CN103399151A - Cxcl8细胞因子检测试剂在制备甲状腺***状癌的诊断试剂中的应用 - Google Patents

Cxcl8细胞因子检测试剂在制备甲状腺***状癌的诊断试剂中的应用 Download PDF

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方微园
李小英
叶蕾
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本发明涉及医药技术领域，特别涉及CXCL8细胞因子检测试剂在制备甲状腺***状癌的诊断试剂中的应用。将甲状腺***状癌标本中，分离和培养出原代肿瘤巨噬细胞，根据巨噬细胞通过分泌的细胞因子作用于肿瘤细胞的假设，对从PTC中分离的原代TAM进行了培养、收集获得其培养上清，将其刺激甲状腺***状癌细胞株，实验证明：TAM可促进甲状腺***状癌细胞的生长，随后将甲状腺***状癌细胞株、正常人PBMC和TAM等进行了检测，实验证明：在TAM中CXCL8高表达，所以，将CXCL8细胞因子应用在制备甲状腺***状癌的诊断试剂中，可以提高甲状腺***状癌的诊断率，避免甲状腺***状癌患者错过最佳的治疗时间。

Description

CXCL8细胞因子检测试剂在制备甲状腺***状癌的诊断试剂中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及CXCL8细胞因子检测试剂在制备甲状腺***状癌的诊断试剂中的应用。
背景技术
甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤，近年来发病率增长迅速，已成为最常见的恶性肿瘤之一，在美国女性中其发病率已高达第五位，在中国也已达到女性恶性肿瘤中第七位，其中90%是甲状腺***状癌(papillary thyroid cancer,PTC)。虽然PTC的死亡率和其他恶性肿瘤相比，死亡率比较低，但是PTC转移率很高，***转移率高达30%-50%，如果PTC转移和复发，病人没能及时诊断，结果丧失最佳手术时机，死亡率则显著升高，是预后不良的重要指标。
近年来，肿瘤微环境在肿瘤发生、发展中的作用和意义渐受重视，肿瘤的生物学行为不仅由肿瘤细胞本身决定，肿瘤微环境中的各细胞成分均参与肿瘤发生发展的各个环节。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophage,TAM)是肿瘤微环境中重要的细胞组分之一，荟萃分析发现，TAM的密度和不同类型肿瘤的不良预后均存在正相关，如淋巴瘤、乳腺癌、***癌等；与巨噬细胞分化和趋化有关的细胞因子的表达量也与肿瘤的不良预后相关；体内实验也证明TAM数量的增加或减少都可以显著影响肿瘤的生长和转移。
大量临床数据和实验结果都已经很明确提示巨噬细胞可以促进肿瘤的发生和肿瘤的恶性进展。在肿瘤的不同阶段和状态中，巨噬细胞都可以发挥着重要的作用，关于巨噬细胞和肿瘤之间紧密联系及相互作用的分子机制，也取得了一些进展成果，在这些联系中最重要的成分是细胞因子。研究表明：作为一个固有免疫细胞，巨噬细胞可以分泌大量的细胞因子，在巨噬细胞促进肿瘤发生发展的机制研究中，巨噬细胞产生的细胞因子是极其重要的效应分子，巨噬细胞主要通过其分泌的细胞因子，包括生长因子，炎症因子和趋化因子等，如EGF，VEGF，MMP等促进肿瘤的生长和进展。总体上来说肿瘤相关巨噬细胞可通过复杂的自分泌与旁分泌途径在促进肿瘤的生长和转移方面扮演着重要的角色。
将甲状腺***状癌肿瘤组织中的巨噬细胞分泌的细胞因子，作为检测甲状腺***状癌的评判标准，将其应用到甲状腺***状癌的诊断试剂中，到目前为止，还没有关于这方面的文献资料。
发明内容
本发明的目的是提供CXCL8细胞因子检测试剂在制备甲状腺***状癌的诊断试剂中的应用。
在肿瘤的生长中，多种肿瘤包括乳腺癌，肾癌，子宫内膜癌等的研究结果已证实，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）浸润密度与肿瘤生长呈正相关。大量体内动物实验和体外细胞实验研究证实TAM可能通过分泌表皮生长因子(EGF)、TGF-β、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，肝细胞生长因子(HGF)、血小板生长因子(PDGF)等生长因子,来促进肿瘤细胞的增殖和抵抗凋亡。在共培养的细胞实验中肿瘤细胞和巨噬细胞共培养或是在肿瘤细胞上予以收集的巨噬细胞培养上清刺激，均可促进肿瘤细胞的生长。
为了研究肿瘤相关巨噬细胞和甲状腺***状癌组织的生长关系，本发明将甲状腺***状癌肿瘤组织中的巨噬细胞分离出来之后培养24小时，收集其培养上清，对获得的TAM条件培养基进行细胞因子芯片分析，全面获得甲状腺***状癌中TAM分泌的细胞因子谱，发现甲状腺***状癌中的TAM培养上清中高表达多种细胞因子，如TNF-α、TNF-β、MIP、CXCL8、TGF-β等，其中以CXCL8表达最为显著。
将甲状腺***状癌标本中，分离和培养出原代肿瘤巨噬细胞，根据巨噬细胞通过分泌的细胞因子作用于肿瘤细胞的假设，对从PTC中分离的原代TAM进行了24小时培养收集获得其培养上清(conditional medium，CM)，将CM刺激甲状腺***状癌细胞株K1、PC-1和BCPAP细胞，观察培养上清对甲状腺***状癌细胞的侵袭能力的改变。实验证明：TAM可促进甲状腺***状癌细胞的生长，能显著提高PTC肿瘤细胞的侵袭能力；将甲状腺***状癌原代肿瘤巨噬细胞、甲状腺***状癌细胞株、正常人PBMC和TAM进行了realt-time PCR检测CXCL8mRNA的表达量，并对细胞株和原代TAM的培养上清进行ELISA测定CXCL8蛋白表达量，实验证明：在TAM中CXCL8高表达，所以，可将CXCL8细胞因子应用在甲状腺***状癌的诊断试剂中，可以提高甲状腺***状癌的诊断率，避免甲状腺***状癌患者错过最佳的治疗时间。
本发明的有益效果为：
1、TAM可促进甲状腺***状癌细胞的生长，能显著提高PTC肿瘤细胞的侵袭能力，而在TAM中CXCL8高表达，所以，可将CXCL8细胞因子检测试剂应用在制备甲状腺***状癌的诊断试剂中，可以提高甲状腺***状癌的诊断率，避免甲状腺***状癌患者错过最佳的治疗时间。
2、CXCL8细胞因子是TAM分泌的功能效应细胞分子，在TAM中高表达，故以CXCL8细胞因子作为甲状腺***状癌的诊断试剂中的有效评判细胞因子，其诊断正确率高。
附图说明
图1是肿瘤相关巨噬细胞培养上清与甲状腺***状癌细胞的影响关系图，说明肿瘤相关巨噬细胞可通过其分泌的细胞因子直接作用于肿瘤细胞，且能显著提高PTC肿瘤细胞的侵袭能力。
图2是甲状腺***状癌中分离的TAM的细胞因子芯片示意图，图中说明，CXCL8在甲状腺***状癌中分离的TAM中高表达。
图3是甲状腺***状癌中分离的TAM和PTC细胞系(K1，TPC-1，BCPAP)中CXCL8的mRNA水平对比图，图中说明,TAM中CXCL8mRNA表达量显著高于PTC细胞系。
图4是甲状腺***状癌中分离的TAM和PTC细胞和PTC组织及配对的癌旁正常甲状腺组织中CXCL8的mRNA水平对比图，图中说明，TAM中CXCL8mRNA表达量显著高于原代PTC细胞和PTC组织。
图5是PTC细胞系(K1，TPC-1，BCPAP)和原代TAM的培养上清的CXCL8蛋白表达量对比图，图中说明，甲状腺***状癌中TAM高表达CXCL8因子，CXCL8是TAM的效应分子。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
实施例1、甲状腺***状癌标本的收集
甲状腺***状癌（PTC）的手术标本在半小时内由手术室工作人员在手术切除甲状腺组织后立即送往病理科进行冰冻切片病理诊断，若初步病理结果为甲状腺***状癌的病理类型，在甲状腺***状癌癌灶组织在不影响后续完整的病理诊断的情况下，由病理科医生指导并帮助收集甲状腺***状癌的新鲜手术组织标本，在无菌条件下切取肿瘤组织迅速丢入装有胎牛血清和抗生素的D-Hank’s液的50mL无菌离心管中，立即送往实验室进行进一步的检测实验。本实验中，共收集60例甲状腺***状癌，用于分离和培养原代肿瘤相关巨噬细胞。
实施例2、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）培养上清与甲状腺***状癌细胞的影响关系
将实施例1中的甲状腺***状癌标本中，分离和培养出原代肿瘤巨噬细胞，根据巨噬细胞通过分泌的细胞因子作用于肿瘤细胞的假设，我们对从PTC中分离的原代TAM进行了24小时培养收集获得其培养上清(conditional medium，CM)，将CM刺激甲状腺***状癌细胞株K1、PC-1和BCPAP细胞，观察培养上清对甲状腺***状癌细胞的侵袭能力的改变。具体结果如图1所示，实验组与空白对照组相比，能显著促进PTC细胞的侵袭。在TAM细胞培养上清的刺激下，K1细胞从Boyden chamber上层穿透matrigel到下层的细胞数量增加50%，TPC-1和BCPAP细胞分别增加53.7%和73%，说明TAM可以通过其分泌的细胞因子直接作用于肿瘤细胞，且能显著提高PTC肿瘤细胞的侵袭能力。其中，*表示实验组和对照组相比p<0.05，**表示实验组和对照相比p<0.01,每个实验至少重复三次。
实施例3、肿瘤相关巨噬细胞中CXCL8细胞因子的表达情况
将甲状腺***状癌原代肿瘤巨噬细胞、甲状腺***状癌细胞株、正常人PBMC和TAM进行了realt-time PCR检测CXCL8mRNA的表达量，并对细胞株和原代TAM的培养上清进行ELISA测定CXCL8蛋白表达量。具体结果如图2-图5所示：
图2为甲状腺***状癌中分离的TAM的细胞因子芯片示意图，将甲状腺***状癌中分离的TAM，使用人细胞因子抗体芯片5检测细胞因子表达谱。细胞因子强阳性点用数字标出，其中1代表：正控制，2代表：负控制，3代表CXCL8，4代表：巨噬细胞炎症蛋白1β细胞因子，图中说明，CXCL8在甲状腺***状癌中分离的TAM中高表达。
图3为甲状腺***状癌中分离的TAM和PTC细胞系(K1，TPC-1，BCPAP)中CXCL8的mRNA水平对比图，使用健康志愿者PBMC做校正。从图中可知,TAM中CXCL8mRNA表达量显著高于PTC细胞系。
图4为甲状腺***状癌中分离的TAM和PTC细胞和PTC组织及配对的癌旁正常甲状腺组织中CXCL8的mRNA水平对比图，使用健康志愿者PBMC做校正。从图中可看出，TAM中CXCL8mRNA表达量显著高于原代PTC细胞(PTC cell)和PTC组织(PTC tissue)。
图5为PTC细胞系(K1，TPC-1，BCPAP)和原代TAM的培养上清进行ELISA测定CXCL8蛋白表达量，实验证实，甲状腺***状癌中TAM确实高表达CXCL8因子，CXCL8是TAM的效应分子。
综上所述，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）促进甲状腺***状癌细胞的生长，能显著提高PTC肿瘤细胞的侵袭能力，而在TAM中CXCL8高表达，所以，可将CXCL8细胞因子检测试剂应用在甲状腺***状癌的诊断试剂中，可以提高甲状腺***状癌的诊断率，避免甲状腺***状癌患者错过最佳的治疗时间。

Claims (1)

1.CXCL8细胞因子检测试剂在制备甲状腺***状癌的诊断试剂中的应用。
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