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Technisches Gebiet
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Die
Erfindung betrifft regulatorische Elemente aus Pflanzen, die zur
Expression verschiedener Nukleinsäuremoleküle in transgenen Pflanzen verwendet
können.
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Hintergrund der Erfindung
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Ein
wesentliches Merkmal für
gentechnische Veränderungen
von Pflanzen ist die Fähigkeit,
Gene in verschiedenen pflanzlichen Geweben zu exprimieren. Promotorelemente
enthalten spezifische Sequenzen, die die Bindung von Proteinen steuern,
die für
die Bildung eines Transkriptionskomplexes notwendig sind, und es
folglich erlauben, dass die Transkription beginnt. Konstitutive
Promotoren wie z. B. die 35S- und 19S-Promotoren aus dem Blumenkohlmosaikvirus
(CaMV; cauliflower mosaic virus) wie auch von Agrobacterium abgeleitete
Promotoren wie z. B. die Promotoren der Nopalinsynthase und der
Octopinsynthase werden oft zum Exprimieren von Genen transformierter
Pflanzen verwendet.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
Erfindung basiert auf der Identifikation regulatorischer Elemente
von Fettsäuredesaturasegenen aus
Pflanzen, die es erlauben, jedes beliebige heterologe Nukleinsäuremolekül in Pflanzenzellen
und Pflanzen zu exprimieren. Folglich können Pflanzen hergestellt werden,
die einen erhöhten
Nährwert,
eine modifizierte Fettsäurezusammensetzung
oder einen modifizierten Gehalt an Kohlenhydraten, Protein oder
Sekundärmetaboliten
haben. Zusätzlich
können
die regulatorischen Elemente verwendet werden, um neue pharmazeutische Erzeugnisse
in Pflanzen herzustellen.
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In
einem Aspekt offenbart die Anmeldung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein
regulatorisches Element eines Fettsäuredesaturasegens einschließt, wobei
das regulatorische Element 5' von
dem Fettsäuredesaturasegen
in einem natürlich
vorkommenden Genom lokalisiert ist. Das Fettsäuredesaturasegen kann z. B.
ein fad2D-Gen von Brassica oder ein fad2F-Gen von Brassica sein.
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Die
Erfindung bietet auch ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz
von SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 5, der Nukleotide 5113 bis 5796 von
SEQ ID NR: 4 oder der Nukleotide 3197 bis 3867 von SEQ ID NR: 5
sowie die komplementären
Sequenzen solcher Nukleinsäuremoleküle. Das
Nukleinsäuremolekül kann auch mindestens
600 Nukleotide (z. B. 600 oder 800 Nukleotide) lang sein und mindestens
80% Sequenzidentitiät (z.
B. 80%, 90% oder 95%) mit solchen Nukleinsäuremolekülen aufweisen. In einigen Ausführungsformen schließt das isolierte
Nukleinsäuremolekül die Nukleotide
5113 bis 5796 von SEQ ID NR: 4 oder die Nukleotide 3197 bis 3867
von SEQ ID NR: 5 ein.
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Die
Erfindung bietet auch ein Nukleinsäurekonstrukt. Das Konstrukt
schließt
ein erstes Nukleinsäuremolekül ein, das
funktionsfähig
mit einem zweiten Nukleinsäuremolekül verbunden
ist, das hinsichtlich des ersten Nukleinsäuremoleküls heterolog ist. Das erste
Nukleinsäuremolekül schließt ein regulatorisches
Element eines Fettsäuredesaturasegens
ein, wobei das regulatorische Element 5' von dem Fettsäuredesaturasegen in einem natürlich vorkommenden
Genom gelegen ist. Das erste Nukleinsäuremolekül fördert die Expression des heterologen
zweiten Nukleinsäuremoleküls, welches
z. B. ein Ribozym oder ein Polypeptid, wie z. B. ein Polypeptid,
das eine Herbizidresistenz verleiht, kodieren kann.
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Das
Nukleinsäurekonstrukt
kann weiterhin ein drittes Nukleinsäuremolekül einschließen, das funktionsfähig mit
dem 3'-Ende des
zweiten Nukleinsäuremoleküls verbunden
ist. Das dritte Nukleinsäuremolekül schließt eine
3'-untranslatierte
Region des Fettsäuredesaturasegens
ein, wobei die 3'-untranslatierte
Region in dem natürlich
vorkommenden Genom 3' von
dem Fettsäuredesaturasegen
lokalisiert ist. Das dritte Nukleinsäuremolekül kann ein Nukleinsäuremolekül einschließen, das
die Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, der Nukleotide 1-894 von SEQ ID
NR: 6 oder der Nukleotide 1-814 von SEQ ID NR: 7 wie auch die komplementären Sequenzen
dieser Moleküle
besitzt. Das Molekül
kann mindestens 100 Nukleotide lang sein und mindestens 70% Sequenzidentität mit einem
Nukleinsäuremolekül der Nukleotide
1-894 von SEQ ID NR: 6 oder der Nukleotide 1-814 von SEQ ID NR:
7 besitzen.
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Das
Nukleinsäurekonstrukt
kann weiterhin ein viertes Nukleinsäuremolekül einschließen, das funktionsfähig mit
den ersten und zweiten Nukleinsäuremolekülen verbunden
ist, wobei das vierte Nukleinsäuremolekül ein Transitpeptid
oder ein Intron ist.
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In
einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäurekonstrukt,
das ein erstes Nukleinsäuremolekül einschließt, das
funktionsfähig
mit einem zweiten Nukleinsäuremolekül verbunden
ist, das hinsichtlich des ersten Nukleinsäuremoleküls heterolog ist. Das erste
Nukleinsäuremolekül umfasst
eine 3'-untranslatierte
Region eines Fettsäuredesaturasegens,
wobei die 3'-untranslatierte
Region in einem natürlich vorkommenden
Genom 3' von dem
Fettsäuredesaturasegen
lokalisiert ist. Die Erfindung bietet auch transformierte Pflanzenzellen
und transgene Pflanzen. Die transformierten Pflanzenzellen und transformierten
Pflanzen schließen
ein Nukleinsäurekonstrukt
ein. Das Nukleinsäurekonstrukt
schließt
ein regulatorisches Element eines Fettsäuredesaturasegens ein, das
funktionsfähig
mit einem heterologen Nukleinsäuremolekül verbunden
ist, wobei das regulatorische Element die Expression der heterologen
Nukleinsäure
fördert,
und wobei das regulatorische Element in einem natürlich vorkommenden
Genom 5' von dem
Fettsäuredesaturasegen
lokalisiert ist. Die transformierte Zelle kann eine Dikotyledone
(z. B. Alfalfa, Sojabohne, Raps oder Sonnenblume) oder eine Monokotyledone
(z. B. Mais, Weizen, Roggen, Reis oder Hirse) sein. Die Samen der
transgenen Pflanzen werden auch dargeboten.
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Soweit
nicht anders definiert, besitzen alle technischen und wissenschaftlichen
Begriffe, die hierin verwendet werden, die Bedeutung, in der sie
im Allgemeinen vom Fachmann auf dem technischen Gebiet, zu dem die
Erfindung gehört,
verstanden werden. Geeignete Verfahren und Materialien sind nachfolgend
beschrieben, wenngleich auch Verfahren und Materialien, die den
hierin beschriebenen ähnlich
oder mit ihnen äquivalent sind,
verwendet werden können,
um die Erfindung auszuführen.
Außerdem
dienen die Materialien, Verfahren und Beispiele nur der Veranschaulichung
und sind nicht als beschränkend
beabsichtigt.
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Andere
Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen
Beschreibung und aus den Ansprüchen
offensichtlich werden.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
ein Schema des Plasmids pMB103, das das genomische DNA-Fragment
1-3A1A SalI aus Brassica
napus ,Bridger' enthält, das
in die SalI-Schnittstelle von pSP72 subkloniert wurde, wobei die
Positionen des fad2D-Promotors, des fad2D-Introns und der 3'-untranslatierten
Region (UTR; untranslated region) von fad2D in Bezug zu der kodierenden
Sequenz von fad2D angegeben sind.
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2 ist
ein Schema des Plasmids pMB102, das das genomische DNA-Fragment
1-2A1A SalI aus B. napus ,Bridger' enthält, welches in die SalI-Schnittstelle
von pSP72 subkloniert wurde, wobei die Positionen des fd2F-Promotors,
des fad2F-Introns und der 3'-untranslatierten
Region (UTR; untranslated region) von fad2F in Bezug zu der kodierenden
Sequenz von fad2F angegeben isind.
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3 ist die Nukleinsäuresequenz des fad2D-Promotors
von B. napus.
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4 ist die Nukleinsäuresequenz des fad2F-Promotors
von B. napus.
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5 ist
die Nukleinsäuresequenz
der 3'-untranslatierten
Region von fad2D aus B. napus.
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6 ist
die Nukleinsäuresequenz
der 3'-untranslatierten
Region von fad2F aus B. napus.
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Ausführliche Beschreibung
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Regulatorische Elemente
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Die
Erfindung bietet ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein regulatorisches
Element eines Gens, das eine Fettsäuredesaturase (FAD; fatty acid
desaturase) kodiert, einschließt.
In einem natürlich
vorkommenden Genom ist das regulatorische Element 5' von einem Fettsäuredesaturase-(fad;
fatty acid desaturase)-gen wie z. B. einem fad1-, fad2- oder fad3-Gen,
einschließlich
Introns solcher fad-Gene, lokalisiert. Zum Beispiel kann das regulatorische
Element stromaufwärts
der fad2D-, fad2F- oder fad2U-Gene von Brassica sein. Wie hierin
verwendet, bezieht sich „5' eines fad-Gens" auf Sequenzen innerhalb
von 7000 Basenpaaren (bp; base pairs) einer fad kodierenden Region.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „isoliert" auf eine Nukleotidsequenz, die dem
regulatorischen Element eines Fettsäuredesaturasegen entspricht,
aber frei von Sequenzen ist, die normalerweise eine oder beide Seiten
des regulatorischen Elements in einem Pflanzengenom flankieren.
Ein isoliertes regulatorisches Element kann z. B. ein rekombinantes
DNA-Molekül
sein, vorausgesetzt, dass eine der Nukleinsäuresequenzen, die normalerweise
in einem natürlich
vorkommenden Genom als dieses rekombinante DNA-Molekül flankierend
gefunden würden,
entfernt oder abwesend ist. Folglich schließen isolierte regulatorische
Elemente, ohne Beschränkung,
sowohl eine rekombinante DNA, die als ein separates Molekül (z. B.
ein genomisches DNA-Fragment, hergestellt durch PCR oder Restriktionsendonukleasebehandlung), ohne dass
flankierende Sequenzen vorhanden sind, existiert, als auch eine
rekombinante DNA ein, die in einen Vektor, ein autonom replizierendes
Plasmid oder in die genomische DNA einer Pflanze als Teil eines
Hybrid- oder Fusionsnukleinsäuremoleküls aufgenommen
ist.
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Die
kodierenden Regionen der fad2D-, fad2F- und fad2U-Gene aus Brassica
napus teilen 84 bis 90% Sequenzidentität auf Nukleotidebene, was durch
MEGALIGN
®-(DNASTAR,
Madison, WI)-Sequenzalignmentsoftware unter Verwendung des „Clustal"-Algorithmus" bestimmt wurde.
Die fad2D- und fad2F-Gene kodieren jeweils eine zytosolische delta-12-Desaturase (auch
FAD2 genannt), die in die enzymatische Umwandlung von Ölsäure in Linolsäure involviert
ist. Siehe
US-Patent Nr. 5,850,026 für die Sequenzen
der fad2D- und fad2F-Gene. Die Nukleotidsequenz des fad2U-Gens legt
nahe, dass es auch eine zytosolische delta-12-Desaturase kodiert.
Siehe
WO 98/56239 für die Sequenz
von fad2U. Alternativ könnte
fad2U eine zytosolische Fettsäurehydroxylase
oder -epoxidase oder ein anderes Enzym kodieren, da die Nukleinsäuren, die
diese Enzyme kodieren, Homologie mit der fad2-Genfamile teilen.
Die fad1- und fad3-Gene kodieren delta-9- bzw. delta-15-Desaturasen.
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Erfindungsgemäße regulatorische
Elemente wurden durch Screenen einer genomischen DNA-Bibliothek
aus Brassica napus, Sorte ,Bridger' unter Verwendung der kodierenden Region
von fad2D als eine Sonde gescreent. Die Nukleotidsequenz ist in 3 (SEQ ID NR: 4) als ein Beispiel eines
erfindungsgemäßen regulatorischen
Elements dargestellt und schließt
ungefähr
5800 Basenpaare (bp; base pairs) stromaufwärts des 5'-Endes des fad2D-Introns ein. Die Nukleotidsequenz,
die in 4 (SEQ ID NR: 5) dargestellt
ist, ist ein regulatorisches Element, das ungefähr 3800 bp stromaufwärts des
5'-Endes des fad2F-Introns
einschließt.
Ein erfindungsgemäßes regulatorisches
Element kann eine Nukleotidsequenz haben, die von den in SEQ ID
NR: 4 und SEQ ID NR: 5 gezeigten Sequenzen abweicht, und die Fähigkeit
beibehält,
die Expression eines Nukleinsäuremoleküls zu fördern. Zum
Beispiel kann eine Nukleinsäuresequenz
mit mindestens 80% Sequenzidentität mit den Nukleotidsequenzen
der SEQ ID NRN: 4 und 5 die Expression eines Nukleinsäuremoleküls fördern. In
einigen Ausführungsformen
kann die Nukleinsäuresequenz
mindestens 90% oder 95% Sequenzidentität mit dem Nukleinsäuremolekül, das in
den SEQ ID NRN: 4 oder 5 dargestellt ist, besitzen.
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Im
Allgemeinen wird die prozentuale Sequenzidentität berechnet, indem die Anzahl
der passenden Positionen in den abgeglichenen Sequenzen bestimmt
wird, die Anzahl der pas senden Positionen durch die Gesamtzahl der
abgeglichenen Nukleotide dividiert wird und mit 100 multipliziert
wird. Eine passende Position bezieht sich auf eine Position, in
welcher identische Nukleotide in der gleichen Position in abgeglichenen
Nukleinsäuresequenzen
auftreten. Die Nukleinsäuresequenzen
werden abgeglichen und die prozentuale Identität wird unter Verwendung des „Clustal"-Algorithmus der
MEGALIGN®-(DNASTAR,
Madison, WI, 1997)-Sequenzalignment-Software berechnet. In diesem
Verfahren werden die Sequenzen durch Prüfen der Abstände zwischen
allen Paaren in Cluster gruppiert. Die Cluster werden als Paare
und dann als Gruppen abgeglichen. Ein „Gap-Penalty" von 100 und ein „Gap-Length-Penalty" von 2 werden in
den Alignments verwendet.
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Fragmente
des regulatorischen Elements, die die Fähigkeit beibehalten, die Expression
eines interessierenden Nukleinsäuremoleküls zu fördern, können hergestellt
werden. Die 1 und 2 stellen
geeignete Restriktionsschnittstellen zur Erzeugung von Fragmenten
bereit. Zum Beispiel können
Fragmente des regulatorischen Elements von fad2D hergestellt werden,
die die Nukleotide 4581 bis 5796 von SEQ ID NR: 4 oder die Nukleotide
5113 bis 5796 von SEQ ID NR: 4 enthalten. Fragmente des regulatorischen
Elements von fad2F können
die Nukleotide 2081 bis 3867 von SEQ ID NR: 5 oder die Nukleotide
3197 bis 3867 von SEQ ID NR: 5 einschließen. Die Fähigkeit von Fragmenten, die
Expression eines Nukleinsäuremoleküls zu fördern, kann unter
Verwendung der hierein beschriebenen Verfahren getestet werden.
Insbesondere kann das Fragment funktionsfähig mit einer Nukleinsäuresequenz
verknüpft
werden und verwendet werden, um eine Pflanzenzelle transient oder
stabil zu transformieren. Der Expression des Genprodukts, das von
der Nukleinsäuresequenz kodiert
wird, kann in solchen transformierten Pflanzenzellen unter Verwendung
von Standardtechniken beobachtet werden.
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Im
Allgemeinen besitzen die Fragmente des regulatorischen Elements
eine Länge
von mindestens 100 Nukleotiden, z. B. ungefähr 200, 400, 600 oder 800 Nukleotiden
in der Länge,
und weisen mindestens 80% Sequenzidentität mit den Nukleotidsequenzen
von SEQ ID NR: 4 oder 5 oder Fragmenten hierzu, wie z. B. Nukleotiden
5113 bis 5797 von SEQ ID NR: 4 oder den Nukleotiden 3197 bis 3867
von SEQ ID NR: 5 auf. In einigen Ausführungsformen besitzen die Fragmente
mindestens 90% oder 95% Sequenzidentität mit den Nukleotidsequenzen
von SEQ ID NRN: 4 oder 5. Die Fragmente der regulatorischen Elemente
können
als Hybridisierungssonden verwendet werden oder sie können verwendet
werden, um die Expression eines Nukleinsäuremoleküls zu fördern. Regulatorische Elemente
mit weniger als 400 bp wurden identifiziert, die die Expression
von Nukleinsäuremolekülen in Pflanzen
fördern.
Zum Beispiel behielt ein Acyl-Carrier-Protein-(ACP)- Promotor die Funktion
nach Deletion von Nukleotiden bis –290 bp stromabwärts des
Initiationspunkts der Transkription (diese Region entspricht 358
Nukleotiden vom Initiationspunkt der Translation) bei. Siehe
EP-91303098 und
US-Patent Nr. 5,767,363 für eine Beschreibung
der Isolierung und Verwendung des ACP-Promotors aus B. napus. Die
Biotincarboxylaseuntereinheit der Acetyl-CoA-Carboxylase aus Plastiden von
Arabidopsis behielt einen funktionstüchtigen Promotor nach Deletion
bis zu –47
bp vom Initiationspunkt der Transkription (diese Region entspricht
167 Nukleotiden vom Initiationspunkt der Translation) bei. Zusätzlich war
die Expression eines Enoyl-ACP-Reduktasepromotors in Samen nach
Deletion bis zu –47
bp von der Transkriptionsstartstelle unverändert, was anzeigt, dass alle
Elemente, die für
ein hohes Expressionsniveau in Samen benötigt wurden, in dieser kleinen
Region vorhanden waren.
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Die
Fragmente der regulatorischen Elemente, die hierin offenbart sind,
können
unter hochstringenten Bedingungen mit den Nukleotidsequenzen von
SEQ ID NR: 4 oder NR: 5 oder Fragmenten hiervon hybridisieren. Die
Hybridisierung bezieht typischerweise Southern-Analyse (Southern Blotting) ein. Siehe
z. B. Abschnitte 9.37–9.52
von Sambrook et al., 1989, "Molecular
Cloning, A Laboratory Manual",
zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, Plainview; NY. Hochstringente
Bedingungen können
die Verwendung von geringer ionischer Stärke und hoher Temperatur zum
Waschen einbeziehen, z. B. 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat (0,1 × SSC),
0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 65°C. Alternativ können Denaturierungsmittel
wie z. B. Formamid während
der Hybridisierung eingesetzt werden, z. B. 50% Formamid mit 0,1%
bovinem Serumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM
Natriumphosphatpuffer mit pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat
bei 42°C.
Ein anderes Beispiel ist die Verwendung von 50% Formamid, 5 × SSC (0,75
M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8),
0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt'sche Lösung, mit
Ultraschall behandelter Lachsspermien-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat
bei 42°C mit
Waschschrittten bei 42°C
in 0,2 × SSC
und 0,1% SDS.
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Ein
erfindungsgemäßes regulatorisches
Element kann aus den 5'-flankierenden
Sequenzen eines genomischen fad-Gens kloniert werden oder kann durch
andere Mittel, einschließlich
chemischer Synthese und Polymerasekettenreaktions-(PCR)-technologie
erhalten werden. PCR bezieht sich auf eine Verfahrensweise oder
Technik, in welcher Zielnukleinsäuren
amplifiziert werden. Im Allgemeinen wird eine Sequenzinformation von
den Enden der interessierenden Region oder darüber hinaus eingesetzt, um Oligonukleotidprimer
zu entwickeln, die mit dem Gegenstrang des zu amplifizierenden Templates
bezüglich
ihrer Se quenz identisch oder dazu ähnlich sind. Die PCR kann verwendet
werden, um spezifische Sequenzen aus sowohl DNA als auch RNA zu
amplifizieren, einschließlich
Sequenzen genomischer Gesamt-DNA oder zellulärer Gesamt-RNA. Primer sind
typischerweise 14 bis 40 Nukleotide lang, aber können im Bereich von 10 Nukleotiden
bis Hunderte von Nukleotiden lang sein. PCR ist z. B. in PCR Primer:
A Laboratory Manual, hrsg. von Dieffenbach, C. und Dveksler, G.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995, beschrieben. Nukleinsäuren können durch
Ligasekettenreaktion, Strangverdrängungsamplifikation, selbsterhaltende
Sequenzreplikation oder Amplifikation auf Grundlage der Nukleinsäuresequenzen
amplifiziert werden. Siehe z. B. Lewis, R., Genetic Engineering
News, 12(9): 1 (1992); Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87: 1874–1878
(1990); und Weiss, R., Science, 254: 1292 (1991).
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Nukleinsäurekonstrukte
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Erfindungsgemäße regulatorische
Elemente können
verwendet werden, um Nukleinsäuremoleküle in Pflanzen
zu exprimieren. Wie hierin verwendet, bezieht sich "heterologes Nukleinsäuremolekül" auf ein Nukelinsäuremolekül, das von
einem 5'-regulatorischen
Element der Fettsäuredesaturase
und seiner assoziierten kodierenden Sequenz verschieden ist und
jede beliebige exogene Nukleinsäure
einschließt,
die teilweise oder vollständig
heterolog (d. h. fremd) für
die Pflanze ist, oder das homolog hinsichtlich eines endogenen Nukleinsäuremoleküls der Pflanze
ist. Ein regulatorisches Element und ein heterologes Nukleinsäuremolekül können in
Sense- oder Antisense-Orientierung verbunden sein. Wie hierin verwendet,
bezieht sich "funktionsfähig verknüpft" auf eine kovalente
Verknüpfung
zweier oder mehrer Nukleinsäuremoleküle in einer
Weise, so dass eine Transkription und Translation auftreten kann,
d. h. die Produktion eines Polypeptids oder RNA-Moleküls ermöglicht wird.
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Antisense-RNA
wurde verwendet, um Pflanzenzielgene unter Verwendung sowohl der
gesamten cDNA-Sequenz als auch einer partiellen cDNA-Sequenz zu
inhibieren. Es gibt auch Hinweise, dass 3'-nichtkodierende Sequenzfragmente oder
5'-kodierende Sequenzfragmente
eine wichtige Rolle bei der Antisense-Inhibition spielen können. Antisense-Nukleinsäurekonstrukte
schließen
ein erfindungsgemäßes regulatorisches
Element ein, das funktionsfähig
in Antisense-Orientierung mit einem interessierenden Nukleinsäuremolekül verknüpft ist,
das für
das regulatorische Element heterolog ist.
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Konstrukte,
die funktionsfähig
in Sense-Orientierung verknüpft
sind, können
verwendet werden, um die Expression eines endogenen Gens zu inhibieren.
Die Co-Suppression unter Verwendung einer Volllängen-cDNA-Sequenz wie auch
einer partiellen cDNA-Sequenz sind bekannt. Siehe z. B.
US-Patent Nr. 5,231,020 .
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Heterologe
Nukleinsäuremoleküle können z.
B. Ribozyme kodieren, die entwickelt wurden, um besondere mRNA-Transkripte
zu spalten, wodurch die Expression eines Polypeptids verhindert
wird. Hammerkopfribozyme sind zum Zerstören besonderer mRNA verwendbar,
obwohl auch verschiedene Ribozyme, die mRNA an schnittstellenspezifischen
Erkennungsstellen schneiden, verwendet können. Hammerkopfribozyme spalten
mRNA an Stellen, die durch die flankierenden Regionen vorgegeben
werden, die komplementäre
Basenpaare mit der Ziel-mRNA bilden. Das einzige Erfordernis ist,
dass die Ziel-RNA eine 5'-UG-3'-Nukleotidsequenz
enthält.
Die Konstruktion und Herstellung von Hammerkopfribozymen sind in
der Technik gut bekannt. Siehe z. B.
US-Patent
Nr. 5,254,678 . Sequenzen von Hammerkopfribozymen können in
stabile RNA, wie z. B. Transfer-RNA (tRNA) eingebettet sein, um
die Spaltungseffizienez in vivo zu erhöhen. Perriman, R. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 92(13): 6175–6179
(1995); de Fester, R. und Gaudron, J., Methods in Molecular Biology, Bd.
74, Kapitel 43, "Expressing
Ribozymes in Plants",
hrsg. von Turner, P. C, Humana Press Inc., Totowa, NJ. RNA-Endoribonukleasen,
wie z. B. jene, die natürlicherweise
in Tetrahymena thermophila auftritt, und die ausführlich von
Cech und Mitarbeitern beschrieben wurden, sind auch verwendbar.
Siehe z. B.
US-Patent Nr. 4,987,071 .
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Heterologe
Nukleinsäuremoleküle können auch
Polypeptide kodieren. Wie hierin verwendet, bezieht sich "Polypeptid" auf eine Aminosäurekette,
unabhängig
von ihrer Länge
oder einer posttranslationalen Modifikation. Polypeptide können Enzyme
oder Fragmente davon, die das Wachstum, die Hormonproduktion, photosynthetische
Wirksamkeit, den Nährwert
und die Öl-
oder Proteinzusammensetzung regulieren, oder Reporterpolypeptide
wie z. B. grün
fluoreszierendes Protein, Neomycinphosphotransferase II oder β-Glucuronidase einschließen. Polypeptide
können
z. B. auch Resistenz gegenüber
Umweltstress wie z. B. Trockenheit oder Kälte, Pathogenen, Insekten oder
Herbiziden verleihen. Toxingene aus Bacillus thuringiensis können in
Pflanzen exprimiert werden, um Resistenz gegenüber Insekten bereitzustellen.
Siehe z. B.
US-Patent Nr. 5,380,831 .
Herbizidresistenz gegenüber
Glyphosat und Glufosinat kann durch Exprimieren von Nukleinsäuremolekülen bereitgestellt
werden, die 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase-(EPSPS)-Polypeptide
bzw. Phosphinothricinacetyltransferase-(PAT)-Polypeptide kodieren.
Siehe z. B.
US-Patent Nrn. 4,940,835 und
5,489,520 . Zusätzlich kann
Resistenz gegenüber
Glyphosat und Glufosinat durch Exprimieren eines Nukleinsäuremoleküls, das
ein Hygromycinphosphotransfe rase-(HPH)-Polypeptid oder die glpA-
und glpB-Gene aus Pseudomonas in Plastiden der Pflanze kodiert,
bereitgestellt werden. Siehe z. B.
WO
99/05265 . Resistenz gegenüber Herbiziden vom Imidazolintyp
kann durch Expression eines Nukleinsäuremoleküls bereitgestellt werden, das
ein Acetohydroxysäuresynthase-Polypeptid
kodiert. Siehe z. B.
US-Patent Nr. 4,761,373 .
Resistenz gegenüber
Cyclohexandion- oder Aryloxyphenoxypropansäuretypherbiziden kann in Mais
durch Expression von Nukleinsäuremolekülen bereitgestellt
werden, die herbizidresistente Acetyl-CoA-Carboxylasepolypeptide (ACC1
und ACC2) kodieren. Siehe z. B.
WO
98/08963 und Herbert et al., Pestic. Sci., 1997, 50: 67–71. Expression
eines Protoporphyrinogenoxidasepolypeptids, das resistent gegenüber Porphyrinherbiziden
ist, stellt Herbizidresistenz gegen Protoporphyrinogen inhibierende
Herbizide bereit. Siehe z. B.
WO
98/29554 . Resistenz gegenüber Herbiziden vom Benzyoylcyclohexandiontyp
kann durch Expression eines Nukleinsäuremoleküls bereitgestellt werden, das
herbizidresistente 4-Hydroxyphenylpyruvatdioxygenasepolypeptide
kodiert. Siehe z. B. Barta und Boger, Pestic. Sci., 1996, 48(2):
109–116;
WO 98/02562 ; und
WO 99/24586 . Herbizidresistenz
kann auch durch Expression von Nukleinsäuremolekülen bereitgestellt werden,
die einzelkettige Fv-Antikörper
kodieren, die ein Herbizid binden. Die Expression von einzelkettigen
Fv-Antikörpern
mit spezifischer Bindungsaktivität
für virale
Hüllproteine,
z. B. in dem Zytosol von Pflanzen, kann Resistenz gegenüber viralen
Pathogenen verleihen. Siehe z. B. Conrad und Fiedler, Plant Mol.
Biol., 1998, 38(1&2):
101–109
und
WO 98/42852 .
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Ein
erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt
kann ein Nukleinsäuremolekül einschließen, das
eine 3'-untranslatierte
Region (3'UTR; 3' untranslated region)
kodiert, die die Stabilität
der transkribierten Sequenzen durch Bereitstellen der Addition von
mehreren Adenylatribonukleotiden am 3'-Ende der transkribierten mRNA-Sequenz
erhöht.
Die 3'UTR kann z.
B. die Napolinsynthase-(NOS)-3'UTR
oder die 3'UTR eines fad-Gens
sein, die in dem natürlich
vorkommenden Genom 3' von
der fad kodierenden Sequenz lokalisiert ist. Wie hierin verwendet,
bezieht sich "3'" auf Sequenzen von 4000 bp oder weniger
(z. B. ungefähr
2000 bp oder weniger), die stromabwärts einer fad kodierenden Region
gelegen sind. Wie hierin beschrieben, wurden die 3'UTR der fad2D- und
fad2F-Gene isoliert und haben die Nukleotidsequenzen, die in 5 (SEQ
ID NR: 6) bzw. in 6 (SEQ ID NR:7) dargestellt
sind. Ein Teil der 3'-untranslatierten
Regionen von fad2D und fad2F waren homolog zu Actingenen verschiedener
Pflanzenspezies. In pMB103 endet die actinhomologe Region bei Nukleotidposition
8846 (3'-Ende) und
beginnt bei Nukleotid 9341 (5'-Ende).
In pMB102 endet die actinhomologe Region bei Nukleotidposition 7007
(3'-Ende) und beginnt
bei Nukleotid 7491 (5'-Ende).
Fragmente von Nukleinsäuremolekü len der
SEQ ID NRN: 6 und 7 können
hergestellt werden, wie z. B. Nukleinsäurefragmente, die die Nukleotide
1-894 von SEQ ID NR: 6 oder der Nukleotide 1-817 von SEQ ID NR:
7 einbeziehen, die partielle Actingene ausschließen. Zusätzliche Fragmente, die mindestens
100 Nukleotide lang sind und die mindestens 70% Sequenzidentität mit den
Nukleotiden 1-894 von SEQ ID NR: 6 oder den Nukleotiden 1-817 von
SEQ ID NR: 7 besitzen, können
auch hergestellt und in den erfindungsgemäßen Konstrukten verwendet werden.
Zum Beispiel kann eine 3'UTR
eines fad-Gens mit dem 3'-Ende
eines heterologen Nukleinsäuremoleküls verknüpft werden,
das weiter mit jedem beliebigen 5'-regulatorischen Element, einschließlich dem 35S-Promotor
von CaMV, verknüpft
werden kann.
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Nukleinsäurekonstrukte
können
auch Elemente wie z. B. induzierbare Elemente, Intronsequenzen, Enhancersequenzen
oder abzielende Sequenzen enthalten. Solche Elemente sind für die Funktion
des heterologen Nukleinsäuremoleküls nicht
notwendig, obwohl sie eine bessere Expression bereitstellen oder
es erlauben, dass ein Nukleinsäuremolekül auf eine
bestimmte Organelle (z. B. einen Plastiden) abgezielt wird. Zum Beispiel
kann die 5'UTR der
kleinen Untereinheit der Ribulose-Bisphosphat-Carboxylase zur Verstärkung der Expression
bereitgestellt werden. Nukleinsäuremoleküle, die
ein Transitpeptid aus der kleinen Untereinheit der Ribulose-Bisphosphat-Carboxylase
oder anderer auf Plastiden abzielende Proteine kodieren, können verwendet
werden, um das kodierte Produkt auf den Plastiden abzuzielen. Siehe
z. B.
US-Patent Nr. 5,925,806 und Tingey
et al., J. Biol. Chem., 1988, 263(20): 9651–9657. Geeignete Introns zur
Verwendung in der Erfindung schließen die fad2D- und fad2F-Introns
ein. Die Sequenz des fad2D-Introns ist in
WO 98/56239 gezeigt.
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Das
Timing der Expression eines Nukleinsäuremoleküls, das von einem 5'-reglatorischen Element
aus einem fad-Gen kontrolliert wird, wird von dem von Nukleinsäuren, die
von den ACP- oder Napinpromotoren kontrolliert werden, auf Grundlage
der differentiellen Expression der entsprechenden nativen Gene verschieden
sein. Zusätzlich
wird das Expressionsniveau und die Regulation der 5'-regulatorischen
Elemente von fad von denen der Napin- und ACP-Promotoren verschieden
sein. Als solche könnten
die 5'-regulatorischen
Elemente der fad-Gene spezielle Vorteile gegenüber anderen Promotoren bei
der Regulation der Expression von fremden oder endogenen Genen haben.
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Überraschenderweise
exprimiert jeder der Promotoren aus den fad2D- und fad2F-Genen Nukleinsäuremoleküle in einer
Anzahl verschiedener Pflanzen. Da kürzlich identifizierte mutierte
fad2D-Gene in einer Veränderung
des Ölsäuregehalts
in Samen, jedoch nicht in Wurzeln oder Blättern, der Canolapflanzen resultierten,
wurde erwartet, dass die fad2D- Genexpression
spezifisch für
Pflanzensamen war. Zusätzlich
besitzen Canolapflanzen, die eine Punktmutation in sowohl den fad2D-
als auch fad2F-Genen besitzen, verkrüppelte Wurzeln, wenn sie bei
niedrigen Temperaturen oder auf dem Feld wachsen gelassen werden,
aber sie enthalten bis zu 85% Ölsäure in den
Samen. Die Wurzeln solcher Pflanzen zeigen eine veränderte Lipidzusammensetzung, ähnlich zu
dem Ölsäuregehalt
in den Samen. Auf Grundlage dieser Daten nahm man an, dass fad2F sowohl
in Samen als auch Wurzeln exprimiert wurde und dass fad2D in Samen
exprimiert wurde. Allerdings wird fad2D in Wurzeln sogar in höherem Niveau
als fad2F, wie hierin beschrieben, exprimiert (auf Grundlage einer
RT-PCR-Analyse). Die erfindungsgemäßen regulatorischen Elemente
können
verwendet werden, um die Expression oder die Co-Suppression von
interessierenden Genen in geeigneten Entwicklungsstadien und in Geweben
entsprechend ihrer endogenen fad2D- und fad2F-Expression zu steuern.
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Erfindungsgemäße regulatorische
Elemente sind bei der Steuerung der transienten Expression von β-Glucuronidase
(GUS) in Brassica und Sojabohnenblättern und im Callus von Brassica ähnlich zu
dem 35S-Promotor. In Wurzeln und embryonalem Gewebe von Brassica
scheinen allerdings die fad2D- und fad2F-Promotoren höhere Niveaus
an GUS-Expression
zu besitzen als der 35S-Promotor. Zusätzlich kann der fad2F-Promotor
die Expression von GUS in Maisbättern
auf Niveaus steuern, die dem des 35S-Promotors ähnlich sind. Dies bedeutet,
dass zusätzlich
zur Expression in dikotylen Pflanzen der fad2F-Promotor verwendet werden kann, um ein
interessierendes Gen in monokotylen Pflanzen zu exprimieren.
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Transgene Pflanzen
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Transgene
Pflanzen können
durch Einführen
mindestens eines Nukleinsäurekonstrukts
in eine Pflanzenzelle wie hierin beschrieben erhalten werden. Geeignete
Pflanzen schließen
Dikotyledonen wie z. B. Alfalfa, Sojabohnen, Raps (hoher Gehalt
an Erucasäure
und Canola) oder Sonnenblumen und Monokotyledonen, wie Mais, Weizen,
Roggen, Reis oder Hirse ein. Samen, die von transgenen Pflanzen
hergestellt wurden, können
wachsen gelassen und über
Inzucht vermehrt werden (oder ausgekreuzt und über Inzucht vermehrt werden),
um für
das Konstrukt homozygote Pflanzen zu erhalten. Die Samen können analysiert
werden, um jene Homozygoten mit der gewünschten Expression des Konstrukts
zu identifizieren. Transgene Pflanzen können in ein Zuchtprogramm aufgenommen
werden, z. B. um die Saat zu steigern, das neue Konstrukt in Linien
anderer Spezies zu introgressieren oder für die weitere Selektion anderer
wünschenswerter
Merkmale. Alternativ können transgene
Pflanzen für
jene Spezies, die solchen Techniken zugänglich sind, durch vegetative
Vermehrung einer transformierten Pflanzenzelle erhalten werden.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich eine transgene Pflanze auch auf einen
Nachkommen einer ursprünglich
transgenen Pflanze. Nachkommen schließen Abkömmlinge einer bestimmten Pflanze
oder Pflanzenlinie ein, z. B. Samen, die von einer vorliegenden
Pflanze entwickelt wurden. Nachfahren einer vorliegenden Pflanze
schließen
auch Pflanzen ein, die auf F1-, F2-, F3- und nachfolgenden
Generationen von Pflanzen gebildet wurden, oder Samen, die auf BC1-, BC2-, BC3- und nachfolgenden Generationen von Pflanzen
gebildet wurden.
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Transgene
Techniken zur Verwendung in der Erfindung schließen ohne Beschränkung Agrobacterium-vermittelte
Transformation, Elektroporation und Teilchenbeschusstransformation
ein. Veranschaulichende Beispiel von Transformationstechniken sind
in der PCT-Anmeldung Nr. 99/04117 (Teilchenbeschuss von Brassica)
und dem
US-Patent Nr. 5,188,958 (Agrobacterium)
beschrieben. Transformationsverfahren, die Ti- und Ri-Plasmide von Agrobacterium
spp. verwenden, verwenden typischerweise Vektoren des binären Typs.
Walkerpeach, C. et al., in Plant Molecular Biology Manual, S. Gelvin
und R. Schilperoort, Hrsg., Kluwer Dordrecht, C1: 1–19 (1994).
Falls Zell- oder Gewebekulturen als Empfängergewebe für die Transformation
verwendet werden, können
Pflanzen aus transformierten Kulturen durch Techniken gewonnen werden,
die dem Fachmann bekannt sind.
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Erfindungsgemäße transgene
Pflanzen sind für
eine Vielzahl kommerzieller und wissenschaftlicher Zwecke verwendbar,
da die erfindungsgemäßen regulatorischen
Elemente verwendet werden können,
um jedes beliebige interessierende heterologe Nukleinsäuremolekül zu exprimieren.
Transformierte Pflanzenzellen sind auch verwendbar, da sie kontinuierlich
in Kultur vermehrt werden können.
Solche Kulturen sind für
die In-vitro-Herstellung
einer Vielzahl nützlicher
Materialien verwendbar, z. B. sekundärer Metaboliten oder ätherischer Öle.
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Die
Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen beschrieben, die
den Umfang der Erfindung, die in den Ansprüchen beschrieben ist, nicht
beschränken.
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BEISPIELE
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Beispiel 1 – Identifikation von Promotorsequenzen
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Eine
genomische DNA-Bibliothek (300.000 Plaques) aus B. napus, Sorte
,Bridger' wurde
durch Hybridisierung mit der kodierenden Region von fad2D gescreent.
Ungefähr
16 positive Plaques wurden in der dritten Screeningrunde identifiziert
und anschließend
gereinigt. Die Plaque-DNA der 16 positiven Plaques wurde mit verschiedenen
Restriktionsenzymen und durch Southern-Analyse unter Verwendung
der kodierenden Region von fad2D als eine Sonde kartiert. Positive
genomische DNA-Fragmente (erzeugt durch SalI-Verdau und identifiziert
durch Southern-Analyse) aus zwei Plaques (Klone 1-3A1A und 1-2A1A)
wurden in den pSP72-Vektor an der SalI-Schnittstelle subkloniert,
um die Plasmide pMB103 bzw. pMB102 herzustellen (1 und 2).
Die Plasmide pMB102 und pMB103 wurden bei der „American Type Culture Collection" hinterlegt. Subklonierte
SalI-DNA-Fragmente in pSP72 wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen
kartiert.
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Die
Gegenwart der fad2D- und fad2F-Gene in den subklonierten SalI-DNA-Fragmenten
in pMB103 und pMB102 wurde über
PCR verifiziert. Die Reaktionsbedingungen schlossen ein: 5 μl 10 × PCR-Puffer
mit Mg2+ (Boehringer Mannheim, bereitgestellt
mit Taq-Polymerase), 1 μl
10 mM dNTPs (Boehringer Mannheim, Katalognrn. 1 051 458, 1 051 440,
1 051 466 und 1 051 482), 1 μl
10 μM Fad2D-RT-1
(caucaucaucauACCGCTACGCTGCTGTCCAA, SEQ ID NR: 1) oder 1 μl 10 μM Fad2F-RT2
(caucaucaucauCTCTTCCGTTACGCCTTCACGTAG, SEQ ID NR: 2), 1 μl 10 μM BS4 (cuacuacuacuaCATAACTTATTGTTGTACCAG,
SEQ ID NR: 3), 0,5 μl
Taq-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim, Katalognr. 1 647 679),
40,5 μl
ddH2O und 1,0 μl 10 ng/μl DNA-Template. Die Proben wurden auf 95°C für 4 Minuten
erhitzt, dann unter Verwendung von 30 Zyklen von Denaturierung bei
94°C für 1 Minute,
Annealen bei 65°C
für 2 Minuten
und Verlängerung
bei 72°C
für 3 Minuten,
gefolgt von einer endgültigen
Verlängerung
bei 72°C
für 10
Minuten, amplifiziert. Das Primerpaar von Fad2F-RT-1 und BS-4 amplifizierte
spezifisch das fad2F-Gen, wohingegen Fad2D-RT-1 und BS-4 spezifisch das
fad2D-Gen amplifizierten. Die Reaktionsprodukte, die erzeugt wurden,
waren konsistent mit dem 1-2A1A-Fragment, das das fad2F-Gen enthielt,
und 1-3A1A, das das fad2D-Gen enthielt.
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Zusätzlich wurden
die 1-2A1A- und 1-3A1A-Klone unter Verwendung synthetischer Primer
aus den kodierenden Regionen von fad2D und fad2F sequenziert. Das
Sequenzieren der DNA wurde unter Verwendung des „ABI PRISM 310"-(Perkin Elmer)-Sequenzierers, der
AmpliTaq-DNA-Polymerase und Farbstoffterminatoren, wie vom Hersteller
beschrieben, durchgeführt.
Die kodierenden Sequenzen in den genomischen 1-2A1A- und 1-3A1A-Klonen waren identisch
zu den zuvor sequenzierten kodierenden Regionen von fad2F und fad2D, was
bestätigte,
dass die 1-2A1A- und 1-3A1A-Fragmente die fad2F- bzw. fad2D-Gene enthalten. Die
vollständigen
Nukleotidsequenzen der genomischen DNA-Fragmente aus jedem Konstrukt
wurden erhalten und sind in den 3 und 4 dargestellt. In beiden Klonen war ein
Intron vier Nukleotide stromaufwärts
des "ATG"-Kodons des Initiationspunkts
der Translation vorhanden.
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Ein
Verdau mit den Restriktionsenzymen SalI und PpuMI von pMB102 und
pMB103 wurde verwendet, um DNA-Fragmente von ungefähr 3,9 kB
bzw. 5,8 kB herzustellen, die den Promotor enthielten, aber frei
von Intron und kodierenden Sequenzen waren. DNA-Fragmente, die durch Restriktionsenzymverdaue
freigesetzt wurden, wurden in Agarosegelen gelöst und wie vom Hersteller (Quiagen)
beschrieben gereinigt. Die gereinigten Fragmente wurden in die SalI-/SmaI-Schnittstellen
von pMB160 ligiert, welcher ein GUS-NOS-DNA-Fragment enthielt, das in die
XbalI-/EcoRI-Schnittstelle von pSP72 kloniert war, um die neuen
Plasmide pMB168 bzw. pMB166 zu erhalten. DNA-Ligationen wurden mit
T4-DNA-Ligase wie vom Hersteller (BRL) beschrieben durchgeführt und
dann in DH5α-Bakterienzellen propagiert.
Die 5'-regulatorischen
Elemente der fad-Gene wurden in pMB160 platziert, so dass die regulatorischen
Elemente die Expression von GUS treiben könnten.
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Die
Nukleotidsequenz der Promotorregion von pMB166 und pMB168 wurde
unter Verwendung von MEGALIGN®-(DNASTAR, Madison, WI)-Sequenzalignmentsoftware
und dem Clustal-V-Verfahren und -algorithmus, der von Higgins und
Sharp, Gene, 1988, 73(1): 237–44
und Comput. Appl. Biosci., 1989, 5(2): 151–153 beschrieben wurde, abgeglichen.
Ein "Gap-Penalty" von 100 und ein "Gap-Length-Penalty" von 2 wurden für Mehrfachalignment
verwendet. Die Parameter für
paarweises Alignment schlossen einen "K-Tupe" von 2, ein "Gap-Penalty" von 5 und ein "Window" von 4 und ein "Diagonal" von 4 ein. Das Alignment der fad2D- und
fad2F-Promotoren in pMB166 bzw. pMB168 identifizierte eine Region
mit 86,4% Identität.
Diese Region beginnt und endet bei den Nukleotiden 4940 bzw. 5796
in dem fad2D-Promotor (3, SEQ ID NR:
4) und bei den Nukleotiden 3132 bzw. 3867 in dem fad2F-Promotor
(4, SEQ ID NO: 5). Es scheint, dass
diese konservierte Region alle für
die vollständige
Funktionstüchtigkeit
beider Promotoren erforderlichen Elemente enthält (siehe Beispiel 3). Die
fad2D- und fad2F-Intronnukleotidsequenz wurde unter Verwendung des
selben Computerprogramms und der gleichen Parameter abgeglichen.
Die beiden Introns hatten 73% Identität.
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Beispiel 2 – RT-PCR-Analyse der Fad2F-
und Fad2D-Expression in verschiedenen Pflanzengeweben:
-
RNA-STAT-60-RNA-Isolierung:
RNA wurde aus Blättern
und Wurzeln von Brassica napus-Pflanzen, Sorte Westar, die für 2 Wochen
im Gewächshaus
gezogen worden waren, und aus Samen, die 10, 20, 30, 30–50 und
45–55
Tage nach dem Blühen
von auf dem Feld gezogenen Brassica napus-IMC129 gesammelt worden
waren, isoliert. IMC129 ist in
US-Patent Nr. 5,668,299 beschrieben.
Die Proben wurden bei –70°C vor der
RNA-Extraktion gelagert. Die RNA-Isolierung basierte auf dem Protokoll
des Herstellers für
RNA STAT-60 (Tel-Test-"B" Bulletin Nr. 1). Ungefähr 200 μg Gewebe
wurden pro 2 ml Reagens verwendet. Das Gewebe wurde mit Mörser und
Stößel unter
Stickstoff gemahlen, zu dem Reagens zugegeben und unter Verwendung
eines Polytronhomogenisators vor dem Extraktionsschritt homogenisiert.
Siehe Chomczynski und Sacchi, Anal. Biochem., 1987, 162: 156–159; und
Kedzierski und Porter, Biotechniques, 1991, 10: 210–214.
-
Reverse
Transkription: Das Erststrang-cDNA-Reaktionsgemisch wurde hergestellt
und enthielt 10 μl
5 × Erststrangpuffer
(BRL), 5 μl
jeden dNTPs (5 mM), 1 μl
Oligo-dT(12–18)-Primer (0,5 mg/ml),
1 μl pd(N)6-Primer (0,5
mg/ml), 1 μl
RNA (1–2 μg gesamt)
und 28 μl
dH2O. Nach Inkubation des Reaktionsgemisches
bei 65°C
für 2 Minuten
und Abkühlen
auf 35°C
bei Raumtemperatur wurden 2 μl
100 mM DTT, 1 μl
RNasin (Promega) und 1 μl
Superscript-II-Reverse-Transkriptase (BRL) zugefügt und gemischt. Die Reaktion
wurde für
zusätzliche
5 min bei 25°C,
5 min bei 30°C
und 60 min bei 37°C
inkubiert. Die PCR wurde unter Verwenden von 2,5 μl Erststrang-cDNA-Reaktionsgemisch
oder 0,5 μg
pMB102- oder pMB103-DNA-Konstrukt, 5,0 μl 10 × PCR-Puffer II (Perkin-Elmer), 2,5 μl eines jeden
dNTPs (5 mM), 1,0 μl
Upstream-Primer (50 μM
gesamt), 1,0 μl Downstream-Primer
(50 μM gesamt),
0,5 μl Amplitaq-Polymerase
(Perkin-Elmer) und 37,5 μl
dH2O (50 μl
gesamt) durchgeführt.
Die Reaktionsbedingungen schlossen 35 Zyklen von Denaturierung bei
94°C für 15 sec, Annealen
bei 60°C
für 30
sec und Verlängerung
bei 72°C
für 60
sec ein. Die Primer, die verwendet wurden, schlossen die Stromabwärts-Primer
BS-4 (SEQ ID NR: 3) und entweder Fad2D-RT1 oder Fad2F-RT2 (SEQ ID
NRN: 1 bzw. 2) als Stromaufwärts-Primer
ein.
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Die
Amplifikationsprodukte waren 434 Nukleotide für sowohl fad2D als auch fad2F
und wurden durch Elektrophorese durch ein Agarosegel und Ethidiumbromidfärbung nachgewiesen.
Die Spezifität
der amplifizierten Produkte wurde durch Verdau mit BalI- oder SspI-Restriktionsenzymen
verifiziert. Ein BalI-Restriktionsverdau erzeugte Fragmente von
274 und 160 Basenpaaren in fad2D, wohingegen ein SspI-Verdau Fragmente von
234 und 200 Basenpaaren in fad2F herstellte. Die RT-PCR-Daten zeigten,
dass die fad2F- und fad2D-Gene in allen untersuchten Geweben exprimiert
wurden, einschließlich
Blättern,
Wurzeln und Samen, obwohl das Niveau der fad2D-Genexpression höher war
als das des fad2F-Gens. Diese Daten korrelieren mit der Analyse der
fad2F- und fad2D-Promotoren, die nachfolgend beschrieben ist.
-
Beispiel 3 – Fad2D- und Fad2F-Promotoranalyse:
-
Es
wurden Konstrukte hergestellt, die das GUS-Reportergen ohne einen
Promotor (pMB160) unter der Kontrolle eines fad2D-Promotors (pMB166)
unter der Kontrolle von fad2D-Promotor-5'-Deletionen (pMB179 und pMB180), unter
der Kontrolle eines fad2F-Promotors
(pMB168), unter der Kontrolle von fad2F-Promotor-5'-Deletionen (pMB167
und pMB176) oder unter der Kontrolle des 35S-Promotors (pMB146)
enthielten. Tabelle 1 stellt eine Beschreibung jedes dieser Konstrukte
bereit. TABELLE Beschreibung der Plasmide
Plasmid | Beschreibung | Länge des
Promotors (bp) |
pMB103 | 1-3A1A
SalI-genomisches DNA-Fragment isoliert aus der 'Bridger'-genomischen Bibliothek, enthält das Gen
und den Promotor von fad2D. Dieses Fragment wurde in die SalI-Schnittstelle
des pSP72-Vektors subkloniert. | |
pMB102 | 1-2A1A
SalI-genomisches DNA-Fragment isoliert aus der 'Bridger'-genomischen Bibliothek, enthält das Gen
und den Promotor fad2F. Dieses Fragment wurde in die SalI-Schnittstelle des
pSP72-Vektors subkloniert. | |
pMB166 | Das
SalI- und PpuMI-(stumpfendige)-DNA-Fragment (enthaltend die genomische
DNA-Sequenz stromaufwärts
des fad2D-Introns) aus dem pMB103-Konstrukt wurde an die SalI- und
SmaI-Schnittstellen des pMB160-Konstrukts ligiert. | 5800 |
pMB179 | Das
pMB166-Konstrukt wurde mit PstI verdaut und wieder ligiert, um die
Region stromaufwärts
des Promotors zu entfernen. | 683 |
pMB180 | Das
pMB166-Konstrukt wurde mit HindIII verdaut und wieder ligiert, um
die Region stromaufwärts
des Promotors zu entfernen. | 1215 |
pMB168 | Das
SalI- und PpuMI-(stumpfendige)-DNA-Fragment (enthaltend die genomische
DNA-Sequenz stromaufwärts
des Fad2F-Introns) aus dem pMB102-Konstrukt wurde an die SalI- und
SmaI-Schnittstellen des pMB160-Konstrukts kloniert. | 3800 |
pMB167 | Das
pMB168-Konstrukt wurde mit PvuII verdaut und wieder ligiert, um
die Region stromaufwärts
des Promotors zu entfernen. | 1786 |
pMB175 | Das
pMB166-Konstrukt wurde mit PstI verdaut und wieder ligiert, um die
Region stromaufwärts
des Promotors zu entfernen. | 670 |
Kontrollplasmide |
pMB146 | Das
35S-GUS-NOS-DNA-Fragment wurde aus dem binären Vektor pBI121 (Clontech)
durch HindIII- und EcoRI-Verdau freigesetzt und dann in die HindIII-
und EcoRI-Schnittstellen von SP72 subkloniert. | |
pMB160 | Das
GUS-NOS-DNA-Fragment wurde aus dem binären Vektor pBI121 (Clontech)
durch XbaI- und EcoRI-Verdau freigesetzt und dann in die XbaI- und
EcoRI-Schnittstellen von SP72 subkloniert. Diese Plasmid enthält keinen
Promotor. | |
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Die
Stärke
der verschiedenen Promotor-GUS-Konstrukte wurde auf Grundlage der
Fähigkeit,
die transiente GUS-Expression in verschiedenen Pflanzengeweben nach
biolistischer Transformation zu steuern, evaluiert. Siehe PCT-Anmeldung
Nr. 99/04117 für
eine Beschreibung einer biolistischen Transformation von Brassica.
Die für
den Partikelbeschuss verwendete Vorrichtung war das „Biolistic
PDS-1000/HE-System" (Dupont). Die
Vorgehensweise für
den Partikelbeschuss folgte dem Bio-Rad US/EG Bulletin 1689 unter
Verwendung von 0,6 μm
Goldpartikeln. Jeder Beschuss verabreichte ungefähr 2 μg DNA. Nach dem Beschuss wurden
die Gewebe kultiviert und in einer feuchten Umgebung für 24 Stunden
gehalten, wie in der PCT-Anmeldung Nr. 99/04117 beschrieben, und
dann durch Färben
auf GUS-Expression getestet. Ein GUS-Färbeverfahren ist von Stopm
in GUS Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression,
Sean R. Gallagher (Hrsg.), 1992, S. 103–13, Academic Press, San Diego,
Kalifornien, beschrieben.
-
Die
Promotorstärke
wurde aus der GUS-Färbung
unter Verwendung eines Beurteilungssystems von 0 bis 5 abgeschätzt. "0" zeigt an, dass keine blauen Punkte
beobachtet wurden; "1" zeigt an, dass 1–10 blaue Punkte
beobachtet wurden; "2" zeigt an, dass 11–100 blaue
Punkte beobachtet wurden; "3" zeigt an, dass 101–1000 blaue
Punkte beobachtet wurden; "4" zeigt an, dass 1001–5000 blaue
Punkte beobachtet wurden; und "5" zeigt an, dass > 5001 blaue Punkte
beobachtet wurden.
-
Zwischen
ein und vier Experimente wurden für Weizen und Sojabohnen durchgeführt. Zwei
bis acht Experimente wurden für
Brassica-Spezies, Mais und Sonnenblume durchgeführt. Tabelle II zeigt den höchsten in
Experimenten beobachteten Grad.
-
Die
Hintergrundexpression des GUS-Gens wurde unter Verwendung des pMB160-Konstrukts evaluiert.
In den Blättern,
dem Mikrosporenembryo und Wurzeln von Brassica-Species variierte die GUS-Hintergrundexpression
in Abhängigkeit
von dem getesteten Gewebe zwischen 0 und 1. Die GUS-Hintergrundexpression
wurde in Sojabohnenblättern
mit einem Niveau von 1 bis 2 nachgewiesen.
-
Der
fad2F-Promotor (3866 bp) in dem pMB160-Konstrukt exprimierte GUS
transient in Blättern,
Wurzeln, Mikrosporenembryonen, kultivierten Geweben und dem Kotyledon
und Hypokotyl von Brassica (B. napus und B. juncea), in Niveaus,
die als 5, 2, 2, 3 bzw. 2 eingestuft wurden. Eine hohe GUS-Expression
wurde in Sojabohnenblättern
(Grad 5) und in Sonnenblumenblättern
(Grad 3) beobachtet. Der fad2F-Promotor war in der Lage, die Expression
von GUS in Maisblättern
(einer monokotolydonen Spezies) bei einem Grad von 1 zu steuern.
-
Eine
Expression von GUS wurde auch erhalten, wenn Fragmente des fad2F-Promotors
verwendet wurden. Der fad2F-Promotor aus dem pMB167-Konstrukt, in
welchem 5' 1800
Nukleotide deletiert wurden (was die Nukleotide 2081–3867 von
SEQ ID NR: 5 übrig
lässt),
exprimierte GUS transient in Blättern,
Mikrosporenembryonen und kultiviertem Gewebe von Brassica, wobei
Grade von 4, 2 bzw. 2 erreicht wurden. Der fad2F-Promotor aus dem
pMB175-Konstrukt (Nukleotide 3197–3867 von SEQ ID NR: 5) exprimiert
GUS transient in Blättern
und Mikrosporenembryonen von Brassica mit Niveaus, die die Grade
von 3 bzw. 1 erreichten. Der fad2F-Promotor in dem pMB167- und pMB168-Konstrukten
exprimierte GUS transient in ähnlichen
Niveaus, während
eine niedrigere transiente GUS-Expression
unter Verwendung des pMB175-Konstrukts nachgewiesen wurde. Diese
Daten lassen vermuten, dass der fad2F-Promotor in pMB168 alle notwendigen
Elemente besitzt, um die Expression von GUS transient zu steuern,
ohne die Expressionsniveaus, die mit dem vollständigen Promotor (Konstrukt
pMB167) beobachtet wurden, zu reduzieren. Eine niedrigere GUS-Aktivität, die unter
Verwendung des pMB175-Konstrukts beobachtet wurde, könnte anzeigen,
dass ein Aktivierungselement oder eine Region entfernt wurde, die
die Promotorstruktur beeinflusst.
-
Der
fad2D-Promotor (5800 bp) aus dem pMB166-Konstrukt exprimiert GUS
transient in Blättern,
Wurzeln, Mikrosporenembryonen und kultivierten Geweben von Brassica
mit Niveaus, die die Grade 4, 1 bzw. 2 erreichen. Ein Expressionsniveau
von "3" wurde auch in Sojabohnenblättern erhalten.
-
Fragmente
des fad2D-Promotors stellten auch Expression von GUS bereit. Der
fad2D-Promotor aus dem
pMB179-Konstrukt (685 bp, Nukleotide 5113–5796 von SEQ ID NR: 4) exprimierte
GUS transient in Blättern
von Brassica in Abhängigkeit
von dem Entwicklungsstadium des Gewebes bis zu einem Grad von 3.
Der fad2D-Promotor aus dem pMB180-Konstrukt (1216 bp, Nukleotide
4581 bis 5796 von SEQ ID NR: 4) exprimierte GUS transient in Blättern von
Brassica in Abhängigkeit
von dem Entwicklungsstadium des verwendeten Gewebes, wobei ein Grad
von 4 erreicht wurde. Die fad2D-Promotoren in den pMB180- und pMB166-Konstrukten
exprimierten GUS transient bei ähnlichen
Niveaus, was vermuten lässt,
dass der Promotor pMB180 alle notwendigen Elemente enthält, um die
Expression von GUS transient zu steuern. Eine leicht niedrigere GUS-Aktivität wurde
unter Verwendung des pMB179-Konstrukts beobachtet, was vermuten
lässt,
dass ein Aktivierungselement oder eine Region entfernt wurde, die
die Promotorstruktur beeinflusst.
-
Als
ein Vergleich wurde die Expression von GUS unter Verwendung des
35S-Promotors untersucht. Der 35S-Promotor exprimiert GUS transient
in Blättern,
Mikrosporenembryonen und kultiviertem Gewebe von Brassica mit Graden
von 5, 1 bzw. 2. Der 35S-Promotor war allerdings nicht in der Lage,
nachweisbare Niveaus von GUS-Aktivität in Wurzeln zu exprimieren
(Tabelle II). Expressionsgrade von 2, 5 und 3 wurden in Mais- und
Weizenblättern,
Sojabohnenblättern
bzw. in Sonnenblumenblättern
beobachtet.
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Sowohl
der fad2D- als auch der fad2F-Promotor in pMB166 und pMB168 steuerten
die transiente Expression eines GUS-Reportergens in verschiedenen
Pflanzengeweben (Tabelle II) in im Allgemeinen gleicher Stärke. Die
vorstehend beschriebene RT-PCR-Analyse zeigte allerdings, dass die
fad2D-Genexpression höher
ist als fad2F. Die Diskrepanz zwischen der endogenen Expression
der fad2D- und fad2F-Gene und der transienten Analyse der fad2D-
und fad2F-Promotoren könnte
in Unterschieden in der Halbwertszeit der endogenen fad2D- und fad2F-Transkripte
begründet
sein. Alternativ könnte
die endogene Expression der fad2D- und fad2F-Transkripte durch die
chromosomale Struktur beeinflusst werden.
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Die
hierin beschriebenen Daten belegen, dass fad2D- und fad2F-Promotoren
funktionstüchtig
sind und verwendet werden können,
um interessierende Gene in allen Pflanzengeweben, sowohl transient
als auch nach stabiler Transformation, zu exprimieren.
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Beispiel 4 – Promotoraktivtät in transgenen
Pflanzen:
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Die
binären
Vektoren pMB177 und pMB178 wurden mit dem GUS-Reportergen unter
der Kontrolle des fad2D- oder fad2F-Promotors konstruiert. Ähnliche
Konstrukte, die Nukleinsäuremoleküle enthalten,
die HPH, NPTII oder PAT kodieren, können hergestellt werden.
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Die
stabile Integration in Canolapflanzen wird mit binären Konstrukten,
die oben beschrieben sind, unter Verwendung von Agrobacterium-Transformation
durchgeführt.
Die transgenen Pflanzen werden auf GUS-Aktivität in verschiedenen Geweben
bei verschiedenen Entwicklungsstadien evaluiert. Die Expression von
GUS unter der Kontrolle der fad2D- oder fad2F-Promotoren wird mit der
GUS-Expression ohne Promotor und mit der GUS-Expression unter der Kontrolle eines
Napinpromotors unter Verwendung des gleichen Vektorrückgrats
verglichen. Die Transformanten, die unter Verwendung binärer Konstrukte
mit HPH, NPTII oder PAT hergestellt wurden, werden auf hygromycin-,
kanamycin- oder
glufosinathaltigen Medien selektioniert. Hygromycin-, kanamycin-
oder glufosinatresistente Transformanten wurden in Pflanzen eingeführt und
gingen in das Zuchtprogramm ein.
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Andere Ausführungsformen
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Es
sollte verstanden werden, dass die vorstehende Beschreibung dazu
beabsichtigt ist, die Erfindung darzustellen und nicht in dem Umfang
zu beschränken,
der durch den Umfang der angehängten
Ansprüche definiert
wird, wobei die Erfindung im Zusammenhang mit ihrer ausführlichen
Beschreibung beschrieben wurde. Andere Aspekte, Vorteile und Modifikationen
sind im Umfang der folgenden Ansprüche.
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