MX2008014663A - Uso de especies bacterianas no agrobacterium para transformacion vegetal. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a métodos para la transformación genética mediada por Rhizobia de células vegetales, incluyendo células de frijol de soya, canola, maíz, y algodón; estos incluyen tanto métodos dependientes de VirD2 como independiente de VirD2; las especies bacterianas utilizadas incluyen cepas de Rhizobium sp., Sinorhizobium sp., y Mesorhizobium sp.; también se describen los vectores para uso en dicha transformación.

Description

USO DE ESPECIES BACTERIANAS NO AGROBACTERIUM PARA TRANSFORMACION VEGETAL REFERENCIA CRUZADA Esta solicitud reclama la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos 60/800,872, presenta del 16 de mayo del 2006, la descripción de la cual se incorpora en a presente invención como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere al campo de la biotecnología vegetal. En particular, la invención se refiere a métodos para la producción de plantas y células vegetales transgénicas mediante el uso de especies bacterianas no Agrobacterium.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Agrobacterium spp., miembros de los Rhizobiales, son bacterias comunes del suelo, junto con Rhizobium spp., Mesorhizobium spp., Sinorhizobium spp., y especies y géneros relacionados. Numerosas cepas de tipo silvestre y desarmadas (no patogénicas) de Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes que contienen los plásmidos Ti o Ri se pueden utilizar para transferencia génica dentro de las plantas. Los genes para la síntesis de fitohormona localizados en el ADN-T de Agrobacteria de tipo silvestre que contiene un plásmido Ti o Ri se expresan en células vegetales después de la transformación, y ocasionan formación tumoral o un fenotipo de pelo radicular dependiendo de la cepa o especies de Agrobacterium. De manera importante, el ADN-T de Agrobacteria se puede diseñar para reemplazar muchos de sus determinantes de virulencia y patogenicidad con "genes de interés" aunque retiene la capacidad de ser transferido dentro de una célula vegetal y se integra dentro de un genoma vegetal. Las cepas que contienen dichos plásmidos Ti "desarmados" se utilizan ampliamente para transformación vegetal. El mecanismo de transferencia del ADN-T a células vegetales mediante Agrobacterium ha sido bien documentado. Brevemente, el ADN-T se delimita por dos regiones borde, referidas como borde derecho (RB) y borde izquierdo (LB). Los bordes se cortan mediante la proteína de virulencia VirD2 que produce ADN transferido de cadena sencilla (la "cadena-T") con la unión covalente del VirD2 en su extremo hacia 5'. El complejo de proteína-ADN, también incluye a la proteína VirE2 de Agrobacterium, que sale de las células de Agrobacterium a través del denominado sistema de secreción tipo 4 (T4SS, transportador tanto de la proteína de virulencia como del ADNss), y se transfiere dentro de las células vegetales y se integra en el genoma vegetal con la ayuda tanto de las proteínas de virulencia de Agrobacterium como de los factores vegetales. El uso de los vectores mediados por Agrobacterium para introducir el ADN dentro de las células vegetales se conoce bien en la técnica. Véase, por ejemplo, los métodos descritos por Fraley et al., (1985), Rogers et al., (1987) y la Patente de E.U.A, No. 5,563,055, específicamente incorporados en la presente invención como referencias en su totalidad. La transformación mediada por Agrobacterium es eficiente en muchas plantas dicotiledóneas incluyendo Arabidopsis, tabaco, y tomate. También se han concebido los métodos para la transformación mediada por Agrobacterium de otras especies (por ejemplo la Patente de E.U.A. No. 6,384,301 , que se refiere a la transformación del frijol de soya). Aunque la transformación mediada por Agrobacterium al principio solamente se utilizó con plantas dicotiledóneas, los avances en las técnicas de transformación mediada por Agrobacterium han hecho a la técnica aplicable también en plantas monocotiledóneas. Por ejemplo, las técnicas de transformación mediadas por Agrobacterium se han aplicado al arroz (Hiei et al., 1997; Zhang et al., 1997; Patente de E.U.A. No. 5,591 ,616, específicamente incorporados en la presente invención como referencias en su totalidad), trigo (McCormac et al. , 1998), cebada (Tingay et al. , 1997; McCormac et al., 1998), y maíz (Ishida et al. , 1996). Sin embargo, numerosas especies vegetales son recalcitrantes a la transformación mediada por Agrobacterium, y la eficiencia es baja en otras. Adicionalmente, puesto que A. tumefaciens entra a los tejidos vegetales en sitios de heridas, y no infecta naturalmente a los tejidos no heridos, aún no está disponible el uso de ciertos tejidos como blancos de transformación.

Además del sistema de administración de la cadena T dependiente de T4SS, Agrobacterium tiene sistemas adicionales para movilización del plásmido que también pueden transferir e integrar plásmidos, tales como el plásmido IncQ pRSF1010, entre las células bacterianas y dentro del genoma vegetal con una menor frecuencia vía transferencia conjugal (Buchanan-Wollaston et al. 1987, Shadenkov et al. 1996; Chen et al., 2002). Por ejemplo, la proteína para transferencia conjugal MobA, en conjunción con las proteínas MobB y MobC del plásmido RSF1010, escinde el sitio or/T (origen de la transferencia), se une al extremo 5' y transfiere el ADNss (ADN de cadena sencilla) dentro de las células independiente del sistema T4SS (Bravo-Angel et al. 1999 y referencias ahí señaladas). Los sistemas de transferencia conjugal están ampliamente presentes en bacterias, resultando en el intercambio de información genética entre las células bacterianas. En Rhizobium, filogenéticamente relacionada pero distinta con respecto a Agrobacterium (Spaink, et al., (ed.), 1998; Farrand et al., 2003), el sistema de transferencia conjugal ha sido parcialmente caracterizado en algunas especies (Freiberg et al., 1997; Turner et al. 2002, Tun-Garrido et al. 2003, Perez-Mendoza et al. 2004). El sistema conjugal requiere un or/T como el sitio de corte y TraA o Mob como una enzima de corte, lo cual es diferente con respecto a los elementos convencionales utilizados en la movilización del ADN-T (sitios VirD2 y RB y LB, respectivamente). A diferencia de VirD2, el cual se encontró que tiene una NLS (por sus siglas en inglés de señal de localización nuclear) vegetal en su extremo C terminal para el direccionamiento nuclear en planta, el TraA o Mob no tiene una NLS evidente. El mecanismo preciso y el sitio de integración del ADN en las plantas mediante TraA aún son confusos. Se sabe que los miembros de los Rhizobiales diferentes de Agrobacterium sp., tales como Rhizobium spp., se asocian de manera simbiótica con las raíces vegetales en los nodulos especializados para fijación del nitrógeno (por ejemplo Long, 2001 ). Además de la formación de nodulos específica del hospedero de las raíces vegetales, especialmente de las legumbres, se conocen algunos efectos promotores del crecimiento vegetal por miembros de los Rhizobiales en la ausencia de la formación de nodulos (por ejemplo Noel er a/., 1996). Recientemente, se han publicado reportes que describen la transformación de plantas por bacterias diferentes a Agrobacterium sp. (por ejemplo Broothaerts et al., 2005; Solicitud de Patente de E.U.A. Publicaciones 20050289667; 20050289672; Weller ef al., 2004; Weller ef al, 2005). Broothaerts et al., reportaron la transformación por las cepas Rhizobium sp., Mesorhizobium loti, y Sinorhizobium meliloti que se limitó a Arabidopsis, tabaco, y arroz. Weller et al. (2004, 2005) reportaron que varias bacterias, incluyendo las cepas de Rhizobium sp. y Ochrobactrum sp. que contenían los plásmidos Ri aparentemente transformaron las plantas de pepino y tomate crecidas de manera hidropónica, llevando a un fenotipo de pelo radicular. Sin embargo, la presencia de Agrobacteria no se descartó como una posibilidad en algunas plantas inoculadas, complicando el análisis.

No se ha reportado la transferencia del ADN a células de plantas de frijol de soya, maíz, algodón, o cañóla mediante cepas bacterianas no Agrobacterium. Además, hasta la fecha los esfuerzos de transformación en arroz, tabaco, y Arabidopsis con cepas bacterianas no Agrobacterium han sido dificultados por las bajas eficiencias de transformación. Por lo tanto, existe una gran necesidad en la técnica para el desarrollo de métodos mejorados que permitan la transformación de especies de cosechas importantes utilizando cepas bacterianas no Agrobacterium, y eficiencias de transformación mejoradas en general.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Los siguientes dibujos son parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor con referencia a los dibujos en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas presentadas en la presente invención. Figura 1 : Mapa esquemático de pMON96033. Figura 2: Mapa esquemático de pMON96036. Figura 3: Mapa esquemático de pMON101316. Figuras 4A-4H: Ensayo transitorio GUS de la transformación mediada por Rhizobium en frijol de soya con Mesorhizobium loti (ML), Rhizobium leguminosarum (RL), Sinorhizobium fredii (SF), Sinorhizobium meliloti (SM) con cualquier plásmido Ti desarmado (pTiBo542G o pT¡4404kan). RL4404: R. leguminosarum cepa Madison con pTi4404kan; ML542G: M. loti USDA3471 con pT¡Bo542G; ML4404: M. loñ USDA3471 con pTi4404kan; 2370LBA: R. leguminosarum USDA2370 con pTi4404kan; 2370G: R. leguminosarum USDA2370 con pTiBo542G; SF4404: S. fredii USDA205 con pTi4404kan; SM542C: S. meliloti USDA1002 con pT¡Bo542G; ABI: A. tumefaciens ABI cepa control. Figura 5: Transmisión a la línea germinal del transgén gus en soya producida a través de la transformación mediada por Rhizobium. Figura 6: Mapa esquemático de pMON96913. Figura 7: Mapa esquemático de pMON96914. Figura 8: Mapa esquemático de pMON96026. Figuras 9A-9F: Transformación mediada por Rhizobia de cañóla con varias cepas como se muestra por el ensayo transitorio de GUS. 9A) ML542C (22.4%); 9B) RL2370G (33.3%); 9C) RL2370LBA (20%); 9D) SF542C (30.5%); 9E) SF4404 (20.6%); y 9F) SM542C (13%). Los % de explantes con sectores positivos a GUS se muestran en paréntesis. Figuras 10A-10E: Transformación transgénica estable de callos de cañóla con varias cepas de Rhizobia. 10A) ML542C (50%); 10B) RL2370G (21 %); 10C) RL2370LBA (67%); 10D) SF542C (36%); y 10E) SM542C (73%). Los % de los explantes con sectores positivos a GUS se muestran en paréntesis. Figura 1 1 : Detección por Southern blot del transgén CP4 en plantas de cañóla derivadas a partir de la transformación mediada por Rhizobium. Línea 1 : línea BN_A22; línea 2: línea BN_A24; línea 3: línea BN_A28¡ y línea 4: línea BN_A35. Figuras 12A-12F. Transformación del algodón mediante Rhizobia que contiene pMON101316: 12A) ML542C (47.8%); 12B) RL2370G (56%); 12C) RL2370LBA (31 .4%); 12D) SF542C (23.2%); 12E) SF4404 (31 .5%); y 12F) SM542C (44.4%). RL2370 se utilizó como un control negativo; Agrobacterium tumefaciens cepa ABI se utilizó como un control positivo. Los porcentajes de los explantes positivos a la tinción por GUS están escritos entre paréntesis en la parte superior. Figuras 13A-13F: Transformación estable de callos de algodón mediante varias cepas de Rhizobia: 13A) ML542C; 13B) SF542C; 13C) SM542C; 13D) SF4404; 13E) RL2370LBA; y 13F) RL2370G. Figura 14: Detección del transgén gus mediante hibridación por Southern en callos de algodón derivados a partir de la transformación mediada por Rhizobium. RL2370LBA: R. leguminosarum 2370 con plásmido ayudador Ti de LBA4404; SF542: Sinorhizobium fredii 205 con plásmido ayudador de pTiBo542 a partir de la cepa AGLO; y SF4404: Sinorhizobium fredii 205 con plásmido ayudador Ti de LBA4404. Figura 15: Transformación de maíz mediada por Rhizobia como se muestra mediante la expresión transitoria de un gen gus en embriones inmaduros de maíz. ABI: A. tumefaciens; RL2370LBA: Rhizobium leguminosarum USDA2370 con el plásmido Ti de LBA4404; SM542C: Sinorhizobium meliloti USDA1002 con pT¡Bo542; ML542G: Mesorhizobium loti con pT¡Bo542; SF4404: Sinorhizobium fredii USDA205 con el plásmido Ti de LBA4404; SF542C: Sinorhizobium fredii USDA205 con pTiBo542. Todas las cepas contenían pMON96036 y se indujeron en medio ATA pH 5.4. Figuras 16A-16C: Callos de maíz que expresan el marcador gfp después de la transformación con cepas de Rhizobia. Figura 17: Análisis de hibridación por Southern de la integración del transgén en plantas de maíz derivadas a partir de la transformación mediada por Rhizobium. Se utilizó la sonda gus marcada con DIG para detectar el transgén. Línea 1 -2 y 1 1 -12: líneas derivadas después de la transformación con M. loti ML542G/pMON96036; línea 3-9: lineas derivadas después de la transformación con A. tumefaciens ABI control; línea 13-17: líneas derivadas después de la transformación con S. fredii SF4404/pMON96033; Línea 18-19: líneas derivadas después de la transformación con S. fredii SF542C/pMON96036.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, la invención provee un método para transformar una célula vegetal, que comprende: (a) poner en contacto al menos una primera célula vegetal con una bacteria diferente a Agrobacterium sp. que comprende: (i) un primer ácido nucléico que comprende una región del gen vir de un plásmido Ti en donde la región del gen vir actúa para introducir un ácido nucléico que codifica para una secuencia de interés dentro de la célula vegetal de manera dependiente de VirD2¡ y (¡i) un segundo ácido nucléico que comprende una o más secuencia(s) borde de ADN-T operativamente asociadas con un ácido nucléico de interés; y (b) seleccionar al menos una primera célula vegetal transformada con el ácido nucléico de interés, en donde la célula vegetal es una célula vegetal de frijol de soya, cañóla, maíz, o algodón. En otro aspecto, la invención provee un método para transformar una célula vegetal, que comprende: (a) poner en contacto al menos una primera célula vegetal con una bacteria diferente a Agrobacterium que comprende (i) un primer ácido nucléico requerido para transferencia conjugativa de las secuencias del ADN independientes de la función de VirD2, y (ii) un segundo ácido nucléico que comprende un ácido nucléico de interés; en donde la célula vegetal es una célula vegetal de frijol de soya, cañóla, maíz, o algodón y en donde los polipéptidos codificados por el ácido nucléico requerido para transferencia conjugativa actúan al transferir el ácido nucléico de interés dentro de la célula vegetal; y (b) seleccionar al menos una primera célula vegetal transformada con el ácido nucléico de interés. En dicho método, la transferencia conjugativa puede ser dependiente de traA, tral, o mobA, y el primer ácido nucléico comprende oriT. El primer ácido nucléico puede carecer del ADN-T borde a izquierda y derecha. En un método de la invención, la bacteria puede ser una célula de Rhizobia. En ciertas modalidades, la Rhizobia se crece bajo condiciones adecuadas para minimizar la producción de polisacárido por las células de Rhizobia. La célula de Rhizobia se puede crecer en la presencia de acetosiringona u otro compuesto, tal como un compuesto fenólico, que induce la función del gen vir antes del contacto con la célula vegetal. La célula de Rhizobia se puede seleccionar a partir del grupo que consiste de: Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacterium spp. Ochrobactrum spp. y Bradyrhizobium spp. En modalidades específicas, la célula de Rhizobia es una célula de Rhizobium leguminosarum y adicionalmente puede ser una célula de R. leguminosarum bv. trifolii, R. leguminosarum bv. phaseoli o Rhizobium leguminosarum. bv. viciae. En otro aspecto de un método de transformación provisto por la invención, una célula vegetal que es transformada puede estar comprendida en un explante a partir de una semilla vegetal, por ejemplo, a partir de un plántula, callo, suspensión celular, cotiledón, meristemo, hoja, raíz, o tallo. El explante puede comprender un explante de meristemo embrionario; callo; suspensión celular; cotiledón; o tejido a partir de hojas, raíces, o tallos. Una bacteria utilizada para transformación de conformidad con la invención puede comprender ácidos nucléicos introducidos, por ejemplo, mediante electroporación. Las secuencias pueden comprender ácidos nucléicos requeridos para la transferencia conjugativa independiente de la función de VirD2. Los ácidos nucléicos pueden incluir un primer y segundo ácidos nucléicos. En otro aspecto de la invención, un método de transformación provisto en la presente invención puede comprender la selección de una célula vegetal transformada con un ácido nucléico de interés en la ausencia de un agente seleccionable. La selección de una célula vegetal transformada con un ácido nucléico de interés puede comprender cultivar la célula vegetal en la presencia de un agente seleccionable, en donde el ácido nucléico de interés confiere tolerancia al agente seleccionable o está operativamente asociado a un ácido nucléico adicional que confiere tolerancia al agente seleccionable. Los ejemplos de dichos agentes seleccionabas incluyen glifosato, canamicina, bialafos o dicamba. En una modalidad, el ácido nucléico de interés o el ácido nucléico adicional codifica EPSP sintasa e incluso en una modalidad adicional codifica la proteína EPSP sintasa CP4. En otra modalidad, el agente seleccionable es glifosato. En incluso otras modalidades, la secuencia de interés se puede definir como no físicamente asociada á un gen marcador seleccionable. Por ejemplo, el gen marcador y el ácido nucléico de interés se pueden segregar genéticamente en la progenie de una planta regenerada a partir de la célula vegetal transformada con el ácido nucléico de interés. Una bacteria de conformidad con la invención puede comprender al menos un tercer ácido nucléico que comprende un ácido nucléico de interés adicional, en donde la célula vegetal se transforma con el tercer ácido nucléico. En un método de la invención, una planta puede ser regenerada por una célula vegetal transgénica, en donde la planta comprende la secuencia de interés. La regeneración de una planta puede comprender la inducción de la formación de uno o más brotes a partir de un explante que comprende la célula vegetal y cultivar al menos un primer brote hacia una planta fértil completa. En ciertas modalidades, la planta puede ser una planta de maíz o de algodón. En modalidades adicionales, la regeneración se presenta mediante organogénesis. En otras modalidades, la planta es una planta de soya o de cañóla. En otro aspecto, la invención provee una célula de Rhizobia seleccionada a partir del grupo que consiste de: Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacteríum spp. Ochrobactrum spp. y Bradyrhizobium spp., la célula que comprende (i) un primer ácido nucléico que comprende una región del gen vir de un plásmido Ti en donde la región del gen vir actúa para introducir un ácido nucléico que codifica para una secuencia de interés dentro de una célula vegetal de manera dependiente de VirD2; y (ii) un segundo ácido nucléico que comprende una o más secuencia(s) borde de ADN-T operativamente asociadas a un ácido nucléico que codifica para una secuencia de interés. En una modalidad, la célula se define adicionalmente como que comprende un marcador seleccionable. En otra modalidad, la célula de Rhizobia se selecciona a partir del grupo que consiste de: Rhizobium sp., Rhizobium sp. NGR234, Rhizobium leguminosarum Madison, R. leguminosarum USDA2370, R. leguminosarum USDA2408, R. leguminosarum USDA2668, R. leguminosarum 2370G, R. leguminosarum 2370LBA, R. leguminosarum 2048G, R. leguminosarum 2048LBA, R. leguminosarum bv. phaseoii, R. leguminosarum bv. phaseoli 2668G, R. leguminosarum bv. phaseoli 2668LBA, R. leguminosarum RL542C, R. leguminosarum bv. viciae, R. leguminosarum bv. trifolii, Rhizobium etli USDA 9032, R. etli bv. phaseoli, Rhizobium tropici, Mesorhizobium sp., Mesorhizobium loti ML542G, M. loti ML4404, Sinorhizobium sp., Sinorhizobium meliloti SD630, S. meliloti USDA1002, Sinorhizobium fredii USDA205, S. fredii SF542G, S. fredii SF4404, S. fredii SM542C, Bradyrhizobium sp., Bradyrhizobium japonicum USDA 6, y B. japonicum USDA 1 10. En modalidades específicas, la célula es una célula de Rhizobium leguminosarum y adicionalmente puede ser, por ejemplo, una célula de R. leguminosarum bv. trifolii, R. leguminosarum bv. phaseoli o Rhizobium leguminosarum. bv. viciae. En incluso otro aspecto de la invención, se provee una construcción de ADN competente para la transferencia independiente de virD2 a partir de Rhizobia y que carece de la secuencia de ADN-T borde, la construcción que comprende una secuencia oriT y la secuencia traA o mob operativamente asociada con un ácido nucléico de interés. La invención provee adicionalmente una célula de Rhizobia transformada con dicha construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 35, en donde la Rhizobia se selecciona a partir del grupo que consiste de: Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacterium spp. Ochrobactrum spp. y Bradyrhizobium spp. En una modalidad, la célula de Rhizobia se selecciona a partir del grupo que consiste de: Rhizobium sp., Rhizobium sp. NGR234, Rhizobium leguminosarum Madison, R. leguminosarum USDA2370, R. leguminosarum USDA2408, R. leguminosarum USDA2668, R. leguminosarum 2370G, R. leguminosarum 2370LBA, R. leguminosarum 2048G, R. leguminosarum 2048LBA, R. leguminosarum bv. phaseoli, R. leguminosarum bv. phaseoli 2668G, R. leguminosarum bv. phaseoli 2668LBA, R. leguminosarum RL542C, R. leguminosarum bv. viciae, R. leguminosarum bv. trifolii, Rhizobium etli USDA 9032, R. etli bv. phaseoli, Rhizobium tropici, Mesorhizobium sp., Mesorhizobium loti ML542G, M. loti ML4404, Sinorhizobium sp., Sinorhizobium meliloti SD630, S. meliloti USDA 002, Sinorhizobium fredii USDA205, S. fredii SF542G, S. fredii SF4404, S. fredii SM542C, Bradyrhizobium sp., Bradyrhizobium japonicum USDA 6, y B. japonicum USDA 1 10. En modalidades específicas, la célula es una célula de Rhizobium leguminosarum, e incluso en modalidades adicionales, puede ser una célula de R. leguminosarum bv. trifolii, R. leguminosarum bv. phaseoli o Rhizobium leguminosarum. bv. viciae.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Lo siguiente es una descripción detallada de la invención provista para ayudar a aquellos expertos en la técnica en la práctica de la presente invención. Aquellos expertos en la técnica pueden hacer modificaciones y variaciones en las modalidades descritas en la presente invención sin apartarse del espíritu o alcance de la presente invención. La presente invención provee métodos y composiciones para la transformación genética eficiente de células vegetales de especies de cosechas importantes mediante Rhizobia. La invención supera las limitaciones sustanciales en la técnica, incluyendo eficiencia de transformación limitada e incapacidad para describir técnicas susceptibles para la transformación de plantas de cosechas importantes mediante el uso de cepas no Agrobacterium. Por ejemplo, aunque se ha discutido el uso de bacterias diferentes a Agrobacterium para diversas variedades vegetales, las frecuencias de transformación han sido bajas. En el caso del arroz, se han reportado frecuencias de transformación del 0.6% y más bajas, con solamente una planta transformada obtenida a partir de 687 callos inoculados (Broothaerts et al., 2005). Esto contrasta con las frecuencias de transformación del 50-80% utilizando Agrobacterium. Incluso utilizando organismos modelo más fácilmente transformados mediante Agrobacterium, las frecuencias de transformación solamente fueron una fracción de aquéllas obtenidas mediante la transformación mediada por Agrobacterium. Hasta la fecha se ha requerido una cantidad considerable de investigación en muchos casos para la aplicación de procedimientos de transformación incluso bien desarrollados tales como la transformación mediada por Agrobacterium de diferentes especies vegetales. Las plantas de diferentes especies frecuentemente exhiben diferencias fisiológicas sustanciales que afectan la susceptibilidad de la transformación genética. Por lo tanto los métodos para transformación de una especie de planta frecuentemente no funcionan de manera efectiva, si es que lo hacen, con otras plantas y la capacidad de transformar una planta no necesariamente es predictiva de la capacidad de transformar especies incluso relacionadas utilizando ese procedimiento. Esto es particularmente cierto para la transformación bacteriana, la cual incluye interacciones bioquímicas complejas entre las cepas bacterianas utilizadas y la células vegetales blanco. Rhizobia interactúa con las plantas en el ambiente nativo y por lo tanto puede exhibir especificidad al hospedero, el impacto de lo cual se desconoce para muchas especies de cosechas. Por lo tanto, es de gran interés la identificación de plantas susceptibles a la transformación mediada por Rhizobia, y el desarrollo de procedimientos que permiten eficiencias de transformación incrementadas. En particular la transformación eficiente es importante debido a que el grado en el cual se expresa cualquier evento de transformación dado puede variar dependiendo sustancialmente del sitio de integración en el genoma vegetal. Por lo tanto la capacidad de seleccionar eventos de transformación que tienen un perfil de expresión adecuado es dependiente de la capacidad de producir transformantes de manera eficiente. Como se explica en los ejemplos de trabajo a continuación, se obtuvieron frecuencias de transformación transitoria tan elevadas como de 5% por los inventores para la transformación de los frijoles de soya (figuras 4A-4H) y se obtuvieron frecuencias cercanas al 56% y 33% en el caso del algodón (figuras 12A-12F) y de la cañóla (figuras 9A-9F), respectivamente. La presente invención supera las limitaciones en la técnica al proveer, en una modalidad, técnicas para el uso de Rhizobia para transformar plantas de cosechas importantes que no se conocían previamente como transformables por Rhizobia, incluyendo cañóla, maíz, algodón, y frijol de soya. La invención también provee técnicas para la eficiente transformación de plantas utilizando Rhizobia, incluyendo aquellas que ya se sabe que son susceptibles para la transformación por Rhizobia a una baja frecuencia. La invención también provee métodos para la transformación de los tejidos blanco que difieren de aquellos de Agrobacterium. Por ejemplo, aunque Agrobacterium típicamente requiere un sitio de herida para infectar a las plantas, algunos otros miembros de los Rhizobiales, incluyendo Rhizobiaceae tales como Rhizobium, infectan de manera natural las raíces vegetales vía hebras de infección que penetran los tejidos vegetales, permitiendo el uso de tejido no herido como un blanco para transformación. Se proveen las siguientes definiciones con el objeto de ayudar a aquellos expertos en la técnica en la comprensión de la descripción detallada de la presente invención. Como se utiliza en la presente invención, "regulador del crecimiento vegetal" u "hormona vegetal" se refiere a compuestos que afectan el crecimiento vegetal. Los reguladores del crecimiento vegetal incluyen, pero no se limitan a, auxinas, citoquininas, ABA, giberelinas, etileno, brasinoesteroides, y poliaminas. Las auxinas afectan la elongación de los brotes y raíces a baja concentración pero inhiben el crecimiento a mayores niveles. Las auxinas comúnmente utilizadas incluyen picloram (ácido 4-amino- 3,5,6-tricloropicolinico), 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), IAA (ácido indol-3-acético), NAA (ácido a-naftalenacético), y dicamba (ácido 3,6-dicloroanísico). Las citoquininas ocasionan división celular, diferenciación celular, y diferenciación del brote. Las citoquininas comúnmente utilizadas incluyen cinetina, BA (6-bencilaminopurina), 2-ip (2-isopenteniladenina), BAP (6-bencilaminopurina), tidiazuron (TDZ), ribósido de zeatina, y zeatina. "Secuencia codificante", "región codificante" o "marco abierto de lectura" se refiere a una región de tripletes continuos de ácido nucléico secuencial que codifican una proteína, polipéptido, o secuencia peptídica. "Dicot" o "dicotiledónea" se refiere a plantas que tienen dos cotiledones. Los ejemplos incluyen, sin limitación, plantas tales como alfalfa, frijoles, brócoli, calabaza, cañóla, zanahoria, coliflor, apio, algodón, pepino, berenjena, lechuga, melón, guisante, pimiento, patata, calabaza, rábano, semilla de colza, espinaca, frijol de soya, zapallo, tomate, y sandía. "Endógeno" se refiere a materiales que se originan dentro del organismo o célula. "Exógeno" se refiere a materiales que se originan a partir de fuera del organismo o célula. Como se utiliza en la presente invención, se pretende que exógeno se refiera a cualquier ácido nucléico a partir de una fuente diferente a la célula o tejido recipiente, sin importar si un ácido nucléico similar (pero no idéntico) puede ya estar presente en la célula o tejido recipiente. "Explante" se refiere a una parte vegetal que es capaz de ser transformada y subsecuentemente regenerada hacia una planta transgénica. Los ejemplos incluyen embriones, callo, suspensiones celulares, cotiledones, meristemos, plántulas, semillas, hojas, tallos o raíces. "Monocot" o "monocotiledónea" se refiere a plantas que tienen un único cotiledón. Los ejemplos incluyen, sin limitación, cebollas, maíz, arroz, sorgo, trigo, centeno, mijo, caña de azúcar, avena, triticale, cebada y césped pasto. "Ácido nucléico" se refiere un ácido deoxirribonucléico (ADN) o ácido ribonucléico (ARN). "Fenotipo" se refiere a un rasgo exhibido por un organismo que resulta de la expresión (o falta de expresión) de los ácidos nucléicos en el genoma (incluyendo ADN y ARN no genómico tales como plásmidos y cromosomas artificiales) y/u organelos del organismo. El término "planta" incluye cualquier planta superior y progenie de la misma, incluyendo monocotiledóneas (por ejemplo, maíz, arroz, trigo, cebada, efe), dicotiledóneas (por ejemplo, frijol de soya, algodón, tomate, patata, Arabidopsis, tabaco, etc.), gimnospermas (pinos, abetos, cedros, etc) e incluye partes de plantas, incluyendo unidades reproductivas de una planta {por ejemplo, semillas, bulbos, tubérculos, tejidos meristemáticos, u otras partes o tejidos a partir de esa planta que se pueden reproducir), frutos y flores. "Señal de poliadenilación" o "señal polyA" se refiere a una secuencia de ácido nucléico localizada hacia 3' con respecto a una región codificante que promueve la adición de nucleótidos de adenilato hacia el extremo 3' de un ARNm transcrito a partir de la región codificante. "Promotor" o "región promotora" se refiere a una secuencia de ácido nucléico, usualmente encontrada hacia 5' con respecto a una secuencia codificante, que altera la expresión de la secuencia codificante al proveer un sitio de reconocimiento para la ARN polimerasa y/u otros sitios de reconocimiento para otros factores relacionados con la transcripción utilizados para producir ARN y/o para iniciar la transcripción en el sitio correcto en el ADN. "Vector de ácido nucléico recombinante" o "vector" o "construcción" se refiere a cualquier agente tal como un plásmido, cósmido, virus, secuencia que se replica de manera autónoma, fago, o segmento de nucleótidos de ADN o ARN de cadena sencilla o doble, lineal o circular, derivado de cualquier fuente, capaz de llevar a cabo la integración genómica o la replicación autónoma, que comprende una molécula de ácido nucléico en la cual se ha asociado una o más secuencias de ácido nucléico de manera funcionalmente operativa. Dichos vectores o construcciones de ácido nucléico recombinante típicamente comprenden una secuencia reguladora hacia 5' o región promotora y una secuencia codificante que codifica para un producto del gen deseado. Los vectores típicamente se diseñan de tal manera que una vez administrados dentro de una célula o tejido, la secuencia codificante se transcribe hacia ARNm, la cual se traduce opcionalmente hacia un polipéptido o proteína.

"Regeneración" se refiere al procedimiento de crecimiento de una planta a partir de una célula o tejido vegetal. "Rhizobia" se refiere sin limitación a un género bacteriano, especies, y cepas que se pueden asignar al orden de los Rhizobiales diferentes a las cepas bacterianas de Agrobacterium que comprenden las familias taxonómicas Rhizobiaceae (por ejemplo Rhizobium spp., Sinorhizobium spp.); Phyllobacteriaceae (por ejemplo Mesorhizobium spp., Phyllobacterium spp.); Brucellaceae (por ejemplo Ochrobactrum spp.); Bradyrhizobiaceae (por ejemplo Bradyrhizobium spp.), y Xanthobacteraceae (por ejemplo Azorhizobium spp.), entre otras. Para los propósitos de la presente solicitud, "Rhizobia" no incluye, biovars, o especies. La asignación taxonómica se puede realizar como se sabe en la técnica, por ejemplo mediante la comparación de las secuencias del ADNr 16S u otros métodos de clasificación. Las cepas de tipo silvestre de muchas especies de Rhizobium típicamente son capaces de inducir la formación de nodulos para la fijación de nitrógeno en los tejidos radiculares de plantas hospederas tales como plantas leguminosas (Fabaceae). Sin embargo, no se requiere la capacidad de formar nodulos en las raíces de una especie vegetal dada para la transferencia de ADN mediada por Rhizobium dentro de las células de las especies vegetales. "Marcador seleccionable" o "marcador registrable" se refieren a una secuencia de ácido nucléico cuya expresión confiere un fenotipo que facilita la identificación de células, tejidos, o plantas que contienen la secuencia del ácido nucléico. "Transcripción" se refiere al procedimiento para la producción de una copia de ARN a partir de un molde de ADN. "Transformación" se refiere a un procedimiento para la introducción de una secuencia de ácido nucléico exógeno dentro de una célula o tejido. La transformación puede ser transitoria o estable. En las transformaciones estables, parte o todo el ácido nucléico exógeno se incorpora (por ejemplo, se integra o se mantiene de manera estable) en el ADN genómico nuclear, ADN del plastidio, o es capaz de llevar a cabo replicación autónoma en el núcleo o el plastidio. "Transgénico" se refiere a organismos dentro de los cuales se ha transformado de manera estable una secuencia de ácido nucléico exógeno. Al diseñar un vector para el procedimiento de transformación, se selecciona uno o más componentes genéticos que serán introducidos dentro de la célula o tejido vegetal. Los componentes genéticos pueden incluir cualquier ácido nucléico que se introduce dentro de una célula o tejido vegetal utilizando el método de conformidad con la invención. Los componentes genéticos pueden incluir ADN no vegetal, ADN vegetal o ADN sintético. En una modalidad, los componentes genéticos se incorporan dentro de una composición de ADN tal como una molécula plasmidica o vector de cadena doble, recombinante que comprende al menos uno o más de los siguientes tipos de componentes genéticos: (a) un promotor que funciona en células vegetales para ocasionar la producción de una secuencia de ARN, (b) una secuencia de ADN estructural que ocasiona la producción de una secuencia de ARN que codifica un producto de utilidad agronómica, y (c) una secuencia de ADN no traducida hacia 3' que funciona en células vegetales para ocasionar la adición de nucleótidos poliadenilados hacia el extremo 3' de la secuencia de ARN. El vector puede contener numerosos componentes genéticos para facilitar la transformación de la célula o tejido vegetal y para regular la expresión de la secuencia de ácido nucléico estructural. En una modalidad preferida, los componentes genéticos se orientan de tal manera que expresen un ARNm, que en una modalidad opcional se puede traducir hacia una proteína. La expresión de una secuencia codificante estructural en planta (un gen, ADNc, ADN sintético, u otro ADN) que existe en forma de cadena doble incluye la transcripción del ARN mensajero (ARNm) a partir de una cadena del ADN mediante la enzima ARN polimerasa y el subsecuente procesamiento del transcrito primario de ARNm dentro del núcleo. Este procesamiento incluye una región no traducida hacia 3' que añade nucleótidos poliadenilados hacia los extremos 3' del ARNm. Los medios para la preparación de los plásmidos o vectores que contienen los componentes genéticos deseados se conocen bien en la técnica. Los vectores típicamente consisten de numerosos componentes genéticos, incluyendo pero no limitados a elementos reguladores tales como secuencias promotoras, líderes, intrones, y terminadoras. Los elementos reguladores también se refieren como elementos reguladores en cis o trans, dependiendo de la proximidad del elemento a las secuencias o gen(es) que controlan. La transcripción del ADN hacia ARNm se regula por una región del ADN usualmente referida como el "promotor". La región promotora contiene una secuencia de bases que señaliza a la ARN polimerasa para asociarse con el ADN e iniciar la transcripción hacia ARNm utilizando una de las cadenas de ADN como un molde para elaborar una cadena complementaria correspondiente de ARN. Numerosos promotores que están activos en células vegetales se han descrito en la literatura. Dichos promotores podrían incluir pero no se limitan a los promotores de la nopalina sintasa (NOS) y octopina sintasa (OCS) que son portados en los plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens, los promotores del virus de la coliflor tales como los promotores 19S y 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia (FMV), y el promotor mejorado de CaMV35S (e35S). También se puede utilizar una variedad de otros promotores de genes vegetales que se regulan en respuesta a señales ambientales, hormonales, químicas, y/o del desarrollo para la expresión de cualquier construcción de ADN en células vegetales, incluyendo, por ejemplo, promotores regulados por (1 ) calor (Callis et al. , 1988, (2) luz (por ejemplo, promotor RbcS-3A del guisante, Kuhlemeier et al., (1989); promotor RbcS del maíz, Schaffner ef al., (1991 ); (3) hormonas, tal como ácido abscísico (Marcotte et al., 1989, (4) formación de herida (por ejemplo, Wuni, Siebertz et al., 1989); u otras señales o químicos. También se conoce la expresión específica de tejido. Como se describe a continuación, se prefiere que el promotor particular seleccionado sea capaz de ocasionar una expresión adecuada para resultar en la producción de una cantidad efectiva del producto del gen de interés. Los ejemplos que describen dichos promotores incluyen sin limitación la Patente de E.U.A. 6,437,217 (promotor RS81 del maíz), Patente de E.U.A. 5,641 ,876 (promotor de actina del arroz, OsActl ), Patente de E.U.A. 6,426,446 (promotor RS324 del maíz), Patente de E.U.A. 6,429,362 (promotor PR-1 del maíz), Patente de E.U.A. 6,232,526 (promotor A3 del maíz), Patente de E.U.A. 6,177,61 1 (promotores constitutivos del maíz), Patentes de E.U.A. 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142 y 5,530,196 (promotor 35S), Patente de E.U.A. 6,433,252 (promotor de oleosina L3 del maíz), Patente de E.U.A. 6,429,357 (promotor de actina del arroz 2 así como un intrón de actina del arroz 2), Patente de E.U.A. 5,837,848 (promotor específico de raíz), Patente de E.U.A. 6,294,714 (promotores inducibles por luz), Patente de E.U.A. 6, 140,078 (promotores inducibles por sal), Patente de E.U.A. 6,252,138 (promotores inducibles por patógeno), Patente de E.U.A. 6, 175,060 (promotores inducibles por deficiencia de fósforo), Patente de E.U.A. 6,635,806 (promotor de gamma-coixina), y Patente de E.U.A. 7, 151 ,204 (promotor de la cloroplasto aldolasa del maíz). Los promotores adicionales que pueden encontrar uso son un promotor de la nopalina sintasa (NOS) (Ebert et al. , 1987), el promotor de la octopina sintasa (OCS) (el cual se porta en los plásmidos inductores de tumor de Agrobacterium tumefaciens), los promotores de virus de la coliflor tales como el promotor 19S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Lawton et al., 1987), el promotor 35S CaMV (Odell et al. , 1985), el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia (Walker et al., 1987; Patentes de E.U.A. 6,051 ,753; 5,378,619), el promotor de la sacarosa sintasa (Yang et al. , 1990), el promotor del complejo de gen R (Chandler et al., 1989), y el promotor del gen de la proteína de unión a la clorofila a/b, PCISV (Patente de E.U.A. 5,850,019). En la presente invención, los promotores CaMV35S con secuencias potenciadoras (e35S; Patentes de E.U.A. Nos. 5,322,938; 5,352,605; 5,359,142; y 5,530,196), FMV35S (Patentes de E.U.A. 6,051 ,753; 5,378,619), virus del mosaico clorótico en veta del cacahuate (PCISV; Patente de E.U.A. 5,850,019), At.Act 7 (# de acceso U2781 1 ), At.ANTI (Solicitud de Patente de E.U.A. 20060236420), FMV.35S-EF1 a (Solicitud de Patente de E.U.A. Publicación 2005/0022261 ), elF4A10 (# de acceso X79008) y AGRtu.nos (Acceso GenBank V00087; Depicker et al, 1982; Bevan et al., 1983), triosa fosfato isomerasa citosólica del arroz (OsTPI; Patente de E.U.A. No. 7, 32,528), y gen de actina 15 del arroz (OsAct15; Solicitud de Patente de E.U.A. Publicación 2006/0162010) pueden ser de beneficio particular. En algunos casos, por ejemplo OsTPI y OsAct 15, un promotor puede incluir una 5'UTR y/o un primer intrón. Los promotores híbridos también se pueden construir para mejorar la actividad transcripcional (Patente de E.U.A. No. 5,106,739), o para combinar la actividad transcripcional deseada, inducibilidad y especificidad tisular o especificidad del desarrollo. Los promotores que funcionan en plantas incluyen pero no se limitan a promotores que son inducibles, virales, sintéticos, constitutivos como se describió, y temporalmente regulados, espacialmente regulados, y espacio-temporalmente regulados. Otros promotores que son mejorados por tejido, específicos de tejido, o regulados por desarrollo también se conocen en la técnica y se prevee que tienen utilidad en la práctica de esta invención. Los promotores utilizados en las construcciones de ADN (es decir genes vegetales quiméricos/recombinantes) de la presente invención se pueden modificar, si se desea, para afectar sus características control. Los promotores se pueden derivar por medio de la ligación con las regiones operadoras, mutagénesis al azar o controlada, etc. Además, los promotores se pueden alterar para que contengan múltiples "secuencias potenciadoras" para ayudar en la elevación de la expresión del gen. El ARNm producido por una construcción de ADN de la presente invención también puede contener una secuencia líder no traducida hacia 5'. Esta secuencia se puede derivar a partir del promotor seleccionado para expresar el gen y se puede modificar específicamente de manera que incremente o disminuya la traducción del ARNm. Las regiones no traducidas hacia 5' también se pueden obtener a partir de ARNs virales, a partir de genes eucariontes adecuados, o a partir de una secuencia del gen sintético. Dichas secuencias "potenciadoras" puede ser deseables para incrementar o alterar la eficiencia traduccional del ARNm resultante. La presente invención no se limita a construcciones en donde la región no traducida se deriva a partir de la secuencia no traducida hacia 5' que acompaña a la secuencia promotora. Más bien, la secuencia líder no traducida se puede derivar a partir de promotores o genes no relacionados (véase, por ejemplo Patente de E.U.A. No. 5,362,865). Los ejemplos de secuencias líder no traducidas incluyen los líderes de la proteína de choque térmico del maíz y de petunia (Patente de E.U.A. No. 5,362,865), líderes de la proteína de la cubierta viral vegetal, líderes de la rubisco vegetal, GmHsp (Patente de E.U.A. 5,659,122), PhDnaK (Patente de E.U.A. No. 5,362,865), AtAntl , TEV (Carrington y Freed, 1990), OsActl (Patente de E.U.A. No. 5,641 ,876), OsTPI (Patente de E.U.A. No. 7,132,528), y OsActl 5 (Publicación E.U.A. No. 20060162010), y AGRtu.nos (Acceso GenBank V00087; Bevan et al., 1983). Otros componentes genéticos que sirven para mejorar la expresión o para afectar la transcripción o la traducción de un gen también se preveen como componentes genéticos. Se sabe en la técnica que las secuencias del intrón ayudan en la expresión de los transgenes en células vegetales monocotiledóneas. Los ejemplos de intrones incluyen el intrón de la actina del maíz (Patente de E.U.A. 5,641 ,876), el intrón HSP70 del maíz (ZmHSP70; Patente de E.U.A. 5,859,347; Patente de E.U.A. 5,424,412), y el intrón TPI del arroz (OsTPI; Patente de E.U.A. No. 7,132,528) y son de beneficio en la práctica de esta invención. El término de la transcripción se puede acompañar por una secuencia de ADN no traducida hacia 3' operativamente asociada con un transgén recombinante {por ejemplo el gene de interés, la secuencia de identificación que comprende un gen registrable, o el gen marcador seleccionarle en planta). La región no traducida hacia 3' de una molécula de ADN recombinante contiene una señal de poliadenilación que funciona en las plantas para ocasionar la adición de los nucleótidos de adenilato al extremo 3' del ARN. La región no traducida hacia 3' se puede obtener a partir de diversos genes que se expresan en células vegetales. La región no traducida hacia 3' de la nopalina sintasa (Fraley et al., 1983), se utiliza comúnmente en esta capacidad. Las moléculas de poliadenilación a partir de un gen RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al., 1984), AGRtu.nos (Acceso GenBank E01312), E6 (# de acceso U30508), glutelina del arroz (Okita et al., 1989), y TaHsp17 (gen de la proteína de choque térmico de bajo peso molecular del trigo; GenBank # de acceso X13431 ) en particular pueden ser de beneficio para uso con la invención. En una modalidad, el vector contiene un gen marcador seleccionable, registrable, o evaluable. Estos componentes genéticos también se refieren en la presente invención como componentes genéticos funcionales, puesto que producen un producto que sirve para una función en la identificación de una planta transformada, o un producto de utilidad agronómica. El ADN que sirve como un dispositivo seleccionable o registrable puede funcionar en un tejido vegetal regenerable para producir un compuesto que podría conferir al tejido vegetal resistencia a un compuesto de otra manera tóxico. Numerosos genes marcadores registrable o seleccionable se conocen en la técnica y se pueden utilizar en la presente invención. Los ejemplos de marcadores selecciónatele y genes que proveen resistencia en contra de éstos se describen en Miki y McHugh, 2004. Los genes de interés para uso como un marcador seleccionable, registrable, o evaluable podrían incluir pero no se limitan a gus, gfp (proteína fluorescente verde), luciferasa (LUX), genes que confieren tolerancia a antibióticos tales como la canamicina (Dekeyser et al., 1989), neomicina, canamicina, paromomicina, G418, aminoglicósidos, espectinomicina, estreptomicina, higromicina B, bleomicina, fleomicina, sulfonamidas, estreptotricina, cloramfenicol, metotrexato, 2-deoxiglucosa, betaína aldehido, S-aminoetil L-cisteína, 4-metiltriptofano, D-xilosa, D-mannosa, benciladenina-N-3-glucuronidasa, genes que codifican enzimas que otorgan tolerancia a los herbicidas semejantes al glifosato (por ejemplo 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS): Della-Cioppa et al. , 1987; Patente de E.U.A. 5,627,061 ; Patente de E.U.A. 5,633,435; Patente de E.U.A. 6,040,497; Patente de E.U.A. 5,094,945; WO04074443, y WO04009761 ; glifosato oxidoreductasa (GOX; Patente de E.U.A. 5,463, 175); glifosato decarboxilasa (WO05003362 y Solicitud de Patente de E.U.A. 20040177399; o glifosato N-acetiltransferasa (GAT): Castle et al., Patente de E.U.A. Publicación 20030083480), dalapon (por ejemplo deh\ que codifica la dehalogenasa del ácido 2,2-dicloropropiónico que confiere tolerancia al ácido 2,2-dicloropropiónico (Dalapon; W099271 6)), bromoxinilo (haloarilnitrilasa (Bxn) para conferir tolerancia al bromoxinilo (WO8704181A1 ; US 4,810,648; WO8900193A)), herbicidas de sulfonilo (por ejemplo acetohidroxiácido sintasa o acetolactato sintasa que confiere tolerancia a los inhibidores de la acetolactato sintasa tales como sulfonilurea, imidazolinona, triazolopirimidina, pirimidiloxibenzoatos y ftalida; (US 6,225,105; US 5,767,366, US 4,761 ,373; US 5,633,437; US 6,613,963; US 5,013,659; US 5,141 ,870; US 5,378,824; US 5,605,01 1 )); que codifica ALS, GST-II), bialafos o fosfinotricina o derivados (por ejemplo fosfinotricina acetiltransferasa (bar) que confiere tolerancia a la fosfinotricina o glufosinato (US 5,646,024, US 5,561 ,236, EP 275,957; US 5,276,268; US 5,637,489; US 5,273, 894), atrazina (que codifica GST-lll), dicamba (dicamba monooxigenasa (DMO); Solicitudes de Patentes de E.U.A. 20030115626, 20030135879), o setoxidima (acetil-coenzima A carboxilasa modificada para conferir tolerancia a la ciclohexanediona (setoxidima) y ariloxifenoxipropionato (haloxyfop) (U.S. 6,414,222)), entre otros. También se pueden implementar otros procedimientos seleccionable incluyendo mecanismos seleccionable positiva (por ejemplo el uso del gen manA de la E. coli, que permite crecimiento en la presencia de mannosa) y aún así podría caer dentro del alcance de la presente invención (véase también Miki y McHugh (2004)). La presente invención se puede utilizar con cualquier plásmido o vector para transformación vegetal adecuada que contiene un marcador seleccionable o registrable y elementos reguladores asociados como se describió, junto con uno o más ácidos nucléicos expresados de manera adecuada para conferir un rasgo deseable particular. Los ejemplos de genes estructurales adecuados de interés agronómico previstos por la presente invención podrían incluir pero no se limitan a genes para tolerancia a la enfermedad, insecto, o plaga, tolerancia a herbicida, genes para mejoría en la calidad tal como rendimiento, mejorías nutricionales, tolerancias ambientales o al estrés, o cualesquiera cambios deseables en la fisiología vegetal, crecimiento, desarrollo, morfología o producto(s) vegetal(es) incluyendo producción de almidón (Patentes de E.U.A. 6,538,181 ; 6,538, 179; 6,538,178; 5,750,876; 6,476,295), producción de aceites modificados (Patentes de E.U.A. 6,444,876; 6,426,447; 6,380,462), alta producción de aceite (Patentes de E.U.A. 6,495,739; 5,608,149; 6,483,008; 6,476,295), conteniendo modificado de ácidos grasos (Patentes de E.U.A. 6,828,475; 6,822,141 ; 6,770,465; 6,706,950; 6,660,849; 6,596,538; 6,589,767; 6,537,750; 6,489,461 ; 6,459,018), alta producción de proteína (Patente de E.U.A. 6,380,466), maduración del fruto (Patente de E.U.A. 5,512,466), nutrición animal y humana mejorada (Patentes de E.U.A. 6,723,837; 6,653,530; 6,5412,59; 5,985,605; 6, 171 ,640), biopolímeros (Patentes de E.U.A. RE37,543; 6,228,623; 5,958,745 y Patente de E.U.A. Publicación No. US20030028917). También resistencia al estrés ambiental (Patente de E.U.A. 6,072, 103), péptidos farmacéuticos y péptidos secretables (Patentes de E.U.A. 6,812,379; 6,774,283; 6,140,075; 6,080,560), rasgos de procesamiento mejorados (Patente de E.U.A. 6,476,295), digestión mejorada (Patente de E.U.A. 6,531 ,648) baja cantidad de rafinosa (Patente de E.U.A. 6,166,292), producción industrial de la enzima (Patente de E.U.A. 5,543,576), sabor mejorando (Patente de E.U.A. 6,01 1 ,199), fijación de nitrógeno (Patente de E.U.A. 5,229, 1 14), producción de semilla híbrida (Patente de E.U.A. 5,689,041), producción de fibra (Patente de E.U.A. 6,576,818; 6,271 ,443; 5,981 ,834; 5,869,720) y producción de biocombustible (Patente de E.U.A. 5,998,700). Cualesquiera de estos u otros elementos genéticos, métodos, y transgenes se pueden utilizar con la invención como se apreciará por aquellos expertos en la técnica en vista de la presente descripción. Alternativamente, las secuencias de ADN de interés pueden afectar estos fenotipos mediante la inhibición de la expresión de un gen endógeno vía tecnologías de silenciamiento de gen tales como cosupresión, antisentido, ARNi, expresión de ARNmi (natural o diseñado), expresión de ARNsi trans-actuantes, y expresión de ribozimas (véase por ejemplo, Solicitud de Patente de E.U.A. Publicación 20060200878). Los ácidos nucléicos ejemplares que se pueden introducir por los métodos previstos por la presente invención incluyen, por ejemplo, secuencias de ADN o genes a partir de otras especies, o incluso genes o secuencias que se originan con o que están presentes en la misma especie, pero que se incorporan dentro de células recipientes mediante métodos de ingeniería genética en lugar de las técnicas de reproducción clásica o cruza. Sin embargo, también se pretende que el término "exógeno" se refiera a genes que no están normalmente presentes en la célula a ser transformada, o tal vez simplemente no están presentes en la forma, estructura, etc., como se encuentra en el segmento de ADN o gen de transformación, o genes que normalmente están presentes incluso aquel que uno desea, por ejemplo, que tenga sobre-expresión. Por lo tanto, se pretende que el término gen "exógeno" o ADN se refiera a cualquier gen o segmento de ADN que se introduce dentro de una célula recipiente, sin importar si un gen similar puede ya estar presente en dicha célula. El tipo de ADN incluido en el ADN exógeno puede incluir ADN que ya está presente en la célula vegetal, ADN a partir de otra planta, ADN a partir de un organismo diferente, o un ADN generado de manera externa, tal como una secuencia de ADN que contiene un mensajero antisentido de un gen, o una secuencia de ADN que codifica una versión sintética o modificada de un gen. A la luz de esta descripción, serán evidentes a aquellos expertos en la técnica muchos otros genes marcadores seleccionable o registrable posibles, elementos reguladores, y otras secuencias de interés. Por lo tanto, se pretende que la discusión precedente sea ejemplar en lugar de exhaustiva. Para la transformación mediada por Rhizobia, después de la construcción de un vector o construcción para transformación vegetal, la molécula de ácido nucléico, preparada como una composición del ADN in vitro, se introduce dentro de un hospedero adecuado tal como E. coli y se aparee dentro de otro hospedero adecuado tal como Rhizobia, incluyendo Rhizobium, o se transforma directamente (por ejemplo electroporada) dentro de la Rhizobia competente. El plásmido Ti o Ri se puede transferir naturalmente dentro del Rhizobium fijador de nitrógeno y puede inducir tumores o pelos radiculares, respectivamente (Hooykaas et al. 1977, Weller et al. 2004). Dicho plásmido Ti o Ri puede estar alternativamente "desarmado", y ser incapaz de ocasionar la proliferación de la célula vegetal. Puesto que Rhizobium y Agrobacterium tienen diferentes mecanismos de infección, la infección profunda por Rhizobium u otra Rhizobia a través de su hebra para infección puede incrementar la frecuencia de la transformación de la línea germinal de un gen de interés durante la transformación con el frijol de soya una vez que el plásmido ayudador Ti o Ri es introducido. La presente invención abarca el uso de cepas bacterianas para introducir uno o más componentes genéticos dentro de las plantas. En una modalidad, los hospederos contienen plásmidos Ti o Ri desarmados que no contienen los oncogenes que ocasionan tumorigénesis o rizogénesis, derivados de los cuales se utilizan como los vectores y contienen los genes de interés que se introducen subsecuentemente dentro de las plantas. En otra modalidad, la bacteria para transferencia del ADN dentro de las células vegetales por medio de un mecanismo independiente de T4SS, es decir transferencia conjugal mediada por or/T. Las funciones necesarias para la transferencia de ADN independiente de T4SS pueden residir en el plásmido que contiene el ADN a ser transferido, o puede residir en el cromosoma o en otro plásmido, incluyendo un plásmido Ti o Ri, también presente en dicha célula bacteriana. Las especies y cepas bacterianas incluyen pero no se limitan a Rhizobium sp., Rhizobium sp. NGR234, Rhizobium leguminosarum Madison, R. leguminosarum USDA2370, R. leguminosarum USDA2408, R. leguminosarum USDA2668, R. leguminosarum 2370G, R. leguminosarum 2370LBA, R. leguminosarum 2048G, R. leguminosarum 2048LBA, R. leguminosarum bv. phaseoli, R. leguminosarum bv. phaseoli 2668G, R. leguminosarum bv. phaseoli 2668LBA, R. leguminosarum RL542C, R. leguminosarum bv. viciae, R. leguminosarum bv. trifolii, Rhizobium etli USDA 9032, R. etli bv phaseoli, Rhizobium tropici, Mesorhizobium sp., Mesorhizobium loti ML542G, M. loti ML4404, Sinorhizobium sp., Sinorhizobium meliloti SD630, S. meliloti USDA1002, Sinorhizobium fredii USDA205, S. fredii SF542G, S. fredii SF4404, S. fredii SM542C, Bradyrhizobium sp., Bradyrhizobium japonicum USDA 6, 8. japonicum USDA 1 10. Se puede utilizar cualquier medio para cultivo vegetal adecuado para desarrollar o mantener un cultivo de tejido vegetal, suplementado como sea apropiado con reguladores del crecimiento vegetal adicionales incluyendo pero no limitados a auxinas tales como picloram (ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolinico), 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y dicamba (ácido 3,6-dicloroanisico); citoquininas tales como BAP (6-bencilaminopurina) y cinetina; ABA; y giberelinas. Otros medios aditivos pueden incluir pero no se limitan a aminoácidos, macro elementos, hierro, microelementos, inositol, vitaminas y orgánicos, carbohidratos, componentes no definidos del medio tales como hidrolizados de caseína, con o sin un agente gelificante apropiado tal como una forma de agar, tal como una agarosa de bajo punto de fusión o Gelrite si se desea. Aquellos expertos en la técnica están familiarizados con la variedad de medios de cultivo de tejidos, los cuales cuando se suplementan de manera apropiada, mantienen el crecimiento y desarrollo del tejido vegetal y son adecuados para transformación vegetal y regeneración. Estos medios para cultivo de tejidos pueden obtenerse ya sea como una preparación comercial, o se preparan y modifican de manera habitual. Los ejemplos de dichos medios podrían incluir pero no se limitan a Murashige y Skoog (1962), N6 (Chu et al., 1975), Linsmaier y Skoog (1965), Uchimiya y Murashige (1962), medio de Gamborg (Gamborg et al. , 1968), medio D (Duncan et al., 1985), medio para planta leñosa de McCown (McCown y Lloyd, 1981), Nitsch y Nitsch (1969), y Schenk y Hildebrandt (1972) o derivaciones de estos medios suplementados de manera adecuada. Aquellos expertos en la técnica están conscientes que los medios y suplementos de medio tales como nutrientes y reguladores del crecimiento para uso en la transformación y regeneración y otras condiciones de cultivo tales como la intensidad de la luz durante la incubación, pH, y temperaturas de incubación que se pueden optimizar para la variedad de interés particular. Después de que un tejido transformable es aislado o desarrollado en cultivo de tejido, o que el tejido vegetal transformable se identifica y/o se prepara in planta, el siguiente paso del método es la introducción de los componentes genéticos dentro del tejido vegetal. Este procedimiento también se refiere en la presente invención como "transformación." Las células vegetales se transforman y opcionalmente se someten a un paso seleccionable. Los transformantes independientes se refieren como eventos genéticos. Se han reportado numerosos métodos que utilizan cepas de Agrobacterium y se pueden utilizar para insertar componentes genéticos dentro del tejido vegetal transformable. Sin embargo, las especies no Agrobacterium spp. típicamente no han sido utilizadas para transformar plantas. Aquellos expertos en la técnica están conscientes de los pasos típicos en el procedimiento de transformación vegetal. La Rhizobia a ser utilizada se puede preparar ya sea mediante la inoculación de un medio líquido tales como medio TY o YEM (Beringer et al., 1974) directamente a partir de un cultivo para almacenamiento en glicerol o de un cultivo en placa de la bacteria sobre un medio solidificado a partir del cultivo para almacenamiento en glicerol, permitiendo que las bacterias crezcan bajo las condiciones selectivas apropiadas. La Rhizobia puede ser "pre-inducida" mediante crecimiento bajo condiciones nutricionales o de cultivo incluyendo la presencia de acetosiringona en una cantidad que facilita la transformación. Aquellos expertos en la técnica están familiarizados con procedimientos para crecimiento y condiciones adecuadas de cultivo para las bacterias así como con los procedimientos subsecuentes de inoculación. La densidad del cultivo bacteriano utilizado para inoculación y la relación del número de células bacterianas para equivaler al explante tejido pueden variar de un sistema al siguiente, y por lo tanto se espera la optimización de estos parámetros para cualquier método de transformación. La siguiente etapa del proceso de transformación es la inoculación. En esta etapa las plantas preparadas de manera adecuada, tejidos vegetales, o explantes, y la suspensión de células bacterianas se mezclan juntas. La duración y condición de la inoculación y la densidad de la célula bacteriana variarán dependiendo del sistema de transformación vegetal. El crecimiento o la inoculación de las bacterias transformantes puede ocurrir en la presencia de acetosiringona, o de otros inductores de la expresión conocidos de los genes de virulencia localizados en los plásmidos Ti o Ri. En ciertas modalidades, el crecimiento de las bacterias diferentes a Agrobacterium sp. se realiza bajo condiciones para minimizar la producción de polisacárido durante el crecimiento en medio para inducción. En modalidades particulares, la fuente de carbono utilizada para minimizar la producción de polisacárido durante el crecimiento de la Rhizobia en medio para inducción es glucosa en medio AB-TY, o L-arabinosa y gluconato de potasio en medio ATA. Después de la inoculación se puede remover cualquier exceso de la suspensión bacteriana y las bacterias y el material vegetal blanco son co-cultivados. El co-cultivo se refiere al tiempo de post-inoculación y antes de la transferencia a un medio para retraso o medio seleccionable opcional. Se puede utilizar cualquier variedad de medios para cultivo de tejido vegetal para el paso de co-cultivo. Los tejidos vegetales después de la inoculación con las bacterias se pueden cultivar en un medio líquido o semi-sólido. El co-cultivo típicamente se lleva a cabo por aproximadamente uno a cuatro días. Después del co-cultivo con bacterias, los tejidos vegetales o explantes inoculados opcionalmente se pueden colocar directamente sobre medio selectivo. Alternativamente, después del co-cultivo con bacterias, éstos se pueden colocar sobre medio sin el agente selectivo y subsecuentemente se colocan sobre un medio selectivo. Aquellos expertos en la técnica están conscientes de las numerosas modificaciones en los regímenes selectivos, medios, y condiciones de crecimiento que pueden variar dependiendo del sistema vegetal y el agente selectivo. Los agentes selectivos típicos incluyen pero no se limitan a antibióticos tales como geneticina (G418), canamicina y paromomicina, o los herbicidas glifosato, glufosinato, y DICAMBA. Se pueden añadir componentes adicionales apropiados para el medio al medio seleccionable o de retraso para inhibir el crecimiento bacteriano. Dichos componentes del medio pueden incluir, pero no se limitan a, antibióticos tales como carbenicilina o cefotaxima. Los cultivos se transfieren subsecuentemente a un medio adecuado para la recuperación de las plántulas transformadas. Aquellos expertos en la técnica están conscientes de los numerosos métodos para la recuperación de plantas transformadas. Se pueden incrementar y optimizar una variedad de medios y de requerimientos para transferencia para cada sistema vegetal para transformación vegetal y recuperación de plantas transgénicas. Consecuentemente, dichos medios y condiciones de cultivo descritas en la presente invención se pueden modificar o sustituir con componentes nutricionalmente equivalentes, o procesos similares para selección y recuperación de eventos transgénicos, y aún así caen dentro del alcance de la presente invención. Una vez que el tejido vegetal transformable se ha inoculado, las células vegetales en el tejido se pueden transformar, y se seleccionan las células vegetales independientemente transformadas. Los transformantes independientes se refieren como eventos transgénicos. Los sistemas de transformación mediada por Agrobacterium y regeneración para muchas especies vegetales monocotiledóneas y dicotiledóneas se conocen en la técnica (por ejemplo Komari et al. , 1998; Zhou et al. 1995; Hiei et al., 1994. Plant J.; 6: 271 -282; Ishida et al. 1996; Rogers et al. , 1987; Schrammeijer et al., 1990; Patente de E.U.A. 6,384,301 ), aunque el uso de Rhizobia para la transformación de células vegetales se ha reportado solamente para el tabaco, Arabidopsis, y el arroz (Broothaerts et al., 2005). Después de la transformación y regeneración, se identifican las plantas transgénicas. Finalmente, un experto en la técnica reconocerá que después de que el cassette de expresión se incorpora de manera estable en las plantas transgénicas y se confirma que se encuentra operable, éste se puede introducir dentro de otras plantas mediante cruza sexual. Se puede utilizar cualquiera de numerosas técnicas de cruza estándar, dependiendo de las especies a ser cruzadas. Los transformantes producidos, y su progenie, se pueden analizar subsecuentemente para determinar la presencia o ausencia de un ácido nucléico particular de interés contenido en el vector para transformación. Los análisis moleculares pueden incluir pero no se limitan a Southern blots (Southern, 1975), análisis por PCR (reacción en cadena de la polimerasa), análisis de las actividades enzimáticas, métodos de inmunodiagnósttco, y evaluaciones en campo y los similares (También véase, por ejemplo, Sambrook et al. , 1989). Estos y otros métodos bien conocidos se pueden llevar a cabo para confirmar la estabilidad de las plantas transformadas producidas por los métodos descritos. Las técnicas anteriormente descritas pueden ser adecuadas para cualquier planta y son especialmente útiles para plantas tales como alfalfa, cebada, frijoles, remolacha, brócoli, calabaza, zanahoria, cañóla, coliflor, apio, calabaza china, maíz, algodón, pepino, frijol seco, berenjena, hinojo, frijoles de jardín, calabaza, puerro, lechuga, melón, avena, okra, cebolla, guisante, pimiento, calabaza, cacahuate, patata, calabaza, rábano, arroz, sorgo, frijol de soya, espinaca, zapallo, maíz dulce, remolacha azucarera, girasol, tomate, sandía, y trigo.

EJEMPLOS Aquellos expertos en la técnica apreciarán las muchas ventajas de los métodos y composiciones provistas por la presente invención. Se incluyen los siguientes ejemplos para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Se debe apreciar por aquellos expertos en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos a continuación representan técnicas descubiertas por los inventores para funcionar bien en la práctica de la invención, y por lo tanto se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica deben apreciar, a la luz de la presente descripción, que se pueden realizar muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y aún así obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Todas las referencias citadas en la presente invención se incorporan aquí como referencias hasta el grado en que suplementen, expliquen, provean un antecedente para, o enseñen metodología, técnicas, o composiciones empleadas en la presente invención.

EJEMPLO 1 Cepas de Rhizobium y Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens AGLO se obtuvo a partir de ATCC (ATCC número: BAA- 00™, Lazo ef al., 1991 ). Rhizobium leguminosarum cepa Madison y Sinorhizobium meliloti SD630 se aislaron a partir de maleza de trébol en un jardín casero en Madison, Wl, EUA, y se confirmaron mediante la secuenciación del producto de PCR de un ARNr 16S amplificado con los siguientes iniciadores: 5' GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3' (Xd578; SEQ ID NO: 1 ) y 5' AAGGAGGTGATCCAGCCGCAG 3' (Xd579; SEQ ID NO: 2). Se obtuvieron otras cepas de Rhizobium a partir del centro de recolección USDA Rhizobium (cuadro 1 ). Las cepas de Rhizobium se crecieron en medio TY o MAG y Agrobacterium en medio LB. Las cepas se muestran a continuación y las secuencias de ARNr 16s amplificadas en cepas aisladas se proveen como SEQ ID NOs: 24-30.

CUADRO 1 Cepas de Aqrobacteríum y Rhizobi'um Nombre de la cepa Plásmido Ti Fuente A. tumefaciens AGLO pTiBo542 ATCC; lazo er a/., 1991 A. tumefaciens LBA4404 pAL4404 Hoekema et al., 1983 A. tumefaciens AGLOC pTiBo542C Este estudio (kanR) A. tumefaciens AGLOG pTiBo542G Este estudio (kanK) A. tumefaciens 4404TIK pTi4404kan Este estudio (kanR) A. tumefaciens ABI pT¡C58 (kanR, Monsanto gentR) Rhizobium leguminosarum Ninguno Este estudio Madison Sinorhizobium meliloti SD630 Ninguno Este estudio Rhizobium leguminosarum Ninguno Centro de recolección USDA2370 USDA rhizobium Rhizobium leguminosarum bv. Ninguno Centro de recolección trifolii USDA2048 USDA rhizobium Rhizobium leguminosarum bv. Ninguno Centro de recolección phaseoli USDA2668 USDA rhizobium Sinorhizobium fredii USDA205 Ninguno Centro de recolección USDA rhizobium Sinorhizobium meliloti USD A1002 Ninguno Centro de recolección USDA rhizobium Mesorhizobium loti USDA 3471 Ninguno Centro de recolección USDA rhizobium Bradyrhizobium japonicum USDA 6 Ninguno Centro de recolección USDA rhizobium Bradyrhizobium japonicum USDA Ninguno Centro de recolección 110 USDA rhizobium Rhizobium etli USDA 9032 (CFN42) Ninguno Centro de recolección USDA rhizobium R. leguminosarum 2370G pTiBo542G Este estudio R. leguminosarum 2370LBA pTi4404kan Este estudio R. leguminosarum bv. trifolii 2048G pTiBo542G Este estudio R. leguminosarum bv. trifolii pTi4404kan Este estudio 2048LBA R. leguminosarum bv. phaseoli pT¡Bo542G Este estudio 2668G R. leguminosarum bv. phaseoli pTi4404kan Este estudio 2668LBA R. leguminosarum RL542C pTiBo542C Este estudio S. fredii SF542G pT¡Bo542G Este estudio S. fredii SF4404 pTi4404kan Este estudio S. Meliloti SM542C pTiBo542C Este estudio M. Loti ML542G pT¡Bo542G Este estudio M. Loti ML4404 pTi4404kan Este estudio EJEMPLO 2 Transformación de Aqrobacterium Las células competentes de Agrobacterium se prepararon mediante lavado de un cultivo en fase log en medio LB con agua deionizada enfriada con hielo y 10% de glicerol, y se almacenaron a -80°C. Se mezclaron cincuenta microlitros de células competentes descongeladas con 1 ó 2 µ? de ADN en hielo y se sometieron a electroporación en una cubeta con 1 mm de separación con 200 ohm de resistencia, 25 pF de capacidad y 1.8 kv utilizando un instrumento BIO-RAD Gene Pulser® II (BIO-RAD, Hercules, CA).

EJEMPLO 3 Construcción de plásmidos Ti con un gen marcador seleccionable por antibiótico Para seleccionar los plásmidos Ti en Rhizobium spp., se amplificó una secuencia homologa a partir de un plásmido Ti correspondiente y se insertó dentro de un vector para resistencia a canamicina. La secuencia homologa se utilizó para integrar el gen de resistencia a canamicina dentro del plásmido Ti mediante recombinación homologa. Para construir el plásmido pTiBo542C, todo el gen virC (Acceso GenBank número AB027257) a partir de la cepa AGLO Agrobacterium se amplificó con PCR utilizando los siguientes iniciadores 5' ACAATAATGTGTGTTGTTAAGTCTTGTTGC 3' (Xd683 SEQ ID NO: 3) y 5' CTCAAACCTACACTCAATATTTGGTGAG 3' (Xd684 SEQ ID NO: 4) y Pfu polimerasa (STRATAGENE, La Jolla, CA) y se insertó dentro del vector para clonación de extremos romos TOPO (Invitrogen Carlsbad, CA) dando lugar a un vector intermedio pMON67402. El vector intermedio se ligó adicionalmente a un fragmento trfA a partir de pCGN1 206 digerido con Pvull/Mscl, lo cual resultó en la construcción pMON96913 (figura 6). Luego el vector se introdujo dentro de la cepa AGLO de Agrobacterium mediante electroporación estándar como se describió anteriormente, y se sembraron sobre medio LB con canamicina 50 mg/l para seleccionar un evento de cruza particular. Puesto que el vector de integración no se mantiene dentro de las células AGLO, las colonias resistentes presumiblemente se debieron a la integración del vector dentro de un plásmido Ti mediante recombinación homologa. La cepa resultante se designó AGLOC. De manera similar, para construir el plásmido pTi542G, toda la secuencia virG (Acceso GenBank número AB027257) a partir de la cepa AGLO de Agrobacteríum se amplificó mediante PCR utilizando 5' AGATCTGGCTCGCGGCGGACGCAC 3' (Xd681 ; SEQ ID NO: 5) y 5' CGCTCGCGTCATTCTTTGCTGGAG 3' (Xd682; SEQ ID NO: 6) con Pfu polimerasa y de insertó dentro de pMON67402, lo cual resultó en la construcción pMON96026 (figura 8). Este vector se introdujo dentro de la cepa AGLO mediante electroporacion estándar y se sembró sobre medio LB con canamicina 50 mg/l para seleccionar un evento de cruza particular. La cepa resultante se designó AGLOG. Con el objeto de construir el plásmido ayudador pTi4404kan, la región tral y trbCE del plásmido Ti de la octopina pAL4404 (Acceso GenBank número NC_002377) a partir de LBA4404 se amplificó mediante PCR con los iniciadores 5' TCAGCAGGATGACGCCGTTATCG 3' (Xd695; SEQ ID NO: 7) y 5' TCTCGCCCGACCAATACCAACAC 3" (Xd696; SEQ ID NO: 8) (secuencia a partir de Genbank AF242881) con Pfu polimerasa, y se insertó dentro de pMON67402. El vector intermedio se ligó adicionalmente a un fragmento trfA a partir de pCGN1 1206 digerido con Pvull/Mscl, lo cual resultó en la construcción pMON96914 (figura 7). Este vector plasmídico se introdujo dentro de LBA4404 mediante electroporación y se seleccionó en medio LB con canamicina 50 mg/l para seleccionar un evento de cruza particular. Después de un cultivo de tres días en medio sólido, las colonias resistentes a kanR se transfirieron dentro de 2 mis de medio LB líquido con canamicina 50 mg/l. Un microlitro del cultivo que se mantuvo durante toda la noche se amplificó directamente con la polimerasa Taq YieldAce® siguiendo las instrucciones del fabricante (Stratagene) con los siguientes iniciadores: 5' GCTGACGGGCCCGGATGAATGTCAGCTACTG 3' (Xd715¡ SEQ ID NO: 9) y 5" GCTCTAGAAATTGTAAGCGTTAATAATTCAGAAGAACTCGTC 3' (Xd716; SEQ ID NO: 10) y se confirmó la integración del gen para resistencia a canamicina dentro de los plásmidos Ti. La cepa resultante se designó como 4404TIK.

EJEMPLO 4 Extracción de los plásmidos Ti a partir de Aprobacterium Los plásmidos Ti modificados, pTiBo542C, pT¡Bo542G, pTi4404kan y pTiC58 (ABI), se extrajeron a partir de las cepas modificadas de Agrobacterium AGLOC, AGLOG, 4404TIK y ABI, que contenían los plásmidos respectivos. Cinco mililitros del cultivo durante toda la noche en LB con canamicina 50 mg/l se centrifugaron, se resuspendieron en 400 µ? de regulador de pH P1 , se mezclaron con 400 pl de regulador de pH P2, neutralizado con 400 pl de regulador de pH P3 (reguladores de pH a partir del equipo maxi-prep de QIAGEN). Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, la mezcla se centrifugó por 10 minutos a 12g a 4°C. Aproximadamente 1200 µ? del sobrenadante se mezclaron con 800 pl de isopropanol y se centrifugaron por 10 minutos a 4°C. El concentrado se lavó con 70% de etanol una vez y se resuspendió en 200 µ? de TE sin secar. Los mega plásmidos se almacenaron subsecuentemente a 4°C.

EJEMPLO 5 Células competentes de Rhizobia e introducción de los plásmidos Ti modificados dentro de Rhizobia Las células competentes de Rhizobia se prepararon de conformidad con Garg et al. 1999 con modificaciones. Brevemente, se creció una asada de células de Rhizobia (por ejemplo Rhizobium) a partir de un cultivo para almacenamiento en glicerol congelado en 10 mililitros de caldo TY por 24 horas, y luego se transfirieron a 500 mi de caldo TY a 30°C con agitación vigorosa y se dejaron crecer hasta fase logarítmica media (DO6oo = 0.4-0.6). El cultivo se transfirió dentro de dos tubos para centrífuga 250, se enfrió con hielo por 15-30 minutos y centrifugó a 9,000 rpm por 10 minutos a 4°C para cosechar las células. El concentrado de células se lavó con agua deionizada estéril fría, y con 10% de glicerol frío y se resuspendió en 10% de glicerol frío. La suspensión celular fue alicuotada a 50 µ?/tubo para uso inmediato o se congeló en nitrógeno liquido y se almacenó a -80 C. Electroporación de los plásmidos Ti modificados dentro de las cepas de Rhizobia: Cincuenta microlitros de las células competentes se descongelaron sobre hielo, se mezclaron con 1 ó 2 piltros del plásmido Ti preparado, y se mantuvieron sobre hielo por 30 minutos. La mezcla se transfirió dentro de una cubeta para electroporación con 1 mm de separación enfriada. Los parámetros de electroporación (BIO-RAD Gene Pulser® I I) se establecieron como sigue: 2 KV/400 O resistencia/25 pF capacidad o 1 .5 KV/400 O resistencia/25 pF capacidad o 1 .5 KV/800 O resistencia/10 pF capacidad. Después de la electroporación, la cubeta se mantuvo sobre hielo por 5-10 minutos antes de añadir 1 mi de medio TY o MAG y se transfirió dentro de un tubo Falcon de 14 mi. El tubo de cultivó por 3 horas a 30°C, se sembró sobre medio sólido TY o MAG con 50 mg/l de canamicina y se cultivó a 30°C por tres días para recuperar las colonias resistentes.

Confirmación de Rhizobia transformada con plásmidos Ti: Las colonias resistentes a canamicina de transfirieron dentro de 3 mililitros de medio líquido TY o MAG con 50 mg/l de canamicina y se cultivaron durante toda la noche. Un microlitro del cultivo se amplificó directamente con Taq polimerasa YieldAce® siguiendo las instrucciones del fabricante (Stratagene). Para detectar pTiBo542C o pTiBo542G las cepas de Rhizobia, los iniciadores virC 5' ACAATAATGTGTGTTGTTAAGTCTTGTTGC 3' (Xd683; SEQ ID NO: 3) y 5' CAATTGCATTTGGCTCTTAATTATCTGG 3' (Xd684a; SEQ ID NO: 1 1 ) o los iniciadores virG 5' AGATCTGGCTCGCGGCGGACGCAC 3' (Xd681 ; SEQ ID NO: 5) y 5' CGCTCGCGTCATTCTTTGCTGGAG 3' (Xd682; SEQ ID NO: 6) se utilizaron para amplificar un fragmento de 2.35 kb o de 1.2 kb, respectivamente. Para el plásmido pTi4404kan, se utilizaron los siguientes iniciadores: 5' GCATGCCCGATCGCGCTCAAGTAATC 3' (Xd699; SEQ ID NO: 12) y 5' TCTAGGTCCCCCCGCGCCCATCG 3' (Xd700; SEQ ID NO: 13)) amplifica una secuencia codificante w'rD2 de 1274 pb para el plásmido Ti de la octopina; 5" CCATGGATCTTTCTGGCAATGAGAAATC 3' (Xd701 ; SEQ ID NO: 14) y 5' GTCAAAAGCTGTTGACGCTTTGGCTACG 3' (Xd702: SEQ ID NO: 15) amplifica un fragmento w'rE2 de 1602 pb; 5' ACGGGAGAGGCGGTGTTAGTTGC 3' (Xd703; SEQ ID NO: 16) y 5' CGATAGCGACAATGCCGAGAACG 3' (Xd704; SEQ ID NO: 17) amplifica aproximadamente un fragmento virB1 de 0.9 kb. Con el objeto de identificar el plásmido pTiC58 a partir de la cepa ABI, se utilizaron tres pares de iniciadores: 5' ATGCCCGATCGAGCTCAAGTTATC 3' (Xd685; SEQ ID NO: 18) y 5' TGAAAGGACACCTCTCCGTTGCTG 3' (Xd686; SEQ ID NO: 19) amplifica un fragmento virD2 de 1247 pb; 5' CCATGGATCCGAAGGCCGAAGGCAATG 3' (Xd687; SEQ ID NO: 20) y 5' CTACAGACTGTTTACGGTTGGGC 3' (Xd688; SEQ ID NO: 21 ) amplifica una secuencia codificante total de 'rE2 de 1670 pb; 5' GTGAGCAAAGCCGCTGCCATATC 3' (Xd689; SEQ ID NO: 22) y 5' TAGAGCGTCTGCTTGGTTAAACC 3' (Xd690; SEQ ID NO: 23) amplifica un fragmento parcial de repA de 1 102 pb.

EJEMPLO 6 Medios para crecimiento bacteriano Los medios utilizados para crecimiento de Rhizobia en el protocolo de transformación mediado por Rhizobia empleados para desarrollar las plantas transformadas se prepararon utilizando métodos estándares conocidos por un experto en la técnica. Las formulaciones de los medios son como sigue: Medio TY por L Bactotriptona 5 g/L Extracto de levadura 3 g/L CaCI2.2H2O 0.87 g/L pH 7.0 Para medio TY sólido, añada 15 g/l de Bacto-Agar antes de someter al autoclave.

Medio liquido MAG (a partir del USDA Rhizobium centro de recolección) HEPES 1 .3 g/L MES 1.1 g/L Extracto de levadura 1 g/L L-arabinosa 1 g/L Gluconato de potasio 1 g/L Na2S04 0.25 g/L pH 6.6 con KOH Someta al autoclave y añada la siguiente solución de almacenamiento esterilizada por filtración: NH4CI (16 g/ 00 mi) 2 ml/l FeCI3 (0.67 g/100 mi, FS) 1 .0 ml/l CaCI2 (1.5 g/100 mi) 1 .0 ml/l MgS04 (18 g/100 mi) 1.0 mi NaMo04. 2H20 (1 g/100 mi) 1 .0 ml/l NiCI2. 6H2O (2.2 g/100 mi) 0.1 ml/l Para medio MAG sólido, añada 15 g/l de Bacto-Agar antes de someter al autoclave.

Medio LB Por litro Bacto-triptona 10 g Bacto extracto de levadura 5 g NaCI 10 g Ajuste el pH a 7.5 con hidróxido de sodio. Después de someter al autoclave, distribuya en una placa para cultivo (25 ml/placa) Para medio LB sólido, añada 15 g/l de Bacto-Agar antes de someter al autoclave Medio mínimo AB: Regulador de pH AB 20x: K2HP04 60 g/l NaH2PO4 20 g/l Someta al autoclave separadamente Sales AB 20x (Esterilizada mediante filtración, mantenida en oscuridad): NH4CI 20 g/l MgS04.7H20 6 g/l KCI 3 g/l CaCI2 0.2 g/l FeS04.7H20 50 mg/l H a 7 antes de someter al autoclave Combine 50 mi del regulador de pH AB y 50 mi de las sales AB con 900 mi sacarosa-agua (la concentración final de sacarosa es un litro es de 0.5%). Medio para inducción AB-TY 1 : Glucosa 5 g Regulador de pH AB 20x 50 mi Solución de almacenamiento de sal AB 20X 50 mi Medio TY 20 mi Añada agua estéril hasta 000 mi Ajuste a pH 5.4 con MES 100 mM Añada acetosiringona 100 µ? (solución de almacenamiento 1 M en DMSO; añada 1 pl de la solución de almacenamiento/10 mi del medio después de la suspensión de las bacterias) Medio ATA para inducción por vir en Rhizobium: El medio ATA (medio mínimo AB +TY + arabinosa) se modificó a partir del medio AB-TY utilizando arabinosa y gluconato de potasio para reemplazar la glucosa. La velocidad de crecimiento de todas las Rhizobia casi se duplicó en este medio. Las bacterias produjeron mucho menos polisacárido en este medio y los concentrados bacterianos fueron mucho más fuertes.

L-arabinosa 1 g/L Gluconato de potasio 1 g/L Regulador de pH AB 20x 50 ml Solución de almacenamiento de sal AB 20x 50 ml Medio TY 20 ml Añada agua estéril hasta 1000 ml pH 5.4 con MES 100 mM Añada acetosiringona 200 µ? (solución de almacenamiento 1 M en DMSO) después de la resuspensión de las bacterias.

EJEMPLO 7 Vectores para transformación de cosecha para uso en cepas modificadas de Rhizobia Los vectores para la transformación de Rhizobium se construyeron utilizando técnicas moleculares estándares conocidas por aquellos expertos en la técnica. Se emplearon las construcciones plasmídicas pMON96033 (figura 1 ; para la transformación de frijol de soya y cañóla), pMON96036 (figura 2; para la transformación del maíz), o pMON101316 (figura 3; para la transformación del algodón). Las tres construcciones contenían un origen de replicación pVS1 , y cualquier gen reportero GUS, GFP, o ambos genes reporteros. Los plásmidos recombinantes se transfirieron dentro de diversas cepas modificadas de Rhizobia mediante electroporación y se confirmaron mediante digestión con enzima de restricción del ADN de miniprep. El gen FMV CP4 utilizado en la construcción de los plásmidos tiene un promotor a partir del virus del mosaico de la escrofularia (FMV) seguido por el gen CP4syn, un gen sintético que codifica la CP4 EPSP sintasa. Véase, la Patente de E.U.A. No. 5,633,435, la cual se incorpora en la presente invención como referencia. EPSP sintasa, cuando se expresa, confiere un grado sustancial de resistencia al glifosato a la célula vegetal y plantas generadas a partir de ésta. El gen e35s GUS es un gen de la ß-glucuronidasa, el cual se utiliza típicamente como un marcador histoquimico, detrás del promotor e35S. El gen FMV GUS es el promotor FMV con GUS. El gen NOS NPTII tiene un gen de neomicina fosfotransferasa, el cual confiere resistencia a la canamicina, detrás del promotor para el gen de la nopalina sintasa (NOS). El gen Act 1 GFP tiene un promotor de actina a partir del arroz y el gen para la proteína fluorescente verde, el cual es un marcador registrable. El gen e35s GFP es el gen para la proteína fluorescente verde detrás del promotor e35S. Los cultivos durante toda la noche de una cepa de Rhizobia que contenían el plásmido utilizado se crecieron hasta una fase logarítmica y luego se diluyeron hasta una densidad óptica final de 0.3 a 0.6.

EJEMPLO 8 Transformación de frijol de soya mediada por Rhizobia La transformación se llevó a cabo utilizando un procedimiento de organogénesis, como se describió por Martinell et al. (Patente de E.U.A. 7,002,058), con modificaciones. pMON96033 que contenía los genes GUS y CP4 se transfirió dentro de diversas cepas modificadas de Rhizobia (por ejemplo Rhizobium sp., Mesorhlzobium sp., Sinorhizobium sp.) mediante electroporación. Las colonias únicas fueron recuperadas en medio MAG o TY con 50 mg/l. de espectinomicina y 50 mg/l de canamicina y se inocularon en 20-50 mililitros de medio liquido TY con la misma selección en un agitador a 30°C a 200 rpm. La presencia del plásmido en el cultivo de Rhizobia se verificó mediante digestión con enzima de restricción del plásmido preparado en mini-prep a partir de 10 mi de cultivo. El cultivo líquido remanente se mezcló con glicerol hasta una concentración final de 20%, se alicuotó y se almacenó a -80°C como cultivos semilla. Para preparar el inoculo de Rhizobia, se inocularon 0.25-1 mi de cultivo semilla congelado en 250 ó 500 mililitros de medio TY con la misma selección de antibiótico que se mencionó anteriormente y se crecieron durante toda la noche a 28°C con agitación a 200 rpm hasta una fase media de crecimiento logarítmico. El cultivo se centrifugó y se suspendió directamente en un medio para inoculación (medio INO) a la concentración de DO660 de aproximadamente 0.3.

Los cultivos inducidos con Rhizobia también se utilizaron en la transformación del frijol de soya. Para inducir la Rhizobia, el cultivo durante toda la noche se resuspendió en medio AB-TY a una ??ßß? de aproximadamente 0.3 y se añadió acetosiringona a una concentración final de 100 µ?. El cultivo se agitó adicionalmente durante toda la noche a 28°C, se centrifugó y se re-suspendió en el medio para inoculación (medio INO) a una concentración de DO660 de aproximadamente 0.3. El cultivar del frijol de soya A3525 (Patente de E.U.A. 7,002,058) se utilizó para la transformación mediada por Rhizobia. El método se modificó para transformación mediada por Rhizobia como sigue. Las semillas de frijol de soya se germinaron a temperatura ambiente en medio BGM y los explantes del meristemo a partir de las semillas maduras de soya se extirparon mediante una máquina (Solicitud U.S. 20050005321 ). Los explantes del meristemo de frijol de soya en una tapa PLANTCON se mezclaron con suspensión de Rhizobia en medio INO y se sonicaron en un Sonicador W-1 13 (Honda Electronics Co., Ltd, Aichi, Japón). Después de la sonicación, los explantes se co-cultivaron en la misma PLANTCON por 1 -1 1 días a 23°C con un fotoperíodo de luz-oscuridad de 16/8 horas. Los explantes se transfirieron entonces sobre la superficie del medio seleccionable WPM que contenía glifosato 75 µ?. Después de 2 semanas, los explantes se transfirieron de nuevo a medio sólido WPM con glifosato 75 µ?. Los brotes con trifolia completamente desarrollada se recuperaron después de 6-10 semanas de post-inoculación y formaron raíces en medio BRM (opcionalmente con fungicida) que contenia IAA 0.1 mg/l y selección con glifosato 25 µ?. Las plántulas con raices se transfirieron al invernadero para madurez.

CUADRO 2 Componentes del medio para transformación de la soya Medio BGM para germinación de semilla de frijol de soya Cantidad/1 Compuesto 0.505 g Nitrato de postasio 0.24 g Nitrato de amonio 0.493 g Sulfato de magnesio 0.176 g Cloruro de calcio 27.2 mg Fosfato monobásico de potasio 1.86 mg Acido bórico 5.07 mg Sulfato de manganeso 2.58 mg Sulfato de zinc 0.249 mg Yoduro de potasio 0.216 mg Molibdato de sodio 0.0008 mg Sulfato de cobre Solución de almacenamiento de cloruro de 0.0008 MG cobalto 3.36 MG EDTA disódico 2.49 MG Sulfato ferroso 1.34 MG Tiamina HCI 0.5 MG Acido nicotínico 0.82 MG Piridoxina HCI 20 G/L Sacarosa (ultra pura) 125 MG Cefotaxima PH 5.6 Medio Ino para co-cultivo de soya Cantidad/I Compuesto 1/10x de medio Gamborg B5 en componentes de micronutrientes y vitamina; 2/5x de macronutrientes 1 9 Nitrato de potasio (KN03) 30 g Glucosa 3.9 g Mes (pH 5.4) Después de someter a autoclave, añada ácido lipóico al inóculo hasta una concentración final de 250 µ? MEDIO PARA FORMACIÓN DE BROTES DE SOYA CON WPM Cantidad/I Compuesto 2.41 g WPM en polvo (PhytoTech laboratories) 20 g Sacarosa (ultra pura) 1.29 g Gluconato de calcio (Sigma) 4.0 g AgarGel (pH 5.6) 5 mi Carbenicilina (40 mg/ml) Glifosato (0.5 FS de solución de 0.15 ml almacenamiento) (0.075 mm) Ingredientes para añadir después de mUL someter al autoclave 4 ml Cefotaxima (50 mg/ml) 1 ml Ticarcilina (100 mg / ml) Medio BRM para formación radicular Cantidad/I Compuesto 2.15 g MS en polvo (Phyt oteen) 0.1 g Mio-inositol 2 mg Glicina 0.5 mg Acido nicotínico 0.5 mg Piridoxina HCI 0.1 mg Tiamina HCI 30 g Sacarosa (ultra pura) 10 mi L-Cisteína (10 mg/ml) 8 g Agar lavado Ingredientes para añadir después de mUL someter al autoclave 5.0 IAA (0.033 mg/ml en KOH 1 m ) 1 mi Ticarcilina (100 mg / mi) Glifosato (0.5 FS de solución de 0.05 mi almacenamiento) (0.025 mm) El vector binario pMON96033 se transfirió dentro de las cepas de Rhizobia y se co-cultivó con explantes de meristemo de frijol de soya, y se observaron resultados positivos a GUS (cuadro 3 y figuras 4A-4H). S. meliloti, S. fredii, M. loti y una R. leguminosarum mostraron administración del ADN-T dentro de los explantes de frijol de soya demostrados por pequeñas manchas azules de actividad GUS. Las plantas transgénicas de frijol de soya se obtuvieron a partir de experimentos de transformación mediada por Rhizobia con diversas cepas (cuadro 4). La naturaleza transgénica de estas plantas de frijol de soya se confirmó mediante un ensayo del número de copias del transgén, en donde la mayoría de los transformantes revelaron un patrón de integración simple de 1 -2 copias, (cuadro 5).

CUADRO 3 Expresión transitoria del gen gus con administración del ADN-T mediada por Rhizobia en explantes de meristemo de frijol de soya* *período de 4 días de co-cultivo.

CUADRO 4 Resumen de la transformación de soya mediada por Rhizobia Cepas Explantes de Plantas TF soya con raíz RL 4404 3705 2 0.05% SF 4404 5553 2 0.04% SM 542c 2555 1 0.04% CUADRO 5 Ensayo del número de copias de las plantas transgénicas a partir de la transformación mediada por Rhizobia* *EI número de copias se analizó mediante el método INVADER (Third Wave Technologies, Madison, Wl) utilizando una sonda nos y comparando con un control interno del genoma. Para evaluar si el transgén gus se transmitía a la progenie de la semilla, se tiñeron las semillas de dos lineas transgénicas de soya derivadas de la transformación mediada por Rhizobia en una solución GUS (figura 5). Se encontró que la línea GM_A9196D tenía una copia del gen nos asociada como se ensayó por el método INVADER. Se ensayaron doce semillas R1 a partir de esta linea para GUS mediante tinción inmunohistoquímica después de embeber y remover la cubierta de la semilla, y 9 fueron positivas a GUS, indicando una proporción de segregación del 3:1 para una copia de inserto.

EJEMPLO 9 Transformación de la cañóla mediada por Rhizobia A. Preparación del inoculo de Rhizobium: Las cepas de Rhizobia con pMON96033 se utilizaron para transformación de cañóla. Las cepas de Rhizobia con el vector a partir de una solución de almacenamiento en glicerol se inocularon dentro de 10 mililitros de medio TY con 50 mg/l de canamicina y 50 mg/l de espectinomicina en un tubo Falcon de 50 mi y se agitaron a 28°C durante toda la noche a 200 rpm. El cultivo nocturno de Rhizobia se concentró mediante centrifugación y se resuspendió en medio liquido MG/L. (caldo MG/L: Manitol 5 g/l, ácido L-glutámico 1 g/l, KH2P04 250 mg/l, NaCI 100 mg/l, MgS047H20 100 mg/l, biotina 1 pg/l, extracto de levadura 2.5 g/l, pH7.0). La D06oo fue entre 0.05-0.1 .

B. Preparación y co-cultivo del explante de cañóla: La transformación de la cañóla se llevó a cabo de conformidad con la Patente de E.U.A. 5,750,871 y Radke et al., 1992. Se transfirieron aproximadamente 0.25 g de semilla de cañóla, cv. Ebony, dentro de un tubo Eppendorf de 1 .5 mi y se humedecieron con 95% de etanol. Para esterilizar las semillas, se añadió 1 mi de solución de hipoclorito de sodio al 1 % por 30 minutos. La solución de blanqueado se reemplazó con agua destilada y las semillas se enjuagaron varias veces. Las semillas se dispersaron sobre medio para germinación 1/10 MS y se mantuvieron en una incubadora Percival a 24°C con un fotoperíodo con 16 horas de luz. Medio para germinación de la semilla (medio 1/10 MS): Medio orgánico mínimo 1/ 0X MS (Gibco BRL; sacarosa final al 0.3%), piridoxina 50 pg/l, ácido nicotinico 50 pg/l, glicina 200 pg/l, PHYTAGAR (Gibco Invitrogen) 6 g/l, pH 5.8; 20). Las plántulas etioladas a partir de cultivos de 7-14 días de edad se utilizaron como la fuente del explante. Los explantes se inocularon en 1 x 08 bacterias/ml. La suspensión de Rhizobium se extrajo, y los explantes inoculados se colocaron sobre placas para co-cultivo en la parte superior del papel filtro, y se incubaron por aproximadamente 2 días a 24°C con luz continua. Los explantes co-cultivados se ensayaron para expresión de gus y se encontró que contenían manchas azules indicando la transformación de las células de cañóla (figuras 9A-9F). Medio para co-cultivo (MS-1 ):_Sales MS (Caisson Laboratories, Logan, UT), mio-inositol 100 mg/l, tiamina-HCI 1.3 mg/l, KH2P04 200 mg/l, 2,4-D 1 mg/l, sacarosa 3%, PHYTAGAR (Gibco Invitrogen) 7 g/l, pH 5.8. C. Inducción del callo: Los explantes co-cultivados se transfirieron a medio para inducción del callo (B5-1 ) por 6 días a 24°C con luz continua a ~ 100 pE/m2/s. Cinco cepas a partir de M. loti, R. leguminosarum, S. fredii y S. meliloti mostraron transferencia eficiente del gen dentro de los explantes de cañóla con una frecuencia de explantes positivos a gus en el intervalo de 21 % a 73% (figuras 10A-10E).

Medio para inducción del callo (B5-1 ): Sales B5 de Gamborg (Caisson Labs), vitaminas B5 (1 mg/l de ácido nicotinico, 1 mg/l de piridoxina-HCI, 10 mg/l de tiamina-HCI), 100 mg/l de inositol, 1 mg/l de 2,4-D, sacarosa 3%, carbenicilina (PhytoTechnology, Shawnee Mission, KS) se ajustaron a una potencia final de 325 mg/l, 50 mg/l de Timentin, 7 g/l de PHYTAGAR (Gibco Invitrogen), pH 5.8.

D. Regeneración y selección del brote: Los explantes que tenían callo se transfirieron a medio para regeneración de brote (B5BZ) con AgNÜ3 y se incubaron a 24°C con luz continua de 100 pE/m2/s por 14 días. A continuación los explantes se transfirieron a medio para regeneración de brote (B5BZ) sin AgNO3. Los brotes regenerados a partir de los callos seleccionados con glifosato se cosecharon ~ cada dos semanas. Un ejemplo de los brotes tempranos que muestran expresión de gus se muestra en la figura 1 1 . Medio para regeneración del brote con nitrato de plata (B5BZ + 3Ag): Sales B5 de Gamborg (Caisson Labs), vitaminas B5 (1 mg/l de ácido nicotinico, 1 mg/l de piridoxina-HCI, 10 mg/l de tiamina-HCI), 100 mg/l de inositol, BAP 3 mg/l (Sigma), zeatina 1 mg/l (Sigma), AgN03, 3 mg/l (Sigma), 45 mg/l de glifosato (Monsanto, 96.5% ácido seco), sacarosa 1 %, carbenicilina (PhytoTechnology) con potencia ajustada a 325 mg/l, 50 mg/l de Timentin, PHYTAGAR (Gibco Invitrogen) 7 mg/l, pH 5.8. Medio para regeneración del brote (B5BZ): Sales B5 de Gamborg (Caisson Labs), vitaminas B5 (1 mg/l de ácido nicotínico, 1 mg/l de piridoxina-HCI, 10 mg/l de tiamina-HCI), 100 mg/l de inositol, BAP 3 mg/l (Sigma, zeatina 1 mg/l (Sigma), 45 mg/l de glifosato, sacarosa 1 %, carbenicilina (PhytoTechnology) con potencia ajustada a 325 mg/l, Timentin 50 mg/l, PHYTAGAR (Gibco Invitrogen) 7 mg/l, pH 5.8.

E. Cosecha del brote: Los brotes verdes de al menos 0.5 cm de longitud fueron podados para aislar el eje principal. Los brotes podados se colocaron sobre medio para cosecha de brote (B5-0). Los brotes se transfirieron al medio para formación de raíz después de 2 semanas. Medio para cosecha del brote (B5-0): Sales B5 de Gamborg (Caisson Labs), vitaminas B5 (1 mg/l de ácido nicotínico, 1 mg/l de píridoxina-HCI, 10 mg/l de tiamina-HCI), 100 mg/l de inositol, carbenicilina (PhytoTechnology) con potencia ajustada a 195 mg/l, sacarosa 1 %, PHYTAGAR (Gibco Invitrogen) 6 g/l, pH 5.8.

F. Crecimiento y formación de raíz del brote: Los brotes verdes se transfirieron a medio para formación de raíz (B5-0 + 2IBA). Los brotes permanecieron en medio para formación de raíz hasta que formaron raices. Los brotes se mantuvieron a 24°C, 16 horas luz/día, -100 uE/m2/s. Medio para formación de raíz (B5-0 + 2IBA): Sales B5 de Gamborg (Caisson Labs), vitaminas B5 (1 mg/l de ácido nicotínico, 1 mg/l de piridoxina-HCI, 10 mg/l de tiamina-HCI), 100 mg/l de inositol, IBA 2 mg/l (ácido indol-3-butírico, Sigma) 150 mg/l de cefotaxima (PhytoTechnology), sacarosa 1 %, PHYTAGAR (Gibco Invitrogen) 6 g/l, pH 5.8.

G. Detección del transgén y frecuencia de transformación: El ADN genómico total se extrajo de plantas de cañóla crecidas en invernadero, se digirió con un cortador único BglW, y se hibridó con una sonda CP4 marcada con DIG. Se confirmó que cuatro lineas eran transgénicas (figura 1 1 ). La frecuencia de transformación se resume en el cuadro 6.

CUADRO 6 Frecuencia de transformación de cañóla (TF) con cepas de Rhizobium Positivos a Cepas Explantes GUS/CP4 TF RL 2370G 150 2 1.33 SF 542 120 1 0.83 SM542C 120 1 0.83 EJEMPLO 10 Transformación del algodón mediada por Rhizobia a través de la embriogénesis A. Preparación del inoculo de Rhizobia: pMON101316 se sometió a electroporación en las cepas de Rhizobia, se verificó mediante digestión por restricción de ADN preparado en mini-prep y se almacenó a -80°C. Las cepas de Rhizobia con el vector a partir de la solución del almacenamiento en glicerol se inocularon en 10 mililitros de medio TY con canamicina (50 mg/l) y espectinomicina (50 mg/l) en un tubo Falcon de 50 mi y se agitaron a 28°C durante toda la noche a 200 rpm. El cultivo nocturno de Rhizobia se concentró mediante centrifugación, se resuspendió en 20 mililitros de medio liquido MS0 y se centrifugó de nuevo. El concentrado se resuspendió en 20 mililitros de medio MS0. La Rhizobia lavada se diluyó en MS0 hasta una ??ß? de aproximadamente 1.0 para inoculación.

B. Preparación del explante: La transformación del algodón se realizó esencialmente de conformidad con la Publicación U.S. 2004087030. Siete días después las plántulas germinaron, las plántulas de algodón etioladas a partir del cultivar Coker se removieron de una incubadora Percival oscura. Los hipocotiledones a partir de PHYTATRAYs se cosecharon y se colocaron en una caja de Petri estéril que contenía MSO estéril para prevenir el secado del tejido. Los hipe-cotiledones se cortaron en explantes pequeños.

C. Inoculación y co-cultivo: Utilizando un fórceps estéril, los explantes se transfirieron a cajas de Petri estériles, y se añadió el inoculo de Rhizobia. Los explantes se dejaron en una campana estéril por 20 minutos, con agitación para asegurar un buen contacto de todos los explantes con el inoculo de Rhizobia. La solución de inoculo de Rhizobia se aspiró entonces y los explantes se secaron cuidadosamente con papel filtro estéril. Las piezas inoculadas del hipocotiledón se colocaron sobre platos de cultivo. El co-cultivo de los platos de explantes, cubiertos con una bolsa plástica, se llevó a cabo en una incubadora Percival ajustada aproximadamente a 22-24°C, con un fotoperíodo de 10 horas de luz/14 horas de oscuridad por 2 días.

D. Embriogénesis a través de la transformación estable: Dos días después de la inoculación, las piezas del explante de algodón se tiñeron con X-gluc para evaluar la expresión transitoria de GUS (figuras 12A-12F). Las manchas azules en los hipocotiledones indican la expresión del gen gus y la transformación de las células de algodón. Con el objeto de obtener plantas establemente transformadas, los explantes de hipocotiledón se transfirieron sobre un plato que contenía medio seleccionable UMSEL1629, que contenía el agente seleccionable apropiado. Posteriormente los platos se cubrieron con PARAFILM y se cultivaron a 28°C con un fotoperiodo de 16/8 horas (día/noche). Los callos establemente transformados se confirmaron mediante tinción con X-Gluc para la expresión de gus después de 4 semanas en el medio seleccionable (figuras 13A-13F). Cuatro semanas después de la transferencia inicial al medio seleccionable, todos los hipocotiledones se transfirieron a medio UMSEL 1788, PARAFILMed y se cultivaron por 7 días. Luego los explantes se transfirieron de nuevo a UMSEL1629 por 4 semanas a 28°C con un fotoperiodo de 16/8 horas, (día/noche). Aproximadamente 4 semanas después de la segunda transferencia en UMSEL1629, dependiendo de la velocidad de crecimiento del callo, se recuperaron los grupos de callos y se transfirieron a platos con UMO. Los platos individuales se marcaron posteriormente, se cubrieron con PARAFILM, y se cultivaron la 28°C en oscuridad continua. De seis a ocho semanas después de que el callo se encontraba en UMO, los callos se subcultivaron en medio UMO recientemente preparado y se cultivaron a 28°C en oscuridad continua. Después de 6-10 semanas en UMO, el callo embriogénico (EC) se encuentra listo para ser cosechado a partir de lineas de callo independientes en UMO y se transfirieron a medio TRP+. Cada 3-5 semanas, por aproximadamente 3 meses, el tejido en crecimiento activo y los embriones pequeños en platos con TRP+ se transfirieron a medio TRP+ recientemente preparado y se cultivaron a 28°C en oscuridad continua. Los embriones se transfirieron a medio SHSU en cajas de Petri y se cubrieron con PARAFILM. Las placas se cultivaron a 28°C en una Percival con un fotoperiodo de 16/8 (día/noche) con iluminación máxima (luces en el estante y en paredes laterales). Los embriones se pueden subcultivar en el mismo medio una vez más hasta la germinación. Las plántulas recuperadas se cultivaron en una Percival o en un cuarto caliente a 28°C con un fotoperiodo de 16/8 (día/noche).

E. Análisis molecular de la naturaleza transgénica de los callos de algodón derivados a partir de la transformación mediada por Rhizobium: El ADN genómico se extrajo a partir del tejido del callo, se digirió con un cortador único SamHI, se fraccionó en un gel de agarosa al 1 %, y se transfirió sobre una membrana Hybond™ (por ejemplo Appligen-Oncor, lllkirch, Francia; o Amersham-Pharmacia Biotech). Se utilizó una sonda gus marcada con DIG para detectar la presencia del transgén como un indicador de la transformación. Se encontró que seis líneas de los callos de algodón, derivadas a partir de la transformación de S. meliloti, S. fredii y R. leguminosarum con el plásmido Ti ayudador, contenían el gen gus (figura 14).

F. Medio para cultivo de algodón: Receta para 1 L de UMSEL - 4.33 g de sales MS, 2 mi de vitaminas B5 500X, 0.1 mi de 2,4-D (1 mg/ml), 1 mi de cinetina (0.5 mg/ml), 30 g de glucosa, pH 5.8, 2.5 g de PHYTAGEL, 1 .7 mi de carbenicilina (250 mg/ml), 1 mi de cefotaxima (100 mg/ml), más el agente seleccionable: canamicina 40 mg/L concentración final, carbenicilina, cefotaxima y agentes selectivos fueron añadidos después de someter al autoclave.

Receta para 1 L de UMSEL1788: - 4.33 g de sales MS, 2 mi de vitaminas B5 500X, 0.1 mi de 2,4-D (1 mg/ml), 1 mi de cinetina (0.5 mg/ml), 30 g de glucosa, pH 5.8, 2.5 g de PHYTAGEL, 1 .7 mi (250 mg/ml) de carbenicilina, 1 mi (100 mg/ml) de cefotaxima, más el agente seleccionable: canamicina 40 mg/L concentración final y 0.1 g de sacarosa disuelta en 100 mi de agua. La carbenicilina, cefotaxima y agentes selectivos fueron añadidos después de someter al autoclave. Receta para 1 L de UMSEL1629: - 4.33 g de sales MS, 2 mi de vitaminas B5 500X, 0.1 mi de 2,4-D (1 mg/ml), 1 mi de cinetina (0.5 mg/ml), 30 g de glucosa, pH 5.8, 2.5 g de PHYTAGEL, 1.7 mi (250 mg/ml) de carbenicilina, 1 mi (100 mg/ml) de cefotaxima, más el agente seleccionable: canamicina 40 mg/L concentración final. La carbenicilina, cefotaxima y agentes selectivos fueron añadidos después de someter al autoclave. Receta para 1 L de UMO - 4.33g de sales MS, 2 mi de vitaminas B5 500X, 30 g de glucosa, pH 5.8, 3.5 g de GELRITE, 1 .7 mi (250 mg/ml) de carbenicilina, 1 mi (100 mg/ml) de cefotaxima, 100 mg/l de ácido ascórbico, más el agente seleccionable: canamicina 50 mg/L concentración final. Receta para 1 L de TRP+ - 4.33 g/l de sales MS, 2 mi de vitaminas B5 500X, 1 .9 g/l de KN03, 30 g/l de glucosa, 0.1 g/l de hidrolizado de caseína, 3.5 g de GELRITE, pH 5.8.

Receta para 1 L de SHSU - 100 mi de Stewart & Hsu Majors (10x), 10 mi de Stewart & Hsu Minors (100x), 1.5 mi de hierro (100x), 10 mi de Stewart & Hsu Organics (100x), 5 g de glucosa, 50 mg/l de benlato, 2.2 g de GELRITE, pH 6.8 (Stewart & Hsu, 1977).

EJEMPLO 11 Transformación de maíz mediada por Rhizobia A. Preparación del inoculo de Rhizobium y composición del medio: pMON96036 que contenía los cassettes de expresión CP4, GUS y gfp se utilizó para transformación del maíz. El vector se sometió a electroporación en diversas cepas modificadas de Rhizobia, se verificó, y se almacenó a -80°C. La Rhizobia que contenía el vector en una solución de almacenamiento con glicerol se sembraron sobre medio sólido TY suplementado con antibióticos (canamicina 40 mg/L y espectinomicina 31 mg/L), y se incubaron a 28°C por 2 días. Dos días antes de la inoculación de Rhizobia a los embriones inmaduros del maíz, se inoculó una asada de células a partir de una placa de cultivo de Rhizobia en 25 mL de medio líquido TY suplementado con 62 mg/L de espectinomicina y 40 mg/L de canamicina en una botella de 250 mL. La botella se colocó en un agitador a aproximadamente 150-200 rpm y 27-28°C durante toda la noche. El cultivo de Rhizobia se diluyó entonces (1 a 5) en el mismo medio líquido y se regresó al agitador. Varias horas después, un día antes de la inoculación, las células de Rhizobia se centrifugaron a 3500 rpm por 15 minutos. El concentrado de células bacterianas se resuspendió en caldo para inducción AB-TY o ATA con 200 µ? de acetosiringona y 50 mg/L de espectinomicina y 25 mg/L de canamicina y la densidad celular se ajustó a 0.2 a DO66o- El cultivo de células bacterianas (50 ml_ en cada botella de 250 ml_) se colocó de nuevo en el agitador y se creció durante toda la noche. La mañana del día de la inoculación, las células bacterianas se centrifugaron y se lavaron con medio líquido 1/2 MS VI (Publicación U.S. 20040244075) suplementado con 200 µ? de acetosiringona. El cultivo bacteriano se centrifugó y el concentrado celular se resuspendió en medio 1/2 MS PL (Publicación U.S. 20040244075) con 200 µ? de acetosiringona y la densidad celular se ajustó a 1 .0 a DO66o para inoculación. Los reactivos están comercialmente disponibles y se pueden obtener a partir de numerosos proveedores (véase, por ejemplo Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.).

B. Aislamiento del embrión del maíz y co-cultivo de Rhizobium: Para la transformación mediada por Rhizobia, las mazorcas que contenían embriones inmaduros del maíz (Zea mays) se aislaron y transformaron mediante co-cultivo bacteriano como se describió generalmente por Cai et al. (Solicitud de Patente de E.U.A. Publicación 20040244075), excepto que los embriones inmaduros se aislaron a partir de mazorcas esterilizadas en su superficie y se gotearon directamente dentro de la suspensión celular preparada de Rhizobia. Después de que se removió la suspensión celular de Rhizobia, los embriones inmaduros se transfirieron sobre el medio para co-cultivo (Publicación U.S. 20040244075). Para investigar la expresión transitoria de GFP, los embriones de maíz co-cultivados se colocaron directamente bajo un microscopio con luz fluorescente para observación de GFP. Alternativamente, 10 embriones tomados al azar después del co-cultivo se transfirieron dentro de un tubo Eppendorf de 1 .5 mi y se tiñeron con solución X-gluc durante toda la noche a 37°C para la expresión transitoria de gus. La figura 15 representa la expresión transitoria de GUS de los embriones inmaduros de maíz transformados con cinco cepas de Rhizobium de R. leguminosarum, M. loti, S. fredii y S. meliloti en comparación con la cepa de Agrobacterium tumefaciens ABI utilizando medio para inducción ATA. Se observó que el medio mínimo AB de rutina utilizado para crecimiento y la inducción de Agrobacterium no sostiene de manera eficiente el crecimiento de Rhizobia. Los inóculos de Rhizobia no mostraron crecimiento significativo en medio mínimo AB sin ninguna selección después de una semana de agitación con 220 rpm a 28°C. La inclusión de 20 mi de medio TY en el medio mínimo AB mejora dramáticamente la velocidad de crecimiento de Rhizobia; mientras que el reemplazo de la glucosa en el medio AB-TY con L-arabinosa y gluconato de potasio en el medio ATA disminuye la producción de polisacárido, resultando en concentrados mas fuertes. El cambio de la fuente de carbono en el medio para inducción mejora significativamente la expresión transitoria de gus con las cepas de Rhizobia en el maíz.

C. Inducción del callo y regeneración de las plantas transqénicas: Después del co-cultivo, la transformación se continuó esencialmente como se describió en la Publicación U.S. 20040244075, con modificaciones de las condiciones seleccionables como sea apropiado. Los embriones se transfirieron sobre un medio MS modificado (Publicación U.S. 20040244075) suplementado con 250 mg/L de carbenicilina y glifosato 0.1 mM. Los callos establemente transformados con la expresión de gfp se observaron a partir de las cepas M. loti, S. fredii y S. meliloti utilizadas en el ensayo transitorio en esta etapa (figuras 16A-16C). Las frecuencias de transformación representativas se muestran en el cuadro 7.

CUADRO 7 Frecuencia de transformación del maíz con diferentes cepas de Rhizobia D. Análisis molecular de las plantas transgénicas derivadas a partir de la transformación mediada por Rhizobia: El ADN genómico total se aisló a partir de plantas de maíz crecidas en invernadero y se digirió con un cortador único BamHI para estimar el número de copias del transgén. Una sonda gus marcada con DIG se utilizó para hibridar con el ADN genómico. La naturaleza transgénica de los tejidos putativamente transformados se confirmó para todas las líneas excepto para una (figura 17).

E. Transmisión a la línea germinal de los transgenes en las plantas de maíz transgénico: Las plantas de maíz transgénico en floración fueron ya sea autocruzadas o exocruzadas con la línea parental del genotipo de maíz utilizada para transformación (linea LH244). Las semillas secas se embebieron el agua por 1 día para tinción de gus o 2 días para conteo de gfp. Se confirmó la expresión y segregación de gus o gfp en las semillas transgénicas R1 (cuadro 8).

CUADRO 8 Expresión del transgén en las semillas R1 de maíz transgénico GFP + Gus + # de semillas/semillas semillas/semillas Cepa de Línea transgénica semillas ensayadas ensayadas Rhizobia ZM A8232 112 9/20 6/7 ML542G ZM A8232/LH244 112 4/20 ML542G ZM A8234 48 0/10 0/20 ML542G ZM A8246 133 12/20 5/5 ML542G ZM A8247 148 4/20 1/3 SF4404 LH244/ZM A8247 150 13/20 SF4404 ZM A8248 75 0/20 4/6 SF4404 LH244/ZM A8249 104 13/20 SF4404 LH244/ZM A8249 275 9/20 SF4404 LH244/ZM A8251 148 7/20 SF4404 LH244/ZM A8251 123 5/20 SF4404 LH244/ZM A8251 108 4/20 SF4404 ZM A8252 137 9/20 4/6 SF4404 ZM_A8255 78 10/20 SM542C LH244/ZM A8245 31 2/10 ML542G LH244/ZM A8253 138 10/20 SF542C LH244/ZM A8253 67 5/20 SF542C LH244/ZM A8254 72 8/20 SF542C LH244/ZM A8254 100 6/20 SF542C LH244/ZM A8235 81 12/20 ABI LH244/ZM A8235 116 13/20 ??? LH244/ZM A8235 161 8/20 ABI ZM A8237/LH244 294 7/20 5/7 ABI ZM A8244/LH244 250 4/20 ABI ZM A8240 14 3/4 ABI ZM A8240/LH244 86 7/20 ABI ZM A8238 31 10 / 10 ABI LH244/ZM A8238 90 10 / 20 ABI ZM A8256 53 3 / 10 ABI LH244/ZM A8256 55 8 / 20 ABI EJEMPL0 12 Transformación de la cosecha mediada por Rhizobia a través del sistema de transferencia conjugal Un sistema de transferencia conjugal del plásmido dependiente de oriT en Rhizobium y las especies relacionadas también se pueden utilizar para suministrar un gen de interés (GOI) dentro de las células vegetales y subsecuentemente se integran dentro del genoma vegetal. Un sistema de transferencia conjugal homogéneo o heterogéneo se podría utilizar para la transferencia del gen. Las plantas transgénicas se podrían regenerar entonces con marcadores seleccionares a través de un sistema de cultivo de tejidos establecido. Las cepas de Rhizobia pueden incluir Sinorhizobium spp., Mesorhizobium loti, Rhizobium leguminosarum y Rhizobium sp. NGR234, entre otras. Referencias Las siguientes referencias, hasta el grado en el que provean detalles ejemplares de procedimiento u otros detalles suplementarios a aquellos establecidos en la presente invención, se incorporan aquí específicamente como referencias.

Patente de E.U.A. 4,761 ,373; Patente de E.U.A. 4,810,648; Patente de E.U.A. 5,013,659; Patente de E.U.A. 5,094,945; Patente de E.U.A. 5, 106,739; Patente de E.U.A. 5,107,065; Patente de E.U.A. 5,141 ,870; Patente de E.U.A. 5,229, 1 14; Patente de E.U.A. 5,273,894; Patente de E.U.A. 5,276,268; Patente de E.U.A. 5,322,938; Patente de E.U.A. 5,352,605; Patente de E.U.A. 5,359, 142; Patente de E.U.A. 5,362,865; Patente de E.U.A. 5,378,619; Patente de E.U.A. 5,378,824; Patente de E.U.A. 5,424,412; Patente de E.U.A. 5,463,175; Patente de E.U.A. 5,512,466; Patente de E.U.A. 5,530, 196; Patente de E.U.A. 5,543,576; Patente de E.U.A. 5,561 ,236; Patente de E.U.A. 5,563,055; Patente de E.U.A. 5,591 ,616; Patente de E.U.A. 5,605,01 1 ; Patente de E.U.A. 5,608, 149; Patente de E.U.A. 5,627,061 ; Patente de E.U.A. 5,633,435; Patente de E.U.A. 5,633,437; Patente de E.U.A. 5,637,489; Patente de E.U.A. 5,641 ,876; Patente de E.U.A. 5,646,024; Patente de E.U.A. 5,659,122; Patente de E.U.A. 5,689,041 ; Patente de E.U.A. 5,750,871 ; Patente de E.U.A. 5,750,876; Patente de E.U.A. 5,767,366; Patente de E.U.A. 5,837,848; Patente de E.U.A. 5,850,019; Patente de E.U.A. 5,859,347; Patente de E.U.A. 5,869,720; Patente de E.U.A. 5,958,745; Patente de E.U.A. 5,981 ,834; Patente de E.U.A. 5,985,605; Patente de E.U.A. 5,998,700; Patente de E.U.A. 6,01 1 , 199; Patente de E.U.A. 6,040,497; Patente de E.U.A. 6,051 ,753; Patente de E.U.A. 6,072, 103; Patente de E.U.A. 6,080,560; Patente de E.U.A. 6,140,075; Patente de E.U.A. 6,140,078; Patente de E.U.A. 6,166,292; Patente de E.U.A. 6,171 ,640; Patente de E.U.A. 6,175,060; Patente de E.U.A. 6,177,61 1 ; Patente de E.U.A. 6,225, 105; Patente de E.U.A. 6,228,623; Patente de E.U.A. 6,232,526; Patente de E.U.A. 6,252, 138; Patente de E.U.A. 6,271 ,443; Patente de E.U.A. 6,294,714; Patente de E.U.A. 6,380,462; Patente de E.U.A. 6,380,466; Patente de E.U.A. 6,384,301 ; Patente de E.U.A. 6,414,222; Patente de E.U.A. 6,426,446; Patente de E.U.A. 6,426,447; Patente de E.U.A. 6,429,357; Patente de E.U.A. 6,429,362, Patente de E.U.A. 6,433,252; Patente de E.U.A. 6,437,217; Patente de E.U.A. 6,444,876; Patente de E.U.A. 6,459,018; Patente de E.U.A. 6,476,295; Patente de E.U.A. 6,483,008; Patente de E.U.A. 6,489,461 ; Patente de E.U.A. 6,495,739; Patente de E.U.A. 6,506,559; Patente de E.U.A. 6,531 ,648; Patente de E.U.A. 6,537,750; Patente de E.U.A. 6,538,178; Patente de E.U.A. 6,538, 179; Patente de E.U.A. 6,538, 181 ; Patente de E.U.A. 6,541 ,259; Patente de E.U.A. 6,576,818; Patente de E.U.A. 6,589,767; Patente de E.U.A. 6,596,538; Patente de E.U.A. 6,635,806; Patente de E.U.A. 6,613,963; Patente de E.U.A. 6,653,530; Patente de E.U.A. 6,660,849; Patente de E.U.A. 6,706,950; Patente de E.U.A. 6,723,837; Patente de E.U.A. 6,770,465; Patente de E.U.A. 6,774,283; Patente de E.U.A. 6,812,379; Patente de E.U.A. 6,822, 141 ; Patente de E.U.A. 6,828,475; Patente de E.U.A. 7,002,058; Patente de E.U.A. 7,132,528; Patente de E.U.A. 7,151 ,204; Patente de E.U.A. RE37.543 Publicación de Patente de E.U.A. 20020168707; Publicación de Patente de E.U.A. 20030028917; Publicación de Patente de E.U.A. 20030083480; Publicación de Patente de E.U.A. 200301 15626; Publicación de Patente de E.U.A. 20030135879; Publicación de Patente de E.U.A. 20040177399; Publicación de Patente de E.U.A. 20040244075; Publicación de Patente de E.U.A. 20050005321 ; Publicación de Patente de E.U.A. 20050022261 ; Publicación de Patente de E.U.A. 20050289667; Publicación de Patente de E.U.A. 20050289672; Publicación de Patente de E.U.A. 20060200878; Publicación de Patente de E.U.A. 20060162010; Publicación de Patente de E.U.A. 20060236420; Beringer, J. Gen. Microbio!., 84: 188-198, 1974. Bevan et al., Nature, 304: 184-187, 1983. Bird et al. , Biotech Gen. Eng. Rev., 9: 207-227, 1991. Bravo-Angel et al., J. Bacterio/., 181 : 5758-5765, 1999. Broothaerts et al., Nature, 433: 629-633, 2005. Buchanan-Wollaston, Nature, 328: 172-175, 1987. Callis et al., Plant Physiol., 88: 965-968, 1988. Carrington y Freed, J. Virol., 64(4): 1590-1597, 1990. Chandler e/ a/., Plant Cell, 1 : 1 175-1 183, 1989. Chen et al., J. Bacterio!. 184: 4838-4845, 2002. Chu et al. , Scientia Sínica 18: 659, 1975. Corruzzief al., EMBO J. 3: 1671 -1679, 1984. Dekeyser et al., Plant Physiol., 90: 217-223, 1989. Della-Cioppa et al., Bio Technology, 5: 579-584, 1987. Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 : 561-573, 1982. Dube y Thomson, Plasmid. , 50: 1-1 1 , 2003. Dube et al., Plant Mol. Biol., 55(4): 531-539, 2004.

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Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1 .- Un método para transformar una célula vegetal, que comprende: (a) poner en contacto al menos una primera célula vegetal con una bacteria diferente a Agrobacterium sp. que comprende: (i) un primer ácido nucléico que comprende una región del gen wr de un plásmido Ti en donde la región del gen vir actúa para introducir un ácido nucléico de interés dentro de la célula vegetal de manera dependiente de VirD2; y (ii) un segundo ácido nucléico que comprende una o más secuencia(s) borde de ADN-T operativamente asociadas con un ácido nucléico de interés; y (b) seleccionar al menos una primera célula vegetal transformada con el ácido nucléico de interés, en donde la célula vegetal es una célula vegetal de soya, cañóla, maíz, o algodón. 2 - Un método para transformar una célula vegetal, que comprende: (a) poner en contacto al menos una primera célula vegetal con una bacteria diferente a Agrobacterium que comprende (i) un primer ácido nucléico requerido para transferencia conjugativa de las secuencias del ADN independientes de la función de VirD2, y (ii) un segundo ácido nucléico que comprende un ácido nucléico de interés; en donde la célula vegetal es una célula vegetal de soya, cañóla, maíz, o algodón y en donde los polipéptidos codificados por el ácido nucléico requerido para transferencia conjugativa actúan al transferir el ácido nucléico de interés dentro de la célula vegetal; y (b) seleccionar al menos una primera célula vegetal transformada con el ácido nucléico de interés. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la transferencia conjugativa es dependiente de traA, tral, o mobA. 4 - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho primer ácido nucléico comprende oríT. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el primer ácido nucléico carece de secuencias de ADN-T borde a la izquierda y/o derecha. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado además porque la bacteria es una célula de Rhizobia. 7.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la célula de Rhizobia se crece en la presencia de acetosiringona u otro compuesto que induce la función del gen vir antes del contacto con la célula vegetal. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la célula de Rhizobia se selecciona a partir del grupo que consiste de: Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacterium spp. Ochrobactrum spp. y Bradyrhizobium spp. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la célula de Rhizobia es Rhizobium leguminosarum. 10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la célula de Rhizobia es R. leguminosarum bv. trifolii, R. leguminosarum bv. phaseoli o Rhizobium leguminosarum. bv. viciae. 1 1. - El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque la célula vegetal está comprendida en un explante a partir de una semilla vegetal, plántula, callo, suspensión celular, cotiledón, meristemo, hoja, raíz, o tallo; y el explante se pone en contacto con la bacteria. 1

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque el explante comprende un meristemo embrionario; callo; suspensión celular; cotiledón; o tejido a partir de hojas, raíces, o tallos. 1

3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el ácido nucléico requerido para transferencia conjugativa independiente de la función de VirD2 se introdujo dentro de la bacteria por electroporación. 1

4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caractenzado además porque el primer y segundo ácidos nucléicos se introdujeron dentro de la bacteria por electroporación. 1

5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque la selección de una célula vegetal transformada con el ácido nucléico de interés se lleva a cabo en la ausencia de un agente seleccionable. 1

6. - El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque la selección de una célula vegetal transformada con el ácido nucléico de interés comprende cultivar la célula vegetal en la presencia de un agente seleccionable, en donde el ácido nucléico de interés confiere tolerancia al agente seleccionable o está operativamente asociado a un ácido nucléico adicional que confiere tolerancia al agente seleccionable. 1

7. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el agente seleccionable es glifosato, canamicina, bialafos o dicamba. 18 - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el ácido nucléico de interés o el ácido nucléico adicional codifica EPSP sintasa. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la proteina EPSP sintasa es CP4. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el agente seleccionable es glifosato. 21 - El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el ácido nucléico de interés no está físicamente asociado a un gen marcador seleccionable. 22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque el gen marcador y el ácido nucléico de interés se segregan genéticamente en la progenie de una planta regenerada a partir de la célula vegetal transformada con el ácido nucléico de interés. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caractenzado además porque la bacteria comprende al menos un tercer ácido nucléico que comprende un ácido nucléico de interés adicional y en donde la célula vegetal se transforma con el tercer ácido nucléico. 24 - El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque comprende adicionalmente regenerar una planta a partir de la célula vegetal, en donde la planta comprende el ácido nucléico de interés. 25. - El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la regeneración de una planta a partir de la célula vegetal comprende la inducción de la formación de uno o más brotes a partir de un explante que comprende la célula vegetal y cultivar al menos un primer brote hacia una planta fértil completa. 26. - El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la regeneración se presenta mediante organogénesis. 27 - El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la planta se selecciona a partir del grupo que consiste de: una planta de maíz, una planta de algodón, una planta de soya, y una planta de cañóla. 28 - Una célula de Rhizobia seleccionada a partir del grupo que consiste de: Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacteríum spp. Ochrobactrum spp. y Bradyrhizobium spp., la célula comprendiendo (i) un primer ácido nucléico que comprende una región del gen vir de un plásmido Ti en donde la región del gen vir actúa para introducir un ácido nucléico que codifica para una secuencia de interés dentro de una célula vegetal de manera dependiente de VirD2; y (¡i) un segundo ácido nucléico que comprende una o más secuencia(s) borde de ADN-T operativamente asociadas a un ácido nucléico que codifica para una secuencia de interés. 29.- La célula de Rhizobia de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque se define como que comprende un marcador seleccionable. 30.- La célula de Rhizobia de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque la célula de Rhizobia se selecciona a partir del grupo que consiste de: Rhizobium sp., Rhizobium sp. NGR234, Rhizobium leguminosarum Madison, R. leguminosarum USDA2370, R. leguminosarum bv. trifolii USDA2408, R. leguminosarum bv. phaseoli USDA2668, R. leguminosarum 2370G, R. leguminosarum 2370LBA, R. leguminosarum 2048G, R. leguminosarum 2048LBA, R. leguminosarum bv. phaseoli, R. leguminosarum bv. phaseoli 2668G, R. leguminosarum bv. phaseoli 2668LBA, R. leguminosarum RL542C, R. leguminosarum bv. viciae, R. leguminosarum bv. trifolii, Rhizobium etli USDA 9032, R. etli bv. phaseoli, Rhizobium tropici, Mesorhizobium sp., Mesorhizobium loti ML542G, M. loti ML4404, Sinorhizobium sp., Sinorhizobium meliloti SD630, S. meliloti USDA1002, Sinorhizobium fredii USDA205, S. fredii SF542G, S. fredii SF4404, S. fredii SM542C, Bradyrhizobium sp., Bradyrhizobium japonicum USDA 6, y

8. japonicum USDA 1 10. 31 .- La célula de Rhizobia de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque la célula es una célula de Rhizobium leguminosarum. 32. - La célula de Rhizobia de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque la célula es una célula de R. leguminosarum bv. trifolii, R. leguminosarum bv. phaseoli o Rhizobium leguminosarum. bv. viciae. 33. - Una construcción de ADN competente para transferencia independiente de virD2 a partir de Rhizobia y que carece de la secuencia de ADN-T borde, la construcción que comprende una secuencia oriT operativamente asociada con un ácido nucléico de interés. 34. - La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque comprende una secuencia traA o mob. 35. - Una célula de Rhizobia transformada con la construcción de ADN de la reivindicación 33, en donde la Rhizobia se selecciona a partir del grupo que consiste de: Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacteríum spp. Ochrobactrum spp. y Bradyrhizobium spp. 36. - La célula de Rhizobia de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque la célula de Rhizobia se selecciona a partir del grupo que consiste de: Rhizobium sp., Rhizobium sp. NGR234, Rhizobium leguminosarum Madison, R. leguminosarum USDA2370, R. leguminosarum bv. trifolii USDA2408, R. leguminosarum bv. phaseoli USDA2668, R. leguminosarum 2370G, R. leguminosarum 2370LBA, R. leguminosarum 2048G, R. leguminosarum 2048LBA, R. leguminosarum bv. phaseoli, R. leguminosarum bv. phaseoli 2668G, R. leguminosarum bv. phaseoli 2668LBA, R. leguminosarum RL542C, R. leguminosarum bv. viciae, R. leguminosarum bv. trifolii, Rhizobium etli USDA 9032, R. etli bv. phaseoli, Rhizobium tropici, Mesorhizobium sp., Mesorhizobium loti ML542G, M. loti ML4404, Sinorhizobium sp., Sinorhizobium meliloti SD630, S. meliloti USDA1002, Sinorhizobium fredii USDA205, S. fredii SF542G, S. fredii SF4404, S. fredii SM542C, Bradyrhizobium sp., Bradyrhizobium japonicum USDA 6, y 8. japonicum USDA 1 10. 37.- La célula de Rhizobia de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque la célula es una célula Rhizobium leguminosarum. 38. - La célula de Rhizobia de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque la célula es una célula de R. leguminosarum bv. trifolii, R. leguminosarum bv. phaseoli o Rhizobium leguminosarum. bv. viciae. 3

9. - El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque comprende hacer crecer la bacteria diferente a Agrobacterium sp. bajo condiciones para minimizar la producción de polisacárido durante crecimiento en medio para inducción. 40.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque la fuente(s) de carbono utilizada para minimizar la producción de polisacárido durante crecimiento en medio para inducción es glucosa en medio AB-TY, o L-arabinosa y gluconato de potasio en medio ATA.