MX2007012499A - Purificacion de proteinas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona metodos para purificar proteinas. En particular, los metodos emplean un proceso de cromatografia de no afinidad de dos etapas sin el uso de una etapa de filtracion de flujo tangencial en el proceso.

Description

PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención en general se relaciona con la purificación de proteínas utilizando un proceso de cromatografía de no afinidad de dos etapas sin el uso de una etapa de filtración de flujo tangencial en el proceso. En particular, la invención se relaciona a un método para purificar polipéptidos (tales como proteínas recombinantes, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, productos relacionados a Fab y Fv, anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos multiespecíficos que incluyen aquellos de fragmentos de anticuerpo, proteínas de fusión con regiones como Fc y moléculas similares a anticuerpos, por ejemplo las inmunoadhesinas) de una composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La purificación económica, de gran escala, de las proteínas es un problema en aumento importante para la industria biofarmacéutica . Las proteínas terapéuticas se producen típicamente utilizando líneas celulares procarióticas o eucarióticas que se diseñan para expresar la proteína de interés de un plásmido recombinante que contiene el gen que codifica la proteína. La separación de la proteína deseada de la mezcla de componentes alimentada a las células y a los subproductos celulares a una pureza adecuada, por ejemplo, suficiente para el uso como un terapéutico humano, propone un desafío formidable para los fabricantes biológicos por varias razones . Los fabricantes de productos farmacéuticos basados en proteínas deben cumplir con estándares reguladores estrictos, incluyendo los requerimientos de pureza sumamente severos. Para asegurar la seguridad, las agencias reguladoras, tales como la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA), requiere que los productos farmacéuticos basados en proteínas estén sustancialmente libres de impurezas, incluyendo ambos; los contaminantes relacionados al producto tales como los agregados, fragmentos y variantes de la proteína recombinante y los contaminantes relacionados al proceso tales como las proteínas de células hospederas, componentes de medios, virus, ADN y endotoxinas. Mientras que varios esquemas de purificación de proteínas están disponibles y son ampliamente utilizados en la industria biofarmacéutica, éstos incluyen típicamente una etapa de purificación por afinidad, tal como la purificación de la Proteína A en el caso de los anticuerpos, a fin de alcanzar un grado de pureza farmacéuticamente aceptable.

A pesar del advenimiento de los métodos avanzados de cromatografía y filtración, la cromatografía por afinidad todavía se emplea a menudo como una etapa de captura para cumplir con la pureza, rendimiento, y los requerimientos de rendimiento para la purificación biofarmacéutica del anticuerpo a fin de lograr la pureza de grado terapéutico. A pesar de una alta afinidad de enlace de la cromatografía de la Proteína A por los anticuerpos (aproximadamente 10"8 M para el IgG humano), y la habilidad de remover tanto como el 99.5% de impurezas, la cromatografía por afinidad es una etapa de purificación cara para el uso en la purificación de las proteínas terapéuticas en una escala comercial. La Proteína A no sólo es significativamente más cara que los medios de no afinidad, también tiene los problemas tales como la inestabilidad de la resina, la dificultad con la limpieza, pérdida del ligando, e inmunogenicidad potencial de la Proteína A o de los compuestos relacionados a la Proteína A que contaminan el producto purificado. El alto costo e inestabilidad de los medios de afinidad, sin embargo, incrementan el último costo de los terapéuticos basados en proteínas, particularmente aquellos que requieren altas dosis y/o administración crónica. La cromatografía aisladamente puede considerar por dos tercios del costo de procesamiento corriente abajo y, con respecto a los anticuerpos monoclonales, el costo de la resina para una columna de captura por afinidad puede agobiar el costo de las materias primas, ( vea Rathore et al , Costing Issues in the Production of Biopharmaceuticals, BioPharm International, 1 de Febrero del 2004) . Incluso si se utiliza la cromatografía por afinidad de la Proteína A, a menudo no se logra la pureza adecuada a menos que se combinen varias etapas de purificación, incrementando más el costo y reduciendo el rendimiento del producto. Tales anticuerpos explican un porcentaje incrementadamente grande de biologías terapéuticas en el mercado y en el desarrollo para el tratamiento de cáncer, padecimientos autoinmunes, padecimientos infecciosos, padecimientos cardiovasculares, y rechazo del trasplante, existe una necesidad por un proceso que pueda purificar las proteínas utilizando menos etapas y comprendiendo así el costo más bajo. La Publicación de Patente Norteamericana No. 2003/0229212, la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad describe un método para purificar los anticuerpos de una mezcla que contiene las proteínas de células hospederas utilizando etapas de purificación de cromatografía de no afinidad seguido por una etapa de filtración de flujo tangencial de alto desempeño (HPTFF) . Como se determinó por la reducción de las CHOPs (Proteínas de células de Ovario de Hámster Chino) , ese proceso de purificación dio como resultado niveles de contaminantes de aproximadamente 144,780 ppm de CHOPs después de la purificación por intercambio catiónico, aproximadamente 410 ppm de CHOPs después de la purificación por intercambio aniónico, y aproximadamente 17-21 ppm de CHOPs después de la purificación HPTFF (etapa final) , proporcionando así un proceso de no afinidad de tres etapas. La etapa de la purificación de HPTFF, la cual utiliza una membrana cargada para separar las impurezas (sin límite al tamaño relativo), tales como las proteínas, ADN y endotoxinas, y para eliminar los oligómeros de proteínas y los productos de degradación de la mezcla que contiene los anticuerpos, fue esencial para lograr la pureza final. Además, la HPTFF tiene desventajas, a saber (1) es una etapa extra en el desarrollo, optimización y escalamiento de los terapéuticos de proteínas que requieren limpieza de membrana, validación, disponibilidad comercial de casetes GMP de gran escala (los cuales aún no están disponibles para la HPTFF) , y amortiguadores adicionales, equipo y mayor tiempo de proceso, y (2) incrementa los costos mientras expone la pérdida potencial de producto comprometiendo la integridad del anticuerpo (mediante degradación o agregación u otro cambio molecular que afecte la actividad molecular) .

Por consiguiente, sería deseable obtener una alta pureza de un terapéutico de proteína de un proceso de no afinidad de dos etapas, que no este basado en la HPTFF, en un costo reducido comparado con la purificación basada en la afinidad y otros procesos de purificación multi-etapa. Sería ventajoso si el proceso de purificación de no afinidad pudiera remover las proteínas de células hospederas, los ácidos nucleicos, las endotoxinas, los contaminantes relacionados al producto, por ejemplo, agregados, oxidados, desamidados o formas degradadas de la proteína, y aditivos de medios, por ejemplo, lípidos, vitaminas, insulina, metotrexato, aminoácidos, fuentes de carbono tales como glucosa, etc. El desarrollo de un esquema de purificación aplicable a varios tipos de proteínas, escalable, controlable, y que emplee resinas más baratas, reutilizables permitirá su integración en el desarrollo de productos en una fase muy temprana en el desarrollo global del fármaco. Este acercamiento al diseño de un esquema de purificación puede minimizar los cambios costosos a los procesos industriales que pueden ser, de otra manera, necesarios después en el desarrollo del fármaco o, peor, después de la aprobación. Mientras el proceso se escala y se acerca a las condiciones de producción GMP, surgen complejidades inherentes adicionales, incluyendo aquellas asociadas con el empaquetamiento de la resina y la preparación del amortiguador. El proceso industrial, y su capacidad, pueden mejorarse simplificando el esquema de purificación mediante las etapas del proceso de eliminación y maximizando el rendimiento y la productividad, manteniendo la integridad y pureza de la molécula que está siendo purificada. Por consiguiente, sería deseable y ventajoso empezar con un proceso simple y eficiente que pueda producir una sustancia del fármaco de alta calidad y segurídad. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el hallazgo inesperado de que los polipéptidos y las proteínas, en particular las proteínas recombinantes tales como los anticuerpos monoclonales, pueden purificarse de una mezcla contaminada que comprende la molécula de interés y al menos un contaminante, tal como las proteínas de células hospederas y otros materiales tales como los componentes de medios, utilizando un proceso de purificación de dos etapas que no incluye una etapa de cromatografía por afinidad o una etapa de intercambio de amortiguador en el proceso (por ejemplo, TFF o HPTFF) . En lugar de eso, solo son necesarias las manipulaciones del pH de la primer etapa a la segunda etapa. El proceso de dos etapas de la presente invención, por consiguiente, reduce sustancialmente el costo de la purificación de las proteínas que típicamente confía en la cromatografía por afinidad o en las metodologías multi-etapa para lograr niveles similarmente altos de pureza de la proteína. En la presente invención, las proteínas se purifican altamente a un grado terapéutico utilizando las etapas de cromatografía por intercambio de cationes y la cromatografía de inducción de carga hidrofóbica, sin tener en cuenta su orden y sin el uso de cromatografía por afinidad, para dar una composición de la proteína de alta pureza que contiene cantidades despreciables de impurezas [por ejemplo, proteínas de células hospederas, tales como las CHOPs en cantidades de menos que 100 partes por millón (ppm) ] . En las modalidades particulares de la invención, descritas en el Ejemplo infra . , los niveles de HCP CHOP se redujeron a menos que 20 ppm. Es una ventaja de un método de la presente invención que las etapas de la cromatografía son intercambiables, permitiendo así a los practicantes entallar el método a sus necesidades. Además, un proceso de purificación de la presente invención puede remover no solo la proteína de célula hospedera de interés, sino también los ácidos nucleicos, endotoxinas, contaminantes relacionados al producto, tales como agregados, oxidados, desamidados o formas degradadas de la proteína, y aditivos de medios, por ejemplo, los lípidos, vitaminas, insulina, metotrexato, aminoácidos, fuentes de carbono tales como la glucosa, etc. La presente invención proporciona métodos para la purificación de proteínas recombinantes incluyendo, pero no limitado a los anticuerpos, proteínas de fusión con regiones como Fc, y moléculas similares a anticuerpos, por ejemplo las inmunoadhesinas, para lograr una composición de proteína altamente pura adecuada para el uso en la preparación de las composiciones de grado terapéutico. Como un resultado, es una ventaja de un método de la presente invención que la composición de proteína altamente pura es adecuada para el uso en la preparación del material de grado terapéutico y puede utilizarse directamente en la terapia humana. Así, en una modalidad, un método de la invención se dirige a purificar una mezcla que contiene una proteína objetivo y uno o más contaminantes mediante (a) someter la mezcla a una etapa de purificación de intercambio iónico y una etapa de purificación de inducción de carga hidrofóbica, donde no hay ninguna etapa de filtración de flujo tangencial en el proceso y (b) aislar la proteína objetivo. En una modalidad particular, el método se dirige a purificar una mezcla que contiene una proteína objetivo y uno o más contaminantes tales como las proteínas de células hospederas (por ejemplo, CHOPs) y ácidos nucleicos sometiendo la mezcla a cromatografía por intercambio de cationes y a cromatografía de inducción de carga hidrofóbica, y aislando la proteína objetivo a una pureza de 100 partes por millón (ppm) o menos de proteína de célula hospedera y 10 pg/mg o menos de ácidos nucleicos. BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO La Figura 1 muestra un diagrama de flujo de un proceso de purificación de dos etapas de la invención, donde el Panel A y el Panel B se refieren a las mismas resinas usadas en diferente orden secuencial. El Panel A representa una primera modalidad del proceso de purificación de la invención, donde la cromatografía por intercambio de cationes (CEXC) es la etapa de cromatografía de captura seguida por la cromatografía de inducción de carga hidrofóbica (HCIC) con solo una manipulación del pH entre las dos etapas de cromatografía. El Panel B representa una segunda modalidad, donde la HCIC es la etapa de cromatografía de captura seguida por la CEXC con solo una manipulación del pH entre las dos etapas de cromatografía.

El pH del enlace aproximado durante la captura fue 6.2 para el Panel A y 7.0 para el Panel B. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Como se utiliza aquí, "proteína" en general se refiere a los péptidos y proteínas que tienen típicamente al menos 5 aminoácidos o más, los cuales están unidos por enlaces del péptido. Una proteína puede ser un anticuerpo, receptor, proteína de fusión del ligando (la cual comprende al menos una porción de dos o más polipéptidos que no están fusionados en su estado natural), etc., por ejemplo, vea US2003022921 y US 20030166869 las cuales están incorporadas aquí por referencia en sus totalidades y que listan varias proteínas que pueden purificarse de acuerdo a un método de la invención. Los polipéptidos pueden ser de cualquier organismo (procariótico o eucariótico), particularmente de mamíferos. Además, una proteína o polipéptido purificado de acuerdo a un método de la invención puede ser un anticuerpo, fragmento, o una variante del mismo. El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más extenso para cubrir los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa) , anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), inmunoadhesinas y fragmentos de anticuerpo tan grandes siempre que los retengan, o se modifica para comprender, un dominio de enlace específico del ligando. Un anticuerpo puede dirigirse contra un "antígeno" de interés, tal como un polipéptido, que puede ser un objetivo terapéutico biológicamente relevante o un antígeno no-polipéptido (por ejemplo, tal como los antígenos de glicolípido asociados al tumor; vea la Patente Norteamericana No. 5,091,178). Preferentemente, el antígeno es un polipéptido biológicamente importante y la administración del anticuerpo a un mamífero que padece de un padecimiento o desorden puede producir un beneficio terapéutico en ese mamífero. Los antígenos de polipéptido incluyen las moléculas transmembrana (por ejemplo el receptor) y ligandos tales como los factores de crecimiento. Los antígenos ejemplares incluyen aquellos polipéptidos descritos anteriormente. La preparación de los antígenos para generar anticuerpos y la producción del anticuerpo son bien conocidas en el arte. Los antígenos solubles, o fragmentos de los mismos opcionalmente conjugados a otras moléculas, pueden utilizarse como inmunógenos para generar anticuerpos. Para las moléculas transmembrana, tales como los receptores, los fragmentos de éstos (por ejemplo el dominio extracelular de un receptor) pueden utilizarse como el inmunógeno. Alternativamente, las células que expresan la molécula transmembrana pueden utilizarse como el inmunógeno. Tales células pueden derivarse de una fuente natural (por ejemplo las líneas celulares de cáncer) o pueden ser células que se han transformado mediante técnicas del recombinante para expresar la molécula transmembrana. Un "fragmento del anticuerpo" incluye al menos una porción de un anticuerpo de longitud completa y típicamente un enlace del antígeno o región variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab' , F(ab')2/ y Fv; moléculas de anticuerpos de cadena sencilla; diacuerpos; anticuerpos lineales; y anticuerpos multiespecíficos formados de los fragmentos de anticuerpos. El término "anticuerpo monoclonal" se utiliza en el sentido convencional para referirse a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos tal que los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo posibles mutaciones existentes de manera natural que pueden estar presente en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, que swe dirigen contra un solo sitio antigénico. Esto está en contraste con las preparaciones de anticuerpo policlonales que típicamente incluyen anticuerpos variados dirigidos contra determinantes diferentes (epítopes) de un antígeno, mientras que los anticuerpos monoclonales se dirigen contra un solo determinante en el antígeno. El término "monoclonal", describiendo los anticuerpos, indica que el carácter del anticuerpo se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no será traducido como que requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales utilizados en la presente invención pueden producirse utilizando tecnología hibridoma convencional descrita primero por Kohier et al., Nature 256:495 (1975), o pueden fabricarse utilizando los métodos de ADN recombinante (vea, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,816,567). Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse de las genotecas del anticuerpo del fago, por ejemplo, utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); y las Patentes Norteamericanas Nos 5,223,409; 5,403,484; 5,571,698; 5,427,908 5,580,717; 5,969,108; 6,172,197; 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; y 6,593,081). Los anticuerpos monoclonales descritos aquí incluyen los anticuerpos "quiméricos" y "humanizados" en que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena (s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o sub-clase de anticuerpo, así como los fragmentos de tales anticuerpos, tan grandes como exhiben la actividad biológica deseada (Patente Norteamericana No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son las inmunoglobulinas humanas (anticuerpo destinatario) en que los residuos de la región hipervariable del destinatario son reemplazados por los residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad, y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la región invariante (Fv) de la región variable de la cadena de inmunoglobulina humana son reemplazados por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo destinatario o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar más el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en que todos o sustancialmente todos los lazos hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, vea Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op . Struct. Biol. 2:593-596 (1992) . Los anticuerpos quiméricos o humanizados pueden prepararse basado en la secuencia de un anticuerpo monoclonal de murino preparada como se describe anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera puede obtenerse del hibridoma murino de interés y puede diseñarse para contener secuencias de inmunoglobulina no murina (por ejemplo, humana) utilizando las técnicas de biología molecular estándar. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables de murino pueden enlazarse a regiones constantes humanas utilizando los métodos conocidos en el arte (vea por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,816,567 por Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR de murino pueden insertarse en una región invariante humana utilizando los métodos conocido en el arte (vea por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,225,539 por Winter, y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 por Queen et al.). Los anticuerpos monoclonales descritos aquí también incluyen los anticuerpos "humanos" que pueden aislarse de varias fuentes, incluyendo, por ejemplo, de la sangre de un paciente humano o pueden prepararse de manera recombinante utilizando animales transgénicos. Los ejemplos de tales animales transgénicos incluyen Km-Mouse® (Medarex, Inc., Princeton, NJ) que tiene un transgene humano de cadena pesada y un transcromosoma humano de cadena ligera (vea WO 02/43478), Xenomouse® (Abgenix, Inc., Fremont CA; descrito en, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 y 6,162,963 por Kucherlapati et al.), y HuMAb-Mouse® (Medarex, Inc.; descrito en, por ejemplo, Taylor, L. et al. (1992) Nuclei c Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) In terna tional Immunology 5: 647- 656; Tuaillon et al. (1993) Proc . Na ti . Acad. Sci USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Na ture Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol . 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) Interna tional Immunology 6:579-591; y Fishwild, D. et al. (1996) Na ture Biotechnology 14: 845-851, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; 5,545,807; y las Publicaciones PCT Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, WO 01/14424 por Korman et al) . Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también pueden prepararse utilizando el ratón SCID en el cual se han reconstituido las células inmunes humanas tal que puede generarse una respuesta del anticuerpo humano en la inmunización. Tal ratón se describe, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,476,996 y 5,698,767 por Wilson et al. El término "región hipervariable" se utiliza para describir los residuos del aminoácido de un anticuerpo que es responsable de enlazar el antígeno. La región hipervariable comprende los residuos del aminoácido de una "región de determinación de complementariedad" o "CDR" (es decir, los residuos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; vea Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos residuos de un "lazo hipervariable" (es decir los residuos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Los residuos "de la región invariante" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable.

Como se utiliza aquí, el término "inmunoadhesina" designa moléculas similares a anticuerpos que combinan el "dominio de enlace" de una proteína de "adhesina" heteróloga (por ejemplo un receptor, ligando o enzima) con las funciones del efector de un dominio constante de inmunoglobulina. Estructuralmente, una inmunoadhesina comprende una fusión de la secuencia de aminoácido de adhesina con la especificidad del enlace deseado que es diferente que el reconocimiento del antígeno y el sitio de enlace (sitio de combinación del antígeno) de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina se deriva preferentemente de las cadenas pesadas ?l, ?2, o ? , debido a que las inmunoadhesinas que comprenden estas regiones pueden purificarse por cromatografía con Proteína A (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Las inmunoadhesinas pueden purificarse de acuerdo a los métodos de la presente invención.

El término "dominio del enlace del ligando" se refiere a cualquier receptor de superficie celular nativo o cualquier región o derivado de la misma que retiene al menos un enlace del ligando cualitativo de un receptor nativo correspondiente. En una modalidad específica, el receptor es desde un polipéptido de superficie celular que tiene un dominio extracelular que es homólogo a un miembro de la familia del super gen de la inmunoglobulina. Otros receptores que no son miembros de la familia del super gen de la inmunoglobulina pero no obstante se cubren específicamente por esta definición, son los receptores para citocinas, y en particular los receptores con actividad de la tirosina cinasa (tirosina cinasa del receptor) , miembros de las superfamilias de la hematopoyetina y el receptor del factor de crecimiento de los nervios, y las moléculas de adhesión celular, por ejemplo, selectinas (E-, L- y P-) . El término "dominio del enlace del receptor" se utiliza para designar cualquier ligando nativo para un receptor, incluyendo las moléculas de adherencia celular, o cualquier región o derivado de tal ligando nativo que retiene al menos una capacidad cualitativa del enlace del receptor de un ligando nativo correspondiente. Esta definición, entre otras, incluye específicamente las secuencias del enlace de los ligandos para los receptores anteriormente mencionados. Una "quimera anticuerpo-inmunoadhesina" comprende una molécula que combina al menos un dominio del enlace de un anticuerpo (como se define aquí) con al menos una inmunoadhesina (como se define en esta solicitud) . Las quimeras anticuerpo-inmunoadhesina ejemplares son las quimeras CD4-IgG biespecíficas descritas en Berg et al., PNAS (USA) 88:4723-4727 (1991) y Chamow et al., J. Immunol . 153:4268 (1994) . Como se utiliza aquí, una "mezcla" comprende un polipéptido de interés (para el cual se desea la purificación) y uno o más contaminantes, es decir, impurezas. La mezcla puede obtenerse directamente de una célula hospedera u organismo que produce el polipéptido. Sin pretender ser limitantes, los ejemplos de mezclas que pueden purificarse de acuerdo a un método de la presente invención incluyen fluido de cultivo celular cosechado, sobrenadante del cultivo celular y sobrenadante acondicionado del cultivo celular. Una mezcla que ha sido "parcialmente purificada" ya se ha sometido a una etapa de cromatografía, por ejemplo, cromatografía de no afinidad, cromatografía por afinidad, etc. Una "mezcla acondicionada" es una mezcla, por ejemplo, un sobrenadante del cultivo celular que se ha preparado para una etapa de cromatografía utilizada en un método de la invención sometiendo la mezcla a uno o más de intercambio de amortiguador, dilución, adición de sal, titración o titulación de pH o filtración para fijar el pH y/o el rango de conductividad y/o la matriz del amortiguador para lograr un desempeño de la cromatografía deseado. Una "mezcla acondicionada" puede utilizarse para estandarizar las condiciones de carga sobre la primera columna de cromatografía. En general, una mezcla puede obtenerse a través de varios medios de separación bien conocidos en el arte, por ejemplo, separando físicamente las células muertas y las células viables de otros componentes en el caldo al final de una corrida del bioreactor utilizando filtración o centrifugación, o por concentración y/o diafiltración del sobrenadante del cultivo celular en los rangos específicos de pH, conductividad y concentración de las especies del amortiguador . Los términos "impureza" y "contaminante", y las variaciones gramaticales de los mismos, se utilizan intercambiablemente para referirse a cualquier material, diferente a la proteína de interés para el cual es deseable removerlo de una composición que contiene la proteína de interés. Los contaminantes incluyen, pero no se limitan a, cualquier macromolécula biológica tal como las proteínas de células hospederas (por ejemplo, CHOPs) , polipéptidos diferentes a la proteína de interés, ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN y ARN), lípidos, sacáridos, endotoxinas, bacterias u otros microorganismos tal como la levadura, componentes de medios, y cualquier molécula que sea parte de un adsorbente utilizado en la cromatografía que pueda lixiviar en una muestra durante la cromatografía, y similares.

El término "proteína de interés" y "proteína objetivo" se utiliza intercambiablemente para referirse a una proteína, como se describe anteriormente, por ejemplo, un anticuerpo, para el cual es deseable purificar de una mezcla de acuerdo a un método de la presente invención. El término "proteína de célula hospedera", o "HCP", se refiere a cualquiera de las proteínas derivadas del metabolismo (intra y extra-celular) de la célula hospedera que expresa la proteína objetivo, incluyendo cualquier proteína expresada del genoma de la célula hospedera o proteínas que son expresadas de manera recombinante, y que no son consideradas la proteína objetivo. La célula hospedera puede ser cualquier célula que sea capaz de expresar la proteína objetivo, particularmente mamífera (por ejemplo, CHO y las líneas celulares del mieloma murino tales como NSO) , líneas celulares de insecto bacteriano, planta y levadura. En una modalidad particular de la invención, la HCP es una "proteína de la célula de ovario del hámster Chino", o "CHOP" que se refiere a cualquiera de las proteínas de células hospederas ("HCP") derivada de un cultivo celular del ovario del hámster Chino ("CHO"). La HCP generalmente está presente como una impureza en un medio de cultivo celular o lisato [ (por ejemplo, un fluido de cultivo celular cosechado ("HCCF")], que contiene la proteína de interés. La cantidad de HCP presente en una mezcla que comprende una proteína de interés proporciona una medida del grado de pureza para la proteína de interés. Típicamente, la cantidad de HCP en una mezcla de proteína se expresa en partes por millón relativas a la cantidad de proteína de interés en la mezcla. Los términos "partes por millón" o "ppm" se utilizan intercambiablemente aquí para referirse a una medida de pureza de la proteína de interés purificada por un método de la invención. Las unidades ppm se refieren a la cantidad de HCP en nanogramos/mililitro por proteína de interés en miligramos/mililitro, donde las proteínas están en solución [es decir, como se describe en un Ejemplo infra , HCP ppm=(CHOP ng/ml )/ (proteína de interés mg/ml)]. Donde las proteínas se secan, tal como por liofilización, las ppm se refieren a (HCP ng) / ( mg de proteína de interés). El término "purificar", y las variaciones gramaticales del mismo, se utilizan para referirse a la remoción, ya sea completamente o parcialmente, de al menos una impureza de una mezcla que contiene el polipéptido y una o más impurezas, que mejora el nivel de pureza del polipéptido en la composición (es decir, disminuyendo la cantidad (ppm) de impureza (s) en la composición) . De acuerdo a la presente invención, la purificación se realiza con dos etapas de cromatografía de no afinidad y ninguna etapa de TFF en el proceso. Un método de la presente invención puede purificar la proteína de interés para lograr una composición que contiene menos que 100 ppm de HCP y preferentemente menos que 90 ppm, menos que 80 ppm, menos que 70 ppm, menos que 60 ppm, menos que 50 ppm, menos que 40 ppm, menos que 30 ppm, menos que 20 ppm, menos que 10 ppm, o menos que 5 ppm de HCP, como se determina por ELISA. Como se utiliza aquí, el término "aislar", y las variaciones gramaticales del mismo, se refiere a la separación de una proteína de interés purificada de las sustancias adicionales, por ejemplo, de una columna o resina utilizada para purificar la proteína de interés, para lograr una composición homogénea que contiene la proteína de interés sustancialmente libre de los contaminantes, impurezas y otras sustancias . El término "cromatografía" se refiere al proceso mediante el cual un soluto de interés, por ejemplo, una proteína de interés, en una mezcla se separa de otros solutos en la mezcla mediante percolación de la mezcla a través de un adsorbente, que adsorbe o retiene un soluto más o menos fuertemente debido a las propiedades del soluto, tales como pl, hidrofobicidad, tamaño y estructura, bajo las condiciones de amortiguamiento particulares del proceso. Un "adsorbente" es cualquier sólido y sustancia fija capaz de adsorber otra sustancia en su superficie mediante adhesión por interacción directa con la molécula de interés o por interacción con los compuestos que se adhieren al adsorbente. Los adsorbentes que son útiles en varios tipos de cromatografía son bien conocidos en el arte y están prontamente disponibles a través de fuentes comerciales. El término "cromatografía por afinidad" y "cromatografía por afinidad de proteína" se utilizan intercambiablemente para referirse a una técnica de separación de proteína en la cual una proteína de interés se une reversiblemente y específicamente a un ligando bioespecífico, usualmente como una combinación de complementariedad espacial y uno o más tipos de interacciones químicas, por ejemplo, fuerzas electrostáticas, enlace de hidrógeno, fuerzas hidrofóbicas, y/o fuerzas de van der Waals en el sitio de enlace. Estas interacciones no se deben a las propiedades generales de la molécula tales como el punto isoeléctrico, hidrofobicidad o tamaño pero son un resultado de las interacciones específicas de la molécula de interés y el ligando tal como el dominio de proteína hidrófobo y preciso ajustado para la proteína A y las interacciones del anticuerpo, por ejemplo. La proteína A es un ejemplo de un adsorbente que puede fijarse a un soporte sólido por ejemplo, Sepharose, para enlazar moléculas que contienen una región Fc . Vea Ostrove (1990) in Guide to Protein Purification, Methods of Enzymology 182, : 357-379, la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Cualquier ligando puede utilizarse para purificar su respectiva proteína de enlace específica. Preferentemente, el ligando bioespecífico se une de manera covalente a un material cromatográfico de fase sólida y es accesible a la proteína de interés (por ejemplo, el anticuerpo, enzima, o proteína del receptor) en solución mientras la solución contacta el material cromatográfico de fase sólida. La proteína de interés retiene su afinidad de enlace específica por el ligando bioespecífico (antígeno, sustrato, cofactor, u hormona, por ejemplo) durante las etapas cromatográficas, mientras que otros solutos y/o proteínas en la mezcla no se unen apreciablemente o específicamente al ligando. El enlace de la proteína de interés al ligando inmovilizado permite a las proteínas contaminantes o impurezas de la proteína pasar a través del medio cromatográfico mientras la proteína de interés permanece específicamente unida al ligando inmovilizado en el material de fase sólida. La proteína específicamente unida se remueve entonces del ligando inmovilizado con pH bajo, pH alto, sal baja, sal alta, ligando competente, o similares, y se pasa a través de la columna cromatográfica con el amortiguador de elución. También pueden estar presentes las proteínas contaminantes que tienen una concentración relativa más baja a la proteína de interés, y otros tipos de contaminantes tales como los ácidos nucleicos y las endotoxinas que fueron anteriormente permitidos atravesar la columna. Los términos "enlace específico" y "especificidad de enlace", y las variaciones gramaticales de los mismos, describen las interacciones generalmente específicas y reversibles entre una proteína de interés y un ligando que requiere los efectos combinados de complementariedad espacial de la proteína y las estructuras del ligando en un sitio de enlace acoplado con uno o más tipos de fuerzas electrostáticas, enlace de hidrógeno, fuerzas hidrofóbicas, y/o fuerzas de van der Waals en el sitio de enlace. El ligando deben tener grupos modificables químicamente que le permitan unirse a la matriz sin destruir su actividad de enlace. El ligando debe tener idealmente una afinidad por la sustancia de enlace en el rango 10"4 a 10~8M en solución libre. Entre mayor sea la complementariedad espacial y más fuerte las otras fuerzas en el sitio de enlace, mayor será la especificidad de enlace de una proteína por su ligando respectivo. Los ejemplos no limitativos del enlace específico incluyen el enlace anticuerpo-antígeno, enlace enzima-sustrato, enlace enzima-cofactor, quelación del ion metálico, enlace de proteína de enlace al ADN- ADN, interacciones reguladores de proteína-proteína, y similares. Los términos "cromatografía de no afinidad" y "purificación de no afinidad" se refieren a una etapa de purificación que no utiliza la cromatografía por afinidad sino que requiere una interacción del enlace no específico entre un soluto (por ejemplo, la proteína de interés) y la matriz adsorbente . El término "enlace no específico" como se utiliza aquí, se refiere a las interacciones entre una proteína de interés y un ligando u otro compuesto unido a una matriz de fase sólida a través de interacciones no específicas, por ejemplo, a través de fuerzas electrostáticas, enlace de hidrógeno, fuerzas hidrofóbicas, y/o fuerzas de van der Waals en un sitio de interacción, pero que carecen de la complementariedad estructural que mejora los efectos de las fuerzas no estructurales tales como en el enlace (específico) por afinidad. Los ejemplos de procesos de cromatografía que confían en el enlace no específico, en lugar de la afinidad, incluyen la cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, intercambio aniónico y catiónico) y la cromatografía de inducción de carga hidrofóbica. El término "cromatografía de inducción de carga hidrofóbica" (o "HCIC") es un tipo de proceso cromatográfico de modo mixto en el cual la proteína de interés en la mezcla se une a un ligando ionizable de modo dual (es decir, hay un modo para unir y otro modo para la elución) , [vea Boschetti et al., 2000, Genetic Engineering News 20(13)] a través de interacciones hidrofóbicas apacibles en la ausencia de sales agregadas (por ejemplo una sal liotrópica) . Una "resina de cromatografía de inducción de carga hidrofóbica" es una fase sólida que contiene un ligando que tiene las propiedades combinadas del efecto tiofílico (es decir, utilizando las propiedades de cromatografía tiofílica) , hidrofobicidad y un grupo ionizable para su capacidad de separación. Así, una resina HCIC utilizada en un método de la invención contiene un ligando que es ionizable y ligeramente hidrofóbico a pH neutral (fisiológico) o ligeramente ácido, por ejemplo, aproximadamente pH 5 a 10, preferentemente aproximadamente pH 6 a 9.5. En este rango de pH, el ligando está predominantemente no cargado y se une a una proteína de interés vía la interacción hidrofóbica no específica apacible. Mientras el pH se reduce, el ligando adquiere carga y el enlace hidrofóbico se rompe por la repulsión de la carga electrostática hacia el soluto debido al cambio de pH. Los ejemplos de ligandos adecuados para el uso en la HCIC incluyen cualquier estructura aromática o heterocíclica ionizable (por ejemplo aquellos que tienen una estructura de piridina, tales como 2-aminometilpiridina, 3-aminometilpiridina y 4-aminometilpiridina, 2-mercaptopiridina, 4-mercaptopiridina o 4-mercaptoetilpiridina, mercaptoácidos, mercaptoalcoholes, basados en imidazolilo, mercaptometilimidazol, 2-mercaptobencimidazol, aminometilbencimidazol, histamina, mercaptobencimidazol, dieti1aminopropilamina, aminopropilmorfolina, aminopropilimidazol, ácido aminocapróico, ácido nitrohidroxibenzóico, nitrotirosina/etanolamina, ácido diclorosalicílico, dibromotiramina, ácido clorohidroxifenilacético, ácido hidroxifenílacético, tiramina, tiofenol, glutationa, bisulfato, y tintes, incluyendo derivados de los mismos; vea Burton and Harding, Journal of Chromatography A 814: 81-81 (1998) y Boschetti, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 49: 361-389 (2001), los cuales se incorporan aquí por referencia en sus totalidades) que tienen una cadena alifática y al menos un átomo de azufre en el brazo enlazador y/o en la estructura del ligando. Un ejemplo de una resina HCIC incluye MEP HYPERCEL (Pall Corporation; East Hills, NY) . Los términos "intercambio iónico" y "cromatografía de intercambio iónico" se refieren a un proceso cromatográfico en que un soluto ionizable de interés (por ejemplo, una proteína de interés en una mezcla) interactúa con un ligando cargado de manera opuesta unido (por ejemplo, por enlace covalente) a un material de intercambio iónico de fase sólida bajo las condiciones apropiadas de pH y conductividad, tal que el soluto de interés interactúa de manera no específica con el compuesto cargado más o menos que las impurezas del soluto o contaminantes en la mezcla. Los solutos contaminantes en la mezcla pueden lavarse de una columna del material de intercambio iónico o pueden unirse o excluirse de la resina, más rápido o más lento que el soluto de interés. La "cromatografía de intercambio iónico" incluye específicamente el intercambio de cationes, el intercambio de aniones, y las cromatografías de modo mixto. La frase "material de intercambio iónico" se refiere a una fase sólida que está cargada negativamente (es decir una resina de intercambio de cationes) o cargada positivamente (es decir una resina de intercambio de aniones) . En una modalidad, la carga puede proporcionarse uniendo uno o más ligandos cargados (o adsorbentes) a la fase sólida, por ejemplo mediante el enlace covalente. Alternativamente, o en adición, la carga puede ser una propiedad inherente de la fase sólida (por ejemplo como es el caso para el sílice, que tiene una carga negativa global). Una "resina de intercambio de cationes" se refiere a una fase sólida que está cargada negativamente, y que tiene cationes libres para el intercambio con los cationes en una solución acuosa que se hace pasar sobre o a través de la fase sólida. Puede utilizarse cualquier ligando cargado negativamente unido a la fase sólida adecuado para formar la resina de intercambio de cationes, por ejemplo, un carboxilato, sulfonato y otros como se describe debajo. Las resinas de intercambio de cationes comercialmente disponibles incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, aquellas que tienen un grupo basado en sulfonato (por ejemplo, MonoS, MiniS, Fuente 15S y 30S, SP Sepharose Fast Flow™, SP Sepharose High Performance a partir de GE Healthcare, Toyopearl SP-650S y SP-650M a partir de Tosoh, Macro-Prep High S a partir de BioRad, Ceramic HyperD S, Trisacryl M y LS SP y Spherodex LS SP a partir de Pall Technologies) ; un grupo basado en sulfoetilo (por ejemplo, Fractogel SE, a partir de EMD, Poros S-10 y S-20 a partir de Applied Biosystems); un grupo basado en sulfopropilo (por ejemplo, TSK Gel SP 5PW y SP-5PW-HR a partir de Tosoh, Poros HS-20 y HS 50 a partir de Applied Biosystems); un grupo basado en sulfoisobutilo (por ejemplo, (Fractogel EMD S03" a partir de EMD); un grupo basado en sulfoxietilo (por ejemplo, SE52, SE53 y Express-Ion S a partir de Whatman) , un grupo basado en carboximetilo (por ejemplo, CM Sepharose Fast Flow a partir de GE Healthcare, Hydrocell CM a partir de Biochrom Labs Inc., Macro-Prep CM a partir de BioRad, Ceramic HyperD CM, Trisacryl M CM, Trisacryl LS CM, a partir de Pall Technologies, Matrx Cellufine C500 y C200 a partir de Millipore, CM52, CM32, CM23 and Express -Ion C a partir de Whatman, Toyopearl CM- 650S, CM-650M y CM-650C a partir de Tosoh) ; grupos basados en ácido sulfónico y carboxílico (por ejemplo BAKERBOND Carboxy-Sulfon a partir de J.T. Baker); un grupo basado en ácido carboxílico (por ejemplo, WP CBX a partir de J.T Baker, DOWEX MAC-3 a partir de Dow Liquid Separations, intercambiador de cationes débiles Amberlite, intercambiador de cationes débiles DOWEX, y Diaion Weak Catión Exchangers a partir de Sigma-Aldrich y Fractogel EMD COO- a partir de EMD) ; un grupo basado en ácido sulfónico (por ejemplo, Hydrocell SP a partir de Biochrom Labs Inc., resina de cationes de ácidos fuertes, de malla fina DOWEX a partir de Dow Liquid Separations, UNOsphere S, WP Sulfonic a partir de J. T. Baker, Sartobind S membrane a partir de Sartorius, intercambiadores de cationes fuertes Amberlite, cationes fuertes DOWEX e intercambiadores de cationes fuertes Diaion a partir de Sigma-Aldrich) ; y un grupo basado en ortofosfato (por ejemplo, Pll a partir de Whatman) . Una "resina de intercambio de aniones" se refiere a una fase sólida que está cargada positivamente, teniendo así uno o más ligandos cargados positivamente unidos a la misma. Pueden utilizarse cualquier ligando cargado positivamente unido a la fase sólida adecuado para formar la resina de intercambio aniónico, tal como los grupos amino cuaternarios. Las resinas de intercambio de aniones comercialmente disponibles incluyen la celulosa DEAE, Poros Pl 20, Pl 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50 a partir de Applied Biosystems, Sartobind Q a partir de Sartorius, MonoQ, MiniQ, Fuente 15Q y 30Q, Q, DEAE y ANX Sepharose Fast Flow, Q Sepharose de alta resolución, QAE SEPHADEX™ y FAST Q SEPHAROSE™ (GE Healthcare), WP PEÍ, WP DEAM, WP QUAT a partir de J.T. Baker, Hydrocell DEAE y Hydrocell QA a partir de Biochrom Labs Inc., UNOsphere Q, Macro-Prep DEAE y Macro-Prep High Q a partir de Biorad, Ceramic HyperD Q, ceramic HyperD DEAE, Trisacryl M y LS DEAE, Spherodex LS DEAE, QMA Spherosil LS, QMA Spherosil M y Mustang Q a partir de Pall Technologies, Resinas Aniónicas DOWEX de malla fina, base fuerte, tipo I y tipo II y DOWEX MONOSPHER E 77, anión de base débil de Dow liquid Separations, membrana Intercept Q, Matrex Cellufine A200, A500, Q500, y Q800, a partir de Millipore, Fractogel EMD TMAE, Fractogel EMD DEAE y Fractogel EMD DMAE a partir de EMD, intercambiadores de aiones fuertes y débiles de Ainberlite tipo I y II, intercambiadores de aniones fuertes y débiles DOWEX tipo I y II, intercambiadores de aniones fuertes y débiles Diaion tipo I y II, Duolite a partir de Sigma-Aldrich, TSK gel Q y DEAE 5PW y 5PW-HR, Toyopearl Su?erQ-650S, 650M y 650C, QAE-550C y 650S, DEAE-650M y 650C a partir de Tosoh, QA52, DE23, DE32, DE51, DE52, DE53, Express-Ion D y Express-Ion Q a partir de Whatman.

Una "resina de intercambio iónico de modo mixto" se refiere a una fase sólida que se modifica de manera covalente con los radicales catiónicos, aniónicos, y/o hidrofóbicos. Los ejemplos de resina de intercambio iónico de modo mixto incluyen BAKERBOND ABX™ (J. T. Baker; Phillipsburg, NJ) , hidroxiapatita cerámica tipo I y II y fluoruro de hidroxiapatita (BioRad; Hercules, CA) y MEP y MBI HyperCel (Pall Corporation; East Hills, NY) . El término "tiofílico" se refiere a la selectividad que las proteínas tienen para los grupos sulfona que está en proximidad a los grupos tioéter (Porath et al, 1985) . La "cromatografía tiofílica" también conocida como "cromatografía de adsorción tiofílica", es un tipo de cromatografía de no afinidad en que una proteína de interés, que contiene regiones tiofílicas y residuos amino aromáticos, se une a un ligando que contiene azufre para el aislamiento de la proteína. Una gel tiofílica puede prepararse reduciendo la divinilsulfona (acoplada a la Sepharose 4B) con ß-mercaptoetanol . La cromatografía de adsorción tiofílica se basa en las propiedades del donador-aceptador del electrón y es distinta de la cromatografía basada en la hidrofobicidad. Las asociaciones hidrofóbicas y las interacciones iónicas no ocurren con los sorbentes tiofílicos debido a que las estructuras tio-etilsulfona no poseen hidrofobicidad o cargas iónicas pronunciadas. Los ejemplos de resinas de cromatografía tiofílica comercialmente disponibles incluyen Fractogel EMD TA (Merck; Rahway, NJ) , Uniflow y Superflow resin (Clontech) y T-Gel (Pierce) . El término "fase sólida" se utiliza para referirse a cualquier matriz no acuosa a la cual uno o más ligandos pueden adherirse o alternativamente, en el caso de cromatografía de exclusión de tamaño, puede referirse a la estructura de gel de una resina. La fase sólida puede ser cualquier matriz capaz de adherir ligandos de esta manera, por ejemplo, una columna de purificación, una fase discontinua de partículas discretas, una membrana, filtro, gel, etc. Los ejemplos de materiales que pueden utilizarse para formar la fase sólida incluyen los polisacáridos (tales como la agarosa y celulosa) y otras matrices mecánicamente estables tales como el sílice (por ejemplo, vidrio de poro controlado) , poli (estirenodivinil) benceno, poliacrilamida, partículas cerámicas y derivados de cualquiera de éstos. La presente invención no se limita a ningún material particular de fase sólida para el uso en una etapa de cromatografía, y aquellos que tienen habilidad ordinaria en el arte serán capaces de seleccionar el material de fase de sólida apropiado para el uso en la presente invención. El término "detergente" se refiere a surfactantes iónicos, zwitteriónicos y no iónicos, que son útiles para prevenir la agregación de proteínas y para prevenir la interacción no específica o el enlace de contaminantes a la proteína de interés, y pueden estar presentes en varios amortiguadores utilizados en la presente invención, incluyendo los amortiguadores de sanitización, equilibrio, carga, lavado (s) post-carga, elución o de separación. En las modalidades particulares, se agrega un detergente a un amortiguador de lavado. Los ejemplos de detergentes que pueden utilizarse en la invención incluyen, pero no se limitan a polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20 o 80); poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188); Tritón; dodecil sulfato de sodio (SDS); lauril sulfato de sodio; glicósido de octilo de sodio; lauril-, miristil-, linoleil-, o estearil-sulfobetaina; lauril-, miristil-, linoleil-, o estearil-sarcosina; linoleil-, miristil-, o cetil-betaina; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil-, o isoestearamidopropil-betaina (por ejemplo, lauroamidopropil) ; miristamidopropil-, palmidopropil-, o isoestearamidopropil-dimetilamina; metil cocoílo de sodio-, o metil oleil-taurato de disodio; series MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, NJ. ) ; Igepal CA-630, Pluronic, Tritón, BRIJ, Atlas G2127, Genapol, HECAMEG, LUBROL PX, MEGA, NP, THESIT, TOPPS, CHAPS, CHAPSO, DDMAU, EMPIGEN BB, AWITTERGENT y C12E8. El detergente puede agregarse en cualquier amortiguador de trabajo y también puede incluirse en la alimentación que contiene la molécula de interés. Los detergentes pueden estar presentes en cualquier cantidad adecuada para el uso en un proceso de purificación de proteínas, por ejemplo, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 20% y típicamente de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 1%. En una modalidad particular, el polisorbato 80 se utiliza en un amortiguador de lavado para la CEXC. Un "amortiguador" utilizado en la presente invención es una solución que se resiste cambios en el pH por la adición de ácido o base por la acción de sus componentes conjugados ácido-base. Pueden emplearse varios amortiguadores en un método de la presente invención dependiendo del pH deseado del amortiguador y la etapa particular en el proceso de purificación [vea Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D. , ed. Calbiochem Corporation (1975)]. Los ejemplos no limitativos de los componentes del amortiguador que pueden utilizarse para controlar el rango de pH deseable para un método de la invención incluyen el acetato, citrato, histidina, fosfato, amortiguadores de amonio tales como el acetato de amonio, succinato, MES, CHAPS, MOPS, MOPSO, HEPES, Tris, y similares, así como las combinaciones de estos TRIS-málico ácido-NaOH, maleato, cloroacetato, formato, benzoato, propionato, piridina, piperacina, ADA, PIPES, ACES, BES, TES, tricina, bicina, TAPS, etanolamina, CHES, CAPS, metilamina, piperidina, ácido bórico-0, ácido carbónico, ácido láctico, ácido butanoandióico, ácido dietilmalónico, glicilglicina, HEPPS, HEPPSO, imidazol, fenol, POPSO, succinato, TAPS, basados en amina, bencilamina, trimetil o dimetil o etil o fenil amina, etilenodiamina, o mofolina. Los componentes adicionales (aditivos) pueden estar presentes en un amortiguador según sea necesario, por ejemplo, pueden utilizarse las sales para ajustar la fuerza iónica del amortiguador, tales como el cloruro de sodio, sulfato de sodio y cloruro de potasio; y otros aditivos tales como los aminoácidos (tales como la glicina e histidina), caótropos (tales como la urea), alcoholes (tales como el etanol, manitol, glicerol, y alcohol bencílico), detergentes (vea supra.), y azúcares (tales como la sacarosa, manitol, maltosa, trehalosa, glucosa, y fructosa). Los componentes del amortiguador y los aditivos, y las concentraciones utilizadas, pueden variar de acuerdo al tipo de cromatografía practicada en la invención.

El pH y la conductividad de los amortiguadores pueden variar, dependiendo en que etapa en el proceso de purificación se utiliza el amortiguador. En la CEXC el pH del amortiguador puede estar entre 3 y 10, más preferentemente de aproximadamente pH 4.0 a 8.0; la conductividad puede ser de aproximadamente 0.1 a 40 mS/cm, más preferentemente de aproximadamente conductividad de 0.5 a 15 mS/cm, dependiendo de la etapa de purificación y del amortiguador empleado. En la HCIC el pH de los amortiguadores puede ser de aproximadamente 3 a 10, más preferentemente de aproximadamente pH de 4.0 a 9.0; la conductividad puede ser de aproximadamente 0.0 (WFI; agua para inyección) a 90.0 mS/cm, más preferentemente de aproximadamente 0.1 a 9.0 mS/cm, dependiendo de la etapa de purificación y del amortiguador empleado. Los amortiguadores utilizados a lo largo del proceso de purificación se describen en mayor detalle debajo para cada etapa de la cromatografía. Una solución de "sanitización" se utiliza típicamente para limpiar la resina removiendo cualquier contaminante unido, por ejemplo, aquellos de origen biológico, antes del proceso de purificación. Cualquier amortiguador deseable podría utilizarse para este propósito con tal de que sea compatible con la columna particular y la resina seleccionada de acuerdo a un método de la invención. Preferentemente, el pH de la solución de sanitización es alto, por ejemplo, pH 10 o mayor, más preferentemente pH 11 o mayor, y todavía más preferentemente pH 12 o mayor; alternativamente, el pH de la solución de sanitización puede ser bajo, por ejemplo pH 4 o menos, más preferentemente pH 3 o menos. En una modalidad particular, las columnas HCIC y CEXC se limpian utilizando una solución de sanitización que incluye NaOH ÍN, pH = 12. Un "amortiguador de equilibrio" se utiliza para ajustar el pH y la conductividad de la columna de cromatografía antes de cargar la columna con la mezcla que contiene la proteína de interés para la purificación. Los amortiguadores adecuados que pueden utilizarse para este propósito son bien conocidos en el arte, por ejemplo, tales como los amortiguadores descritos anteriormente, e incluyen cualquier amortiguador en pH que sea compatible con la resina seleccionada utilizada en la etapa de cromatografía para purificar la proteína de interés. Este amortiguador se utiliza para cargar la mezcla que comprende el polipéptido de interés. El amortiguador de equilibrio tiene una conductividad y/o un pH tal que el polipéptido de interés se une a la resina o tal que la proteína interés fluye a través de la columna mientras que una o más impurezas se unen a la columna. En una modalidad preferida, la equilibrio de la columna de cromatografía se completa cuando el pH y la conductividad están dentro de ±0.2 y ±0.4 mS/cm del amortiguador de equilibrio, respectivamente, más preferentemente dentro de ±0.1 y ±0.2 mS/cm del amortiguador de equilibrio, respectivamente. En las modalidades preferidas, las especies del amortiguador de equilibrio para la CEXC y la HCIC están basadas en fosfato de sodio. En la CEXC el pH del amortiguador de equilibrio es de aproximadamente 3 a aproximadamente 9, más preferentemente pH de aproximadamente 4.0 a 8.0, la conductividad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 40 mS/cm, más preferentemente de aproximadamente 0.5 a 10.0 mS/cm. En la HCIC el pH del amortiguador de equilibrio es de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, más preferentemente pH de aproximadamente 6 a 9, la conductividad de aproximadamente 0.0 (WFI) a aproximadamente 90 mS/cm, más preferentemente conductividad de aproximadamente 2.0 a 9 mS/cm. Un "amortiguador de carga" se utiliza para cargar la mezcla que contiene la proteína de interés sobre la columna. Puede utilizarse cualquier solución apropiada como el amortiguador de carga. La conductividad y el pH del amortiguador de carga en el presente proceso se seleccionan tal que la proteína de interés se une a la resina mientras que los contaminantes pueden fluir a través de la columna. Preferentemente, el amortiguador de carga puede ser amortiguador intercambiado. El amortiguador de carga también puede prepararse de una mezcla amortiguada derivada de una etapa de purificación previa, tal como el amortiguador de elución. Los amortiguadores adecuados para el uso como un amortiguador de carga con la resina seleccionada son bien conocidos en el arte, por ejemplo, tales como aquellos descritos anteriormente. Se apreciará por aquellos que tienen habilidad ordinaria en el arte que los amortiguadores de carga para la CEXC y la HCIC pueden utilizarse en un pH comparable (si no el mismo) y conductividades como se describe anteriormente para los amortiguadores de equilibrio para la CEXC y HCIC. Los términos "amortiguador de lavado" o "lavado post carga", como se utiliza aquí, se refieren a un amortiguador utilizado para eluir una o más impurezas de la resina de intercambio iónico antes de eluir la proteína de interés. El término "lavar", y las variaciones gramaticales del mismo, se utiliza para describir el paso de un amortiguador de lavado apropiado a través o sobre la resina de cromatografía. Convenientemente, los amortiguadores de lavado, equilibrio y de carga pueden ser los mismos, pero no se requiere. El pH y la conductividad del amortiguador son tales que una o más impurezas se eluyen de la resina mientras la resina retiene el polipéptido de interés. Si se desea, el amortiguador de lavado puede contener un detergente, como se describe anteriormente, tal como un polisorbato. Puede utilizarse cualquier amortiguador adecuado en un pH compatible con la resina seleccionada para purificar la proteína de interés, tal como los amortiguadores descritos anteriormente. La selección del pH y la conductividad del amortiguador de lavado es importante para la remoción de HCPs y otros contaminantes sin eluir significativamente la proteína de interés. La conductividad y el pH, pueden reducirse o mantenerse o aumentarse en los amortiguadores de lavado utilizados en las etapas de lavado subsiguientes para la cromatografía HCIC y CEXC después de cargar la mezcla para remover más contaminantes hidrofílicos y más contaminantes ácidos o básicos que aquellos de la proteína de interés y para reducir la conductividad del sistema antes de la etapa de elución. En una modalidad particular, solo la conductividad se disminuye para la cromatografía HCIC, y los lavados post-carga para la CEXC no incluyen ningún cambio en el pH o en la conductividad de los amortiguadores utilizados para la equilibrio, carga y lavado post-carga. En una modalidad particular el amortiguador de lavado utilizado para la CEXC es el fosfato de sodio. El pH de un amortiguador de lavado utilizado en la CEXC puede ser de aproximadamente 3 a aproximadamente 9, más preferentemente pH de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 8.0; y la conductividad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 40 mS/cm, más preferentemente conductividad de aproximadamente 0.5 a aproximadamente lOmS/cm. El amortiguador de lavado utilizado en la HCIC puede ser cualquier amortiguador adecuado para lograr un pH y una conductividad deseable, y puede seleccionarse de un amortiguador como se describe anteriormente. En una modalidad particular, el amortiguador de lavado utilizado en la HCIC es el fosfato de sodio. El pH de un amortiguador de lavado utilizado en la HCIC puede ser de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, más preferentemente pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 9; y la conductividad de aproximadamente 0.0 (WFI) a aproximadamente 90mS/cm, más preferentemente conductividad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 9mS/cm.

El término "amortiguador de elución", como se utiliza aquí, se refiere a un amortiguador utilizado para eluir la proteína de interés de la fase sólida (es decir, la resina de cromatografía). El término "eluir", y las variaciones gramaticales del mismo, se refieren a la remoción de una molécula, por ejemplo, el polipéptido de interés, de un material de cromatografía, utilizando las condiciones apropiadas, por ejemplo, alterando la fuerza iónica o el pH del amortiguador que rodea el material de cromatografía, por la adición de una molécula competitiva para el ligando, alterando la hidrofobicidad de la molécula o cambiando una propiedad química del ligando (por ejemplo la carga), tal que la proteína de interés sea incapaz de unirse a la resina y por consiguiente se eluya de la columna de cromatografía. El término "eluato" se refiere al efluente de la columna que contiene el polipéptido de interés cuando se aplica la elución sobre la columna. Después de la elución del polipéptido de interés la columna puede regenerarse, sanitizarse y almacenarse según sea necesario. El pH y la conductividad del amortiguador de elución se seleccionan tal que la proteína de interés se eluya de la CEXC particular o de la resina HCIC utilizada en el proceso. Los amortiguadores adecuados para el uso como un amortiguador de elución se describen anteriormente. En una modalidad particular, el amortiguador de elución utilizado en las cromatografías CEXC y HCIC es el fosfato de sodio y el acetato de sodio, respectivamente. El pH del amortiguador de elución utilizado en la CEXC puede ser de aproximadamente 3.0 a aproximadamente 10, más preferentemente pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 8; y la conductividad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 40 mS/cm, más preferentemente conductividad de aproximadamente 5 a aproximadamente 15mS/cm. El pH del amortiguador de elución utilizado en la HCIC puede ser de aproximadamente 3.0 a aproximadamente 7.0, más preferentemente pH de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 6.0; y la conductividad de aproximadamente 0.0 (WFI) a aproximadamente 20 mS/cm, más preferentemente conductividad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 2 mS/cm. Si se desea, pueden utilizarse soluciones adicionales para preparar la columna para el reuso. Por ejemplo, una "solución de regeneración" puede utilizarse para "separar" o remover los contaminantes firmemente unidos de una columna utilizada en el proceso de purificación. Típicamente, la solución de regeneración tiene una conductividad y pH suficientes para remover sustancialmente cualquier impureza restante y la proteína de interés de la resina. Como se utiliza aquí, el término "conductividad" se refiere a la habilidad de una solución acuosa para conducir una corriente eléctrica entre dos electrodos a una temperatura particular. Una corriente fluye por transporte de iones en la solución. Por consiguiente, con una cantidad creciente de iones presentes en la solución acuosa, la solución tendrá una mayor conductividad. En un método de la presente invención la temperatura a la cual se realiza típicamente la purificación puede ser de aproximadamente 4 a aproximadamente 37 °C, más preferentemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 °C dentro de los rangos de pH especificados.

La unidad de medida para la conductividad es miliSiemens por centímetro (mS/cm) , y puede medirse utilizando un medidor de conductividad estándar. La conductividad de una solución puede alterarse cambiando la concentración de iones de la misma. Por ejemplo, la concentración de un agente de amortiguamiento y/o la concentración de una sal (por ejemplo NaCl o KCl) en la solución puede alterarse para lograr la conductividad deseada. Preferentemente, la concentración de la sal se modifica para lograr la conductividad deseada como se describe en el Ejemplo debajo. El "pl" o "punto isoeléctrico" de un polipéptido se refiere al pH al cual la carga positiva del polipéptido equilibra su carga negativa. El pl puede calcularse de acuerdo a varias metodologías convencionales, por ejemplo, de la carga neta del aminoácido y/o los residuos de ácido siálico en el polipéptido o utilizando enfoque isoeléctrico. Como se utiliza aquí, una "retención de pH bajo" se refiere a una disminución en el pH de un eluato que contiene la proteína de interés, donde la disminución del pH es de menos que aproximadamente pH 5.0, preferentemente menos que aproximadamente pH 4.0, más preferentemente menos que aproximadamente pH 3.7, y más preferentemente aproximadamente pH 3.4 a aproximadamente 3.6 para lograr la inactivación viral (es decir, al menos una reducción 2 log en los títulos virales, más preferentemente al menos una reducción 3 log) seguida por un aumento en el pH para preparar el eluato para la segunda etapa de cromatografía o para llevar el producto a una matriz que proporciona estabilidad a la integridad molecular del producto de interés. Cualquier ácido adecuado puede aplicarse al eluato que contiene la proteína de interés para disminuir el pH para la retención de pH bajo, por ejemplo, HCl ÍN o ácido acético glacial. Cualquier base adecuada puede aplicarse al eluato para regresar su pH a rangos más neutros, por ejemplo, NaOH ÍN o Tris ÍN . La retención de pH bajo típicamente resulta en un aumento en la conductividad de al menos 0.5 mS/cm. Si la retención de pH bajo tiene lugar después de la primer etapa de cromatografía y la segunda etapa de cromatografía es cromatografía de intercambio catiónico entonces es probable que el aumento en el pH este dentro de un rango de pH adecuado, que es aproximadamente 3.0 a aproximadamente 9.0, preferentemente aproximadamente 4.0 - 8.0. Si la retención de pH bajo tiene lugar después de la primer etapa de cromatografía y la segunda etapa de cromatografía es HCIC entonces el aumento en el pH probablemente estará dentro de un rango de pH adecuado para la HCIC, que es aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 10.0, preferentemente aproximadamente pH 6.0 a aproximadamente 9.0. La retención de pH bajo también puede tener lugar después de la segunda cromatografía pero en el método de la invención se ha escogido que tenga lugar entre las etapas de cromatografía debido a la conveniencia experimental. Se apreciará por aquellos que tienen habilidad ordinaria en el arte que no es esencial una etapa de retención de pH bajo para lograr los niveles de pureza obtenibles por un método de la presente invención. La "filtración de flujo tangencial" o "TFF" o "filtración de flujo cruzado" se refiere a un proceso de filtración en que la mezcla de la muestra circula por la parte superior de una membrana, mientras la presión aplicada provoca que ciertos solutos y moléculas pequeñas atraviesen la membrana. En la TFF, típicamente, la solución fluye paralela a la membrana del filtro. Un diferencial de presión a través de la membrana provoca que el fluido y los solutos filtrables (cuyo peso molecular es menor que aquel de las membranas o que se comporta de manera similar, tal como las proteínas globulares) fluyan a través del filtro. Esto puede dirigirse como un proceso de flujo continuo, debido a que la solución se pasa repetidamente sobre la membrana mientras que el fluido que atraviesa el filtro se arrastra continuamente en un circuito separado. En la HPTFF (filtración de flujo tangencial de alto desempeño) la membrana está cargada, utilizando por consiguiente el tamaño y la carga de las moléculas para separar los contaminantes (vea la Publicación de Patente Norteamericana No. 2003/0229212) . Si se desea, la TFF puede utilizarse para intercambiar el amortiguador en el cual la proteína de interés se solubiliza en otro amortiguador que sea más adecuado para el enlace sobre la resina de cromatografía antes de comenzar un método de la presente invención. En otras palabras, la TFF puede utilizarse antes de la primer etapa de cromatografía, sin embargo, una etapa TFF en el proceso (es decir, la TFF ocurre entre las dos etapas de cromatografía) es innecesaria debido a que los amortiguadores y las resinas utilizados en el método presente permiten el movimiento directo de una resina a la siguiente. Como se utiliza aquí, "en el proceso" se refiere a cualquier metodología, etapa, operación, etc., que se realiza después de comenzar la etapa de carga para la primer columna de cromatografía, pero antes de la colección del pico de elución de la segunda columna de cromatografía en un método de la presente invención. Una metodología en el proceso puede resultar directamente en un cambio en la pureza (tal como una TFF en el proceso) o no resulta directamente en un cambio en la pureza (tal como un ajuste de pH y/o conductividad en donde el resultado del ajuste no causa directamente ningún cambio en la pureza) .

Puede ser deseable lograr una pureza de proteína de grado terapéutico utilizando un método de la invención, en cuyo caso las etapas adicionales bien conocidas en el arte pueden emplearse opcionalmente para lograr una capacidad de eliminación viral para ambos; los virus adventicios y endógenos, por ejemplo, los métodos de inactivación de pH bajo y de filtración viral (incluyendo la filtración de membrana cargada específica para virus tales como VR CUNO (CUNO) o DV20 (Pall Technologies), que se describen adicionalmente a continuación. Como se utiliza aquí la "filtración de profundidad" es un método de filtración que utiliza filtros de profundidad, los cuales se caracterizan típicamente por su diseño para retener las partículas dentro de una matriz del filtro. La capacidad del filtro de profundidad se define típicamente por la profundidad, por ejemplo 10" o 20" de la matriz y así la capacidad de retención para los sólidos. En un método de la presente invención un filtro de profundidad puede utilizarse para mejorar la capacidad de eliminación viral del esquema de purificación, sin embargo es una etapa opcional y no se requiere para lograr los niveles de pureza de un método de la presente invención. El filtro de profundidad para la remoción de virus puede utilizarse en cualquier punto durante el esquema de purificación, pero se utiliza preferentemente después de la primer etapa de cromatografía con bajos volúmenes de proceso, debido al costo del filtro. DESCRIPCIÓN DEL PROCESO En el método de la presente invención pueden utilizarse la CEXC y la HCIC en cualquier orden para purificar una proteína de interés para tan poco como aproximadamente 100 ppm de HCP o menos y tan alto como 99% de pureza de monómero o mayor. No se necesitan etapas de cromatografía adicionales para obtener este alto nivel de pureza. La proteína de interés puede producirse mediante las células hospederas vivientes que se han por ingeniería genética para producir la proteína. Los métodos para diseñar genéticamente las células para producir las proteínas son bien conocidos en el arte. Vea por ejemplo, Ausabel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York) y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,534,615 y 4,816,567, cada una de las cuales se incorporan aquí específicamente por referencia. Tales métodos incluyen la introducción de ácidos nucleicos que codifican y permiten la expresión de la proteína en células hospederas vivas. Estas células hospederas pueden ser células bacterianas, células fúngicas, o, preferentemente, células animales crecidas en cultivo. Las células hospederas bacterianas incluyen, pero no se limitan a las células E. coli. Los ejemplos de cepas E. coli adecuadas incluyen: HB101, DH5a, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539, y cualquier cepa E. coli que falle en escindir el DNA extraño. Las células hospederas fúngicas que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, células de Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Aspergillus. Unos pocos ejemplos de líneas celulares animales que pueden utilizarse son CHO, VERO, DXB11, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, NSO y W1138. Pueden establecerse nuevas líneas celulares animales utilizando los métodos bien conocidos por aquellos experimentados en el arte (por ejemplo, por transformación, infección viral, y/o selección) . En las modalidades particulares, la proteína de interés se produce en una célula CHO (vea, por ejemplo, WO 94/11026) . Varios tipos de células CHO son bien conocidos en el arte, por ejemplo, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DXB11, CHO/dhfr" y CHO-S. La preparación de una mezcla para la purificación de proteínas de los deshechos celulares depende inicialmente de la manera de expresión de la proteína. Algunas proteínas se provocan para ser secretadas directamente de la célula en el medio de crecimiento circundante, mientras que otras proteínas se retienen de manera intracelular. Para tales proteínas producidas de manera intracelular, la célula puede dividirse utilizando cualquiera de una variedad de métodos, como corte mecánico, choque osmótico, y tratamiento enzimático. La división libera los contenidos completos de la célula en el homogenado, y además produce fragmentos subcelulares que pueden removerse por centrifugación o por filtración. Un problema similar surge, aunque en menor grado, con las proteínas secretadas directamente debido a la muerte natural de las células y la liberación de las proteínas de células hospederas intracelular durante el curso de la corrida de producción de proteínas. Cuando se utilizan las técnicas recombinantes, la proteína de interés puede producirse de manera intracelular, en el espacio periplásmico, o puede secretarse directamente en el medio. Un método de la invención no depende de ninguna metodología particular para remover los deshechos celulares. Puede emplearse cualquier método por los practicantes experimentados para lograr esto. Si la proteína se produce de manera intracelular, como una primera etapa, los desechos particulados o en partículas, ya sea fragmentos de células hospederas o lisados, pueden removerse, por ejemplo, por una etapa de centrifugación o filtración para preparar una mezcla para la purificación. Si la proteína se secreta en el medio, las células hospederas recombinantes pueden separarse del medio de cultivo celular por, por ejemplo, filtración de flujo tangencial (TFF) o filtración de profundidad, para preparar una mezcla para la purificación.

De acuerdo a la presente invención, una vez que se ha obtenido una mezcla que contiene la proteína de interés, su separación de los contaminantes en la mezcla se realiza utilizando una combinación de cromatografías HCIC y CEXC en cualquier orden como se desee (vea la Figura 1), bajo las condiciones apropiadas, como se describe aquí anteriormente. Ninguna otra etapa de purificación en el proceso, por ejemplo, TFF o HPTFF, se requiere para lograr los niveles de pureza obtenibles por un método de la presente invención. Solo manipulaciones de pH se realizan según sea necesario entre las dos etapas de cromatografía para preparar la mezcla para la purificación en la segunda etapa de cromatografía. En una modalidad particular, la resina de HCIC utilizada es MEP HyperCel (Pall Corp.) y la resina de CEXC es Poros 50HS (Applied Biosystems). Estas técnicas de cromatografía separan las mezclas de proteínas en base a varias propiedades, incluyendo la carga y la hidrofobicidad. En esencia, estos métodos de separación provocan que las proteínas y otras moléculas se muevan a diferentes velocidades de manera descendente a una columna larga para lograr una separación física mientras que el material pasa adicionalmente de manera descendente a la columna. Bajo las condiciones apropiadas como se describe aquí anteriormente, las etapas de cromatografía permiten a la proteína de interés adherirse a la columna, mientras permiten al otro material pasar a través de la columna. La proteína de interés se eluye entonces de manera diferenciada por el amortiguador apropiado. Alternativamente, bajo las condiciones apropiadas, la proteína deseada puede separarse de las impurezas adhiriendo las impurezas a la columna, mientras que la proteína de interés pasa a través de la columna, es decir, la proteína de interés está presente en el "flujo atravesante". Se apreciará por aquellos de habilidad ordinaria en el arte que una retención de pH bajo puede incorporarse en el método presente si se desea. Debido a los requerimientos de eliminación viral de las agencias reguladoras para la producción de proteínas terapéuticas, debe haber al menos dos etapas separadas para la inactivación y eliminación viral, basadas en diferentes modos químicos de acción que son típicamente una retención de pH bajo y una etapa de filtración viral. La retención de pH bajo típicamente emplea cambios de pH de la muestra purificada (por ejemplo, vea el Ejemplo infra . ) , y puede incorporarse en la manipulación de pH necesaria para preparar para la segunda etapa de cromatografía. Se apreciará por aquellos de habilidad ordinaria en el arte que una retención de pH entre las dos etapas de cromatografía puede lograrse utilizando cualquier metodología conocida en el arte para llevar a cabo la eliminación viral típicamente lograda por una retención de pH bajo, con tal de que la mezcla que contiene la proteína de interés se amortigüe apropiadamente antes de a la aplicación en la segunda columna. Por ejemplo, sin pretender ser limitante, una retención de pH bajo que sigue la HCIC puede lograrse utilizando HCl ÍN o ácido acético glacial para disminuir el pH del eluato de HCIC a un rango de pH de aproximadamente 3.4 a 3.6 seguido por Tris 2M de pH 9.0 para incrementar el pH del eluato a aproximadamente 6.2; alternativamente, después de la CEXC, puede utilizarse HCl ÍN o ácido acético glacial para disminuir el pH del eluato de CEXC a un rango de pH de aproximadamente 3.4 a 3.6 y Tris 2M de pH 9.0 para incrementar el pH del eluato a aproximadamente 7.0. Una retención de pH típicamente resultará en un aumento de al menos 0.5mS/cm en la conductividad . Uno de habilidad ordinaria en el arte apreciará las condiciones de cronometración para una etapa de retención de pH bajo utilizada en un método de la presente invención. Típicamente, una retención de pH bajo se realiza durante al menos aproximadamente 30 minutos, preferentemente aproximadamente 45 minutos, más preferentemente hasta aproximadamente 60 minutos, y más preferentemente hasta aproximadamente 90 minutos, En ciertos esquemas de purificación puede ser deseable realizar una retención de pH bajo durante hasta 5 horas dependiendo de la proteína que se está purificando. Si es deseable la formulación de proteínas de grado terapéutico, entonces puede emplearse una segunda etapa de eliminación viral, por ejemplo, una etapa de filtración de virus, que es sin embargo, no requerida para lograr los niveles de pureza obtenibles por un método de la invención. Los dispositivos de filtración que pueden utilizarse en un método de la invención son bien conocidos en el arte (por ejemplo, Ultipor® VF Grado DV20 or DV50 y Filtron® TFF (Pall Corporation, East Hills, NY) ; Viresolve (Millipore, Billerica, MA) ; VR CUNO (CUNO; Meriden, CT) ; y Planova® (Asahi Kasei Pharma, Planova División, Buffalo Grove, IL) , para remover virus y otros materiales biológicos, preferentemente con tamaños de poro menores que 20nm, que pueden remover el poliovirus . Las etapas cromatográficas de la invención pueden llevarse a cabo por cualquier medio mecánico. La cromatografía puede llevarse a cabo en una columna. La columna puede correrse con o sin presión y de la cima al fondo o del fondo a la cima. La dirección del flujo del fluido en la columna puede invertirse durante el proceso de cromatografía. La cromatografía también puede llevarse a cabo utilizando un proceso por lotes en el cual el soporte sólido se prepara del líquido utilizado para cargar, lavar, y eluir la muestra por cualquier medio adecuado, incluyendo gravedad, centrifugación, o filtración. La cromatografía también puede llevarse a cabo poniendo en contacto la muestra con un filtro cargado que absorbe o retiene algunas moléculas en la muestra más fuertemente que otros, utilizando los mismos principios químicos como aquellos descritos para una resina de cromatografía. Aunque pueden ajustarse las etapas en la preparación de las columnas utilizadas en la presente invención para satisfacer las necesidades individuales del practicante, la siguiente descripción se proporciona como guía, y aquellos que tienen habilidad ordinaria en el arte apreciarán que pueden hacerse alteraciones sin apartarse del espíritu de la invención. Las columnas se preparan de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Antes de la purificación, las columnas típicamente se sanitizan utilizando una solución de sanitización, luego se cargan utilizando una sal liotrópica, por ejemplo, NaCl ÍM, y se equilibran utilizando un amortiguador de equilibrio. Durante la etapa de sanitización, típicamente hay un sostenimiento, por ejemplo, durante aproximadamente 30 minutos, preferentemente durante aproximadamente 1 hora, después de que se aplica la solución de sanitización sobre la columna para limpiar la resina que tiene cualquier contaminante unido, incluyendo los contaminantes de origen biológico. La etapa de carga neutraliza la resina desplazando la solución de sanitización, por ejemplo, en la CEXC, puede utilizarse NaCl para remover el NaOH de la columna y para mantener el ligando de la resina en contacto con los iones positivamente cargados. Después de que se carga la columna, se utiliza un amortiguador de equilibrio para equilibrar la columna para preparar el pH y la conductividad de la resina para unir la proteína de interés. Por ejemplo, la columna puede considerarse equilibrada cuando su pH y conductividad están dentro de ±0.1 y dentro de ±0.2 mS/cm de pH y conductividad del amortiguador de equilibrio, respectivamente . Se prepara una mezcla de carga, la cual es típicamente un sobrenadante de cultivo celular que se concentra y amortiguador intercambiado en una sal amortiguada apropiada (es decir, el amortiguador de carga) . La mezcla de carga (es decir, que contiene la proteína de interés para la cual se desea la purificación) derivada de las células hospederas recombinantes se carga sobre la columna equilibrada (CEXC o HCIC) utilizando un amortiguador de carga que opcionalmente puede ser el mismo que el amortiguador de equilibrio. Mientras que la mezcla fluye a través de la fase sólida de la columna, la proteína de interés y otras impurezas (por ejemplo, HCPs si la proteína se produce en una célula CHO) se unen diferencialmente a la fase sólida, permitiendo así la separación mientras la proteína y los contaminantes atraviesan la columna de cromatografía. Una vez que la mezcla se ha cargado sobre la columna y se ha unido a la resina, se realizan las etapas de lavado utilizando un amortiguador de lavado como se describe, para eliminar los contaminantes de la columna. Opcionalmente, puede realizarse una primer etapa de lavado a una velocidad de flujo más lenta que para las otras etapas de lavado y elución (pero no es necesario), por ejemplo, utilizando una velocidad de flujo que corresponde a un tiempo de residencia de varios minutos (por ejemplo, 5-10 minutos) . Las velocidades de flujo se describen en mayor detalle infra . El pH y la conductividad del amortiguador de lavado son importantes durante el primer lavado, particularmente para la cromatografía HCIC, para maximizar la remoción de HCPs. En el método presente, la etapa de lavado en la cromatografía CEXC remueve los ácidos nucleicos y HCPs restantes mientras retiene la proteína de interés. La primer etapa de lavado en la cromatografía HCIC remueve las HCPs mientras que el segundo lavado remueve más contaminantes hidrofílicos, por ejemplo, las HCPs. La HCIC es muy eficiente para la remoción del ácido nucleico debido a que fluye principalmente en la fracción no unida. Si la HCIC se emplea como la primera columna, entonces una tercer etapa de lavado puede emplearse para reducir más los niveles de cualquier contaminante hidrofílico. Para eluir la proteína de interés de la columna, se utiliza un amortiguador de elución apropiado, como se describe anteriormente, para provocar que la proteína de interés invierta el enlace en la columna. El tipo y concentración del amortiguador, la sal, y/u otro compuesto en la composición del amortiguador son tal el amortiguador eluye la(s) impureza (s) de manera diferencial en relación a la proteína de interés, mientras que la proteína de interés se retiene relativo a las impurezas. Los rango apropiados de pH y conductividad para los amortiguadores de carga, lavado, y de elución pueden determinarse rápidamente por aquellos que tienen habilidad ordinaria en el arte, utilizando el Ejemplo proporcionado aquí como guía, tal que la proteína de interés se recupere durante la elución. Para minimizar las HCPs en el eluato que contiene la proteína de interés, puede emplearse una velocidad de flujo reducida, descrita infra . , por ejemplo, no mayor que un tiempo de residencia correspondiente de 2 minutos, más preferentemente no mayor que un tiempo de residencia de 3 minutos, más preferentemente no mayor que un tiempo de residencia de 10 minutos. Mientras la proteína de interés se remueve de la columna, se recolecta basado en la formación de un pico desde la elevación de A2so hasta la caída de A280 entre 5 y 25% por arriba de la línea base, como se mide por la absorbancia. La línea base puede determinarse rápidamente por uno de habilidad ordinaria en el arte midiendo la absorbancia del amortiguador de equilibrio a 250-280 nm mientras el amortiguador pasa a través de la columna. Para reducir la colección de HCPs para preparar una composición purificada que contiene la proteína de interés, se prefiere que el eluato que contiene la proteína de interés se colecte antes del 25% de altura del pico máximo, debido a que las HCPs tienden a eluir en un tiempo más tarde o en valores de pH más bajos para la resina de HCIC. En esencia, los métodos de separación utilizados en la presente invención provocan que los contaminantes se muevan a diferentes velocidades hacia debajo de una columna larga, logrando una separación física que incrementa mientras que pasan más abajo de la columna, mientras que la proteína de interés se adhiere al medio de cromatografía, y se eluye entonces diferencialmente dependiendo del amortiguador. En el método de purificación presente, la velocidad máxima a la cual una mezcla se mueva hacia debajo de la columna (HCIC o CEXC) no es mayor que un tiempo de residencia de 30 minutos, preferentemente no mayor que 10, más preferentemente no mayor que 6 minutos, todavía más preferentemente no mayor que 3 minutos, y más preferentemente no mayor que 2 minutos. En una modalidad particular de la invención, la velocidad de flujo en la etapa de CEXC corresponde a un tiempo de residencia no mayor que aproximadamente 2 minutos; en la etapa de HCIC es no mayor que 3 minutos. Mientras que la velocidad de flujo no es esencial para lograr los niveles de pureza obtenibles por un método de la invención, las velocidades se proporcionan para propósitos de guía. Uno que tiene habilidad ordinaria en el arte puede modificar la velocidad de flujo según sea necesario. La medición preferida de la purificación de proteínas mediante un proceso de la presente invención es la medición de la remoción de la proteína de célula hospedera. La proteína purificada es preferentemente una composición homogénea domo se define supra . La concentración de la proteína de una muestra en cualquier fase de la purificación puede determinarse por cualquier método adecuado. Tales métodos son bien conocidos en el arte e incluyen: 1) los métodos colorimétricos tales como el ensayo Lowry, el ensayo Bradford, el ensayo Smith, y el ensayo con oro coloidal; 2) los métodos que utilizan las propiedades de absorción de UV de las proteínas; y 3) la estimación visual basada en bandas de proteína teñida sobre gel que dependen de la comparación con los estándares de proteína de cantidades conocidas del mismo gel. Vea por ejemplo Stoschek (1990), Quantitation of Protein, in Guide to Protein Purification, Methods in Enzymol. 182: 50-68. La contaminación de la proteína de una composición homogénea que contiene la proteína de interés puede determinarse por varios medios conocidos en el arte, por ejemplo, por ensayo inmunosorbente enlazado a la enzima (ELISA; vea por ejemplo Reen (1994), Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) , in Basic Protein and Peptide Protocols, Methods Mol. Biol. 32: 461-466, la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad) . La cantidad de ADN que puede estar presente en una composición homogénea que contiene la proteína de interés puede determinarse por cualquier método adecuado. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo que utiliza la reacción de cadena polimerasa. El ADN puede reducirse a niveles que son más bajos que 10 pg/mg. La proteína recuperada así puede formularse en una composición biofarmacéuticamente aceptable y puede utilizarse para varios usos diagnósticos, terapéuticos u otros usos conocidos para tales moléculas. Después de la colección del eluato que contiene la proteína de interés, cualquier proteína que pueda permanecer unida a la columna puede liberarse separando el medio de cromatografía utilizando una solución que comprende el amortiguador o la sal utilizada para la cromatografía, pero en una molaridad superior o pH modificado. La columna puede entonces regenerarse utilizando una solución (por ejemplo, una solución de regeneración) que tendrá el efecto de liberar la mayoría o todas las proteínas del medio de cromatografía y reducir o eliminar cualquier contaminación microbiana que pueda existir en el medio de cromatografía. Subsiguientemente, la columna puede enjuagarse y almacenarse en una solución que desalienta el crecimiento microbiano. Tal una solución puede comprender hidróxido de sodio, pero también pueden utilizarse otros reactivos, tales como el etanol, azida de sodio, alcohol bencílico o concentración mayor de las sales liotrópicas. El siguiente Ejemplo se proporciona para propósitos de demostrar la invención, y no pretende ser limitativo. EJEMPLO El presente Ejemplo describe la purificación de los anticuerpos utilizando un método de purificación de la presente invención. Se prepararon los anticuerpos totalmente humanos contra un antígeno asociado a la célula T activada (CTLA-4) y un antígeno asociado al tumor (CD30) utilizando el Medarex' s HuMAb Mouse®. Se prepararon los transfectomas utilizando las células CHO DG44. El cultivo celular se realizó utilizando el medio sintético, libre de suero, definido, en pH neutro (7 a 8) y conductividad entre 10 y 16 mS/cm. Las células DG44 CHO se hicieron crecer a una densidad de aproximadamente 3 a lOxlO6 células/ml. El cultivo celular se clarificó por filtración utilizando un filtro 60MO2 CUNO (Meriden, CT) . El sobrenadante del cultivo celular resultante se concentró y diafiltró en 35 o 70mM de Fosfato se Sodio, pH 6.2. Para los experimentos donde se utilizó MEP Hypercel como la resina de captura, la carga se ajustó a pH 7 mediante titulación del sobrenadante del cultivo celular concentrado y diafiltrado con NaOH ÍM. La purificación de las mezclas que contienen ambos de los dos anticuerpos se realizó en ambas direcciones como se describe debajo. Las Tablas 1 y 2 muestran ejemplos de las dos etapas en un proceso de purificación de la invención para la producción de material de proteína de grado terapéutico. En este proceso (A) , la primer etapa de cromatografía CEXC de no afinidad fue la cromatografía de intercambio catiónico (Tabla 1) utilizando la resina Poros 50HS para la captura, seguida por una retención de pH bajo utilizando HCl ÍN o ácido acético glacial para disminuir el pH del eluato a 3.4 a 3.6 y Tris 2M de pH 9.0 para incrementar el pH de la fracción a 7.0. La segunda etapa de no afinidad fue la HCIC (Tabla 2) utilizando la resina MEP HyperCel para la captura. La retención de pH bajo típicamente resultó en un aumento de aproximadamente 2mS/cm en la conductividad. El proceso se llevó a cabo utilizando los amortiguadores de equilibrio, carga, lavado y de elución para la resina respectiva como se indica en las Tablas 1 y 2.

Ninguna etapa de purificación utilizó una etapa de intercambio de amortiguador en el proceso, es decir, la muestra procede de una etapa de cromatografía a la próxima con solo manipulaciones de pH como parte de la retención de pH bajo. Se realizó un proceso alternativo (B) para la producción del material de proteína de grado terapéutico donde se invirtieron las etapas de cromatografía CEXC y HCIC, es decir, las etapas en la Tabla 2 se realizaron primero seguidas por las etapas en la Tabla 1. La primer etapa de cromatografía de no afinidad fue la HCIC utilizando la resina MEP HyperCel para la captura, como se describe en la Tabla 2. Se realizó una retención de pH bajo utilizando HCl ÍN o ácido acético glacial para disminuir el pH del eluato MEP a 3.4 a 3.6, seguido por Tris 2M, pH 9.0 para incrementar el pH de la fracción a 6.2. La retención de pH bajo típicamente resultó en un aumento de aproximadamente 2mS/cm en la conductividad. La segunda etapa de cromatografía (CEXC) fue CEXC utilizando la resina Poros 50HS para pulido, como se describe en la Tabla 1. El proceso se llevó a cabo utilizando los amortiguadores de equilibrio, carga, lavado y de elución para la resina respectiva como se indica en las Tablas. Ninguna de las etapas de purificación en el proceso alternativo incluyó una etapa de intercambio del amortiguador en el proceso, es decir, la muestra procede de una etapa de cromatografía a la próxima con solo manipulaciones de pH como parte de la retención de pH bajo.

Tabla 1 Cromatografía de intercambio de cationes para la captura de anticuerpos o pulido resumen de los detalles operacionales principales La capacidad de enlace fue constante a 15mg/ml de resina Las velocidades de flujo están expresadas en los tiempos de residencia correspondientes para proporcionar flexibilidad experimental más amplia La temperatura de operación vanó entre 15-25°C NaP = fosfato de sodio Tabla 2 Cromatografía MEP HyperCel para la captura de anticuerpos o pulido: resumen de los detalles principales La capacidad de enlace fue constante a 15mg/ml de resina. Las velocidades de flujo están expresadas en los tiempos de residencia correspondientes para proporcionar flexibilidad experimental más amplia La temperatura de operación varió entre 15-25°C NaP = fosfato de sodio Utilizando un ensayo ELISA estándar para confirmar los niveles de CHOP, PCR para confirmar los niveles de ADN, y HPLC-SEC para confirmar la pureza del monomero del anticuerpo, cada uno de los dos procedimientos de purificación A y B, lograron una composición homogénea, que contiene menos que 100 ppm de la protema de célula hospedera (vea Tabla 3 debajo) , menos que lOpg de ADN/mg de anticuerpo y mayor que 99% del monómero, lo que permite el procesamiento adicional y la formulación del material purificado a un producto de grado terapéutico. La concentración de contaminantes después de la primera etapa varió entre 200 y 1500ng/mg para las CHOPs y 95 a 100% del monómero. Los resultados para los procesos A y B utilizando dos diferentes anticuerpos monoclonales totalmente humanos se reportan en la Tabla 3.

Tabla 3. Resumen de la remoción de contaminantes utilizando los esquemas de purificación sugeridos

Claims (37)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para purificar una mezcla, que comprende una proteína objetivo y uno o más contaminantes, caracterizado porque comprende (a) someter la mezcla a una etapa de cromatografía de intercambio iónico y etapa de cromatografía de inducción de carga hidrofóbica, en donde no hay ninguna etapa de filtración de flujo tangencial en el proceso, y (b) aislar la proteína objetivo.
2. 2. Un método para purificar una mezcla, caracterizado porque comprende una proteína objetivo y uno o más contaminantes, cuya mezcla se ha sometido a cromatografía de inducción de carga hidrofóbica, que comprende (a) someter la mezcla a una etapa de cromatografía de intercambio de cationes, en donde no hay ninguna etapa de filtración de flujo tangencial en el proceso, y (b) aislar la proteína objetivo.
3. 3. Un método para purificar una mezcla, caracterizado porque comprende una proteína objetivo y uno o más contaminantes, cuya mezcla se ha sometido a cromatografía de intercambio iónico, que comprende (a) someter la mezcla a una etapa de cromatografía de inducción de carga hidrofóbica, en donde no hay ninguna etapa de filtración de flujo tangencial en el proceso, y (b) aislar la proteína objetivo.
4. 4. Un método para purificar una mezcla, caracterizado porque comprende una proteína objetivo y un contaminante seleccionado de las proteínas de células hospederas y los ácidos nucleicos, que comprende someter la mezcla a la cromatografía de intercambio catiónico y a la cromatografía de inducción de carga hidrofóbica, y aislar la proteína objetivo a una pureza de aproximadamente 100 partes por millón (ppm) o menos de la proteina de célula hospedera y aproximadamente 10 pg/mg o menos de los ácidos nucleicos.
5. 5. El método de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque incluye además una etapa de inactivación viral.
6. 6. El método de la reivindicación 5, caracterizado porque la etapa de inactivación viral es una etapa en el proceso.
7. 7. El método de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la mezcla se prepara de un sobrenadante del cultivo celular .
8. 8. El método de las reivindicaciones 1, 2 o 4, caracterizado porque la cromatografía por intercambio de cationes se realiza en un rango de pH de 3 a 10.
9. 9. El método de las reivindicaciones 1, 2 o 4, caracterizado porque la cromatografía por intercambio de cationes se realiza en un rango de pH de 4.0 a 8.0. 10. El método de las reivindicaciones 1, 3 o 4, caracterizado porque la cromatografía de inducción de carga hidrofóbica se realiza en un rango de pH de 3 a
10. 10.
11. 11. El método de las reivindicaciones 1, 3 o 4, caracterizado porque la cromatografía de inducción de carga hidrofóbica se realiza utilizando un rango de pH de .0 a 9.0.
12. 12. El método de las reivindicaciones 1, 2 o 4, caracterizado porque en la proteína objetivo se une a una columna de cromatografía de intercambio de cationes a pH 3 a 9 y en un rango de conductividad de 0.1 a 40 mS/cm.
13. 13. El método de las reivindicaciones 1, 2 o 4, caracterizado porque la proteína objetivo se une a una columna de cromatografía de intercambio de cationes a pH 4.0 a 8.0 y a una conductividad de 0.5 a 10 mS/cm.
14. 14. El método de las reivindicaciones 1, 3 o 4, caracterizado porque la proteína objetivo se une a una columna de cromatografía de inducción de carga hidrofóbica a pH 5 a 10 y en un rango de conductividad de 0 a 90 mS/cm.
15. 15. El método de las reivindicaciones 1, 3 o 4, caracterizado porque la proteína objetivo se une a una columna de cromatografía de inducción de carga hidrofóbica a pH 6 a 9 y un rango de conductividad de 2 a 9mS/cm.
16. 16. El método de las reivindicaciones 1, 2 o 4, caracterizado porque la proteína objetivo se une a la columna de cromatografía de intercambio de cationes y la columna se lava utilizando un amortiguador de lavado que tiene un rango de pH de 3 a 9 y un rango de conductividad de 0.1 a 40 mS/cm.
17. 17. El método de las reivindicaciones 1, 2 o 4, caracterizado porque la proteína objetivo se une a una columna de cromatografía de intercambio de cationes y la columna se lava utilizando un amortiguador de lavado que tiene un rango de pH de 4.0 a 8.0 y un rango de conductividad de 0.5 a 10 mS/cm.
18. 18. El método de las reivindicaciones 1, 3 o 4, caracterizado porque la proteína objetivo se une a una columna de cromatografía de inducción de carga hidrofóbica y la columna se lava utilizando un amortiguador de lavado que tiene un rango de pH de 5 a 10 y un rango de conductividad de 0 a 90 mS/cm.
19. 19. El método de las reivindicaciones 1, 3 o 4, caracterizado porque la proteína objetivo se une a una columna de cromatografía de inducción de carga hidrofóbica y la columna se lava utilizando un amortiguador de lavado que tiene un rango de pH de 6 a 9 y un rango de conductividad de 0.1 a 9 mS/cm.
20. 20. El método de la reivindicación 1, 2 o 4, caracterizado porque la proteína objetivo eluye de la columna de cromatografía de intercambio de cationes en un rango de pH de 3 a 10 y un rango de conductividad de 0.1 a 40 mS/cm.
21. 21. El método de las reivindicaciones 1, 2 o 4, caracterizado porque la proteína objetivo eluye de la columna de cromatografía de intercambio de cationes en un rango de pH de 4.0 a 8.0 y un rango de conductividad de 5 a 15 mS/cm.
22. 22. El método de las reivindicaciones 1, 3 o 4, caracterizado porque la proteína objetivo eluye de la columna de cromatografía de inducción de carga hidrofóbica en un rango de pH de 3.0 a 7.0 y un rango de conductividad de 0 a 20 mS/cm.
23. 23. El método de las reivindicaciones 1, 3 o 4, caracterizado porque la proteína objetivo eluye de la columna de cromatografía de inducción de carga hidrofóbica en un rango de pH de 4.0 a 6.0 y un rango de conductividad de 0.1 a 2.0 mS/cm.
24. 24. El método de las reivindicaciones 1, 2 o 4, caracterizado porque la etapa de cromatografía de intercambio de cationes emplea un ligando de intercambio de cationes seleccionado del sulfonato, ácido carboxílico, ácido carboximetil sulfónico, sulfoisobutilo, sulfoetilo, carboxilo, sulfopropilo, sulfonilo, sulfoxietilo y ortofosfato.
25. 25. El método de las reivindicaciones 1, 2 o 4, caracterizado porque la etapa de cromatografía de intercambio de cationes se realiza sobre una resina de intercambio de cationes seleccionada de Poros HS, Poros S, carboxi-metil-celulosa, BAKERBOND ABX™, sulfopropil inmovilizado sobre agarosa y sulfonilo inmovilizado sobre agarosa, MonoS, MiniS, Fuente 15S, 30S, SP sepharose, CM Sepharose, BAKERBOND Carboxy-Sulfon, WP CBX, WP Sulfonic, Hydrocell CM, Hydrocel SP, UNOsphere S, Macro-Prep High S, Macro-Prep CM, Ceramic HyperD S, Ceramic HyperD CM, Ceramic HyperD Z, Trisacryl M CM, Trisacryl LS CM, Trisacryl M SP, Trisacryl LS SP, Spherodex LS SP, resina de catión de ácido fuerte, de malla fina DOWEX, DOWEX MAC-3, Matrex Cellufine C500, Matrex Cellufine C200, Fractogel EMD S03-, Fractogel EMD SE, Fractogel EMD COO-, intercambiadores de cationes fuertes y débiles Amberlite, intercambiadores de cationes fuertes y débiles Diaion, TSK Gel SP-5PW-HR, TSK Gel SP-5PW, Toyopearl CM (650S, 650M, 650C) , Toyopearl SP (650S, 650M, 650C) , CM (23, 32, 52), SE(52, 53), Pll, Express-Ion C y Express-Ion S.
26. 26. El método de las reivindicaciones 1, 3 o 4, caracterizado porque la etapa de cromatografía de inducción de carga hidrofóbica emplea un ligando de cromatografía de inducción de carga hidrofóbico que comprende una estructura aromática o heterocíclica ionizable que tiene una cadena alifática y al menos un átomo de azufre en el brazo enlazador y/o estructura del ligando.
27. 27. El método de la reivindicación 26, caracterizado porque el ligando de cromatografía de inducción de carga hidrofóbico comprende un grupo seleccionado de 2-aminometilpiridina, 3-aminometilpiridina y 4-aminometilpiridina, 2-mercaptopiridina, 4-mercaptopiridina o 4-mercaptoetilpiridina, mercaptoácidos, mercaptoalcoholes, basados en imidazolilo, mercaptometilimidazol, 2-mercaptobencimidazol, aminometilbencimidazol, histamina, mercaptobencimidazol, dietilaminopropilamina, aminopropilmorfolina, aminopropilimidazol, ácido aminocapróico, ácido nitrohidroxibenzóico, nitrotirosina/etanolamina, ácido diclorosalicílico, dibromotiramina, ácido clorohidroxifenilacético, ácido hidroxifenilacético, tiramina, tiofenol, glutationa, bisulfato, y tintes, o un derivado de los mismos.
28. 28. El método de las reivindicaciones 1, 3 o 4, caracterizado porque la etapa de cromatografía de inducción de carga hidrofóbica se realiza utilizando una resina de inducción de carga hidrofóbica seleccionada de MEP HyperCel.
29. 29. El método de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque los contaminantes se seleccionan de las proteínas de células hospederas, metabolitos de la célula hospedera, proteínas constitutivas de la célula hospedera, ácidos nucleicos, endotoxinas, contaminantes relacionados al producto, lípidos, y aditivos de medios o derivados de medios.
30. 30. El método de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la proteína objetivo es un anticuerpo o un fragmento del anticuerpo.
31. 31. El método de la reivindicación 30, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
32. 32. El método de la reivindicación 30, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo totalmente humano.
33. 33. El método de la reivindicación 30, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del anticuerpo anti-CTLA4 y el anticuerpo anti-CD30.
34. 34. El método de la reivindicación 30, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona de las moléculas de anticuerpo de cadena sencilla, diacuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos biespecíficos y anticuerpos multiespecíficos .
35. 35. El método de la reivindicación 30, caracterizado porque el fragmento del anticuerpo se selecciona de Fab, Fab' , F(ab' )2 y Fv.
36. 36. El método de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la proteína objetivo es una inmunoadhesina.
37. 37. El método de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque comprende además la etapa de formular la proteína aislada en una composición farmacéutica.