MX2008014656A - Antagonistas de las quimiocinas cxc-elr de alta afinidad. - Google Patents

Abstract

La presente invención provee novedosas secuencias polipeptídicas, métodos para la producción de las mismas y usos de las mismas para novedosas agonistas y antagonistas del receptor de quimiocinas CXC-ELR.

Description

ANTAGONISTAS DE LAS QUIMOCINAS CXC-ELR DE ALTA AFINIDAD CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere al campo de los antagonistas del receptor de quimocina CXC.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las quimocinas CXC que poseen el motivo ácido glutámico-leucina-arginina (ELR) de señalización de receptor (por ejemplo, 1 CXCL1/GROa, CXCL8/IL-8; Baggiolini, M., 1998, Nature, 392:565-568), son importantes para la afluencia de células inflamatorias que median gran parte de la patología en múltiples situaciones que incluyen el daño de ¡squemia-reperfusión (Sekido, N. y otros, 1993, Nature, 365:654-657; Villard, J. y otros, 1995, Am. J. Hespir. Crit. Care Meó. 152:1549-1554), síndrome de dificultad respiratoria aguda inducida por endotoxemia (ARDS; Mukaida, N. y otros, 1998, Inflamm. fíes. 47 supl. 3):S151 -157), artritis, y glomerulonefritis del tipo de complejo inmune (Harada, A. y otros, 1996, Inflamm. fíes. 2:482-489). Por ejemplo, las enzimas hidrolíticas liberadas inadecuadamente y las especies de oxígeno reactivas de los neutrofilos activados inician o perpetúan los procesos patológicos. Por otra parte, durante la mayoría de las infecciones bacterianas esta respuesta de quimocina representa una primera línea de defensa crítica.

Pero incluso aquí, las respuestas de quimocina CXC ELR+, mediante su capacidad para activar células inflamatorias que despliegan los receptores CXCR1 y CXCR2, pueden exacerbar la patología. Por ejemplo, durante punción cecal experimental y sepsis de ligación, la neutralización de MIP-2 reduce la mortalidad del ratón de 85% a 38% (Walley, K. R. y otros, 1997, Infect. Immun. 65:3847-3851 ). Los tratamientos experimentales que eliminan los neutrofilos circulantes alivian la patología de la mannheimiosis neumónica (Slocombe, R. y otros 1985, Am. J. Vet. Res. 46:2253), en donde la expresión de CXCL8 en las vías respiratorias afecta variablemente la quimioatracción de neutrofilos (Caswell, J. L. y otros, 1997, Vet. Pathol. 35:124-131 ; Caswell, J. L. y otros, 2001 , Cañad. J. Vet. Res. 65:229-232). A pesar de la importancia crítica de estas respuestas de quimocina en muchas situaciones, las respuestas de células inflamatorias caprichosas son suficientemente dañinas para que el desarrollo de herramientas terapéuticas con las cuales se puedan bloquear las quimocinas ELR+, se haya convertido en una prioridad de investigación (Baggiolini, M., y B. Moser. 1997, J. Exp. Med. 186:1 189-1 191 ). Las quimocinas 'ELR' atraen químicamente y activan las células inflamatorias por medio de sus receptores CXCR1 y CXCR2 (Baggiolini, 1998; Ahuja, S. K., y P. M. Murphy, 1996, J. Biol. Chem. 271 :20545-20550). La mayoría de los mamíferos expresan ortólogos (genes de especies diferentes que evolucionan de un gen ancestral común por la evolución de las especies) de los receptores CXCR1 y CXCR2 y las quimocinas 'ELR'. La similitud de secuencias entre estos genes homólogos (genética o funcionalmente relacionados) es alta; más alta todavía cuando se consideran sustituciones de aminoácidos conservativas. El ratón y la rata son excepciones en donde estas especies no tienen genes CXCR1 , y su equivalente CXCL8 es muy divergente del de otros mamíferos. La interleucina 8 (CXCL8) no es específica de especie, ya que la proteína CXCL8 de una especie puede ser funcional en otras especies (Rot, 1991 , Cytokine 3: 21 -27). El CXCR1 es específico para CXCL8 y CXCL6/proteína quimiotáctica de granulocito 2 (GCP-2), mientras que CXCR2 se une a CXCL8 con alta afinidad, pero también la proteína inflamatoria de macrófago 2 (MIP-2), CXCL1 , CXCL5/ENA-78 y CXCL6, con afinidades un poco más bajas (véase por ejemplo, Baggiolini y Moser, 1997). La señalización de CXCL8 en líneas de células transfectadas con el CXCR1 o CXCR2 humano induce respuestas quimiotácticas equipotentes (Wuyts, A. y otros 1998, Eur. J. Biochem. 255:67-73; Richardson, R. y otros 1998, J. Biol. Chem. 273:23830-23836), y aunque los cambios de Ca++ libre citosólico en los neutrofilos y la desgranulación celular en respuesta a CXCL8 también son mediados por los dos receptores, la explosión respiratoria y la activación de fosfolipasa D dependen exclusivamente del CXCR1 , según se informa (Jones, S. A. y otros 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 93:6682-6686.). Por otra parte, se ha informado que un antagonista no peptídico del CXCR2, pero no el CXCR1 , antagoniza la quimiotaxis de neutrofilos mediada por CXCL8, pero no la activación celular (White, J. R. y otros, 1998, J. Biol. Chem. 273:10095-10098). Finalmente, existe evidencia abundante de que más frecuentemente las quimocinas son expresadas redundantemente durante las respuestas inflamatorias (véase, por ejemplo, Caswell y otros, 1997). Sin embargo, a pesar de la investigación activa en el campo, no se conocen en la técnica anterior antagonistas de quimocina CXC que sean eficaces para suprimir la actividad adversa de células inflamatorias inducida por cualquier receptor de quimocina CXC-ELR.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Las composiciones de la presente invención incluyen proteínas agonistas y antagonistas de quimocina CXC-ELR novedosas que son capaces de unirse a los receptores CXCR1 o CXCR2 en células de mamífero. Estos incluyen agonistas y antagonistas que son capaces unirse con alta afinidad, en donde "alta afinidad" se refiere a una afinidad del agonista o antagonista por el receptor suficiente para que pueda bloquear al agonista de quimocina de tipo silvestre bajo concentraciones fisiológicamente relevantes. Las proteínas antagonistas novedosas también incluyen aquellas que son sustancialmente equivalentes (esto es, aquellas que contienen sustituciones, adiciones y supresiones de aminoácido que no suprimen las funciones de unión de CXCR1 y CXCR2) a la proteína CXCL8 bovina o humana de tipo silvestre (ilustrada aquí como las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 2), y que también llevan residuos de aminoácido amino-terminales modificados junto con sustituciones de Lys11 con Arg y Gly31 con Pro (SEQ ID NO: 6). También se incluyen análogos de esta CXCL8(3. 74) 11 R/G31 P bovina, particularmente CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P/P32G (SEQ ID NO: 7) y CXCL8(3.74)K11 R/T12S/H13F/G31 P (SEQ ID NO: 8). Otras composiciones de la invención son polinucleótidos y polipéptidos novedosos relacionados con estas proteínas. En otras modalidades, se proveen secuencias de nucleótidos derivadas de las secuencias de aminoácidos. Además, la invención incluye vectores que comprenden los polinucleótidos novedosos, y vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos novedosos asociados operativamente con secuencias reguladoras que controlan la expresión de los polinucleótidos. Similarmente, se incluyen en la invención fusiones de genes que comprenden asas de afinidad y los polinucleótidos novedosos, igual que los vectores resultantes y vectores de expresión que contienen dichas fusiones de gen. La invención también incluye hospederos construidos por ingeniería genética para contener los polinucleótidos novedosos y también hospederos construidos por ingeniería genética para contener los polinucleótidos novedosos asociados operativamente con secuencias reguladoras, esto es, asociadas con secuencias reguladoras de modo que las secuencias reguladoras controlen la expresión de los polinucleótidos novedosos. También se incluyen hospederos que contienen fusiones de genes asociadas con secuencias reguladoras de modo que las secuencias reguladoras controlen la expresión de las fusiones de genes, o en ausencia de dichas secuencias reguladoras. Estos hospederos pueden ser virus o células, en donde estas últimas incluyen, sin limitación, bacterias, levaduras, protozoarios, hongos, algas, células de planta y células de animal, y organismos superiores derivados de las mismas. Adicionalmente, la invención comprende los usos de los polipéptidos novedosos para tratar patologías mediadas por citocinas CXC, que incluyen los receptores CXCR1 o CXCR2 en los mamíferos. Similarmente, la invención incluye métodos de tratamiento de patologías mediadas por quimocina CXC-ELR que incluyen los receptores CXCR1 o CXCR2, que comprenden administrar al mamífero afectado una cantidad efectiva de uno de los polipéptidos novedosos. También se incluyen en la invención composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad biológicamente activa de uno de los polipéptidos novedosos. También se incluyen en la invención métodos de producción y purificación de los polipéptidos novedosos. En un aspecto de la invención, se provee un péptido purificado o aislado que tiene o que comprende una secuencia de aminoácidos de: XELRCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLX PXXXWVQXXV XXFXKXXEXX XX (SEQ ID NO: 3), en donde X es cualquier aminoácido. En otra modalidad de la invención, se provee un péptido aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos de: XELRCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLX PXXXWVQXXV XXFXKXXEXX2X3X4 en donde ?? , X2, X3 y X son independientemente de 0 a 10 residuos de aminoácido y X es cualquier aminoácido. En otra modalidad de la invención, se provee un péptido aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos de: Xi ELRCXeCIRXioXiiSXi3PFX16PKXi9l X21 EX23X24X25IX27SPP HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX5o PX52X53X54WVQX58X59V X61X62FX64KX66X67EX69 7o 7iX72 (consenso definido SEQ ID NO: 4) en donde: Xi es 0-10 aminoácidos; X6 es Q, E o L; Xn es H o Y; X16 es H o N; X25 es V o A; X27 es D o E; X42 es S o V o T o F; X43 es D o N; X5o es D o N; X52 es K o H; X53 es E o Q o T; X58 es R o K o I; X67 es A o T; X69 es S o N o K o G; X70 es Q o S o K, o se suprime; X71 es N o D, o se suprime; y X72 es P o A o S, o se suprime. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se provee un péptido aislado que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos como se indica en cualquiera de las siguientes: GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDG RELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P - SEQ ID NO: 10); KELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRE LCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P (0) - SEQ ID NO: 1 1 ); ELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGREL CLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P (-1 ) - SEQ ID NO: 12); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSD GRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRÁENS (hG31 P (+2) - SEQ ID NO: 13); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIV KLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P (+6) - SEQ ID NO: 14); GSTELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDG RELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P K3T - SEQ ID NO: 15); GSKELRCQCIRTHSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSD GRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P Y 3H - SEQ ID NO: 16); GSKELRCQCIRTYSTPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDG RELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P K15T (0) - SEQ ID NO: 17); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCENTEIIVKLSD GRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P A35E(0) - SEQ ID NO: 18); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANSEIIVKLSD GRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P T37S (0) - SEQ ID NO: 19); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLTDG RELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P S44T (0) - SEQ ID NO: 20); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSD GDELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P R47D (0) - SEQ ID NO: 21 ); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSD GRELCLDPKEKWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P N56K(0) - SEQ ID NO: 22); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSD GRELCLDPKENWVQKVVEKFLKRAENS (hG31 P R60K (0) - SEQ ID NO: 23); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSD GRELCLDPKENWVQRVVEVFLKRAENS (hG31 P K64V (0) - SEQ ID NO: 24); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSD GREVCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P L49V - SEQ ID NO: 25); GSKELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTD GRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P T3K- SEQ ID NO: 26); GSTELRCQCIRTYSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDG RELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P H13Y - SEQ ID NO: 27); GSTELRCQCIRTHSKPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTD GRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P T15K - SEQ ID NO: 28); GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCANSEIIVKLTDG RELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P E35A - SEQ ID NO: 29); GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENTEIIVKLTDG RELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P S37T - SEQ ID NO: 30); GSMGGSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIV KLTDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P (+6) - SEQ ID NO: 31 ); GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDG RELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P (+2) - SEQ ID NO: 32); TELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRE LCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG3 P (+0) - SEQ ID NO: 33); ELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGREL CLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P (-1) - SEQ ID NO: 34); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIV KLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hK11 R (+6) - SEQ ID NO: 35); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCENTEIIV KLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hK11 RG31 P A35E(+6) - SEQ ID NO: 36); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANSEIIV KLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hK1 1 RG31 P T37S (+6) -SEQ ID NO: 37); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIV KLTDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hK1 1 RG31 P S44T (+6) -SEQ ID NO: 38); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIV KLSDGDELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hK11 RG31 P R47D (+6) -SEQ ID NO: 39); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIV KLSDGREVCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hK11 RG31 P L49V - SEQ ID NO: 40); GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTNG NEVCLNPKEKWVQKVVQVFVKRAEKQDP (3-74 K1 1 RG31 P (+2) bovina -SEQ ID NO: 41 ). De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se provee una secuencia de polinucleotido aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de: XT ELRCXC I RX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLX PXXXWVQXXV XXFXKXXEXX2X3X4 en donde Xi, X2, X3 y X4 son independientemente 0-10 residuos de aminoácido y X es cualquier aminoácido. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se provee una secuencia de polinucleotido que codifica una secuencia de aminoácidos de: XiELRCX6CIRXi0 XiiSX13PFX16PKX19l X21 EX23X24X25IX27SPP HCX33NX35EI I VK LX42X43GX45EX47CLX50PX52X53X54WVQX58X59V X61X62FX64KX66X67EX69X70X71X72 (SEQ ID NO: 4) en donde: Xi es 0-10 aminoácidos; X6 es Q, E o L; X19 es F o Y o L; X23 es L o M; X24 es R o T; X27 es D o E; X62 es K o I o V o A; X6g es S o N o K o G; X70 es Q o S o K, o se suprime; ?p es N o D, o se suprime; y X72 es P o A o S, o se suprime. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se provee un polinucleotido aislado que consiste esencialmente en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos como se indica en cualquiera de las SEQ ID NO: 10-41. En otro aspecto de la invención, se provee una célula transgénica que comprende un polinucleotido como el que se describe arriba. El polinucleotido puede ser no nativo. En otro aspecto de la invención, se provee un hospedero viral construido por ingeniería genética para comprender un polinucleotido como el que se describe arriba. En un aspecto adicional de la invención, se provee un vector de expresión que comprende el polinucleotido que se describe arriba, enlazado operativamente a una secuencia reguladora que controla la expresión de dicho polinucleotido en un hospedero adecuado. En un aspecto adicional de la invención, se provee una célula hospedera que comprende el vector de expresión que se describe arriba. En otro aspecto de la invención, se provee el uso del péptido que se describe arriba en la fabricación de un medicamento para tratar una patología mediada por la quimocina CXC. En otro aspecto de la invención, se provee un método de tratamiento de una patología mediada por la quimocina CXC, que comprende administrar a un individuo en necesidad de dicho tratamiento, una cantidad efectiva de un péptido como el que se describe arriba.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figuras 1 A-1 B. El análogo G31 P de CXCL8(3-74)K1 1 R es un potente inhibidor de la unión de CXCL8 a los neutrófilos de sangre periférica. Figura 1 A: neutrófilos de sangre periférica bovina (87-93% de pureza) se expusieron a 4 °C durante 2 horas a análogos de CXCL8(3.74)K1 1 R (10 ng/ml), o a medio solo (med); después se lavaron y se incubaron similarmente con CXCL8 biotinilada (bi0,CXCL8; 1000 ng/ml o 129 nM). Estas concentraciones de CXCL8 se aproximan a las encontradas en los tejidos de pulmón de animales con pasteurelosis neumónica (referencias 8 y 9). El grado de unión de l0tCXCL8 a las células se determinó usando tecnología ELISA. Las sustituciones de aminoácidos representadas dentro de CXCL8(3.74)K1 1 R incluyeron: G31 P; P32G; T12S/H13P/G31 P; y T12S/H13P/G31 P/P32G. El análogo G3 P, pero no el P32G, fue un antagonista altamente efectivo de la unión de CXCL8 a las células. Con los análogos G31 P y P32G, las sustituciones adicionales T12S y H13F redujeron sus actividades antagonistas de CXCL8. Figura 1 B: los neutrófilos se expusieron simultáneamente durante 45 minutos a 4 °C a concentraciones variables de CXCL8(3-74)K R/G31 P, o CXCL8 no marcada y 20 pM de 125ICXCL8. Esta concentración de 125I-CXCL8 se escogió como la saturación cercana para los receptores de CXCL8 de alta afinidad de la célula (datos no mostrados). Las concentraciones de 125l-CXCL8 asociadas a la célula se evaluaron usando un contador. Los datos indican claramente que CXCL8(3-74)K11 R/G31 P tenía una afinidad sustancialmente más alta por los neutrófilos que CXCL8. Figuras 2A-2B. CXCL8(3-74)K11 R/G31 P no es un agonista de las respuestas de quimioatracción de neutrófilos o liberación de glucuronidasa. CXCL8 y los análogos G31 P, P32G, o combinados G31 P/P32G de CXCL8(3- 74)K1 1 R, se probaron para determinar su afinidad agonista de neutrófilos, usando neutrófilos de sangre periférica bovina recién purificados. Figura 2A: las respuestas quimiotácticas a cada proteína se probaron en pruebas de microquimiotaxis de 30 minutos y los resultados se expresaron como el número medio (+/-SEM) de células /campo de microscopio en objetivo 40x, como se indica en la sección de métodos. Los análogos G31 P y G3 P/P32G exhibieron poca actividad quimiotáctica discemible, mientras que el análogo P32G estimuló respuestas sustanciales a 100 ng/ml. Figura 2B: los neutrófilos se expusieron a dosis variables de cada análogo durante 30 minutos, después los productos de secreción celular se analizaron para determinar la glucuronidasa usando el substrato cromogénico p-nitrofenil-D-glucurónido, como se presenta en la sección de métodos. Las reservas celulares totales de glucuronidasa se determinaron de alícuotas de células lisadas con Triton-X-100. La liberación de enzima de cada tratamiento se expresó como el porcentaje de las reservas celulares totales. Ninguno de los análogos tuvo actividad agonista sustancial, aunque la CXCL8 misma no induce liberación significativa de enzima. El tratamiento de control positivo con 12,13-miristato-acetato de forbol y ionóforo de calcio A23187, indujo 42% +/-6% de liberación de enzima. Figura 3. CXCL8(3-74)K11 R-G31 P es un antagonista altamente efectivo de la quimioatracción de neutrófilos mediada por quimocina CXC-ELR. La capacidad de CXCL8(3.74)K1 1 R/G31 P para bloquear las respuestas quimiotácticas de neutrófilos bovinos a varias quimocinas CXC-ELR se midió usando pruebas de microquimiotaxis de 20 minutos. (Panel izquierdo) las células se expusieron simultáneamente a CXCL8 (1 pg/ml) y diversas concentraciones del análogo. El número de células que respondió a la CXCL8 se determinó por conteo directo de las membranas de prueba de quimiotaxis, como en las figuras 2A-2B. CXCL8(3.74)K1 1 R/G31 P fue un inhibidor competitivo altamente efectivo de las respuestas celulares a CXCL8. (Panel medio) curvas de dosis-respuesta para la quimioatracción de neutrófilos bovinos por CXCL1 , CXCL5, o CXCL8 humanas. Cada quimocina exhibió un patrón de actividad bifásica, con máximos a 1-10 ng/ml y a 1 pg/ml. (Panel derecho) la capacidad de CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P para bloquear las respuestas de las células a 1 ng/ml de CXCL5 o CXCL1 humana o 10 ng/ml de CXCL8 humana se determinó como arriba. CXCL8(3-74)K11 R/G31 P antagonizó eficazmente cada quimocina CXC-ELR, lográndose la inhibición completa con 3-20 nM de CXCL8(3-74)K11 R/G31 P. Figuras 4A-4B. CXCL8(3-74)K11 R-G31 P bloquea las actividades quimioatrayentes de CXCL8 y no-CXCL8 expresados en las vías respiratorias neumónicas o en la mastitis inducida por endotoxina. Los efectos del anticuerpo monoclonal anti-IL8 8B6, o de CXCL8(3-74)K11 R-G31 P, sobre las respuestas de neutrófilo a los quimioatrayentes expresados en las vías respiratorias de animales con pasteurelosis neumónica o en las cisternas mamarias de reses con mastitis inducida por endotoxina, se determinaron como en la figura 3. Figura 4A: fluidos de lavado bronquioalveolar (FLBA) diluidos (1 :10) de lóbulos de pulmón lesionados de reses neumónicas (neumonía), o fluidos de lavado de cisterna de ubre de reses con mastitis (mastitis) se probaron como tal (solo) o después de tratamiento con mAb anti-CXCL8 8B6 (5 pg/ml) o CXCL8(3-74)K11 R/G31 P (G31 P; 1 o 10 ng/ml), para determinar sus actividades quimiotácticas en comparación con medio solo. Con ambas muestras, los anticuerpos mAb 8B6 por si solos neutralizaron 74% de las actividades quimiotácticas en las muestras, mientras que CXCL8(3- 74)K11 R/G31 P redujo las respuestas en 93-97%. Figura 4B: para confirmar estos resultados usando una estrategia alternativa, los presentes autores absorbieron los fluidos de LBA de lesión con matrices de inmunoafinidad de anticuerpo monoclonal 8B6, removiendo >99% de su contenido de CXCL8, y después probaron sus actividades quimiotácticas residuales y la capacidad de CXCL8(3-74)K11 R/G31 P para antagonizar estas actividades quimiotácticas residuales no-CXCL8. Hubo en las muestras una inhibición dependiente de la dosis de las actividades quimiotácticas totales y residuales, indicando que los quimioatrayentes tanto CXCL8 como no-CXCL8 son expresados en estas lesiones. Figura 5. CXCL8(3-74)K1 1 R-G31 P puede eliminar las respuestas inflamatorias inducidas por endotoxina in vivo. Se probaron becerros Holstein de dos semanas de edad para determinar sus respuestas inflamatorias neutrofílicas a la provocación de endotoxina intradérmica (1 pg/sitio), antes y a diferentes tiempos después de inyección intravenosa (i.v.), subcutánea (subcutan.), o intramuscular (i.m.) de CXCL8(3.74)K1 R-G31 P (75 pg/kg). Se obtuvieron 15 biopsias del sitio de reacción de endotoxina por hora a las 0, 16, 48 y 72 horas después de tratamiento, y se procesaron para evaluación histopatológica de la respuesta de neutrofilos, determinada por conteo de los neutrofilos en nueve campos de microscopio de objetivo 40x por sección, (panel izquierdo) microfotografías de las respuestas de tejido a la provocación de endotoxina alrededor de los vasos sanguíneos dentro de la dermis reticular antes de tratamiento (0 h) y después de tratamiento (48 h). Grandes cantidades de neutrofilos se acumularon alrededor de la vasculatura dentro de la dermis reticular en los tejidos de pretratamiento pero no después del tratamiento, (panel medio) representación gráfica de las respuestas de neutrofilos a la provocación de endotoxina antes (0 h) o después (16, 48, 72 h) del suministro de CXCL8(3-74)K1 1 R-G31 P por cada vía; ** o *** = p 0.01 o 0.001 , respectivamente, con respecto a las respuestas de pretratamiento de control interno. Figuras 6A-6B. Se evaluaron eosinófilos purificados de la sangre de donadores asmáticos atópicos o no asmáticos atópicos (figura 6A), o de un sujeto con hipereosinofilia (figura 6B), para determinar sus respuestas a CXCL8 humana recombinante, CXCL5, o CCL11 , en presencia o ausencia de las dosis indicadas de CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P (G31 P) bovina recombinante. Bajas dosis de G31 P fueron capaces de bloquear las respuestas de estas células a cada uno de los ligandos de CXCR1 y CXCR2, pero no tuvieron efecto sobre las respuestas de eosinofilo al ligando de CCR3 no relacionado CCL1 1/eotaxina. Figura 7. Neutrófilos de la sangre periférica de un donador sano se probaron para determinar sus respuestas a CXCL8 o CXCL5 humanas recombinantes en presencia o ausencia de CXCL8(3.74)K1 1 R/G31 P bovina (G31 P; 10 ng/ml). G31 P bloqueó las respuestas de neutrófilos a los dos ligandos. Figura 8. Caracterización física de las isoformas de hbG31 P. Figuras 9A-9B. Comparación de bG31 P y hbG31 P (antagonismo de CXCL8). Figuras 10A-10B. Figura 10A: los análogos de hbG31 P no son agonistas de neutrófilo. Figura 10B: actividad antagonista de hbG31 P. Figuras 1 A- 1 B. Efecto de la secuencia carboxi-terminal de hbG31 P sobre sus actividades antagonistas. Figuras 12A-12C. Agonista y análogos de CXCL8 -actividades de las construcciones. Figura 13. Comparación de las actividades antagonistas de bG31 P y hG31 P+6.

Figura 14. hG31 P antagoniza con ENA78, un ligando específico de CXCR2. Figura 15. hG31 P antagoniza la liberación de ROI inducida por CXCL8. Figura 16. hG31 P antagoniza las actividades quimiotácticas de neutrófilos en el esputo de pacientes de bronquiectasia y fibrosis quística. Figura 17. hG31 P reduce la inflamación pulmonar en ratones endotoxémicos. Figura 18. Efecto de hG31 P en endotoxemia mórbida de las vías respiratorias en conejillos de indias. Figura 19. Efecto de varias isoformas de hG31 P (y hbG31 P) sobre la patología de endotoxemia de las vías respiratorias en conejillos de indias. Figura 20. Efecto de varias isoformas de hG31 P (y hbG31 P) sobre la patología de endotoxemia de las vías respiratorias en conejillos de indias. Figuras 21A-21 B. Efecto de los mutantes de hbG31 P sobre el bloqueo de la respuesta a IL-8 humana y GROa de afluencia de Ca intracelular en neutrófilos humanos (PMN). Se determinó la actividad de hbG31 P y la actividad de sus mutantes sobre el bloqueo de la liberación de Ca intracelular [Ca]¡ de PMN estimulada por IL-8 y GROa humanas. Se incubaron 100 ng/ml de bG31 P, hbG31 P y hbG31 P mutantes con 2 µ? de Fluo-4 AM teñidos con 2 x 105 PMNs durante 15 minutos, después se estimularon con 100ng/ml de IL-8 o GROa. Después se leyó la fluorescencia de las muestras con un fluorómetro. Los datos se expresaron como el área de las mediciones de [Ca]¡. Generalmente, los mutantes de hbG31 P y también hbG31 P, bG31 P mostraron actividad agonista efectiva sobre [Ca]¡ de PMN estimulado por IL-8 y GROa. Figura 22. Los mutantes hbG31 P mostraron diferentes efectos sobre el bloqueo de la emigración de PMN al sitio de inflamación en una prueba de piel estimulada con LPS. Se evaluó la actividad antagonista de hbG31 P y sus mutantes para bloquear la infiltración de PMN en el sitio de inflamación estimulada por LPS. Los datos se expresaron como el porcentaje del número bloqueado de PMN en el campo 40x del microscopio en el tejido subcutáneo e intradérmico tratado con 0.5 pg de LPS y 250 pg/ml de bG31 P, hbG31 P, o sus mutantes en el número de PMN en el sitio de inflamación tratado solo con LPS. Los datos muestran claramente que hbG31 P tiene igual actividad bloqueadora con bG31 P. H13Y mostró actividad antagonista mucho mejor que T3K, E35A. T15K mostró un efecto ligero sobre el bloqueo. Mientras tanto, S37T no muestra ninguna actividad antagonista.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Las siguientes abreviaciones se usan en toda esta descripción: ARDS, síndrome de dificultad respiratoria aguda; FLBA, fluido de lavado bronquioalveolar; BHR, reactivo de Bolton-Hunter; CXCR1 , CXCR2, receptores de CXCL8 A, B, respectivamente; ELR, motivo de ácido glutámico-lisina-arginina; CXCL1 , oncogen alfa relacionado con el crecimiento; CXCL4, factor de plaqueta 4; CXCL5, activador de neutrófilo 78 derivado del epitelio; CXCL6, proteína quimiotáctica 2 de granulocito; CXCL8, interleucina 8; fMLP, tripéptido bacteriano formil-metionil-leucilprolina; IPTG, isopropil-tio-D-galactopiranósido; MIP-2, proteína inflamatoria 2 de macrófago; PMSF, fluoruro de fenilmetilsulfonilo; TMB, tetrametilbencidina). Como se usa aquí, "un agonista" se refiere a un agente que activa una célula. Como se usa aquí, un "antagonista" se refiere a un agente que impide que la célula se active en presencia o ausencia del agonista. Como se usa aquí, "purificado" no require pureza absoluta sino que más bien se considera como una definición relativa. Por ejemplo, se contempla expresamente dentro de la definición de "purificado" la purificación del material inicial o material natural a por lo menos un orden de magnitud, preferiblemente 2 o 3 órdenes de magnitud. Como se usa aquí, el término "aislado" requiere que el material sea removido de su medio original. Como se usa aquí, el término "tratamiento" en sus diversas formas gramaticales se refiere a prevenir, curar, revertir, atenuar, aliviar, minimizar, suprimir o detener los efectos nocivos de un estado patológico, el avance de la enfermedad, el agente causante de la enfermedad u otra condición anormal.

Como se usa aquí, "una cantidad efectiva" es una cantidad que es suficiente para obtener el resultado deseado. Como será apreciado por el experto en la materia, desde luego, dicha cantidad depende de la edad, peso y condición del individuo tratado. Cuando el truncamiento amino terminal de CXCL8 bovina se combina con una sustitución de lisina a arginina en el aminoácido 1 1 (es decir, CXCL8(3-74) 1 1 R), son evidentes incrementos notables en la afinidad de los receptores CXCR1 y CXCR2, de tal manera que CXCL8(3-74)K1 1 R inhibe competitivamente la unión de múltiples ligandos a los dos receptores (L¡, F., y J. R. Gordon. 2001 . Biochem. Biophys. Res. Comm. 286:595-600, que se incorpora aquí como referencia). Mayor truncamiento en el motivo ELR de señalización de receptor (por ejemplo, los aminoácidos 4-6 de CXCL8 humana) de algunas quimocinas CXC, puede transformarlas en antagonistas del receptor suaves (CXCL8(6-72)) a moderados (CXCL1 (8-73)) (McColl y Clark Lewis 1999; Moser, B. y otros 1993. J. Biol. Chem. 268:7125-7128). Como se usa aquí, la introducción en la CXCL8(3.74)K1 1 R bovina de una segunda sustitución de aminoácido, glicina 31 , a un residuo de prolina (es decir, CXCL8(3-74) 1 1 R/G31 P), hace a este análogo de CXCL8 un antagonista de afinidad muy alta de las respuestas de quimocina CXC-ELR bovinas y humanas. Antagoniza completamente todo el arreglo de las quimocinas CXC-ELR expresadas dentro de focos inflamatorios inducidos por bacterias o endotoxinas y bloquea la inflamación inducida por endotoxina in vivo. Aunque parte de la siguiente exposición trata principalmente con neutrófilos de bovino, otras células inflamatorias de mamífero (incluyendo humano) también despliegan receptores CXCR1 y CXCR2 (véase por ejemplo, Benson, M. y otros 1999. Pediatr. Allergy Immunol. 10:178-185) y por lo tanto son vulnerables a la inhibición por CXCL8(3.74)K1 1 R/G31 P. Por consiguiente, la presente invención tiene amplia aplicación a las patologías mediadas por quimocina CXC-ELR de mamífero. Como entenderá el experto en la materia, en la nomenclatura utilizada en la presente, "3-74" se refiere al hecho de que el péptido CXCL8 nativo es de 74 aminoácidos de longitud ('74') y los primeros dos aminoácidos han sido cortados, lo que significa que la secuencia de péptido "empieza" en el aminoácido #3 de la secuencia nativa. Para consistencia de nomenclatura, los aminoácidos son referidos por el número basado en la secuencia de tipo silvestre y por lo tanto "G31 P" se refiere a la sustitución de glicina del aminoácido #31 de la secuencia de tipo silvestre con prolina. Como apreciará el experto en la materia, con respecto a la SEQ ID NO: 1 , la prolina es de hecho el 29° aminoácido en vista de la supresión de los primeros dos aminoácidos. En otras modalidades de la invención se proveen proteínas antagonistas de quimocina CXC-ELR que son capaces de unirse a los receptores CXCR1 y CXCR2 en células inflamatorias de mamífero. En una modalidad preferida, estos péptidos son sustancialmente equivalentes a un péptido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1 , en donde como apreciará el experto en la materia, sustancialmente equivalente significa que estos péptidos tienen una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 60% idéntica, o por lo menos 65% idéntica, o por lo menos 70% idéntica, o por lo menos 71 %, o por lo menos72 % idéntica, o por lo menos 73% idéntica, o por lo menos 74% idéntica, o por lo menos 75% idéntica, o por lo menos 76% idéntica, o por lo menos 77% idéntica, o por lo menos 78% idéntica, o por lo menos 79% idéntica, o por lo menos 80% idéntica, o por lo menos 81% idéntica, o por lo menos 82% idéntica, o por lo menos 83% idéntica, o por lo menos 84% idéntica, o por lo menos 85% idéntica, o por lo menos 86% idéntica, o por lo menos 87% idéntica, o por lo menos 88% idéntica, o por lo menos 89% idéntica, o por lo menos 90% idéntica, o por lo menos 91% idéntica, o por lo menos 92% idéntica, o por lo menos 93% idéntica, o por lo menos 94% idéntica, o por lo menos 95% idéntica, a una proteína CXCL8 de tipo silvestre (ilustrada aquí como la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2) y también tiene un truncamiento de los primeros dos residuos de aminoácido junto con las sustituciones de Lys 11 con Arg y Gly31 con Pro. Como será apreciado por el experto en la materia, en muchas modalidades estos péptidos serán de aproximadamente 69, 70 o 72 aminoácidos de largo, como se expone más abajo. Sin embargo, en otras modalidades los péptidos que se describen arriba pueden incluir supresiones o inserciones de 1 , 2, 3, 4, 5, 6 o más aminoácidos. Como apreciará el experto en la materia, se pueden predecir regiones de un péptido que pueden tolerar una inserción o supresión, de la estructura tridimensional de un péptido o por comparación de secuencias de organismos relacionados.

Por ejemplo, haciendo referencia al cuadro 1 que muestra la alineación de péptido de la secuencia de CXCL8 de tipo silvestre de varias especies, incluyendo bovino, humano, mono rhesus, oveja, perros y cerdo, una de las secuencias de cerdo incluye un aminoácido adicional insertado entre lo que corresponde a los aminoácidos 60 y 61 de la secuencia bovina de tipo silvestre, indicando que este es un sitio que probablemente tolera inserciones de uno o más aminoácidos en otras especies. Similarmente, en las secuencias de humano y cerdo, 2 y 3 aminoácidos, respectivamente, están suprimidos en el extremo C con respecto a la secuencia bovina, sugiriendo que la supresión de por lo menos 2-3 aminoácidos del extremo C probablemente también es tolerado en otras especies. Como apreciará el experto en la materia, esto también indica que la adición o sustitución de aminoácidos en el extremo C-terminal de estos péptidos probablemente es tolerada, esto es, no tendría un efecto significativamente negativo sobre la actividad biológica deseada del péptido. Es de notar que es muy conocido que se pueden hacer algunas modificaciones y cambios en la estructura de un polipéptido sin alterar sustancialmente la función biológica de ese péptido, para obtener un polipéptido biológicamente equivalente. En un aspecto de la invención, los péptidos anteriormente descritos pueden incluir péptidos que difieren por sustituciones conservativas de aminoácidos. Los péptidos de la presente invención también se extienden a péptidos biológicamente equivalentes que difieren por sustituciones conservativas de aminoácidos. Como se usa aquí, el término "sustituciones conservativas de aminoácidos" se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro en un sitio dado en el péptido, en donde la sustitución se puede hacer sin pérdida sustancial de la función relevante, en este caso, el pliegue del epítope. Al hacer dichos cambios, se pueden hacer sustituciones de residuos de aminoácido similares basándose en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral, por ejemplo su tamaño, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, etcétera, y mediante las pruebas de rutina se pueden evaluar dichas sustituciones para determinar su efecto sobre la función del péptido. En estas modalidades, la función se refiere a la actividad antagonista de quimocina CXCL8. En algunas modalidades, se pueden hacer sustituciones conservativas de aminoácidos en las que un residuo de aminoácido se sustituye con otro que tiene un valor de hidrofilicidad similar (por ejemplo dentro de un valor de más o menos 2.0), en donde lo siguiente puede ser un aminoácido que tiene un índice hidropático de aproximadamente -1.6, tal como Tyr (-1.3) o Pro (-1.6), que se asigna a los residuos de aminoácido (como se detalla en la patente de EE. UU. No. 4,554,101 , que se incorpora aquí como referencia): Arg (+3.0); Lys (+3.0); Asp (+3.0); Glu (+3.0); Ser (+0.3); Asn (+0.2); Gln (+0.2); Gly (0); Pro (-0.5); Thr (-0.4); Ala (-0.5); His (-0.5); Cys (-1.0); Met (-1.3); Val (-1.5); Leu (-1.8); lie (-1.8); Tyr (-2.3); Phe (-2.5); y Trp (-3.4). En modalidades alternativas, se pueden hacer sustituciones conservativas de aminoácidos en donde un residuo de aminoácido se sustituye con otro que tiene un índice hidropático similar (por ejemplo, dentro de un valor de más o menos 2.0). En dichas modalidades, a cada residuo de aminoácido se le puede asignar un índice hidropático basándose en su hidrofobicidad y características de carga, de la siguiente manera: lie (+4.5); Val (+4.2); Len (+3.8); Phe (+2.8); Cys (+2.5); Met (+1.9); Ala (+1.8); Gly (-0.4); Thr (-0.7); Ser (-0.8); Trp (-0.9); Tyr (-1.3); Pro (-1.6); His (-3.2); Glu (-3.5); Gln (-3.5); Asp (-3.5); Asn (-3.5); Lys (-3.9); y Arg (-4.5). En modalidades alternativas, se pueden hacer sustituciones conservativas de aminoácido en donde un residuo de aminoácido se sustituye con otro de la misma clase, en donde los aminoácidos se dividen en las clases no polar, ácido, básico y neutro, de la siguiente manera: no polares: Ala, Val, Leu, lie, Phe, Trp, Pro, Met; ácidos: Asp, Glu; básicos: Lys, Arg, His; neutros: Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr. En otras modalidades, se pueden hacer sustituciones en donde cualquier aminoácido conocido se sustituye en una posición dada. En algunas modalidades, se pueden sustituir aminoácidos evolutivamente no conservados o débilmente conservados, con cualquier aminoácido, por ejemplo de tamaño similar pero de diferente hidrofobicidad, carga similar pero diferente tamaño, u otros tipos de sustituciones similares, que serán entendidos por el experto en la materia. De esta manera, se pueden construir análogos de CXCL8(3. 74)K11 RG31 P en donde la función biológica deseada es retenida, por inserción, supresión y sustitución de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 6, como se expone en la presente. Además, es de notar que en las SEQ ID NOs. 7-41 se muestran análogos ejemplares. En una modalidad preferida, se preparan análogos sustancialmente equivalentes de CXCL8(3.74)G31 P usando comparaciones de secuencias relacionadas de varias especies, por ejemplo como se muestra en el cuadro 1. Como apreciará el experto en la materia, la sustitución en sitios de aminoácidos altamente variables probablemente es más tolerada que la sustitución en aminoácidos altamente conservados. Por ejemplo, la comparación de las secuencias mostradas en el cuadro 1 , seguida por supresión de los dos aminoácidos N-terminales y la sustitución de glicina 31 con prolina, y glicina 11 con arginina, provee una secuencia de: XELRCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLX PXXXWVQXXV XXFXKXXEXX XX (SEQ ID NO: 3), en donde X es cualquier aminoácido. En algunas modalidades, X es un aminoácido natural. En otra modalidad de la invención, se provee un péptido aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos de: XELRCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLX PXXXWVQXXV XXFXKXXEXX2X3X4 (SEQ ID NO: 42) en donde ??, X2, X3 y X4 son independientemente 0-10 residuos de aminoácido y X es cualquier aminoácido. Esto es, X1 puede ser por ejemplo de 6 aminoácidos aleatorios de largo, mientras que X2, X3 y X4 pueden ser de O aminoácidos de largo, esto es, se pueden eliminar. En otras modalidades, X<[ puede ser 2 aminoácidos no nativos, esto es, no MS (bovino) ni SA (humano), sino cualesquiera otros 2 aminoácidos; X2 puede ser S o Q, y X3 y X4 se pueden eliminar. Alternativamente, X1 puede ser de 0-9 aminoácidos, 0-8 aminoácidos, 0-7 aminoácidos, o 0-6 aminoácidos, o 0-5 aminoácidos, o 0-4 aminoácidos, o 0-3 aminoácidos, o 0-2 aminoácidos, o X1 se puede seleccionar del grupo que consiste en GSK, GST, S, A, T, K, GSMGGSK, y GSMGGST, o X-i se puede eliminar. Es de notar que en algunas modalidades se provee la condición de que el péptido no tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 7, 8 o 9. En otra modalidad de la invención, se provee un péptido aislado o purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de: Xi X21 EX23X24X25IX27SPP HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX50 PX52X53X54WVQX58X59V X61X62FX64KX66X67EX69X70X71X72 (SEQ ID NO: 43) en donde: ?? , X70, X71 y X72 son independientemente 0-10 aminoácidos; y ?d. Xl0> Xl1> l3. Xl6. Xl9> X21 , X23, 24. X25, 27. 33, 35, X 2, X43.

X45, X47, X50. X52. d3> X54, ?dß. ?d9> ?e-? , ?ß2. ?ß4, ?ßß. ?e7, ?TT se seleccionan, cada uno independientemente, del grupo que consiste en A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V y Y.

Alternativamente, ??, X7o, X71 y X72 pueden ser independientemente 0-9 aminoácidos, 0-8 aminoácidos, 0-7 aminoácidos, o 0- 6 aminoácidos o 0-5 aminoácidos, o 0-4 aminoácidos, o 0-3 aminoácidos, o 0- 2 aminoácidos, o X1 se puede seleccionar del grupo que consiste en GSK, 5 GST, S, A, T, K, GSMGGSK y GSMGGST, o se puede eliminar. En otras modalidades, X1 puede ser 2 aminoácidos no nativos, esto es, no MS (bovino) ni SA (humano), sino cualesquiera otros 2 aminoácidos, X7o puede ser S o Q y X7 y X72 se pueden eliminar. Es de notar que en algunas modalidades se provee la condición 10 de que el péptido no tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 7, 8 o 9. En otra modalidad de la invención, se provee un péptido aislado o purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de: X1ELRCX6CIRX10X11SX13PFX16P X19I X21 EX23X24X25IX27SPP : 15 HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX5o PX52X53X54WVQX58X59V ! X61X62FX64KX66X67EX69X70X7 X72 (SEQ ID NO: 4) | en donde Xi es 0-10 aminoácidos; X6 es Q, E o L; 20 Xio es T o l; Xn es H o Y; X16 es H o N; X23 es L o M; X24 es R o T; X33 es V o A o E; X47 es L o V; X5o es D o N; X52 es K o H; X53 es E o Q o T; X62 es K o I o V o A; X64 es L o V; X67 es A o T; X69 es S o N o K o G; X7o es Q o S o K, o se suprime; X71 es N o D, o se suprime; y X72 es P o A o S, o se suprime. Alternativamente, X1 puede ser 0-9 aminoácidos, 0-8 aminoácidos, 0-7 aminoácidos, o 0-6 aminoácidos o 0-5 aminoácidos, o 0-4 aminoácidos, o 0-3 aminoácidos, o 0-2 aminoácidos, o X1 se puede seleccionar del grupo que consiste en GSK, GST, S, A, T, K, GSMGGSK, y GSMGGST, o Xi se puede suprimir. Es de notar que en algunas modalidades se provee la condición de que el péptido no tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 7, 8 o 9. En otra modalidad de la invención, se provee un péptido aislado o purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de: XT ELRCQCI RT X SXi3PFHPKFI KELRVI ESPP HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX50 PKEX54WVQX58VV X6 X62FX64KRAEX69X7oX7iX72 (SEQ I D NO: 4) en donde: X! es GSK, GST, S, A, T, K, GSMGGSK, GSMGGST, o se suprime; Xn es H o Y; X33 es A o E; X42 es S o T; X43 es D o N; X47 es L o V; X50 es D o N; X54 es N o K; X58 es R o K; X64 es L o V; X7o es Q o S, o se suprime; X7i es D, o se suprime; y X72 es P, o se suprime. Es de notar que en algunas modalidades se provee la condición de que el péptido no tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 7, 8 0 9. En otras modalidades, se provee un péptido aislado o purificado que tiene, o que comprende, o que consiste esencialmente, o que consiste en, una secuencia de aminoácidos como la que se indica en cualquiera de las SEQ ID NO: 6-41 , o SEQ ID NO: 10-41. Para una referencia estos aminoácidos son como sigue: TELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTNGNE VCLNPKEKWVQKVVQVFVKRAEKQDP (3-74 K1 1 RG31 P bovina - SEQ ID NO: 6) TELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESGGHCENSEIIVKLTNGN EVCLNPKEKWVQKVVQVFVKRAEKQDP (3-74 K1 1 R P32G bovina - SEQ ID NO: 7) TELRCQCIRSPSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTNGNE VCLNPKEKWVQKVVQVFVKRAEKQDP (3-74 T12SH13PG31 P - SEQ ID NO: 8) TELRCQCIRSPSTPFHPKFIKELRVIESPGHCENSEIIVKLTNGN EVCLNPKEKWVQKVVQVFVKRAEKQDP (3-74 T12SH13PG31 PP32G bovina- SEQ ID NO: 9) GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDG RELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P - SEQ ID NO: 10); KELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRE LCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P (0) - SEQ ID NO: 11); ELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGREL CLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P (-1) - SEQ ID NO: 12); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSD GRELCLDPKENWVQR VVEKFLKRAENS (hG31 P (+2) - SEQ ID NO: 13); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIV KLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P (+6) - SEQ ID NO: 14); GSTELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDG RELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P K3T - SEQ ID NO: 15); GSKELRCQCIRTHSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSD GRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG3 PY13H - SEQ ID NO: 16); GSKELRCQCIRTYSTPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDG RELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P K15T (0) - SEQ ID NO: 17); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCENTEIIVKLSD GRELCLDPKENWVQR VVEKFLKRAENS (hG31 P A35E(0) - SEQ ID NO: 18); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANSEIIVKLSD GRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P T37S (0) - SEQ ID NO: 19); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLTDG RELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P S44T (0) - SEQ ID NO: 20); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSD GDELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P R47D (0) - SEQ ID NO: 21); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSD GRELCLDPKEKWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P N56K(0) - SEQ ID NO: 22); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSD GRELCLDPKENWVQKVVEKFLKRAENS (hG31 P R60K (0) - SEQ ID NO: 23); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSD GRELCLDPKENWVQRVVEVFLKRAENS (hG31 P K64V (0) - SEQ ID NO: 24); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSD GREVCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hG31 P L49V - SEQ ID NO: 25); GSKELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTD GRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P T3K- SEQ ID NO: 26); GSTELRCQCIRTYSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDG RELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P H13Y - SEQ ID NO: 27); GSTELRCQCIRTHSKPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTD GRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P T15K - SEQ ID NO: 28); GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCANSEIIVKLTDG RELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P E35A - SEQ ID NO: 29); GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENTEIIVKLTDG RELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P S37T - SEQ ID NO: 30); GSMGGSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIV KLTDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P (+6) - SEQ ID NO: 31 ); GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDG RELCLDPKENWVQR VVEKFLKRAENS (bhG31 P (+2) - SEQ ID NO: 32); TELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRE LCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P (+0) - SEQ ID NO: 33); ELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGREL CLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (bhG31 P (-1 ) - SEQ ID NO: 34); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIV KLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hK11 R (+6) - SEQ ID NO: 35); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCENTEIIV KLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hK11 RG31 P A35E(+6) - SEQ ID NO: 36); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANSEIIV KLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hK11 RG31 P T37S (+6) -SEQ ID NO: 37); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIV KLTDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hK11 RG31 P S44T (+6) -SEQ ID NO: 38); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIV KLSDGDELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hK11 RG31 P R47D (+6) -SEQ ID NO: 39); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIV KLSDGREVCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS (hK1 1 RG31 P L49V - SEQ ID NO: 40); y GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTNG NEVCLNPKEKWVQKVVQVFVKRAEKQDP (3-74 K11 RG31 P (+2) bovina-SEQ ID NO: 41 ). Como será apreciado por el experto en la materia, "que consiste esencialmente en" como se usa con respecto a los péptidos anteriormente definidos, se refiere al hecho de que los péptidos pueden incluir, por ejemplo, supresiones N-terminales o C-terminales que no afectan materialmente la actividad; esto es, la actividad agonista o antagonista de quimocina CXC-ELR del péptido en cuestión. En una modalidad preferida, el péptido aislado o purificado es como se indica en la SEQ ID NO: 13 (hG31 P+2) o la SEQ ID NO: 14 (hG31 P+6). Como se puede observar, haciendo referencia a las figuras 12A-12C, 19 y 20, y como se expone más abajo, parece que estos péptidos muestran mayor actividad relativa en comparación con hG31 P+0 y hG31 P- . Como se expone en la presente, los polinucleótidos que codifican los péptidos anteriormente descritos están dentro del alcance de la invención y se pueden construir usando medios muy conocidos. Como será apreciado por el experto en la materia, las células o líneas celulares transgénicas que comprenden o que han sido transformadas o transfectadas con dichos polinucleótidos, también están dentro del alcance de la invención como se expone más abajo. Por ejemplo, por medio de ingeniería genética se puede construir un hospedero viral que comprenda el polinucleótido, o usando los medios conocidos se puede construir un vector de expresión que comprenda el polinucleótido que se describe arriba, y se puede enlazar operativamente a una secuencia reguladora que controla la expresión de dicho polipéptido. Además, los péptidos anteriormente descritos se pueden usar en la fabricación de un medicamento para tratar una patología mediada por quimocina CXC. En algunas modalidades, el medicamento es para el tratamiento de una patología mediada por la quimocina CXC-ELR. La patología mediada por quimocina CXC se puede seleccionar del grupo que consiste en: daño de isquemia-reperfusión, síndrome de dificultad respiratoria aguda inducida por endotoxemía, glomerulonefritis del tipo de complejo inmune, neumonía bacteriana y mastitis. Como será apreciado por el experto en la materia, tales medicamentos que comprenden una cantidad efectiva de cualquiera de los péptidos anteriormente descritos, se pueden administrar a un individuo en necesidad de dicho tratamiento. En una modalidad alternativa de la invención, se contempla que se pueden usar como antagonistas los compuestos que tienen la misma estructura tridimensional en el sitio de unión. El análisis tridimensional de la estructura química se usa para determinar la estructura de sitios activos, que incluyen sitios de unión para las quimocinas. Se han usado guías químicas con exploración de alto rendimiento para generar y optimizar químicamente un antagonista selectivo del CXCR2 (J Biol Chem, 1998, 273:10095, que se incorpora aquí como referencia). También se usó un enfoque similar para generar un antagonista de CCR3 (J Biol Chem, 2000, 275:36626, que se incorpora aquí como referencia). Wells y otros (J Leuk Biol, 1996, 59:53, que se incorpora aquí como referencia), han usado espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) para detallar la estructura tridimensional de los ligandos para CXCR, incluyendo las quimocinas CXC-ELR y no ELR. Con su información de RMN, Wells y otros generaron múltiples sustituciones dentro de los sitios de unión del receptor de múltiples quimocinas, de tal manera que pudieron alterar sustancialmente las especificidades de receptor de los ligandos.

Materiales y métodos Reactivos y proveedores. Los siguientes reactivos se compraron: glutatión-Sepharose, el vector de expresión pGEX-2T, Sephadex G-25 (Amersham-Pharmacia-Biotech, Baie d'Urf, Provincia de Quebec), reactivo de Bolton-Hunter, un equipo de biotinilación de proteína (Pierce Scientific, Rockford, Illinois), el vector de secuenciación pBluescript II KS, Pfu Turbo™, ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, California), un equipo de mutagénesis dirigida a sitio (QuickChange™; Boerhinger-Mannheim Canadá, Laval, Provincia de Quebec), aprotinina, benceno, ionóforo de calcio A23187, cloramina T, citocalasina B, dimetilformamida, endotoxina (lipopolisacárido de Escherichia coli, serotipo 0127B8), isopropil-tio-D-galactopiranósido (IPTG), leupeptina, p-nitrofenil-D-glucurónido, aceite mineral, aceite de silicón, tetrametilbencidina (TMB), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 12,13-miristato-acetato de forbol (PMA), y Tritón X-100 (Sigma Chemical Co, Mississauga, Ontario), un equipo de tinción Diff-Quick (American Scientific Products, McGaw Pk, Illinois), CXCL1 , CXCL5 y CXCL8 humanas (R & D Systems Inc, Minneapolis, Minnesota), anti-lg de conejo conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) (Zymed, South San Francisco, California), DMEM, HBSS (Gibco, Grand Island, Nueva York), HRP-estreptavidina (Vector Labs, Burlingame, California), substrato de enzima ABTS (Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, Maryland), seroalbúmina bovina (BSA), y medio de separación de linfocito (ICN Pharmaceuticals, Aurora, Illinois). Generación de análogos de CXCL8(3-74)K1 1 R. El ligando de CXCR1/CXCR2 de alta afinidad CXCL8(3-74)K1 1 R, y su análogo T12S/H13F, se generaron de acuerdo con los métodos descritos por Li y Gordon (2001 , arriba). Similarmente se generaron los análogos Gly31 Pro (G31 P), Pro32Gly (P32G), y G31 P/P32G de estas proteínas por medio de mutagénesis dirigida a sitio usando PCR, con los iniciadores de oligonucleótido delantero e inverso apropiados (cuadro 1 ). Los productos de cada reacción se digirieron con Dpn1 , se ligaron en el vector pGEX-2T, se transfectaron en células HB101 , y sus secuencias se verificaron comercialmente (Plant Biotechnology Institute, Saskatoon). Brevemente, las bacterias recombinantes se lisaron en presencia de un coctel inhibidor de proteasa (2 mM de PMSF, 2 g/ml de aprotinina, y 2 pg/ml de leupeptina), y las proteínas recombinantes de fusión de los sobrenadantes se purificaron por cromatografía de afinidad usando cuentas de glutatión-Sepharose de acuerdo con los métodos de Caswell y otros (Caswell, J. L, D. M. Middleton, y J. R. Gordon. 1998. Vet. Immunol. Immunopath. 67:327-340.). Los análogos de CXCL8(3-74) 1 1 R se separaron de las proteínas de fusión GST mediante digestión de trombina, se dializaron contra una solución salina amortiguadora de fosfato (PBS), se corrieron a través de columnas comerciales de remoción de endotoxina, y después se caracterizaron por medio de electroforesis en gel poliacrilamida (PAGE) y Western blotting con un anticuerpo anti-CXCL8 bovina de cabra (provisto por el Dr. M. Morsey). Cada análogo purificado tenía una masa molecular de 8 kDa, fue reconocido específicamente por el anticuerpo anti-CXCL8 en el Western blotting, y tenía una pureza relativa de 96%, determinada por análisis densitométrico de los geles de PAGE. Marcación de las proteínas recombinantes. Los presentes autores utilizaron bl0,CXCL8 para los exámenes iniciales de unión de análogo a los neutrofilos y 125I-CXCL8 para las pruebas de etapa tardía de afinidad relativa de receptor. La CXCL8 fue biotinilada y el grado de sustitución de biotina se determinó usando un equipo comercial, como lo indican Li y Gordon (2001 , arriba). La bl0,CXCL8 se sustituyó con 2.15 moles de biotina por mol de CXCL8. La CXCL8 se marcó radiactivamente con 25l usando el método del reactivo Bolton-Hunter (BHR), como se indica en detalle (Li y Gordon 2001 , arriba). La proteína marcada se separó del 125I-BHR no incorporado por cromatografía sobre Sephadex G50, y la CXCL8 marcada se caracterizó por su afinidad relativa por los neutrofilos y el tiempo requerido para alcanzar el equilibrio de unión, como lo indican Li y Gordon (2001 , arriba). Pruebas de unión del análogo de CXCL8(3.74)K1 1 R. Se purificaron células (85-93% de neutrofilos) de la sangre de reses de acuerdo con el método de Caswell (Caswell, J. L. y otros 1998. Vet. Immunol. Immunopath. 67:327-340). En experimentos preliminares, los presentes autores determinaron que ninguno de sus análogos afectó la viabilidad de los neutrofilos, determinada por exclusión del colorante azul de trípano. Para los amplios exámenes de análogos, neutrofilos en HBSS/0.5% BSA se incubaron durante 2 horas a 4 °C con el análogo, se lavaron en DMEM frío, y después se incubaron otras 2 horas a 4 °C con biotCXCL8 (1000 ng/ml). La biotina asociada con la célula se detectó incubando las células lavadas con estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (dilución 1 :700), y después con substrato de enzima ABTS. La DO405 de las muestras se determinó usando una lectora de placas de ELISA. Los neutrofilos tratados con medio se unieron rutinariamente a suficiente bl0,CXCL8 para generar una DO405 de 0.5-0.6. Para los estudios a profundidad con CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P, los presentes autores usaron 125I-CXCL8 en pruebas de inhibición de unión con CXCL8 no marcada o CXCL8(3.74)K11 R/G31 P. En experimentos preliminares determinaron que el tiempo de equilibrio de unión de los neutrofilos para 125l-CXCL8 fue de 45 minutos, y que 20 pM de 125I-CXCL8 apenas saturaron los receptores de alta afinidad de las células. De esta manera, en estas pruebas, se incubaron sobre hielo 106 de neutrofilos purificados durante 45 minutos con 20 pM de 125I-CXCL8 y concentraciones variables de ligando de competidor no marcado. Después, las células se sedimentaron a través de aceite mineral al 6% en aceite de silicón y las cantidades de radioligando asociado con célula se determinaron usando un contador. La unión no específica de 125ICXCL8 a las células se evaluó en cada prueba incluyendo un exceso molar de 200 veces de ligando no marcado en un grupo de muestras. Este valor se usó para calcular el porcentaje de unión específica (Coligan, J., A. Kruisbeek, D. Margulies, E. Shevach, y W. Strober. 1994, "Current Protocols in Immunology", John Wiley & Sons, New York). Prueba de liberación de glucuronidasa de neutrófilo. Se ha reportado en detalle la prueba de glucuronidasa de neutrófilo (Li y Gordon 2001 , arriba). Brevemente, se incubaron neutrófilos tratados con citocalasina B durante 30 minutos con los análogos de CXCL8, y después se analizaron por calorimetría sus productos de secreción para detectar la enzima. La liberación de glucuronidasa se expresó como el porcentaje del contenido celular total, determinado lisando las células tratadas con medio con 0.2% de (v/v) Tritón X-100. La provocación de neutrófilos con el estímulo de control positivo PMA (50 ng/ml) y A23187 (1 pg/ml) indujo 42+/-6% de liberación de las reservas totales de glucuronidasa celular. Muestras de lesiones inflamatorias. Los presentes autores obtuvieron fluidos de lavado bronquioalveolar (FLBA) de los pulmones de reses (n=4) con mannheimiosis neumónica fibrinopurulenta clínica diagnosticada (Caswell y otros, 1997), así como también fluidos de lavado de cisterna de ubre de reses (n=4) con mastitis experimental inducida por endotoxina (Waller, K. P. 1997. Vet. Immunol. Immunopathol. 57:239-251 ). En experimentos preliminares de dosis-respuesta, se determinó que 5 pg de endotoxina indujeron una fuerte respuesta de neutrófilos mamarios (70-80% máxima). De esta manera, en los experimentos reportados se indujo mastitis por infusión de 5 pg de endotoxina o medio vehículo solo (solución salina; volúmenes de 3 mi) en las cisternas de ubre de vacas lecheras Holstein que no estaban en lactación, y 15 horas después los infiltrados se recuperaron de las cisternas de lavado con 30 mi de HBSS. Las células del FLBA y los fluidos de lavado de cisterna de ubre se sedimentaron por centrifugación y se hicieron conteos diferenciales. Los fluidos de lavado no tratados y agotados en CXCL8 (más abajo) se analizaron para evaluar su contenido de quimocina por medio de ELISA (CXCL8 solamente) y pruebas de quimiotaxis. Pruebas de quimiotaxis de neutrófillos. Se corrieron por duplicado pruebas de microquimiotaxis en cámaras de microquimiotaxis de Boyden modificadas, usando filtros de policarbonato de 5 pm de tamaño de poro, libres de polivinilpirrolidona, de acuerdo con los métodos conocidos (Caswell y otros,1998; Cairns, C. M. y otros 2001 , J. Immunol. 167:57-65). Para cada muestra se contaron los números de células que habían emigrado a las membranas durante 20-30 minutos por conteo directo de por lo menos nueve campos de objetivo 40x, y los resultados se expresaron como el número medio de células /campo 40x (±SEM). Los quimioatrayentes incluyeron CXCL8 bovina o humana, CXCL5 y CXCL1 humanas, FLBA de mannheimiosis neumónica y fluidos de lavado de mastitis (diluidos 1 :10-1 :80 en HBSS), mientras que los antagonistas comprendieron anticuerpo anti-CXCL8 ovino de ratón 8M6 (provisto generosamente por el Dr. P. Wood, CSIRO, Australia), o los análogos de CXCL8(3-74)K1 1 R. En algunas pruebas, los autores presentes preincubaron las muestras con los anticuerpos (5 pg/ml) durante 60 minutos sobre hielo (Gordon, J. R. 2000. Cell Immunol. 201 :42-49). En otros generaron matrices de inmunoafinidad específicas de CXCL8 con los anticuerpos 8M6 y cuentas de protein-A-Sepharose, y usaron estas en exceso para absorber las muestras (Caswell y otros, 1997; Gordon, J. R., y S. J. Galli, 1994. J. Exp. Med. 180:2027-2037); la magnitud del agotamiento de CXCL8 se confirmó por medio de ELISA de las muestras tratadas. Para pruebas con los antagonistas recombinantes, los inhibidores se mezclaron directamente con las muestras inmediatamente antes del análisis. ELISA de CXCL8. Para la prueba ELISA de los presentes autores, se usó MAb 8M6 como el anticuerpo de captura, antisuero anti-CXCL8 ovina de conejo (también de P. Wood, CSIRO) como el anticuerpo secundario, y anti-lg de conejo conjugada con HRP, y TMB como el sistema de detección, como lo indican Caswell y otros (1997). Diluciones en serie de cada muestra se analizaron por triplicado y cada prueba incluyó una curva patrón de CXCL8 recombinante de bovino. Bloqueo de CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P de las respuestas de endotoxina in vivo. Los presentes autores usaron una serie secuencial de pruebas de piel de 15 horas para probar la capacidad de CXCL8(3- 74)K1 1 R/G31 P para bloquear las respuestas inflamatorias inducidas por endotoxina in vivo. Para cada prueba hicieron una provocación intradérmica de vacas Holstein sanas de 2 semanas de edad con 1 pg de endotoxina en 100 µ? de solución salina; 15 horas después tomaron biopsias de punción de 6 mm bajo anestesia local (lidocaína) y procesaron estas para histopatología (Gordon y Galli, 1994). Después de la primera prueba (control positivo interno), inyectaron a cada animal por vía subcutánea, intramuscular, o intravenosa, CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P (75 pg/kg) en solución salina, y después se provocaron nuevamente con endotoxina, como arriba. Los animales se sometieron un total de 4 veces a provocación con endotoxina, de tal manera que se obtuvieron biopsias del sitio de reacción de 15 horas a las 0, 16, 48 y 72 horas después del tratamiento. Las biopsias se procesaron mediante los métodos rutinarios en secciones de parafina de 6 mieras, teñidas con solución de Giemsa, y se examinaron en una prueba de ciego a una amplificación de 400 (Gordon y Galli, 1994; Gordon, J. R. 2000. J. Allergy Clin. Immunol. 106:1 10-1 16). Los números medios de neutrófilos por campo de microscopio de objetivo 40x se determinaron a tres profundidades diferentes dentro de la piel, la dermis papilar (superficial), intermedia, y reticular (profunda). Análisis estadísticos. Se analizaron los datos de multigrupos por medio de ANOVA y análisis de la diferencia menos significativa protegida (PLSD) de post-hoc de Fisher, mientras que se hicieron comparaciones de dos grupos usando la prueba t de Student (de dos colas). Los resultados se expresan como la media +/-SEM.

Resultados 1 . G31 P bovina La CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P inhibe competitivamente la unión de CXCL8 a los neutrófilos. Los presentes autores examinaron la capacidad de cada análogo de CXCL8(3-74)K1 1 R para unirse a los receptores de CXCL8 sobre los neutrófilos, y competir así con CXCL8 como ligando. En sus exámenes iniciales, usaron pruebas de inhibición de la unión de bl0tCXCL8, incubando las células con los análogos (10 ng/ml) durante 2 horas a 4 °C antes de la exposición a biotCXCL8 (1 pg/ml). Esta cantidad de CXCL8 se aproxima a la encontrada en los tejidos de pulmón de ovejas con mannheimiosis neumónica experimental (Caswell, J. L. 1998, "The role of interleukin-8 as a neutrophil chemoattractant in bovine bronchopneumonia", Tesis para Ph. D., Departamento de Patología Veterinaria, University of Saskatchewan). Los presentes autores encontraron que CXCL8(3. 74)K1 1 R/G31 P fue un antagonista potente de la unión de CXCL8 en esta prueba (figuras 1A-1 B), de tal manera que 10 ng/ml de CXCL8(3.74)K11 R/G31 P bloquearon 95% de la unión subsiguiente de bl0tCXCL8 a las células. Cuando se probó a esta dosis, CXCL8(3-74)K11.R/P32G bloqueó únicamente 48% de la unión de CXCL8, mientras que la CXCL8 no marcada sola inhibió competitivamente 30% de la unión de biotCXCL8. La introducción en CXCL8(3. 74)K11 R/G31 P o CXCL8(3-74)K11 R/P32G de sustituciones de aminoácido adicionales en Thr 2 e His13, reduce sustancialmente las actividades antagonistas de los análogos (figuras 1A-1 B). Estos datos sugieren claramente que la preincubación de los neutrófilos con CXCL8(3-74)K11 R/G31 P regula negativamente muy fuerte la unión subsiguiente de CXCL8. Para mapear más finamente la capacidad de CXCL8(3. 74)K11 R/G31 para inhibir la unión de CXCL8, en el siguiente grupo de experimentos, los presentes autores expusieron simultáneamente las células a 125ICXCL8 y dosis variables de CXCL8(3.74)K1 1 R/G31 P o CXCL8 no marcada. Encontraron que CXCL8(3.74)K11 R/G31 P es aproximadamente dos órdenes de magnitud más eficaz que la CXCL8 de tipo silvestre para inhibir la unión de 20 pM de 125I-CXCL8 a las células (figuras 1A-1 B). La concentración para inhibir 50% de la unión del ligando marcado (CI50) fue de 120 pM para CXCL8 no marcada y 4 pM para CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P. Estos datos sugieren que CXCL8(3-74) 1 1 R/G31 P es un inhibidor competitivo muy potente de la unión de CXCL8 a los neutrófilos. CXCL8(3- 4)K1 1 R/G3 P no exhibe actividades de agonista de neutrófilos. Aunque CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P fuera con seguridad un ligando de alta afinidad para los receptores de CXCL8 de neutrófilo, lo haría igualmente bien como agonista o antagonista. De esta manera, los siguientes experimentos se enfocaron en las posibles actividades de agonista de los análogos de CXCL8(3-74)K1 1 R generados, medidas por su capacidad para atraer químicamente estas células o inducir in vitro la liberación de la enzima hidrolítica de gránulos de neutrófilo glucuronidasa (figuras 2A-2B). Encontraron que incluso a 100 ng/ml de CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P fue un quimioatrayente pobre, induciendo 13.9+/-4% o 5.4+/-2% de las respuestas inducidas por 1 o 100 ng/ml de CXCL8 (p<0.001 ), respectivamente. A 100 ng/ml, el análogo CXCL8(3.74)K1 1 R/P32G indujo una respuesta que fue bastante sustancial (38.3+/-2% de la respuesta de CXCL8), mientras que el análogo combinado CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P/P32G tampoco fue un quimioatrayente eficaz. Cuando los presentes autores evaluaron su capacidad para inducir la liberación de glucuronidasa, encontraron que ninguno de los análogos de CXCL8(3-74)K1 1 R fue tan eficaz como CXCL8 para inducir la liberación del mediador. El realidad, encontraron solo liberación de fondo con cualquiera de ellos a 10 ng/ml, y a 100 ng/ml únicamente CXCL8(3- 74)K1 1 R/G31 P/P32G indujo respuestas de neutrófilos significativas (figuras 2A- 2B). Dada la inhibición competitiva de CXCL8 combinada y los datos de agonista de neutrófilo, desde este punto los presentes autores enfocaron su atención sobre CXCL8(3-74) 1 1 R/G31 P. CXCL8(3.74)K1 1 R/G31 P bloquea las respuestas quimiotácticas de neutrófilo a los ligandos de CXCR1 y CXCR2. El efecto más patógeno de la expresión inapropiada de la quimocina ELR+ es la atracción de células inflamatorias a los tejidos. De esta manera, los presentes autores evaluaron enseguida el impacto de CXCL8(3-74) 1 1 R/G31 P sobre las respuestas quimiotácticas de los neutrófilos a altas dosis de CXCL8 (figura 3). Como se predijo en las observaciones in vivo en oveja y res (33), 1 pg/ml (129 nM) de CXCL8 fue fuertemente quimioatrayente, pero incluso dosis muy bajas de CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P disminuyeron esta respuesta. La adición de 12.9 pM de CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P redujo la respuesta quimiotáctica de las células en 33%. La Cl50 para CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P bajo estas condiciones fue de 0.1 1 nM, mientras que el bloque completo de esta respuesta de CXCL8 se logró con 10 nM de CXCL8(3.74)K1 1 R/G31 P. Cuando los presentes autores probaron la eficacia de CXCL8(3. 74)K1 1 R/G31 P para bloquear las respuestas a provocaciones de CXCL8 bovina más sutiles, también extendieron el estudio para evaluar la capacidad de CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P para bloquear respuestas de neutrófilo a CXCL8 humana y también a los ligandos específicos de CXCR2 humana CXCL1 y CXCL5. Cada uno de estos es expresado en los tejidos afectados de pacientes de pancreatitis (Hochreiter, W. W. y otros, 2000, Urology, 56:1025- 1029) o ARDS (Villard y otros, 1995) a 1 -10 ng/ml. Encontraron que los neutrófilos bovinos eran sensibles a 1 ng/ml de hCXCLI o hCXCL5, y similarmente sensibles a 10 ng/ml de hCXCL8 (figura 3), de modo que usaron estas dosis para probar los efectos de CXCL8(3-74) 1 1 R/G31 P sobre las respuestas de neutrofilo de estos ligandos. Las respuestas de neutrofilo a hCXCLI y hCXCL5 se redujeron a 50% con 0.26 nM y 0.06 nM de CXCL8(3. 74)K1 1 R/G31 P, respectivamente, mientras que sus respuestas a hCXCL8 se redujeron en 50% con 0.04 nM de CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P (figura 3). Estos datos indican que CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 puede antagonizar las acciones de múltiples miembros de la subfamilia de quimocinas CXC-ELR. CXCL8(3-74)K1 1 R G31 P es un antagonista eficaz in vitro de las quimocinas de neutrofilo expresadas en neumonía bacteriana o lesiones de mastitis. Los presentes autores pretenden probar la magnitud a la cual su antagonista puede bloquear el arreglo de quimioatrayentes de neutrofilo expresados dentro de medios inflamatorios complejos in vivo. De esta manera, escogieron dos enfermedades en las cuales la activación de neutrófilos motivada por quimocina contribuye importantemente al avance de la patología, la mastitis y la mannheimiosis neumónica. Utilizaron un modelo de endotoxina de mastitis (Persson, K. y otros, 1993. Vet. Immunol. Immunopathol. 37:99-1 12), en el cual infundieron 5 pg de endotoxina/cisterna de ubre y 15 horas después lavaron cada cisternaí Los neutrófilos comprendieron 82% y 6%, respectivamente de las células de las cisternas de endotoxina y control de solución salina, el grueso de las células remanentes comprendiendo macrófagos. Los fluidos del lavado diluidos (1 :10) indujeron fuertes respuestas quimiotácticas de neutrófilos in vitro, y la adición de anticuerpos anti-CXCL8 a las muestras redujo de forma máxima estas en 73+/-8% (figura 4A), con respecto al medio de control. Por otra parte, la adición de 1 ng/ml de CXCL8(3-74) 1 1 R/G31 P a las muestra redujo su actividad quimiotáctica en 97+/-3%. Los neutrófilos también comprendieron 93+/-12% de las células recuperadas del FLBA de las reses con mannheimiosis neumónica avanzada. Cuando se probaron in vitro, estas muestras fueron demasiado fuertemente quimiotácticas para los neutrófilos, y la adición de anticuerpos anti-CXCL8 redujo máximamente sus actividades quimiotácticas de neutrófilo en 73+/-5% (figura 4A). El tratamiento de estas muestras de FLBA con 1 o 10 ng/ml de CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P redujo las respuestas de neutrófilo en 75+/-9% o 93+/-9%, respectivamente, con respecto a los controles de medio. Estos datos sugieren que CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P bloquea las acciones de los quimioatrayentes de CXCL8 y no CXCL8 en estas muestras. Para confirmar estas observaciones, usando una estrategia alternativa, los presentes autores agotaron de CXCL8 unas muestras de FLBA de neumonía bacteriana usando matrices de inmunoafinidad, después evaluaron la eficacia de CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P para bloquear las actividades quimotácticas residuales de neutrófilo en las muestras (figura 4B). Las muestras de FLBA de lesión no tratada contenían 3.215+/-275 pg/ml de CXCL8, mientras que el FLBA absorbido por inmunoafinidad contenía 24+/-17 pg/ml de CXCL8. En esta serie de experimentos la respuesta de neutrófilo a las muestras de FLBA agotadas en CXCL8 fue de 65.4+/-4% de sus respuestas a las muestras no absorbidas. Se sabe que CXCL8 puede contribuir tan poco como 15% a las actividades quimiotácticas de neutrófilo en el FLBA de la mannheimiosis neumónica obtenida de un arreglo de casos clínicos (Caswell y otros, 2001 ). Aunque los tratamientos de agotamiento de CXCL8 fueron 99% eficaces para remover CXCL8, permanecieron en estas muestras cantidades sustanciales de actividad quimiotáctica de neutrófilo, y la adición de 1 ng/ml de CXCL8(3-74) 1 1 R/G31 P abolió completamente sus efectos acumulativos (figura 4B). Estos datos confirman inequívocamente que CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P también antagoniza el espectro de quimioatrayentes que no son IL-8 expresados en estas muestras. CXCL8(3- 4)K1 1 R/G31 P es altamente eficaz para bloquear la inflamación neutrofílica inducida por endotoxina in vivo. En los últimos experimentos de los presentes autores, estos evaluaron la capacidad de CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P para bloquear las respuestas inflamatorias inducidas por endotoxina en la piel de reses, así como también los marcos de tiempo sobre los cuales fue eficaz. Los animales se sometieron a provocación intradérmica con 1 pg de endotoxina bacteriana 15 horas antes (respuesta de control positivo interno), o a tres tiempos después de inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular de CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P (75 pg/kg). De esta manera, se tomaron biopsias de punción de sitios de reacción de endotoxina de 15 horas, 15 minutos antes del tratamiento y 16, 48 y 72 horas después de la inyección del antagonista en cada animal, y se determinó el número de neutrófilos infiltrados en forma de ciego a la dermis papilar (superficial), intermedia y reticular de cada biopsia. Antes de los tratamientos con antagonista, fueron evidentes fuertes respuestas inflamatorias neutrofílicas en los sitios de provocación de endotoxina en cada animal (figura 5). Dentro de las biopsias, las respuestas en la dermis papilar fueron leves en todos los animales (datos no mostrados), y se hicieron progresivamente más notables a mayor profundidad de la piel, de tal manera que la inflamación máxima (infiltración de neutrófilos) se observó alrededor de los vasos sanguíneos en la dermis reticular (figura 5). Después de los tratamientos con CXCL8(3. 74)K1 1 R/G31 P, las respuestas inflamatorias observadas en las biopsias de 16 horas fueron suprimidas 88-93%, mientras que las biopsias de 48 horas fueron suprimidas 57% (intravenoso) a 97% (¡ntradérmico) con respecto a sus respuestas de pretratamiento respectivas. Setenta y dos horas después del tratamiento los efectos del antagonista administrado por vía intravenosa se habían quitado, mientras que las respuestas de endotoxina en las reses tratadas por vía intradérmica y subcutánea todavía estaban suprimidas 60%. Estos datos indican claramente que CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P es un antagonista altamente efectivo de las respuestas inflamatorias inducidas por endotoxina in vivo, y que estos efectos pueden durar durante 2-3 días, y que la vía de suministro afecta notablemente la farmacocinética de este antagonista novedoso. Los presentes autores encontraron que G31 P también antagoniza los efectos quimiotácticos de las quimocinas CXC-ELR humanas CXCL8/IL-8 y CXCL5/ENA-78 sobre los neutrófilos humanos. De esta manera, las actividades quimiotácticas de 0.1 a 500 ng/ml de CXCL8 (figura 6A) o CXCL5/ENA-78 (figura 6B) fueron esencialmente bloqueadas por completo con la adición de 10 ng/ml del presente antagonista a las pruebas de quimiotaxis. Similarmente G31 P bloqueó los efectos quimiotácticos de CXCL8 para eosinófilos CXCR1/CXCR2 positivos. Los presentes autores y otros investigadores han encontrado que los eosinófilos de sujetos atópicos o asmáticos expresan ambos receptores de quimocina CXC-ELR, y son sensibles a CXCL8 (figura 7). Los efectos quimiotácticos de 100 ng/ml de CXCL8, pero no el ligando de CCR3 CCL1 1/eotaxina, sobre eosinófilos de sangre periférica purificados de un donador no asmático levemente atópico (99% de pureza), fueron abolidos completamente con la adición de 10 ng/ml de G31 P a las pruebas de quimiotaxis (figura 7). Cuando se probaron contra eosinófilos purificados de un paciente hipereosinofílico (figura 7), G31 P neutralizó las respuestas de estas células a CXCL8/IL-8 o CXCL5/ENA-78. Estos datos indican claramente que la G31 P bovina es un antagonista efectivo de las quimocinas CXC-ELR bovinas expresadas in vivo en respuesta a la provocación de endotoxina, pero también puede antagonizar completamente las respuestas del receptor de quimocina CXC-ELR de neutrófilo y eosinófilo a CXCL8 y CXCL5, ligandos conocidos para la CXCR1 y CXCR2.

G31 P bovina humanizada Los presentes autores generaron una proteína quimérica bovina-humana, que comprende la mitad amino terminal de G31 P bovina y la mitad carboxi terminal de CXCL8 humana (bhG31 P) (SEQ ID NO: 10), y encontraron que tienen fuerte actividad antagonista de neutrófilo in vitro e in vivo; en realidad, bhG31 P puede tener mayor actividad que bG31 P, o las formas humanas de G31 P. Los presentes autores también generaron y caracterizaron 5 formas alternas de bhG31 P (SEQ ID NO: 26-30) en las cuales los aminoácidos humanos se sustituyeron con los aminoácidos bovinos remanentes -ninguno de estos aumentó la actividad antagonista de los análogos, y alguna evidencia sugiere que pueden reducir la actividad antagonista. Como un enfoque para generar un fármaco de uso humano, los presentes autores emprendieron la humanización de bG31 P. Además, puesto que la "mitad" amino terminal de CXCL8 es más importante para la actividad biológica de CXCL8 que el extremo carboxi, y como la "mitad" carboxi terminal de CXCL8 contiene 10 de los 15 aminoácidos discrepantes de bovino-humano, primero examinaron si la ligación completa del extremo carboxi de hCXCL8 (es decir, aminoácidos codificadores 45-72) sobre la mitad amino de bG31 P (es decir, aminoácidos codificadores 3-44) afectaría su actividad. Específicamente, se sabe que la mitad amino de CXCL8 lleva los motivos críticos de reconocimiento y señalización de receptor y sus estructuras de armazón asociadas.

De esta manera, los presentes autores generaron la proteína G31 P quimérica bovina-humana, bCXCL8(3.44)K1 1 R/G31 P-hCXCL8(45.72) (bhG31 P) (SEQ ID NO: 10), y después usaron el ADNc de esta proteína como un molde para la sustitución uno por uno de los residuos de aminoácido discrepantes de bovino-humano restantes, como se expuso arriba. Los presentes autores expresaron y purificaron cada construcción usando SOP para enterocinasa (isoformas bhG31 P+0 y bhG31 P"1 solamente) o trombina (todos los otros análogos), y las caracterizaron por medio de SDS-PAGE y Western blotting (figura 8). Cada isoforma era de ~8 kD de tamaño, aunque las soluciones de las isoformas bhG31 P/T15K (SEQ ID NO: 28) y bhG31 P/S37T (SEQ ID NO: 30) parecieron contener lo que se podría interpretar como bajas cantidades de dímeros de análogo, formados quizás como resultado de las altas concentraciones de proteína en las muestras, o alternativamente quizás relacionados con la perturbación de aquellas porciones de estos análogos de G31 P asociados con dimerización. Previamente se ha reportado que varios aminoácidos de esta región afectan significativamente la dimerización de CXCL8 humana. Los presentes autores encontraron que bhG31 P (es decir, bCXCL8(3-44) 1 1 R/G31 P-hCXCL8(45-72)) retiene la actividad antagonista de quimocina CXC-ELR de bG31 P, de tal manera que bloquea las respuestas quimiotácticas o de liberación de intermediario de oxígeno reactivo (ROI) de neutrófilos humanos a CXCL8 humana (figuras 9A-9B). Cuando adicionalmente humanizaron esta proteína quimérica bovina-humana introduciendo aminoácidos equivalentes de humano adicionales en lugar de los residuos discrepantes (es decir, T3K (SEQ ID NO: 26), H13Y (SEQ ID NO: 27), T15K (SEQ ID NO: 28), E35A (SEQ ID NO: 29), y S37T (SEQ ID NO: 30)), encontraron que estos cambios realmente no tienen efecto significativo sobre la actividad de la quimera 50:50 bh ni hace a ninguno de los análogos agonistas para los neutrófilos, según se evaluó en las pruebas de quimiotaxis (figura 10A), o en cuanto a reducir significativamente la actividad antagonista determinada por inhibición de quimiotaxis o por inhibición de la liberación de intermediario de oxígeno reactivo (figura 10B). Como se indicó, los presentes autores evaluaron el impacto sobre la actividad de bhG31 P de la variación de la secuencia amino terminal (es decir, bhG3P+6, bhG31 P+2, bhG31 P+0, bhG31 F1) (SEQ ID NO: 14, 3, y 12, respectivamente), midiendo la actividad de cada uno en pruebas de inhibición de quimiotaxis e inhibición de intermediario de oxígeno reactivo (figuras 1 A-11 B). Aunque encontraron que la eliminación de Lys3 tiende a reducir la actividad de bhG31 P, las actividades antagonistas de los otros análogos fueron aproximadamente equivalentes (figuras 1 1A-11 B). Como apreciará el experto en la materia, estos datos indican que las adiciones N-terminales de longitud variable y la variación de la composición de aminoácidos, serían toleradas sin interrupción significativa de la actividad de G31 P. Por consiguiente, las adiciones N-terminales de 0-10 aminoácidos aleatorios, o 0-10 aminoácidos aleatorios, o 0-9 aminoácidos aleatorios, o 0-8 aminoácidos aleatorios, o 0-7 aminoácidos aleatorios, o 0-6 aminoácidos aleatorios, o 0-5 aminoácidos aleatorios, o 0-4 aminoácidos aleatorios, o 0-3 aminoácidos aleatorios, o 0-2 aminoácidos aleatorios. Estos datos considerados en su conjunto sugieren que múltiples formas quiméricas de bovino-humano de G31 P son antagonistas de neutrófilo útiles. Sin embargo, se debe notar que en el tiempo aproximado en que los presentes autores completaron la caracterización de estas quimeras, determinaron que las formas humanas de CXCL8(3-72)K1 1 R/G31 P son tan efectivas como bG31 P para bloquear las respuestas de neutrófilo motivadas por CXCL8, y que hG31 P también fue un antagonista altamente efectivo de la inflamación neutrofílica y la patología motivadas por endotoxina bacteriana in vivo. De esta manera, en este momento los presentes autores enfocan sus esfuerzos para caracterizar más completamente sus construcciones de hG31 P. 3. G31 P humana (hG31 P) Los presentes autores hicieron un contrato con Takara Biotechnology Co., Dalian, República Popular de China, para sintetizar un ADNc de longitud completa de CXCL8 humana, que los presentes autores clonaron en pGEX-2T usando extremos 5' (BamH1 ) y 3' (EcoR1 ) compatibles. Este ADNc de pGEX-hCXCL8 se usó como molde para mutagénesis dirigida de sitio para generar pGEX-hCXCL8(3-72)K1 1 R (hK1 1 R) y pGEX-hCXCL8(3-72)K1 1 R/G31 P (hG31 P), que se expresaron como proteínas de fusión GST y se purificaron por separación de trombina usando los procedimientos de operación estándares. Como con bhG31 P (arriba), los presentes autores generaron dos familias de moléculas relacionadas con G31 P recombinantes que fueron precedidas por seis aminoácidos ajenos (Gly-Ser-Met-Gly-Gly-Ser) o dos (Gly-Ser), referidos como hG31 P+6 (SEQ ID NO: 14) o hG31 P+2 (SEQ ID NO:13), pero también familias adicionales de construcciones sin aminoácidos exógenos (G31 P+0) (SEQ ID NO: 11), o que además fueron suprimidos en su extremo amino (es decir, G31 P"1, G3 P"3, o G31 P"5). Los presentes autores también introdujeron en hG31 P+6 los aminoácidos equivalentes bovinos en las posiciones de aminoácido 35 (SEQ ID NO: 36), 37 (SEQ ID NO: 37), 44 (SEQ ID NO: 38), 47 (SEQ ID NO: 39) y 49 (SEQ ID NO: 40). Cada proteína se expresó, purificó y caracterizó por medio de SDS-PAGE y Western blotting. Como se predijo, cada uno comprendió una sola banda de ~8kD que fue reactiva con anticuerpos anti-CXCL8. Caracterización biológica de los análogos de CXCL8. Los presentes autores usaron pruebas de quimiotaxis con neutrófilos humanos purificados para evaluar la actividad de agonista y antagonista de CXCL8 de cada construcción (figuras 12A-12C). hCXCL8(3-72)K11 R (hK11 R)- hK1 1 R tuvo una actividad específica significativamente más alta (pruebas de quimiotaxis de neutrófilo) que la CXCL8 humana, de tal manera que representa un agonista de neutrófilo mucho más fuerte que la quimocina humana nativa. De esta manera, se puede usar hK11 R en situaciones clínicas que requieren un aumento del reclutamiento/activación de neutrófilos. hCXCL8(3-72)K11 R/G31 P (hG31 P). La sustitución de G31 P dentro de hK11 R+6 eliminó esencialmente la actividad agonista de esta molécula, de tal manera que hG31 R+6 fue por lo menos tan efectiva como antagonista de la quimiotaxis de neutrófilo motivada por CXCL8 que bG31 R+6. Las diversas estructuras N-terminales de hG31 P afectan la actividad biológica de los análogos, de tal manera que parece que hG31 P+6 y hG31 P+2 son antagonistas superiores de la quimiotaxis de CXCL8, mientras que hG31 P+0 y hG31 P+2 tienen actividad antagonista de quimiotaxis significativamente menor con respecto a bG31 P+6. De forma interesante, cuando se comparan sus capacidades para inhibir la liberación de ROI inducida por CXCL8 de los neutrófilos humanos, las diversas secuencias N-terminales tuvieron un efecto mucho menor sobre las actividades de antagonista del análogo, cada análogo exhibiendo una actividad antagonista de liberación de ROI altamente significativa. La liberación de ROI depende de la actividad de NADPH oxidasa en los neutrófilos, y se ha reportado que la NADPH oxidasa está bajo el control del CXCR2, pero no del CXCR . El fundamento de los diferentes grados de eficacia de estos diversos análogos de sustitución N-terminales puede ser que los dos o seis residuos extras sobre hG31 P+2 hG31 P+6 pueden reducir más el potencial para la interacción del motivo ELR (esto es, sobre G31 P) con el CXCR1/CXCR2, quizás por impedimento estérico. Para documentar más la capacidad de hG31 P para antagonizar las funciones de CXCR2, los presentes autores evaluaron sus capacidades para inhibir la quimiotaxis de neutrófilo dependiente de CXCL5 (ENA-78); CXCL5 es un ligando específico de CXCR2, pero no de CXCR1. hG31 P+6 antagonizo su actividad quimiotáctica de manera dependiente de la dosis (figura 14). Los presentes autores también analizaron si los diversos análogos N-terminales de hG31 P tenían actividad agonista significativa con respecto a PBS solo en una prueba de quimiotaxis de neutrófilos. No encontraron respuestas significativas en la parte de los neutrófilos a cualquiera de los análogos N-terminales alternativos. En seguida examinaron si sustituciones adicionales dentro de hG31 P+6 de los aminoácidos discrepantes de humano-bovino aumentarían esta actividad antagonista de los hG31 P's. Generaron y probaron hG31 P/A35E, hG31 P/L49V, hG31 P/R47D, hG31 P/S44T y hG31 P/T37S, y encontraron que todos son agonistas ineficaces. La introducción de aminoácidos equivalentes de bovino en las posiciones 35, 37, 44, 47 o 49 redujo diferencialmente la actividad antagonista de estos análogos, de tal manera que parece que los análogos R47D y S44T aumentan la actividad de CXCL8, en lugar de inhibirla, mientras que los análogos A35E, L49V y T37S no exhiben actividad de inhibición de quimiotaxis significativa. Los presentes autores informaron previamente que bG31 P puede antagonizar las actividades quimiotácticas de neutrófilo presentes en el esputo de pacientes de fibrosis quística (FQ) que sufren exacerbaciones bacterianas de neumonía. De esta manera, probaron la capacidad de hG31 P para bloquear las actividades quimiotácticas de neutrófilo presentes en el esputo de pacientes con FQ leve (n=1 ), moderada (n=2), severa (n=2), o avanzada (n=2), pero también de pacientes con bronquiectasia no clasificada (n=2; bact), moderada (n=2), o severa (n=2). También se examinaron los esputos de pacientes con diagnóstico de asma, COPD, o sinusitis/bronquitis general con o sin hG31 P+6 . Excepto por un paciente de asma de control, todos los otros fueron positivos en el cultivo para varias especies bacterianas (por ejemplo, Haemophilus, Pseudomonas, Staphylococcus). Cada muestra se tituló en experimentos preliminares para determinar la dilución óptima para usarse en la prueba de quimiotaxis. La G31 P fue de eficaz a notablemente eficaz para bloquear las actividades quimiotácticas de neutrófilo presentes en todas las muestras, excepto las de pacientes de FQ avanzada. Esto sugiere que puede existir una etiología alternativa para la patología observada en pacientes de FQ avanzada. La hG31 P antagoniza la inflamación por neutrófilos in vivo. Los presentes autores informaron previamente de la capacidad de bG31 P para bloquear la inflamación neutrofílica dérmica inducida por endotoxina y la patología de endotoxemia de las vías respiratorias. De esta manera, evaluaron la actividad de hG31 P en modelos de endotoxemia de las vías respiratorias.

Modelo de ratón de endotoxemia de las vías respiratorias Puesto que los ratones son animales pequeños y estos requerirían sustancialmente menos G31 P que los conejillos de indias (el modelo estándar de los presentes autores), primero se probaron los efectos protectores de hG31 P+6 sobre la inflamación neutrofílica en ratones. En pruebas preliminares determinaron que una dosis de LPS de 1.5 mg/kg fue una dosis de provocación adecuada para los ratones BALB/c; esto en notable contraste con los conejillos de indias en donde 5 pg/kg de LPS inducen una fuerte neutrofilia de las vías respiratorias, pirexia y una respuesta hemorrágica pleural pulmonar. En un solo experimento de ratón (n = 5/grupo), a los ratones se les administró solución salina o 100 pg/kg, 250 pg/kg, o 500 pg/kg de hG31 P+6 por vía s.c; una hora después se sometieron a provocación ¡ntranasal, bajo ligera anestesia con gas isofluorano, con LPS (1/5 mg/kg). Después de 16 horas, los animales se sometieron a eutanasia usando C02 y después se tomó sangre, fluido de lavado alveolar bronquial (LBA), y tejidos de pulmón para su análisis. Aunque una prueba piloto previa había mostrado que 150 pg/kg de bG31 P tenían poco efecto en un modelo de peritonitis de LPS, hG31 P6+ fue muy efectiva para reducir la infiltración total de leucocitos y neutrófilos en las vías respiratorias, neutrofilia parenquimal pulmonar y, a un grado menor y variable, también la aparición de eritrocitos en las vías respiratorias (figura 17).

Modelo de conejillo de indias de endotoxemia de las vías respiratorias Los presentes autores también usaron un modelo de conejillo de indias de endotoxemia de las vías respiratorias en tres experimentos. En uno, administraron a los animales una dosis subóptima de endotoxina (50 pg/kg), mientras que en el segundo y tercero los provocaron con la dosis de LPS estándar de 5 pg/kg, pero con G31 P suministrado en cantidades variables. En cada experimento, los animales se provocaron por vía intranasal con LPS y se trataron por vía s.c. al mismo tiempo con G31 P. Quince horas después se sacrificó a los animales y se evaluó su sangre periférica (diferenciales de leucocitos) y la respuesta pulmonar (número de leucocitos de LBA, diferenciales y concentraciones de producto de desgranulación de neutrófilos, y neutrofilia de tejido), como arriba.

Experimento de provocación con LPS, dosis alta (mórbida) A dosis > 50 pg/kg, el LPS causa daño pulmonar severo en los conejillos de indias, incluyendo sangrado severo en las vías respiratorias, aunque a estas dosis la infiltración de neutrófilos en los pulmones está mitigada con respecto a la observada con +/- 5 pg/kg de LPS. Los presentes autores encontraron que incluso con una provocación de 50 pg/kg de LPS, gG31 P+6 fue muy eficaz para reducir la aparición de eritrocitos en las vías respiratorias (figura 18). El tratamiento con G31 P también redujo el número medio de neutrófilos en el LBA.

Eficacia de hG31 P v hbG31 P en la patología de endotoxemia de las vías respiratorias Los presentes autores compararon la eficacia terapéutica relativa de hG31 P+0, hG31 P"1, hG31 P+2 y hG31 P+6, y también la quimera bovina- 5 humana bhG31 P+6, que había parecido altamente eficaz in vitro contra el reclutamiento de neutrofilos dependiente de CXCL8 humana. Nuevamente, se suministraron 250 pg/kg de cada isoforma de G31 P a grupos de conejillos de indias (s.c; n=5), y se provocaron a través de las vías respiratorias con 5 pg/kg de LPS de E. coli, y 15 h después los animales se sometieron a 10 eutanasia; se evaluó su neutrofilia en la sangre periférica, las concentraciones \ de neutrofilos y eritrocitos en las vías respiratorias, y también las concentraciones de dos marcadores de gránulos de neutrofilos, lactoferrina (un marcador específico de gránulos 1 o de neutrofilos) y mieloperoxidasa (un marcador específico de gránulos 2° de neutrofilos). A esta dosis de 250 ; 15 pg/kg, cada una de las isoformas de G31 P probadas sustancialmente eliminó ; la infiltración de neutrofilos en las vías respiratorias (neutrofilos en LBA), y disminuyó significativamente la aparición de eritrocitos, lactoferrina y mieloperoxidasa en el LBA (figura 19). Parece que hG31 P+2 pudiera dar ! mayor protección que las otras, pero no significativamente cuando se toman 20 en cuenta todos los parámetros. La quimera de bhG31 P también fue muy eficaz en este sistema en cuanto a cada uno de los parámetros evaluados.

Pruebas toxicolóqicas Se hicieron pruebas preliminares de la toxicidad de bG31 P. El suministro de bG31 P (250 pg/kg) a tres conejillos de indias en un marco de tiempo diseñado para optimizar la sensibilización inmune (esto es, si la 5 molécula fuera un ¡nmunógeno), no causa ninguna fluctuación observable de lo normal en las concentraciones séricas de un panel de enzimas hepáticas y renales. No se observaron cambios de conducta ni la salud general del animal. Además, evaluaciones histológicas preliminares del corazón, riñon, pulmón, hígado, e intestino de estos animales no revelaron evidencia de 10 infiltrados inflamatorios, ni apoptosis o proliferación celular local, ni tampoco anormalidades histopatológicas. Los presentes autores han dispuesto que un anatomopatólogo evalúe independientemente estos tejidos. Los presentes | autores no pudieron detectar grados discernibles de reactividad de anticuerpo ' anti-bG31 P en el suero de estos animales, aunque las pruebas usadas no son ' 15 particularmente sensibles. De importancia para la generación de hG31 P o bG31 P usando un sistema de expresión procariótico (esto es, bacteriano), se encontró que las preparaciones sé contaminan significativamente con endotoxina bacteriana. Cuando se pasan sobre columnas de remoción de endotoxina 20 comerciales para reducir la carga de endotoxina del fármaco, se encontró que el uso de columnas de remoción de endotoxina produjo una pérdida inaceptablemente alta de G31 P. In vivo, el tratamiento de conejillos de indias con las cantidades de endotoxina encontradas en dosis terapéuticas de G31 P no imitan la actividad terapéutica de G31 P.

Estudios de ef icacia En un experimento, los presentes autores usaron hG31 P+6 a 50 pg/kg (esto es, 20% de la dosis óptima para bG31 P). Conejillos de indias se provocaron con 5 pg/kg de LPS y se trataron con esta dosis baja de hG31 P. Se encontró que hG31 P+2 y hG31 P+6 apenas retuvieron una modesta eficacia en cuanto a reducción de la infiltración de neutrofilos, pero fueron ineficaces para reducir la emigración de eritrocitos a las vías respiratorias (el significado de este hallazgo no es del todo claro, pero sugiere el potencial de otro grado más de complejidad en el mecanismo mediante el cual actúan estos fármacos). En otro enfoque in vivo que usa el modelo de endotoxemia de vías respiratorias, se provocó a conejillos de indias con una dosis de LPS conocida que induce hemorragia pulmonar severa, y se trataron con 250 pg/kg de hG31 P. Se sabía de estudios previos que a esta dosis elevada de LPS los neutrofilos son reclutados solo muy poco de la vasculatura a las vías respiratorias. En un experimento, se usó hG31 P+6 a 50 pg/kg (esto es, 20% de la dosis óptima para bG31 P). Los conejillos de indias se provocaron con 5 pg/kg de LPS y se trataron con esta dosis baja de hG31 P. Se encontró que hG31 P+2 y hG31 P+6 retuvieron una eficacia apenas modesta en cuanto a la reducción de la infiltración de neutrofilos, pero fueron eficaces para reducir la emigración de eritrocitos a las vías respiratorias (el significado de este hallazgo no es del todo claro, pero sugiere el potencial de otro grado más de complejidad en los mecanismos mediante los cuales actúan estos fármacos). En otro enfoque in vivo que usa el modelo de endotoxemia de vías respiratorias, se provocó a conejillos de indias con 50 pg/kg de LPS, una dosis conocida que induce hemorragia pulmonar severa, y se trataron con 250 pg/kg de hG31 P (véase la figura 18). Se sabía de estudios previos que a esta dosis elevada de LPS los neutrófilos son reclutados solo muy poco de la vasculatura a las vías respiratorias. No obstante, hG31 P tuvo efectos significativos sobre la reducción del alto grado de extravasación de los eritrocitos a las vías respiratorias, observada en animales provocados con una dosis alta de LPS tratados con solución salina (figura 18), y tendió a reducir la respuesta de neutrófilos de las vías respiratorias y la movilización de neutrófilos de sangre periférica asociada con esta provocación (figura 18).

Discusión Los presentes autores demostraron que CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P es un antagonista de alta afinidad de múltiples quimocinas CXC-ELR. In vitro, este antagonista bloqueó eficazmente todas las actividades quimiotácticas de neutrófilos expresadas en lesiones inflamatorias leves a intensas en dos compartimentos mucosales (los pulmones, las glándulas mamarias), y bloqueó hasta 97% las respuestas inflamatorias inducidas por endotoxina in vivo. Se identificó a CXCL8 como un quimioatrayente principal en las muestras de neumonía y mastitis, pero también se demostró que 35% de la actividad en las muestras de neumonía se debió a quimioatrayentes que no son CXCL8, que también fueron antagonizados eficazmente por CXCL8(3. 74)K1 1 R/G31 P. Basándose en estudios de las respuestas inflamatorias de roedores (Tateda y otros, 2001 ; Tsai y otros, 2000), reses (Caswell y otros, 1997), y humanos (Villard y otros, 1995), es evidente que estas muestras podrían contener muchas quimocinas CXC ELR+ (por ejemplo, CXCL5 y CXCL8), para las cuales CXCL8(3-74)K1 1 R/G31 P tiene un efecto antagonista.

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CUADRO 1 Alineación de CXCL8 de mamíferos seleccionados y el % de identidad con CXCL8 humana CUADRO 2 Resultados de actividad de proteína quimérica (% supresión) 1o 2o 3o 3o Media bG31P 56 72 51 53 58 hbG31P+7 11 36 66 46 39.75 hbG31 P/S37T+7 -2 -104 73 82 12.25 hbG31 P/T3K+7 -9 -35 34 -19 -7.25 hbG31P/T15K+T 16 -24 80 -38 8.5 hbG31P+6 70 20 45 hbG31P/S37T+6 -61 -82 -71.5 bG31 P/E35A+6 35 -132 -48.5 hbG31P/H13Y+6 52 -244 -96

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 .- Un péptido aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos de: XiELRCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLX PXXXWVQXXV XXFXKXXEXX2X3X4, en donde ?? , X2, X3 y X4 son independientemente de 0-10 residuos de aminoácido y X es cualquier aminoácido. 2.- El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque Xi es 0-8 aminoácidos. 3. - El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque cada X1 es 0-6 aminoácidos. 4. - El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque X1 se selecciona del grupo que consiste en GSK, GST, S, A, T, K, GSMGGSK y GSMGGST. 5. - El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque X1 es 0 aminoácidos. 6. - El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque cumple la condición de que la secuencia de aminoácidos no es la que se indica en cualquiera de las SEQ ID NO: 6-9. 7. - El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende una secuencia de aminoácidos como la que se indica en la SEQ ID NO: 13. 8. - Un péptido aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos de: Xi ELRCX6CIRX X21 EX23X24X25I 27SPP HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX50 PX52X53X54WVQX58X59V X61X62FX64KX66X67EX69X7oX7iX72 (SEQ ID NO: 43), en donde: X1 , X7o, X71 y X72 son independientemente 0-10 aminoácidos; y X6, Xl0. Xl 1 > Xl3, Xl6. Xl9, X21 , X23. 24. 25. 27> X33. X35. 2. X43. X45. X 7> d?. X52, X53. X54, X58, X59, ß? , 62> X64, ß6, ?7 y ß9 se seleccionan, cada uno independientemente, del grupo que consiste en A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V y Y. 9. - El péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque Xi es 0-8 aminoácidos. 10. - El péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque cada Xi es 0-6 aminoácidos. 1 1 .- El péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque Xi se selecciona del grupo que consiste en GSK, GST, S, A, T, K, GSMGGSK y GSMGGST. 12.- El péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque Xi es 0 aminoácidos. 13.- El péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque cumple la condición de que la secuencia de aminoácidos no es la que se indica en cualquiera de las SEQ ID NO: 6-9. 14.- El péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque comprende una secuencia de aminoácidos como la que se indica en la SEQ ID NO: 13. 15.- Un péptido aislado o purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de: XiELRCX6CIRXi0 XiiSXi3PFX16PKX19l 5 X2.1 EX23X24X25IX27SPP HCX33NX35EIIVK LX 2X43GX45EX47CLX5o PX52X53X54WVQX58X59V X61X62FX64KX66X67EX69X70X71X72 (SEQ ID NO: 4), en donde: X1 es 0-10 aminoácidos; X6 es Q, E o L; X10 es T o I; Xn es H o Y; X13 es T o K; Xi6 es H o N; X 9 es F o Y o L; X21 es K o B; X23 es L o M; X24 es R o T; X25 es V o A; X27 es D o E; X33 es V o A o E; X35 es T o S; X42 es S o V o T 10 o F; X43 es D o N; X 5 es R o A o N o K o D; X47 es L o V; X50 es D o N; X52 es K o H; X53 es E o Q o T; X54 es P o N o K; X58 es R o K o I; X59 es V o I; 6i es E o Q; X62 es K o I o V o A; X64 es L o V; X66 es R o K; X67 es A o T; X6g es S o N o K o G; X7o es Q o S o K, o se suprime; X71 es N o D, o se suprime; y X72 es P o A o S, o se suprime. , 15 16.- El péptido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque 1 es 0-8 aminoácidos. 17. - El péptido de conformidad con la reivindicación 15, ; caracterizado además porque X1 es 0-6 aminoácidos. 18. - El péptido de conformidad con la reivindicación 15, 20 caracterizado además porque X1 se selecciona del grupo que consiste en S, I I A, T, K, GSK, GST, GSMGGSK, GSMGGST, o se suprime. 19. - El péptido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque cumple la condición de que la secuencia de aminoácidos no es la que se indica en cualquiera de las SEQ ID NO: 6-9. 20.- Un péptido aislado que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos que se indica en cualquiera de las SEQ ID NO: 10- 41. 5 21 .- Una secuencia de polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de: X1 ELRCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLX I PXXXWVQXXV XXFXKXXEXX2X3X4, en donde X^, X2> X3 y X4 son independientemente 0-10 residuos de aminoácido y X es cualquier 10 aminoácido. 22. - La secuencia de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizada además porque X^ es 0-8 aminoácidos. 23. - La secuencia de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque X1 es 0-6 aminoácidos. , 15 24.- La secuencia de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque X1 se selecciona del grupo que consiste en GSK, GST, S, A, T, K, GSMGGSK y GSMGGST. 25.- La secuencia de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque X1 es 0 aminoácidos. 20 26.- La secuencia de polinucleótido de conformidad con la i reivindicación 2 , caracterizada además porque cumple la condición de que la secuencia de aminoácidos no es la que se indica en cualquiera de las SEQ ID NO: 6-9. 27.- Una secuencia de polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de: X! ELRCXeCIRX!o XnSXi3PFX16PKX19l HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX50 PX52X53X54WVQX58X59V X6iX62FX64KX66X67EX69X7oX7iX72 (SEQ ID NO: 43), en donde: X! , X70) X7i y X72 son independientemente 0-10 aminoácidos; y X6> X10, X , X13, Xi e, X19, X211 X231 X24. X25. X27, X33. X35, X42. X43» X45, X47, X50, X52, X53. X54, X58. ?d9» ?ß? , ?ß2, ??4, ?ßß, ?ß7 y ?ß9 se seleccionan, cada uno independientemente, del grupo que consiste en A D, E, F, G, H, I , K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V y Y. 28.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque X1 es 0-8 aminoácidos. 29:- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque cada X1 es 0-6 aminoácidos. 30. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque Xt se selecciona del grupo que consiste en GSK.- GST, S, A, T, K, GSMGGSK y GSMGGST. 31 . - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque X1 es 0 aminoácidos. 32. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque cumple la condición de que la secuencia de aminoácidos no es la que se indica en cualquiera de las SEQ I D NO: 6-9. 33. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque codifica una secuencia de aminoácidos como la que se indica en la SEQ ID NO: 13. 34. - Una secuencia de polinucleótido aislado que codifica una secuencia de aminoácidos de: Xi i SXi3PFXi6PKXi9l X21 EX23 X24X25IX27SPP HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX50 PX52X53X54WVQX58X59V X61X62FX64KX66X67EX69X7oX7iX72 (SEQ ID NO: 4), en donde: X1 es 0-10 aminoácidos; X6 es Q, E o L; X 0 es T o I; Xn es H o Y; X13 es T o K; X 6 es H o N; X19 es F o Y o L; X21 es K o R; X23 es L o M; X24 es R o T; X25 es V o A; X27 es D o E; X33 es V o A o E; X35 es T o S; X42 es S o V o T o F; X43 es D o N; X45 es R o A o N o K o D; X47 es L o V; X50 es D o N; X52 es K o H; X53 es E o Q o T; X54 es P o N o K; X58 es R o K o I ; X59 es V o I; X6i es E o Q; X62 es K o I o V o A; X64 es L o V; X66 es R o K; X67 es A o T; X6g es S o N o K o G; X7o es Q o S o K, o se suprime; X7i es N o D, o se suprime; y X 2 es P o A o S, o se suprime. 35. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque ^ es 0-8 aminoácidos. 36. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque X es 0-6 aminoácidos. 37. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque X1 se selecciona del grupo que consiste en: S, A, T, K, GSK, GST, GSMGGSK, GSMGGST, o se suprime. 38. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque cumple la condición de que la secuencia de aminoácidos no es la que se indica en cualquiera de las SEQ ID NO: 6-9. 39. - Un polinucleótido aislado que consiste esencialmente en una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoácidos como la que se indica en cualquiera de las SEQ ID NO: 10-41. 40. - Una célula transgénica que comprende el polinucleótido que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 21 -39. 41. - Un hospedero viral construido por ingeniería genética para comprender el polinucleótido que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 21 -39. 42. - Un vector de expresión que comprende el polinucleótido que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 21 -39, enlazado operativamente a una secuencia reguladora que controla la expresión de dicho polinucleótido en un hospedero adecuado. 43. - Una célula hospedera que comprende el vector de expresión que se reclama en la reivindicación 42. 44.- El uso del péptido que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 -20, en la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de una patología mediada por quimocina CXC. 45. - El uso que se reclama en la reivindicación 44, en donde el medicamento es útil para el tratamiento de una patología mediada por quimocina CXC-ELR. 46. - El uso que se reclama en la reivindicación 44, en donde el medicamento se formula para suministro intravenoso, suministro intradérmico o suministro subcutáneo. 47.- El uso que se reclama en la reivindicación 44, en donde la patología mediada por quimocina CXC se selecciona del grupo que consiste en: daño de isquemia-reperfusión, síndrome de dificultad respiratoria aguda inducida por endotoxemia, glomerulonefritis del tipo de complejo inmune, neumonía bacteriana y mastitis.