CN101484579B - Elr-cxc趋化因子的高亲和力拮抗剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了新的多肽序列,产生其的方法和将其用于新的ELR-CXC趋化因子受体激动剂和拮抗剂的用途。
Description
发明领域
本发明涉及CXC趋化因子受体拮抗剂领域。
发明背景
具有受体信号转导谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(ELR)基序(例如CXCL1/GROα,CXCL8/IL-8;Baggiolini,M.1998.Nature.392:565-568)的CXC趋化因子对介导多种情况下许多病理的炎症细胞的内流是重要的,所述病理包括缺血再灌注损伤(Sekido,N.et al.1993.Nature.365:654-657;Villard,J.et al.1995.Am.J.Respir.Crit.Care Med.152:1549-1554)、内毒素血症诱导的急性呼吸窘迫综合征(ARDS;Mukaida,N.et al.1998.Inflamm.Res.47 suppl.3):S151-157)、关节炎和免疫复合物型肾小球肾炎(Harada,A.et al.1996.Inflamm.Res.2:482-489)。例如,不适当释放的水解酶和来自激活的是中性粒细胞的活性氧(reactive oxygenspecies)启动和/或延续(perpetuate)该病理过程。另一方面,在大多数细菌感染期间,该趋化因子响应代表了至关重要的第一道防线。但甚至这样,ELR+ CXC趋化因子响应通过其激活显示CXCR1和CXCR2受体的炎症细胞的能力,加重了其病理。例如,在实验“盲肠穿刺及结扎”脓毒症中,MIP-2的中和将小鼠死亡率从85%降低到38%(Walley,K.R.et al.1997.Infect.Immun.65:3847-3851)。并且消除循环嗜中性粒细胞的实验性治疗改善了肺炎曼氏杆菌病的病理(Slocombe,R.et al.1985.Am.J.Vet.Res.46:2253),其中在呼吸道中的CXCL8表达不定地影响了嗜中性粒细胞的趋化吸引(Caswell,J.L.et al.1997.Vet.Pathol.35:124-131;Caswell,J.L.et al.2001.Canad.J.Vet.Res.65:229-232)。尽管这些趋化因子在许多情况下至关重要,但反复性炎症细胞响应具有足够的破坏力,以致开发我们能用来阻断ELR+趋化因子的治疗工具已经成为研究的优先考虑(Baggiolini,M.,and B.Moser.1997.J.Exp.Med.186:1189-1191)。
“ELR”趋化因子通过CXCR1和CXCR2受体来化学吸引和激活炎症细胞(Baggiolini,1998;Ahuja,S.K.,and P.M.Murphy.1996.J.Biol.Chem.271:20545-20550)。大部分哺乳动物表达CXCR1和CXCR2受体以及“ELR”趋化因子的直系同源物(通过种别形成从共同的祖先基因进化而来的不同物种中的基因)。这些同源(遗传或功能相关的)基因之间的序列相似性是高的;当考虑保守氨基酸取代(替换)的话,更高。小鼠和大鼠是例外,其中这些物种不具有CXCR1基因并且它们的CXCL8等价物与其他哺乳动物的差异很大。白介素8(CXCL8)不是物质特异的,因为来自一个物种的CXCL8可以在另外一个物种中具有功能(Rot,1991,Cytokine 3:21-27)。
CXCR1对CXCL8和CXCL6/粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)是特异的,而CXCR2以高亲和力结合CXCL8,但也以一定的更低亲和力结合巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)、CXCL1、CXCL5/ENA-78和CXCL6(参见例如Baggiolini and Moser,1997)。人CXCR1或CXCR2转染后细胞系中的CXCL8信号转导诱导等效的趋化响应(Wuyts,A.et al.1998.Eur.J.Biochem.255:67-73;Richardson,R.et al.1998.J.Biol.Chem.273:23830-23836),而响应CXCL8的嗜中性粒细胞胞质游离Ca++变化和细胞脱粒也通过这两种受体所介导,据报道呼吸爆发和磷脂酶D的激活只依赖于CXCR1(Jones,S.A.et al.1996.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S A.93:6682-6686.)。另一方面,已经报道CXCR2而不是CXCR1的非肽拮抗剂拮抗CXCL8介导的嗜中性粒细胞趋化性,但不拮抗细胞激活(White,J.R.et al.1998.J.Biol.Chem.273:10095-10098.)。总之,有充分的证据说明在炎症响应期间趋化因子是最经常冗余表达的(参见例如Caswell et al.,1997)。但是,尽管本领域的研究活跃,还没有任何现有技术中已知的CXC趋化因子拮抗剂有效抑制由任一ELR-CXC趋化因子受体诱导的有害炎症细胞活性。
发明综述
本发明的组合物包含能够结合哺乳动物细胞中的CXCR1或CXCR2受体的ELR-CXC趋化因子激动剂和拮抗剂蛋白。这些包括能够高亲和力结合的激动剂和拮抗剂,其中“高亲和力”是指激动剂或拮抗剂对受体的亲和力足以使其在生理相关浓度下能阻断野生型趋化因子激动剂。所述新拮抗剂蛋白也包括那些基本上等价(即那些包含氨基酸替换、添加和缺失而不缺失CXCR1和CXCR2结合功能)与野生型牛的和/或人的CXCL8蛋白(在本文中表示为氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2)并且也具有修饰的氨基末端氨基酸残基以及Lys11被Arg和Gly31被Pro取代(SEQ ID No.6)。该牛CXCL8(3-74)K11R/G31P的类似物也包括在内,被称为CXCL8(3-74)K11R/G31P/P32G(SEQ ID No.7)和CXCL8(3-74)K11R/T12S/H13F/G31P(SEQ ID No.8)。
本发明的其他组合物是与这些蛋白相关的新的多核苷酸和多肽。在其他实施方式中,提供了衍生自所述氨基酸序列的核苷酸序列。而且,本发明包括包含所述新的多核苷酸的载体,以及包含与控制所述多核苷酸表达的调节序列有效连接的新的多核苷酸的表达载体。相似地,本发明包括包含亲和柄和所述新的多核苷酸的基因融合物,以及包含这样的基因融合物的所得载体和表达载体。
本发明也包括经遗传改造而包含所述新的多核苷酸的宿主,以及经遗传改造而包含与调节序列有效地连接的所述新的多核苷酸的宿主,即是所述新的多核苷酸与调节序列以所述调节序列控制所述新的多核苷酸表达的方式结合。也包括包含基因融合物的宿主,所述基因融合物或者以调节序列控制所述基因融合物表达的方式与所述调节序列结合,或者没有这样的调节序列。这些宿主是病毒或细胞,其中后者包括而不限于细菌、酵母、原生质体、真菌、霉菌、植物细胞和动物细胞,以及衍生自以上各项的更高等等生物。
本发明还包括所述新的多肽在治疗涉及哺乳动物中CXCR1或CXCR2受体的CXC趋化因子介导的病理中的用途。同样地,本发明包括治疗涉及CXCR1或CXCR2受体的ELR-CXC趋化因子介导的病理中的方法,其包括向受侵害的哺乳动物施用有效量的所述新的多肽中的一种。本发明也包括包含生物活性量的所述新的多肽中的一种的药学组合物。
本发明也包括产生和纯化所述新的多肽的方法。
在本发明一方面中,提供了具有或包含如下氨基酸序列的纯化的或分离的肽:
XELRCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLXPXXXWVQXXV XXFXKXXEXX XX(SEQ ID No.3),其中X是任意氨基酸。
在本发明另一个实施方式中,提供了具有或包含如下氨基酸序列的纯化的或分离的肽:
X1ELRCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLXPXXXWVQXXV XXFXKXXEXX2X3X4
其中X1,X2,X3和X4独立地是0-10个氨基酸残基并且X是任意氨基酸。
在本发明另一个实施方式中,提供了具有或包含如下氨基酸序列的纯化的或分离的肽:
X1ELRCX6CIRX10 X11SX13PFX16PKX19I X21EX23X24X25IX27SPP
HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX50 PX52X53X54WVQX58X59V
X61X62FX64KX66X67EX69X70X71X72(限定的共有SEQ ID No.4)
其中
X1是0-10个氨基酸;
X6是Q、E或L;
X10是T或I;
X11是H或Y;
X13是T或K;
X16是H或N;
X19是F或Y或L;
X21是K或R;
X23是L或M;
X24是R或T;
X25是V或A;
X27是D或E;
X33是V或A或E;
X35是T或S;
X42是S或V或T或F;
X43是D或N;
X45是R或A或N或K或D;
X47是L或V;
X50是D或N;
X52是K或H;
X53是E或Q或T;
X54是P或N或K;
X58是R或K或I;
X59是V或I;
X61是E或Q;
X62是K或I或V或A;
X64是L或V;
X66是R或K;
X67是A或T;
X69是S或N或K或G;
X70是Q或S或K或缺失;
X71是N或D或缺失;以及
X72是P或A或S或缺失
根据本发明另一方面,提供了基本由以下任一项所示的氨基酸序列组成的分离的肽:
GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(bhG31P-SEQ ID No.10);
KELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hG31P(0)-SEQ ID No.11);
ELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hG31P(-1)-SEQ ID No.12);
GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hG31P(+2)-SEQ ID No.13);
GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hG31P(+6)-SEQ ID No.14);
GSTELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hG31P K3T-SEQ ID No.15);
GSKELRCQCIRTHSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hG31P Y13H-SEQ ID No.16);
GSKELRCQCIRTYSTPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hG31P K15T(0)-SEQ ID No.17);
GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCENTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hG31P A35E(0)-SEQ ID No.18);
GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANSEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hG31P T37S(0)-SEQ ID No.19);
GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hG31P S44T(0)-SEQ ID No.20);
GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGDELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hG31P R47D(0)-SEQ ID No.21);
GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKEKWVQRVVEKFLKRAENS(hG31P N56K(0)-SEQ ID No.22);
GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQKVVEKFLKRAENS(hG31P R60K(0)-SEQ ID No.23);
GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEVFLKRAENS(hG31P K64V(0)-SEQ ID No.24);
GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGREVCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hG31P L49V-SEQ ID No.25);
GSKELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(bhG31P T3K-SEQ ID No.26);
GSTELRCQCIRTYSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(bhG31P H13Y-SEQ ID No.27);
GSTELRCQCIRTHSKPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(bhG31P T15K-SEQ ID No.28);
GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCANSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(bhG31P E35A-SEQ ID No.29);
GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENTEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(bhG31P S37T-SEQ ID No.30);
GSMGGSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(bhG31P(+6)-SEQ ID No.31);
GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(bhG31P(+2)-SEQ ID No.32);
TELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(bhG31P(+0)-SEQ ID No.33);
ELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(bhG31P(-1)-SEQ ID No.34);
GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hK11R(+6)-SEQ ID No.35);
GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCENTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hK11RG31P A35E(+6)-SEQ ID No.36);
GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANSEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hK11RG31P T37S(+6)-SEQ ID No.37);
GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hK11RG31P S44T(+6)-SEQ ID No.38);
GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGDELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hK11RG31P R47D(+6)-SEQ ID No.39);
GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGREVCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hK11RG31P L49V-SEQ ID No.40);
GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTNGNEVCLNPKEKWVQKVVQVFVKRAEKQDP(牛3-74 K11RG31P(+2)-SEQ ID No.41)。
根据本发明另一方面,提供了包含编码如下氨基酸序列的核苷酸序列的分离的多核苷酸序列:
X1ELRCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLX
PXXXWVQXXV XXFXKXXEXX2X3X4
其中X1,X2,X3和X4独立地是0-10个氨基酸残基并且X是任意氨基酸。
根据本发明另一方面,提供了包含编码如下氨基酸序列的分离的多核苷酸序列:
X1ELRCX6CIRX10 X11SX13PFX16PKX19I X21EX23X24X25IX27SPP
HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX50 PX52X53X54WVQX58X59V
X61X62FX64KX66X67EX69X70X71X72(SEQ ID No.4)
其中
X1是0-10个氨基酸;
X6是Q、E或L;
X10是T或I;
X11是H或Y;
X13是T或K;
X16是H或N;
X19是F或Y或L;
X21是K或R;
X23是L或M;
X24是R或T;
X25是V或A;
X27是D或E;
X33是V或A或E;
X35是T或S;
X42是S或V或T或F;
X43是D或N;
X45是R或A或N或K或D;
X47是L或V;
X50是D或N;
X52是K或H;
X53是E或Q或T;
X54是P或N或K;
X58是R或K或I;
X59是V或I;
X61是E或Q;
X62是K或I或V或A;
X64是L或V;
X66是R或K;
X67是A或T;
X69是S或N或K或G;
X70是Q或S或K或缺失;
X71是N或D或缺失;以及
X72是P或A或S或缺失。
根据本发明另一方面,提供了基本由编码SEQ ID No.10-41任一项所示的氨基酸的核苷酸序列组成的分离的多核苷酸。
在本发明另一方面中,提供了包含上述多核苷酸的转基因细胞。所述多核苷酸可以是非天然的。
在本发明另一方面中,提供了经遗传改造而包含上述多核苷酸的病毒宿主。
在本发明另一方面中,提供了包含上述多核苷酸的表达载体,所述多核苷酸有效地连接至在合适宿主中控制所述多核苷酸表达的调节序列。
在本发明另一方面中,提供了包含上述表达载体的宿主细胞。
在本发明另一方面中,提供了如上所述的肽在制备用于治疗CXC趋化因子介导的病理的药物中的用途。
在本发明另一方面中,提供了治疗CXC趋化因子介导的病理的方法,其包括向由需要此治疗的个体施用有效量的上述肽。
附图说明
图1.CXCL8(3-74)K11R的G31P类似物是CXCL8结合外周血嗜中性粒细胞的有效抑制剂。将牛外周血嗜中性粒细胞(87-93%纯度)在4℃暴露于CXCL8(3-74)K11R类似物(10ng/ml)(上图)或单独培养基(中间)2小时,然后用生物素化的CXCL8(biotCXCL8;1000ng/ml或129nM)洗涤并相似地温育。这些CXCL8的水平类似于在具有肺巴斯德菌病(pneumonic pasteurellosis)的动物肺组织中发现的水平(参考文献8、9)。使用ELISA确定结合所述细胞的biotCXCL8的水平。CXCL8(3-74)K11R中所描述的氨基酸替换包括:G31P;P32G;T12S/H13P/G31P;和T12S/H13P/G31P/P32G。G31P,而非P32G类似物嗜CXCL8结合所述细胞的高效拮抗剂。对于G31P和P32G两者,T12S和H13F的附加取代降低了它们的CXCL8拮抗活性(下图)。将嗜中性粒细胞在4摄氏度同时暴露于多种浓度的CXCL8(3-74)K11R/G31P和未标记的CXCL8和20pM 125ICXCL8以45分钟。选择该水平的125I-CXCL8作为对于细胞高亲和力CXCL8受体的近似饱和(未显示数据)。使用计数器评估与细胞结合的125I-CXCL8的水平。数据清楚地说明CXCL8(3-74)K11R/G31P比CXCL8具有基本上更高的对嗜中性粒细胞的亲和力。
图2.CXCL8(3-74)K11R/G31P不是嗜中性粒细胞化学吸引应答或葡萄糖苷酶释放的激动剂。使用新鲜纯化的牛外周血嗜中性粒细胞,就如下各项的嗜中性粒细胞激动活性测试CXCL8和CXCL8(3-74)K11R的G31P、P32G或组合的G31P/P32G类似物(上图)。如在方法部分所描述的,在30分钟微趋化性分析法中测试对每种蛋白的趋化响应,并且将结果表示为平均(+/-SEM)细胞数量/40x物镜显微镜视野。G31P和G31P/P32G类似物两者都表现出很少discemable的趋化活性,而P32G类似物以100ng/ml刺激实质响应(下图)。如在方法部分所描述的,将嗜中性粒细胞暴露于不同剂量的每种类似物以30分钟,然后使用生色底物p-硝基苯基--D-葡萄糖苷酸(p-nitrophenyl--D-glucuronide),就葡萄糖苷酶分析细胞分泌产物。从用Triton-X-100裂解的等份试样中测定葡萄糖苷酶的总细胞储存。将每种处理的酶释放表示为从细胞储存的百分比。没有分析物具有实质上的激动活性,尽管CXCL8本身诱导显著的酶释放。用佛波醇-12,13-豆蔻酰二酯(phorbol-12,13-myristate acetate)和钙离子载体A23187的阳性对照处理诱导了42+/-6%的酶释放
图3.CXCL8(3-74)K11R-G31P是ELR-CXC趋化因子介导的嗜中性粒细胞化学吸引的高度有效的拮抗剂。使用20分钟的微趋化性分析法,测量CXCL8(3-74)K11R/G31P阻断牛嗜中性粒细胞对几种ELR-CXC趋化因子的趋化响应的能力。(左图)将细胞同时暴露于CXCL8(1μg/ml)和不同浓度的拮抗剂。如图2,通过直接计数趋化性分析膜来评估对CXCL8的响应的细胞数目。CXCL8(3-74)K11R/G31P是细胞对CXCL8响应的高度有效的竞争性抑制剂。(中图)人CXCL1,CXCL5或CXCL8对牛嗜中性粒细胞的化学吸引的剂量-响应曲线。每一种趋化因子表现出最大1-10ng/ml和1μg/ml的双相活性模式。(右图)如上评估CXCL8(3-74)K11R/G31P阻断细胞对1ng/ml人CXCL5或CXCL1或者10ng/ml人CXCL8的响应的能力。CXCL8(3-74)K11R/G31P通过用3-20nMCXCL8(3-74)K11R/G31P实现的完全抑制来有效拮抗每一个ELR-CXC趋化因子。
图4.CXCL8(3-74)K11R-G31P阻断表达在肺炎呼吸道或内毒素诱导的乳腺炎的CXCL8和非CXCL8的化学吸引物的活性。如图3中评估抗-IL8单克隆抗体8B6或CXCL8(3-74)K11R-G31P对嗜中性粒细胞响应患肺巴斯德菌病的动物呼吸道或在患内毒素诱导的乳腺炎的牛乳腺池中表达的化学吸引物的功效。(A)对来自肺炎牛(PNEUMONIA)的损伤肺叶的(1∶10)稀释的支气管肺泡灌洗液(BALF)或来自患乳腺炎的牛(MASTITIS)的***腔灌洗液以原样(无)或用抗-CXCL8 MAb 8B6(5μg/ml)或CXCL8(3-74)K11R/G31P(G31P;1或10ng/ml)治疗后,就其趋化作用相对于只用培养基进行测试。在两个样品中,单独的Mab8B6抗体中和样品中74%的趋化活性,而CXCL8(3-74)K11R/G31P可降低93-97%的响应。(B)为了使用备选的策略确证这些结果,我们接下来用单克隆抗体8B6免疫亲和基质吸附损伤BAL液,去除了其CXCL8含量>99%,然后测试其残余的趋化作用及CXCL8(3-74)K11R/G31P拮抗这些残余的非CXCL8的趋化活性的能力。样品中的总的和残余的趋化活性的剂量依赖性的抑制指示在这些损伤中同时表达CXCL8和非CXCL8的化学吸引物。
图5.CXCL8(3-74)K11R-G31P可在体内除去内毒素诱导的炎症响应。两周龄的荷斯坦牛用来测试在静脉内(i.v.)、皮下(subcutan.)或肌肉内(i.m.)注射CXCL8(3-74)K11R-G31P(75μg/kg)之前和之后的不同时间,其嗜中性粒细胞对皮内内毒素(1μg/位点)攻击的炎症响应。在治疗后0、16、48和72小时获得15小时内毒素反应位点活检,并进行嗜中性粒细胞响应的组织病理学评估,该评估是通过计数每个切片上9个40x物镜显微镜视野的嗜中性粒细胞数目来确定。(左图)在治疗前(0h)和治疗后48h的网状层中的血管周围,对内毒素攻击的组织响应的显微照片。大量的嗜中性粒细胞积累于治疗前的网状层中的脉管***而不在治疗后的组织中。(B)图形表示对在通过每种途径递送CXCL8(3-74)K11R-G31P之前(0h)或之后(16,48,72h)的内毒素攻击的嗜中性粒细胞响应。**或***=p 0.01或0.001,分别地,相对于内在对照处理前的响应。
图6评估纯化自特应性哮喘或特应性非哮喘供者(左图)或的具有嗜酸性粒细胞增多的受试者(右图)的血液中的嗜酸性粒细胞在存在或不存在指示剂量的重组牛CXCL8(3-74)K11R/G31P(G31P)时,对于重组的人CXCL8,CXCL5或CCL11的响应。低剂量的G31P能够阻断这些细胞对CXCR1和CXCR2的每一种配体的响应,但不作用于嗜酸性粒细胞对不相关CCR3配体CCL11/eotaxin的响应。
图7测试来自健康供者外周血的嗜中性粒细胞在存在或不存在牛CXCL8(3-74)K11R/G31P(G31P;10ng/ml)时,对于重组人CXCL8或CXCL5的响应。G31P阻断嗜中性粒细胞对两种配体的响应。
图8 hbG31P异构体的物理特征。
图9比较bG31P和hbG31P(CXCL8拮抗剂)
图10A hbG31P类似物不是嗜中性粒细胞激动剂。图10B hbG31P的拮抗活性。
图11 hbG31P羧基端序列对其拮抗活性的影响。
图12激动剂和CXCL8类似物-构建体的活性
图13比较bG31P和hG31P+6的拮抗活性。
图14 hG31P拮抗ENA78,一个CXCR2特异性的配体。
图15 hG31P拮抗CXCL8诱导的ROI释放。
图16 hG31P拮抗在支气管扩张症和囊肿性纤维化患者痰液中的嗜中性粒细胞趋化活性。
图17 hG31P减轻内毒素血症小鼠的肺部炎症。
图18 hG31P在豚鼠的病态呼吸道内毒素血症中的作用。
图19不同hG31P异构体(和hbG31P)在豚鼠的呼吸道内毒素血症病理中的作用。
图20不同hG31P异构体(和hbG31P)在豚鼠的呼吸道内毒素血症病理中的作用。
图21 hbG31P突变作用于阻断响应人IL-8和GROa的人嗜中性粒细胞(PMN)细胞内Ca内流。评估了hbG31P和其突变体对阻断由人IL-8和GROa刺激的PMN细胞内Ca释放[Ca]i的活性。将100ng/ml的bG31P、hbG31P和hbG31P突变体与用2μM Fluo-4AM染色的2×105PMNs一起孵育15分钟,然后用100ng/ml IL-8或GROα刺激。然后用荧光光度计读出样品的荧光。数据表示为[Ca]I测量的面积。一般地,hbG31P的突变体同hbG31P,bG31P一样对由IL-8和GROa刺激的PMN[Ca]I表现有效的激动活性。
图22 hbG31P突变体表现出在LPS刺激的皮肤测试中对阻断PMN迁移到炎症位点的不同效果。评估了hbG31P及其突变体的阻断PMN浸润到LPS刺激的炎症位点的拮抗活性。数据表示为用0.5μg LPS和250μg/ml bG31P、hbG31P或其突变体处理后,皮下和皮内组织的40倍显微视野内的被阻断PMN的数目与仅用LPS处理的炎症位点的PMN的数目的百分比。此数据清楚地显示hbG31P与bG31P具有等同的阻断活性。H13Y比T3K、E35A表现出更好的拮抗活性。T15K表现微弱的阻断作用。同时,S37T没有表现出任何拮抗活性。
发明详述
本公开自始至终使用下列缩写:ARDS,急性呼吸窘迫综合症;BALF,支气管肺泡灌洗液;BHR,Bolton-Hunter试剂;CXCR1、CXCR2、CXCL8受体A、B,分别地;ELR,谷氨酸-赖氨酸-精氨酸基序;CXCL1,生长相关的原癌基因α;CXCL4,血小板因子-4;CXCL5,上皮来源的嗜中性粒细胞活化因子-78;CXCL6,粒细胞趋化蛋白-2;CXCL8,白介素-8;fMLP,甲酰甲硫氨酰-亮氨酰脯氨酸细菌三肽;IPTG,异丙基-硫-D-吡喃半乳糖苷;MIP-2,巨噬细胞炎性蛋白-2;PMSF,苯甲基磺酰氟;TMB,四甲基联苯胺。
如本文所用,“激动剂”是指引起细胞活化的试剂。
如本文所用,“拮抗剂”是指阻止细胞在激动剂存在或不存在时被活化的试剂。
如本文所用,“纯化的”不要求绝对的纯净度而是旨在作为相对的定义取而代之。例如,初始材料或天然材料的纯化到达至少一个数量级,优选地两个或三个数量级明确预期达到“纯化的”定义。
如本文所用,术语“分离的”要求将材料从其原始环境中分离出来。
如本文所用,术语“治疗”在其不同的文法形式下是指预防、治愈、逆转、减弱、缓和、使最小化、抑制或阻止疾病状态的有害作用、疾病进程、致病试剂的其它异常状态。
如本文所用,“有效量”是足以达到所需结果的量。正如本领域技术人员所理解的,这样的量当然是依据被治疗个体的年龄、体重和状况。
当CXCL8的氨基酸端截短与在11位氨基酸的赖氨酸变为精氨酸的替换相组合时(即,CXCL8(3-74)K11R),CXCR1和CXCR2受体亲和力发生明显的戏剧性的增加,从而CXCL8(3-74)K11R竞争性抑制多个配体结合到这两个受体上(Li,F.,and J.R.Gordon.2001.Biochem.Biophys.Res.Comm.286:595-600.,hereby incorporated byreference)。而且在一些CXC趋化因子的受体信号转导ELR基序上(例如,人CXCL8的4-6位氨基酸)的进一步截短可将其转化为轻微(CXCL8(6-72))或中度的(CXCL1(8-73))受体拮抗剂(McColl and ClarkLewis 1999;Moser,B.et al.1993.J.Biol.Chem.268:7125-7128)。如本文所公开,向牛CXCL8(3-74)K11R引入第二个氨基酸替换,31位的甘氨酸变为脯氨酸残基(即,CXCL8(3-74)K11R/G31P),使此CXCL8类似物成为牛和人ELR-CXC趋化因子响应的非常高亲和力的拮抗剂。其完全拮抗在细菌或内毒素诱导的炎性病灶表达的整个系列的ELR-CXC趋化因子,并阻断体内由内毒素诱导的炎症。
尽管下列讨论的一部分主要围绕牛嗜中性粒细胞,但是其他哺乳动物(包括人)的炎症细胞也显示CXCR1和CXCR2受体(参见,例如,Benson,M.et al.1999.Pediatr.Allergy Immunol.10:178-185)并且易受CXCL8(3-74)K11R/G31P的抑制。因此,本发明对哺乳动物ELR-CXC趋化因子介导的病理具有广谱的应用性。
正如本领域技术人员所理解的,本文所用的命名法,“3-74”是指事实上天然的CXCL8为74个氨基酸长度(“74”)并且前两个氨基酸已被切除,意味着肽序列“开始”于天然序列的第3个氨基酸。至于命名法的一致性,通过基于野生型序列的数字指示氨基酸,如“G31P”是指在野生型序列的第31位氨基酸上甘氨酸替换为脯氨酸。如本领域技术人员所理解的,参照SEQ ID No.1,鉴于前两个氨基酸的缺失脯氨酸实际上在第29位氨基酸上。
本发明的其他实施方案中,提供了能够结合哺乳动物炎症细胞的CXCR1或CXCR2受体的ELR-CXC趋化因子拮抗蛋白。在一个优选的实施方案中,这些肽基本等同于具有序列SEQ ID No.1的肽,其中,如本领域技术人员所理解的,基本等同于表示这些肽具有的氨基酸序列对于野生型CXCL8蛋白(本文表示为氨基酸序列SEQ ID NO:2)至少60%一致、或至少65%一致、或至少70%一致、或至少71%、或至少72%一致、或至少73%一致、或至少74%一致、或至少75%一致、或至少76%一致、或至少77%一致、或至少78%一致、或失少79%一致、或至少80%一致、或至少81%一致、或至少82%一致、或至少83%一致、或至少84%一致或至少85%一致、或至少86%一致、或至少87%一致或至少88%一致或至少89%一致或至少90%一致或至少91%一致或至少92%一致或至少93%一致或至少94%一致或至少95%一致,并且也具有前两个氨基酸的截短连同Lys11替换为Arg和Gly31替换为Pro。如本领域技术人员所理解,在许多实施方案中,这些肽如下讨论约为69、70或72个氨基酸长度。然而,在其他实施方案中,上述肽可包括缺失和/或***1、2、3、4、5、6或更多个氨基酸。如本领域技术人员所理解,可通过肽的三维结构或通过比较相关生物体的序列预测肽上可耐受***或缺失的区域。
例如,参照表1显示的来自许多物种的野生型CXCL8序列的肽的比对,所述物种包括牛、人、恒河猴、绵羊、狗和猪,一个猪的序列包括***在对应于牛的野生型序列的60位和61位氨基酸之间的一个附加氨基酸,其说明这是一个在其他物种中可能耐受一个或多个氨基酸***的位点。相似地,在人和猪序列中,分别缺失在牛序列C端相关的2和3个氨基酸,说明在其他物种中也可能承受C端的至少2-3个氨基酸的缺失。如本领域技术人员所理解的,这也表明可耐受在这些肽的C端氨基酸的添加或替换,即,不会对所护肽的所需的生物活性有显著负面影响。
应该理解本领域众所周知,在肽的结构中产生一些修饰和变化基本不会改变所述肽的生物功能,从而获得生物学上等同的多肽。本发明的一个方面,上述肽可包括由保守性氨基酸替换而产生差异的肽。本发明的肽也扩展为由保守性氨基酸替换而产生差异的生物学上等同的肽。如本文所用,术语“保守性氨基酸替换”是指在肽的给定位置的一个氨基酸替换为另一个氨基酸,其中产生所述替换而基本不丢失相关功能,在这种情况下,为表位折叠。在产生这类变化时,产生类似氨基酸残基的替换可根据侧链取代基相对相似性,例如,其尺寸、电荷、疏水性、亲水性等等,并且可通过常规测试分析这些替换对于所述肽的功能的影响。这些实施方案中,功能是指CXCL8趋化因子的拮抗活性。
在一些实施方案中,产生保守氨基酸替换,其中一个氨基酸残基被替换为具有相似亲水性值(例如,值为+或-2.0之间)另一个氨基酸残基,其中下列为具有为氨基酸残基指定的亲水系数为约-1.6的氨基酸,如Tyr(-1.3)或Pro(-1.6)(如United States Patent No.4,554,101所述,通过引用并入本文):Arg(+3.0);Lys(+3.0);Asp(+3.0);Glu(+3.0);Ser(+0.3);Asn(+0.2);Gln(+0.2);Gly(0);Pro(-0.5);Thr(-0.4);Ala(-0.5);His(-0.5);Cys(-1.0);Met(-1.3);Val(-1.5);Leu(-1.8);Ile(-1.8);Tyr(-2.3);Phe(-2.5);以及Trp(-3.4)。
在备选的实施方案中,产生保守氨基酸替换,其中一个氨基酸残基被替换为具有相似亲水系数(例如,值为+或-2.0之间)的另一个氨基酸残基。在这些实施方案中,每个氨基酸残基可根据其疏水性和电荷特征指定一个亲水系数,如下:Ile(+4.5);Val(+4.2);Len(+3.8);Phe(+2.8);Cys(+2.5);Met(+1.9);Ala(+1.8);Gly(-0.4);Thr(-0.7);Ser(-0.8);Trp(-0.9);Tyr(-1.3);Pro(-1.6);His(-3.2);Glu(-3.5);Gln(-3.5);Asp(-3.5);Asn(-3.5);Lys(-3.9);以及Arg(-4.5)。
在备选的实施方案中,产生保守氨基酸替换,其中一个氨基酸残基被替换为相同类别的另一个氨基酸残基,其中氨基酸被划分为非极性、酸性、碱性和中性类别,如下:非极性:Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、Met;酸性:Asp、Glu;碱性:Lys、Arg、His;中性:Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr。
在其他实施方案中,产生替换,其中给定位置上替换任何已知氨基酸。在一些实施方案中,进化非保守或弱保守的氨基酸可被替换为任意氨基酸,例如具有相似尺寸但不同疏水性、相似电荷但不同尺寸的氨基酸或其他为本领域技术人员所理解的相似类型的替换。
因而,构建CXCL8(3-74)K11RG31P的类似物,其中如本文所讨论通过在SEQ ID No.6所示序列中的***、缺失和替换保持所需生物功能。另外注明将示范性类似物显示于Nos.7-41中。
在一个优选的实施方案中,使用例如表1中所示,几个物种来源的相关序列的比较来制备CXCL8(3-74)G31P的基本等同的类似物。如本领域技术人员所理解,在高度可变氨基酸位置的替换比高度保守的氨基酸替换更可能被耐受。
例如,表1所示序列比较,接着通过N端两个氨基酸的缺失和31位甘氨酸替换为脯氨酸以及11位赖氨酸替换为精氨酸提供了如下序列:
XELRCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLX
PXXXWVQXXV XXFXKXXEXX XX(SEQ ID No.3)其中X是任何氨基酸。在一些实施方案中,X为天然氨基酸。
在本发明另一个实施方案中,提供了包含如下氨基酸系列的分离或纯化的肽:
X1ELRCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLX
PXXXWVQXXV XXFXKXXEXX2X3X4(SEQ ID No.42)
其中X1、X2、X3和X4独立地是0-10个氨基酸残基并且X为任意氨基酸。也就是,X1可为例如6个随机氨基酸长度而X2、X3和X4可全部是0个氨基酸长度,即缺失。在其他实施方案中,X1可为2个非天然氨基酸,即,不是MS(牛)或SA(人)而是任意其他2个氨基酸,X2可为S或Q并且X3和X4可缺失。
备选地,X1可为0-9个氨基酸,0-8个氨基酸,0-7个氨基酸或0-6个氨基酸或0-5个氨基酸,或0-4个氨基酸,或0-3个氨基酸,或0-2个氨基酸,或者X1可选自GSK、GST、S、A、T、K、GSMGGSK和GSMGGST,或X1可缺失。
应该认识到在一些实施方案中提供了不具有SEQ ID No.6、7、8或9的氨基酸序列的肽。
在本发明另一个实施方案中,提供了包含如下氨基酸序列的分离或纯化的肽:
X1ELRCX6CIRX10 X11SX13PFX16PKX19I X21EX23X24X25IX27SPP
HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX50 PX52X53X54WVQX58X59V
X61X62FX64KX66X67EX69X70X71X72(SEQ ID No.43)
其中:
X1、X70、X71和X72独立地是0-10个氨基酸;并且
X6、X10X11、X13X16X19X21X23X24X25X27X33X35X42X43X45X47X50X52X53X54X58X59X61X62X64X66X67X69中每一个独立地选自:A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V和Y。
备选地,X1、X70、X71和X72独立地为0-9个氨基酸、0-8个氨基酸、0-7个氨基酸或0-6个氨基酸或0-5个氨基酸、或0-4个氨基酸、或0-3个氨基酸、或0-2个氨基酸、或者X1可选自GSK、GST、S、A、T、K、GSMGGSK和GSMGGST,或X1可缺失。
在其他实施方案中,X1可为2个非天然氨基酸,即,不是MS(牛)或SA(人)而是任意其他2个氨基酸,X70可为S或Q并且X71和X72可缺失。
应该认识到在一些实施方案中提供了不具有SEQ ID No.6、7、8或9的氨基酸序列的肽。
在本发明另一个实施方案中,提供了包含如下氨基酸序列的分离或纯化的肽:
X1ELRCX6CIRX10 X11SX13PFX16PKX19I X21EX23X24X25IX27SPP
HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX50 PX52X53X54WVQX58X59V
X61X62FX64KX66X67EX69X70X71X72(SEQ ID No.4)
其中,
X1为0-10个氨基酸;
X6为Q、E或L;
X10为T或I;
X11为H或Y;
X13为T或K;
X16为H或N;
X19为F或Y或L;
X21为K或R;
X23为L或M;
X24为R或T;
X25为V或A;
X27为D或E;
X33为V或A或E;
X35为T或S;
X42为S或V或T或F;
X43为D或N;
X45为R或A或N或K或D;
X47为L或V;
X50为D或N;
X52为K或H;
X53为E或Q或T;
X54为P或N或K;
X58为R或K或I;
X59为V或I;
X61为E或Q;
X62为K或I或V或A;
X64为L或V;
X66为R或K;
X67为A或T;
X69为S或N或K或G;
X70为Q或S或K或缺失;
X71为N或D或缺失;并且
X72为P或A或S或缺失。
备选地,X1可为0-9个氨基酸,0-8个氨基酸,0-7个氨基酸或0-6股氨基酸或0-5个氨基酸,或0-4个氨基酸,或0-3个氨基酸,或0-2个氨基酸,或X1可选自GSK、GST、S、A、T、K、GSMGGSK和GSMGGST,或者X1可缺失。
应该认识到在一些实施方案中提供了不具有SEQ ID No.6、7、8或9的氨基酸序列的肽。
在本发明另一个实施方案中,提供了包含如下氨基酸序列的分离或纯化的肽:
X1ELRCQCIRT X11SX13PFHPKFI KELRVIESPP
HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX50 PKEX54WVQX58VV
X61X62FX64KRAEX69X70X71X72(SEQ ID No.4)
其中,
X1为GSK、GST、S、A、T、K、GSMGGSK、GSMGGST或缺失;
X11为H或Y;
X13为T或K;
X33为A或E;
X35为T或S;
X42为S或T;
X43为D或N;
X45为R或N或D;
X47为L或V;
X50为D或N;
X54为N或K;
X58为R或K;
X61为E或Q;
X62为K或V;
X64为L或V;
X69为N或K;
X70为Q或S或缺失;
X71为D或缺失;并且
X72为P或缺失。
应该认识到在一些实施方案中提供了不具有SEQ ID No.6、7、8或9的氨基酸序列的肽。
在其它实施方案中,提供了具有或包含或基本上由或由任一SEQID No.6-41或SEQ ID No.10-41中所述的氨基酸序列组成的分离或纯化的肽。作为参考,这些氨基酸序列如下:
TELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTNGNEVCLNPKEKWVQKVVQVFVKRAEKQDP(牛3-74 K11RG31P-SEQ ID No.6)
TELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESGGHCENSEIIVKLTNGNEVCLNPKEKWVQKVVQVFVKRAEKQDP(牛3-74 K11R P32G-SEQ ID No.7)
TELRCQCIRSPSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTNGNEVCLNPKEKWVQKVVQVFVKRAEKQDP(牛3-74 T12SH13PG31P-SEQ ID No.8)
TELRCQCIRSPSTPFHPKFIKELRVIESPGHCENSEIIVKLTNGNEVCLNPKEKWVQKVVQVFVKRAEKQDP(牛3-74 T12SH13PG31PP32G-SEQ ID No.9)
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GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGREVCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS(hK11RG31P L49V-SEQ ID No.40);和
GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTNGNEVCLNPKEKWVQKVVQVFVKRAEKQDP(牛3-74 K11RG31P(+2)-SEQ ID No.41).
如本领域技术人员所理解的,用于关于上述肽的“基本上由...组成”是指所述肽可包括例如实质上不影响所述活性的N端和/或C端缺失的情况,也就是,在考虑中的所述肽的ELR-CXC趋化因子的激动或拮抗活性。
在优选的实施方案中,分离或纯化的肽如SEQ ID No.13(hG31P+2)或SEQ ID No.14(hG31P+6)所示。通过参考图12、19和20可见并如下面的讨论,与hG31P+0和hG31P-1相比,这些肽似乎表现出更强的相对活性。
如本文所讨论的,编码上述肽的多核苷酸在本发明的范围内,并且通过使用本领域已知的方法来构建。如本领域技术人员理解的,如下所讨论的包含这些多核苷酸或者用这些多核苷酸转化或转染的转基因细胞或细胞系在本发明的范围内。
例如,对病毒寄主经遗传改造而包含所述多核苷酸或者含有上述多核苷酸并且可操作地连接至控制所述多核苷酸表达的调节序列的表达载体,可使用本领域已知的技术构建这样的病毒宿主。
而且,上述肽可用在制备用于治疗CXC趋化因子介导的病理的药物。在一些实施方式中,所述药物用于治疗ELR-CXC趋化因子介导的病理。所述CXC趋化因子介导的病理选自:局部缺血再灌注损伤、内毒素血症诱导的急性呼吸窘迫综合征、免疫复合物型肾小球肾炎、细菌性肺炎和乳腺炎。
如本领域技术人员理解的,这样的药物包含有效量的任一上述肽,将其施用至有此治疗需要的个体。
在本发明的备选实施方式中,预期在所述结合位点具有相同三维结构的化合物可用作拮抗剂。化学结构的三维分析用于确定活性位点的结构,包括趋化因子的结合位点。高通量筛选的化学前导(chemicalleads)已经用于产生和化学优化CXCR2的选择性拮抗剂(J Biol Chem,1998,273:10095,通过引用并入本文)。相似的方法也用于产生CCR3拮抗剂(J Biol Chem,2000,275:36626,通过引用并入本文)。
Wells等人(J Leuk Biol,1996,59:53,herein incorporated byreference)已经用核磁共振光谱(NMR)以详细显示CXCR的配体的三维结构,其中包括ELR和非ELR CXC趋化因子两者。根据他们的NMR信息,Wells等人在多种趋化因子的受体结合位点内产生了多个替换,使得他们基本上改变了配体的受体特异性。
材料和方法
试剂和用品。以下试剂市售购得:谷胱甘肽-Sepharose,表达载体pGEX-2T,Sephadex G-25(Amersham-Pharmacia-Biotech,Baied′Urf,PQ),Bolton-Hunter试剂,蛋白生物素化试剂盒(PierceScientific,Rockford,Ill.),测序载体pBluescript II KS,PfuTurbo.TM.DNA聚合酶你(Stratagene,La Jolla,Calif.),定点诱变试剂盒(QuickChange.TM.;Boerhinger-Mannheim Canada,Laval,PQ),抑肽酶,苯,钙离子载体A23187,氯胺T,细胞松弛素B,二甲基甲酰胺,内毒素(大肠杆菌脂多糖,血清型0127B8),异丙基-硫-D-吡喃半乳糖苷(IPTG),亮肽素,对硝基苯--D-葡萄糖苷酸,矿物油,硅油,四甲基联苯胺(TMB),苯甲基磺酰氟(PMSF),佛波醇-12,13-肉豆蔻酰二酯(PMA),和Triton X-100(Sigma Chemical Co,Mississauga,ON),Diff-Quick染色试剂盒(American ScientificProducts,McGaw Pk,Ill.),人CXCL1,CXCL5和CXCL8(R & D SystemsInc,Minneapolis,Minn.),辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的抗-兔Ig(Zymed,South San Francisco,Calif.),DMEM,HBSS(Gibco,GrandIsland,N.Y.),HRP-链霉亲和素(Vector Labs,Burlingame,Calif.),ABTS酶底物(Kirkegaard & Perry Labs,Gaithersburg,Md.),牛血清白蛋白(BSA),和淋巴细胞分离培养基(ICN Pharmaceuticals,Aurora,Ill.).
CXCL8(3-74)K11R类似物的产生。根据Li和Gordon(2001,同上)所述的方法产生高亲和力CXCR1/CXCR2配体CXCL8(3-74)K11R及其T12S/H13F类似物。通过使用合适的正向和反向多核苷酸引物(表1)的PCR的定点诱变,相似地产生这些蛋白的Gly31Pro(G31P)、Pro32Gly(P32G)和G31P/P32G类似物。用DpnI消化每个反应的产物,将其连接到载体pGEX-2T,转染到HB101细胞,并且它们的序列经商业确认(Plant Biotechnology Institute,Saskatoon)。简言之,在存在蛋白酶抑制剂混合物(2mM PMSF、2μg/ml抑肽酶和2μg/ml亮肽素)情况下裂解所述重组细菌,并且根据Caswell等人(Caswell,J.L.,D.M.Middleton,and J.R.Gordon.1998.Vet.Immunol.Immunopath.67:327-340.)的方法,使用谷胱甘肽-Sepharose珠通过亲和层析来纯化上清液中的重组融合蛋白。通过凝血酶消化,从GST融合蛋白剪切CXCL8(3-74)K11R类似物,针对磷酸缓冲液(PBS)透析,通过市购内毒素去除柱,并随后通过用山羊抗-牛CXCL8抗体(由Dr.M.Morsey提供)的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印记对其表征。每种纯化的类似物具有分子量为8kDa,在Western印记中被抗CXCL8抗体所特异识别,并且如在PAGE凝胶中光密度分析所测定的具有96%的相对纯度。
重组蛋白的标记。我们使用biotCXCL8用于类似物结合嗜中性粒细胞的最初观察,并使用125I-CXCL8用于相对受体亲和力的其后阶段的分析。对CXCL8生物素化,并使用市售试剂盒测定生物素替换的水平,如Li和Gordon(2001,同上)所述。biotCXCL8被每摩尔CXCL8的2.15摩尔生物素所替换。如Li和Gordon(2001,同上)所详述的,使用Bolton-Hunter试剂(BHR)方法用125I对CXCL8进行放射性标记。通过Sephadex G50上的层析,从未渗入的125I-BHR中分离标记的蛋白,如Li和Gordon(2001,同上)所述,就CXCL8对嗜中性粒细胞的相对亲和力和达到结合平衡的时间对标记的CXCL8表征。
CXCL8(3-74)K11R类似物结合分析。根据Caswell方法(Caswell,J.L.et al.1998.Vet.Immunol.Immunopath.67:327-340),从牛血液中纯化细胞(85-93%嗜中性粒细胞)。在预实验中,通过台盼蓝染料排出所测定的,我们确定了我们的类似物都不影响嗜中性粒细胞的存活力。对于广泛的类似物的观察,将HBSS/0.5%BSA中的嗜中性粒细胞在在4℃与类似物温育2小时,在冷DMEM中洗涤,然后在4℃与biotCXCL8(1000ng/ml)温育另外的2小时。通过将洗涤的细胞与碱性磷酸酶-缀合的链霉亲和素(1∶700稀释),再与ABTS酶底物温育来检测细胞结合的生物素。使用ELISA平板读取仪测定所述样品的OD405。培养基处理的嗜中性粒细胞通常结合足够的biotCXCL8而产生0.5-0.6的OD405。
对于CXCL8(3-74)K11R/G31P的深入研究,我们在抑制分析中使用125I-CXCL8连同未标记的CXCL8或CXCL8(3-74)K11R/G31P。在预实验中,我们确定了嗜中性粒细胞对125I-CXCL8待结合平衡时间是45分钟,而20pM 125I-CXCL8刚好饱和细胞的高亲和力受体。因此,在我们的分析中,将106个纯化的嗜中性粒细胞在冰上与20pM 125I-CXCL8和多种浓度的未标记竞争剂配体温育45分钟。随后通过含6%矿物油的硅油沉淀所述细胞,并使用计数器测定细胞结合放射性配体的水平。通过在一组样品中包括200倍摩尔过量的未标记配体,在每个分析中评估125ICXCL8对细胞的非特异性结合。该数值用于计算特异性结合百分比(Coligan,J.,A.Kruisbeek,D.Margulies,E.Shevach,and W.Strober.1994.Current Protocols in Immunology.John Wiley &Sons,New York)。
嗜中性粒细胞-葡萄糖苷酸酶释放分析。在Li和Gordon(2001,同上)中详细报道了嗜中性粒细胞-葡萄糖苷酸酶释放分析。简言之,将细胞松弛素B处理的嗜中性粒细胞与CXCL8类似物温育30分钟,随后就该酶测热地分析其分泌产物。-葡萄糖苷酸酶释放表示为总细胞内容物的百分比,通过用0.2%(v/v)Triton X-100裂解培养基处理的细胞来测定。用阳性对照刺激物PMA(50ng/ml)和A23187(1μg/ml)的嗜中性粒细胞攻击诱导了总细胞--葡萄糖苷酸酶库的42+/-6%的释放。
来自炎性病变的样品。我们从具有诊断的临床脓性纤维蛋白肺炎曼氏杆菌病(fibrinopurulent pneumonic mannheimiosis)的牛(n=4)的肺中得到支气管肺泡灌洗液(BALF)(Caswell et al.1997),并从具有实验内毒性诱导的乳腺炎的牛(n=4)中得到***腔洗液(teatcistern wash fluids)(Waller,K.P.1997.Vet.Immunol.Immunopathol.57:239-251)。在预剂量-相应实验中,我们确定了5μg内毒素诱导强(最大70-80%)的乳腺嗜中性粒细胞响应。因此,在报道的实验中,通过将5μg内毒素或单独的载体培养基(盐水;3ml体积)输注到非泌乳Holstein奶牛的***腔中来诱导实验乳腺炎,15小时后通过灌洗30ml HBSS从***腔中修复该侵润。通过离心沉淀来自BALF和***腔洗液的细胞,并进行分类计数(differential counts)。通过ELISA(仅CXCL8)和趋化性分析,就其趋化因子含量分析未处理的和CXCL8耗尽(如下)的洗液。
嗜中性粒细胞趋化性分析。根据已知的方法(Caswell etal.,1998;Cairns,C.M.et al.2001.J.Immunol.167:57-65),使用无聚乙烯吡咯烷酮的5μm孔尺寸的聚碳酸酯滤膜,在一式两份的改进Boyden微趋化性隔室中进行微趋化性分析。对于每一个样品,通过在至少9个40x物镜视野中直接计数,来计算20-30分钟内迁移到所述膜上的细胞的数量,并且将结果表示为细胞/40x视野(+/-SEM)的平均数量。所述趋化吸引物包括牛或人CXCL8、人CXCL5和CXCL1,肺炎曼氏杆菌病BALF和乳腺炎灌洗液(在HBSS中稀释1∶10-1∶80),而所述拮抗剂包括小鼠抗羊CXCL8抗体8M6(由Dr.P.Wood,CSIRO,Australia慷慨提供)或CXCL8(3-74)K11R类似物。在一些分析中,我们将所述样品与所述抗体(5μg/ml)在冰上预温育60分钟(Gordon,J.R.2000.Cell Immunol.201:42-49)。在其他分析中,我们用8M6抗体和蛋白-A-Sepharose珠产生CXCL8特异性免疫亲和基质,并将其过量用于吸收所述样品(Caswell et al.,1997;Gordon,J.R.,andS.J.Galli.1994.J.Exp.Med.180:2027-2037);通过所处理样品的ELISA来确证CXCL8耗尽的程度。对于使用重组拮抗剂对分析,在即将测试前将所述抑制剂直接与所述样品混合。
CXCL8 ELISA。对于我们的ELISA,MAb 8M6作为捕获抗体,兔抗羊CXCL8抗血清(也来自P.Wood,CSIRO)作为第二抗体,而HRP缀合的抗兔Ig和TMB作为检测***,如Caswell等人(1997)所述。对每个样品的系列稀释物进行一式三份的分析,每个分析包括重组牛CXCL8标准曲线。
CXCL8(3-74)K11R/G31P体内阻断内毒性响应。我们使用连续系列的15小时皮肤测试以测试CXCL8(3-74)K11R/G31P体内阻断内毒性诱导的炎性响应的能力。对于每次测试,我们使用含1μg内毒素的100μl盐水皮内攻击2周龄的健康Holstein牛,15小时后再局部麻醉(利多卡因)下取6mm穿刺活检并对其进行组织病理学分析(Gordon andGalli,1994)。在第一次(内部阳性对照)测试后,我们对每个动物进行皮下、肌肉内或静脉内注射含CXCL8(3-74)K11R/G31P(75μg/kg)盐水,随后如上用内毒素对它们进行攻击。对所述动物攻击总共4次内毒素,从而在处理后0、16、48和72小时获得15小时反应位点活检。通过常规方法将所述活检加工成6μm石蜡切片,用吉姆萨溶液染色,并在400放大倍率下以盲法进行检查(Gordon and Galli,1994;Gordon,J.R.2000.J.Allergy Clin.Immunol.106:110-116)。在皮肤中的3个不同深度,***(表)、中和网状(深)真皮中测定每40x物镜显微镜视野中嗜中性粒细胞的平均数目。
统计学分析。通过ANOVA和post-hoc Fisher保护的最小显著性差异(PLSD)测试来分析多组数据,而使用学生t检验(双尾)进行2组队比较。结果表示为平均+/-SEM。
结果
1.牛G31P
CXCL8(3-74)K11R/G31P竞争性抑制CXCL8与嗜中性粒细胞的结合。我们观察了每种CXCL8(3-74)K11R类似物与嗜中性粒细胞上的CXCL8受体结合,并从而作为配体与CXCL8竞争的能力。在我们最初的观察中,我们应用了biotCXCL8结合抑制分析,在将所述细胞暴露于biotCXCL8(1μg/ml)之前将其与所述类似物(10ng/ml)在4℃温育2小时。CXCL8的该水平类似于具有实验肺炎曼氏杆菌病的绵羊的肺组织中发现的水平(Caswell,J.L.1998.The role of interleukin-8 as aneutrophil chemoattractant in bovine brohchopneumonia.Ph.D.thesis,Department of Veterinary Pathology,University ofSaskatchewan)。我们发现在该分析中,CXCL8(3-74)K11R/G31P是CXCL8的有效拮抗剂(图1),例如10ng/ml的CXCL8(3-74)K11R/G31P阻断95%的随后biotCXCL8与细胞的结合。但在该剂量测试时,CXCL8(3-74)K11R/P32G仅阻断48%的CXCL8结合,而未标记的CXCL8本身竞争性抑制30%的biotCXCL8结合。将在Thr12的His13的附加氨基酸替换引入CXCL8(3-74)K11R/G31P或CXCL8(3-74)K11R/P32G实质上降低了所述类似物的拮抗活性(图1)。该数据清楚地表明用CXCL8(3-74)K11R/G31P与嗜中性粒细胞预先温育强烈地下调了随后的CXCL8的结合。
为了更好地反映CXCL8(3-74)K11R/G31抑制CXCL8的结合的能力,在我们随后的一组实验中,我们将所述细胞同时暴露于125ICXCL8以及多种剂量的CXCL8(3-74)K11R/G31P或未标记的CXCL8。我们发现在抑制20pM 125I-CXCL8和所述细胞的结合中,CXCL8(3-74)K11R/G31P比野生型CXCL8更有效约2个数量级(图1)。抑制50%标记配体结合的浓度(IC50),对于未标记的CXCL8是120pM,对于CXCL8(3-74)K11R/G31P是4pM。该数据说明CXCL8(3-74)K11R/G31P是CXCL8与嗜中性粒细胞结合的非常有效的竞争性抑制剂。
CXCL8(3-74)K11R/G31P不显示嗜中性粒细胞激动活性。尽管CXCL8(3-74)K11R/G31P当然是嗜中性粒细胞CXCL8受体的高亲和力配体,其同等地作为激动剂或拮抗剂。因此,我们其后的实验探索了我们产生的CXCL8(3-74)K11R类似物的潜在激动活性,通过测量它们在体内趋化吸引这些细胞或诱导嗜中性粒水解酶-葡萄糖苷酸酶的释放的能力(图2)。我们发现甚至在100ng/ml时CXCL8(3-74)K11R/G31P还是弱的趋化吸引物,诱导的响应分别为1或100ng/ml CXCL8诱导响应的13.9+/-4%或5.4+/-2%(p<0.001)。在100ng/ml时,CXCL8(3-74)K11R/P32G类似物诱导相当大的响应(CXCL8响应的38.3+/-2%),而组合的CXCL8(3-74)K11R/G31P/P32G类似物也不是有效的趋化吸引物。当我们评估其诱导葡萄糖苷酸酶释放的活性,我们发现没有任何CXCL8(3-74)K11R的类似物像CXCL8一样有效地诱导中介释放。实际上,我们发现其中任一种在10ng/ml是仅有背景释放,并且在100ng/ml时仅有CXCL8(3-74)K11R/G31P/P32G诱导显著的嗜中性粒细胞响应(图2)。根据组合的CXCL8竞争性抑制和嗜中性粒细胞激动剂的数据,从这一观点出发我们将注意力放在CXCL8(3-74)K11R/G31P上。
CXCL8(3-74)K11R/G31P阻断嗜中性粒细胞对CXCR1和CXCR2配体的趋化响应。不适当ELR+趋化因子表达的主要病理效应为吸引炎症细胞到组织中。因此,我们接着评估了CXCL8(3-74)K11R/G31P对于嗜中性粒细胞对高剂量CXCL8的趋化响应的影响(图3)。如通过我们在绵羊和牛上体内观察所预测(33),1μg/ml(129nM)CXCL8具有非常强的趋化吸引活性,但甚至非常低剂量的CXCL8(3-74)K11R/G31P改善此响应。添加12.9pM CXCL8(3-74)K11R/G31P减少33%的所述细胞趋化响应。在这些条件下的CXCL8(3-74)K11R/G31P的IC50为0.11nm,而10nM的CXCL8(3-74)K11R/G31P可实现完全阻断此CXCL8响应。
当我们测试CXCL8(3-74)K11R/G31P在阻断更轻微的牛CXCL8攻击的响应的效力时,我们也将研究扩展到评估CXCL8(3-74)K11R/G31P阻断嗜中性粒细胞对人CXCL8以及对人CXCR2特异性配体CXCL1和CXCL5的响应的能力。这些中的每一个以1-10ng/ml表达在胰腺炎的受影响组织中(Hochreiter,W.W.et al.2000.Urology.56:1025-1029)或ARDS(Villard et al.,1995)患者中。我们发现牛嗜中性粒细胞对1ng/ml的hCXCL1或hCXCL5有响应,并且对10ng/ml的hCXCL8有类似的响应(图3),所以我们用这些剂量来测试CXCL8(3-74)K11R/G31P对这些配体的嗜中性粒细胞响应的效果。0.26和0.06nM的CXCL8(3-74)K11R/G31P分别将嗜中性粒细胞对hCXCL1和hCXCL5的响应减少到50%,而0.04nM的CXCL8(3-74)K11R/G31P将其对hCXCL8的响应减少到50%(图3)。此数据表明CXCL8(3-74)K11R/G31P可拮抗趋化因子的ELR-CXC亚家族中多个成员的行为。
CXCL8(3-74)K11R/G31P是表达在细菌性肺炎或乳腺炎病变中的嗜中性粒细胞趋化因子的有效的体外拮抗剂。我们希望测试我们的拮抗剂阻断在体内复杂的炎症环境中表达的嗜中性粒细胞趋化吸引物系列的程度。因此,我们选择了两种疾病,乳腺炎和肺炎曼氏杆菌病,其中趋化因子驱使的嗜中性粒细胞活化对病理进程具有重要贡献。我们使用乳腺炎的内毒素模型(Persson,K.et al.,1993.Vet.Immunol.Immunopathol.37:99-112),其中我们用5μg内毒素灌注每个***腔并在15小时之后灌洗每个***腔。嗜中性粒细胞分别包括82%和6%的来自内毒素和盐水对照***腔的细胞,以及大量的包含巨噬细胞的剩余细胞。(1∶10)稀释的灌洗液诱导强的体外嗜中性粒细胞趋化响应,并且添加抗-CXCL8抗体到样品中最多降低73+/-8%的响应(图4A),相比于培养基对照。另一方面,添加1ng/ml的CXCL8(3-74)K11R/G31P到样品中降低97+/-3%的响应。
嗜中性粒细胞也包含从患有晚期肺炎曼氏杆菌病的牛的BALF中复原的细胞的93+/-12%。但进行体外测试时,这些样品也对嗜中性粒细胞有强烈的趋化作用,并且添加抗-CXCL8抗体最大降低其嗜中性粒细胞趋化活性的73+/-5%(图4A)。相对于培养基对照,用1或10ng/ml的CXCL8(3-74)K11R/G31P处理这些BALF样品分别降低嗜中性粒细胞响应的75+/-9或93+/-9%。此数据说明CXCL8(3-74)K11R/G31P阻断CXCL8和非CXCL8趋化吸引物在这些样品中的作用。
为了使用备选策略确证这些观察,我们接下来用免疫亲和基质耗尽细菌性肺炎BALF样品中的CXCL8,然后评估CXCL8(3-74)K11R/G31P在这些样品中对阻断残余嗜中性粒细胞趋化活性的效率(图4B)。未处理的病变BALF样品含3,215+/-275pg/ml的CXCL8,而免疫亲和吸收的BALF含有24+/-17pg/ml的CXCL8。在这一系列实验中,嗜中性粒细胞对耗尽CXCL8后的BALF样品的响应是其对未吸收样品响应的65.4+/-4%。已知在来自大量临床病例的肺炎曼氏杆菌病BALF中CXCL8可促成少至15%的嗜中性粒细胞趋化活性(Caswell et al.,2001)。然而,CXCL8耗尽处理可以99%有效的去除CXCL8,但这些样品中仍残余相当量的嗜中性粒细胞趋化活性,而添加1ng/ml的CXCL8(3-74)K11R/G31P可彻底废除其累积效应(图4B)。此数据明白地确证了CXCL8(3-74)K11R/G31P也拮抗在这些样品中表达的广谱的非IL-8趋化吸引物。
CXCL8(3-74)K11R/G31P高度有效的阻断体内的内毒素诱导的嗜中性粒细胞炎症。在我们最后的试验中,我们评估了CXCL8(3-74)K11R/G31P阻断在牛皮肤中的内毒素诱导的炎症响应的能力,以及其生效的时间框架。在静脉内、皮下或肌肉内注射CXCL8(3-74)K11R/G31P(75μg/kg)之前15h(内部阳性对照响应),或之后的3个不同时间用1μg细菌内毒素皮内攻击动物。于是,在治疗前15分钟以及在注射拮抗剂到每个动物体内之后的16、48、72小时进行15h内毒素反应位点的穿刺活检,以盲法测定每个活检中***(表层)、中层和网状层皮肤的浸润的嗜中性粒细胞数目。在拮抗剂治疗之前,每个动物的内毒素攻击位点上的强嗜中性粒细胞炎症响应明显(图5)。在活检中,所有动物中在***皮层的响应轻微(数据未显示)并且随着皮肤深度增加逐渐更加显著,如此以致在网状层皮肤的血管周围观察到最强的炎症(嗜中性粒细胞浸润)(图5A)。在CXCL8(3-74)K11R/G31P治疗后,相对于其各自的治疗前的响应,在16h活检中观察到的炎症响应被抑制了88-93%,而在48h活检中被抑制了57%(静脉内)-97%(皮内)。在治疗后的72h静脉内施用的拮抗剂的效果已耗尽,而内毒素响应在皮内和皮下治疗的牛中仍有60%的抑制。此数据清楚的证明了CXCL8(3-74)K11R/G31P是体内的内毒素诱导炎症响应的高度有效的拮抗剂,这些作用可持续2-3天,并且递送途径显著影响这种新的拮抗剂的药物动力学。
我们已发现G31P也拮抗人ELR-CXC趋化因子CXCL8/IL-8和CXCL5/ENA-78对人嗜中性粒细胞的趋化作用。于是,通过添加10ng/ml的我们的拮抗剂到趋化性分析中基本上完全阻断0.1-500ng/ml的CXCL8(图6,左图)或CXCL5/ENA-78(图6,右图)的趋化活性。相似地,G31P阻断CXCL8对CXCR1/CXCR2阳性嗜酸性粒细胞的作用。我们及其他人已发现来自特应性的或哮喘的受试者的嗜酸性粒细胞表达两种ELR-CXC趋化因子受体,并对CXCL8响应(图7,左图)。通过添加10ng/ml的G31P到趋化性分析中,完全废除100ng/ml的CXCL8对轻度特应性、非哮喘患者的纯化外周血嗜酸性粒细胞(99%)的趋化作用而不能废除CCR3配体CCL11/eotaxin的趋化作用(图7,中图)。当对从嗜酸性粒细胞增多的患者中纯化的嗜酸性粒细胞进行测试时,G31P中和这些细胞对CXCL8/IL-8或CXCL5/ENA-78的响应。
此数据清楚地表明牛G31P是体内表达的牛ELR-CXC趋化因子对内毒素攻击的有效的拮抗剂,而且也可完全拮抗嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞ELR-CXC趋化因子受体对CXCL8和CXCL5(CXCR1和CXCR2的已知配体)的响应。
人源化的牛G31P
我们产生了牛-人嵌合蛋白,包括牛G31P的氨基端的一半和人CXCL8(bhG31P)(SEQ ID No.10)羧基端的一半,发现其在体内和体外具有强的嗜中性粒细胞拮抗活性;确实地,bhG31P比bG31P或G31P的人源形式具有更强的活性。我们也产生并表征了5种bhG31P的变体形式(SEQ ID No.26-30),其中人的氨基酸用来替换残余的牛的氨基酸-这些不能增强所述类似物的拮抗活性,并且一些证据说明他们可降低其拮抗活性。
作为产生人用药物的一种途径,我们采用bG31P的人源化。而且,因为CXCL8的氨基端的“一半”对于CXCL8的生物活性比羧基端更重要,并且因为CXCL8的羧基端的“一半”包含所述分子中15个牛-人差异氨基酸中的10个,所以我们首先检测了将hCXCL8的羧基端(也就是,编码氨基酸45-72)批量连接到bG31P的氨基端一半(也就是编码氨基酸3-44)上是否会影响其活性。特别是,已知CXCL8的氨基端一半携带重要的受体识别和信号基序以及其相关的脚手架结构。
我们由此产生了嵌合牛-人G31P蛋白,bCXCL8(3-44)K11R/G31P-hCXCL8(45-72)(bhG31P)(SEQ ID No.10),于是使用此蛋白的cDNA作为模板对残余的牛-人差异氨基酸残基进行逐一替换,如上所述。
我们用SOP表达和纯化了每一个构建体来进行肠激酶裂解(仅bhG31P+0和bhG31P-1异构体)或凝血酶裂解(全部其他类似物),并通过SDS-PAGE和Western印记对其表征(图8)。每个异构体的大小为≈8kD,尽管bhG31P/T15K(SEQ ID No.28)和bhG31P/S37T(SEQID No.30)异构体溶液似乎含有可解释为低水平的拮抗剂二聚体,所述二聚体形成可能是样品中高浓度的蛋白所致或备选地可能涉及这些G31P类似物与二聚化相关的那些部分的扰动。先前已经报道过这个区域的几个氨基酸显著影响人CXCL8的二聚化。
我们发现bhG31P(也就是,bCXCL8(3-44)K11R/G31P-hCXCL8(45-72))保持bG31P的ELR-CXC趋化因子拮抗活性,如此以致它阻断人嗜中性粒细胞对CXCL8的趋化性的或活性氧中间体(ROI)释放响应(图9)。
当我们通过引入附加的人-等价氨基酸取代差异残基来进一步人源化此牛-人嵌合蛋白(即,T3K(SEQ ID No.26)、H13Y(SEQ IDNo.27)、T15K(SEQ ID No.28)、E35A(SEQ ID No.29)和S37T(SEQID No.30)),我们发现这些变化的确对于50∶50bh嵌合体的活性没有显著影响,即不赋予如在趋化性分子中所评估的任何对嗜中性粒细胞拮抗的类似物(图10A)也不会显著地降低通过趋化性抑制或通过活性氧中间体释放的抑制所评估的拮抗活性(图10B)。
如所注明的,我们评估了变化氨基末端序列(即,bhG31P+6、bhG31P+2、bhG31P+0、bhG31P-1)(分别地SEQ ID Nos.14、13、11和12)对bhG31P活性的影响,测定在趋化性抑制或通过活性氧中间体释放的抑制分析中每一个的活性(图11)。然而我们发现剔除Lys3倾向于降低bhG31P的活性,其他类似物的拮抗活性大体等同(图11)。如本领域技术人员所理解,此数据表明可以耐受N端添加不同长度和不同氨基酸组合物而不显著破坏G31P的活性。因此,N端添加0-10个随机氨基酸或0-9个随机氨基酸或0-8个随机氨基酸或0-7个随机氨基酸或0-6个随机氨基酸或0-5个随机氨基酸或0-4个随机氨基酸或0-3个随机氨基酸或0-2个随机氨基酸。
综合考虑,此数据说明多个牛-人嵌合形式的G31P作为嗜中性粒细胞拮抗剂。然而应该注意,当我们即将完成对这些嵌合体的表征时,我们确定CXCL8(3-72)K11R/G31P的人源形式对于阻断CXCL8驱使的嗜中性粒细胞响应和bG31p一样有效,并且hG31P也是细菌内毒素驱使的体内嗜中性粒细胞炎症和病理的高度有效的拮抗剂。由此,在这一点上我们及时将我们的主要努力转移到全面对我们的hG31P构建体进行定性。
3.人G31P(hG31P)
我们签约Takara Biotechnology Co.,Dalian,PRC来合成全长人CXCL8的cDNA,我们使用兼容的5’(BamH1)和3’(EcoR1)末端将所述cDNA克隆进pGEX-2T。此pGEX-hCXCL8 cDNA用做模板进行定点突变来产生作为GST融合蛋白表达并使用标准操作程序通过凝血酶裂解进行纯化的pGEX-hCXCL8(3-72)K11R(hK11R)和pGEX-hCXCL8(3-72)K11R/G31P(hG31P)。与bhG31P(上面)一样,我们产生了以6个(Gly-Ser-Met-Gly-Gly-Ser)或2个(Gly-Ser)外来氨基酸为前缀的两个家族的重组的G31P相关分子,被称为hG31P+6(SEQ ID No.14)或hG31P+2(SEQ ID No.13),而且还产生不带有外来氨基酸(G31P+0)(SEQ ID No.11)或另外的氨基酸缺失(即,G31P-1、G31P-3、或G31P-5)的另外的构建体家族。我们也向hG31P+6在氨基酸位点35(SEQ ID No.36)、37(SEQ ID No.37)、44(SEQ ID No.38)、47(SEQ ID No.39)和49(SEQ ID No.40)导入牛等同氨基酸。每一个蛋白被表达、纯化并通过SDS-PAGE和Western印记进行表征。如预测,每一个包含可与抗-CXCL8抗体反应的~8kD的单一条带。
CXCL8类似物的生物特性。我们使用纯化的人嗜中性粒细胞的趋化性分析评估激动剂和每个构建体的CXCL8拮抗活性(图12).
hCXCL8(3-72)K11R(hK11R)-hK11R比人CXCL8具有显著的更高特异性的活性(嗜中性粒细胞的趋化性分析),如此以致它代表了比人趋化因子更强的嗜中性粒细胞激动剂。由此,hK11R可用于需要增强嗜中性粒细胞的补充/活化的临床情况。
hK11R+6中的hCXCL8(3-72)K11R/G31P(hG31P)-G31P替换基本消除了此分子的激动活性,如此以致hG31P+6是至少与bG31P一样有效的CXCL8驱使的嗜中性粒细胞趋化性的拮抗剂。
hG31P的不同的N端结构的确影响所述类似物的生物活性,如此以致hG31P+6和hG31P+2似乎是CXCL8趋化性的更好的拮抗剂,然而hG31P+0和hG31P+2相对于bG31P+6具有明显更低的趋化性拮抗活性。有趣地,当比较他们抑制CXCL8诱导的人嗜中性粒细胞的ROI释放的能力时,不同的N端序列对所述类似物的拮抗活性具有更低的影响,而每个类似物表现高度显著的ROI释放拮抗活性。ROI释放是依赖于嗜中性粒细胞内的NADPH氧化酶的活性,并且已经报道NADPH氧化酶在CXCR2的控制之下而不是CXCR1的控制之下。
这些不同的N末端替换类似物的不同程度效力的原理是hG31P+2或hG31P+6上多余的2个或6个残基可能通过空间位阻进一步降低ELR基序(即在G31P上)与CXCR1/CXCR2的相互作用的可能性。
为了进一步证明hG31P拮抗CXCR2功能的能力,我们评估了其抑制CXCL5(ENA-78)依赖性嗜中性粒细胞趋化性的能力;CXCL5是CXCR2特异的配体,但不是CXCR1特异的配体。hG31P+6以剂量依赖方式拮抗其趋化活性(图14)。
我们也评估了在嗜中性粒细胞趋化性分析中,相对于单独的PBS,hG31P的多种N末端类似物是否具有显著的激动活性。我们发现在嗜中性粒细胞部分上没有对任意所述改变的N末端类似物的显著响应。
我们其后评估了在hG31P+6中的人-牛差异氨基酸的附加替换是否放大该hG31P的拮抗活性。我们产生并测试了hG31P/A35E、hG31P/L49V、hG31P/R47D、hG31P/S44T和hG31P/T37S,并发现所有这些都是无效的激动剂。在35、37、44、47或49位置引入牛的等效氨基酸,差异地降低这些类似物的拮抗活性,因此R47D和S44T类似物似乎放大了CXCL8的活性,而不是对其抑制,而A35E、L49V和T37S类似物未表现出显著的趋化性抑制活性。
我们之前证明了bG31P能够拮抗在遭受肺炎的细菌性恶化的脓肿性纤维化(CF)患者的痰液中存在的嗜中性粒细胞趋化活性。因此,我们测试了hG31P阻断痰液中存在的嗜中性粒细胞趋化活性的能力,所述痰液来自患轻度(n=1)、中度(n=2)、重度(n=2)或晚期(n=2)CF的患者,也来自患未分级(n=2;bact)、中度(n=2)或重度(n=2)支气管扩张的患者。来自被诊断为哮喘、COPD或普通窦炎/支气管炎的患者的痰液也在有或无hG31P+6情况下进行操作。除了一个对照哮喘患者外,所有其他患者对不同细菌物种(例如嗜血菌属(Haemophilus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus))都是培养阳性的。在预实验重对每个样品滴定,以确定在所述趋化性分析中使用的最佳稀释度。G31P在阻断所有样品中存在的嗜中性粒细胞趋化活性中是有效至显著有效的,除了那些来自晚期CF患者的样品。这说明在晚期CF患者中观察到的病理中存在其他病因。
hG31P体内拮抗嗜中性粒细胞炎症
我们之前证明了bG31P阻断内毒素诱导的皮肤嗜中性粒细胞炎症和呼吸道内毒素血症病理的能力。因此,我们其后评估了hG31P在呼吸道内毒素血症模型中的活性。
呼吸道内毒素血症的小鼠模型
由于小鼠是小动物,并且其比豚鼠(我们的标准模型)需要基本上更少的G31P,我们首先测试了小鼠中hG31P+6对嗜中性粒细胞炎症的保护作用。在预实验中,我们确定了1.5mg/kg的LPS剂量提供了对BALB/c小鼠的合适的攻击;这完全与豚鼠相反,后者中5μg/kgLPS诱导强烈的呼吸道嗜中性粒细胞增多(neutrophilia)、发烧和肺胸膜出血响应。在单个小鼠实验(n=5/组)中,对小鼠皮下(s.c)给予盐水或者100、250或500μg/kg hG31P+6,1小时后在轻微异氟泼尼龙气体麻醉下,用LPS(1/5mg/kg)对它们进行鼻内攻击。16小时后,用CO2对所述动物进行安乐死,取血液、支气管肺泡灌注(BAL)液和肺组织用于分析。尽管之前的指导试验已经证明150μg/kg的bG31P在LPS腹膜炎模型中具有很小的作用,hG31P+6在降低呼吸道总白细胞和嗜中性粒细胞浸润、肺实质嗜中性粒细胞增多中高度有效,以及在降低呼吸道中出现的红细胞至更低和多种程度有效。(图17)。
呼吸道内毒素血症的豚鼠模型
我们也在3个实验中应用了呼吸道内毒素血症的豚鼠模型。在一个实验中,对动物给予超最佳剂量的内毒素(50μg/kg),而在第二和第三实验中,用标准5μg/kg的LPS剂量攻击它们,但用以多种水平递送的G31P。在每个实验中,用LPS鼻内攻击动物,并在相同时间用G31P皮下处理。15小时后,处死动物,如上评估其外周血(WBC差异)和肺响应(BAL WBC数目、差异和嗜中性脱粒产物水平和组织嗜中性粒细胞增多)。
高(致病)剂量LPS攻击实验
在≥50μg/kg的剂量,LPS在豚鼠中引起严重的肺损伤,包括严重流血至呼吸道,尽管在这些剂量,肺的嗜中性粒细胞浸润被减弱,相对于使用+/-5μg/kg LPS所观察到的。我们发现甚至使用50μg/kg LPS攻击,hG31P+6在降低呼吸道中红细胞(RBC)的出现十分有效(图18)。G31P治疗也降低BAL中嗜中性粒细胞的平均数目。
hG31P和hbG31P在呼吸道内毒素血症病理中的功效
我们比较了hG31P+0、hG31P-1、hG31P+2和hG31P+6,以及牛-人嵌合bhG31P+6(其似乎在体外抗人CXCL8依赖嗜中性粒细胞募集中高度有效)的相对治疗功效。另外,我们向豚鼠组中递送250μg/kg每种G31P异构体(s.c.;n=5),并且通过呼吸道用5μg/kg大肠杆菌LPS对它们进行攻击,15小时后对这些动物实施安乐死,并且评估它们的外周血嗜中性粒细胞增多,和呼吸道嗜中性粒细胞和红细胞水平,以及2种嗜中性颗粒标记物-乳铁蛋白(lactoferrin)(嗜中性粒细胞1号颗粒特异标记物)和髓过氧化物酶(嗜中性粒细胞2号颗粒特异标记物)的水平。在250μg/kg的剂量,每种测试的G31P异构体基本上除去嗜中性粒细胞对呼吸道的浸润(BAL嗜中性粒细胞),并显著降低RBC的出现、BAL中的乳铁蛋白和髓过氧化物酶(图19)。似乎hG31P+2比其他给出更好的保护,但当考虑所有参数时该保护不明显更好。对于每个所评估的参数而言,bhG31P嵌合体也在该***中高度有效。
毒理性测试.
进行了bG31P毒性的预实验。在经设计优化免疫敏感性的时间框架(即,如果分子时免疫原)内,对3只豚鼠递送bG31P(250μg/kg)不引起在一组肝和肾的酶类的血清水平中任何可观察到的脱离正常的波动。而且,心脏、肾脏、肺、肝、肠和这些动物的预组织学评估揭示没有炎性浸润,或局部细胞调亡或增殖,或组织病理异常。我们安排了解剖病理学家独立评估了这些组织。我们在这些动物的血浆中不能检测到可辨别水平的抗bG31P抗体反应性,尽管所应用的分析不是特别灵敏的。
对于使用原核(即细菌)表达***产生hG31P或bG31P的重要性,我们发现所述制备物被细菌内毒素明显污染。当通过市售内毒素去除柱以减少药物的内毒素载量时,我们发现使用内毒素去除柱导致不可接受的G31P的高度损失。在体内,使用在治疗剂量的G31P的治疗剂量中发现的内毒素的水平处理豚鼠不能模拟G31P的治疗活性。
功效研究
在一个实验中,我们以50μg/kg(即,对于bG31P的20%最佳剂量)使用hG31P+6。豚鼠用5μg/kg的LPS攻击,并用低剂量的hG31P治疗。我们发现hG31P+2和hG31P+6对于降低嗜中性浸润仅保留了适度功效,而对降低红细胞迁移入呼吸道仍然有效(该发现的意义并不完全清楚,但说明该药物发挥作用的机制的其他复杂程度的可能)。
在使用呼吸道内毒素血症模型的另一个体内方法中,我们用已知诱导重度肺出血的LPS剂量攻击豚鼠,并用250μg/kg hG31P治疗它们。我们从之前的研究中得知仅很差地从进入呼吸道的脉管***中恢复该升高剂量的LPS嗜中性粒细胞。
在一个实验中,我们以50μg/kg(即,对于bG31P最佳剂量的20%)使用hG31P+6。豚鼠用5μg/kg的LPS攻击,并用低剂量的hG31P治疗。我们发现hG31P+2和hG31P+6对于降低嗜中性浸润仅保留了适度功效,而对降低红细胞迁移入呼吸道仍然有效(该发现的意义并不完全清楚,但说明该药物发挥作用的机制的其他复杂程度的可能)。
在使用呼吸道内毒素血症模型的另一个体内方法中,我们用已知诱导重度肺出血的50μg/kg LPS剂量攻击豚鼠,并用250μg/kg hG31P治疗它们(参见图18)。我们从之前的研究中得知仅很差地从进入呼吸道的脉管***中恢复LPS嗜中性粒细胞的该升高的剂量。然而,hG31P对降低在盐水处理的、高剂量LPS攻击的动物中观察到的,高水平的RBC向外溢出至呼吸道中有显著的作用(图18),并且倾向于降低与该攻击相关的呼吸道嗜中性粒细胞响应和外周血嗜中性粒细胞动员(图18)。
讨论
我们在本文中证明了CXCL8(3-74)K11R/G31P是多种ELR-CXC趋化因子的高亲和力拮抗剂。在体外,该拮抗剂有效阻断在2个粘膜隔室(肺、乳腺)的弱至强炎性病变中表达的所有嗜中性粒细胞趋化活性,高至97%阻断体内的内毒素诱导的炎性响应。我们将CXCL8鉴定为肺炎和乳腺炎样品中的主要趋化吸引物,但也证明在细菌性肺炎中该活性的35%是源于非CXCL8趋化吸引物,后者也被CXCL8(3-74)K11R/G31P有效拮抗。基于啮齿动物(Tateda et al.,2001;Tsai et al.,2000)、牛(Caswell et al.,1997)和人(Villard et al.,1995)中炎性响应的研究,清楚的表明这些样品包含大量的ELR+ CXC趋化因子(例如CXCL5和CXCL8),CXCL8(3-74)K11R/G31P对所述趋化因子具有拮抗作用。
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表2
嵌合蛋白活性结果(抑制%)
第一 | 第二 | 第三 | 第四 | 平均 | |
bG31P | 56 | 72 | 51 | 53 | 58 |
hbG31P+7 | 11 | 36 | 66 | 46 | 39.75 |
hbG31P/S37T+7 | -2 | -104 | 73 | 82 | 12.25 |
hbG31P/T3K+7 | -9 | -35 | 34 | -19 | -7.25 |
hbG31P/T15K+7 | 16 | -24 | 80 | -38 | 8.5 |
hbG31P+6 | 70 | 20 | 45 | ||
hbG31P/S37T+6 | -61 | -82 | -71.5 | ||
hbG31P/E35A+6 | 35 | -132 | -48.5 | ||
hbG31P/H13Y+6 | 52 | -244 | -96 |
Claims (10)
1.具有CXCL8趋化因子的拮抗活性的分离或纯化的肽,其包含SEQ ID No.13所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的肽,其由SEQ ID No.13或SEQ ID No.14所示的氨基酸序列组成。
3.具有CXCL8趋化因子的拮抗活性的肽的分离的多核苷酸序列,其包含编码SEQ 1D No.13所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
4.根据权利要求3的分离的多核苷酸序列,其由编码SEQ ID No.13或SEQ ID No.14所示的氨基酸序列的核苷酸序列组成。
5.包含根据权利要求3或4的多核苷酸的转基因细胞。
6.经遗传改造包含根据权利要求3或4的多核苷酸的病毒宿主。
7.包含与调节序列有效连接的根据权利要求3或4的多核苷酸的表达载体,所述调节序列控制所述多核苷酸在合适宿主中的表达。
8.包含权利要求7的表达载体的宿主细胞。
9.根据权利要求1或2的肽在制备用于治疗CXC趋化因子介导的病理的药物中的用途,其中所述CXC趋化因子介导的病理选自缺血再灌注损伤、内毒素血症诱导的急性呼吸窘迫综合征、免疫复合物型肾小球肾炎、细菌性肺炎和乳腺炎。
10.根据权利要求9的用途,其中所述药物被配制成用于静脉内递送、皮内递送或皮下递送。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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