BR112020006045A2

BR112020006045A2 - molécula de ácido nucleico, cassete de expressão, vetor, célula vegetal, planta, semente da planta, método para produzir uma planta transgênica, planta transgênica, semente da planta transgênica, método para aprimorar a eficiência de maturação de embrião somático e método para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica

Info

Publication number: BR112020006045A2
Application number: BR112020006045-3A
Authority: BR
Inventors: Alexandre da Silva Conceição; Allison M. Finch; William James Gordon-Kamm; Theodore M. Klein; Keith S. Lowe
Original assignee: Pioneer Hi-Bred International, Inc.
Priority date: 2017-09-25
Filing date: 2018-09-19
Publication date: 2020-10-06
Also published as: KR20200056434A; WO2019060383A1; CN111373046A; EP3688171A1; US20200270622A1; JP2020536515A; CA3076831A1; IL273284A; AU2018337756A1

Abstract

Trata-se de composições e métodos para regular expressão de sequências de nucleotídeos heterólogos em uma planta. As composições incluem promotores preferenciais de tecido operacionalmente ligados a genes morfogênicos. Também é fornecido um método para expressar uma sequência de nucleotídeos heterólogos em uma planta com o uso de uma sequência de promotores revelada no presente pedido operacionalmente ligada a um gene morfogênico. Os construtos de DNA que compreendem um promotor operacionalmente ligado a um gene morfogênico e que compreendem adicionalmente uma sequência de nucleotídeos heterólogos de interesse também são fornecidos.

Description

“MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, CASSETE DE EXPRESSÃO, VETOR, CÉLULA VEGETAL, PLANTA, SEMENTE DA PLANTA, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA, PLANTA TRANSGÊNICA, SEMENTE DA PLANTA TRANSGÊNICA, MÉTODO PARA APRIMORAR A EFICIÊNCIA DE MATURAÇÃO DE EMBRIÃO SOMÁTICO E MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA DICOTILEDÔNEA TRANSGÊNICA OU UMA PLANTA GIMNOSPERMA TRANSGÊNICA” CAMPO DA REVELAÇÃO

[0001] A presente revelação refere-se ao campo de biologia molecular de planta, mais particularmente à regulação de expressão de gene em plantas.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0002] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório no U.S. 62/562.663, depositado em 25 de setembro de 2017, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS ENVIADA ELETRONICAMENTE

[0003] A cópia oficial da listagem de sequências é submetida eletronicamente através de EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um arquivo nomeado 20180829_7453WOPCT_ST25 , criado em 29 de agosto de 2018, e que tem um tamanho de 995.556 bites e é depositado simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida nesse documento em formato ASCII faz parte do relatório descritivo e é incorporada na sua totalidade no presente documento por referência.

ANTECEDENTES DA REVELAÇÃO

[0004] A expressão de sequências de DNA heterólogas em um hospedeiro vegetal é dependente da presença de promotores ligados operacionalmente, incluindo promotores, que são funcionais dentro do hospedeiro vegetal. A escolha da sequência de promotores determinará quando e onde dentro do organismo a sequência de DNA heteróloga é expressa.Quando a expressão em tecidos ou órgãos específicos é desejada, promotores preferenciais de tecido podem ser usados.Quando a expressão genética em resposta a um estímulo é desejada, promotores induzíveis são o elemento regulador de escolha.Em contraste, quando a expressão contínua é desejada ao longo das células de uma planta, os promotores constitutivos são utilizados. As sequências reguladoras adicionais a montante e/ou a jusante da sequência promotora nuclear podem ser incluídas nos construtos de expressão de vetores de transformação para gerar níveis variáveis de expressão de sequências de nucleotídeos heterólogos em uma planta transgênica.

[0005] Frequentemente é desejável expressar uma sequência de DNA, em particular tecidos ou órgãos de uma planta.Por exemplo, uso de promotores preferenciais de tecido operacionalmente ligados aos genes morfogênicos que promovem proliferação celular é útil para a recuperação eficiente de eventos transgênicos durante o processo de transformação.Tais promotores preferenciais de tecido também têm utilidade na expressão de genes característicos e/ou proteínas de resistência a patógenos no tecido vegetal desejado de modo a intensificar rendimento vegetal e resistência aos patógenos.

Alternativamente, pode ser desejável inibir a expressão de uma sequência de DNA nativo dentro de tecidos de uma planta para alcançar um fenótipo desejado.Nesse caso, tal inibição pode ser alcançada com a transformação da planta para compreender um promotor preferencial de tecido operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos antissenso, de modo que a expressão da sequência antissenso produza uma transcrição de RNA que interfira na tradução do mRNA da sequência de DNA nativa.

[0006] Adicionalmente, pode ser desejável expressar uma sequência de DNA em tecidos vegetais que estão em uma fase de desenvolvimento ou crescimento particular, tal como, por exemplo, divisão ou alongamento celular.Tal sequência de DNA pode ser usada para promover ou inibir processos de crescimento vegetal, desse modo, se afeta a taxa de crescimento ou arquitetura da planta.

[0007] Portanto, há uma necessidade do isolamento e caracterização de promotores preferenciais de tecido, particularmente promotores que podem servir como elementos reguladores para a expressão controlada de genes de estimulação de crescimento, incluindo genes morfogênicos, que fornecem um forte surto de expressão dos genes para estimular o crescimento in vitro e a morfogênese imediatamente após a transformação mediada por Agrobacterium, que, então, diminui e é virtualmente “inativo” nos tecidos de uma planta em que a superexpressão ectópica causaria crescimento anormal e desenvolvimento.

SUMÁRIO DA REVELAÇÃO

[0008] Composições e métodos para regular expressão genética em uma planta são fornecidos.Mais particularmente, os promotores da revelação conferem expressão preferencial ao tecido na L1 de epiderme (camadas externas) de tecido vegetal.

Certos aspectos da revelação incluem uma molécula de ácido nucleico que compreende um cassete de gene morfogênico que compreende um promotor preferencial de tecido que tem a sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 95% de identidade com pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% de identidade com pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; um fragmento ou variante da sequência de nucleotídeos de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que o fragmento ou variante da sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; e pelo menos 100 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que os pelo menos 100 nucleotídeos contíguos da sequência de nucleotídeos iniciam a transcrição em uma célula vegetal; em que o promotor preferencial de tecido é operacionalmente ligado a um gene morfogênico.Também são incluídos cassetes de expressão que compreendem um cassete de gene morfogênico. Os vetores que compreendem um cassete de expressão que compreende um cassete de gene morfogênico também são incluídos.

[0009] Ademais, as células vegetais e plantas que compreendem um cassete de expressão que compreende um cassete de gene morfogênico são fornecidas, as quais compreendem um promotor preferencial de tecido que tem uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em uma sequência de nucleotídeos de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 95% de identidade com pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% de identidade com pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; um fragmento ou variante da sequência de nucleotídeos de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que o fragmento ou variante da sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; e pelo menos 100 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que os pelo menos 100 nucleotídeos contíguos da sequência de nucleotídeos iniciam a transcrição em uma célula vegetal; em que o promotor preferencial de tecido é operacionalmente ligado a um gene morfogênico.

As células vegetais e plantas que compreendem um cassete de expressão que compreende um cassete de gene morfogênico incluem monocotiledôneas, dicotiledôneas e gimnospermas.

As células vegetais e plantas que compreendem um cassete de expressão que compreende um cassete de gene morfogênico incluem monocotiledôneas, dicotiledôneas e gimnospermas incluindo, mas sem limitações, milho, alfafa, sorgo, arroz, milheto, soja, trigo, algodão, girassol, cevada, aveia, centeio, linho, cana de açúcar, banana, mandioca, feijão comum, feijão-frade, tomate, batata, beterraba, uva, eucalipto, choupo, pinho, douglásia, cítricos, mamão, cacau, pepino, maçã, Capsicum, bambu, triticale, melão e Brassica, também são fornecidas.

A presente revelação também fornece uma célula vegetal ou planta que compreende um cassete de expressão que compreende um cassete de gene morfogênico, em que o gene morfogênico do cassete de gene morfogênico codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX, em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, ou 148; ou em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado por uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, ou 147.Também é fornecida uma célula vegetal ou planta que compreende um cassete de expressão que compreende um cassete de gene morfogênico, em que o gene morfogênico do cassete de gene morfogênico codifica um produto genético envolvido no metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgãos, desenvolvimento de células-tronco, estimulação do crescimento celular, organogênese, regeneração, iniciação de embriogênese somática, maturação acelerada do embrião somático, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema apical, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema de broto, iniciação e/ou desenvolvimento de brotos ou uma combinação dos mesmos.

[0010] A presente revelação também fornece células vegetais e plantas que compreendem um cassete de expressão que compreende um cassete de gene morfogênico, em que o cassete de expressão compreende adicionalmente um cassete de gene de traço que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica um produto genético que confere reforço nutricional, rendimento aumentado, tolerância ao estresse abiótico, tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a pragas, resistência a patógenos, resistência a insetos, eficiência de uso de nitrogênio (NUE), resistência a doenças ou uma capacidade para alterar uma via metabólica. A presente revelação também fornece células vegetais e plantas que compreendem um cassete de expressão que compreende um cassete de gene morfogênico, em que o cassete de expressão compreende ainda um cassete de gene de traço que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica um produto genético que confere reforço nutricional, rendimento aumentado, tolerância ao estresse abiótico, tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a pragas, resistência a patógenos, resistência a insetos, eficiência de uso de nitrogênio (NUE), resistência a doenças ou uma capacidade para alterar uma via metabólica e um cassete de recombinase específica de sítio que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um recombinase específica de sítio selecionada dentre o grupo que consiste em FLP, FLPe, KD, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, B2, B3, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153, em que a recombinase específica de sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor específico de tecido ou um promotor regulado por desenvolvimento.Também são fornecidos promotores constitutivos, promotores induzíveis, promotores específicos de tecido e promotores regulados por desenvolvimento selecionados dentre o grupo que consiste em UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2- 2, NOS, a versão -135 de 35S, ZM-ADF PRO (ALT2), AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A, AT-HSP811, AT- HSP811L, GM-HSP173B, promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona, PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A ou LEA-D34.Também são fornecidas células vegetais e plantas em que o cassete de gene morfogênico e o cassete de recombinase específica de sítio do cassete de expressão são expressos de maneira transitória nas células vegetais e plantas e o cassete de gene de traço do cassete de expressão é estavelmente incorporado no genoma das células vegetais e plantas.Também são fornecidas células vegetais e plantas em que o cassete de gene morfogênico e o cassete de recombinase específica de sítio do cassete de expressão são excisadas das células vegetais e plantas e o cassete de gene de traço do cassete de expressão é incorporado de maneira estável no genoma das células vegetais e plantas.Uma semente de uma planta também é fornecida, em que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão.

[0011] A revelação fornece ainda um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeos capaz de iniciar a transcrição em uma planta ou uma célula vegetal, em que a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 100 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos com capacidade para iniciar a transcrição é operacionalmente ligada a um gene morfogênico.

[0012] Também é fornecido um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende um fragmento ou variante funcional com capacidade para iniciar a transcrição em uma planta ou uma célula vegetal, em que o fragmento ou variante funcional é derivada de uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que o fragmento ou variante funcional com capacidade para iniciar a transcrição é operacionalmente ligada a um gene morfogênico.

[0013] A revelação também fornece um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeos capaz de iniciar a transcrição em uma planta ou uma célula vegetal, em que a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 70% de identidade com uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos com capacidade para iniciar a transcrição é operacionalmente ligada a um gene morfogênico.

[0014] Também é fornecido um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeos com capacidade para iniciar a transcrição em uma planta ou uma célula vegetal, em que a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 95% de identidade com uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos com capacidade para iniciar a transcrição é operacionalmente ligada a um gene morfogênico.

[0015] Cassete de expressão caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeos com capacidade para iniciar a transcrição em uma planta ou uma célula vegetal, em que a sequência de nucleotídeos é selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos com capacidade para iniciar a transcrição é operacionalmente ligada a um gene morfogênico também é fornecido.

[0016] Também são fornecidos métodos para produzir uma planta transgênica, em que o método compreende transformar uma célula vegetal com um cassete de expressão recombinante que compreende (a) um cassete de promotor preferencial de tecido, em que o cassete de promotor preferencial de tecido compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em: pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia transcrição na célula vegetal; uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; uma sequência de nucleotídeos que é um fragmento ou variante de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; ou uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos um fragmento de 100 bp de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal, em que a sequência de nucleotídeos é operacionalmente ligada a um gene morfogênico e (b) um cassete de gene de traço que compreende um polinucleotídeo heterólogo de interesse que codifica um produto genético que confere reforço nutricional, rendimento aumentado, tolerância ao estresse abiótico, tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a pragas, resistência a patógenos, resistência a insetos, eficiência de uso de nitrogênio (NUE), resistência a doenças ou uma capacidade para alterar uma via metabólica; selecionar uma célula vegetal transgênica que tem o cassete de expressão recombinante; e regenerar a planta transgênica da célula vegetal transgênica.

[0017] Também são fornecidas células vegetais monocotiledôneas, células vegetais dicotiledôneas e células vegetais gimnospermas úteis nos métodos para produzir uma planta transgênica da revelação. As células vegetais úteis nos métodos da revelação incluem monocotiledôneas, dicotiledôneas e gimnospermas incluindo, mas sem limitações, milho, alfafa, sorgo, arroz, milheto, soja, trigo, algodão, girassol, cevada, aveia, centeio, linho, cana de açúcar, banana, mandioca, feijão comum, feijão-frade, tomate, batata, beterraba, uva, eucalipto, choupo, pinho, douglásia, cítricos, mamão, cacau, pepino, maçã, Capsicum, bambu, triticale, melão e Brassica, também são fornecidas.

[0018] A presente revelação também fornece métodos para produzir uma planta transgênica, em que o método compreende transformar uma célula vegetal com um cassete de expressão recombinante que compreende um cassete de promotor preferencial de tecido revelado no presente documento, em que o gene morfogênico codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX, em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, ou 148; ou em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado por uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:60, 62, 64, 66,

68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, ou 147.Também são fornecidos métodos para produzir uma planta transgênica, em que o método compreende transformar uma célula vegetal com um cassete de expressão recombinante que compreende um cassete de promotor preferencial de tecido revelado no presente documento, em que o gene morfogênico codifica um produto genético envolvido no metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgãos, desenvolvimento de células-tronco, estimulação do crescimento celular, organogênese, regeneração, iniciação de embriogênese somática, maturação acelerada do embrião somático, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema apical, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema de broto, iniciação e/ou desenvolvimento de brotos ou uma combinação dos mesmos.

[0019] Também são fornecidos métodos para produzir uma planta transgênica, em que o método compreende transformar uma célula vegetal com um cassete de expressão recombinante que compreende um cassete de promotor preferencial de tecido revelado no presente documento, em que o cassete de expressão recombinante compreende adicionalmente um cassete de recombinase específica de sítio que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica de sítio selecionada dentre o grupo que consiste em FLP, FLPe, KD, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, B2, B3, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153, em que a recombinase específica de sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor específico de tecido ou um promotor regulado por desenvolvimento.Também são fornecidos métodos para produzir uma planta transgênica, em que o método compreende transformar uma célula vegetal com um cassete de expressão recombinante que compreende um cassete de promotor preferencial de tecido e um cassete de recombinase específica de sítio revelado no presente documento, em que o promotor constitutivo, o promotor induzível, o promotor específico de tecido ou promotor regulado por desenvolvimento é selecionado dentre o grupo que consiste em UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S, ZM-ADF PRO (ALT2), AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A, AT-HSP811, AT-HSP811L, GM-HSP173B, promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona, PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A ou LEA-D34.

[0020] Também são fornecidos métodos para produzir uma planta transgênica, em que o método compreende adicionalmente excisar o cassete de promotor preferencial de tecido e o cassete de recombinase específica de sítio do cassete de expressão recombinante. As plantas transgênicas produzidas pelos métodos revelados no presente documento também são fornecidas. A semente contendo o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante produzido a partir das plantas transgênicas produzidas pelos métodos revelados no presente documento também é fornecida.

[0021] Também são fornecidos métodos para produzir uma planta transgênica, em que o cassete de promotor preferencial de tecido compreende um primeiro T-DNA e o cassete de gene de traço compreende um segundo T-DNA.Também são fornecidos métodos para produzir uma planta transgênica, em que o primeiro T-DNA e o segundo T-DNA residem na mesma cepa bacteriana para transformar a célula vegetal.Também são fornecidos métodos para produzir a planta transgênica, em que os métodos compreendem adicionalmente segregar o primeiro T- DNA para longe do segundo T-DNA. As plantas transgênicas assim produzidas também são fornecidas. A semente das plantas transgênicas assim produzidas, em que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante, também é fornecida.

[0022] Também são fornecidos métodos para produzir uma planta transgênica, em que o primeiro T-DNA reside em uma primeira cepa bacteriana e o segundo T-DNA reside em uma segunda cepa bacteriana e a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana são misturadas em uma razão para transformar a célula vegetal.Também são fornecidos métodos para produzir a planta transgênica, em que os métodos compreendem adicionalmente segregar o primeiro T-DNA para longe do segundo T-DNA. As plantas transgênicas assim produzidas também são fornecidas. A semente das plantas transgênicas assim produzidas, em que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante, também é fornecida.

[0023] Os métodos para aprimorar a eficácia de maturação de embrião somático, em que o método compreende transformar uma célula vegetal com um cassete de expressão recombinante que compreende (a) um cassete de promotor preferencial de tecido, em que o cassete de promotor preferencial de tecido compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em: pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia transcrição na célula vegetal; uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; uma sequência de nucleotídeos que é um fragmento ou variante de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; ou uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos um fragmento de 100 bp de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal, em que a sequência de nucleotídeos é operacionalmente ligada a um gene morfogênico e (b) um cassete de gene de traço que compreende um polinucleotídeo heterólogo de interesse que codifica um produto genético que confere reforço nutricional, rendimento aumentado, tolerância ao estresse abiótico, tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a pragas, resistência a patógenos, resistência a insetos, eficiência de uso de nitrogênio (NUE), resistência a doenças ou uma capacidade para alterar uma via metabólica; selecionar uma célula vegetal transgênica que tem o cassete de expressão recombinante; e regenerar a planta transgênica da célula vegetal transgênica, em que o cassete de expressão recombinante resulta em eficácia aprimorada de maturação de embrião somático em comparação com uma célula vegetal transgênica que não compreende o cassete de expressão recombinante.

[0024] Também são fornecidas células vegetais monocotiledôneas, células vegetais dicotiledôneas e células vegetais gimnospermas úteis nos métodos para aprimorar a eficácia de maturação de embrião somático da revelação. As células vegetais úteis nos métodos da revelação incluem monocotiledôneas, dicotiledôneas e gimnospermas incluindo, mas sem limitações, milho, alfafa, sorgo, arroz, milheto, soja, trigo, algodão, girassol, cevada, aveia, centeio, linho, cana de açúcar, banana, mandioca, feijão comum, feijão-frade, tomate, batata, beterraba, uva, eucalipto, choupo, pinho, douglásia, cítricos, mamão, cacau, pepino, maçã, Capsicum, bambu, triticale, melão e Brassica, também são fornecidas.

[0025] A presente revelação também fornece métodos para aprimorar a eficácia de maturação de embrião somático, em que o método compreende transformar uma célula vegetal com um cassete de expressão recombinante que compreende um cassete de promotor preferencial de tecido revelado no presente documento, em que o gene morfogênico codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX, em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, ou 148; ou em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado por uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, ou 147.Também são fornecidos métodos para aprimorar a eficácia de maturação de embrião somático, em que o método compreende transformar uma célula vegetal com um cassete de expressão recombinante que compreende um cassete de promotor preferencial de tecido revelado no presente documento, em que o gene morfogênico codifica um produto genético envolvido no metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgãos, desenvolvimento de células-tronco, estimulação do crescimento celular, organogênese, regeneração, iniciação de embriogênese somática, maturação acelerada do embrião somático, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema apical, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema de broto, iniciação e/ou desenvolvimento de brotos ou uma combinação dos mesmos.

[0026] Também são fornecidos métodos para aprimorar a eficácia de maturação de embrião somático, em que o método compreende transformar uma célula vegetal com um cassete de expressão recombinante que compreende um cassete de promotor preferencial de tecido revelado no presente documento, em que o cassete de expressão recombinante compreende adicionalmente um cassete de recombinase específica de sítio que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica de sítio selecionada dentre o grupo que consiste em FLP, FLPe, KD, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, B2, B3, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153, em que a recombinase específica de sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor específico de tecido ou um promotor regulado por desenvolvimento.Também são fornecidos métodos para aprimorar a eficácia de maturação de embrião somático, em que o método compreende transformar uma célula vegetal com um cassete de expressão recombinante que compreende um cassete de promotor preferencial de tecido e um cassete de recombinase específica de sítio revelado no presente documento, em que o promotor constitutivo, o promotor induzível, o promotor específico de tecido ou o promotor regulado por desenvolvimento é selecionado dentre o grupo que consiste em UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S, ZM-ADF PRO (ALT2), AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A, AT-HSP811, AT-HSP811L, GM-HSP173B, promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona, PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A ou LEA-D34.

[0027] Também são fornecidos métodos para aprimorar a eficácia de maturação de embrião somático, em que o método compreende adicionalmente excisar o cassete de promotor preferencial de tecido e o cassete de recombinase específica de sítio do cassete de expressão recombinante. As plantas transgênicas produzidas pelos métodos revelados no presente documento também são fornecidas. A semente contendo o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante produzido a partir das plantas transgênicas produzidas pelos métodos revelados no presente documento também é fornecida.

[0028] Também são fornecidos métodos para aprimorar a eficácia de maturação de embrião somático, em que o cassete de promotor preferencial de tecido compreende um primeiro T-DNA e o cassete de gene de traço compreende um segundo T-DNA.Também são fornecidos métodos para aprimorar a eficácia de maturação de embrião somático, em que o primeiro T-DNA e o segundo T-DNA residem na mesma cepa bacteriana para transformar a célula vegetal.Também são fornecidos métodos para aprimorar a eficácia de maturação de embrião somático, em que os métodos compreendem adicionalmente segregar o primeiro T-DNA para longe do segundo T-DNA. As plantas transgênicas assim produzidas também são fornecidas. A semente das plantas transgênicas assim produzidas, em que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante, também é fornecida.

[0029] Também são fornecidos métodos para aprimorar a eficácia de maturação de embrião somático, em que o primeiro T-DNA reside em uma primeira cepa bacteriana e o segundo T-DNA reside em uma segunda cepa bacteriana e a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana são misturadas em uma razão para transformar a célula vegetal.Também são fornecidos métodos para aprimorar a eficácia de maturação de embrião somático, em que os métodos compreendem adicionalmente segregar o primeiro T-DNA para longe do segundo T-DNA. As plantas transgênicas assim produzidas também são fornecidas. A semente das plantas transgênicas assim produzidas, em que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante, também é fornecida.

[0030] Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, o método que compreende transformar uma célula vegetal dicotiledônea ou uma célula vegetal gimnosperma com um cassete de expressão recombinante que compreende (a) um cassete de promotor preferencial de tecido, em que o cassete de promotor preferencial de tecido compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em: pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia transcrição na célula vegetal; uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; uma sequência de nucleotídeos que é um fragmento ou variante de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; ou uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos um fragmento de 100 bp de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal, em que a sequência de nucleotídeos iniciando a transcrição na célula vegetal é operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX e (b) um cassete de gene de traço que compreende um polinucleotídeo heterólogo de interesse que codifica um produto genético conferindo reforço nutricional,

rendimento aumentado, tolerância ao estresse abiótico, tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicida, resistência a praga, resistência a patógeno, resistência a inseto, eficiência de uso de nitrogênio (NUE), resistência a doença ou uma capacidade para alterar uma via metabólica; permitindo a expressão do cassete de expressão recombinante em cada célula vegetal transformada para formar um embrião somático ou um broto; e germinar o embrião somático ou cultivar o broto para formar a planta dicotiledônea transgênica ou a planta gimnosperma transgênica em que a planta dicotiledônea transgênica ou a planta gimnosperma transgênica compreende o polinucleotídeo heterólogo de interesse. O método revelado também fornece o embrião somático ou a formação de broto em cerca de 21 a cerca de 28 dias após a iniciação da transformação da célula dicotiledônea ou da célula gimnosperma.

[0031] Também são fornecidas células vegetais gimnospermas úteis nos métodos para produzir uma planta transgênica da revelação. As células vegetais gimnospermas úteis nos métodos da revelação incluindo, porém, sem limitações, pinha e douglásia,também são fornecidas.Também são fornecidas células vegetais dicotiledôneas úteis nos métodos para produzir uma planta transgênica da revelação. As células vegetais dicotiledôneas úteis nos métodos da revelação incluindo, porém, sem limitações, alfafa, soja, algodão, girassol, linho, mandioca, feijão comum, feijão-frade, tomate, batata, beterraba, uva, eucalipto, choupo, cítricos, mamão, cacau, pepino, maçã, Capsicum, melão ou Brassica, também são fornecidas.

[0032] A presente revelação também fornece métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que o método compreende a transformação de uma célula vegetal dicotiledônea ou uma célula vegetal gimnosperma com um cassete de expressão recombinante que compreende um cassete de promotor preferencial de tecido revelado no presente documento, em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, ou 148; ou em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado por uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, ou

147.Também são fornecidos métodos para produzir uma planta transgênica, em que o método compreende transformar uma célula vegetal com um cassete de expressão recombinante que compreende um cassete de promotor preferencial de tecido revelado no presente documento, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX codifica um produto genético envolvido no metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgão, desenvolvimento de célula-tronco, estimulação de crescimento de célula, organogênese, regeneração, iniciação de embriogênese somática, maturação acelerada de embrião somático, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema apical, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema de broto, iniciação e/ou desenvolvimento de brotos ou uma combinação dos mesmos.

[0033] Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que o método compreende transformar uma célula vegetal dicotiledônea ou uma célula vegetal gimnosperma com um cassete de expressão recombinante que compreende um cassete de promotor preferencial de tecido revelado no presente documento, em que o cassete de expressão recombinante compreende adicionalmente um cassete de recombinase específica de sítio que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica de sítio selecionada dentre o grupo que consiste em FLP, FLPe, KD, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, B2, B3, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153, em que a recombinase específica de sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor específico de tecido ou um promotor regulado por desenvolvimento.Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que o método compreende transformar uma célula vegetal dicotiledônea ou uma célula vegetal gimnosperma com um cassete de expressão recombinante que compreende um cassete de promotor preferencial de tecido e um cassete de recombinase específica de sítio revelado no presente documento, em que o promotor constitutivo, o promotor induzível, o promotor específico de tecido ou promotor regulado por desenvolvimento é selecionado dentre o grupo que consiste em UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S, ZM-ADF PRO (ALT2), AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A, AT-HSP811, AT-HSP811L, GM- HSP173B, promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona, PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A ou LEA-D34.

[0034] Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que o método compreende ainda excisar o cassete de promotor preferencial de tecido e o cassete de recombinase específica de sítio do cassete de expressão recombinante. As plantas dicotiledôneas transgênicas ou plantas gimnospermas transgênicas produzidas pelos métodos revelados no presente documento também são fornecidas. A semente contendo o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante produzida a partir das plantas dicotiledôneas transgênicas ou das plantas gimnospermas transgênicas produzidas pelos métodos revelados no presente documento também é fornecida.

[0035] Também são fornecidos métodos para produzir plantas dicotiledôneas transgênicas ou plantas gimnospermas transgênicas, em que o cassete de promotor preferencial de tecido compreende um primeiro T-DNA e o cassete de gene de traço compreende um segundo T-DNA.Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que o primeiro T-DNA e o segundo T-DNA residem na mesma cepa bacteriana para transformar a célula vegetal.Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que os métodos compreendem adicionalmente segregar o primeiro T-DNA para longe do segundo T-DNA. As plantas transgênicas assim produzidas também são fornecidas. A semente das plantas dicotiledôneas transgênicas ou plantas gimnospermas transgênicas assim produzidas, em que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante, também é fornecida.

[0036] Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que o primeiro T-DNA reside em uma primeira cepa bacteriana e o segundo T-DNA reside em uma segunda cepa bacteriana e a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana são misturadas em uma razão para transformar a célula vegetal dicotiledônea ou a célula vegetal gimnosperma.Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que os métodos compreendem adicionalmente segregar o primeiro T-DNA para longe do segundo T-DNA. As plantas transgênicas assim produzidas também são fornecidas. A semente das plantas dicotiledôneas transgênicas ou plantas gimnospermas transgênicas assim produzidas, em que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante, também é fornecida.

[0037] Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, que compreende: (a)transformar uma célula de um explante de dicotiledônea ou um explante de gimnosperma com um cassete de expressão recombinante que compreende um cassete de gene de traço que compreende um gene heterólogo de interesse e um cassete de gene morfogênico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; (b) permitir a expressão do cassete de expressão recombinante de (a) em cada célula transformada para formar um embrião somático ou um broto; e (c) germinar o embrião somático ou cultivar o broto para formar a planta dicotiledônea transgênica ou a planta gimnosperma transgênica. O método revelado também fornece o embrião somático ou a formação de broto em cerca de 21 a cerca de 28 dias após a iniciação da transformação da célula dicotiledônea ou da célula gimnosperma.

[0038] Também são fornecidas células vegetais dicotiledôneas e células vegetais gimnospermas úteis nos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica da revelação. As células vegetais úteis nos métodos da revelação incluem dicotiledôneas e gimnospermas incluindo, porém, sem limitações, alfafa, soja, algodão, girassol, linho, mandioca, feijão comum, feijão- frade, tomate, batata, beterraba, uva, eucalipto, choupo, pinha, douglásia, cítricos, mamão, cacau, pepino, maçã, Capsicum, melão ou Brassica.

[0039] A presente revelação também fornece métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, ou 148; ou em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado por uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID

NOS:60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, ou 147.Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado por um nucleotídeo que codifica um produto genético envolvido no metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgão, desenvolvimento de célula- tronco, estimulação de crescimento de célula, organogênese, regeneração, iniciação de embriogênese somática, maturação acelerada de embrião somático, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema apical, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema de broto, iniciação e/ou desenvolvimento de brotos ou uma combinação dos mesmos.

[0040] Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligado a um promotor selecionado dentre o grupo que consiste em um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor específico de tecido ou um promotor regulado por desenvolvimento.Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que o promotor constitutivo, o promotor induzível, o promotor específico de tecido ou o promotor regulado por desenvolvimento é selecionado dentre o grupo que consiste em UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2- 2, NOS, a versão -135 de 35S, ZM-ADF PRO (ALT2), AXIG1, DR5,

XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A, AT-HSP811, AT- HSP811L, GM-HSP173B, promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona, PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A, LEA-D34, pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, um fragmento ou uma variante de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189 ou pelo menos um fragmento de 100 bp de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189.

[0041] Também são fornecidos métodos para produzir a planta dicotiledônea transgênica ou a planta gimnosperma transgênica, em que o polinucleotídeo heterólogo de interesse codifica um produto genético que confere reforço nutricional, rendimento aumentado, tolerância ao estresse abiótico, tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicida, resistência a praga, resistência a patógeno, resistência a inseto, eficiência de uso de nitrogênio (NUE), resistência a doença ou uma capacidade para alterar uma via metabólica.

[0042] Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que o cassete de expressão recombinante compreende ainda um cassete de recombinase específica de sítio que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica de sítio selecionada dentre o grupo que consiste em FLP, FLPe, KD, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, B2, B3, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153, em que a recombinase específica de sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor específico de tecido ou um promotor regulado por desenvolvimento.Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que o promotor constitutivo, o promotor induzível, o promotor específico de tecido ou o promotor regulado por desenvolvimento é selecionado dentre o grupo que consiste em UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2- 2, NOS, a versão -135 de 35S, ZM-ADF PRO (ALT2), AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A, AT-HSP811, AT- HSP811L, GM-HSP173B, promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona, PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A ou LEA-D34.

[0043] Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que o método compreende ainda excisar o cassete de gene morfogênico e o cassete de recombinase específica de sítio do cassete de expressão recombinante. A planta dicotiledônea transgênica ou planta gimnosperma transgênica produzida pelos métodos revelados no presente documento também é fornecida. A semente contendo o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante produzido das plantas dicotiledôneas transgênicas ou as plantas gimnospermas transgênicas produzidas pelos métodos revelados no presente documento também são fornecidas.

[0044] Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que o cassete de gene morfogênico compreende um primeiro T-DNA e o cassete de gene de traço compreende um segundo T-DNA.Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que o primeiro T-DNA e o segundo T-DNA residem na mesma cepa bacteriana para transformar a célula vegetal.Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que os métodos compreendem adicionalmente segregar o primeiro T-DNA para longe do segundo T-DNA. As plantas dicotiledôneas transgênicas e plantas gimnospermas transgênicas assim produzidas também são fornecidas. A semente das plantas dicotiledôneas transgênicas e plantas gimnospermas transgênicas assim produzidas, em que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante, também é fornecida.

[0045] Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que o primeiro T-DNA reside em uma primeira cepa bacteriana e o segundo T-DNA reside em uma segunda cepa bacteriana e a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana são misturadas em uma razão para transformar a célula vegetal.Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que os métodos compreendem adicionalmente segregar o primeiro T-DNA para longe do segundo T-DNA. As plantas transgênicas assim produzidas também são fornecidas. A semente das plantas dicotiledôneas transgênicas e plantas gimnospermas transgênicas assim produzidas, em que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante, também é fornecida.

[0046] Também são fornecidos métodos para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica, em que germinar compreende transferir o embrião somático ou broto para um meio de maturação ou meio de germinação e formar a planta dicotiledônea transgênica ou a planta gimnosperma transgênica.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0047] A Figura 1 mostra a eficácia mediana de maturação de embrião somático de promotores GM-HBSTART2 (HBS2; SEQ ID NO:108), GM-HBSTART3 (HBS3; SEQ ID NO:1), GM-LTP3 (LTP3; SEQ ID NO:124), GM-MATE1 (MATE1; SEQ ID NO:109), GM-NED1 (NED1; SEQ ID NO:110) conduzindo a expressão de WUS (HBS2 (PHP80734; SEQ ID NO:113), HBS3 (PHP81343; SEQ ID NO:116), LTP3 (PHP80730; SEQ ID NO:112), MATE1 (PHP80736; SEQ ID NO:114) e NED1 (PHP81060; SEQ ID NO:115)) e o controle de TAG-RFP (sem gene de WUS) (PHP80728; SEQ ID NO:111).

[0048] As imagens da Figura 2A, da Figura 2B e da Figura 2C foram tomadas sob luz branca. As imagens da Figura 2D, da Figura 2E e da Figura 2F foram tomadas sob luz fluorescente para mostrar os eventos transgênicos. As imagens da Figura 2A, da Figura 2B, da Figura 2C, da Figura 2D, da Figura 2E e da Figura 2F foram tomadas ao mesmo tempo (5 a 6 semanas após a infecção por Agrobacterium). Os embriões somáticos mostrados na Figura 2A e na Figura 2D, o tratamento de controle de TAG- RFP (TAG-RFP de Controle; PHP80728; SEQ ID NO:111), são pequenos e subdesenvolvidos. Os embriões somáticos mostrados na Figura 2B e na Figura 2E, o tratamento de LTP3 PRO::WUS (PHP80730; SEQ ID NO:112) são aproximadamente 2 vezes maiores que aqueles no tratamento de controle de TAG-RFP. Os embriões somáticos mostrados na Figura 2C e na Figura 2F, o tratamento de HBS3 PRO::WUS (PHP81343; SEQ ID NO:116) são aproximadamente 5 vezes maiores que aqueles no tratamento de controle de TAG- RFP.

[0049] A Figura 3A e a Figura 3B ilustram o desenvolvimento normal e conjunto de semente dos eventos GM-HBS3 PRO::WUS.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0050] As revelações no presente documento serão descritas mais completamente doravante com referência aos desenhos anexos, em que alguns, porém não todos, os aspectos possíveis são mostrados.De fato, as revelações podem ser incorporadas em muitas formas diferentes e não devem ser interpretadas como limitadas aos aspectos apresentados no presente documento; em vez disso, esses aspectos são fornecidos de modo que esta invenção satisfaça os requisitos legais aplicáveis.

[0051] Muitas modificações e outros aspectos revelados no presente documento serão percebidos por um versado na técnica a qual as composições e métodos revelados pertencem que têm o benefício dos ensinamentos apresentados nas descrições a seguir e nos desenhos associados.Portanto, deve-se entender que as invenções não devem ser limitadas aos aspectos específicos revelados e que modificações e outros aspectos são concebidos como estando incluídos dentro do escopo das reivindicações anexas. Embora termos específicos sejam empregados no presente documento, os mesmos são usados em um sentido genérico e descritivo apenas e não com propósitos de limitação.

[0052] Deve-se entender também que a terminologia usada no presente documento se destina a descrever somente aspectos específicos e não pretende ser limitativa. Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, o termo "que compreende" pode incluir o aspecto de "que consiste em". A menos que sejam definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual as composições e os métodos revelados pertencem. Neste relatório descritivo e nas reivindicações a seguir, será feita referência a diversos termos que serão definidos no presente documento.

[0053] A estrutura de planta regenerável é definida como uma estrutura multicelular com capacidade de formar uma planta fértil totalmente funcional, como, mas sem limitação, meristema de broto, brotos, embriões somáticos, calo embriogênico, meristemas somáticos e/ou calo organogênico.

[0054] O embrião somático é definido como uma estrutura multicelular que progride através de estágios de desenvolvimento que são semelhantes ao desenvolvimento de um embrião zigótico, incluindo formação de embriões de estágio globular e de transição, formação de um eixo geométrico do embrião e um escutelo, e acúmulo de lipídios e amido. Os únicos embriões somáticos derivados de um embrião zigótico germinam para produzir únicas plantas não quiméricas, que podem derivar originalmente de uma única célula.

[0055] O calo embriogênico é definido como um a mistura friável ou não friável de células não diferenciadas ou particularmente não diferenciadas que subtendem proliferar embriões somáticos primários e secundários com capacidade de regenerar plantas férteis maduras.

[0056] O meristema somático é definido como uma estrutura multicelular que é semelhante ao meristema apical que é parte de um embrião derivado de semente, caracterizado como tendo um domo apical não diferenciado flanqueado por folha primordial e subtendido por iniciais vasculares, sendo que o domo apical origina uma planta vegetativa acima do solo.Tais meristemas somáticos podem formar agrupamentos únicos ou fundidos de meristemas.

[0057] O calo organogênico é definido como uma mistura compacta de estruturas de plantas em crescimento diferenciadas, incluindo, mas sem limitação, meristemas apicais, meristemas radiculares, folhas e raízes.

[0058] A germinação é o crescimento de uma estrutura regenerável para formar uma plântula que continua a crescer para produzir uma planta.

[0059] Uma planta transgênica é definida como uma planta madura, fértil que contém um transgene.

[0060] A revelação se refere a composições e métodos direcionados a uma molécula de ácido nucleico que compreende um promotor preferencial de tecido operacionalmente ligado a um gene morfogênico e métodos de seu uso. As composições de molécula de ácido nucleico da revelação compreendem as sequências de nucleotídeos para promotores preferenciais de tecido conhecidos como GM-HBSTART3 (SEQ ID NO: 1), GM-HBSTART3 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 2), A-ML1 (SEQ ID NO: 3), GM-ML1-Like (SEQ ID NO: 4), GM-ML1-Like (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 5), ZM- HBSTART3 (SEQ ID NO: 6), OS-HBSTART3 (SEQ ID NO: 7), A-PDF1 P2 (SEQ ID NO: 8), GM-PDF1 (SEQ ID NO: 9), GM-PDF1 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 10), SB-PDF1 (SEQ ID NO: 11), OS-PDF1 (SEQ ID NO: 12), OS-PDF1 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 13), PT-PDF1 (SEQ ID NO: 14), PT-PDF1 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 15), SI-PDF1 (SEQ ID NO: 16), SI-PDF1 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 17), A-PDF2 (SEQ ID NO: 18), GM-PDF2 (SEQ ID NO: 19), GM-PDF2 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 20), ZM-GL1 (SEQ ID NO: 21), A-PDF2a (SEQ ID NO: 22), A-PDF2a (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 23), GM-PDF2a (SEQ ID NO: 24), GM-PDF2a (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 25), OS-PDF2 (SEQ ID NO: 26), OS-PDF2 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 27), PT-PDF2 (SEQ ID NO: 28), PT-PDF2 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 29), VV-PDF2 (SEQ ID NO: 30), VV-PDF2 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 31), ZM-PDF2 (SEQ ID NO: 32), SI-PDF2 (SEQ ID NO: 33), SI-PDF2 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 34), VV-PDF2a (SEQ ID NO: 35), PT-PDF2a (SEQ ID NO: 36), PT-PDF2a (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 37), MT-PDF2 (SEQ ID NO: 38), MT-PDF2 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 39), A-HDG2 (SEQ ID NO: 40), GM-HDG2 (SEQ ID NO: 41), GM-HDG2 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 42), SB-HDG2 (SEQ ID NO: 43), SB-HDG2 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 44), A-CER6 (SEQ ID NO: 45), A-CER60 (SEQ ID NO: 46), A-CER60 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 47), GM-CER6 (SEQ ID NO: 48), GM-CER6 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 49), PT-CER6 (SEQ ID NO: 50), PT-CER6 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 51), VV-CER6 (SEQ ID NO: 52), VV-CER6 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 53), SB-CER6 (SEQ ID NO: 54), ZM-CER6 (SEQ ID NO: 55), SI-CER6 (SEQ ID NO: 56), SI-CER6 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 57), OS-CER6

(SEQ ID NO: 58), OS-CER6 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 59), GM- HBSTART2 (SEQ ID NO: 108), GM-MATE1 (SEQ ID NO: 109), GM-NED1 (SEQ ID NO: 110), GM-LTP3 (SEQ ID NO:124), A-ML1 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 125), A-CER6 (TRUNCADO1) (SEQ ID NO: 126), A-PDF1 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 149), A-PDF2 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 150), A-HDG2 (TRUNCADO) (SEQ ID NO: 151), A-ANL2 (SEQ ID NO: 152), e AT-CER6 (TRUNCADO2) (SEQ ID NO: 189) operacionalmente ligados a um gene morfogênico. A presente revelação fornece moléculas de ácidos nucleicos que compreendem pelo menos uma dentre as sequências de nucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189 e fragmentos e variantes das mesmas operacionalmente ligadas a um gene morfogênico. As composições compreendem ainda cassetes de expressão, construtos de DNA e vetores que compreendem moléculas de ácidos nucleicos que compreendem uma sequência de nucleotídeos de pelo menos uma dentre as sequências de nucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189 operacionalmente ligadas a um gene morfogênico.

[0061] Como usado no presente documento o termo “promotor preferencial de tecido revelado no presente documento” significa uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia transcrição em uma célula vegetal; uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% de identidade com pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; um fragmento ou variante da sequência de nucleotídeos de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que o fragmento ou variante inicia a transcrição em uma célula vegetal; pelo menos 100 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que os pelo menos 100 nucleotídeos contíguos da sequência de nucleotídeos iniciam a transcrição em uma célula vegetal; e pelo menos um fragmento de 100 bp da sequência de nucleotídeos de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que o pelo menos um fragmento de 100 bp da sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal.

[0062] Como usado no presente documento, o termo “gene morfogênico” significa um gene que, quando expresso ectopicamente, estimula a formação de uma estrutura derivada somaticamente que pode produzir uma planta.Mais precisamente, a expressão ectópica do gene morfogênico estimula a formação de novo de um embrião somático ou uma estrutura organogênica, como um meristema de broto, que pode produzir uma planta.Essa formação de novo estimulada ocorre na célula em que o gene morfogênico é expresso, ou em uma célula vizinha.Um gene morfogênico pode ser um fator de transcrição que regula a expressão de outros genes, ou um gene que influencia níveis de hormônio em um tecido vegetal, ambos os quais podem estimular alterações morfogênicas.Um gene morfogênico pode ser incorporado de maneira estável no genoma de uma planta ou pode ser expresso de maneira transitória. Um promotor preferencial de tecido da revelação é usado para expressar um gene morfogênico envolvido no metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgão, desenvolvimento de célula-tronco, estimulação de crescimento de célula, organogênese, regeneração, iniciação de embriogênese somática, maturação acelerada de embrião somático, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema apical, iniciação e/ou desenvolvimento de meristema de broto, iniciação e/ou desenvolvimento de brotos ou uma combinação dos mesmos, como genes WUS/WOX (WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 ou WOX9), consultar as patentes no U.S. 7.348.468 e

7.256.322 e publicações de Pedido de Patente no U.S. 20170121722 e 20070271628; Laux et al.(1996) Development 122:87 a 96; e Mayer et al.(1998) Cell 95:805 a 815; van der Graaff et al., 2009, Genome Biology 10:248; Dolzblasz et al., 2016, Mol. Plant 19:1028-39.É esperado que a modulação de WUS/WOX module o fenótipo de planta e/ou tecido vegetal incluindo metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgãos, desenvolvimento de células-tronco, estimulação do crescimento celular, organogênese, regeneração, iniciação de embriogênese somática, maturação acelerada do embrião somático, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema apical, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema de broto, iniciação e/ou desenvolvimento de brotos ou uma combinação dos mesmos.Expressão de WUS de Arabidopsis pode induzir células tronco em tecidos vegetativos, que podem se diferenciar em embriões somáticos (Zuo et al. (2002) Plant J 30:349 a

359).Também seria de interesse nesse sentido um gene MYB118 (consultar a Patente no U.S. 7.148.402), gene MYB115 (consultar Wang et al.(2008) Cell Research 224 a 235), um gene BABYBOOM (BBM; consultar Boutilier et al.(2002) Plant Cell 14:1737 a 1749), ou um gene CLAVATA (consultar, por exemplo, a Patente no U.S. 7.179.963).

[0063] Os genes morfogênicos úteis na presente revelação incluem, porém, sem limitações, genes WUS/WOX conhecidos na técnica assim como aqueles revelados no presente documento. Os genes morfogênicos incluem, porém, sem limitações, os genes WUS/WOX revelados no presente documento incluindo A-WUS (SEQ ID NO: 60), LJ-W (SEQ ID NO: 62), GM-W (SEQ ID NO: 64), CS-WUS (SEQ ID NO: 66), CR-WUS (SEQ ID NO: 68), AA-WUS (SEQ ID NO: 70), RS-WUS (SEQ ID NO: 72), BN-WUS (SEQ ID NO: 74), BO-WU (SEQ ID NO: 76), HA-WUS (SEQ ID NO: 78), PT-WUS (SEQ ID NO: 80), VV-WUS (SEQ ID NO: 82), A-WUS (otimizado com soja) (SEQ ID NO: 84), LJ-WUS(otimizado com soja) (SEQ ID NO: 86), MT-WUS (otimizado com soja) (SEQ ID NO: 88), PY-WUS (otimizado com soja) (SEQ ID NO: 90), PV-WUS (otimizado com soja) (SEQ ID NO: 92), ZM-WUS1 (SEQ ID NO: 94), ZM-WUS2 (SEQ ID NO: 96), ZM-WUS3 (SEQ ID NO: 98), ZM-WOX2A (SEQ ID NO: 100), ZM-WOX4 (SEQ ID NO: 102), ZM-WOX5A (SEQ ID NO: 104), ZM-WOX9 (SEQ ID NO: 106), GG- WUS (SEQ ID NO: 127), MD-WUS (SEQ ID NO: 129), ME-WUS (SEQ ID NO: 131), KF-WUS (SEQ ID NO: 133), GH-WUS (SEQ ID NO: 135), ZOSMA-WUS (SEQ ID NO: 137), AMBTR-WUS (SEQ ID NO: 139), AC-WUS (SEQ ID NO: 141), AH-WUS (SEQ ID NO: 143), CUCSA-WUS (SEQ ID NO: 145), e PINTA-WUS (SEQ ID NO: 147).

[0064] Os genes WUS/WOX revelados no presente documento codificam polipeptídeos homeobox WUS/WOX incluindo A-WUS (SEQ

ID NO: 61), LJ-W (SEQ ID NO: 63), GM-W (SEQ ID NO: 65), CS-WUS (SEQ ID NO: 67), CR-WUS (SEQ ID NO: 69), AA-WUS (SEQ ID NO: 71), RS-WUS (SEQ ID NO: 73), BN-WUS (SEQ ID NO: 75), BO-WU(SEQ ID NO: 77), HA-WUS (SEQ ID NO: 79), PT-WUS (SEQ ID NO: 81), VV-WUS (SEQ ID NO: 83), A-WUS (SEQ ID NO: 85), LJ-WUS (SEQ ID NO: 87), MT-WUS (SEQ ID NO: 89), PY-WUS (SEQ ID NO: 91), PV- WUS (SEQ ID NO: 93), ZM-WUS1 (SEQ ID NO: 95), ZM-WUS2 (SEQ ID NO: 97), ZM-WUS3 (SEQ ID NO: 99), ZM-WOX2A (SEQ ID NO: 101), ZM-WOX4 (SEQ ID NO: 103), ZM-WOX5A (SEQ ID NO: 105), ZM-WOX9 (SEQ ID NO: 107), GG- WUS (SEQ ID NO: 128), MD-WUS (SEQ ID NO: 130), ME-WUS (SEQ ID NO: 132), KF-WUS (SEQ ID NO: 134), GH-WUS (SEQ ID NO: 136), ZOSMA-WUS (SEQ ID NO: 138), AMBTR-WUS (SEQ ID NO: 130), AC-WUS (SEQ ID NO: 142), AH-WUS (SEQ ID NO: 144), CUCSA-WUS (SEQ ID NO: 146), e PINTA-WUS (SEQ ID NO: 148).

[0065] Os genes WUS/WOX revelados no presente documento incluem aqueles que codificam um polipeptídeo homeobox WUS/WOX, em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, ou 148; ou em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado por uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS:60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, ou 147.

[0066] Outros genes morfogênicos úteis na presente revelação incluem, porém, sem limitações, LEC1 (Lotan et al., 1998, Cell 93:1195 a 1205), LEC2 (Stone et al., 2008, PNAS 105:3151 a

3156; Belide et al., 2013, Plant Cell Tiss. Organ Cult 113:543 a 553), KN1/STM (Sinha et al., 1993. Genes Dev 7:787 a 795), o gene IPT de Agrobacterium (Ebinuma e Komamine, 2001, In vitro Cell. Dev Biol – Plant 37:103 a 113), MONOPTEROS-DELTA (Ckurshumova et al., 2014, New Phytol. 204:556 a 566), o gene Agrobacterium AV-6b (Wabiko e Minemura 1996, Plant Physiol. 112:939 a 951), a combinação dos genes Agrobacterium IAA-h e IAA-m (Endo et al., 2002, célula vegetal Rep., 20:923 a 928), o gene Arabidopsis SERK (Hecht et al., 2001, Plant Physiol. 127:803 a 816), o gene Arabiopsis AGL15 (Harding et al., 2003, Plant Physiol. 133:653 a 663).

[0067] Como usado no presente documento, o termo “fator de transcrição” significa uma proteína que controla a taxa de transcrição de genes específicos por ligação à sequência de DNA do promotor e regula de modo crescente ou de modo decrescente a expressão. Os exemplos de fatores de transcrição, que também são genes morfogênicos, incluem membros da família AP2/EREBP (incluindo as subfamílias BBM (ODP2), pletora e aintegumenta, proteínas de ligação de caixa de CAAT como LEC1 e HAP3 e membros das famílias MYB, bHLH, NAC, MADS, bZIP e WRKY.

[0068] Em um aspecto, o cassete ou construto de expressão recombinante compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX.Em vários aspectos, a expressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica um homeobox WUS/WOX ocorre por cerca de 21 a cerca de 28 dias após a iniciação da transformação.

[0069] Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX pode ser alvejada para excisão por uma recombinase específica de sítio.Portanto, a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX pode ser controlada por excisão em um momento desejado pós-transformação. Compreende-se que quando uma recombinase específica a sítio é usada para controlar a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX, o construto de expressão compreende sítios de excisão específicos a sítio adequados que flanqueiam as sequências de polinucleotídeos a serem excisadas, por exemplo, sítios Cre lox se Cre recombinase for utilizada.Não é necessário que a recombinase específica a sítio seja colocalizada no construto de expressão que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX.No entanto, em um aspecto, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio.

[0070] A recombinase específica a sítio usada para controlar a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX pode ser escolhida a partir de uma variedade de recombinases específicas a sítio adequadas.Por exemplo, em vários aspectos, a recombinase específica de sítio é FLP, FLPe, KD, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, B2 (Nern et al. (2011) PNAS Volume 108, no 34 páginas 14198 a 14203), B3 (Nern et al. (2011) PNAS Volume 108, no 34 páginas 14198 a 14203), Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. A recombinase específica a sítio pode ser um polipeptídeo de fusão desestabilizado. O polipeptídeo de fusão desestabilizado pode ser TETR(G17A)~CRE ou ESR(G17A)~CRE.

[0071] Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operativamente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor específico de tecido ou um promotor regulado em desenvolvimento. Os promotores constitutivos, promotores induzíveis, promotores específicos de tecido e promotores regulados por desenvolvimento adequados incluem UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S, ZM-ADF PRO (ALT2), AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2 (Kalla et al., 1994. Plant J. 6:849 a 860 e US5525716), HSP17.7, HSP26, HSP18A, AT-HSP811, AT-HSP811L, GM-HSP173B, promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona, PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A ou LEA-D34.

[0072] Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível operativamente ligado à recombinase específica a sítio é XVE. O promotor quimicamente induzível pode ser reprimido pelo repressor de tetraciclina (TETR), pelo repressor de etametsulfurona (ESR) ou pelo repressor de clorsulfurona (CR) e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. O repressor pode ser TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina.(Gatz, C., Frohberg, C. e Wendenburg, R. (1992) Stringent repression and homogeneous de-repression by tetracycline of a modified CaMV 35Spromoter in intact transgenic tobacco plants, Plant J. 2, 397 a 404). Alternativamente, o repressor pode ser ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona- metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona (US20110287936 incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade).

[0073] Em um aspecto, quando a expressão construto compreende sítios de excisão de recombinase específica de sítio, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX pode ser operacionalmente ligada a um promotor induzível de auxina, um promotor regulado por desenvolvimento, um promotor específico de tecido ou um promotor constitutivo. Os promotores induzíveis de auxina, promotores regulados por desenvolvimento, promotores específicos de tecido e promotores constitutivos exemplificativos úteis no presente contexto incluem UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S, ZM-ADF PRO (ALT2), AXIG1 (no U.S.6.838.593 incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade), DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A, AT-HSP811 (Takahashi, T et al.(1992) Plant Physiol. 99 (2): 383 a 390), AT-HSP811L (Takahashi, T et al. (1992) Plant Physiol. 99 (2): 383 a 390), GM-HSP173B (Schöffl, F. et al.(1984) EMBO J. 3(11): 2491 a 2497), promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona, PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A, LEA-D34, pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, um fragmento ou uma variante de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189 ou pelo menos um fragmento de 100 bp de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189.

[0074] A duração apropriada para a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX pode ser alcançada por uso de um promotor preferido de tecido revelado no presente documento incluindo, porém, sem limitações, pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, um fragmento ou uma variante de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189 ou pelo menos um fragmento de 100 bp de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS:1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e

189. Ao usar um cassete de gene morfogênico e um cassete de gene de traço para produzir plantas transgênicas é desejável ter a capacidade para segregar o locus de gene morfogênico para longe do locus de gene de traço em plantas cotransformadas para fornecer plantas transgênicas contendo apenas o gene de traço.Isso pode ser alcançado usando um sistema binário de dois T-DNAs de Agrobacterium tumefaciens, com duas variações nesse tema geral (consultar Miller et al., 2002).Por exemplo, no primeiro, um vetor de dois T-DNAs, em que os cassetes de expressão para genes morfogênicos e seleção de herbicida (isto é, HRA) são contidos dentro de um primeiro T-DNA e o cassete de gene de traço é contido dentro de um segundo T-DNA, em que ambos os T-DNAs residem em um único vetor binário.Quando uma célula vegetal é transformada por uma Agrobacterium contendo o plasmídeo de dois T-DNAs, uma alta porcentagem de células transformadas contêm ambos os T-DNAs que se integraram em diferentes localizações genômicas (por exemplo, em diferentes cromossomos).No segundo método, por exemplo, duas cepas de Agrobacterium, cada uma contendo um dentre os dois T-DNAs (o T-DNA de gene morfogênico ou o T-DNA de gene de traço), são misturadas em uma razão, e a mistura é usada para a transformação. Após a transformação usando esse método de Agrobacterium misturada, é observado a uma alta frequência que os eventos transgênicos recuperados contêm ambos os T-DNAs, frequentemente em localizações genômicas separadas.Para ambos os métodos de cotransformação, é observado que, em uma grande proporção dos eventos transgênicos produzidos, os dois loci de T-DNA segregam independentemente e as plantas T1 da progênie podem ser prontamente identificadas, em que os loci de T-DNA segregaram para longe um do outro, resultando na recuperação de semente de progênie que contém o gene de traço sem genes morfogênicos/genes herbicidas. Consultar Miller et al. Transgenic Res 11(4):381-96.

[0075] Os métodos fornecidos no presente documento dependem do uso de transferência de gene mediada por bactérias e/ou mediada por biolística para produzir células vegetais regeneráveis que têm uma sequência de nucleotídeos de interesse incorporada. As cepas bacterianas úteis nos métodos da revelação incluem, porém, sem limitações, uma Agrobacteria desarmada, bactérias Ochrobactrum ou bactérias Rhizobiaceae. Em um aspecto, as diferentes cepas bacterianas são selecionadas a partir de (i) uma Agrobacteria desarmada e bactérias Ochrobactrum, (ii) uma Agrobacteria desarmada e bactérias Rhizobiaceae e (iii) bactérias Rhizobiaceae e bactérias Ochrobactrum.

[0076] A Agrobacteria desarmada útil nos presentes métodos inclui, porém, sem limitações, AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 e LBA4404 THY-.

[0077] As cepas bacterianas de Ochrobactrum úteis nos presentes métodos incluem, porém, sem limitações, depósito de Ochrobactrum haywardense H1 NRRL B-67078, Ochrobactrumcytisi, Ochrobactrum daejeonense, Ochrobactrum oryzae, Ochrobactrum tritici LBNL124-A-10, HTG3-C-07, Ochrobactrumpecoris, Ochrobactrumciceri, Ochrobactrumgallinifaecis, Ochrobactrumgrignonense, Ochrobactrumguangzhouense, Ochrobactrumhaematophilum, Ochrobactrumintermedium, Ochrobactrumlupini, Ochrobactrumpituitosum, Ochrobactrumpseudintermedium, Ochrobactrumpseudogrignonense, Ochrobactrumrhizosphaerae, Ochrobactrumthiophenivorans, e Ochrobactrumtritici.

[0078] As cepas bacterianas de Rhizobiaceae úteis nos presentes métodos incluem, porém, sem limitações, Rhizobium lusitanum, Rhizobium rhizogenes, Agrobacterium rubi, Rhizobium multihospitium, Rhizobium tropici, Rhizobium miluonense, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli, Rhizobium leguminosarum. bv. viciae, Rhizobium leguminosarum Madison, Rhizobium leguminosarum USDA2370, Rhizobium leguminosarum USDA2408, Rhizobium leguminosarum USDA2668, Rhizobium leguminosarum 2370G, Rhizobium leguminosarum 2370LBA, Rhizobium leguminosarum 2048G, Rhizobium leguminosarum 2048LBA, Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli2668G, Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli2668LBA, Rhizobium leguminosarum RL542C, Rhizobium etli USDA 9032, Rhizobium etli bv. phaseoli, Rhizobium endophyticum, Rhizobium tibeticum, Rhizobium etli, Rhizobium pisi, Rhizobium phaseoli, Rhizobium fabae, Rhizobium hainanense, Arthrobacter viscosus, Rhizobium alamii, Rhizobium mesosinicum, Rhizobium sullae, Rhizobium indigoferae, Rhizobium gallicum, Rhizobium yanglingense, Rhizobium mongolense, Rhizobium oryzae, Rhizobium loessense, Rhizobium tubonense, Rhizobium cellulosilyticum, Rhizobium soli, Neorhizobium galegae,Neorhizobium vignae, Neorhizobium huautlense, Neorhizobium alkalisoli, Aureimonas altamirensis, Aureimonas frigidaquae, Aureimonas ureilytica.

Aurantimonas coralicida, Fulvimarina pelagi, Martelella mediterranea, Allorhizobium undicola, Allorhizobium vitis, Allorhizobium borbor, Beijerinckia fluminensis, Agrobacterium larrymoorei, Agrobacterium radiobacter, Rhizobium selenitireducens corrig.

Rhizobium rosettiformans, Rhizobium daejeonense, Rhizobium aggregatum, Pararhizobium capsulatum, Pararhizobium giardinii, Ensifer mexicanus, Ensifer terangae, Ensifer saheli, Ensifer kostiensis, Ensifer kummerowiae, Ensifer fredii, Sinorhizobium americanum, Ensifer arboris, Ensifer garamanticus, Ensifer meliloti, Ensifer numidicus, Ensifer adhaerens, Sinorhizobium sp., Sinorhizobium meliloti SD630, Sinorhizobiummeliloti USDA1002, Sinorhizobium fredii USDA205, Sinorhizobiumfredii SF542G, Sinorhizobiumfredii SF4404, e Sinorhizobium fredii SM542C. Consultar no U.S. 9.365.859 incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0079] Em um aspecto, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 50:50.Em um aspecto, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 25:75.Em um aspecto, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 10:90.Em um aspecto, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 5:95.Em um aspecto, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 1:99.Em um aspecto, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana são cepas bacterianas diferentes.

[0080] Os promotores da presente revelação incluem sequências de nucleotídeos que permitem a iniciação de transcrição em uma planta.Em aspectos específicos, os promotores permitem a iniciação de transcrição de uma maneira preferencial de tecido. Os construtos da revelação compreendem um promotor preferencial de tecido revelado no presente documento operacionalmente ligado a um gene morfogênico.

[0081] Os promotores preferenciais de tecido revelados no presente documento também encontram uso na construção de cassetes de expressão ou vetores para expressão subsequente de um polinucleotídeo heterólogo ou um polinucleotídeo de interesse em uma planta de interesse ou como sondas para o isolamento de outros promotores. A presente revelação fornece construtos de DNA isolados que compreendem as sequências de promotor de nucleotídeos apresentadas em pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189 operacionalmente ligadas ao gene morfogênico e opcionalmente que compreendem ainda um polinucleotídeo heterólogo ou polinucleotídeo de interesse.

[0082] Os aspectos da revelação incluem uma molécula de ácido nucleico que compreende um promotor que tem uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em: pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia transcrição em uma célula vegetal; uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% de identidade com pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; um fragmento ou variante da sequência de nucleotídeos de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que o fragmento ou variante inicia a transcrição em uma célula vegetal; pelo menos 100 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que os pelo menos 100 nucleotídeos contíguos da sequência de nucleotídeos iniciam a transcrição em uma célula vegetal; e pelo menos um fragmento de 100 bp da sequência de nucleotídeos de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que o pelo menos um fragmento de 100 bp da sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; em que o promotor é operacionalmente ligado a um gene morfogênico e opcionalmente que compreende ainda um polinucleotídeo heterólogo ou um polinucleotídeo de interesse. Também é incorporado um cassete de expressão que compreende o promotor que contém o ácido nucleico, um vetor que compreende o cassete de expressão e uma célula vegetal que compreende o cassete de expressão. Aspectos adicionais incluem uma célula vegetal ou planta, em que o cassete de expressão é expresso de maneira transitória ou integrado de maneira estável no genoma da célula vegetal ou planta, independentemente de células vegetais ou plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas, e uma planta que compreende o cassete de expressão descrito, independentemente de ser planta monocotiledônea ou dicotiledônea, em que a célula vegetal ou planta monocotiledônea ou dicotiledônea inclui milho, alfafa, sorgo, arroz, milheto, soja, trigo, algodão, girassol, cevada, aveia, centeio, linho, cana-de- açúcar, banana, mandioca, feijão comum, feijão-frade, tomate, batata, beterraba, uva, eucalipto, choupo, pinho, douglásia, cítricos, mamão, cacau, pepino, maçã, Capsicum, bambu, triticale, melão e Brassica.

[0083] Também é incorporada uma planta com o cassete de expressão descrito estavelmente incorporado ao genoma da planta, uma semente da planta, sendo que a semente compreende o cassete de expressão.É incorporada adicionalmente uma planta em que um gene ou produto genético de um polinucleotídeo heterólogo ou um polinucleotídeo de interesse confere reforço nutricional, rendimento aumentado, tolerância ao estresse abiótico, tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a pragas, resistência a patógenos, resistência a insetos, eficiência de uso de nitrogênio (NUE), resistência a doenças ou uma capacidade para alterar uma via metabólica.Uma planta em que a expressão de um polinucleotídeo heterólogo ou um polinucleotídeo de interesse altera o fenótipo da dita planta também é incorporada.Também é incorporado um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende um fragmento funcional que tem atividade promotora, sendo que o fragmento é derivado de uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que o fragmento funcional que tem atividade de promotor é operacionalmente ligado a um gene morfogênico.

[0084] A revelação engloba composições de ácido nucleico substancialmente purificadas ou isoladas.Uma molécula de ácido nucleico "isolada" ou "purificada" ou porção biologicamente ativa da mesma é substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando produzida através de técnicas recombinantes ou substancialmente livre de precursores químicos ou outras substâncias químicas quando quimicamente sintetizada.Um ácido nucleico "isolado” é substancialmente livre de sequências (que incluem sequências codificadoras de proteína) que naturalmente flanqueiam o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado.Por exemplo, em vários aspectos, a molécula de ácido nucleico isolada pode conter menos que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequências de nucleotídeos que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico em DNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucleico é derivado. As sequências da revelação podem ser isoladas da região não traduzida 5’ que flanqueia seus respectivos locais de iniciação de transcrição.

[0085] Fragmentos e variantes das sequências de nucleotídeo de promotor reveladas também são abrangidos pela presente revelação. Os fragmentos e variantes das sequências de promotor de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189 podem ser usados nos construtos de DNA da revelação. Conforme usado no presente documento, o termo "fragmento” se refere a uma porção da sequência de ácidos nucleicos.Fragmentos de sequências de promotores retêm a atividade biológica de iniciar transcrição, tal como conduzir transcrição de uma maneira constitutiva. Alternativamente, fragmentos de uma sequência de nucleotídeos que são úteis como sondas de hibridização podem não necessariamente reter atividade biológica. Os fragmentos de uma sequência de nucleotídeos para os promotores revelados no presente documento podem variar de pelo menos cerca de 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150, 1175, 1200,

1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375, 1400, 1425, 1450, 1475, 1500, 1525, 1550, 1575, 1600, 1625, 1650, 1675, 1700, 1725, 1750, 1775, 1800, 1825, 1850, 1875, 1900, 1925, 1950, 1975, 2000, 2025, 2050, 2075, 2100, 2125, 2150, 2175, 2200, 2225, 2250, 2275, 2300, 2325, 2350, 2375, 2400, 2425, 2450, 2475, 2500, 2525, 2550, 2575, 2600, 2625, 2650, 2675, 2700, 2725, 2750, 2775, 2800, 2825, 2850, 2875, 2900, 2925, 2950, 2975, 3000, 3025, 3050, 3075, 3100, 3125, 3150, 3175, 3200, 3225, 3250, 3275, 3300, 3325, 3350, 3375, 3400, 3425, 3450, 3475, 3500, 3525, 3550, 3575, 3600, 3625, 3650, 3675, 3700, 3725, 3750, 3775, 3800, 3825, 3850, 3875, 3900, 3925, 3950, 3975, 4000, 4025, 4050, 4075, 4100, 4125, 4150, 4175, 4200, 4225, 4250, 4275, 4300, 4325, 4350, 4375, 4400, 4425, 4450, 4475, 4500, 4525, 4550, 4575, 4600, 4625, 4650, 4675, 4700, 4725, 4750, 4775, 4800, 4825, 4850, 4875, 4900, 4925, 4950, 4975, 5000, 5025, 5050, 5075, 5100, 5125, 5150, 5175, 5200, 5225, 5250, 5275, 5300, 5325, 5350, 5375, 5400, 5425, 5450, 5475, 5500, 5525, 5550, 5575, 5600, 5625, 5650, 5675, 5700, 5725, 5750, 5775, 5800, 5825, 5850, 5875, 5900, 5925, 5950, 5975, 6000, 6025, 6050, 6075, 6100, 6125, 6150, 6175, 6200, ou 6225 nucleotídeos, e até o comprimento total de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e

189.Uma porção biologicamente ativa de um promotor pode ser preparada isolando-se uma porção das sequências de promotor da revelação e avaliando-se a atividade de transcrição da porção.

[0086] Conforme usado no presente documento, o termo "variantes" significa sequências que têm similaridade substancial com uma sequência de promotores revelada no presente documento.Uma variante compreende uma deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais locais internos dentro do polinucleotídeo nativo e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais locais no polinucleotídeo nativo. Conforme usado no presente documento, uma sequência de nucleotídeos "nativa" compreende uma sequência de nucleotídeos de ocorrência natural.Para sequências de nucleotídeos, variantes de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bastante conhecidas, tais como, por exemplo, técnicas de reação em cadeia de polimerase (PCR) e de hibridização conforme delineado no presente documento.

[0087] As sequências de nucleotídeos variantes também incluem sequências de nucleotídeos sinteticamente derivadas, como aquelas geradas, por exemplo, usando-se mutagênese de local direcionado.De modo geral, as variantes de uma sequência de nucleotídeos revelada no presente documento terão pelo menos 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, a 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com aquela sequência de nucleotídeos conforme determinado por programas de alinhamento de sequência descritos em outro local no presente documento usando parâmetros padrão. As variantes ativas biologicamente de uma sequência de nucleotídeos revelada no presente documento também são englobadas. As variantes ativas biologicamente incluem, por exemplo, as sequências de promotores nativas de uma sequência de nucleotídeos revelada no presente documento que tem uma ou mais substituições, deleções ou inserções de nucleotídeo. Atividade promotora pode ser medida com o uso de técnicas, tais como análise Northern blot, medições de atividade de repórter obtidas a partir de fusões transcricionais e semelhantes.

Consultar, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), doravante "Sambrook," incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.

Alternativamente, níveis de um gene repórter, tal como proteína verde fluorescente (GFP) ou proteína amarelo fluorescente (YFP) ou semelhantes produzidos sob o controle de um fragmento ou uma variante de promotor podem ser medidos.

Consultar, por exemplo, Matz et al. (1999) Nature Biotechnology 17:969 a 973; documento de Patente no U.S. 6.072.050, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência; Nagai et al. (2002) Nature Biotechnology 20(1):87 a 90. As sequências de nucleotídeos variantes também abrangem as sequências derivadas de um procedimento mutagênico e recombinogênico, como embaralhamento de DNA.

Com tal procedimento, uma ou mais sequências de nucleotídeos diferentes para o promotor podem ser manipuladas para criar um novo promotor.Dessa maneira, as bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de sequência relacionada que compreendem regiões de sequência que têm identidade de sequência substancial e podem ser recombinadas de modo homólogo in vitro ou in vivo.

As estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica.

Consultar, por exemplo, Stemmer, (1994) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

EUA 91:10.747 a 10.751; Stemmer, (1994) Nature 370:389 a 391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436 a 438; Moore et al. (1997) J.

Mol.

Biol. 272:336 a 347; Zhang et al. (1997)

Proc Natl. Acad. Sci. EUA 94:4.504 a 4.509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288 a 291 e documentos de Patente no U.S.

5.605.793 e 5.837.458, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0088] Métodos de mutagênese e alterações de sequências de nucleotídeos são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Kunkel, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 82:488 a 492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367 a 382; documento de Patente no U.S. 4.873.192; Walker e Gaastra, edições (1983) Techniques in Molecular Biology (Companhia de Publicação MacMillan, Nova Iorque) e as referências citadas nas mesmas, incorporadas no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0089] As sequências de nucleotídeos da revelação podem ser usadas para isolar sequências correspondentes de outros organismos, particularmente outras plantas, mais particularmente outras monocotiledôneas ou dicotiledôneas.Dessa maneira, métodos, tais como PCR, hibridização e semelhantes podem ser usados para identificar tais sequências com base em sua homologia de sequência com as sequências apresentadas no presente documento.Sequências isoladas com base em sua identidade de sequência com as sequências inteiras apresentadas no presente documento ou com fragmentos das mesmas estão englobadas pela presente revelação.

[0090] Em uma abordagem de PCR, iniciadores de oligonucleotídeo podem ser projetados para uso em reações de PCR para amplificar sequências de DNA correspondentes de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer planta de interesse.Métodos para projetar iniciadores de PCR e clonagem de PCR são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook, supra. Consultar também, Innis et al., edições (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nova Iorque); Innis e Gelfand, edições (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nova Iorque); e Innis e Gelfand, edições (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova Iorque), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.Métodos conhecidos de PCR incluem, porém não se limitam, aos métodos que usam iniciadores pareados, iniciadores aninhados, iniciadores únicos específicos, iniciadores degenerados, iniciadores específicos de gene, iniciadores específicos de vetor, iniciadores parcialmente não correspondidos e semelhantes.

[0091] Em técnicas de hibridização, toda ou parte de uma sequência de nucleotídeos conhecida é usada como uma sonda que se hibridiza seletivamente com outras sequências de nucleotídeos correspondentes presente em uma população de fragmentos de DNA genômico clonados ou fragmentos de cDNA (isto é, bibliotecas de genômicas ou de cDNA) a partir de um organismo escolhido. As sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos, e podem ser marcadas com um grupo detectável, tal como 32P, ou qualquer outro marcador detectável. Assim, por exemplo, sondas para hibridização podem ser produzidas marcando-se oligonucleotídeos sintéticos com base nos promotores da revelação.Métodos para preparação de sondas para hibridização e para construção de bibliotecas genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook, supra.

[0092] Por exemplo, uma sequência de promotores completa aqui revelada, ou uma ou mais porções da mesma, pode ser utilizada como uma sonda capaz de hibridar especificamente com sequências de promotores correspondentes e RNAs mensageiros.Para obter hibridização específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem sequências que são únicas dentre sequências de promotores e são, de modo geral, de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos em comprimento ou pelo menos cerca de 20 nucleotídeos em comprimento.Tais sondas podem ser usadas para amplificar sequências de promotores correspondentes a partir de uma planta escolhida através de PCR.Essa técnica pode ser usada para isolar sequências codificadoras adicionais de um organismo desejado ou como um ensaio de diagnóstico para determinar a presença de sequências codificadoras em um organismo.Técnicas de hibridização incluem exame de hibridização de bibliotecas de DNA em placa (sejam placas ou colônias, consultar, por exemplo, Sambrook, supra).

[0093] A hibridização de tais sequências pode ser executada sob condições estringentes. Os termos "condições estringentes" ou “condições de hibridização estringentes" são destinados a significar condições sob as quais uma sonda hibridizará a sua sequência-alvo até um grau maior de modo detectável do que outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre fundo). As condições estringentes são dependentes de sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Controlando a estringência das condições de hibridação e/ou de lavagem, as sequências alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir algum emparelhamento errado nas sequências de modo que sejam detectados graus mais baixos de similaridade (sondagem heteróloga).Geralmente, uma sonda é menor que cerca de 1.000 nucleotídeos em comprimento, menor de modo ideal que 500 nucleotídeos em comprimento.

[0094] Tipicamente, as condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor que cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon Na (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é de pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas (por exemplo, maiores que 50 nucleotídeos). As condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes, como formamida. Condições de baixa estringência exemplificativas incluem hibridização com uma solução de tampão de formamida a 30 a 35%, NaCl 1 M, SDS a 1% (sulfato de dodecila de sódio) a 37 °C e uma lavagem em SSC de 1 vez a 2 vezes (SSC de 20 vezes = NaCl 3,0 M/citrato trissódico 0,3 M) em 50 a 55 °C. Condições de estringência moderada exemplificativas incluem hibridização em formamida a 40 a 45%, NaCl 1,0 M, SDS a 1% a 37 °C e uma lavagem em SSC de 0,5 vez a 1 vez em 55 a 60 °C. Condições de estringência alta exemplificativa incluem hibridização em formamida a 50%, NaCl 1 M, SDS a 1% a 37 °C e um lavagem final em SSC de 0,1 vez em 60 a 65 °C por uma duração de pelo menos 30 minutos. A duração de hibridização é geralmente menor que cerca de 24 horas, usualmente cerca de 4 a cerca de 12 horas. A duração do tempo de lavagem será pelo menos um comprimento de tempo suficiente para alcançar o equilíbrio.

[0095] A especificidade é tipicamente a função de lavagens pós-hibridização, em que os fatores críticos são a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final.Para híbridos de DNA e DNA, o ponto de fusão térmica (Tm) pode ser aproximado da equação de Meinkoth e Wahl, (1984) Anal. Biochem 138:267 a 284: Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (% de GC) - 0,61 (% de forma) - 500/l; em que M é a molaridade de cátions monovalentes, % de GC é a porcentagem de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA, % de forma é a porcentagem de formamida na solução de hibridização e L é o comprimento dos pares de base em híbrido. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) à qual 50% de uma sequência-alvo complementar hibrida com uma sonda perfeitamente correspondente. A Tm é reduzida em cerca de 1 °C para cada 1% de emparelhamentos defeituosos, assim, Tm, condições de hibridação e/ou lavagem podem ser ajustadas para ocorrer hibridação com sequências da identidade desejada.Por exemplo, se as sequências com 90% de identidade são observadas, a Tm pode ser diminuída 10 °C. De modo geral, condições estringentes são selecionadas de modo a serem cerca de 5 °C menores que a Tm para a sequência específica e seu complemento em uma força iônica e pH definidos.No entanto, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4 °C menor que a Tm; condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10 °C menor que a Tm; condições de estringência baixa podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20 °C menor que a Tm.Usando a equação, composições de hibridação e lavagem e Tm desejada, os com perícia habitual entenderão que são inerentemente descritas variações na estringência das soluções de hibridação e/ou lavagem.Se o grau desejado de emparelhamentos defeituosos originar uma Tm menor do que 45 °C (solução aquosa) ou 32 °C (solução de formamida), é preferencial aumentar a concentração de SSC de modo a poder ser usada uma temperatura mais elevada.Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos encontra-se em Tijssen, (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte 1, Capítulo 2 (Elsevier, Nova Iorque); e Ausubel et al., edições (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing e Wiley- Interscience, Nova Iorque), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.Também consultar Sambrook supra. Assim, sequências isoladas que têm atividade promotora e que hibridizam sob condições estringentes com as sequências de promotores reveladas no presente documento ou com fragmentos das mesmas, são englobadas pela presente revelação.

[0096] Em geral, as sequências que têm atividade promotora e hibridizam com as sequências de promotor reveladas no presente documento serão pelo menos 40% a 50% homólogas, cerca de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% a 98% homólogas ou mais com as sequências reveladas.Isto é, a similaridade de sequência de sequências pode estar na faixa de, compartilhando pelo menos cerca de 40% a 50%, cerca de 60% a 70% e cerca de 80%, 85%, 90%, 95% a 98% de similaridade de sequência.

[0097] Os termos a seguir são usados para descrever as relações de sequência entre dois ou mais ácido nucleicos ou polinucleotídeos: (a) "sequência de referência", (b) "janela de comparação", (c) "identidade de sequência", (d) "porcentagem de identidade de sequência" e (e) "identidade substancial".

[0098] Conforme usado no presente documento, "sequência de referência" é uma sequência definida usada como base para comparação de sequências.Uma sequência de referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de uma sequência especificada; por exemplo, como um segmento de um cDNA ou sequência genética de comprimento completo ou o cDNA ou sequência genética completa.

[0099] Conforme usado no presente documento, "janela de comparação" se refere a um segmento contíguo e especificado de uma sequência de polinucleotídeos, sendo que a sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas sequências.Geralmente, a janela de comparação tem comprimento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos e, opcionalmente, pode ser de 30, 40, 50, 100 ou mais. Aqueles de habilidade na técnica entendem que para evitar uma alta similaridade com uma sequência de referência devido a inclusão de lacunas na sequência de polinucleotídeos, uma penalidade de lacuna é tipicamente introduzida e é subtraída do número de correspondências.

[0100] Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Assim, a determinação da percentagem de identidade de sequência entre quaisquer duas sequências pode ser realizada utilizando um algoritmo matemático.Exemplos sem limitação de tais algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller, (1988) CABIOS 4:11 a 17; o algoritmo de Smith et al. (1981) Adv.Appl. Math. 2:482; o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 a 453; o algoritmo de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 a 2448; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872:264, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5.873 a 5.877, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0101] As implantações de computador desses algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para comparação de sequências para determinar a identidade de sequência.Tais implantações incluem, porém sem limitação: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponível junto à Intelligenetics, Mountain View, Califórnia); o programa ALIGN (Versão 2.0) e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no GCG Wisconsin Genetics Software Package®, Versão 10 (disponível junto à Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Califórnia, EUA). Os alinhamentos com o uso desses programas podem ser realizados com o uso de parâmetros padrão. O programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins et al.(1998) Gene 73:237 a 244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151 a 153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10.881 a 10.890; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155 a 165; e Pearson et al.(1994) Meth.Mol. Biol. 24:307 a 331, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. O programa ALIGN é com base no algoritmo de

Myers e Miller, (1988) supra.Uma tabela de peso de resíduo PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12, e uma penalidade de lacuna de 4 podem ser usadas com o programa ALIGN durante a comparação de sequências de aminoácidos.

Os programas BLAST de Altschul et al. (1990) J.

Mol.

Biol. 215:403, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência, são com base no algoritmo de Karlin e Altschul, (1990) supra.

Buscas por nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências de nucleotídeos homólogas a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína da revelação.

Buscas por proteína BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas a uma proteína ou polipeptídeo da revelação.Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3.389, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.

Alternativamente, PSI-BLAST (em BLAST 2.0) pode ser usado para realizar uma busca iterada que detecta relações distantes entre moléculas.

Consultar Altschul et al. (1997) supra.Durante a utilização de BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTN para sequências de nucleotídeos, BLASTX para proteínas) podem ser usados.

Consultar o site na internet para o Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia na internet em ncbi.nlm.nih.gov.

O alinhamento também pode ser realizado manualmente por inspeção.

[0102] A não ser que determinado de outro modo, os valores de identidade/similaridade de sequência fornecidos aqui se referem ao valor obtido com o uso de GAP Versão 10 com o uso dos seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de nucleotídeos com o uso de Peso de GAP de 50 e Peso do Comprimento de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; % de identidade e % de similaridade para uma sequência de aminoácidos usando Peso de GAP de 8 e Peso do Comprimento de 2, e a matriz de pontuação BLOSUM62; ou qualquer programa equivalente a esses. Conforme usado no presente documento, "programa equivalente” é qualquer programa de comparação de sequência que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento que tem correspondências de resíduo de nucleotídeo ou aminoácido idênticas e uma porcentagem de identidade de sequência idêntica quando em comparação com o alinhamento correspondente gerado por GAP Versão 10.

[0103] O programa GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch, supra, para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que maximiza o número de correspondências e minimiza o número de lacunas.GAP considera todos os alinhamentos e posições de lacuna possíveis e cria o alinhamento com o maior número de bases correspondidas e o menor número de lacunas. O mesmo permite a provisão de uma penalidade de criação de lacuna e uma penalidade de extensão de lacuna em unidades de bases correspondidas.GAP deve se beneficiar do número de penalidade de criação de lacuna de correspondências para cada lacuna que insere.Se uma penalidade de extensão de lacuna maior que zero for escolhida, GAP deve, além disso, se beneficiar de cada lacuna inserida do comprimento da lacuna vezes a penalidade de extensão de lacuna.Valores de penalidade de criação de lacuna padrão e valores de penalidade de extensão de lacuna na Versão 10 do GCG Wisconsin Genetics Software Package® para sequências de proteína são 8 e 2, respectivamente.Para as sequências de nucleotídeos, a penalidade de criação de lacuna padrão é 50 enquanto a penalidade de extensão de lacuna padrão é 3. As penalidades de criação de lacuna e extensão de lacuna podem ser expressas como um número inteiro selecionado dentre o grupo de números inteiros que consiste em 0 a 200. Assim, por exemplo, as penalidades por criação de lacuna e extensão de lacuna podem ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou maiores.

[0104] GAP apresenta um membro da família de melhores alinhamentos.Pode haver muitos membros dessa família, mas nenhum outro membro tem uma qualidade melhor.GAP exibe quatro parâmetros de mérito para alinhamentos: Qualidade, Razão, Identidade e Similaridade. A Qualidade é a métrica maximizada para alinhar as sequências. A Razão é a Qualidade dividida pelo número de bases no segmento mais curto. A Percentagem de Identidade é a percentagem dos símbolos que se correspondem realmente. A Percentagem de Similaridade é a percentagem dos símbolos que são similares. Os símbolos que se encontram através de intervalos são ignorados.Uma similaridade é pontuada quando o valor da matriz de pontuação para um par de símbolos é maior ou igual a 0,50, o limiar de similaridade. A matriz de pontuação usada na Versão 10 do GCG Wisconsin Genetics Software Package® é BLOSUM62 (consultar Henikoff e

Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:10.915, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência).

[0105] Conforme usado no presente documento, "identidade de sequência" ou "identidade" no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo se refere aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada.Quando a porcentagem de identidade de sequência é usada em referência às proteínas, se reconhece que as posições de resíduo que não são idênticas se diferem frequentemente por substituições de aminoácido conservadoras, em que resíduos de aminoácido são substituídos por outros resíduos de aminoácido com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não alteram as propriedades funcionais da molécula.Quando as sequências diferem em substituições conservativas, a percentagem de identidade de sequência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. As sequências que diferem por tais substituições conservativas são ditas ter "semelhança de sequência" ou "semelhança".Meios para fazer este ajustamento são bem conhecidos dos especialistas na técnica.Tipicamente isto envolve a classificação de uma substituição conservativa como um emparelhamento errado parcial em vez de um completo, aumentando assim a percentagem de identidade de sequência. Assim, por exemplo, quando um aminoácido idêntico recebe uma pontuação de um e uma substituição não conservadora recebe uma pontuação de zero, uma substituição conservadora recebe uma pontuação entre zero e um. A pontuação de substituições conservadoras é calculada, por exemplo, conforme implantado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif.).

[0106] Conforme usado no presente documento, "porcentagem de identidade de sequência" significa o valor determinado comparando-se duas sequências alinhadas de maneira ideal sobre uma janela de comparação, sendo que a porção da sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando-se o número de posições em que a mesma base de ácido nucleico ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para gerar o número de posições correspondentes, dividindo-se o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando-se o resultado por 100 para gerar a percentagem de identidade de sequência.

[0107] O termo "identidade substancial" de sequências de polinucleotídeos significa que um polinucleotídeo compreende uma sequência que tem pelo menos 70% de identidade de sequência, de maneira ideal pelo menos 80%, de maneira mais ideal pelo menos 90% e de maneira ainda mais ideal pelo menos 95%, em comparação com uma sequência de referência que usa um programa de alinhamento que usa parâmetros padrão.Um versado na técnica reconhecerá que estes valores podem ser ajustados apropriadamente para determinar a identidade correspondente de proteínas codificadas por duas sequências de nucleotídeos, considerando a degenerescência de códons, semelhança de aminoácidos, posicionamento do quadro de leitura e semelhantes.Identidade substancial de sequências de aminoácidos para esses fins significa normalmente identidade de sequência de pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% e pelo menos 95%.

[0108] Outra indicação que as sequências de nucleotídeos são substancialmente idênticas é se duas moléculas hibridizam uma a outra sob condições severas.Geralmente, as condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5 °C inferiores à Tm para a sequência específica a uma força iônica e pH definidos. Contudo, as condições estringentes abrangem temperaturas na gama de cerca de 1 °C a cerca de 20 °C inferiores à Tm, dependendo do grau de estringência desejado, como de outro modo aqui qualificado. Os ácidos nucleicos que não hibridam entre si sob condições estringentes são ainda substancialmente idênticos se os polipeptídeos que codificam forem substancialmente idênticos.Tal pode ocorrer, por exemplo, quando é criada uma cópia de um ácido nucleico usando a degenerescência máxima de códons permitida pelo código genético.Uma indicação de que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é quando o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico tem imunologicamente reatividade cruzada com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico.

[0109] Os promotores preferenciais de tecido revelados no presente documento, assim como variantes e fragmentos dos mesmos, são úteis para engenharia genética de plantas, por exemplo, para produzir uma planta transformada ou transgênica, para expressar um fenótipo de interesse. Conforme usado no presente documento, os termos "planta transformada" e "planta transgênica" se referem a uma planta que compreende dentro do seu genoma um polinucleotídeo heterólogo.Geralmente, o polinucleotídeo heterólogo está integrado de forma estável no genoma de uma planta transgênica ou transformada de tal modo que o polinucleotídeo é passado para sucessivas gerações. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado no genoma sozinho ou como parte de uma construção de DNA recombinante.Deve ser entendido que, conforme usado no presente documento, o termo "transgênico" inclui qualquer célula, linhagem celular, calo, tecido, parte de planta ou planta em que o genótipo foi alterado pela presença de um ácido nucleico heterólogo que inclui aqueles transgênicos inicialmente alterados, assim como aqueles criados por cruzamentos sexuais ou propagação assexual a partir do transgênico inicial.

[0110] Um "evento" transgênico é produzido através de transformação de células vegetais com um construto de DNA heterólogo, que inclui um cassete de expressão de ácido nucleico que compreende um gene de interesse, a regeneração de uma população de plantas que resulta da inserção do gene transferido para o genoma da planta e seleção de uma planta caracterizada pela inserção em uma localização de genoma particular.Um evento é caracterizado fenotipicamente pela expressão do gene inserido.No nível genético, um evento é parte da composição genética de uma planta. O termo "evento" também se refere à progênie produzida através de um cruzamento sexual entre o transformante e outra planta em que a progênie inclui o DNA heterólogo.

[0111] O termo "planta" se refere a plantas inteiras, órgãos de planta, tecidos de planta, sementes, células de planta, sementes e progênie da mesma. As células vegetais incluem, mas sem limitação, células de sementes, culturas de suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos.

[0112] As partes de planta incluem tecidos diferenciados e não diferenciados que incluem, mas sem limitação, os seguintes: raízes, caules, brotos, folhas, pólen, sementes, tecido de tumor e várias formas de células e cultura (por exemplo, células individuais, protoplastos, embriões e tecido de calo). O tecido vegetal pode estar em uma planta ou em uma cultura celular, tecido ou órgão de planta.

[0113] A presente revelação também inclui plantas obtidas por meio de qualquer um dos métodos ou composições revelados no presente documento. A presente revelação também inclui sementes de uma planta obtidas através de qualquer um dos métodos ou composições reveladas no presente documento. O termo "planta" se refere a plantas inteiras, órgãos de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), tecidos de planta, células vegetais, partes de planta, sementes, propágulos, embriões e progênie das mesmas. As células vegetais podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calo, calo não diferenciado, embriões imaturos e maduros, embrião zigótico imaturo, cotiledônea imatura, eixo geométrico embrionário, células de cultura em suspensão, protoplastos, folha, células de folha, células de raiz, células de floema e pólen). As células vegetais incluem, sem limitação, células de sementes, culturas de suspensão, explantes, embriões imaturos, embriões, embriões zigóticos,

embriões somáticos, calo embrionário, meristema, meristemas somáticos, calo organogênico, protoplastos, embriões derivados de semente derivada de espiga madura, bases de folha, folhas de plantas maduras, pontas de folha, influorescências imaturas, borla, espiga imatura, sedas, cotiledôneas, cotiledôneas imaturas, eixos geométricos embrionários, regiões meristemáticas, tecido de calo, células de folhas, células de caules, células de raízes, células de brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos. As partes de planta incluem tecidos diferenciados e não diferenciados que incluem, mas não são limitados a, raízes, caules, brotos, folhas, pólen, sementes, tecido de tumor e diversas formas de células em cultura (por exemplo, células individuais, protoplastos, embriões e tecido de calo). O tecido vegetal pode estar em uma planta ou em uma cultura celular, tecido ou órgão de planta.Grão destina-se a significar a semente madura produzida por produtores comerciais para propósitos diferentes de cultivo ou reprodução da espécie. A progênie, as variantes e mutantes das plantas regeneradas também são incluídas no escopo da revelação, desde que essa progênie, variantes e mutantes compreendam os polinucleotídeos introduzidos.

[0114] A presente revelação pode ser usada para a transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, porém, sem limitações, monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindo, porém, sem limitações, milho, alfafa, sorgo, arroz, milheto, soja, trigo, algodão, girassol, cevada, aveia, centeio, linho, cana de açúcar, banana, mandioca, feijão comum, feijão-frade, tomate, batata, beterraba, uva, eucalipto, choupo, pinho, douglásia, cítricos, mamão, cacau, pepino, maçã, Capsicum,

bambu, triticale, melão e Brassica. As monocotiledôneas incluem, porém, sem limitações, cevada, milho (maís), milheto (por exemplo, milheto pérola (Pennisetum glaucum), milheto proso (Panicum miliaceum), milheto tipo rabo de raposa (Setaria italica), milheto tipo dedo (Eleusine coracana)), aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, triticale ou trigo ou culturas de folha e caule, incluindo, porém, sem limitações, bambu, grama marram, poa dos prados, juncos, azevém, cana de açúcar; gramados, gramíneas ornamentais e outras gramíneas como painço amarelo e relva. Alternativamente, as plantas dicotiledôneas usadas na presente revelação incluem, porém, sem limitações, couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da- Índia, alfafa, feijão-fava, tomate, amendoim, mandioca, soja, canola, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão.

[0115] As plantas superiores, por exemplo, classes de Angiospermae e Gymnospermae podem ser usadas na presente revelação. As plantas de espécies adequadas úteis na presente revelação podem ser provenientes da família Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae e Vitaceae. As plantas de membros do gênero Abelmoschus, Abies, Acer,

Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis e Zea podem ser usadas nos métodos da revelação.

[0116] As plantas importantes ou interessantes para a agricultura, horticultura, produção de biomassa (para produção de moléculas de combustível líquido e outros agentes químicos) e/ou florestamento podem ser usadas nos métodos da revelação. Os exemplos não limitantes incluem, por exemplo, Panicum virgatum (painço), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum spp. (cana de açúcar, cana energética), Populus balsamifera (choupo), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfafa), Beta vulgaris (beterraba sacarina), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Erianthus spp., Andropogon gerardii (bluestem alto), Pennisetum purpureum (capim-elefante), Phalaris arundinacea

(capim-amarelo), Cynodon dactylon (grama bermudas), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (cabo de grama de pradaria), Arundo donax (cana gigante), Secale cereale (centeio), Salix spp. (salgueiro), Eucalyptus spp. (eucalipto, incluindo E. grandis (e seus híbridos, conhecidos como “urograndis”), E. globulus, E. camaldulensis, E. tereticornis, E.viminalis, E. nitens, E. saligna e E. urophylla), Triticosecale spp. (triticum - trigo X centeio), bambu, Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatrofa), Ricinus communis (rícino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (linho), Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca sativa (alface), Phaseolus vulgaris (feijão-verde), Phaseolus limensis (feijões-lima), Lathyrus spp. (ervilhas), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica spp. (B. napus (canola), B. rapa, B. juncea), Brassica oleracea (brócolis, couve-flor, couve-de-bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (pimento e pimentão), Arachis hypogaea (amendoins), Ipomoea batatus (batata doce), Cocos nucifera (coco), Citrus spp. (árvores cítricas), Persea americana (abacate), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), Carica papaya (mamão), Anacardium occidentale (cajú), Macadamia integrifolia (árvore de macadâmia), Prunus amygdalus (amêndoa), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão almiscarado), Cucumis sativus (pepino), Cucumis cantalupensis (cantalupo), Cucurbita maxima (abobrinha), Cucurbita moschata

(abobrinha), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quiabo), Solanum melongena (beringela), Cyamopsis tetragonoloba (grãos de guar), Ceratonia siliqua (alfarroba), Trigonella foenum-graecum (feno-grego), Vigna radiata (feijão-mungo), Vigna unguiculata (feijão-frade), Vicia faba (feijão-fava), Cicer arietinum (grão de bico), Lens culinaris (lentilha), Papaver somniferum (papoila de ópio), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis sativa, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Colchicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guaiúle), Hevea spp. (borracha), Mentha spicata (menta), Mentha piperita (menta), Bixa orellana (urucum), Alstroemeria spp., Rosa spp. (rosa), Rhododendron spp. (azaleia), Macrophylla hydrangea (hortênsia), Hibiscus rosasanensis (hibisco), Tulipa spp. (tulipas), Narcissus spp. (narcisos), Petunia hybrida (petúnias), Dianthus caryophyllus (cravo), Euphorbia pulcherrima (poinsétia), Chrysanthemum, Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (tremoço), Uniola paniculata (aveias), bentgrass (Agrostis spp.), Populus tremuloides (faia), Pinus spp. (pinheiro), Abies spp. (abeto),

Acer spp. (bordo), Hordeum vulgare (cevada), Poa pratensis (cabelo-de-cão), Lolium spp. (azevém), Phleum pratense (erva- dos-prados) e coníferas.

[0117] A coníferas podem ser usadas na presente revelação e incluem, por exemplo, pinheiros, como pinheiro (Pinus taeda), pinheiro-americano (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro de lodgepole (Pinus contorta) e pinheiro- de-Monterey (Pinus radiata); pinheiro-do-oregon (Pseudotsuga menziesii); cicuta oriental ou do Canadá (Tsuga canadensis); cicuta ocidental (Tsuga heterophylla); cicuta de montanha (Tsuga mertensiana); lariço americano ou lariço (Larix occidentalis); abeto Sitka (Picea glauca); sequóia (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros, como abeto de prata (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies balsamea); e cedros, como cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparis nootkatensis).

[0118] As gramíneas podem ser usadas na presente revelação e incluem, porém, sem limitações: poa-anual (Poa annua); azevém anual (Lolium multiflorum); poa canadiana (Poa compressa); Agrostide-ténue (Agrostis tenuis); erva-fina (Agrostis palustris); grama de trigo do deserto ("crested wheatgrass") (Agropyron desertorum); capim-mombaça (Agropyron cristatum); festuca rígida (Festuca longifolia); erva-de-febra (Poa pratensis); panasco (Dactylis glomerata); azevém perene (Lolium perenne); festuca-encarnada (Festuca rubra); germínia rubra (Agrostis alba); poa-comum (Poa trivialis); festuca ovina (Festuca ovina); bromo (Bromus inermis); rabo-de-gato (Phleum pratense); Agrostis-de-cão ("velvet bentgrass") (Agrostis canina); Grama-salgada ("weeping alkaligrass")

(Puccinellia distans); erva-trigo ocidental (Agropyron smithii); grama Santo Agostinho (Stenotaphrum secundatum); Grama Zoysia (Zoysia spp.); grama-Bahia (Paspalum notatum); grama tapete (Axonopus affinis); grama centípede (Eremochloa ophiuroides); grama Kikuio (Pennisetum clandesinum); capim- arame-da-praia (Paspalum vaginatum); grama azul (Bouteloua gracilis); grama americana (Buchloe dactyloids); "sideoats gramma" (Bouteloua curtipendula).

[0119] Em aspectos específicos, plantas da presente revelação são plantas cultivadas (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, cártamo, amendoim, arroz, sorgo, trigo, milheto, tabaco, etc.). Outras plantas úteis na presente revelação incluem cevada, aveias, centeio, linho, cana de açúcar, banana, mandioca, feijão comum, feijão-frade, tomate, batata, beterraba, uva, eucalipto, choupo, pinha, douglásia, cítricos, mamão, cacau, pepino, maçã, Capsicum, bambu, Triticale e melão.

[0120] As sequências de codificação heterólogas, polinucleotídeos heterólogos e polinucleotídeos de interesse adicionais expressos por uma sequência de promotor da revelação pode ser usada para variar o fenótipo de uma planta.Várias alterações em fenótipo são de interesse incluindo modificar a expressão de um gene em uma planta, alterar um patógeno de planta ou mecanismo de defesa de inseto, aumentar uma tolerância da planta aos herbicidas, alterar desenvolvimento de planta para responder ao estresse ambiental, modular a resposta de planta ao sal, temperatura (quente e fria), seca e semelhantes.Esses resultados podem ser alcançados através da expressão de uma sequência de nucleotídeos heterólogos de interesse que compreende um produto genético apropriado.Em aspectos específicos, a sequência de nucleotídeos heterólogos de interesse é uma sequência vegetal endógena cujo nível de expressão é aumentado na planta ou parte de planta.Resultados podem ser obtidos fornecendo-se expressão alterada de um ou mais produtos de gene endógeno, particularmente hormônios, receptores, moléculas sinalizadoras, enzimas, transportadores ou cofatores ou afetando-se admissão de nutriente na planta.Expressão preferencial de tecido, conforme fornecida pelos promotores revelados no presente documento pode alterar a expressão de produto genético.Essas mudanças resultam em uma mudança do fenótipo da planta transformada.Em determinados aspectos, visto que o modelo de expressão é preferencial de tecido, os modelos de expressão são úteis para diversos tipos de exame.

[0121] Categorias gerais de sequências de nucleotídeos de interesse para a presente revelação incluem, por exemplo, aqueles genes envolvidos em informações, tais como dedos de zinco, aqueles envolvidos em comunicação, tais como quinases e aqueles envolvido em gestão interna, tal como proteínas de choque de calor. Categorias mais específicas de transgenes incluem, por exemplo, genes codificadores de traços importantes para agronomia, resistência a insetos, resistência a doenças, resistência a herbicidas, resistência ao estresse ambiental (tolerância alterada ao frio, sal, à seca, etc.) e características de grão. Ainda outras categorias de transgenes incluem genes para induzir expressão de produtos exógenos, tais como enzimas, cofatores e hormônios de plantas e outros eucariotas, assim como organismos procariotas.É reconhecido que qualquer gene ou polinucleotídeo de interesse pode ser operacionalmente ligado a um promotor da revelação e expresso em uma planta.

[0122] Múltiplos genes de interesse podem ser operacionalmente ligados a um promotor da revelação e expressos em uma planta, por exemplo, os genes WUS/WOX podem ser empilhados com traços de resistência a inseto que também podem ser empilhados com um ou mais traços de entrada adicionais (por exemplo, resistência a herbicida, resistência fúngica, resistência a vírus, tolerância à tensão, resistência a doenças, esterilidade do macho, força da haste e semelhantes) ou traços de saída (por exemplo, rendimento aumentado, amidos modificados, perfil de óleo aprimorado, aminoácidos equilibrados, lisina ou metionina alta, digestibilidade aumentada, qualidade de fibra aprimorada, resistência à seca, reforço nutricional e semelhantes).

[0123] Um promotor da revelação pode ser operacionalmente ligado a traços importantes agronomicamente que afetam a qualidade de grão, como níveis (aumentando o teor de ácido oleico) e tipos de óleos, saturados e insaturados, qualidade e quantidade de aminoácidos essenciais, níveis crescentes de lisina e enxofre, níveis de celulose e teor de amido e proteína.Um promotor da revelação pode ser operacionalmente ligado a genes que fornecem modificações de proteína de hordotionina em milho que são descritos nas Patentes nos U.S.

5.990.389; 5.885.801; 5.885.802 e 5.703.049; incorporadas no presente documento a título de referência em sua totalidade. Outro exemplo de um gene ao qual um promotor da presente revelação pode ser operacionalmente ligado é proteína de semente rica em lisina e/ou enxofre codificada pela albumina de soja 2S descrita no documento de Patente no U.S. 5.850.016, depositado em 20 de março de 1996 e o inibidor de quimotripsina da cevada, Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem 165:99 a 106, em que as revelações dos mesmos estão incorporadas no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0124] Um promotor da revelação pode ser operacionalmente ligado a genes de resistência a inseto que codificam a resistência às pestes que tem grande perda de rendimento, tal como crisomelídeo, lagarta rosca, broca europeia do milho e semelhantes.Tais genes incluem, por exemplo, genes de proteína tóxicos de Bacillus thuringiensis, documentos de Patente no U.S. 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881 e Geiser et al. (1986) Gene 48:109, em que as revelações dos mesmos estão incorporadas no presente documento em sua totalidade a título de referência. Os genes que codificam os traços de resistência a doença que podem ser operacionalmente ligados a um promotor da revelação incluem, por exemplo, genes de desintoxicação, como aqueles que desintoxicam fumonisina (documento de Patente no U.S. 5.792.931); avirulência (avr) e genes de resistência à doença (R) (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1.432; e Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1.089), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0125] Os traços de resistência a herbicida que podem ser operacionalmente ligados a um promotor da revelação incluem genes que codificam resistência aos herbicidas que atuam para inibir a ação de acetolactato sintase (ALS), em particular os herbicidas de tipo sulfonilureia (por exemplo, o gene de acetolactato sintase (ALS) que contém mutações que levam a tal resistência, em particular as mutações de S4 e/ou Hra), genes que codificam resistência aos herbicidas que atuam para inibir a ação de glutamina sintase, tal como fosfinotricina ou basta (por exemplo, o gene bar), genes que codificam resistência ao glifosato (por exemplo, o gene EPSPS e o gene GAT; consultar, por exemplo, o documento de Patente no de Publicação U.S. 2004/0082770 e WO 03/092360, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência) ou outros tais genes conhecidos na técnica. O gene bar codifica resistência ao herbicida basta, o gene nptII codifica resistência aos antibióticos canamicina e geneticina e os mutantes de gene ALS codificam resistência ao herbicida clorsulfurão, todo e qualquer dos quais pode ser operacionalmente ligado a um promotor da revelação.

[0126] A resistência a glifosato é conferida por 5- enolpiruvil-3-fosfiquimato sintase mutante (EPSP) e genes aroA que podem ser operacionalmente ligados a um promotor da revelação. Consultar, por exemplo, a Patente no U.S. 4.940.835 por Shah et al., a qual revela a sequência de nucleotídeo de uma forma de EPSPS que pode conferir resistência a glifosato. A Patente no U.S. 5.627.061 de Barry et al., também descreve os genes de codificação de enzimas EPSPS, que podem ser operacionalmente ligadas a um promotor da revelação.Também consultar os documentos de Patente no U.S. 6.248.876 B1;

6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908;

5.312.910; 5.188.642; 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1;

6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448;

5.510.471; Re. 36.449; RE 37.287 E e 5.491.288 e as publicações internacionais no WO 97/04103; WO 97/04114; WO 00/66746; WO 01/66704; WO 00/66747 e WO 00/66748, que estão incorporadas no presente documento em sua totalidade a título referência.Resistência ao glifosato também é transmitida às plantas que expressam um gene, que pode ser operacionalmente ligado a um promotor da revelação, que codifica uma enzima oxidorredutase de glifosato, conforme descrito mais completamente nos documentos de Patente n° U.S. 5.776.760 e

5.463.175, que estão incorporados no presente documento em sua totalidade a título referência. A resistência a glifosato também pode ser conferida às plantas pela superexpressão de genes que podem ser operacionalmente ligados a um promotor da revelação que codifica glifosato N-acetiltransferase. Consultar, por exemplo, os Pedidos de Patente no de série U.S. 11/405.845 e 10/427.692, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0127] Os genes de esterilidade operacionalmente ligados a um promotor da revelação podem ainda ser codificados em um construto de DNA e fornecer uma alternativa para despendoamento físico.Exemplos de genes usados de tais maneiras incluem genes preferenciais de tecido masculino e genes com fenótipos de esterilidade masculina, tal como QM, descrito no documento de Patente no U.S. 5.583.210, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. Outros genes que podem ser operacionalmente ligados a um promotor da revelação incluem quinases e aqueles que codificam compostos tóxicos para desenvolvimento gametofítico masculino e feminino.

[0128] Os traços comerciais também podem ser codificados em um gene ou genes operacionalmente ligados a um promotor da revelação que poderia aumentar, por exemplo, o amido para a produção de etanol ou fornecer expressão de proteínas. Outro importante uso comercial de plantas transformadas é a produção de polímeros e bioplásticos, tais como os descritos no documento de Patente no U.S. 5.602.321, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.Genes, tais como β-Cetotiolase, PHBase (sintase de poli-hidroxibutirato) e acetoacetil-CoA redutase que podem ser operacionalmente ligados a um promotor da revelação (consultar Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5.837 a 5.847, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência) facilitam a expressão de poli-hidroxialcanoatos (PHAs).

[0129] Exemplos de outros genes aplicáveis e seu fenótipo associado, que podem ser operacionalmente ligados a um promotor da revelação, incluem o gene que codifica proteína de revestimento viral e/ou RNA, ou outros genes virais ou vegetais que conferem resistência viral; genes que conferem resistência fúngica; genes que promovem melhoramento de rendimento; e genes que fornecem resistência ao estresse, tal como ao frio, desidratação que resulta da seca, aquecimento e salinidade, metal tóxico ou elementos vestigiais ou semelhantes.

[0130] A título de ilustração, sem a intenção de ser limitante, a seguir há uma lista de outros exemplos dos tipos de genes que podem ser operacionalmente ligados a uma sequência de promotor da revelação.

[0131] 1.Transgenes Que Conferem Resistência Aos Insetos Ou

Doença e Que Codificam:

[0132] (A)Genes de resistência à doença de planta. As defesas de plantas são frequentemente ativadas por interação específica entre o produto de um gene de resistência a doenças (R) na planta e o produto de um gene de avirulência (Avr) correspondente no patógeno.Uma variedade de planta pode ser transformada com gene de resistência clonado para manipular plantas que são resistentes a cepas de patógenos específicos. Consultar, por exemplo, Jones et al. (1994) Science 266:789 (clonagem do gene Cf-9 do tomate para resistência a Cladosporium fulvum); Martin et al. (1993) Science 262:1432 (gene de Pto do tomate para resistência a Pseudomonas syringae pv. tomate codifica uma proteína quinase); Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089 (gene RSP2 de Arabidopsis para resistência a Pseudomonas syringae), McDowell e Woffenden, (2003) Trends Biotechnol. 21(4):178 a 183 e Toyoda et al. (2002) Transgenic Res. 11(6):567 a 582, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.Uma planta resistente a uma doença é uma mais resistente a um patógeno em comparação à planta do tipo selvagem.

[0133] (B)Uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado na mesma. Consultar, por exemplo, Geiser et al. (1986) Gene 48:109, que revelam a clonagem e sequência de nucleotídeos de um gene de delta-endotoxina Bt. Além disso, moléculas de DNA que codificam genes delta-endotoxina podem ser compradas junto a American Type Culture Collection (Rockville, MD), por exemplo, com número de acesso ATCC 40098, 67136, 31995 e 31998. Outros exemplos de transgenes de Bacillus thuringiensis que são modificados geneticamente são dados nas seguintes patentes e pedidos de patente e, assim, estão incorporados a título de referência para esse propósito: As Patentes números US

5.188.960; 5.689.052; 5.880.275; WO 91/14778; WO 99/31248; WO 01/12731; WO 99/24581; WO 97/40162 e Pedidos de Patente de números de série US 10/032.717; 10/414.637 e 10/606.320, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0134] (C)Um hormônio ou feromônio específico para inseto, tal como um ecdisteroide e hormônio juvenil, uma variante do mesmo, um mimético à base do mesmo ou um antagonista ou agonista do mesmo. Consultar, por exemplo, a revelação por Hammock et al. (1990) Nature 344:458, de expressão de baculovírus de esterase de hormônio juvenil clonado, um desativador de hormônio juvenil, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0135] (D)Um peptídeo específico para inseto que, mediante expressão, perturba a fisiologia da praga afetada.Por exemplo, consultar as revelações de Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269:9 (clonagem de expressão produz DNA que codifica receptor de hormônio diurético de insetos); Pratt et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm.163:1.243 (uma alostatina é identificada em Diploptera puntata); Chattopadhyay et al. (2004) Critical Reviews in Microbiology 30(1):33 a 54; Zjawiony, (2004) J Nat Prod 67(2):300 a 310; Carlini e Grossi-de-Sa, (2002) Toxicon 40(11):1.515 a 1.539; Ussuf et al. (2001) Curr Sci. 80(7):847 a 853 e Vasconcelos e Oliveira, (2004) Toxicon 44(4):385 a 403, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.Também consultar a Patente número US

5.266.317 por Tomalski et al., a qual revela genes que codificam toxinas específicas de inseto, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0136] (E)Uma enzima responsável por um hiperacúmulo de um monterpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico, um derivado de fenilpropanoide ou outra molécula de não proteína com atividade inseticida.

[0137] (F)Uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-traducional, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, uma enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, um polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, seja natural ou sintética. Consultar o Pedido PCT número WO 93/02197 no nome de Scott et al., o qual revela a sequência de nucleotídeos de um gene de calase, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade. As moléculas de DNA que contêm sequências de codificação de quitinase podem ser obtidas, por exemplo, junto à ATCC sob os números de acesso 39637 e 67152. Consultar também Kramer et al. (1993) Insect Biochem. Molec. Biol.23:691, que ensinam a sequência de nucleotídeos de um cDNA que codifica uma quitinase de ancilóstomo de tabaco, e Kawalleck et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:673, que fornecem a sequência de nucleotídeos do gene de poliubiquitina ubi4-2 de salsa, Pedidos de Patente de números de série US 10/389.432, 10/692.367 e Patente número US

6.563.020, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0138] (G)Uma molécula que estimula a transdução de sinal.Por exemplo, consultar a revelação por Botella et al. (1994) Plant Molec. Biol.24:757 de sequências de nucleotídeo para clones de cDNA de calmodulina de feijão-mungo, e Griess et al. (1994) Plant Physiol. 104:1.467, que fornece a sequência de nucleotídeo de um clone de cDNA de calmodulina de milho, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0139] (H)Um peptídeo de momento hidrofóbico. Consultar, o Pedido PCT no WO 95/16776 e o documento de Patente no U.S.

5.580.852 (revelação de derivados de peptídeo de Taquiplesina que inibe patógenos de planta fúngicos) e o Pedido PCT no WO 95/18855 e o documento de Patente no U.S. 5.607.914) (ensina peptídeos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência à doença), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0140] (I)Uma membrana permease, um formador de canal ou um bloqueador de canal.Por exemplo, consultar a revelação por Jaynes et al. (1993) Plant Sci. 89:43, de expressão heteróloga de um análogo de peptídeo lítico de cecropina-beta para tornar plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0141] (J)Uma proteína invasiva viral ou uma toxina complexa derivada da mesma.Por exemplo, o acúmulo de proteínas de revestimento viral em células de plantas transformadas confere resistência à infecção viral e/ou desenvolvimento de doença efetuado pelo vírus a partir do qual o gene de proteína de revestimento é derivado, assim como por vírus relacionados.

Consultar Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol.28:451, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. A resistência mediada por proteína de revestimento tem sido conferida em plantas transformadas contra vírus do mosaico da alfafa, vírus do mosaico do pepino, vírus da risca do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus do entalhe do tabaco, vírus “rattle” do tabaco e vírus do mosaico do tabaco.Id.

[0142] (K)Um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina derivada do mesmo. Assim, um anticorpo direcionado a uma função metabólica essencial nos intestinos do inseto poderia inativar uma enzima afetada, exterminando o inseto.Cf. Taylor et al., Resumo no 497, SEVENTH INT'L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS (Edinburgh, Escócia, 1994) (inativação enzimática em tabaco transgênica por meio de produção de fragmentos de anticorpo de cadeia única), incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0143] (L)Um anticorpo específico de vírus. Consultar, por exemplo, Tavladoraki et al. (1993) Nature366:469, que mostra que plantas transgênicas que expressam genes de anticorpo recombinantes são protegidas do ataque de vírus, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0144] (M)Uma proteína de prisão de desenvolvimento produzida em natura por um patógeno ou um parasita.Desse modo, endo alfa-1,4-D-poligalacturonases fúngicas facilitam a colonização fúngica e a liberação de nutriente de planta solubilizando-se a homo-alfa-1,4-D-galacturonase de parede de célula vegetal.

Consultar, Lamb et al. (1992) Bio/Technology10:1.436, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. A clonagem e a caracterização de um gene que codifica uma proteína de inibição de endopoligalacturonase de feijão é descrita por Toubart et al. (1992) Plant J. 2:367, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0145] (N)Uma proteína de prisão de desenvolvimento produzida em natura por uma planta.Por exemplo, Logemann et al. (1992) Bio/Technology10:305, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência, mostrou que plantas transgênicas que expressam o gene de inativação ribossômica de cevada tem uma resistência à doença fúngica aumentada.

[0146] (O)Genes envolvidos na Resposta de Resistência Adquirida Sistêmica (SAR) e/ou os genes relacionados à patogênese. Briggs, (1995) Current Biology 5(2):128 a 131, Pieterse e Van Loon, (2004) Curr. Opin. Pant Bio. 7(4):456 a 464 e Somssich, (2003) Cell 113(7):815 a 816, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0147] (P)Genes antifúngicos (Cornelissen e Melchers, (1993) Pl.Physiol. 101:709-712 e Parijs et al. (1991) Planta 183:258- 264 e Bushnell et al. (1998) Can J. of Plant Path. 20(2):137-

149. Consultar também o documento de Patente no U.S. 09/950.933, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0148] (Q)Genes de desintoxicação, tais como para fumonisina, beauvericina, moniliformina e zearalenona e seus derivados estruturalmente relacionados.Por exemplo, consultar o documento de Patente no U.S. 5.792.931, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0149] (R)Inibidores de cistatina e cisteína proteinase. Consultar o Pedido de Patente no de série U.S. 10/947.979, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0150] (S)Genes de defensina. Consultar o documento no WO03/000863 e o Pedido de Patente no de série U.S. 10/178.213, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0151] (T)Genes que conferem resistência aos nematódeos. Consultar o documento WO 03/033651 e Urwin et. al., (1998) Planta 204:472 a 479, Williamson (1999) Curr Opin Plant Bio. 2(4):327 a 331, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0152] (U)Genes, tais como rcg1 que conferem resistência ao apodrecimento de caule de Antracnose, que é causado pelo fungo Colletotrichum graminiola. Consultar Jung et al., Generation- means analysis and quantitative trait locus mapping of Anthracnose Stalk Rot genes in Maize, Theor. Appl. Genet. (1994) 89:413 a 418, assim como o Pedido de Patente Provisório no U.S. 60/675.664, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0153] 2.Transgenes Que Conferem Resistência a um Herbicida, Por Exemplo:

[0154] (A)Um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como uma imidazolinona ou uma sulfonilureia.Genes exemplificativos nesse código de categoria para enzima ALS e AHAS mutante, conforme descritos, por exemplo, por Lee et al. (1988) EMBO J.7:1.241 e Miki et al.

(1990) Theor. Appl. Genet.80:449, respectivamente.Também consultar documentos de Patente nos 5,605,011; 5,013,659; 5,141,870; 5,767,361; 5,731,180; 5,304,732; 4,761,373; 5,331,107; 5,928,937 e 5,378,824 e a Publicação Internacional no WO 96/33270, que estão incorporados no presente documento em sua totalidade a título referência.

[0155] (B)Glifosato (resistência transmitida por sintase de 5-enolpiruvl-3-fosfiquimato (EPSP) mutante e genes aroA, respectivamente) e outros compostos de fosfono, tal como glufosinato (genes de fosfinotricina acetil transferase (PAT) e fosfinotricina acetil transferase de Streptomyces hygroscopicus (bar)) e ácidos propriônicos de piridinóxi ou fenóxi e cicloexonas (genes codificadores de inibidor ACCase). Consultar, por exemplo, a Patente no U.S. 4.940.835 por Shah et al., a qual revela a sequência de nucleotídeo de uma forma de EPSPS que pode conferir resistência a glifosato. A Patente nº U.S. 5.627.061 de Barry et al., também descreve os genes de codificação de enzimas EPSPS. Consultar também a Patente no US 6;,566,587; 6,338,961; 6,248,876 B1; 6,040,497; 5,804,425; 5,633,435; 5,145,783; 4,971,908; 5,312,910; 5,188,642; 4,940,835; 5,866,775; 6,225,114 B1; 6,130,366; 5,310,667; 4,535,060; 4,769,061; 5,633,448; 5,510,471; Re. 36.449; RE

37.287 E e 5.491.288 e publicações internacionais EP1173580; WO 01/66704; EP1173581 e EP1173582, que estão incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. A resistência a glifosato também é conferida a plantas que expressam um gene que codifica uma enzima glifosato oxidorredutase, conforme descrito mais completamente nas Patentes números U.S. 5.776.760 e 5.463.175, que estão incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Além disso, a resistência a glifosato pode ser conferida a plantas pela superexpressão de genes que codificam glifosato N-acetiltransferase. Consultar, por exemplo, os Pedidos de Patente de números de série US 11/405.845 e 10/427.692 e Pedido PCT número US01/46227, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.Uma molécula de DNA codificante de um gene aroA mutante pode ser obtida sob o Número de Acesso ATCC 39256 e a sequência de nucleotídeo do gene mutante é revelada na Patente nº U.S. 4.769.061 de Comai, incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade. O Pedido de Patente número EP 0 333 033 de Kumada et al., e a Patente número U.S.

4.975.374 de Goodman et al., revelam sequências de nucleotídeo de genes de glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas, como L-fosfinotricina, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. A sequência de nucleotídeo de um gene fosfinotricina-acetil- transferase é fornecida nas Patente números EP 0 242 246 e 0 242 236 por Leemans et al., De Greef et al. (1989) Bio/Technology 7:61, que descrevem a produção de plantas transgênicas que expressa os genes bar quiméricos que codificam a atividade de acetil transferase de fosfinotricina, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Consultar também as Patentes números US

5.969.213; 5.489.520; 5.550.318; 5.874.265; 5.919.675;

5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 6.177.616 B1 e 5.879.903, incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Os genes exemplificativos que conferem resistência a ácidos fenóxi propiônicos e ciclos-hexonas, como setoxidim e haloxifope, são os genes Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1- S3 descritos por Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0156] (C)Um herbicida que inibe a fotossíntese, tal como uma triazina (genes psbA e gs+) e uma benzonitrila (gene de nitrilase).Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3:169, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade, descrevem a transformação de Chlamydomonas com plasmídeos que codificam genes psbA mutantes. As sequências de nucleotídeos para genes nitrilase são reveladas na Patente número U.S. 4.810.648 por Stalker, incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade, e moléculas de DNA que contêm esses genes estão disponíveis sob os Números de Acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. A clonagem e a expressão de DNA que codifica uma glutationa S-transferase são descritas por Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0157] (D)Aceto-hidroxiácido sintase, que mostrou tornar plantas que expressam essa enzima resistentes a múltiplos tipos de herbicidas, foi introduzida em uma variedade de plantas (consultar, por exemplo, Hattori et al. (1995) Mol Gen Genet 246:419, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade). Outros genes que conferem resistência a herbicidas incluem: um gene que codifica uma proteína quimérica de citocromo de rato P4507A1 e oxidorredutase P450 de citocromo de NADPH de levedura (Shiota et al. (1994) Plant Physiol 106(1):17 a 23), genes para glutationa redutase e superóxido dismutase (Aono et al. (1995) Plant Cell Physiol 36:1.687 e genes para várias fosfotransferases (Datta et al. (1992) Plant Mol Biol 20:619), incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0158] (E)Protoporfirinogênio oxidase (protox) é necessária para a produção de clorofila, que é necessária para a sobrevivência de todas as plantas. A enzima protox serve como o direcionamento para uma variedade de compostos herbicidas.Esses herbicidas também inibem o crescimento de todas as espécies diferentes de plantas presentes, causando sua destruição total. O desenvolvimento de plantas que contêm atividade de protox alterada que são resistentes àqueles herbicidas é descrito nos documentos de Patentes no U.S.

6.288.306 B1; 6.282.837 B1 e 5.767.373; e na Publicação Internacional no WO 01/12825, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0159] 3.Transgenes que Conferem ou Contribuem para uma Característica de Grão Alterado Como: (A)Ácidos graxos alterados, por exemplo, por

[0160] (1) Regulação decrescente de estearoil-ACP dessaturase para aumentar o teor de ácido esteárico da planta. Consultar Knultzon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:2.624 e WO99/64579 (Genes for Desaturases to Alter Lipid Profiles in Corn), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência,

[0161] (2)Elevação do ácido oleico por meio de modificação de gene de FAD-2 e/ou diminuição de ácido linolênico por meio de modificação de gene FAD-3 (consultar as Patentes números U.S.

6.063.947; 6.323.392; 6.372.965 e documento número WO 93/11245, incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade).

[0162] (3)Alteração de teor de ácido linolênico ou linoleico, tal como no documento WO 01/12800, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0163] (4)Alteração de LEC1, AGP, Dek1, Superal1, mi1ps, vários genes Ipa, como lpa1, lpa3, hpt ou hggt.Por exemplo, consultar os documentos WO 02/42424, WO 98/22604, WO 03/011015, Patente número US 6.423.886, Patente número US

6.197.561, Patente número US 6.825.397, Publicações de Pedido de Patente números US 2003/0079247, 2003/0204870, WO02/057439, WO03/011015 e Rivera-Madrid et. al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:5.620 a 5.624, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. (B)Teor de fósforo alterado, por exemplo, por

[0164] (1)Introdução de um gene de codificação por fitase aprimoraria o rompimento de fitato, adicionando mais fosfato livre à planta transformada.Por exemplo, consultar Van Hartingsveldt et al. (1993) Gene 127:87, para uma revelação da sequência de nucleotídeos de um gene de fitato de Aspergillus niger, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0165] (2)Regulação crescente de um gene que reduz o teor de fitato.Em milho, isso, por exemplo, poderia ser alcançado por clonagem e, então, reintrodução de DNA associado a um ou mais dentre os alelos, como os alelos de LPA, identificados em mutantes de milho distinguidos por níveis baixos de ácido fítico, como em Raboy et al. (1990) Maydica35:383 e/ou alterando-se atividade de inositol quinase como no documento WO 02/059324, Publicação de Pedido de Patente número US 2003/0009011, documento WO 03/027243, Publicação de Pedido de Patente número US 2003/0079247, documento WO 99/05298, Patente número US 6.197.561, Patente número US 6.291.224, Patente número US 6.391.348, documento WO2002/059324, Publicação de Pedido de Patente número US 2003/0079247, documentos WO98/45448, WO99/55882, WO01/04147, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0166] (C)Carboidratos alterados efetuado, por exemplo, alterando-se um gene para uma enzima que afeta o padrão de ramificação de amido ou um gene que altera tioredoxina, como NTR e/ou TRX (consultar a Patente nº U.S. 6.531.648 que é incorporada a título de referência em sua totalidade) e/ou uma gama zeína knock out ou mutante, como cs27 ou TUSC27 ou en27 (consultar a Patente número U.S. 6.858.778 e as Publicações de Pedido de Patente números US 2005/0160488 e 2005/0204418, que estão incorporadas a título de referência em sua totalidade). Consultar Shiroza et al. (1988) J. Bacteriol. 170:810 (sequência de nucleotídeo de gene frutosiltransferase mutante de Streptococcus), Steinmetz et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 200:220 (sequência de nucleotídeo de gene levansucrase de Bacillus subtilis), Pen et al. (1992) Bio/Tchnology 10:292 (produção de plantas transgênicas que expressam alfa-amilase de Bacillus licheniformis), Elliot et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:515 (sequências de nucleotídeo de genes invertase de tomate), Søgaard et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:22480

(mutagênese sítio-dirigida de gene alfa-amilase de cevada) e Fisher et al. (1993) Plant Physiol. 102:1045 (enzima de ramificação de amido de endosperma de milho II), documento nº WO 99/10498 (digestibilidade melhorada e/ou extração de amido através da modificação de UDP-D-xilose 4-epimerase, Frágil 1 e 2, Ref1, HCHL, C4H), Patente número U.S. 6.232.529 (método para produzir semente oleaginosa superior por modificação de níveis de amido (AGP)), incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Os genes de modificações de aminoácido mencionados acima podem ser também usados para afetar o teor de amido e/ou a composição através da inter-relação das trajetórias de amido e óleo.

[0167] (D)Teor ou composição de antioxidante alterado, como alteração de tocoferol ou trocotrienóis.Por exemplo, consultar a Patente número U.S. 6.787.683, Publicação de Pedido de Patente número U.S. 2004/0034886 e documento WO 00/68393 que envolvem a manipulação de níveis antioxidantes através da alteração de uma fitil prenil transferase (ppt), o documento WO 03/082899 através da alteração de uma homogentisato geranil-geranil transferase (hggt), incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0168] (E)Aminoácidos essenciais de semente alterados.Por exemplo, consultar a Patente número U.S. 6.127.600 (método para aumentar o acúmulo de aminoácidos essenciais em sementes), Patente nº U.S. 6.080.913 (métodos binários para aumentar o acúmulo de aminoácidos essenciais em sementes), Patente número U.S. 5.990.389 (lisina superior), documento WO99/40209 (alteração de composições de aminoácido em sementes), documento WO99/29882 (métodos para alterar o teor de aminoácido de proteínas), Patente número U.S. 5.850.016 (alteração de composições de aminoácido em sementes), documento WO98/20133 (proteínas com níveis aprimorados de aminoácidos essenciais), Patente número U.S. 5.885.802 (metionina alta), Patente número U.S. 5.885.801 (treonina superior), Patente número U.S. 6.664.445 (enzimas biossintéticas de aminoácido de planta), Patente número U.S.

6.459.019 (lisina e treonina aumentadas), Patente número U.S.

6.441.274 (subunidade beta de triptofano sintase de planta), Patente número U.S. 6.346.403 (enzimas metabólicas de metionina), Patente número U.S. 5.939.599 (enxofre superior), Patente número U.S. 5.912.414 (metionina aumentada), documento WO98/56935 (enzimas biossintéticas de aminoácido de planta), documento WO98/45458 (proteína de semente modificada geneticamente que tem porcentagem superior de aminoácidos essenciais), documento WO98/42831 (lisina aumentada), Patente número U.S. 5.633.436 (aumentar teor de aminoácido de enxofre), Patente número U.S. 5.559.223 (proteínas de armazenamento sintético com estrutura definida contendo níveis programáveis de aminoácidos essenciais para a melhora do valor nutricional de plantas), documento WO96/01905 (treonina aumentada), documento WO95/15392 (lisina aumentada), Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2003/0163838, Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2003/0150014, Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2004/0068767, Patente nº U.S. 6.803.498, documento WO01/79516 e documento WO00/09706 (Ces A: celulose sintase), Patente número US 6.194.638 (hemicelulose), Patente número US 6.399.859 e Publicação de Pedido de Patente número US 2004/0025203 (UDPGdH), Patente número US 6.194.638 (RGP), incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0169] 4.Genes que criam um sítio para integração de DNA específica para sítios;

[0170] Isso inclui a introdução de sítios FRT que podem ser usados no sistema FLP/FRT e/ou sítios Lox que podem ser usados no sistema Cre/Loxp.Por exemplo, consultar Lyznik et al. (2003) Plant Cell Rep 21:925 a 932 e WO 99/25821, que estão incorporados aqui a título de referência em sua totalidade. Outros sistemas que podem ser usados incluem a recombinase Gin de fago Mu (Maeser et al., 1991; Vicki Chandler, The Maize Handbook ch. 118 (Springer-Verlag 1994), a recombinase Pin de E. coli (Enomoto et al., 1983), e o sistema R/RS do plasmídeo pSR1 (Araki et al., 1992), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0171] 5.Genes que afetam resistência ao estresse abiótico (que incluem, porém sem limitação, o desenvolvimento de flores, espiga e semente, intensificação de eficiência de utilização de nitrogênio, capacidade de resposta de nitrogênio alterada, resistência ou tolerância à seca, resistência ou tolerância ao frio e resistência ou tolerância ao sal) e rendimento aumentado sob estresse.Por exemplo, consultar o documento no WO 00/73475 em que a eficiência de uso de água é alterada através da alteração de malato; documento de Patente no U.S. 5.892.009, documento de Patente no U.S. 5.965.705, documento de Patente no U.S. 5.929.305, documento de Patente no U.S. 5.891.859, documento de Patente no U.S. 6.417.428, documento de Patente no U.S. 6.664.446, documento de Patente no U.S. 6.706.866, documento de Patente no U.S. 6.717.034,

WO2000060089, WO2001026459, WO2001035725, WO2001034726, WO2001035727, WO2001036444, WO2001036597, WO2001036598, WO2002015675, WO2002017430, WO2002077185, WO2002079403, WO2003013227, WO2003013228, WO2003014327, WO2004031349, WO2004076638, WO9809521, e WO9938977 que descrevem genes, incluindo genes CBF e fatores de transcrição eficazes em mitigar os efeitos negativos de congelamento, alta salinidade e seca em plantas, assim como conferir outros efeitos positivos em fenótipo de planta; a Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0148654 e documento no WO01/36596 em que ácido abscísico é alterado em plantas que resultam em fenótipo de planta melhorado, tal como rendimento aumentado e/ou tolerância ao estresse abiótico aumentada; documentos no WO2000/006341, WO04/090143, Pedido de Patente no de série U.S. 10/817483 e documento de Patente no U.S. 6.992.237, em que a expressão de citocinina é modificada, o que resulta em plantas com tolerância ao estresse aumentada, tal como tolerância à seca, e/ou rendimento aumentado, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Consultar também os documentos noWO0202776, WO2003052063, JP2002281975, o documento de Patente no U.S. 6.084.153, WO0164898, documento de Patente no U.S. 6.177.275 e o documento de Patente no U.S.

6.107.547 (intensificação de utilização de nitrogênio e capacidade de resposta de nitrogênio alterada), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.Para alteração de etileno, consultar a Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0128719, Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2003/0166197 e o documento no WO200032761, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.Para fatores de transcrição vegetal ou reguladores transcricionais de estresse abiótico, consultar, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0098764 ou Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0078852, incorporadas no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0172] 6. Outros genes e fatores de transcrição que afetam crescimento vegetal e traços agronômicos, tais como rendimento, floração, crescimento vegetal e/ou estrutura vegetal, podem ser introduzidos ou introgredidos em plantas, consultar, por exemplo, os documentos no WO97/49811 (LHY), WO98/56918 (ESD4), WO97/10339 e o documento de Patente no U.S.

6.573.430 (TFL), documento de Patente no U.S. 6.713.663 (FT), WO96/14414 (CON), WO96/38560, WO01/21822 (VRN1), WO00/44918 (VRN2), WO99/49064 (GI), WO00/46358 (FRI), WO97/29123, documento de Patente no U.S. 6.794.560, o documento de Patente no U.S. 6.307.126 (GAI), WO99/09174 (D8 e Rht) e WO2004076638 e WO2004031349 (fatores de transcrição), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0173] A sequência de nucleotídeos heterólogos operacionalmente ligada à sequência de promotor e seus fragmentos ou variantes biologicamente ativos relacionados revelados no presente documento podem ser uma sequência antissenso para um gene direcionado. A terminologia "sequência de nucleotídeos de DNA antissenso” é destinada a significar uma sequência que está na orientação inversa à orientação normal de 5’ a 3' daquela sequência de nucleotídeos.Quando entregue em uma célula vegetal, a expressão da sequência de DNA antissenso evita expressão normal da sequência de nucleotídeos de DNA para o gene direcionado. A sequência de nucleotídeos antissenso codifica uma transcrição de RNA que é complementar e tem capacidade para hibridizar com o RNA mensageiro endógeno (mRNA) produzido através de transcrição da sequência de nucleotídeos de DNA para o gene direcionado.Nesse caso, a produção da proteína nativa codificada pelo gene direcionado é inibida de modo a obter uma resposta fenotípica desejada. As modificações das sequências antissenso podem ser feitas desde que as sequências se hibridizem e interfiram com a expressão do RNAm correspondente.Dessa maneira, construções antissenso que têm 70%, 80%, 85% de identidade de sequência com as sequências antissenso correspondentes podem ser usadas. Além disso, porções dos nucleotídeos antissenso podem ser usadas para perturbar a expressão do gene direcionado.De modo geral, as sequências de pelo menos 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos ou mais podem ser usadas. Assim, as sequências de promotor reveladas no presente documento podem ser operacionalmente ligadas às sequências de DNA antissenso para reduzir ou inibir expressão de uma proteína nativa na planta.

[0174] "RNAi" se refere a uma série de técnicas relatadas para reduzir a expressão de genes (consultar, por exemplo, o documento de Patente no U.S. 6.506.559, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência). As técnicas mais velhas denominadas por outros nomes são ensinadas agora para depender do mesmo mecanismo, mas são dados nomes diferentes na literatura.Essas incluem "inibição antissenso", a produção de transcrições de RNA antissenso que têm capacidade para suprimir a expressão da proteína-alvo e

"cossupressão" ou "supressão de sentido", que se referem à produção de transcrições de RNA senso que têm capacidade para suprimir a expressão de genes endógenos ou estranhos idênticos ou substancialmente similares (documento de Patente no U.S.

5.231.020, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade).Tais técnicas dependem do uso de construtos que resulta no acúmulo de RNA de fita dupla com uma fita complementar ao gene-alvo a ser silenciado. As sequências de promotor da revelação podem ser usadas para conduzir expressão de construtos que resultarão em interferência de RNA, incluindo microRNAs e siRNAs.

[0175] Conforme usados no presente documento, os termos "promotor" ou "região de iniciação transcricional" significam uma região reguladora de DNA que compreende normalmente uma caixa TATA ou uma sequência de DNA que tem capacidade para direcionar RNA polimerase II para iniciar síntese de RNA no local de iniciação de transcrição apropriado para uma sequência codificante particular.Um promotor pode compreender adicionalmente outras sequências de reconhecimento posicionadas, de modo geral, a montante ou 5' da caixa TATA ou a sequência de DNA capaz de direcionar a polimerase II de RNA para iniciar a síntese de RNA, denominados elementos promotores a montante, que influenciam a taxa de iniciação de transcrição.É reconhecido que ter identificado as sequências de nucleotídeos para as regiões promotoras reveladas no presente documento, está dentro do estado da técnica para isolar e identificar promotores adicionais na região 5' não traduzida a montante das regiões promotoras particulares identificadas no presente documento. Adicionalmente,

promotores quiméricos podem ser fornecidos.Tais quimeras incluem porções da sequência de promotores fundidas aos fragmentos e/ou variantes de regiões reguladoras transcricionais heterólogas. Assim, as regiões promotoras reveladas no presente documento podem compreender promotores a montante, tais como aqueles responsáveis por expressão de tecido e temporal da sequência codificante, intensificadores e semelhantes.

[0176] Conforme usado no presente documento, o termo "elemento regulador" também se refere a uma sequência de DNA, normalmente, porém nem sempre, a montante (5') da sequência codificante de um gene estrutural, que inclui sequências que controlam a expressão da região codificante fornecendo-se o reconhecimento para RNA polimerase e/ou outros fatores necessários para que a transcrição se inicie em um local particular.Um exemplo de um elemento regulador que fornece o reconhecimento para RNA polimerase ou outros fatores transcricionais para assegurar a iniciação em um local particular é um elemento promotor.Um elemento promotor compreende um elemento promotor nuclear, responsável pela iniciação de transcrição, assim como outros elementos reguladores que modificam a expressão genética.Deve ser entendido que as sequências de nucleotídeos, localizadas dentro de íntrons ou 3’ da sequência de região codificante também podem contribuir com a regulação de expressão de uma região codificante de interesse. Os exemplos de íntrons adequados incluem, mas sem limitação, o íntron IVS6 de milho ou o íntron de actina de milho.Um elemento regulador também pode incluir aqueles elementos localizados a jusante (3') do local de iniciação de transcrição ou dentro de regiões transcritas, ou ambos.No contexto da presente revelação um elemento regulador pós-transcricional pode incluir elementos que são ativos depois da iniciação de transcrição, por exemplo, intensificadores traducionais e transcricionais, repressores traducionais e transcricionais e determinantes de estabilidade de mRNA.

[0177] Os promotores ou variantes ou fragmentos dos mesmos da presente revelação podem ser operativamente associados aos elementos reguladores heterólogos ou promotores de modo a modular a atividade do elemento regulador heterólogo.Tal modulação inclui intensificar ou reprimir a atividade de transcrição do elemento regulador heterólogo, modular os eventos pós-transcrição ou intensificar ou reprimir a atividade de transcrição do elemento regulador heterólogo e modular os eventos pós-transcrição.Por exemplo, um ou mais promotores ou fragmentos dos mesmos da presente revelação podem ser operativamente associados aos promotores ou fragmentos constitutivos, induzíveis ou específicos de tecido dos mesmos, para modular a atividade de tais promotores dentro de tecidos desejados em células vegetais.

[0178] As sequências de promotores da presente revelação ou variantes ou fragmentos das mesmas, quando operacionalmente ligadas a um gene morfogênico e/ou sequência heteróloga de nucleotídeos de interesse podem conduzir expressão estável ou transitória do gene morfogênico e/ou sequência heteróloga de nucleotídeos no tecido de L1 da planta.

[0179] Uma "sequência heteróloga de nucleotídeos", “polinucleotídeo heterólogo de interesse” ou “polinucleotídeo heterólogo” como usado ao longo da revelação, é uma sequência que não é de ocorrência natural com ou operacionalmente ligada a uma sequência de promotor da revelação.Embora essa sequência de nucleotídeos seja heteróloga à sequência de promotores, a mesma pode ser homóloga ou nativa ou heteróloga ou estranha ao hospedeiro vegetal.Da mesma forma, a sequência de promotores pode ser homóloga ou nativa ou heteróloga ou estranha ao hospedeiro vegetal e/ou ao polinucleotídeo de interesse.

[0180] As sequências de promotor isoladas da presente revelação podem ser modificadas para fornecer uma faixa de níveis de expressão da sequência de nucleotídeos heterólogos. Assim, menos que a região de promotor inteira pode ser utilizada e a capacidade para conduzir a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse é retida.É reconhecido que níveis de expressão do mRNA podem ser alterados de diferentes maneiras com deleções de porções das sequências de promotor. Os níveis de expressão de mRNA podem ser diminuídos, ou alternativamente, a expressão pode ser aumentada como um resultado de deleções de promotor caso, por exemplo, haja um elemento regulador negativo (para um repressor) que é removido durante o processo de truncação.De modo geral, pelo menos cerca de 20 nucleotídeos de uma sequência de promotores isolada serão usados para conduzir a expressão de uma sequência de nucleotídeos.

[0181] É reconhecido que para aumentar níveis de transcrição, intensificadores podem ser utilizados em combinação com as regiões promotoras da revelação.Intensificadores são sequências de nucleotídeos que atuam para aumentar a expressão de uma região promotora.Intensificadores são conhecidos na técnica e incluem a região intensificadora SV40, o elemento intensificador 35S e semelhantes. Alguns intensificadores também são conhecidos por alterar modelos de expressão de promotor normais, por exemplo, fazendo-se com que um promotor seja expresso constitutivamente quando não se tem o intensificador, o mesmo promotor é expresso apenas em um tecido específico ou em poucos tecidos específicos.

[0182] Modificações das sequências de promotor isoladas da presente revelação podem fornecer uma faixa de expressão da sequência de nucleotídeos heterólogos.Desse modo, as mesmas podem ser modificadas para serem promotores fracos ou promotores fortes.Geralmente, um "promotor fraco" significa um promotor que aciona a expressão de uma sequência de codificação em um nível baixo.Um "nível baixo" de expressão é destinado a significar expressão em níveis de cerca de 1/10.000 transcrições a cerca de 1/100.000 transcrições a cerca de 1/500.000 transcrições.Em contrapartida, um promotor forte aciona a expressão de uma sequência de codificação em um nível alto, ou em cerca de 1/10 transcrições a cerca de 1/100 transcrições a cerca de 1/1.000 transcrições.

[0183] É reconhecido que os promotores da revelação podem ser usados com suas sequências codificadoras nativas para aumentar ou diminuir expressão, desse modo se resulta em uma alteração em fenótipo da planta transformada. As sequências de nucleotídeos reveladas no presente documento (consultar Tabela 1), assim como variantes e fragmentos das mesmas, são úteis na manipulação genética de qualquer planta. As sequências reguladoras são úteis nesse aspecto quando operacionalmente ligadas a uma sequência de nucleotídeos heterólogos cuja expressão deve ser controlada para obter uma resposta fenotípica desejada. O termo "operacionalmente ligado" significa que a transcrição ou tradução da sequência de nucleotídeos heterólogos está sob a influência da sequência de promotores.Dessa maneira, as sequências de nucleotídeos para os promotores da revelação podem ser fornecidas em cassetes de expressão juntamente com sequências de nucleotídeos heterólogos de interesse para expressão na planta de interesse, mais particularmente para expressão no tecido reprodutivo da planta.

[0184] Em um aspecto da revelação, os cassetes de expressão compreendem uma região de iniciação transcricional que compreende uma das sequências de nucleotídeos de promotor da presente revelação ou variantes ou fragmentos das mesmas, operacionalmente ligados a um gene morfogênico e/ou uma sequência heteróloga de nucleotídeos.Tal cassete de expressão pode ser fornecido com uma pluralidade de locais de restrição para inserção da sequência de nucleotídeos que deve estar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. O cassete de expressão pode conter genes marcadores adicionalmente selecionáveis assim como regiões de terminação 3’.

[0185] O cassete de expressão pode incluir, na direção de transcrição 5’ a 3', uma região de iniciação transcricional (isto é, um promotor ou variante ou fragmento do mesmo, da revelação), uma região de iniciação translacional, uma sequência de nucleotídeos heterólogos de interesse, uma região de terminação translacional e, opcionalmente, uma região de terminação transcricional funcional no organismo hospedeiro. As regiões reguladoras (isto é, promotores, regiões reguladoras transcricionais e regiões de terminação translacionais) e/ou o polinucleotídeo dos aspectos podem ser nativos/análogos à célula hospedeira ou entre si. Alternativamente, as regiões reguladoras e/ou o polinucleotídeo dos aspectos podem ser heterólogos à célula hospedeira ou entre si. Conforme usado no presente documento, "heterólogo" em referência a uma sequência é uma sequência que se origina de uma espécie estranha ou, caso seja da mesma espécie, é substancialmente modificada de sua forma nativa em composição e/ou locus genômico através de intervenção humana deliberada.Por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo é de uma espécie diferente da espécie da qual o polinucleotídeo foi derivado ou, se for de espécie igual/análogo, uma ou ambas são substancialmente modificadas de sua forma e/ou locus genômico original ou o promotor não é o promotor nativo para o polinucleotídeo operacionalmente ligado.

[0186] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação de transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse ligada de modo operacional, pode ser nativa com o hospedeiro de planta ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, em que a sequência de DNA é expressa, o hospedeiro de planta, ou qualquer combinação dos mesmos). As regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Consultar também, Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141 a 144; Proudfoot, (1991) Cell 64:671 a 674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141 a 149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1.261 a 1.272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151 a 158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7.891 a 7.903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9.627 a 9.639, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0187] O cassete de expressão que compreende as sequências da presente revelação também pode conter pelo menos uma sequência de nucleotídeos adicional para um gene, sequência heteróloga de nucleotídeos, polinucleotídeo heterólogo de interesse ou polinucleotídeo heterólogo a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, a sequência (ou sequências) de nucleotídeos adicional pode ser fornecida em outro cassete de expressão.

[0188] Quando apropriado, as sequências de nucleotídeos cuja expressão deve estar sob o controle da sequência de promotores preferencial de tecido da presente revelação e qualquer sequência de nucleotídeos (ou sequências de nucleotídeos) adicional podem ser otimizadas para expressão aumentada na planta transformada.Isto é, essas sequências de nucleotídeos podem ser sintetizadas com o uso de códons preferidos de planta para expressão melhorada. Consultar, por exemplo, Campbell e Gowri, (1990) Plant Physiol. 92:1 a 11, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência, para uma discussão sobre uso de códon preferencial de hospedeiro.Métodos estão disponíveis na técnica para sintetizar genes preferenciais para plantas. Consultar, por exemplo, documentos de Patente no U.S. 5.380.831, 5.436.391 e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477 a 498, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0189] As modificações de sequência adicionais são conhecidas por intensificar a expressão de gene em um hospedeiro celular.Essas incluem eliminação de sequências codificantes de sinais de poliadenilação artificiais, sinais de local de divisão de éxon e íntron, repetições tipo transposão e outras tais sequências bastante caracterizadas que podem ser prejudiciais à expressão genética. O teor de G-C da sequência de nucleotídeos heteróloga pode ser ajustado para níveis médios para um dado hospedeiro celular, como calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira.Quando possível, a sequência é modificada para evitar as estruturas de mRNA secundárias em grampo previstas.

[0190] Os cassetes de expressão podem conter adicionalmente sequências-líder 5'.Tais sequências-líder podem atuar para aprimorar a tradução.Líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação: picornoavírus líderes, por exemplo, EMCV líder (região não codificante 5’ de Encefalomiocardite) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 86:6.126 a 6.130); potivírus líderes, por exemplo, TEV líder (Vírus Tobacco Etch) (Allison et al. (1986) Virology 154:9 a 20); MDMV líder (Vírus Maize Dwarf Mosaic); proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90 a 94); líder não traduzido do mRNA de proteína de revestimento de vírus de mosaico de alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622 a 625); vírus de mosaico de tabaco líder (TMV) (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237 a 256) e vírus mosqueado clorótico de milho líder (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382 a 385), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Consultar, também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84:965 a 968, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.Métodos conhecidos para intensificar estabilidade de mRNA também podem ser utilizados, por exemplo, íntrons, tais como o íntron de Ubiquitina de milho (Christensen e Quail, (1996) Transgenic Res. 5:213 a 218; Christensen et al. (1992) Plant Molecular Biology 18:675 a 689) ou o íntron de AdhI de milho (Kyozuka et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 228:40 a 48; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353 a 357) e semelhantes, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0191] Os construtos de DNA dos aspectos também podem incluir intensificadores adicionais, intensificadores de tradução ou transcrição, conforme podem ser necessários.Essas regiões intensificadoras são bastante conhecidas pelas pessoas versadas na técnica, e podem incluir o códon de iniciação ATG e sequências adjacentes. O códon de iniciação precisa estar sintonizado com o quadro de leitura da sequência codificante para assegurar tradução da sequência inteira. Os sinais de controle de tradução e códons de iniciação podem ter uma variedade de origens, tanto naturais quanto sintéticas.Regiões de iniciação translacionais podem ser fornecidas a partir da fonte da região de iniciação transcricional, ou a partir do gene estrutural. A sequência também pode ser derivada do elemento regulador selecionado para expressar o gene, e pode ser especificamente modificada para aumentar a tradução do mRNA.É reconhecido que para aumentar níveis de transcrição, intensificadores podem ser utilizados em combinação com as regiões promotoras dos aspectos. Os intensificadores são conhecidos na técnica e incluem a região intensificadora SV40, o elemento intensificador 35S e semelhantes.

[0192] Na preparação do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a proporcionar as sequências de DNA na orientação adequada e, conforme apropriado, no quadro de leitura adequado.Para este fim podem ser utilizados adaptadores ou ligantes para juntar os fragmentos de DNA, ou outras manipulações podem estar envolvidas para proporcionar locais de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de locais de restrição ou semelhantes. Com esse propósito, a mutagênese in vitro, o reparo de iniciador, a restrição, o anelamento, as ressubstituições, por exemplo, transições e transversões podem ser envolvidos.

[0193] Genes repórteres ou genes marcadores selecionáveis também podem ser incluídos nos cassetes de expressão da presente revelação.Exemplos de genes repórteres adequados conhecidos na técnica podem ser encontrados em, por exemplo, Jefferson et al. (1991) em Plant Molecular Biology Manual, edição, Gelvin et al. (Kluwer Academic Publishers), páginas 1 a 33; DeWet et al. (1987) Mol. Cell Biol. 7:725 a 737; Goff et al. (1990) EMBO J. 9:2.517 a 2.522; Kain et al. (1995) Bio Techniques 19:650 a 655 e Chiu et al. (1996) Current Biology 6:325 a 330, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0194] Genes marcadores selecionáveis para seleção de células ou tecidos transformados podem incluir genes que conferem resistência antibiótica ou resistência aos herbicidas.Exemplos de genes marcadores selecionáveis adequados incluem, porém sem limitação, genes codificantes de resistência ao cloranfenicol (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987 a 992); metotrexato (Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303:209 a 213; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807 a 820); higromicina (Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol.5:103 a 108 e Zhijian et al. (1995) Plant Science 108:219 a 227); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86 a 91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res.5:131 a 137); bleomicina (Hille et al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171 a 176); sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127 a 136); bromoxinila (Stalker et al. (1988) Science 242:419 a 423); glifosato (Shaw et al. (1986) Science233:478 a 481 e Pedidos de Patente no de série U.S. 10/004.357 e 10/427.692); fosfinotricina (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2.513 a 2.518), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0195] Outros genes que teriam utilidade na recuperação de eventos transgênicos incluiriam, porém sem limitação, os exemplos, tais como GUS (beta-glucuronidase; Jefferson, (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387), GFP (proteína de fluorescência verde; Chalfie et al. (1994) Science 263:802), luciferase (Riggs et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15(19):8.115 e Luehrsen et al. (1992) Methods Enzymol. 216:397 a 414) e os genes de milho codificantes para produção de antocianina (Ludwig et al. (1990) Science 247:449), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0196] O cassete de expressão que compreende as sequências de promotores da presente revelação operacionalmente ligadas a um gene morfogênico e ainda de modo opcional operacionalmente ligadas a uma sequência heteróloga de nucleotídeos, um polinucleotídeo heterólogo de interesse, um polinucleotídeo heterólogo nucleotídeo ou uma sequência de interesse pode ser usado para transformar qualquer planta.Dessa maneira, plantas, células vegetais, tecido vegetal, semente, raiz geneticamente modificados e semelhantes podem ser obtidos.

[0197] Conforme usado no presente documento, "vetor" se refere a uma molécula de DNA, tal como um plasmídeo, cosmídeo ou fago bacteriano para introduzir um construto de nucleotídeo, por exemplo, um cassete ou construto de expressão, em uma célula hospedeira.Vetores de clonagem contêm tipicamente um, ou um pequeno número de locais de reconhecimento de endonuclease de restrição nos quais sequências de DNA estranhas podem ser inseridas de uma maneira determinável sem a perda de função biológica essencial do vetor, assim como um gene marcador que é adequado para uso na identificação e seleção de células transformadas com o vetor de clonagem.Genes marcadores incluem tipicamente genes que fornecem resistência à tetraciclina, resistência à higromicina ou resistência à ampicilina.

[0198] Os métodos da revelação envolvem introduzir um polipeptídeo ou polinucleotídeo em uma planta. Conforme usado no presente documento, o termo "introduzir" significa apresentar à planta o polinucleotídeo ou polipeptídeo de uma tal maneira que a sequência ganha acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da revelação não dependem de um método particular para introduzir uma sequência em uma planta, apenas que o polinucleotídeo ou polipeptídeos ganham acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta.Métodos para introduzir polinucleotídeo ou polipeptídeos em plantas são conhecidos na técnica, que incluem, porém sem limitação, os métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente e métodos mediados por vírus.

[0199] Uma "transformação estável” é uma transformação na qual o construto de nucleotídeo introduzido em uma planta se integra no genoma da planta e tem capacidade para ser herdado pela progênie da mesma."Transformação transiente" significa que um polinucleotídeo é introduzido na planta e não se integra no genoma da planta ou um polipeptídeo é introduzido em uma planta.

[0200] Os protocolos de transformação, assim como protocolos para introduzir sequências de nucleotídeos em plantas, podem variar dependendo do tipo de planta ou célula vegetal, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, direcionada para transformação.Métodos adequados de introdução de sequências de nucleotídeos em células de planta e subsequente inserção no genoma de planta incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320 a 334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 83:5.602 a 5.606), Transformação de mediada por Agrobacterium(Townsend et al., Patente número US

5.563.055 e Zhao et al., Patente número US 5.981.840), transferência de gene direta (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2.717 a 2.722) e aceleração de partícula de balística (consultar, por exemplo, Patente no US 4.945.050; 5.879.918;

5.886.244 e 5.932.782; Tomes et al. (1995) em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, edição de Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al.

(1988) Biotechnology 6:923 a 926) e transformação de Lec1 (documento número WO 00/28058).Também consultar Weissinger et al. (1988) Ann.

Rev.

Genet. 22:421 a 477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27 a 37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671 a 674 (soja); McCabe et al.(1988) Bio/Technology 6:923 a 926 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev.Biol. 27P:175 a 182 (soja); Singh et al. (1998) Theor.

Appl.

Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736 a 740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

EUA 85:4.305 a 4.309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology6:559 a 563 (milho); Patentes nos U.S. 5.240.855; 5.322.783 e 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440 a 444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology8:833 a 839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311:763 a 764; Patente nº U.S. 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

EUA 84:5.345 a 5.349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed.

Chapman et al. (Longman, Nova Iorque), páginas 197 a 209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415 a 418 e Kaeppler et al. (1992) Theor.

Appl.

Genet. 84:560 a 566 (transformação mediada por fibras); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1.495 a 1.505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250 a 255 e Christou e Ford, (1995) Annals of Botany 75:407 a 413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology14:745 a 750 (milho por meio de Agrobacterium tumefaciens); todos os quais são incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.Métodos e composições para rápida transformação vegetal também se encontram no documento no U.S. 2017/0121722, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.Vetores úteis na transformação de planta são encontrados no Pedido de Patente de no de série 15/765,521, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0201] Em aspectos específicos, os construtos de DNA que compreendem as sequências de promotor da revelação podem ser fornecidos a uma planta com o uso de uma variedade de métodos de transformação transiente.Tais métodos de transformação temporária incluem, mas sem limitação, sistemas de vetor viral e a precipitação do polinucleotídeo de uma maneira que impeça a liberação subsequente do DNA.Portanto, a transcrição a partir do DNA ligado à partícula pode ocorrer, mas a frequência com que a mesma é liberada para se integrar ao genoma é muito reduzida.Tais métodos incluem o uso de partículas revestidas com polietilimina (PEI; Sigma no P3143).

[0202] Em outros aspectos, o polinucleotídeo da revelação pode ser introduzido em plantas colocando-se plantas em contato com um vírus ou ácidos nucleicos virais.Geralmente, tais métodos envolvem incorporar um construto de nucleotídeo da revelação dentro de um DNA viral ou molécula de RNA. Os métodos para introduzir polinucleotídeos em plantas e expressar uma proteína codificada nos mesmos, envolvendo moléculas de DNA ou RNA viral, são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, documentos de Patente no U.S.

5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931 e Porta et al. (1996) Molecular Biotechnology 5:209 a 221, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0203] São conhecidos na técnica métodos para a inserção direcionada de um polinucleotídeo em uma localização específica no genoma da planta.Em um aspecto, a inserção do polinucleotídeo em uma localização genômica desejada é obtida com o uso de um sistema de recombinação de local específico. Consultar, por exemplo, os documentos no WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 e WO99/25853, em que todos esses estão incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Brevemente, o polinucleotídeo da revelação pode estar contido em cassete de transferência flanqueado por dois locais de recombinação não idênticos. O cassete de transferência é introduzido em uma planta que tem um local-alvo estavelmente incorporado em seu genoma, o qual é flanqueado por dois locais de recombinação não idênticos que correspondem aos locais do cassete de transferência.Uma recombinase apropriada é fornecida e o cassete de transferência é integrado ao local-alvo. O polinucleotídeo de interesse é, assim, integrado em uma posição cromossômica específica no genoma de planta.

[0204] As células que foram transformadas podem se desenvolver em plantas, de acordo com maneiras convencionais. Consultar, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81 a 84, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.Essas plantas podem, então, ser cultivadas e polinizadas com a mesma cepa transformada ou diferentes cepas, e a progênie resultante que tem expressão da característica fenotípica desejada identificada.Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada e, então, as sementes colhidas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada tenha sido atingida.Dessa maneira, a presente revelação fornece a semente transformada (também denominada "semente transgênica") que tem um construto de nucleotídeo da revelação, por exemplo, um cassete de expressão da revelação, incorporado de modo estável em seu genoma.

[0205] Há uma variedade de métodos para a regeneração de plantas a partir do tecido da planta. O método particular de regeneração dependerá do tecido de planta de partida e da espécie de planta particular a ser regenerada. A regeneração, o desenvolvimento e o cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplasto de planta únicos ou de vários explantes transformados são bem conhecidos na técnica (Weissbach e Weissbach, (1988) em: Methods for Plant Molecular Biology, (Edições), Academic Press, Inc., San Diego, Calif., incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência).Esse processo de regeneração e crescimento inclui, tipicamente, as etapas de seleção de células transformadas, cultivar aquelas células individualizadas através dos estágios normais de desenvolvimento embriônicos através do estágio de plântula enraizada.Embriões transgênicos e sementes são similarmente regenerados. Os brotos transgênicos com raiz resultantes são, depois disso, plantados em um meio de crescimento de planta adequado, tal como o solo.De preferência, as plantas regeneradas são autopolinizadas para fornecer plantas transgênicas homozigotas.De outro modo, o pólen obtido a partir das plantas regeneradas é cruzado com plantas cultivadas a partir da semente de linhagens agronomicamente importantes.De modo contrário, o pólen de plantas dessas linhagens importantes é usado para polinizar plantas regeneradas.Uma planta transgênica dos aspectos que contém um polinucleotídeo desejado é cultivada com o uso de métodos bastante conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

[0206] Os aspectos fornecem composições para examinar compostos que modulam a expressão dentro das plantas. Os vetores, células e plantas podem ser usados para examinar moléculas candidatas a agonistas e antagonistas das sequências reguladoras reveladas no presente documento.Por exemplo, um gene repórter pode ser operacionalmente ligado a uma sequência reguladora e expresso como um transgene em uma planta. Compostos a serem testados são adicionados e expressão genética de repórter é medida para determinar o efeito sobre a atividade promotora.

[0207] Em um aspecto, os métodos e composições revelados podem ser usados para introduzir em embriões somáticos com eficiência e velocidade aumentadas polinucleotídeos úteis para direcionar um local específico para modificação no genoma de uma planta derivada do embrião somático. As modificações específicas para local que podem ser introduzidas com os métodos e composições revelados incluem aquelas produzidas com o uso de qualquer método para introduzir modificações específicas para local, incluindo, porém sem limitação, através do uso de oligonucleotídeos de reparo de gene (por exemplo, Publicação no U.S. 2013/0019349) ou através do uso de tecnologias de quebra de fita dupla, tais como TALENs,

meganucleases, nucleases de dedo de zinco, CRISPR-Cas e similares.Por exemplo, os métodos e composições revelados podem ser usados para introduzir um sistema CRISPR-Cas em uma célula vegetal ou planta, com o propósito de modificação de genoma de uma sequência-alvo no genoma de uma planta ou célula de planta, para selecionar plantas, deletar uma base ou uma sequência, para edição de gene e para inserir um polinucleotídeo de interesse no genoma de uma planta ou célula vegetal. Assim, os métodos e composições revelados podem ser usados juntamente com um sistema de CRISPR-Cas para fornecer um sistema eficaz para modificar ou alterar locais-alvo e nucleotídeos de interesse dentro do genoma de uma planta, célula vegetal ou semente. O gene de endonuclease Cas é uma endonuclease Cas9 otimizada vegetal, sendo que a endonuclease Cas9 otimizada vegetal tem capacidade para se ligar a e criar uma quebra de fita dupla em uma sequência-alvo genômica do genoma vegetal.

[0208] A endonuclease Cas é guiada pelo nucleotídeo-guia para reconhecer e, opcionalmente, introduzir uma quebra de fita dupla em um local-alvo específico no genoma de uma célula. O sistema de CRISPR-Cas fornece um sistema eficaz para modificar locais-alvo dentro do genoma de uma planta, célula vegetal ou semente. São adicionalmente fornecidos métodos e composições que empregam um sistema de polinucleotídeo-guia/endonuclease Cas para fornecer um sistema eficaz para modificar locais-alvo dentro do genoma de uma célula e para editar uma sequência de nucleotídeos no genoma de uma célula. Uma vez que um local- alvo genômico é identificado, uma variedade de métodos podem ser empregados para modificar adicionalmente os locais-alvo de modo que os mesmos contenham uma variedade de polinucleotídeos de interesse. As composições e os métodos revelados podem ser usados para introduzir um sistema de CRISPR-Cas para editar uma sequência de nucleotídeos no genoma de uma célula. A sequência de nucleotídeos a ser editada (a sequência de nucleotídeos de interesse) pode estar localizada dentro ou fora de um local-alvo que é reconhecido por uma endonuclease Cas.

[0209] Os loci CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas) (também conhecidos como Repetições Diretas Interespaçadas SPIDRs-SPacer) constituem uma família de loci de DNA recentemente descrita. Os loci de CRISPR consistem em repetições de DNA curtas e altamente conservadas (tipicamente 24 a 40 bp, repetidas de 1 a 140 vezes - também denominadas repetições CRISPR) que são parcialmente palindrômicas. As sequências repetidas (usualmente específicas para uma espécie) são interespaçadas por sequências variáveis de comprimento constante (tipicamente 20 a 58 dependendo do locus de CRISPR (documento no WO2007/025097 publicado em 1 de março de 2007).

[0210] Loci CRISPR foram reconhecidos primeiro em E. coli (Ishino et al. (1987) J. Bacterial. 169:5.429 a 5.433; Nakata et al. (1989) J. Bacterial. 171 :3.553 a 3.556). As repetições de sequência curtas interespaçadas similares foram identificadas em Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena e Mycobacterium tuberculosis (Groenen et al. (1993) Mol. Microbiol. 10:1.057 a 1.065; Hoe et al. (1999) Emerg. Infect. Dis. 5:254 a 263; Masepohl et al.(1996) Biochim. Biophys. Acta 1307:26 a 30; Mojica et al. (1995) Mol.

Microbiol. 17:85 a 93). Os loci de CRISPR diferem de outros SSRs pela estrutura das repetições, as quais foram denominadas repetições espaçadas regularmente curtas (SRSRs) (Janssen et al.(2002) OMICS J. Integ. Biol. 6:23 a 33; Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:244 a 246). As repetições são elementos curtos que ocorrem em agrupamentos que são sempre regularmente espaçados por sequências variáveis de comprimento constante (Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:244 a 246).

[0211] O gene Cas inclui um gene que é geralmente acoplado, associado ou que está próximo ou na vizinhança de loci de CRISPR flanqueadores. Os termos "gene Cas" e "gene associado a CRISPR (Cas)" são usados de forma intercambiável no presente documento. Uma revisão compreensiva da família de proteínas Cas é apresentada em Haft et al. (2005) Computational Biology, PLoS Comput Biol 1(6): e60. doi:10.1371/journal.pcbi.0010060.

[0212] Adicionalmente às quatro famílias de genes inicialmente descritas, uma família de 41 genes associados a CRISPR (Cas) adicional foi descrita no documento WO/2015/026883, que está incorporado ao presente documento a título de referência.Essa referência mostra que os sistemas de CRISPR pertencem às classes diferentes, com diferentes padrões de repetição, conjuntos de genes e gamas de espécies. O número de genes Cas em um dado locus de CRISPR pode variar entre espécies. A endonuclease Cas se refere a uma proteína Cas codificada por um gene Cas, em que a proteína Cas tem capacidade de introduzir uma ruptura de filamento duplo em uma sequência alvo de DNA. A endonuclease Cas é orientada pelo polinucleotídeo-guia para reconhecer e, opcionalmente, introduzir uma ruptura de filamento duplo em um sítio-alvo específico no genoma de uma célula. Conforme usado no presente documento, o termo “sistema de polinucleotídeo- guia/endonuclease Cas” inclui um complexo de uma endonuclease Cas e um polinucleotídeo-guia que tem capacidade de introduzir uma quebra de fita dupla em uma sequência-alvo de DNA. A endonuclease Cas desenrola o duplex de DNA em grande proximidade do local-alvo gemômico e cliva ambas as fitas de DNA sob reconhecimento de uma sequência-alvo através de um nucleotídeo-guia, porém apenas se o motivo adjacente de protoespaçador correto (PAM) estiver orientado aproximadamente na extremidade 3' da sequência-alvo (consultar a Figura 2A e a Figura 2B do documento no WO/2015/026883, publicado em 26 de fevereiro de 2015).

[0213] Em um aspecto, o gene de endonuclease Cas é uma endonuclease Cas9, tal como, porém sem limitação, os genes Cas9 listados nas SEQ ID NOs: 462, 474, 489, 494, 499, 505 e 518 do documento nº WO2007/025097, publicado em 1 de março de 2007, e incorporado ao presente documento a título de referência. Em outro aspecto, o gene de endonuclease Cas é endonuclease Cas9 otimizada de planta, milho ou soja, tal como, porém sem limitação, aquelas mostradas na Figura 1A do documento no WO/2015/026883. Em outro aspecto, o gene de endonuclease Cas é ligado de modo operacional a um sinal de direcionamento nuclear de SV40 a montante da região de códon de Cas e um sinal de localização nuclear de VirD2 bipartido (Tinland et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:7.442 a

7.446) a jusante da região de códon de Cas.

[0214] Em um aspecto, o gene de endonuclease Cas é um gene de endonuclease Cas9 da SEQ ID NO:1, 124, 212, 213, 214, 215,

216, 193 ou nucleotídeos 2.037 a 6.329 da SEQ ID NO:5, ou qualquer fragmento funcional ou variante do mesmo, do documento no WO/2015/026883.

[0215] Conforme relacionado à endonuclease Cas, os termos "fragmento funcional", "fragmento que é funcionalmente equivalente" e “fragmento funcionalmente equivalente" são usados de modo intercambiável no presente documento. Esses termos se referem a uma porção ou subsequência da sequência de endonuclease Cas da presente revelação em que a capacidade para criar uma quebra de fita dupla é mantida.

[0216] Conforme relacionado à endonuclease Cas, os termos "variante funcional", "variante que é funcionalmente equivalente" e “variante funcionalmente equivalente" são usados de modo intercambiável no presente documento. Esses termos se referem a uma variante da endonuclease Cas da presente revelação em que a capacidade para criar uma quebra de fita dupla é mantida. Os fragmentos e as variantes podem ser obtidos por meio de métodos, tais como mutagênese local- dirigida e construção sintética.

[0217] Em um aspecto, o gene de endonuclease Cas é um gene Cas9 de Streptococcus pyogenes otimizado por códon vegetal que pode reconhecer qualquer sequência genômica da forma N(12- 30)NGG que pode, a princípio, ser direcionado.

[0218] Endonucleases são enzimas que clivam a ligação de fosfodiéster dentro de uma cadeia de polinucleotídeo, e incluem endonucleases de restrição que clivam DNA em locais especiais sem danificar as bases. As endonucleases de restrição incluem endonucleases do Tipo I, Tipo II, Tipo III e Tipo IV, que incluem, ainda, subtipos. Nos sistemas do Tipo I e Tipo III, as atividades tanto de metilase quanto de restrição estão contidas em um complexo único.

Endonucleases também incluem meganucleases, também conhecidas como endonucleases de alojamento (HEases), que, assim como endonucleases de restrição, se ligam e cortam em um local de reconhecimento específico, no entanto, os locais de reconhecimento para meganucleases são tipicamente mais longos, cerca de 18 bp ou mais (Pedido de Patente PCT/U.S. 12/30061 depositado em 22 de março de 2012). As meganucleases foram classificadas em quatro famílias com base em motivos de sequência conservados, as famílias são as famílias de LAGLIDADG, GIY-YIG, H-N-H e His-Cys box.

Esses motivos participam da coordenação de íons metálicos e hidrólise de ligações fosfodiéster.

As meganucleases são notáveis por seus longos locais de reconhecimento e por tolerar alguns polimorfismos de sequência nos seus substratos de DNA.

A convenção de nomenclatura para meganucleases é similar à convenção para outras endonucleases de restrição.

As meganucleases também são caracterizadas pelo prefixo F-, I- ou PI- para enzimas codificadas por ORFs, íntrons e inteínas independentes, respectivamente.

Uma etapa no processo de recombinação envolve clivagem polinucleotídica no ou próximo ao sítio de reconhecimento.

Essa atividade de clivagem pode ser usada para produzir uma ruptura de filamento duplo.

Para revisões de recombinases específicas a sítio e seus sítios de reconhecimento, consulte Sauer (1994) Curr Op Biotechnol 5:521 a 527; e Sadowski (1993) FASEB 7:760 a 767. Em alguns exemplos, a recombinase é das famílias Integrase ou Resolvase.

As nucleases de efetor TAL são uma nova classe de nucleases sequência-específicas que pode ser usada para realizar quebras de fita dupla em sequências alvo específicas no genoma de uma planta ou outro organismo (Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143 a 148). As nucleases de dedo de zinco (ZFNs) são agentes de indução de quebra de fita dupla modificados compreendidos por um domínio de ligação ao DNA de dedo de zinco e um domínio de agente de indução de quebra de fita dupla.

A especificidade do sítio de reconhecimento é conferida pelo domínio de dedo de zinco, que compreende, tipicamente, dois, três ou quatro dedos de zinco, por exemplo, que têm uma estrutura C2H2, no entanto, outras estruturas de dedo de zinco são conhecidas e foram modificadas.

Os domínios de dedo de zinco são propícios para projetar polipeptídeos que se ligam especificamente a uma sequência de reconhecimento de polinucleotídeo selecionada.

As ZFNs incluem um domínio de dedo de zinco de ligação ao DNA modificado ligado a um domínio de endonuclease não específico, por exemplo, domínio de nuclease de uma endonuclease do Tipo Ms, tal como Fokl.

Funcionalidades adicionais podem ser fundidas com o domínio de ligação de dedo de zinco, incluindo domínios de ativador transcricional, domínios de repressor transcricional e metilases.

Em alguns exemplos, a dimerização de domínio de nuclease é exigida para a atividade de clivagem.

Cada dedo de zinco reconhece três pares de base consecutivos no DNA-alvo.

Por exemplo, um domínio de 3 dedos reconheceu uma sequência de 9 nucleotídeos contíguos, com uma exigência de dimerização da nuclease, dois conjuntos de tripletos de dedo de zinco são usados para ligar uma sequência de reconhecimento de 18 nucleotídeos.

[0219] Bactérias e Archaea têm defesas imunológicas adaptativas evoluídas denominadas sistemas associados às repetições palindrômicas curtas regularmente espaçadas e agrupadas (CRISPR)/CRISPR (Cas) que usam RNA curto para direcionar a degradação de ácidos nucleicos estranhos (WO2007/025097 publicado em 1 de março de 2007). O sistema CRISPR tipo II/Cas de bactérias emprega um crRNA e tracrRNA para orientar a endonuclease Cas para o seu alvo de DNA. O crRNA (CRISPR RNA) contém a região complementar a uma fita do DNA-alvo de fita dupla e pares de base com o tracrRNA (CRISPR RNA de transativação) que formam um duplex de RNA que orienta a endonuclease Cas a clivar o DNA-alvo.

[0220] Conforme usado no presente documento, o termo “nucleotídeo-guia" refere-se a uma fusão sintética de duas moléculas de RNA, um crRNA (RNA de CRISPR) que compreende um domínio de direcionamento variável e um tracrRNA. Em um aspecto, o nucleotídeo-guia compreende um domínio de direcionamento variável de 12 a 30 sequências de nucleotídeos e um fragmento de RNA que pode interagir com uma endonuclease Cas.

[0221] Conforme usado no presente documento, o termo "polinucleotídeo-guia" se refere a uma sequência de polinucleotídeos que pode formar um complexo com uma endonuclease Cas e permite que a endonuclease Cas reconheça e, opcionalmente, clive um local-alvo de DNA. O polinucleotídeo guia pode ser uma molécula única ou uma molécula dupla. A sequência polinucleotídica-guia pode ser uma sequência de RNA, uma sequência de DNA ou uma combinação das mesmas (uma sequência de combinação de RNA-DNA). Opcionalmente, o polinucleotídeo-guia pode compreender pelo menos um nucleotídeo, ligação fosfodiéster ou modificação de ligação, tal como, mas sem limitação, ácido nucleico bloqueado (LNA, do inglês “Locked Nucleic Acid”), 5-metil dC, 2,6-diaminopurina, 2’-Fluoro A, 2’-Fluoro U, 2’-O-Metil RNA, ligação de fosforotioato, ligação a uma molécula de colesterol, ligação a uma molécula de polietilenoglicol, ligação a uma molécula de espaçador 18 (cadeia de hexaetilenoglicol) ou ligação covalente 5’ a 3’ que resulta em circularização. Um polinucleotídeo-guia que compreende somente ácidos ribonucleicos também é denominado “nucleotídeo-guia".

[0222] O polinucleotídeo-guia pode ser uma molécula dupla (também denominada duplex de polinucleotídeo-guia) que compreende um primeiro domínio de sequência de nucleotídeos (denominado domínio de Direcionamento Variável ou domínio de VT) que é complementar a uma sequência de nucleotídeos em um DNA-alvo e um segundo domínio de sequência de nucleotídeos (denominado domínio de reconhecimento de endonuclease Cas ou domínio de CER) que interage com um polipeptídeo de endonuclease Cas. O domínio de CER do polinucleotídeo guia de molécula dupla compreende duas moléculas separadas que são hibridizadas ao longo de uma região de complementariedade. As duas moléculas separadas podem ser RNA, DNA e/ou sequências de combinação de RNA-DNA. Em um aspecto, a primeira molécula do polinucleotídeo-guia dúplex que compreende um domínio de VT ligado a um domínio de CER é denominada "crDNA" (quando composta de um trecho contíguo de nucleotídeos de DNA) ou "crRNA" (quando composta de um trecho contíguo de nucleotídeos de RNA) ou "crDNA-RNA" (quando composta de uma combinação de

DNA e nucleotídeos de RNA). O crNucleotídeo pode compreender um fragmento do cRNA de ocorrência natural em Bactéria e Archaea. Em um aspecto, o tamanho do fragmento do cRNA de ocorrência natural em Bactérias e Arqueas que está presente em um crNucleotídeo revelado no presente documento pode variar de, mas sem limitação, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos.

[0223] Em um aspecto, a segunda molécula do polinucleotídeo- guia dúplex que compreende um domínio de CER é referida como "tracrRNA" (quando composta por uma extensão contígua de nucleotídeos de RNA) ou "tracrDNA" (quando composta por uma extensão contígua de nucleotídeos de DNA) ou "tracrDNA-RNA" (quando composta por uma combinação de nucleotídeos de DNA e RNA).Em um aspecto, o RNA que guia o complexo de endonuclease Cas9 de RNA é um RNA duplex que compreende um duplex de crRNA e tracrRNA.

[0224] O polinucleotídeo-guia também pode ser uma molécula única que compreende um primeiro domínio de sequência de nucleotídeos (denominado domínio de Direcionamento Variável ou domínio de VT) que é complementar a uma sequência de nucleotídeos em um DNA-alvo e um segundo domínio de nucleotídeo (denominado domínio de reconhecimento de endonuclease Cas ou domínio de CER) que interage com um polipeptídeo de endonuclease Cas. Por “domínio” entende-se uma extensão contígua de nucleotídeos que pode ser uma sequência de RNA, DNA e/ou combinação de RNA-DNA. O domínio VT e/ou o domínio de CER de um polinucleotídeo-guia único pode compreender uma sequência de RNA, uma sequência de DNA ou uma sequência de combinação de RNA-DNA. Em um aspecto, o polinucleotídeo-guia único compreende um crNucleotídeo (que compreende um domínio VT ligado a um domínio de CER) ligado a um tracrNucleotídeo (que compreende um domínio de CER), em que a ligação é uma sequência de nucleotídeos que compreende uma sequência de RNA, uma sequência de DNA ou uma sequência de combinação de RNA-DNA. O polinucleotídeo-guia único que é compreendido por sequências do crNucleotídeo e tracrNucleotídeo pode ser denominado "nucleotídeo-guia único" (quando composto de um trecho contíguo de nucleotídeos de RNA) ou "DNA-guia único" (quando composto de um trecho contíguo de nucleotídeos de DNA) ou “DNA-nucleotídeo-guia único" (quando composto de uma combinação de RNA e nucleotídeos de DNA). Em um aspecto da revelação, o nucleotídeo-guia único compreende um cRNA ou fragmento de cRNA e um tracrRNA ou fragmento de tracrRNA do sistema CRISPR/Cas do tipo II que pode formar um complexo com uma endonuclease Cas tipo II, em que o complexo de nucleotídeo-guia e endonuclease Cas pode direcionar a endonuclease Cas a um local-alvo genômico de planta, que possibilita que a endonuclease Cas introduza uma quebra de fita dupla no local-alvo genômico. Um aspecto de uso de um polinucleotídeo-guia único versus um polinucleotídeo-guia duplex é que apenas um cassete de expressão precisa ser feito para expressar o polinucleotídeo-guia único.

[0225] O termo “domínio de direcionamento variável" ou "domínio de VT" é usado de modo intercambiável no presente documento e inclui uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma fita (sequência de nucleotídeos) de um local-alvo de DNA de fita dupla. A % de complementação entre o primeiro domínio de sequência de nucleotídeos (domínio de VT)

e a sequência-alvo pode ser pelo menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 63%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. O domínio-alvo variante pode ter pelo menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos de comprimento. Em um aspecto, o Domínio de Direcionamento Variável compreende uma extensão contígua de 12 a 30 nucleotídeos. O domínio de direcionamento variável pode ser composto de uma sequência de DNA, uma sequência de RNA, uma sequência de DNA modificada, uma sequência de RNA modificada ou qualquer combinação das mesmas.

[0226] O termo "domínio de reconhecimento de endonuclease Cas" ou "domínio de CER" de um polinucleotídeo guia é usado de modo intercambiável no presente documento e inclui uma sequência de nucleotídeos (como um segundo domínio de sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo guia), que interage com um polipeptídeo de endonuclease Cas. O domínio de CER pode ser composto de uma sequência de DNA, uma sequência de RNA, uma sequência de DNA modificada, uma sequência de RNA modificada (consultar, por exemplo, as modificações descritas no presente documento) ou qualquer combinação dos mesmos.

[0227] A sequência nucleotídica que liga o crNucleotídeo e o tracrNucleotídeo de um polinucleotídeo-guia único pode compreender uma sequência de RNA, uma sequência de DNA ou uma sequência de combinação de RNA-DNA. Em um aspecto, a sequência nucleotídica que liga o crNucleotídeo e o tracrNucleotídeo de um polinucleotídeo-guia único pode ter pelo menos 3, 4, 5, 6,

7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 nucleotídeos de comprimento. Em um outro aspecto, a sequência de nucleotídeos que liga o crNucleotídeo e o tracrNucleotídeo de um polinucleotídeo-guia único pode compreender uma sequência de tetralaço, como, mas sem limitação, uma sequência de tetralaço GAAA.

[0228] A modificação de sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo-guia, do domínio de VT e/ou do domínio de CER pode ser selecionada, mas sem limitação, dentre o grupo que consiste em um cap 5’, uma cauda poliadenilada de 3’, uma sequência de riboswitch, uma sequência de controle de estabilidade, uma sequência que forma um duplex de dsRNA, uma modificação ou sequência que direciona o polinucleotídeo-guia para uma localização subcelular, uma modificação ou sequência que fornece rastreamento, uma modificação ou sequência que fornece um local de ligação para proteínas, um Ácido Nucleico Bloqueado (LNA), um nucleotídeo 5-metil dC, um nucleotídeo

2.6-Diaminopurina, um nucleotídeo 2’-Flúor A, um nucleotídeo 2’-Flúor U; um nucleotídeo de RNA 2’-O-Metil, uma ligação fosforotioato, uma ligação a uma molécula de colesterol, uma ligação a uma molécula de polietilenoglicol, uma ligação a uma molécula de espaçador 18, uma ligação covalente 5’ a 3’ ou qualquer combinação das mesmas. Essas modificações podem resultar em pelo menos um recurso benéfico adicional, em que o recurso benéfico adicional é selecionado dentre o grupo de uma estabilidade modificada ou regulada, um direcionamento subcelular, rastreamento, uma identificação fluorescente, um local de ligação para uma proteína ou complexo de proteína, afinidade de ligação modificada a uma sequência-alvo complementar, resistência modificada à degradação celular e permeabilidade celular aumentada.

[0229] Em um aspecto, o nucleotídeo-guia e a endonuclease Cas têm capacidade para formar um complexo que permite que a endonuclease Cas introduza uma quebra de fita dupla em um local-alvo de DNA.

[0230] Em um aspecto da revelação, o domínio-alvo variável tem 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos em comprimento.

[0231] Em um aspecto da revelação, o nucleotídeo-guia compreende um cRNA (ou fragmento de cRNA) e um tracrRNA (ou fragmento de tracrRNA) do sistema CRISPR/Cas do tipo II que pode formar um complexo com uma endonuclease Cas tipo II, em que o complexo de nucleotídeo-guia e endonuclease Cas pode direcionar a endonuclease Cas a um local-alvo genômico de planta, que possibilita que a endonuclease Cas introduza uma quebra de fita dupla no local-alvo genômico. O nucleotídeo- guia pode ser introduzido em uma planta ou célula vegetal diretamente com o uso de qualquer método conhecido na técnica, tal como, porém sem limitação, bombardeio de partículas ou aplicações tópicas.

[0232] Em um aspecto, o nucleotídeo-guia pode ser introduzido indiretamente introduzindo-se uma molécula de DNA recombinante que compreende a sequência de DNA-guia correspondente operacionalmente ligada a um promotor específico de planta que tem capacidade para transcrever o nucleotídeo-guia na célula vegetal. O termo “DNA-guia correspondente” inclui uma molécula de DNA que é idêntica à molécula de RNA, mas tem um “T” substituído para cada “U” da molécula de RNA.

[0233] Em um aspecto, o nucleotídeo-guia é introduzido por meio de bombardeamento de partícula ou com o uso dos métodos e composições revelados para transformação de Agrobacterium de um construto de DNA recombinante que compreende o DNA-guia correspondente operacionalmente ligado a um promotor de polimerase III U6 vegetal.

[0234] Em um aspecto, o RNA que guia o complexo de endonuclease Cas9 de RNA é um RNA duplex que compreende um duplex de crRNA e tracrRNA. Uma vantagem do uso de um nucleotídeo-guia versus um crRNA-tracrRNA duplexado é que somente um cassete de expressão precisa ser produzido para expressar o nucleotídeo-guia fundido.

[0235] Os termos “local-alvo”, “sequência-alvo”, “DNA-alvo”, “locus-alvo”, “local-alvo genômico”, “sequência-alvo genômica” e “locus-alvo genômico” são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a uma sequência de polinucleotídeos no genoma (incluindo DNA cloroplástico e mitocondrial) de uma célula vegetal na qual uma ruptura de fita dupla é induzida no genoma de célula vegetal por uma endonuclease Cas. O local-alvo pode ser um local endógeno no genoma de planta ou, alternativamente, o local-alvo pode ser heterólogo à planta e, assim, não ser de ocorrência natural no genoma, ou o local-alvo pode ser encontrado em uma localização genômica heteróloga em comparação ao local que a mesma ocorre na natureza.

[0236] Conforme usado no presente documento, os termos “sequência-alvo endógena” e “sequência-alvo nativa” são usados de modo intercambiável no presente documento e referem-se a uma sequência-alvo que é endógena ou nativa do genoma de uma planta e está na posição endógena ou nativa dessa sequência- alvo no genoma da planta. Em um aspecto, o local-alvo pode ser similar a um local de reconhecimento de DNA ou local-alvo que é especificamente reconhecido e/ou ligado por um agente de indução de quebra de fita dupla, tal como uma endonuclease LIG3-4 (Publicação de Patente no U.S. 2009-0133152 A1 (publicada em 21 de maio de 2009) ou uma meganuclease MS26++ (Pedido de Patente no U.S. 13/526912 depositado em 19 de junho de 2012).

[0237] Um “local-alvo artificial” ou uma “sequência-alvo artificial” são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a uma sequência-alvo que foi introduzida no genoma de uma planta. Tal sequência-alvo artificial pode ter sequência idêntica a uma sequência-alvo endógena ou nativa no genoma de uma planta, mas estar localizada em uma posição diferente (isto é, uma posição não endógena ou não nativa) no genoma de uma planta.

[0238] Um “sítio-alvo alterado”, uma “sequência-alvo alterada”, “sítio-alvo modificado” e “sequência-alvo modificada” são usados de modo intercambiável no presente documento e referem-se a uma sequência-alvo, conforme revelado no presente documento, que compreende pelo menos uma alteração em comparação com uma sequência-alvo não alterada. Tais "alterações" incluem, por exemplo: (i) substituição de pelo menos um nucleotídeo, (ii) uma deleção de pelo menos um nucleotídeo, (iii) uma inserção de pelo menos um nucleotídeo, ou (iv) qualquer combinação de (i) a (iii).

[0239] Um resumo das SEQ ID NOS: 1 a 189 é apresentado na Tabela 1.

Tabela 1. Resumo das SEQ ID NOS: 1 a 189.

Polinucleotídeo

SEQ (DNA) ou ID Nome Descrição Polipeptídeo NO. (PRT) sequência de promotor de Glycine max HBSTART3 1 DNA GM-HBSTART3 (transfer3 de lipídio relacionado a Homeodomain) sequência de promotor de Glycine max HBSTART3 GM-HBSTART3 2 DNA (transfer3 de lipídio (TRUNCADO) relacionado a Homeodomain) (TRUNCADO) sequência de promotor de 3 DNA A-ML1 Arabidopsis thaliana ML1 (CAMADA1 DE MERISTEMA) sequência de promotor de 4 DNA GM-ML1-Like Glycine max Tipo ML1 (Tipo CAMADA1 DE

MERISTEMA)

sequência de promotor de GM-ML1-Like Glycine max Tipo ML1 5 DNA (TRUNCADO) (Tipo CAMADA1 DE MERISTEMA) (TRUNCADO)

sequência de promotor de Zea mays HBSTART3 6 DNA ZM-HBSTART3 (transfer3 de lipídio relacionado a Homeodomain)

sequência de promotor de Oryza sativa HBSTART3 7 DNA OS-HBSTART3 (transfer3 de lipídio relacionado a Homeodomain)

sequência de promotor de 8 DNA A-PDF1 Arabidopsis thaliana PDF1 (FATOR1 PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de 9 DNA GM-PDF1 Glycine max PDF1 (FATOR1 PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de GM-PDF1 10 DNA Glycine max PDF1 (FATOR1 (TRUNCADO) PROTODÉRMICO) (TRUNCADO)

11 DNA SB-PDF1 sequência de promotor de Sorghum bicolor PDF1

(FATOR1 PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de 12 DNA OS-PDF1 Oryza sativa PDF1 (FATOR1 PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de OS-PDF1 13 DNA Oryza sativa PDF1 (FATOR1 (TRUNCADO) PROTODÉRMICO) (TRUNCADO)

sequência de promotor de 14 DNA PT-PDF1 Populus trichocarpa PDF1 (FATOR1 PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de PT-PDF1 Populus trichocarpa PDF1 15 DNA (TRUNCADO) (FATOR1 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO)

sequência de promotor de 16 DNA SI-PDF1 Setaria italica PDF1 (FATOR1 PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de SI-PDF1 Setaria italica PDF1 17 DNA (TRUNCADO) (FATOR1 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO)

sequência de promotor de 18 DNA A-PDF2 Arabidopsis thaliana PDF2 (FATOR2 PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de 19 DNA GM-PDF2 Glycine max PDF2 (FATOR2 PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de GM-PDF2 20 DNA Glycine max PDF2 (FATOR2 (TRUNCADO) PROTODÉRMICO) (TRUNCADO)

sequência de promotor de 21 DNA ZM-GL1 Zea mays GL1 (GLABROUS1)

sequência de promotor de Arabidopsis thaliana 22 DNA A-PDF2a PDF2a (FATOR2a PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de A-PDF2a Arabidopsis thaliana 23 DNA (TRUNCADO) PDF2a (FATOR2a PROTODÉRMICO) (TRUNCADO)

sequência de promotor de 24 DNA GM-PDF2a Glycine max PDF2a (FATOR2a PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de GM-PDF2a Glycine max PDF2a 25 DNA (TRUNCADO) (FATOR2a PROTODÉRMICO) (TRUNCADO)

26 DNA OS-PDF2 sequência de promotor de Oryza sativa PDF2 (FATOR2

PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de OS-PDF2 27 DNA Oryza sativa PDF2 (FATOR2 (TRUNCADO) PROTODÉRMICO) (TRUNCADO)

sequência de promotor de 28 DNA PT-PDF2 Populus trichocarpa PDF2 (FATOR2 PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de PT-PDF2 Populus trichocarpa PDF2 29 DNA (TRUNCADO) (FATOR2 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO)

sequência de promotor de 30 DNA VV-PDF2 Vitis vinifera PDF2 (FATOR2 PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de VV-PDF2 Vitis vinifera PDF2 31 DNA (TRUNCADO) (FATOR2 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO)

sequência de promotor de 32 DNA ZM-PDF2 Zea mays PDF2 (FATOR2 PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de 33 DNA SI-PDF2 Setaria italica PDF2 (FATOR2 PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de SI-PDF2 Setaria italica PDF2 34 DNA (TRUNCADO) (FATOR2 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO)

sequência de promotor de 35 DNA VV-PDF2a Vitis vinifera PDF2a (FATOR2a PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de 36 DNA PT-PDF2a Populus trichocarpa PDF2a (FATOR2a PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de PT-PDF2a Populus trichocarpa PDF2a 37 DNA (TRUNCADO) (FATOR2a PROTODÉRMICO) (TRUNCADO)

sequência de promotor de 38 DNA MT-PDF2 Medicago trunculata PDF2 (FATOR2 PROTODÉRMICO)

sequência de promotor de MT-PDF2 Medicago trunculata PDF2 39 DNA (TRUNCADO) (FATOR2 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO)

sequência de promotor de Arabidopsis thaliana HDG2 40 DNA A-HDG2 (GLABROUS2 de HOMEODOMAIN)

sequência de promotor de Glycine max HDG2 41 DNA GM-HDG2 (GLABROUS2 de HOMEODOMAIN)

sequência de promotor de GM-HDG2 Glycine max HDG2 42 DNA (TRUNCADO) (GLABROUS2 de HOMEODOMAIN) (TRUNCADO)

sequência de promotor de Sorghum bicolor HDG2 43 DNA SB-HDG2 (GLABROUS2 de HOMEODOMAIN)

sequência de promotor de SB-HDG2 Sorghum bicolor HDG2 44 DNA (TRUNCADO) (GLABROUS2 de HOMEODOMAIN) (TRUNCADO)

sequência de promotor de 45 DNA A-CER6 Arabidopsis thaliana CER6 (ECERIFERUM6)

sequência de promotor de 46 DNA A-CER60 Arabidopsis thaliana CER60 (ECERIFERUM60)

sequência de promotor de A-CER60 Arabidopsis thaliana 47 DNA (TRUNCADO) CER60 (ECERIFERUM60) (TRUNCADO)

sequência de promotor de 48 DNA GM-CER6 Glycine max CER6 (ECERIFERUM6)

sequência de promotor de GM-CER6 49 DNA Glycine max CER6 (TRUNCADO) (ECERIFERUM6)(TRUNCADO)

sequência de promotor de 50 DNA PT-CER6 Populus trichocarpa CER6 (ECERIFERUM6)

sequência de promotor de PT-CER6 51 DNA Populus trichocarpa CER6 (TRUNCADO) (ECERIFERUM6) (TRUNCADO)

sequência de promotor de 52 DNA VV-CER6 Vitis vinifera CER6 (ECERIFERUM6)

sequência de promotor de VV-CER6 53 DNA Vitis vinifera CER6 (TRUNCADO) (ECERIFERUM6) (TRUNCADO)

sequência de promotor de 54 DNA SB-CER6 Sorghum bicolor CER6 (ECERIFERUM6)

sequência de promotor de 55 DNA ZM-CER6 Zea mays CER6 (ECERIFERUM6)

sequência de promotor de 56 DNA SI-CER6 Setaria italica CER6 (ECERIFERUM6)

sequência de promotor de SI-CER6 57 DNA Setaria italica CER6 (TRUNCADO) (ECERIFERUM6) (TRUNCADO)

sequência de promotor de 58 DNA OS-CER6 Oryza sativa CER6 (ECERIFERUM6)

sequência de promotor de OS-CER6 59 DNA Oryza sativa CER6 (TRUNCADO) (ECERIFERUM6) (TRUNCADO)

sequência de codificação 60 DNA A-WUS de Arabidopsis thalianaWUS sequência de proteína de 61 PRT A-WUS Arabidopsis thalianaWUS sequência de codificação 62 DNA LJ-WUS de Lotus japonicusWUS sequência de proteína de 63 PRT LJ-WUS Lotus japonicusWUS sequência de codificação 64 DNA GM-WUS de Glycine max WUS

65 PRT GM-WUS sequência de proteína de

Glycine max WUS sequência de codificação 66 DNA CS-WUS de Camelina sativaWUS sequência de proteína de 67 PRT CS-WUS Camelina sativaWUS sequência de codificação 68 DNA CR-WUS de Capsella rubellaWUS sequência de proteína de 69 PRT CR-WUS Capsella rubellaWUS sequência de codificação 70 DNA AA-WUS de Arabis alpinaWUS sequência de proteína de 71 PRT AA-WUS Arabis alpinaWUS sequência de codificação 72 DNA RS-WUS de Raphanus sativusWUS sequência de proteína de 73 PRT RS-WUS Raphanus sativusWUS sequência de codificação 74 DNA BN-WUS de Brassica napusWUS sequência de proteína de 75 PRT BN-WUS Brassica napusWUS

76 DNA BO-WUS sequência de codificação de Brassica oleracea var.

oleraceaWUS sequência de proteína de 77 PRT BO-WUS Brassica oleracea var. oleraceaWUS sequência de codificação 78 DNA HA-WUS de Helianthus annuusWUS sequência de proteína de 79 PRT HA-WUS Helianthus annuusWUS sequência de codificação 80 DNA PT-WUS de Populus trichocarpaWUS sequência de proteína de 81 PRT PT-WUS Populus trichocarpaWUS sequência de codificação 82 DNA VV-WUS de Vitis viniferaWUS sequência de proteína de 83 PRT VV-WUS Vitis viniferaWUS sequência de codificação de Arabidopsis 84 DNA A-WUS thalianaWUS (otimizado com soja)

sequência de proteína de 85 PRT A-WUS Arabidopsis thalianaWUS

86 DNA LJ-WUS sequência de codificação de Lotus japonicusWUS

(otimizado com soja)

sequência de proteína de 87 PRT LJ-WUS Lotus japonicusWUS sequência de codificação 88 DNA MT-WUS de Medicago trunculataWUS (otimizado com soja)

sequência de proteína de 89 PRT MT-WUS Medicago trunculataWUS sequência de codificação 90 DNA PY-WUS de Petunia hybridaWUS (otimizado com soja)

sequência de proteína de 91 PRT PY-WUS Petunia hybridaWUS sequência de codificação 92 DNA PV-WUS de Phaseolus vulgarisWUS (otimizado com soja)

sequência de proteína de 93 PRT PV-WUS Phaseolus vulgarisWUS sequência de codificação 94 DNA ZM-WUS1 de Zea mays WUS1 sequência de proteína de 95 PRT ZM-WUS1 Zea mays WUS1

96 DNA ZM-WUS2 sequência de codificação de Zea mays WUS2 sequência de proteína de 97 PRT ZM-WUS2 Zea mays WUS2 sequência de codificação 98 DNA ZM-WUS3 de Zea mays WUS3 sequência de proteína de 99 PRT ZM-WUS3 Zea mays WUS3 sequência de codificação 100 DNA ZM-WOX2A de Zea mays WOX2A sequência de proteína de 101 PRT ZM-WOX2A Zea mays WOX2A sequência de codificação 102 DNA ZM-WOX4 de Zea mays WOX4 sequência de proteína de 103 PRT ZM-WOX4 Zea mays WOX4 sequência de codificação 104 DNA ZM-WOX5A de Zea mays WOX5A sequência de proteína de 105 PRT ZM-WOX5A Zea mays WOX5A sequência de codificação 106 DNA ZM-WOX9 de Zea mays WOX9 sequência de proteína de 107 PRT ZM-WOX9 Zea mays WOX9 sequência de promotor de Glycine max HBSTART2 108 DNA GM-HBSTART2 (transfer2 de lipídio relacionado a Homeodomain)

sequência de promotor de Glycine max MATE1 109 DNA GM-MATE1 (proteína1 de extrusão multi-antimicrobiana)

sequência de promotor de Glycine max NED1 110 DNA GM-NED1 (epimerase/desidratase1 dependente de NAD)

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB) (RB + GM-UBQ PRO::GM- 111 DNA PHP80728 UBQ INTRON1::TAG- RFP::UBQ3 TERM + GM-SAMS PRO::GM-SAMS INTRON1::GM- HRA::GM-ALS TERM + LB)

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB) (RB + GM-LTP3 112 DNA PHP80730 PRO::AT-WUS::UBQ14 TERM + GM-UBQ PRO::GM-UBQ INTRON1::TAG-RFP::UBQ3 TERM + GM-SAMS PRO::GM-

SAMS INTRON1::GM-HRA::GM- ALS TERM + LB)

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB) (RB + GM-HBSTART2 PRO::AT-WUS::UBQ14 TERM + 113 DNA PHP80734 GM-UBQ PRO::GM-UBQ INTRON1::TAG-RFP::UBQ3 TERM + GM-SAMS PRO::GM- SAMS INTRON1::GM-HRA::GM- ALS TERM + LB)

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB) (RB + GM-MATE1 PRO::AT-WUS::UBQ14 TERM + 114 DNA PHP80736 GM-UBQ PRO::GM-UBQ INTRON1::TAG-RFP::UBQ3 TERM + GM-SAMS PRO::GM- SAMS INTRON1::GM-HRA::GM- ALS TERM + LB)

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB) (RB + GM-NED1

115 DNA PHP81060 PRO::AT-WUS::UBQ14 TERM + GM-UBQ PRO::GM-UBQ INTRON1::TAG-RFP::UBQ3 TERM + GM-SAMS PRO::GM- SAMS INTRON1::GM-HRA::GM-

ALS TERM + LB) O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB) (RB + GM-HBSTART3 PRO::AT-WUS::UBQ14 TERM + 116 DNA PHP81343 GM-UBQ PRO::GM-UBQ INTRON1::TAG-RFP::UBQ3 TERM + GM-SAMS PRO::GM- SAMS INTRON1::GM-HRA::GM- ALS TERM + LB) GM-EF1A PRO::GM-EF1A INTRON1::ZS-YELLOW::NOS 117 DNA QC318 TERM + GM-SAMS PRO::GM- SAMS INTRON1::GM-ALS::GM-

ALS TERM AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 118 DNA pVER9662 INTRON1::AT-WUS::UBQ14

TERM AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 119 DNA UBIGMWUS INTRON1::GM-WUS:: UBQ3

TERM AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 120 DNA UBIMTWUS INTRON1::MT-WUS:: UBQ3

TERM 121 DNA UBILJWUS AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 INTRON1::LJ-WUS:: UBQ3

TERM AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 122 DNA UBIPVWUS INTRON1::PV-WUS:: UBQ3

TERM AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 123 DNA UBIPYWUS INTRON1::PY-WUS:: UBQ3

TERM sequência de promotor de Glycine max LTP3 124 DNA GM-LTP3 (Proteína3 de Transferência de Lipídio) sequência de promotor A-ML1 Arabidopsis thaliana ML1 125 DNA (TRUNCADO) (CAMADA1 DE MERISTEMA) (TRUNCADO) sequência de promotor de A-CER6 126 DNA Arabidopsis thaliana CER6 (TRUNCADO1) (ECERIFERUM6) (TRUNCADO) sequência de codificação 127 DNA GG- WUS de Gnetum gnemon WUS sequência de proteína de 128 PRT GG- WUS Gnetum gnemon WUS sequência de codificação 129 DNA MD-WUS de Malus domestica WUS sequência de proteína de 130 PRT MD-WUS Malus domestica WUS sequência de codificação 131 DNA ME-WUS de Manihot esculenta WUS sequência de proteína de 132 PRT ME-WUS Manihot esculenta WUS sequência de codificação 133 DNA KF-WUS de Kalanchoe fedtschenkoi

WUS sequência de proteína de 134 PRT KF-WUS Kalanchoe fedtschenkoi

WUS sequência de codificação 135 DNA GH-WUS de Gossypium hirsutum WUS sequência de proteína de 136 PRT GH-WUS Gossypium hirsutum WUS sequência de codificação 137 DNA ZOSMA-WUS de Zostera marina WUS sequência de proteína de 138 PRT ZOSMA-WUS Zostera marina WUS sequência de codificação 139 DNA AMBTR-WUS de Amborella trichopoda

WUS sequência de proteína de 140 PRT AMBTR-WUS Amborella trichopoda WUS sequência de codificação 141 DNA AC-WUS de Aquilegia coerulea WUS sequência de proteína de 142 PRT AC-WUS Aquilegia coerulea WUS sequência de codificação 143 DNA AH-WUS de Amaranthus hypochondriacus WUS sequência de proteína de 144 PRT AH-WUS Amaranthus hypochondriacus WUS sequência de codificação 145 DNA CUCSA-WUS de Cucumis sativus WUS sequência de proteína de 146 PRT CUCSA -WUS Cucumis sativus WUS sequência de codificação 147 DNA PINTA-WUS de Pinus taeda WUS sequência de proteína de 148 PRT PINTA-WUS Pinus taeda WUS sequência de promotor de A-PDF1 Arabidopsis thaliana PDF1 149 DNA (TRUNCADO) (FATOR1 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO)

sequência de promotor de A-PDF2 Arabidopsis thaliana PDF1 150 DNA (TRUNCADO) (FATOR1 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO)

sequência de promotor de A-HDG2 Arabidopsis thaliana HDG2 151 DNA (TRUNCADO) (GLABROUS2 de HOMEODOMAIN) (TRUNCADO)

promotor de Arabidopsis 152 DNA A-ANL2 thaliana Anthocyanless2

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB):RB + CAMV35S PRO::HA- WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM- 153 DNA RV021090 UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB

T-DNA com GNEGN-WUS (GG - Gnetum gnemon)

154 DNA RV026522 O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB):RB + CAMV35S PRO:: GG-WUS::OS-T28 TERM + GM-

UBQ PRO::GM-UBQ 5UTR::GM- UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5UTR::AT- UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB

T-DNA com VITVI-WUS (VV - Vitis vinifera)

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB):RB + CAMV35S PRO::VV- WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ 155 DNA RV026526 PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM- UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB

T-DNA com PETHY-WUS (PH - Petunia hybrida)

O construto sintético que 156 DNA RV026534 compreende o T-DNA (RB a LB):RB + CAMV35S PRO::PH- WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM-

UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB

T-DNA com MALDO-WUS (MD - Malus domestica)

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB):RB + CAMV35S PRO::MD- WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ 157 DNA RV026531 PRO::GM-UBQ 5UTR::GM-UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5UTR::AT- UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB

T-DNA com MANES-WUS (ME - Manihot esculenta)

O construto sintético que 158 DNA RV026524 compreende o T-DNA (RB a LB):RB + CAMV35S PRO::ME- WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM- UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1

N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB

T-DNA com KALFE-WUS (KF - Kalanchoe fedtschenkoi)

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB):RB + CAMV35S PRO::KF- WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ 159 DNA RV026523 PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM- UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB

T-DNA com GOSHI-WUS (GH - Gossypium hirsutum)

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a 160 DNA RV026530 LB):RB + CAMV35S PRO::GH- WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM- UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10

PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT- UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB

T-DNA com ZOSMA-WUS (Zostera marina)

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB):RB + CAMV35S PRO::ZOSMA-WUS::OS-T28

161 DNA RV026527 TERM + GM-UBQ PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM-UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB

T-DNA com AMBTR-WUS (Amborella trichopoda)

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a 162 DNA RV026529 LB):RB + CAMV35S PRO::AMBTR-WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM-UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1

T-DNA com AQUCO-WUS (Aquilegia coerulea)

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB):RB + CAMV35S PRO::AC- WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ 163 DNA RV026528 PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM- UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB

T-DNA com POPTR-WUS (Populus trichocarpa)

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a 164 DNA RV026520 LB):RB + CAMV35S PRO::PT- WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM- UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10

PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB

T-DNA com AMAHY-WUS (Amaranthus hypochondriacus)

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB):RB + CAMV35S PRO::AH-

165 DNA RV026533 WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM- UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB

T-DNA com CUCSA-WUS (Cucumis sativus)

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a 166 DNA RV026521 LB):RB + CAMV35S PRO::CS- WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM- UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10

PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB

T-DNA com PINTA-WUS (Pinus taeda)

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB):RB + CAMV35S PRO::PINTA-WUS::OS-T28

167 DNA RV026525 TERM + GM-UBQ PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM-UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB

T-DNA com cassete NO WUS

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB):RB + CCDB + GM-UBQ 168 DNA RV022814 PRO-V1::GM-UBQ 5’ UTR::GM-UBQ INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + GM-EF1A2 PRO:: GM- EF1A2 5’ UTR:: GM-EF1A2

INTRON1:: GM-EF1A2 5’ UTR::DS-RED2::UBQ3 TERM +

LB T-DNA com AT-PDF2 PRO O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB):RB + AT-PDF2 PRO::HA- WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ 169 DNA RV027344 PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM- UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB T-DNA para TESTE PRO NEG-

NO WUS O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB):RB + GM-UBQ PRO- 170 DNA RV026532 V1::GM-UBQ 5’ UTR::GM-UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + GM-UBQ PRO-V1::GM-UBQ 5’ UTR::GM-UBQ INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + GM-EF1A2 PRO:: GM-

EF1A2 5’ UTR:: GM-EF1A2 INTRON1:: GM-EF1A2 5’ UTR::DS-RED2::UBQ3 TERM +

LB T-DNA com AT-ANL2 PRO O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB):RB + AT-ANL2 PRO::HA- WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ 171 DNA RV027337 PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM- UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB T-DNA com AT-CER6 PRO O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB):RB + AT-CER6 PRO::HA- WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ 172 DNA RV027338 PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM- UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14

TERM + LB

T-DNA com AT-HDG2 PRO

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB):RB + AT-HDG2 PRO::HA- WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ

173 DNA RV027340 PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM- UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB

T-DNA com AT-ML1 PRO

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB):RB + AT-ML1 PRO::HA- WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ

174 DNA RV027342 PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM- UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB

175 DNA RV027343 T-DNA com AT-PDF1 PRO

O construto sintético que compreende o T-DNA (RB a LB):RB + AT-PDF1 PRO::HA- WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ PRO::GM-UBQ 5’ UTR::GM- UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5’ UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB

Alvo1 de PCR de sequência 176 DNA Alvo1 de PCR sintética

Alvo2 de PCR de sequência 177 DNA Alvo2 de PCR sintética

Alvo3 de PCR de sequência 178 DNA Alvo3 de PCR sintética

Alvo4 de PCR de sequência 179 DNA Alvo4 de PCR sintética

Alvo5 de PCR de sequência 180 DNA Alvo5 de PCR sintética

Alvo6 de PCR de sequência 181 DNA Alvo6 de PCR sintética

Alvo7 de PCR de sequência 182 DNA Alvo7 de PCR sintética

Alvo8 de PCR de sequência 183 DNA Alvo8 de PCR sintética Alvo9 de PCR de sequência 184 DNA Alvo9 de PCR sintética Alvo10 de PCR de 185 DNA Alvo10 de PCR sequência sintética Alvo11 de PCR de 186 DNA Alvo11 de PCR sequência sintética Alvo12 de PCR de 187 DNA Alvo12 de PCR sequência sintética Alvo13 de PCR de 188 DNA Alvo13 de PCR sequência sintética Sequência de promotor de AT-CER6 189 DNA Arabidopsis thaliana CER6 (TRUNCADO2) (ECERIFERUM6) (TRUNCADO2)

[0240] Os exemplos a seguir são oferecidos a título de ilustração e não como limitação.

EXEMPLOS

[0241] Os aspectos da revelação são adicionalmente definidos nos seguintes exemplos, em que partes e porcentagens são em peso e graus são Celsius, exceto se indicado de outro modo.Esses exemplos, embora indiquem aspectos da revelação, são fornecidos apenas a título de ilustração. A partir da discussão acima e desses Exemplos, uma pessoa versada na técnica pode determinar as características essenciais dos aspectos da revelação, e sem se afastar do espírito e escopo dos mesmos, pode realizar várias alterações e modificações nos mesmos para se adaptarem às várias utilizações e condições.Portanto, várias modificações adicionalmente àquelas mostradas e descritas no presente documento ficarão evidentes para aqueles indivíduos versados na técnica a partir da descrição anterior.Tais modificações também se destinam a ser abrangidas pelo escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLO 1. MATERIAIS VEGETAIS E COMPOSIÇÕES DE MEIO

[0242] Uma ampla variedade de tipos de tecido ou explante pode ser usada no presente método, incluindo culturas de suspensão, cotiledôneas imaturas, cotiledôneas maduras, semente dividida, eixos geométricos embrionários, hipocótilos, epicótilos e folhas. As composições de vários meios usados na transformação de soja, cultura de tecido e regeneração são esboçados na Tabela 2.Nessa tabela, o meio M1 é usado para a iniciação de culturas de suspensão, se esse for o material de partida para a transformação. Os meios M2 e M3 representam meios de cocultivo típicos úteis para transformação de Agrobacterium da gama inteira de explantes listados acima. O meio M4 é útil para a seleção (com o agente seletivo apropriado), M5 é usado para a maturação de embrião somático e o meio M6 é usado para germinação para produzir T0 plântulas.

Tabela 2. Composição de Meios de Cultivo M1 a M5

M1 M2 M3 M4 M5 M6

O sal de MS com vitaminas 4,44 4,4 4,44 B5 (PhytoTech g/L g/L g/L M404)

Meio basal de Gamborg B-5 3,21 (PhytoTech g/L G398)

Sal de MS modificado 2,68 2,68 (PhytoTech g/L g/L M571)

vitaminas B5 (1000X) 1 ml 1 ml 1 ml (PhytoTech G249)

2,4-D estoque 4 ml 1 ml 1 ml 4 ml a 10 mg/ml

1,64 1,64 KNO3 g/L g/L

0,463 0,463 (NH4)2SO4 g/L g/L

Asparagina 1 g/L 1 g/L

68,5 85,6 Sacarose 20 g/L g/L g/L

31,5 49,6 31,5 Glicose 36 g/L g/L g/L g/l

Maltose 60 g/L

0,75 MgCl2.6H2O g/L

Carvão ativado (PhytoTech 5 g/L C325)

Hidrolisado de caseína 1 g/L 1 g/L (PhytoTech C184)

pH 7,0 5,4 5,4 7,0 5,7 5,7

Acetosiringona 300 µM 300 µM

Ágar TC 4 g/L 5 g/L

Gelrita (Meios vegetais no de 2 g/l 2 g/L Cat 714246)

[0243] Após 1 a 5 dias de cocultura, o tecido é cultivado em meio de M3 sem seleção por uma semana (período de recuperação) e, então, movido para a seleção.Para a seleção, um antibiótico ou herbicida é adicionado ao meio de M3 para a seleção de transformantes estáveis.Para começar a contrasseleção contra Agrobacterium, 300 mg/l de Timentin® (dissódio ticarcilina estéril misturado com potássio de clavulanato, PlantMedia, Dublin, OH, EUA) também é adicionado, e tanto o agente seletivo quanto Timentin® são mantidos no meio ao longo da seleção (até o total de 8 semanas). O meio seletivo é substituído semanalmente. Após 6 a 8 semanas no meio seletivo, o tecido transformado se torna visível como tecido verde contra um segundo plano de tecido alvejado (ou necrótico) menos saudável.Esses pedaços de tecido são cultivados por 4 a 8 semanas adicionais.

[0244] Os embriões somáticos verdes e saudáveis são, então, transferidos para meios de M5 contendo 100 mg/l de Timentin®. Após um total de 4 semanas de maturação em meios de M5, embriões somáticos maduros são colocados em uma placa Petri vazia estéril, vedada com fita MicroporeTM (3M Health Care, St. Paul, MN, EUA) ou colocados em uma caixa de plástico (sem fita de fibra) por 4 a 7 dias à temperatura ambiente.

[0245] Os embriões dissecados são plantados em meios de M6 em que são deixados para germinar a 26 °C com um fotoperíodo de 18 horas a 60 a 100 µE/m2/s de intensidade de luz. Após 4 a 6 semanas em meios de germinação, as plântulas são transferidas para péletes de turfa Jiffy-7 umedecidos (Jiffy Products Ltd, Shippagan, Canadá), e mantidos fechados em caixas de bandeja plástica claras até serem climatizados em um incubador Percival sob as seguintes condições, um fotoperíodo de 16 horas a 60 a 100 µE/m2/s, temperaturas de dia/noite 26 °C/24 °C.Por fim, as plântulas endurecidas são envasadas em vasos de 2 galões contendo SunGro 702 umedecido e cultivadas à maturidade, semente portadora, em uma estufa.

EXEMPLO 2: TRANSFORMAÇÃO DE SOJA

[0246] Os padrões para bombardeamento de partícula (Finer e McMullen, 1991, In Vitro Cell Dev. Biol. – Plant 27:175 a 182), a transformação mediada por Agrobacterium (Jia et al., 2015, Int J. Mol. Sci. 16:18552 a 18543; no U.S. 20170121722 incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade), ou transformação mediada por Ochrobactrum (no U.S. 20180216123 incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade) para soja pode ser usada com os métodos da revelação.

EXEMPLO 3: O PROMOTOR DE GM-LTP3 CONTROLANDO EXPRESSÃO DE WUS

APRIMORA A TRANSFORMAÇÃO DE SOJA

[0247] A cepa de Agrobacterium AGL1, contendo um T-DNA com o cassete de expressão GM-LTP3 PRO::AT-WUS::UBQ14 TERM + GM-UBQ PRO::GM-UBQ INTRON1::TAG-RFP::UBQ3 TERM + GM-SAMS PRO::GM-SAMS INTRON1::GM-HRA::GM-ALS TERM (PHP80730; SEQ ID NO:112), foi usado para transformar a variedade de soja Pioneer PHY21.Quatro dias após a infecção por Agrobacterium iniciar, o tecido foi lavado com meio de cultura estéril para remover bactérias em excesso.Nove dias depois o tecido foi movido para meio de maturação de embrião somático e vinte e dois dias depois que os embriões transgênicos somáticos estavam prontos para secar.Nesse ponto, embriões somáticos maduros bem formados estavam vermelhos fluorescentes sob um estereomicroscópio de epifluorescência com um conjunto de filtro de RFP. Os embriões somáticos que se desenvolveram foram funcionais e germinaram para produzir plantas saudáveis na estufa.Esse rápido método de produção de embriões somáticos e germinação para formar plantas reduziu o cronograma típico da infecção por Agrobacterium para mover plantas T0 transgênicas para a estufa de quatro meses (para transformação de soja convencional) para dois meses.

EXEMPLO 4: O PROMOTOR DE GM-HBSTART3 CONTROLANDO A EXPRESSÃO

DE WUS APRIMORA A EFICIÊNCIA DE MATURAÇÃO DE TRANSFORMAÇÃO DE SOJA

[0248] Em variedades de soja que são difíceis de transformar, é comumente observado que muitos dos embriões somáticos transgênicos que se formam durante o processo de transformação de soja falham em amadurecer adequadamente. A falha dos embriões somáticos para amadurecer, por fim, resulta em frequências amplamente reduzidas de germinação para formar plântulas transgênicas que irão sobreviver na estufa. Os promotores (GM-HBSTART3 (SEQ ID NO:1), GM-LTP3 (SEQ ID NO:124), GM-HBSTART2 (SEQ ID NO:108), GM-MATE1(SEQ ID NO:109), GM-NED1 (SEQ ID NO:110)) conduzindo a expressão de WUS foram testados para determinar seu impacto sobre a eficiência de maturação de transformação de soja. O promotor de GM-HBSTART3 (SEQ ID NO:1) conduzindo a expressão de WUS (PHP81343; SEQ ID NO:116) aprimorou amplamente a eficiência de maturação de embrião somático, aumentando a eficiência de maturação de um valor mediano menor que 8% no controle de TAG-RFP (PHP80728; SEQ ID NO:111) a mais de 50%. Consultar a Figura 1.Isso se traduziu diretamente em uma frequência aumentada de embriões somáticos transgênicos maduros que foram capazes de germinar para formar plantas T0 transgênicas. Consultar as Figuras 3A e 3B.

[0249] Usar outros promotores para conduzir a expressão de WUS resultou em eficiências de maturação intermediárias, com níveis medianos de 13%, 33%, 13% e 15% para os promotores de GM-HBSTART2 (PHP80734; SEQ ID NO:113), GM-LTP3 (PHP80730; SEQ ID NO:112), GM-MATE1 (PHP80736; SEQ ID NO:114) ou os promotores de GM-NED1 (PHP81060; SEQ ID NO:115), respectivamente. Consultar a Figura 1.No tratamento de controle de TAG-RFP (PHP80728; SEQ ID NO:111), embriões somáticos foram pequenos e subdesenvolvidos a 5 a 6 semanas após a infecção por Agrobacterium, enquanto os embriões somáticos nos tratamentos de GM-LTP3 PRO::WUS (PHP80730; SEQ ID NO:112) e GM-HBSTART3 PRO::WUS (PHP81343; SEQ ID NO:116) foram aproximadamente 2 a 5 vezes maiores, respectivamente. Consultar as Figuras 2A a 2F.

EXEMPLO 5: O PROMOTOR DE GM-HBSTART3 OU DE GM-LTP3 CONTROLANDO

A EXPRESSÃO DE GENES MORFOGÊNICOS APRIMORA A TRANSFORMAÇÃO

[0250] Usar opromotor de GM-HBSTART3 (SEQ ID NO: 1), o promotor de GM-LTP3 (SEQ ID NO:124) ou qualquer um dos outros promotores revelados no presente documento para conduzir a expressão de um gene tipo Arabidopsis LEC1, LEC2, KN1, STM ou LEC1 (Kwong et al. (2003) The Plant Cell, Volume 15, 5 a 18) em cassetes de expressão que compreendem um marcador fluorescente, constatadamente aumenta a frequência de formação de embrião somático e a recuperação de plantas T0 transgênicas.

A cepa de Agrobacterium LBA4404 é usada para transformar vários tipos de explante, incluindo cotiledôneas imaturas, sementes divididas, eixos geométricos embrionários isolados, nódulos cotiledonários maduros, hipocótilo, epicótilo ou tecido de folha de variedade de soja Pioneer PHY21.Quatro dias após a infecção por Agrobacterium iniciar, o tecido é lavado com meio de cultura estéril para remover bactérias em excesso.Espera-se que aproximadamente nove dias após o tecido ser movido para o meio de maturação de embrião somático, e aproximadamente vinte e dois dias depois disso, os embriões somáticos transgênicos estejam prontos para a secagem.Nesse ponto, embriões somáticos maduros bem formados fluorescem sob um estereomicroscópio de epifluorescência com um conjunto de filtro apropriado.

Os embriões somáticos que se desenvolvem são funcionais e germinam para produzir plantas saudáveis na estufa.É esperado que esse método rápido de produção de embriões somáticos e germinação para formar plantas reduza o cronograma típico da infecção por Agrobacterium para mover plantas T0 transgênicas para a estufa de quatro meses (para transformação de soja convencional) para aproximadamente dois a três meses.

EXEMPLO 6: USO DO PROMOTOR DE GM-HBSTART3 OU DE GM-LTP3 PARA

CONTROLAR A EXPRESSÃO DO GENE DE AGROBACTERIUM IPT ESTIMULA A FORMAÇÃO DIRETA DE BROTO E APRIMORA A TRANSFORMAÇÃO

[0251] Usar opromotor de GM-HBSTART3 (SEQ ID NO: 1), o promotor de GM-LTP3 (SEQ ID NO:124) ou qualquer um dentre outros promotores revelados no presente documento para conduzir a expressão de um gene de Agrobacterium IPT em cassetes de expressão que compreendem um marcador fluorescente, constatadamente aumenta a frequência de formação de múltiplos brotos e a recuperação de plantas T0 transgênicas. A cepa de Agrobacterium LBA4404 é usada para transformar vários tipos de explante, incluindo cotiledôneas imaturas, sementes divididas, eixos geométricos embrionários isolados, nódulos cotiledonários maduros, hipocótilo, epicótilo ou tecido de folha de variedade de soja Pioneer PHY21.Quatro dias após a infecção de Agrobacterium ser iniciada, o tecido é lavado com meio de cultura estéril para remover as bactérias em excesso e movido para o meio que promove proliferação de múltiplos brotos.Espera-se que nove dias depois o tecido seja movido para o meio que favorece o desenvolvimento de broto, e vinte e dois dias depois disso, que os brotos transgênicos sejam movidos para o meio que promove o enraizamento.Nesse ponto, as plântulas incipientes fluorescem sob um estereomicroscópio de epifluorescência com uma definição de filtro apropriada. As plântulas funcionais se desenvolvem rapidamente e continuam a crescer e a produzir plantas saudáveis na estufa.Espera-se que esse método rápido de formar diretamente plantas transgênicas reduza o cronograma típico da infecção de Agrobacterium a mover as plantas T0 transgênicas para a estufa de quatro meses (para a transformação de soja convencional) para aproximadamente dois a três meses.

EXEMPLO 7: O PROMOTOR DE GM-HBSTART3 OU DE GM-LTP3 CONTROLANDO A EXPRESSÃO DO GENE DE ARABIDOPSIS MONOPTEROS-DELTA ESTIMULA A

FORMAÇÃO DIRETA DE BROTO E APRIMORA A TRANSFORMAÇÃO

[0252] Usar opromotor de GM-HBSTART3 (SEQ ID NO: 1), o promotor de GM-LTP3 (SEQ ID NO:124) ou qualquer um dentre outros promotores revelados no presente documento para conduzir a expressão de um gene de Arabidopsis MONOPTEROS- DELTA em cassetes de expressão que compreendem um marcador fluorescente, constatadamente aumenta a frequência de formação de múltiplos brotos e a recuperação de plantas T0 transgênicas. A cepa de Agrobacterium LBA4404 é usada para transformar vários tipos de explante, incluindo cotiledôneas imaturas, sementes divididas, eixos geométricos embrionários isolados, nódulos cotiledonários maduros, hipocótilo, epicótilo ou tecido de folha na variedade de soja Pioneer PHY21.Quatro dias após a infecção de Agrobacterium ser iniciada, o tecido é lavado com meio de cultura estéril para remover as bactérias em excesso e movido para o meio que promove proliferação de múltiplos brotos.Espera-se que nove dias depois o tecido seja movido para o meio que favorece o desenvolvimento de broto, e vinte e dois dias depois disso, que os brotos transgênicos sejam movidos para o meio que promove o enraizamento.Nesse ponto, as plântulas incipientes fluorescem sob um estereomicroscópio de epifluorescência com uma definição de filtro apropriada. As plântulas funcionais se desenvolvem rapidamente e continuam a crescer e a produzir plantas saudáveis na estufa.Espera-se que esse método rápido de formar diretamente plantas transgênicas reduza o cronograma típico da infecção de Agrobacterium a mover as plantas T0 transgênicas para a estufa de quatro meses (para a transformação de soja convencional) para aproximadamente dois a três meses.

EXEMPLO 8: O PROMOTOR DE GM-HBSTART3 OU DE GM-LTP3 CONTROLANDO

A EXPRESSÃO DE GENES DE REFORÇO DE CRESCIMENTO APRIMORA A TRANSFORMAÇÃO

[0253] Usar opromotor de GM-HBSTART3 (SEQ ID NO: 1), o promotor de GM-LTP3 (SEQ ID NO:124) ou qualquer um dentre outros promotores revelados no presente documento para conduzir a expressão de um gene de Agrobacterium AV-6B, um gene de Agrobacterium IAA-h, um gene de Agrobacterium IAA-m, um gene de Arabidopsis SERK ou um gene de Arabidopsis AGL15 em cassetes de expressão que compreendem um marcador fluorescente, constatadamente aumenta a frequência de formação de embrião somático e a recuperação de plantas T0 transgênicas. A cepa de Agrobacterium LBA4404 é usada para transformar vários tipos de explante, incluindo cotiledôneas imaturas, sementes divididas, eixos geométricos embrionários isolados, nódulos cotiledonários maduros, hipocótilo, epicótilo ou tecido de folha de variedade de soja Pioneer PHY21.Quatro dias após a infecção por Agrobacterium iniciar, o tecido é lavado com meio de cultura estéril para remover bactérias em excesso.Espera-se que nove dias depois o tecido seja movido para o meio de maturação de embrião somático, e vinte e dois dias depois disso, que os embriões somáticos transgênicos estejam prontos para secagem.Nesse ponto, embriões somáticos maduros bem formados fluorescem sob um estereomicroscópio de epifluorescência com um conjunto de filtro apropriado. Os embriões somáticos que se desenvolvem são funcionais e germinam para produzir plantas saudáveis na estufa.É esperado que esse método rápido de produção de embriões somáticos e germinação para formar plantas reduza o cronograma típico da infecção por Agrobacterium para mover plantas T0 transgênicas para a estufa de quatro meses (para transformação de soja convencional) para aproximadamente dois a três meses.

EXEMPLO 9: USO DE ELEMENTOS DE REFORÇO VIRAL EM CONJUNTO COM O PROMOTOR DE GM-HBSTART3 PARA CONDUZIR A EXPRESSÃO DE

RESULTADOS DE WUS EM APRIMORAMENTO ADICIONAL DE TRANSFORMAÇÃO DE SOJA

[0254] Em relação ao uso do promotor de GM-HBSTART3 (SEQ ID NO: 1), o promotor de GM-LTP3 (SEQ ID NO:124) ou qualquer um dentre os outros promotores revelados no presente documento sozinhos, o uso de umelemento de reforço viral como o reforçador de 35S adjacente ao promotor de GM-HBSTART3 (SEQ ID NO: 1), o promotor de GM-LTP3 (SEQ ID NO:124) ou qualquer um dentre os outros promotores revelados no presente documento para conduzir a expressão de WUS em cassetes de expressão que compreendem um marcador fluorescente, resulta em um crescimento adicional na frequência de formação de embrião somático e na frequência de maturação de embrião somático, resultando em um aumento geral na recuperação de plantas T0 transgênicas. A cepa de Agrobacterium LBA4404 é usada para transformar vários tipos de explante, incluindo cotiledôneas imaturas, sementes divididas, eixos geométricos embrionários isolados, nódulos cotiledonários maduros, hipocótilo, epicótilo ou tecido de folha de variedade de soja Pioneer PHY21.Quatro dias após a infecção por Agrobacterium iniciar, o tecido é lavado com meio de cultura estéril para remover bactérias em excesso.Nove dias depois, o tecido é movido para meio de maturação de embrião somático e vinte e dois dias depois, os embriões transgênicos somáticos estão prontos para secar.Nesse ponto, embriões somáticos maduros bem formados fluorescem sob um estereomicroscópio de epifluorescência com um conjunto de filtro apropriado. Os embriões somáticos que se desenvolvem são funcionais e germinam para produzir plantas saudáveis na estufa.Esse rápido método de produção de embriões somáticos e germinação para formar plantas reduz o cronograma típico da infecção por Agrobacterium para mover plantas T0 transgênicas para a estufa de quatro meses (para transformação de soja convencional) para aproximadamente dois a três meses.

[0255] Outros elementos de reforço são testados de um modo similar, e mostram que também resultam em transformação aumentada em relação ao uso do promotor de GM-HBSTART3 (SEQ ID NO: 1) sozinho.Esses reforçadores incluem os reforçadores virais como o Vírus do Mosaico da Couve-flor 35S e o Vírus do Mosaico Mirabilis 2xMMV, assim como os elementos de reforço de planta endógenos.

EXEMPLO 10: ORTÓLOGOS DO GENE DE ARABIDOPSIS WUS FUNCIONAM EM

SOJA PARA ESTIMULAR A FORMAÇÃO DE EMBRIÃO SOMÁTICO

[0256] Os seguintes tratamentos foram comparados.Para os tratamentos de transformação de arma de partícula, todos continham plasmídeo QC318 (SEQ ID NO:117) com GM-EF1A PRO::GM- EF1A INTRON1::ZS-YELLOW::NOS TERM + GM-SAMS PRO::GM-SAMS INTRON1::GM-ALS::GM-ALS TERM. Os tratamentos incluíram 1) um controle sem genes adicionais, 2) pVER9662 (SEQ ID NO:118) com o AT-UBI PRO conduzindo a expressão do gene de Arabidopsis WUS, 3) UBIGMWUS (SEQ ID NO:119) com o AT-UBI PRO conduzindo a expressão do gene de Glycine max de WUS, 4) UBIMTWUS (SEQ ID NO:120) com o AT-UBI PRO conduzindo a expressão do gene de Medicago truncatula WUS, 5) UBILJWUS (SEQ ID NO:121) com o AT- UBI PRO conduzindo a expressão do gene de Lotus japonica WUS, 6) UBIPVWUS (SEQ ID NO:122) com o AT-UBI PRO conduzindo a expressão do gene de Phaseolus vulgaris WUS, e 7) UBIPYWUS (SEQ ID NO:123) com o AT-UBI PRO conduzindo a expressão do gene de petúnia de WUS.

[0257] As cotiledôneas imaturas foram isoladas da semente, pré-cultivadas durante duas semanas e, então, transformadas com a arma de partícula, cointroduzindo uma mistura de dois plasmídeos, o primeiro contendo um cassete de expressão consistindo no AT-UBI PRO conduzindo a expressão da sequência de cDNA para cada um dentre os ortólogos de WUS (pVER9662 (SEQ ID NO:118), UBIGMWUS (SEQ ID NO:119), UBIMTWUS (SEQ ID NO:120), UBILJWUS (SEQ ID NO:121), UBIPVWUS (SEQ ID NO:122) e UBIPYWUS (SEQ ID NO:123)) mais um cassete de expressão para ZS-YELLOW (QC318 (SEQ ID NO:117)). Os explantes foram cultivados por duas semanas.Em duas semanas, o número de embriões somáticos globulares fluorescentes foi contado e tabulado para cada tratamento.

[0258] Duas semanas após a transformação de arma de partícula, os embriões somáticos globulares fluorescentes foram raramente observados nas cotiledôneas de controle bombardeadas, enquanto para todos os outros tratamentos (contendo genes WUS de diferentes espécies dicotiledôneas conduzidos pelo promotor AT-UBI), inúmeros embriões somáticos fluorescentes foram observados em cotiledôneas bombardeadas.

EXEMPLO 11: ORTÓLOGOS DO GENE DE ARABIDOPSIS WUS FUNCIONAM EM

BRASSICA PARA ESTIMULAR A FORMAÇÃO DE EMBRIÃO SOMÁTICO

[0259] Vários tipos de explante, incluindo cotiledôneas imaturas, sementes divididas, eixos geométricos embrionários isolados, nódulos cotiledonários maduros, hipocótilo, epicótilo ou tecido de folha de Brassica são isolados para transformação com ortólogos no gene de Arabidopsis WUS. Os seguintes tratamentos são comparados.Para os tratamentos de transformação de arma de partícula, todos contém plasmídeo QC318 (SEQ ID NO:117) com GM-EF1A PRO::GM-EF1A INTRON1::ZS- YELLOW::NOS TERM + GM-SAMS PRO::GM-SAMS INTRON1::GM-ALS::GM- ALS TERM. Os tratamentos incluem 1) um controle sem genes adicionais, 2) pVER9662 (SEQ ID NO:118) com o AT-UBI PRO conduzindo a expressão do gene de Arabidopsis WUS, 3) UBIGMWUS (SEQ ID NO:119) com o AT-UBI PRO conduzindo a expressão do gene de Glycine max de WUS, 4) UBIMTWUS (SEQ ID NO:120) com o AT-UBI PRO conduzindo a expressão do gene de Medicago truncatula WUS, 5) UBILJWUS (SEQ ID NO:121) com o AT-UBI PRO conduzindo a expressão do gene de Lotus japonica WUS, 6) UBIPVWUS (SEQ ID NO:122) com o AT-UBI PRO conduzindo a expressão do gene de Phaseolus vulgaris WUS, e 7) UBIPYWUS

(SEQ ID NO:123) com o AT-UBI PRO conduzindo a expressão do gene de petúnia de WUS.

[0260] Vários tipos de explante, incluindo cotiledôneas imaturas, sementes divididas, eixos geométricos embrionários isolados, nódulos cotiledonários maduros, hipocótilo, epicótilo ou tecido de folha de Brassica são isolados para transformação com a arma de partícula, cointroduzindo uma mistura de dois plasmídeos, o primeiro contendo um cassete de expressão consistindo no AT-UBI PRO conduzindo a expressão da sequência de cDNA para cada um dentre os ortólogos de WUS (pVER9662 (SEQ ID NO:118), UBIGMWUS (SEQ ID NO:119), UBIMTWUS (SEQ ID NO:120), UBILJWUS (SEQ ID NO:121), UBIPVWUS (SEQ ID NO:122) e UBIPYWUS (SEQ ID NO:123)) mais um cassete de expressão para ZS-YELLOW (QC318 (SEQ ID NO:117)). Os explantes são cultivados por duas semanas.Em duas semanas, o número de embriões somáticos globulares fluorescentes é contado e tabulado para cada tratamento.

[0261] Duas semanas após a transformação de arma de partícula, os embriões somáticos globulares fluorescentes são raramente observados nos tipos de explante de controle bombardeados, incluindo cotiledôneas imaturas, sementes divididas, eixos geométricos embrionários isolados, nódulos cotiledonários maduros, hipocótilo, epicótilo ou tecido de folha de Brassica, enquanto para todos os outros tratamentos (contendo genes WUS de diferentes espécies dicotiledôneas conduzidas pelo promotor AT-UBI), inúmeros embriões somáticos fluorescentes são observados em tipos de explante bombardeados, incluindo cotiledôneas imaturas, sementes divididas, eixos geométricos embrionários isolados, nódulos cotiledonários maduros, hipocótilo, epicótilo ou tecido de folha de Brassica.

EXEMPLO 12: ORTÓLOGOS DO GENE DE ARABIDOPSIS WUS FUNCIONAM EM

GIRASSOL PARA ESTIMULAR A FORMAÇÃO DE EMBRIÃO SOMÁTICO

[0262] Vários tipos de explante, incluindo cotiledôneas imaturas, sementes divididas, eixos geométricos embrionários isolados, nódulos cotiledonários maduros, hipocótilo, epicótilo ou tecido de folha de girassol são isolados para transformação com ortólogos no gene de Arabidopsis WUS. Os seguintes tratamentos são comparados.Para os tratamentos de transformação de arma de partícula, todos contém plasmídeo QC318 (SEQ ID NO:117) com GM-EF1A PRO::GM-EF1A INTRON1::ZS- YELLOW::NOS TERM + GM-SAMS PRO::GM-SAMS INTRON1::GM-ALS::GM- ALS TERM. Os tratamentos incluem 1) um controle sem genes adicionais, 2) pVER9662 (SEQ ID NO:118) com o AT-UBI PRO conduzindo a expressão do gene de Arabidopsis WUS, 3) UBIGMWUS (SEQ ID NO:119) com o AT-UBI PRO conduzindo a expressão do gene de Glycine max de WUS, 4) UBIMTWUS (SEQ ID NO:120) com o AT-UBI PRO conduzindo a expressão do gene de Medicago truncatula WUS, 5) UBILJWUS (SEQ ID NO:121) com o AT-UBI PRO conduzindo a expressão do gene de Lotus japonica WUS, 6) UBIPVWUS (SEQ ID NO:122) com o AT-UBI PRO conduzindo a expressão do gene de Phaseolus vulgaris WUS, e 7) UBIPYWUS(SEQ ID NO:123) com o AT-UBI PRO conduzindo a expressão do gene de petúnia de WUS.

[0263] Vários tipos de explante, incluindo cotiledôneas imaturas, sementes divididas, eixos geométricos embrionários isolados, nódulos cotiledonários maduros, hipocótilo,

epicótilo ou tecido de folha de girassol são isolados para transformação com a arma de partícula, cointroduzindo uma mistura de dois plasmídeos, o primeiro contendo um cassete de expressão consistindo no AT-UBI PRO conduzindo a expressão da sequência de cDNA para cada um dentre os ortólogos de WUS (pVER9662 (SEQ ID NO:118), UBIGMWUS (SEQ ID NO:119), UBIMTWUS (SEQ ID NO:120), UBILJWUS (SEQ ID NO:121), UBIPVWUS (SEQ ID NO:122) e UBIPYWUS (SEQ ID NO:123)) mais um cassete de expressão para ZS-YELLOW (QC318 (SEQ ID NO:117)). Os explantes são cultivados por duas semanas.Em duas semanas, o número de embriões somáticos globulares fluorescentes é contado e tabulado para cada tratamento.

[0264] Duas semanas após a transformação de arma de partícula, os embriões somáticos globulares fluorescentes são raramente observados nos tipos de explante de controle bombardeados, incluindo cotiledôneas imaturas, sementes divididas, eixos geométricos embrionários isolados, nódulos cotiledonários maduros, hipocótilo, epicótilo ou tecido de folha de girassol, enquanto para todos os outros tratamentos (contendo genes WUS de diferentes espécies dicotiledôneas conduzidas pelo promotor AT-UBI), inúmeros embriões somáticos fluorescentes são observados em tipos de explante bombardeados, incluindo cotiledôneas imaturas, sementes divididas, eixos geométricos embrionários isolados, nódulos cotiledonários maduros, hipocótilo, epicótilo ou tecido de folha de girassol.

EXEMPLO 13: ORTÓLOGOS DO GENE DE ARABIDOPSIS WUS ESTIMULAM

CRESCIMENTO MORFOGÊNICO EM BRASSICA

[0265] Os genes WUS de 12 espécies dicotiledôneas, 2 gimnospermas e uma espécie monocotiledônea diferentes foram testados quanto à eficácia através da avaliação de sua capacidade para estimular o crescimento de respostas de broto verde transgênico em Brassica enquanto são submetidas à seleção em meio contendo espectinomicina.Para todos os tratamentos contendo um cassete de expressão de WUS, a configuração do T-DNA foi idêntica, com a exceção do gene de WUS usado no construto.Essa configuração de T-DNA foi - RB + CAMV35S PRO::WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ PRO::GM-UBQ 5UTR::GM- UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT- UBIQ10 5UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB com o gene de WUS variável em negrito e itálico

[0266] As sementes de Brassica napus foram esterilizadas na superfície em uma solução a 50% de Clorox e germinadas em meio sólido contendo sais basais de MS e vitaminas.Essas mudas foram cultivadas a 28 °C na luz por 10 a 14 dias, e os hipocótilos foram dissecados das cotiledôneas. Os explantes de hipocótilo foram transferidos para placas petri de 100 x 25 mm contendo 10 ml de meio 20A (Tabela 3) com 200 mM de acetosiringona e, então, fatiadas em seções de 3 a 5 mm de comprimento. Após o fatiamento, 40 µl de solução Agrobacterium (cepa de Agrobacterium LBA4404 THY- a uma Densidade Óptica de 0,50 a 550 nM) contendo os cassetes de expressão descritos acima foram adicionados às placas, e as placas de petri contendo a mistura de hipocótilo/Agrobacterium foram colocadas em uma plataforma de agitação e levemente agitadas por 10 minutos. Após 10 minutos de agitação suave, as placas foram movidas para luz fraca e 21 °C para 3 dias de cocultivo.

[0267] Após o cocultivo, os explantes de hipocótilo foram removidos da solução de Agrobacterium, e levemente manchados em papel de filtro estéril antes da colocação em meio de seleção de 70A (Tabela 3) (contendo 10 mg/l de espectinomicina) e movidos para o ambiente iluminado (26 °C e luz brilhante). Os explantes permaneceram no meio de seleção de 70A por duas semanas antes da transferência para segundo ciclo de seleção de 70A (alternativamente, explantes foram movidos para o meio 70B (Tabela 3) com 20 mg/l de espectinomicina para o segundo ciclo de seleção). Após dois ciclos de seleção, os explantes foram transferidos para meios de alongamento de broto de 70C (Tabela 3) por 2 a 3 semanas e colocados de volta no ambiente iluminado. Os brotos foram, então, transferidos para meios de enraizamento 90A (Tabela 3) antes de serem transferidos para o solo na estufa.

Tabela 3. Meios para Transformação de Canola Meio de infecção e cocultivo (20A); sais e vitaminas MS, 0,1 g/l de mio-inositol, 0,5 g/l de tampão de MES, 0,1 mg/l de a- NAA, 1 mg/l de BAP, 10 ug/l de ácido giberélico, 50 mg/l de timidina, pH 5,5.

Primeiro meio de seleção (70A); sais e vitaminas MS, 0,1 g/l de mio-inositol, 0,5 g/l de tampão de MES, 0,1 mg/l de a-NAA, 1 mg/l de BAP, 10 ug/l de ácido giberélico, 40 mg/l de hemissulfato de adenina, 20 g/l de sacarose, 0,5 g/l de PVP40, 2 mg/l de nitrato de prata, 0,5 g/l de carbenicilina, 5 mg/l de espectinomicina, 5 g/l de Ágar TC, pH 5,7.

O segundo meio de seleção (70B); sais e vitaminas MS, 0,1 g/l de mio-inositol, 0,5 g/l de tampão de MES, 0,1 mg/l de a-NAA, 1 mg/l de BAP, 10 ug/l de ácido giberélico, 40 mg/l de hemissulfato de adenina, 20 g/l de sacarose, 0,5 g/l de PVP40, 2 mg/l de nitrato de prata, 0,5 g/l de carbenicilina, 10 mg/l de espectinomicina, 5 g/l de Ágar TC, pH 5,7.

Meio de regeneração (70C); sais e vitaminas MS, 0,1 g/l de mio-inositol, 0,5 g/l de tampão de MES, 2,5 ug/l de BAP, 40 mg/l de hemissulfato de adenina, 20 g/l de sacarose, 0,5 g/l de PVP40, 0,5 g/l de carbenicilina, 10 mg/l de espectinomicina, 5 g/l de Ágar TC, pH 5,7.

Meio de enraizamento (90A); sais e vitaminas MS, 0,5 mg/l de IBA, pH 5,7.

[0268] Como mostrado na Tabela 4, os genes WUS de diferentes espécies estimularam respostas de crescimento de brotos verdes transgênicos em canola.Essa estimulação de desenvolvimento de broto e a capacidade para recuperar os brotos resistentes à espectinomicina foi variável, dependendo da fonte do gene de WUS.Para o pepino, essa estimulação de brotos transgênicos foi marginalmente acima dos níveis vistos nos tratamentos de controle negativo, mas variou para os genes WUS de outras espécies até 95% para Gnetum gnemon (uma gimnosperma), com uma resposta acima de 70% sendo observada para genes WUS de uva, zostera (uma monocotiledônea), Kalanchoe, petúnia, maçã, girassol, mandioca e Gnetum.

Tabela 4. Eficácia* de genes WUS de várias espécies no SEQ % de Número SEQ ID de ID NO Explan respo de NO de Espécie de Nome brot de tes sta Plasmí plasmí gênero comum os Gene totais de deo deo: verd WUS: WUS es

RV0210 Helianthus 153 78 Girassol 128 110 86% 90 annuus

RV0265 Gnetum 154 127 Gnetum 41 39 95% 22 gnemon

RV0265 Vitis 155 82 Uva 81 58 72% 26 vinifera

RV0265 Petunia 156 90 Petúnia 121 97 80% 34 hybrida

RV0265 Malus 157 129 Maçã 43 35 81% 31 domestica

RV0265 Manihot 158 131 Mandioca 38 34 89% 24 esculenta

Kalanchoe Vieiras RV0265 159 133 fedtschenk de 40 31 78% 23 oi lavanda

RV0265 Gossypium 160 135 Algodão 41 22 54% 30 hirsutum

RV0265 161 137 Zostera Zostera 40 30 75%

27 marina

RV0265 Amborella Amborell 162 139 44 20 45% 29 trichopoda a

RV0265 Aquilegia Columbin 163 141 40 21 53% 28 coerulea e

Populus RV0265 164 80 trichocarp Poplar 49 7 14% 20 a

Amaranthus RV0265 165 143 hypochondr Amaranto 41 6 15% 33 iacus

RV0265 Cucumis 166 145 Pepino 69 4 6% 21 sativus

RV0265 Pinus 167 147 Pinheiro 43 5 12% 25 taeda

RV0228 168 NA Nenhum No Wus 38 2 5% 14 sem NA NA Nenhum sem agro 124 2 2% agro

*Eficácia de genes WUS de várias espécies, como presumido pela porcentagem de explantes de partida de hipocótilo que produziu brotos fluorescentes verdes a partir dos explantes (em seleção de espectinomicina) em 28 dias após a infecção de Agrobacterium, em que os explantes de partida de hipocótilo foram transformados por um Agrobacterium com um T-DNA contendo um gene de WUS como descrito acima.

EXEMPLO 14. USO DE PROMOTORES DA FAMÍLIA DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO HD-ZIP IV CONTROLANDO A EXPRESSÃO DE UM ORTÓLOGO DE WUS DE

GIRASSOL ESTIMULA O CRESCIMENTO MORFOGÊNICO EM BRASSICA

[0269] Os promotores de Arabidopsis conduzindo a expressão de um ortólogo do Arabidopsis gene de WUS de girassol (Helianthus annuus) foram testados quanto à eficácia através da avaliação de sua capacidade para estimular o crescimento de respostas de broto verde transgênico em Brassica enquanto submetidos à seleção em meio contendo espectinomicina.Para todos os tratamentos, um T-DNA foi usado contendo três cassetes de expressão RB + HD-ZIP IV PRO::HA-WUS::OS-T28 TERM + GM-UBQ PRO::GM-UBQ 5UTR::GM-UBQ INTRON1::ZS-YELLOW1 N1::NOS TERM + AT-UBIQ10 PRO::AT-UBIQ10 5UTR::AT-UBIQ10 INTRON1::CTP::SPCN::UBQ14 TERM + LB, com o promotor variável HD-ZIP IV PRO em negrito e itálico.

[0270] Os promotores testados foram de Arabidopsis e incluíram Fator Protodérmico 1 (PDF1, SEQ ID NO: 149), Factor Protodérmico 2 (PDF2, SEQ ID NO: 150), Glabrous2 (HDG2, SEQ ID NO: 151), Camada 1 de Meristema (ML1, SEQ ID NO: 125), Eceriferum6 (CER6, SEQ ID NO: 126) e Anthocyanless (ANL1, SEQ ID NO: 152). A configuração de T-DNA para os plasmídeos contendo esses promotores é mostrada na Tabela 1 em RV027343, RV027344, RV027340, RV027342, RV027338 e RV027337, respectivamente, que correspondem às SEQ ID NOS: 175, 169, 173, 174, 172 e 171, respectivamente. Esses promotores foram comparados a CaMV35S PRO (para informações de T-DNA, consultar

RV021090, SEQ ID NO: 153) como um controle positivo, e um T- DNA sem cassete de expressão de WUS como um controle negativo (para informações de T-DNA, consultar RV026532, SEQ ID NO: 170).

[0271] A esterilização de superfície de semente de Brassica, germinação para produzir mudas, preparação dos explantes de hipocótilo, transformação com cepa de Agrobacterium LBA4404 THY-, cultura de tecido e seleção usando espectinomicina foram todos realizados como descrito no Exemplo 13.

[0272] Os resultados são apresentados em uma escala de 0 a 10, com zero (0) sendo sem resposta além daquela do controle negativo e dez (10) correspondendo à estimulação de resposta morfogênica forte observada com o CaMV35S PRO. Para os vários promotores testados, a resposta observada com o PDF1 PRO foi 5, para o PDF2 PRO, a resposta foi 2,3, para o HDG2 PRO, a resposta foi 2,2, para o ML1, a resposta foi 2, para o CER6 PRO, a resposta foi 2 e para o ANL1 PRO, a resposta foi 2. O promotor CaMV35S é um promotor constitutivo forte que pode ser indesejável ao conduzir a expressão de WUS; embora a expressão inicial forte seja benéfica imediatamente após a integração do T-DNA (para estimular rapidamente a formação de broto), a expressão forte na planta inteira resulta em anomalias morfológicas e esterilidade. Os promotores HD-ZIP IV testados foram expressos na camada (epidérmica) L1 de embriões e meristemas em desenvolvimento, e não são, de outro modo, expressos na planta inteira. Assim, uma estimulação de crescimento positivo de formação de broto após a entrega de T- DNA com regulação de modo decrescente da expressão de WUS visto que o desenvolvimento das porções vegetativa e reprodutiva da planta foi o resultado desejado e foi alcançado.Essa estimulação de crescimento rápido de formação de broto foi demonstrada para todos os promotores de HD-ZIP IV testados.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que compreende um cassete de gene morfogênico que compreende um promotor preferencial de tecido que tem uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em: (a) pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; (b) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; (c) uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% de identidade com pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; (d) um fragmento ou uma variante da sequência de nucleotídeos de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que o fragmento ou variante da sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; ou (e) pelo menos 100 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que os pelo menos 100 nucleotídeos contíguos da sequência de nucleotídeos iniciam a transcrição em uma célula vegetal; em que o promotor preferencial de tecido de (a) a (e) é operacionalmente ligado a um gene morfogênico.

2. Cassete de expressão caracterizado pelo fato de que compreende o cassete de gene morfogênico, conforme definido na reivindicação 1.

3. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 2.

4. Célula vegetal caracterizada pelo fato de que compreende o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 2.

5. Célula vegetal, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a célula vegetal é de uma monocotiledônea, uma dicotiledônea ou uma gimnosperma.

6. Célula vegetal, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a monocotiledônea, a dicotiledônea ou a gimnosperma é selecionada dentre o grupo que consiste em milho, alfafa, sorgo, arroz, milhete, soja, trigo, algodão, girassol, cevada, aveia, centeio, linho, cana de açúcar, banana, mandioca, feijão comum, feijão-frade, tomate, batata, beterraba, uva, eucalipto, choupo, pinho, douglásia, cítricos, mamão, cacau, pepino, maçã, Capsicum, bambu, triticale, melão ou Brassica.

7. Célula vegetal, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o gene morfogênico codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX, em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, ou 148; ou em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado por uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, ou 147.

8. Célula vegetal, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o gene morfogênico codifica um produto genético envolvido no metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgãos, desenvolvimento de células-tronco,

estimulação do crescimento celular, organogênese, regeneração, iniciação de embriogênese somática, maturação acelerada do embrião somático, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema apical, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema de broto, iniciação e/ou desenvolvimento de brotos, ou uma combinação dos mesmos.

9. Célula vegetal, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o cassete de expressão compreende adicionalmente um cassete de gene de traço que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica um produto genético que confere reforço nutricional, rendimento aumentado, tolerância ao estresse abiótico, tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a pragas, resistência a patógenos, resistência a insetos, eficiência de uso de nitrogênio (NUE), resistência a doenças ou uma capacidade para alterar uma via metabólica.

10. Célula vegetal, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o cassete de expressão compreende adicionalmente um cassete de recombinase sítio-especifica que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase sítio-específica selecionada dentre o grupo que consiste em FLP, FLPe, KD, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, B2, B3, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907- 1 ou U153, em que a recombinase sítio-específica é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor específico de tecido ou um promotor regulado por desenvolvimento.

11. Célula vegetal, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o promotor constitutivo, o promotor induzível, o promotor específico de tecido ou o promotor regulado por desenvolvimento é selecionado dentre o grupo que consiste em UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2

PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S, ZM- ADF PRO (ALT2), AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A, AT-HSP811, AT-HSP811L, GM-HSP173B, promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona, PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A ou LEA-D34.

12. Célula vegetal, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o cassete de gene morfogênico e o cassete de recombinase sítio-especifica do cassete de expressão são expressos de maneira transitória na célula vegetal e o cassete de gene de traço do cassete de expressão é incorporado de maneira estável no genoma da célula vegetal.

13. Célula vegetal, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o cassete de gene morfogênico e o cassete de recombinase sítio-especifica do cassete de expressão são excisados da célula vegetal e o cassete de gene de traço do cassete de expressão é incorporado de maneira estável no genoma da célula vegetal.

14. Planta caracterizada pelo fato de que compreende o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 2.

15. Planta, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a planta é uma monocotiledônea, uma dicotiledônea ou uma gimnosperma.

16. Planta, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a monocotiledônea, a dicotiledônea ou a gimnosperma é selecionada dentre o grupo que consiste em milho, alfafa, sorgo, arroz, milhete, soja, trigo, algodão, girassol, cevada, aveia, centeio, linho, cana de açúcar, banana, mandioca, feijão comum, feijão-frade, tomate, batata, beterraba, uva, eucalipto, choupo, pinho, douglásia, cítricos, mamão, cacau, pepino, maçã, Capsicum, bambu, triticale, melão ou Brassica.

17. Planta, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o gene morfogênico codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX, em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, ou 148; ou em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado por uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, ou 147.

18. Planta, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o gene morfogênico codifica um produto genético envolvido no metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgãos, desenvolvimento de células-tronco, estimulação do crescimento celular, organogênese, regeneração, embriogênese somática, maturação acelerada do embrião somático, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema apical, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema de broto, iniciação e/ou desenvolvimento de brotos, ou uma combinação dos mesmos.

19. Planta, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o cassete de expressão compreende adicionalmente um cassete de gene de traço que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica um produto genético que confere reforço nutricional, rendimento aumentado, tolerância ao estresse abiótico, tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a pragas, resistência a patógenos, resistência a insetos, eficiência de uso de nitrogênio (NUE), resistência a doenças ou uma capacidade para alterar uma via metabólica.

20. Planta, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o cassete de expressão compreende adicionalmente um cassete de recombinase sítio-especifica que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase sítio-específica selecionada dentre o grupo que consiste em FLP, FLPe, KD, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, B2, B3, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907- 1 ou U153, em que a recombinase sítio-específica é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor específico de tecido ou um promotor regulado por desenvolvimento.

21. Planta, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o promotor constitutivo, o promotor induzível, o promotor específico de tecido ou o promotor regulado por desenvolvimento é selecionado dentre o grupo que consiste em UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S, ZM- ADF PRO (ALT2), AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A, AT-HSP811, AT-HSP811L, GM-HSP173B, promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona, PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A ou LEA-D34.

22. Planta, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o cassete de gene morfogênico e o cassete de recombinase sítio-especifica do cassete de expressão são expressos de maneira transitória na planta e o cassete de gene de traço do cassete de expressão é incorporado de maneira estável no genoma da planta.

23. Semente da planta conforme definida na reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão.

24. Planta, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o cassete de gene morfogênico e o cassete de recombinase sítio-especifica do cassete de expressão são excisados da planta e o cassete de gene de traço do cassete de expressão é incorporado de maneira estável no genoma da planta.

25. Semente da planta conforme definida na reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão.

26. Cassete de expressão caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeos com capacidade para iniciar a transcrição em uma planta ou uma célula vegetal, em que a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 100 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos com capacidade para iniciar a transcrição é operacionalmente ligada a um gene morfogênico.

27. Cassete de expressão caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende um fragmento ou variante funcional com capacidade para iniciar a transcrição em uma planta ou uma célula vegetal, em que o fragmento ou variante funcional é derivada de uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que o fragmento ou variante funcional com capacidade para iniciar a transcrição é operacionalmente ligada a um gene morfogênico.

28. Cassete de expressão caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeos com capacidade para iniciar a transcrição em uma planta ou uma célula vegetal, em que a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 70% de identidade com uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos com capacidade para iniciar a transcrição é operacionalmente ligada a um gene morfogênico.

29. Cassete de expressão caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeos com capacidade para iniciar a transcrição em uma planta ou uma célula vegetal, em que a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 95% de identidade com uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos com capacidade para iniciar a transcrição é operacionalmente ligada a um gene morfogênico.

30. Cassete de expressão caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeos com capacidade para iniciar a transcrição em uma planta ou uma célula vegetal, em que a sequência de nucleotídeos é selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos com capacidade para iniciar a transcrição é operacionalmente ligada a um gene morfogênico.

31. Método para produzir uma planta transgênica caracterizado pelo fato de que compreende: transformar uma célula vegetal com um cassete de expressão recombinante que compreende (a) um cassete de promotor preferencial de tecido, em que o cassete de promotor preferencial de tecido compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em: (i) pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; (ii) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a

110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; (iii) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; (iv) uma sequência de nucleotídeos que é um fragmento ou uma variante de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; ou (v) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos um fragmento de 100 pb de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal, em que a sequência de nucleotídeos de (i) a (v) é operacionalmente ligada a um gene morfogênico e (b) um cassete de gene de traço que compreende um polinucleotídeo heterólogo de interesse que codifica um produto genético que confere reforço nutricional, rendimento aumentado, tolerância ao estresse abiótico, tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a pragas, resistência a patógenos, resistência a insetos, eficiência de uso de nitrogênio (NUE), resistência a doenças ou uma capacidade para alterar uma via metabólica; selecionar uma célula vegetal transgênica que tem o cassete de expressão recombinante; e regenerar a planta transgênica a partir da célula vegetal transgênica.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal é uma monocotiledônea, uma dicotiledônea ou gimnosperma.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a monocotiledônea, a dicotiledônea ou a gimnosperma é selecionada dentre o grupo que consiste em milho, alfafa, sorgo, arroz, milhete, soja, trigo, algodão, girassol, cevada, aveia, centeio, linho, cana de açúcar, banana, mandioca, feijão comum, feijão-frade, tomate, batata, beterraba, uva, eucalipto, choupo, pinho, douglásia, cítricos, mamão, cacau, pepino, maçã, Capsicum, bambu, triticale, melão ou Brassica.

34. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o gene morfogênico codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX, em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, ou 148; ou em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado por uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, ou 147.

35. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o gene morfogênico codifica um produto genético envolvido no metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgãos, desenvolvimento de células-tronco, estimulação do crescimento celular, organogênese, regeneração, embriogênese somática, maturação acelerada do embrião somático, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema apical, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema de broto, iniciação e/ou desenvolvimento de brotos, ou uma combinação.

36. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão compreende adicionalmente um cassete de recombinase sítio-especifica que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase sítio-específica selecionada dentre o grupo que consiste em FLP, FLPe, KD, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int,

HK022, R, B2, B3, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907- 1 ou U153, em que a recombinase sítio-específica é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor específico de tecido ou um promotor regulado por desenvolvimento.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o promotor constitutivo, o promotor induzível, o promotor específico de tecido ou o promotor regulado por desenvolvimento é selecionado dentre o grupo que consiste em UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S, ZM- ADF PRO (ALT2), AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A, AT-HSP811, AT-HSP811L, GM-HSP173B, promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona, PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A ou LEA-D34.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente excisar o cassete de promotor preferencial de tecido e o cassete de recombinase sítio-especifica do cassete de expressão recombinante.

39. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, conforme definido na reivindicação 38.

40. Semente da planta transgênica conforme definida na reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante.

41. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o cassete de promotor preferencial de tecido compreende um primeiro T-DNA e o cassete de gene de traço compreende um segundo T-DNA.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o primeiro T-DNA e o segundo T-

DNA residem na mesma cepa bacteriana para transformar a célula vegetal.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente segregar o primeiro T-DNA para longe do segundo T-DNA.

44. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, conforme definido na reivindicação 43.

45. Semente da planta transgênica conforme definida na reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante.

46. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o primeiro T-DNA reside em uma primeira cepa bacteriana e o segundo T-DNA reside em uma segunda cepa bacteriana e a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana são misturadas em uma razão para transformar a célula vegetal.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente segregar o primeiro T-DNA para longe do segundo T-DNA.

48. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, conforme definido na reivindicação 47.

49. Semente da planta transgênica conforme definida na reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante.

50. Método para aprimorar a eficiência de maturação de embrião somático caracterizado pelo fato de que compreende: transformar uma célula vegetal com um cassete de expressão recombinante que compreende (a) um cassete de promotor preferencial de tecido, em que o cassete de promotor preferencial de tecido compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em:

(i) pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; (ii) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; (iii) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; (iv) uma sequência de nucleotídeos que é um fragmento ou uma variante de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; (v) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos um fragmento de 100 pb de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal, em que a sequência de nucleotídeos de (a) a (e) é operacionalmente ligada a um gene morfogênico e (b) um cassete de gene de traço que compreende um polinucleotídeo heterólogo de interesse que codifica um produto genético que confere reforço nutricional, rendimento aumentado, tolerância ao estresse abiótico, tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a pragas, resistência a patógenos, resistência a insetos, eficiência de uso de nitrogênio (NUE), resistência a doenças ou uma capacidade para alterar uma via metabólica; selecionar uma célula vegetal transgênica que tem o cassete de expressão recombinante; e regenerar a planta transgênica a partir da célula vegetal transgênica, em que o cassete de expressão recombinante resulta em eficiência de maturação de embrião somático aprimorada quando comparado a uma célula vegetal transgênica que não compreende o cassete de expressão recombinante.

51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal é uma monocotiledônea, uma dicotiledônea ou uma gimnosperma.

52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a monocotiledônea, a dicotiledônea ou a gimnosperma é selecionada dentre o grupo que consiste em milho, alfafa, sorgo, arroz, milhete, soja, trigo, algodão, girassol, cevada, aveia, centeio, linho, cana de açúcar, banana, mandioca, feijão comum, feijão-frade, tomate, batata, beterraba, uva, eucalipto, choupo, pinho, douglásia, cítricos, mamão, cacau, pepino, maçã, Capsicum, bambu, triticale, melão ou Brassica.

53. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o gene morfogênico codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX, em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, ou 148; ou em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado por uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, ou 147.

54. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o gene morfogênico codifica um produto genético envolvido no metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgãos, desenvolvimento de células-tronco, estimulação do crescimento celular, organogênese, regeneração, embriogênese somática, maturação acelerada do embrião somático, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema apical, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema de broto, iniciação e/ou desenvolvimento de brotos, ou uma combinação.

55. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão compreende adicionalmente um cassete de recombinase sítio-especifica que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase sítio-específica selecionada dentre o grupo que consiste em FLP, FLPe, KD, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, B2, B3, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907- 1 ou U153, em que a recombinase sítio-específica é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor específico de tecido ou um promotor regulado por desenvolvimento.

56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o promotor constitutivo, o promotor induzível, o promotor específico de tecido ou o promotor regulado por desenvolvimento é selecionado dentre o grupo que consiste em UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S, ZM- ADF PRO (ALT2), AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A, AT-HSP811, AT-HSP811L, GM-HSP173B, promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona, PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A ou LEA-D34.

57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente excisar o cassete de promotor preferencial de tecido e o cassete de recombinase sítio-especifica do cassete de expressão recombinante.

58. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, conforme definido na reivindicação 57.

59. Semente da planta transgênica conforme definida na reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante.

60. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o cassete de promotor preferencial de tecido compreende um primeiro T-DNA e o cassete de gene de traço compreende um segundo T-DNA.

61. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o primeiro T-DNA e o segundo T- DNA residem na mesma cepa bacteriana para transformar a célula vegetal.

62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente segregar o primeiro T-DNA para longe do segundo T-DNA.

63. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, conforme definido na reivindicação 62.

64. Semente da planta transgênica conforme definida na reivindicação 63, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante.

65. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o primeiro T-DNA reside em uma primeira cepa bacteriana e o segundo T-DNA reside em uma segunda cepa bacteriana e a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana são misturadas em uma razão para transformar a célula vegetal.

66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente segregar o primeiro T-DNA para longe do segundo T-DNA.

67. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, conforme definido na reivindicação 66.

68. Semente da planta transgênica conforme definida na reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante.

69. Método para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica caracterizado pelo fato de que compreende: transformar uma célula vegetal dicotiledônea ou uma célula vegetal gimnosperma com um cassete de expressão recombinante que compreende (a) um cassete de promotor preferencial de tecido, em que o cassete de promotor preferencial de tecido compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em: (i) pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; (ii) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; (iii) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal; (iv) um fragmento ou uma variante de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que o fragmento ou variante inicia a transcrição na célula vegetal; (v) pelo menos um fragmento de 100 pb de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, em que o pelo menos um fragmento de 100 pb da sequência de nucleotídeos inicia a transcrição na célula vegetal, em que a sequência de nucleotídeos de (i) a (v) que inicia a transcrição na célula vegetal é operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX e (b)

um cassete de gene de traço que compreende polinucleotídeo heterólogo de interesse que codifica um produto genético que confere reforço nutricional, rendimento aumentado, tolerância ao estresse abiótico, tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a pragas, resistência a patógenos, resistência a insetos, eficiência de uso de nitrogênio (NUE), resistência a doenças ou uma capacidade para alterar uma via metabólica; permitir a expressão do cassete de expressão recombinante em cada célula vegetal transformada para formar um embrião somático ou um broto; e germinar o embrião somático ou cultivar o broto para formar a planta dicotiledônea transgênica ou a planta gimnosperma transgênica, em que a planta dicotiledônea transgênica ou a planta gimnosperma transgênica compreende o polinucleotídeo heterólogo de interesse.

70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o embrião somático ou o broto é formado dentro de cerca de 21 a cerca de 28 dias após a iniciação da transformação da célula dicotiledônea ou da célula gimnosperma.

71. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal gimnosperma é selecionada dentre o grupo que consiste em pinho e douglásia.

72. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal dicotiledônea é selecionada dentre o grupo que consiste em alfafa, soja, algodão, girassol, linho, mandioca, feijão comum, feijão-frade, tomate, batata, beterraba, uva, eucalipto, choupo, cítricos, mamão, cacau, pepino, maçã, Capsicum, melão ou Brassica.

73. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre

SEQ ID NOS: 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, ou 148; ou em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado por uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, ou 147.

74. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX codifica um produto genético envolvido no metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgãos, desenvolvimento de células-tronco, estimulação do crescimento celular, organogênese, regeneração, embriogênese somática, maturação acelerada do embrião somático, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema apical, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema de broto, iniciação e/ou desenvolvimento de brotos, ou uma combinação.

75. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão compreende adicionalmente um cassete de recombinase sítio-especifica que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase sítio-específica selecionada dentre o grupo que consiste em FLP, FLPe, KD, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, B2, B3, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907- 1 ou U153, em que a recombinase sítio-específica é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor específico de tecido ou um promotor regulado por desenvolvimento.

76. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracterizada pelo fato de que o promotor constitutivo, o promotor induzível, o promotor específico de tecido ou o promotor regulado por desenvolvimento é selecionado dentre o grupo que consiste em UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S, ZM- ADF PRO (ALT2), AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A, AT-HSP811, AT-HSP811L, GM-HSP173B, promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona, PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A ou LEA-D34.

77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente excisar o cassete de promotor preferencial de tecido e o cassete de recombinase sítio-especifica do cassete de expressão recombinante.

78. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, conforme definido na reivindicação 77.

79. Semente da planta transgênica conforme definida na reivindicação 78, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante.

80. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o cassete de promotor preferencial de tecido compreende um primeiro T-DNA e o cassete de gene de traço compreende um segundo T-DNA.

81. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que o primeiro T-DNA e o segundo T- DNA residem na mesma cepa bacteriana para transformar a célula vegetal.

82. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente segregar o primeiro T-DNA para longe do segundo T-DNA.

83. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, conforme definido na reivindicação 82.

84. Semente da planta transgênica conforme definida na reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante.

85. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que o primeiro T-DNA reside em uma primeira cepa bacteriana e o segundo T-DNA reside em uma segunda cepa bacteriana e a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana são misturadas em uma razão para transformar a célula vegetal.

86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente segregar o primeiro T-DNA para longe do segundo T-DNA.

87. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, conforme definido na reivindicação 86.

88. Semente da planta transgênica conforme definida na reivindicação 86, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante.

89. Método para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar uma célula de um explante de dicotiledônea ou um explante de gimnosperma com um cassete de expressão recombinante que compreende um cassete de gene de traço que compreende um gene heterólogo de interesse e um cassete de gene morfogênico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; (b) permitir a expressão do cassete de expressão recombinante de (a) em cada célula transformada para formar um embrião somático ou um broto; e (c) germinar o embrião somático ou cultivar o broto para formar a planta dicotiledônea transgênica ou a planta gimnosperma transgênica.

90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o embrião somático ou o broto é formado dentro de cerca de 21 a cerca de 28 dias após a iniciação da transformação da célula.

91. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que a dicotiledônea ou a gimnosperma é selecionada dentre o grupo que consiste em alfafa, soja, algodão, girassol, linho, mandioca, feijão comum, feijão-frade, tomate, batata, beterraba, uva, eucalipto, choupo, pinho, douglásia, cítricos, mamão, cacau, pepino, maçã, Capsicum, melão ou Brassica.

92. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, ou 148; ou em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado por uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, ou 147.

93. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX está envolvido no metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgãos, desenvolvimento de células-tronco, estimulação do crescimento celular, organogênese, regeneração, embriogênese somática, maturação acelerada do embrião somático, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema apical, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema de broto, iniciação e/ou desenvolvimento de brotos, ou uma combinação.

94. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligado a um promotor selecionado dentre o grupo que consiste em um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor específico de tecido ou um promotor regulado por desenvolvimento.

95. Método, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o promotor constitutivo, o promotor induzível, o promotor específico de tecido ou o promotor regulado por desenvolvimento é selecionado dentre o grupo que consiste em UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S, ZM- ADF PRO (ALT2), AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A, AT-HSP811, AT-HSP811L, GM-HSP173B, promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona, PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A, LEA-D34, pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, um fragmento ou uma variante de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189, ou pelo menos um fragmento de 100 pb de pelo menos uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 59, 108 a 110, 124 a 126, 149 a 152 e 189.

96. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o gene heterólogo de interesse codifica um produto genético que confere reforço nutricional, rendimento aumentado, tolerância ao estresse abiótico, tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a pragas, resistência a patógenos, resistência a insetos, eficiência de uso de nitrogênio (NUE), resistência a doenças ou uma capacidade para alterar uma via metabólica.

97. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão recombinante compreende adicionalmente um cassete de recombinase sítio-especifica que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase sítio-específica selecionada dentre o grupo que consiste em FLP, FLPe, KD, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, B2, B3, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153, em que a recombinase sítio-específica é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor específico de tecido ou um promotor regulado por desenvolvimento.

98. Método, de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo fato de que o promotor constitutivo, o promotor induzível, o promotor específico de tecido ou o promotor regulado por desenvolvimento é selecionado dentre o grupo que consiste em UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S, ZM- ADF PRO (ALT2), AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A, AT-HSP811, AT-HSP811L, GM-HSP173B, promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona, PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A ou LEA-D34.

99. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente excisar o cassete de gene morfogênico e o cassete de recombinase sítio- especifica do cassete de expressão recombinante.

100. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, conforme definido na reivindicação 99.

101. Semente da planta transgênica conforme definida na reivindicação 100, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante.

102. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o cassete de gene morfogênico compreende um primeiro T-DNA e o cassete de gene de traço compreende um segundo T-DNA.

103. Método, de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que o primeiro T-DNA e o segundo T- DNA residem na mesma cepa bacteriana para transformar a célula vegetal dicotiledônea.

104. Método, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente segregar o primeiro T-DNA para longe do segundo T-DNA.

105. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, conforme definido na reivindicação 104.

106. Semente da planta transgênica conforme definida na reivindicação 105, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante.

107. Método, de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que o primeiro T-DNA reside em uma primeira cepa bacteriana e o segundo T-DNA reside em uma segunda cepa bacteriana e a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana são misturadas em uma razão para transformar a célula vegetal.

108. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente segregar o primeiro T-DNA para longe do segundo T-DNA.

109. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, conforme definido na reivindicação 108.

110. Semente da planta transgênica conforme definida na reivindicação 109, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o cassete de gene de traço do cassete de expressão recombinante.

111. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que a germinação compreende transferir o embrião somático ou broto para um meio de maturação ou meio de germinação e formar a planta transgênica.