CN111991571B - 一种柱上低pH病毒灭活的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种柱上低pH病毒灭活的方法。具体步骤如下：1)阳离子层析柱平衡。2)蛋白样品上样。3)阳离子层析柱上样后冲洗。4)柱上低pH病毒灭活。5)阳离子层析柱再冲洗。6)蛋白洗脱回收。本发明的特色在于开发了一种快速便捷的低pH病毒灭活方法，方法的关键在于阳离子层析柱上直接进行低pH病毒灭活，操作步骤简单、工艺稳健、有利于保护对酸敏感的蛋白。

Description

一种柱上低pH病毒灭活的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白药物下游生产工艺中一种柱上低pH病毒灭活的方法。
背景技术
近年来蛋白类药物越来越受到人们的关注。随着哺乳动物细胞培养技术的发展，大量的抗体类蛋白或融合蛋白都采用哺乳动物进行表达生产。目前，中国仓鼠卵巢细胞（CHO，Chinese hamster ovary cells）是应用最为广泛的表达体系之一。采用动物细胞表达生产的产品，有引入病毒的风险。为了保证最终产品的安全性，需要下游生产工艺有效去除或者灭活潜在的病毒。
低pH病毒灭活是一种常用的病毒灭活方式，能有效降低病毒水平，但在传统的实际应用和操作过程中仍存在一些不足之处。低pH病毒灭活通常需要在较低的pH下进行，在进行酸调节时容易发生局部过酸，导致部分产品聚体含量增加。其次，大规模生产中，pH的调节操作比较繁琐，调节过程时间长，调节pH的一致性不容易控制。另外，在容器中进行低pH调节，容易存在死角或是残液挂壁的现象，有可能导致病毒灭活不彻底。
本发明针对蛋白药物，采用柱上低pH病毒灭活，充分利用阳离子层析柱高吸附容量、操作方便和易于控制的优势，提高低pH病毒灭活的工艺稳健性，保证产品的病毒安全性。
发明内容
本发明的目的是提供一种柱上低pH病毒灭活的方法。
一种柱上低pH病毒灭活的方法包括如下步骤：
1）采用50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱3-8个柱体积；
2）将待处理的蛋白样品调节至pH 4-6，得到蛋白上样液；
3）将蛋白上样液上样到阳离子层析柱上，上样量为20-120 g/L 填料；
4）采用50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱3-8个柱体积；
5）采用50 mM柠檬酸灭活缓冲液冲洗阳离子层析柱3-8个柱体积，并暂停30-120min；
6）采用50 mM柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品。
进一步的，所述的50 mM柠檬酸平衡缓冲液，pH值为4-6；
进一步的，所述的待处理的蛋白样品，为单抗、双特异性抗体或融合蛋白；
进一步的，所述的阳离子层析柱，为装填Capto S ImpAct或Poros XS的层析柱；
进一步的，所述的50 mM柠檬酸灭活缓冲液，pH值为3.0-3.8；
进一步的，所述的50 mM柠檬酸洗脱缓冲液，pH值为5-6，氯化钠浓度为100-300mM。
本发明采用柱上低pH病毒灭活，充分利用阳离子层析柱高吸附容量、操作方便和易于控制的优势，提高低pH病毒灭活的工艺稳健性。本发明的优点在于：1）高吸附容量；2）操作方便；3）易于放大；4）病毒灭活效果好；5）利于稳定蛋白产品；6）回收的蛋白产品纯度高。
附图说明
附图1 是本发明阳离子层析柱上对单抗料液进行低pH病毒灭活的电泳谱图，第1泳道为标准蛋白，第2泳道为待处理的单抗料液，第3、4泳道为低pH病毒灭活后的单抗产品。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1
取柱体积为10 mL的Capto S ImpAct阳离子层析柱，用pH 4.0的50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱3个柱体积。取含有0.2 g单抗的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节pH至4.0，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到阳离子层析柱，上样量为20 g/L填料。用pH4.0的50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱3个柱体积。用pH 3.0的50 mM柠檬酸灭活缓冲液冲洗阳离子层析柱3个柱体积，并暂停30 min。采用pH 5.0含100 mM NaCl的50 mM柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低pH病毒灭活后的单抗产品，电泳分析纯度为97.8%。
实施例2
取柱体积为35 mL的Capto S ImpAct阳离子层析柱，用pH 6.0的50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱8个柱体积。取含有4.2 g双特异性抗体的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节pH至6.0，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到阳离子层析柱，上样量为120 g/L填料。用pH 6.0的50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱8个柱体积。用pH 3.8的50 mM柠檬酸灭活缓冲液冲洗阳离子层析柱8个柱体积，并暂停120 min。采用pH 6.0含300 mM NaCl的50 mM柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低pH病毒灭活后的双特异性抗体产品，电泳分析纯度为98.5%。
实施例3
取柱体积为20 mL的Poros XS阳离子层析柱，用pH 5.0的50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱4个柱体积。取含有2.0 g单抗的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节pH至5.0，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到阳离子层析柱，上样量为100 g/L填料。用pH 5.0的50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱8个柱体积。用pH 3.5的50 mM柠檬酸灭活缓冲液冲洗阳离子层析柱4个柱体积，并暂停90 min。采用pH 5.0含200 mM NaCl的50 mM柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低pH病毒灭活后的单抗产品，电泳分析纯度为98.0%。
实施例4
取柱体积为25 mL的Poros XS阳离子层析柱，用pH 5.5的50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱5个柱体积。取含有2.0 g融合蛋白的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节pH至5.5，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到阳离子层析柱，上样量为80 g/L填料。用pH 5.5的50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱5个柱体积。用pH 3.6的50 mM柠檬酸灭活缓冲液冲洗阳离子层析柱5个柱体积，并暂停60 min。采用pH 5.5含150 mM NaCl的50 mM柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低pH病毒灭活后的融合蛋白产品，电泳分析纯度为97.5%。
实施例5
取柱体积为15 mL的Capto S ImpAct阳离子层析柱，用pH 4.5的50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱3个柱体积。取含有0.9 g融合蛋白的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节pH至4.5，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到阳离子层析柱，上样量为60 g/L填料。用pH 4.5 的50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱3个柱体积。用pH 3.3的50 mM柠檬酸灭活缓冲液冲洗阳离子层析柱5个柱体积，并暂停40 min。采用pH 5.4含180 mM NaCl的50mM柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低pH病毒灭活后的融合蛋白产品，电泳分析纯度为99.1%。
实施例6
取柱体积为50 mL的Poros XS阳离子层析柱，用pH 4.8 的50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱7个柱体积。取含有2.5 g融合蛋白的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节pH至4.8，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到阳离子层析柱，上样量为50 g/L填料。用pH4.8 的50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱4个柱体积。用pH 3.5的50 mM柠檬酸灭活缓冲液冲洗阳离子层析柱4个柱体积，并暂停70 min。采用pH 5.5含150 mM NaCl的50 mM柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低pH病毒灭活后的融合蛋白产品，电泳分析纯度为98.4%。
实施例7
取柱体积为20 mL的Poros XS阳离子层析柱，用pH 4.0的50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱3个柱体积。取含有0.4 g单抗的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节pH至4.0，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到阳离子层析柱，上样量为20 g/L填料。用pH 4.0的50 mM柠檬酸灭活缓冲液冲洗阳离子层析柱3个柱体积。用pH 3.0的50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱3个柱体积，并暂停30 min。采用pH 5.0含100 mM NaCl的50mM柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低pH病毒灭活后的单抗产品，电泳分析纯度为97.6%。
实施例8
取柱体积为200 mL的Poros XS阳离子层析柱，用pH 6.0的50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱8个柱体积。取含有24 g双特异性抗体的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节pH至6.0，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到阳离子层析柱，上样量为120 g/L填料。用pH 6.0的50mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱8个柱体积。用pH 3.8的50 mM柠檬酸灭活缓冲液冲洗阳离子层析柱8个柱体积，并暂停120 min。采用pH 6.0含300 mM NaCl的50mM柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低pH病毒灭活后的双特异性抗体产品，电泳分析纯度为98.8%。
实施例9
取柱体积为50 mL的Capto S ImpAct阳离子层析柱，用pH 4.8的50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱7个柱体积。取含有2.5 g融合蛋白的料液，用柠檬酸或柠檬酸钠调节pH至4.8，得到蛋白上样液。蛋白上样液上样到阳离子层析柱，上样量为50 g/L填料。用pH 4.8的50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱4个柱体积。用pH 3.5的50 mM柠檬酸灭活缓冲液冲洗阳离子层析柱4个柱体积，并暂停70 min。采用pH 5.5含150 mM NaCl的50mM柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品，收集洗脱组分，得到低pH病毒灭活后的融合蛋白产品，电泳分析纯度为98.3%。

Claims (6)

1.一种柱上低pH病毒灭活的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）采用50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱3-8个柱体积；
2）将待处理的蛋白样品调节至pH 4-6，得到蛋白上样液；
3）将蛋白上样液上样到阳离子层析柱上，上样量为20-120 g/L填料；
4）采用50 mM柠檬酸平衡缓冲液冲洗阳离子层析柱3-8个柱体积；
5）采用50 mM柠檬酸灭活缓冲液冲洗阳离子层析柱3-8个柱体积，并暂停30-120 min；
6）采用50 mM柠檬酸洗脱缓冲液洗脱回收产品。
2.根据权利要求1所述的一种柱上低pH病毒灭活的方法，其特征在于所述的50 mM柠檬酸平衡缓冲液，pH值为4-6。
3.根据权利要求1所述的一种柱上低pH病毒灭活的方法，其特征在于所述的待处理的蛋白样品，为单抗、双特异性抗体或融合蛋白。
4.根据权利要求1所述的一种柱上低pH病毒灭活的方法，其特征在于所述的阳离子层析柱，为装填Capto S ImpAct或Poros XS的层析柱。
5.根据权利要求1所述的一种柱上低pH病毒灭活的方法，其特征在于所述的50 mM柠檬酸灭活缓冲液，pH值为3.0-3.8。
6.根据权利要求1所述的一种柱上低pH病毒灭活的方法，其特征在于所述的50 mM柠檬酸洗脱缓冲液，pH值为5-6，氯化钠浓度为100-300 mM。
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