MX2007007494A - Variantes de alfa-amilasa. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a variantes de una alfa-amilasa similar a Termamil, en la cual, la variante exhibe propiedades alteradas, en particular, afinidad incrementada al almidon, con relacion a la alfa-amilasa precursora.

Description

VARIANTES DE ALFA-AMILASA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere, entre otras cosas, a nuevas variantes de las alfa-amilasas similares a Termamil precursoras, notablemente, variantes que exhiben propiedades alteradas, en particular, afinidad alterada al almidón (con relación al precursor), las cuales son ventajosas con respecto a aplicaciones de las variantes en, particular, en procesamientos de almidón industrial (por ejemplo, licuefacción o sacarificación de almidón) . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las alfa-a ilasas (alfa-1, 4-glucan-4-glucanohidrolasas, EC 3.2.1.1), constituyen un grupo de enzimas las cuales catalizan la hidrólisis de almidón y otros oligo y polisacáridos 1, 4-glucosídicos lineales y ramificados . Existe un cuerpo muy extenso de patentes y literatura científica, que se refieren a esta clase de enzimas industrialmente muy importantes. Un número de alfa-amilasas tales como variantes alfa-amilasas similares de Termamil, se conocen de por ejemplo, los documentos WO 90/11352, WO 95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873, WO 96/23874 y WO 97/41213. REF.: 182886 Entre la descripción reciente que se refiere a alfa-amilasas, el documento WO 96/23874, proporciona datos de estructuras cristalinas por rayos-X, tridimensionales, para una alfa-amilasa similar a Termamil, referida como BA2 , las cuales consisten de los residuos de 300 aminoácidos N-terminales de la. alfa-amilasa de B . ayi l ol i qu efa ci ens que comprende, la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 6, en este documento, y los aminoácidos 301-483 del extremo C-terminal de alfa-amilasa de B . l icheni formis que comprende, la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 4 en este documento (el último siendo comercialmente disponible bajo el nombre comercial Termamyl™), y el cual es además, estrechamente relacionado con las alfa-amilasas Baci l l us industrialmente importantes (las cuales en el presente contexto, están abarcadas dentro del significado del término "alfa-amilasas similares a Termamil", y las cuales incluyen, entre otras cosas, las alfa-amilasas B . licheni formis , B . amyloliquefaciens , y B . s tearothermophi l us ) . El documento WO 96/23874 además, describe la metodología para diseñar, en base al análisis de la estructura de alfa-amilasa similar a Termamil, variantes de alfa-amilasa similar a Termamil, las cuales exhiben propiedades alteradas con relación al precursor.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nuevas variantes alfa-amilolíticas (mutantes) de una alfa-amilasa similar a Termamil, en particular, variantes que exhiben afinidad alterada al almidón (con relación al precursor) , las cuales tienen la ventaja en conjunto con los procesamientos industriales del almidón (licuefacción del almidón, sacarificación y similares) . Los inventores han encontrado que las variantes con propiedades alteradas, en particular, afinidad alterada de almidón, mejoran la conversión de almidón, comparadas con las alfa-amilasas similares a Termamil precursoras. La invención además se refiere a constructos de ADN que codifican variantes de la invención, a composiciones que comprenden variantes de la invención, a métodos para preparar variantes de la invención, y al uso de variantes y composiciones de la invención, solas o en combinación con otras enzimas alfa-amilolíticas, en varios procesos industriales, por ejemplo, licuefacción de almidón, y en la composición de detergentes, tales como, composiciones para limpiar superficies duras y lavaplatos, lavandería; purificación de etanol, tal como combustible, producción de etanol industrial y para bebidas; desencolado de textiles, telas o prendas, etc.

Nomenclatura En la presente descripción y reivindicaciones, se usan códigos convencionales de una letra y tres letras para residuos de aminoácidos. Por facilidad de referencia, las variantes alfa-amilasas de la invención, son descritas por el uso de la siguiente nomenclatura: Aminoácido (s) original (es) : posición (es) : aminoácido (s) sustituido (s) De conformidad con esta nomenclatura, por ejemplo, la sustitución de alanina por asparagina en la posición 30 se muestra como: Ala30Asn o A30N una supresión de alanina en la misma posición se muestra como: Ala30* o A30* e inserción de un residuo de aminoácido adicional, tal como lisina, se muestra como: Ala30AlaLys o A30AK Una supresión de un estiramiento consecutivo de residuos de aminoácidos, tales como residuos de amino ácidos 30-33, se indica como (30-33)* o ?(A30-N33). En donde una alfa-amilasa específica contiene una "supresión" en comparación con otras alfa-amilasas y se hace una inserción en tal posición que se indica como: *36Asp o *36D por inserción de un ácido aspártico en la posición 36. Las mutaciones múltiples se separan por signos de más, es decir: Ala30Asn + Glu34Ser ó A30N+E34S que representan mutaciones en las posiciones 30 y 34, sustituyendo alanina y ácido glutámico por asparagina y serina, respectivamente. En donde uno o más residuos alternativos de aminoácido pueden ser insertados en una posición dada indicada como: A30N, E o A30N o A30E Además, cuando una posición adecuada para modificación se identifica en este documento sin alguna modificación específica sugerida, se entiende que cualquier residuo de aminoácido puede ser sustituido por el residuo de aminoácido presente en la posición. De este modo, por ejemplo, cuando se menciona una modificación de una alanina en la posición 30, pero no se especifica, se entiende que la alanina puede ser suprimida o sustituida por cualquier otro aminoácido, es decir, cualquiera de: R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V. Además, "A30X" significa cualquiera de las siguientes sustituciones: A30R, A30N, A30D, A30C, A30Q, A30E, A30G, A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P, A30S, A30T, A30W, A30Y, o A30 V; o abreviado: A30R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V. Si la enzima precursora -usada para la numeración-ya tiene el residuo de aminoácido en cuestión sugerido para sustitución en tal posición, se usa la siguiente nomenclatura : "X30N" o "X30N,V", en el caso en donde por ejemplo, uno de N o V esté presente en el tipo natural . De este modo, significa que otras enzimas precursoras correspondientes son sustituidas en "Asn" o "Val" en la posición 30. Características de residuos de aminoácidos Amioácidos cargados: Asp, Glu, Arg, Lys, His Aminoácidos negativamente cargados (con el primer residuo más negativo) : Asp, Glu Aminoácidos positivamente cargados (con el primer residuo más positivo) : Arg, Lys, His Aminoácidos neutrales : Gly, Ala, Val, Leu, lie, Phe, Tyr, Trp, Met, Cys, Asn, Gln, Ser, Thr, Pro Residuos de aminoácidos hidrofóbicos (con el último residuo listado más hidrofóbico) : Gly, Ala, Val, Pro, Met, Leu, lie, Tyr, Phe, Trp Aminoácidos hidrofílicos (con el último residuo listado más hidrofílico) : Thr, Ser, Cys, Gln, Asn DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La alfa-amilasa similar a Termamil Es bien sabido que un número de alfa-amilasas producidas por Bacillus spp . son altamente homologas al nivel de aminoácido. Por ejemplo, las alfa-amilasas de B . licheniformis, comprenden la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 4 (comercialmente disponible como Termamyl™) , se han encontrado por ser aproximadamente 89% de homologas con la alfa-amilasa de B . amyloliquefaciens que comprende la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 6, y aproximadamente 79% homologa con la alfa-amilasa de B . stearothermophillus que comprende la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 8. Además, las alfa-amilasas homologas incluyen una alfa-amilasa derivada de una cepa de Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 ó DSM 9375, las cuales se describen en detalle en el documento WO 95/26397, y la alfa-amilasa #707 descrita por Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988) , pp. 25-31. Todavía, alfa-amilasas homologas adicionales incluyen, alfa-amilasas producidas por la cepa B . licheniformis descrita en el documento EP 0252666 (ATCC 27811) , y las alfa-amilasas identificadas en los documentos WO 91/00353 y WO 94/18314. Otras alfa-amilasas similares a Termamil, están comprendidas en los productos vendidos bajo los siguientes nombres comerciales: Optitherm™ y Takatherm™ (disponible de Solvay) ; Maxamyl™ (disponibles de Gist-brocades/Genencor) , Spezym AA™ y Spezyme Delta AA™ (disponible de Genencor) , y Keistase™ (disponible de Daiwa) , Purastar™ ST 5000E, PURASTRA™ HPAM L (de Genencor Int.). Debido a la homología sustancial encontrada entre estas alfa-amilasas, son consideradas por pertenecer a la misma clase de alfa-amilasas, es decir, las clases de "alfa-amilasas similares a Termamil". Por consiguiente, en el presente contexto, el término "alfa-amilasa similar a Termamil", está propuesto para indicar una alfa-amilasa, la cual en el nivel de aminoácido, exhibe una homología sustancial a Termamyl™, es decir, la alfa-amilasa B . licheniformis, que tiene la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO : 4 , en este documento. En otras palabras, una alfa-amilasas similar a Termamil, es una alfa-amilasa la cual tiene la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 2, 4, o 6 en este documento, y la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 1 ó 2 del documento WO 95/26397 o en Tsukamoto et al., 1998, o í) la cual exhibe al menos, 60%, preparado al menos 70%, más preferido al menos 75%, aún más preferido al menos 80%, especialmente al menos 85%, especialmente preferido al menos 90%, aún especialmente más preferido al menos 95% de homología, más preferido al menos 97%, más preferido al menos 99% con al menos, una de dichas secuencias de aminoácido y/o ii) exhibe reactividad cruzada inmunológica con un anticuerpo originado contra al menos, una de dichas alfa-amilasas, y/o iii) es codificada por una secuencia de ADN la cual hibridiza a la secuencia de ADN que codifica las alfa-amilasas especificadas anteriormente las cuales son aparentes de las SEC ID NOS: 1, 3 y 5 y de la presente solicitud y SEC ID NOS: 4 y 5 del documento WO 95/26397, respectivamente. Homología (identidad) La homología puede ser determinada como el grado de identidad entre las dos secuencias, indicando una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. La homología puede ser adecuadamente determinada por medio de programas de ordenador conocidos en la técnica tal como GAP, proporcionado en el paquete de programa GCG (descrito anteriormente) . De este modo GCGy8 Gap, puede ser usado con la matriz de registro de falta para identidad y los siguientes parámetros de falta: omisión de creación GAP de 0.5 y omisión de extensión GAP de 0.3, respectivamente, para comparación de secuencia de ácido nucleico, y omisión de creación GAP de 3.0 y omisión de extensión GAP de 0.1, respectivamente, para la comparación de secuencia de proteína. GAP usa el método de Needleman and Wunsch, (1970), J. Mol. Biol. 48, p.443-453, para hacer alineaciones y calcular la identidad. Una alineación estructural entre Termamil y alfa-amilasa similar a Termamil, puede ser usada para identificar posiciones equivalentes/correspondientes en otras alfa-amilasas similares a Termamil. Un método para obtener dicha alineación estructural es usar le programa Pile Up del paquete GCG usando valores de falta de omisiones gap, es decir, una omisión de creación gal de 3.0 y una omisión de extensión gap de 0.1. Otros métodos de alineación estructural incluyen, el análisis de agrupamiento hidrofóbico (Gaboriaud et al., (1987), FEBS LETTERS 224, pp . 149-155) y ensartamiento inverso (Huber, T; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No. 1 pp. 142-149 (1998). La propiedad ii) de alfa-amilasa, es decir, la reactividad cruzada inmunológica, puede ser ensayada usando un anticuerpo originado contra o reactivo con, al menos, un epítope de la alfa-amilasa similar a Termamil relevante. El anticuerpo, el cual puede ser ya sea monoclonal o policlonal, puede ser producido por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe por Hudson et al., Practical Immunology, Third edition (1989), Black- well Scientific Publications. La reactividad cruzada inmunológica, puede ser determinada usando ensayos conocidos en la técnica, ejemplos de los cuales son, Manchado Western o ensayo de inmunodifusion radial, por ejemplo, como se describe por Hudson et al., 1989. En este sentido, se ha encontrado la reactividad cruzada inmunológica entre las alfa-amilasas que tienen las secuencias de aminoácido SEC ID NOS: 2, 4, 6, u 8, respectivamente. Hibridización La sonda de oligonucleótido usada en la caracterización de alfa-amilasas similares a Termamil de conformidad con la propiedad iii) anterior, puede ser adecuadamente preparada en base a la secuencia de nucleótido o aminoácido completo o parcial de la alfa-amilasa en cuestión. Condiciones adecuadas para probar hibridización involucran, presacudimiento en 5xSSC y prehibridización por 1 hora a ~40°C en solución de formamida al 20%, solución 5xDenhardt, 50 mM de fosfato de sodio, pH 6.8, y 50 mg de ADN de timo de ternera sonicado desnaturalizado, seguido por hibridización en la misma solución, suplementado con 100 mM de ATP por 18 horas a ~40°C, seguido por tres lavados del filtro en 2xSSC, SDS al 0.2% a 40°C por 30 minutos (baja rigurosidad) , preferido a 50°C (rigurosidad media) , más preferiblemente a 65°C (alta rigurosidad) , aún más preferiblemente a ~75°C (rigurosidad muy alta) . Más detalles acerca del método de hibridización se pueden encontrar en Sambrook et al., Molecular_Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989). En el presente contexto, "derivado de", se pretende no solamente para indicar una alfa-amilasa producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, sino también una alfa-amilasa codificada por una secuencia de ADN de tal cepa y producida en un organismo hospedador transformado con dicha secuencia de ADN. Finalmente, el término está propuesto para indicar una alfa-amilasa, la cual es codificada por una secuencia de ADN de origen ADNc y/o sintético, y la cual tiene las características de identificación de la alfa-amilasa en cuestión. El término también está propuesto para indicar que la alfa-amilasa precursora puede ser una variante de una alfa-amilasa que se origina naturalmente, es decir, una variante la cual es el resultado de una modificación (inserción, sustitución, supresión) , de uno o más residuos de aminoácido de la alfa-amilasa que se origina naturalmente. Alfa-amilasas híbridas precursoras Las alfa-amilasas precursoras pueden ser una alfa-amilasa híbrida, es decir, una alfa-amilasa, la cual comprende una combinación de secuencias de aminoácido precursoras derivadas de al menos, dos alfa-amilasas. La alfa-amilasa híbrida precursora puede ser una, la cual, en base a la homología de aminoácido y/o reactividad cruzada inmunológica y/o hibridización de ADN (como se define anteriormente) , puede ser determinada por pertenecer a la familia de alfa-amilasa similares a Termamil. En este caso, la alfa-amilasa híbrida es típicamente compuesto de al menos, una parte de una alfa-amilasa similar a Termamil y parte (s) de una o más de otras alfa-amilasas seleccionadas de alfa-amilasas similares a Termamil o alfa-amilasas no similares a Termamil de origen microbiano (bacterial o fúngico) y/o mamífero . De este modo, la alfa-amilasa híbrida precursora puede comprender una combinación de secuencias de aminoácido ácido parciales derivadas de al menos, dos alfa-amilasas similares a Termamil, o de al menos, una alfa-amilasa bacteriana similar a termamil y al menos una no similar a termamil, o de al menos una alfa-amilasa fúngica y al menos una similar a Termamil. Las alfa-amilasas similares a termamil de las cuales se deriva una secuencia de aminoácido parcial, pueden por ejemplo, ser cualquiera de aquellas alfa-amilasas similares a Termamil específicas, referidas en este documento. Por ejemplo, la alfa-amilasa precursora puede comprender una parte C-terminal de una alfa-amilasa derivada de una cepa de B. licheniformis, y una parte N-terminal de una alfa-amilasa derivada de una cepa de B. amyloliquefaciens , o de una cepa de B . stearothermophillus .

Por ejemplo, la alfa-amilasa precursora puede comprender al menos, 430 residuos de aminoácido de la parte C-terminal de la alfa-amilasa de B . licheniformis , y puede por ejemplo, comprender a) un segmento de aminoácido que corresponde a 37 residuos de aminoácido N-terminales de alfa-amilasa de B . licheniformis que tienen la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO : 6, y un segmento de aminoácido que corresponde a 445 residuos de aminoácido C-terminal de alfa-amilasa de B . licheniformis que tiene la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 4, o b) un segmento de aminoácido que corresponde a 68 residuos de aminoácido N-terminales de la alfa-amilasas de B . stearothermophillus que tiene la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO : 8 y un segmento de aminoácido que corresponde a 415 residuos de aminoácido C-terminales de alfa-amilasa de B . licheniformis que tiene la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 4. En una modalidad preferida, la alfa-amilasa similar a Termamil precursora, es una alfa-amilasa similar a Termamil híbrida idéntica a la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4, excepto que los 35 residuos de aminoácidos N-terminales (de la proteína madura) , son reemplazados con 33 residuos de aminoácidos N-terminales de la proteína madura de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (BAN) , mostrado en la SEC ID NO: 6. Dicho híbrido puede además tener las siguientes mutaciones: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando la numeración en la SEC ID NO: 4) referida como LE174. Otra alfa-amilasa híbrida precursora preferida es LE429, mostrada en la SEC ID NO: 2. La alfa-amilasa no similar a Termamil, puede por ejemplo, ser una alfa-amilasa fúngica, una alfa-amilasa de planta o mamífero, o una alfa-amilasa bacteriana (diferente de alfa-amilasa similar a Termamil) . Ejemplos específicos de tales alfa-amilasas incluyen, la alfa-amilasas TAKA de Aspergillus oryzae, la alfa-amilasa de ácido de A . niger, la alfa-amilasa de Bacillus subtilis, la alfa-amilasa pancreática porcina y la alfa-amilasa de cebada. Todas estas alfas-amilasas tienen estructuras elucidadas, las cuales son marcadamente diferentes de las estructuras de una alfa-amilasa similar a Termamil típica, como se refiere en este documento . Las alfa-amilasas fúngicas mencionadas anteriormente, es decir, derivadas de A. niger y A . oryzae, son altamente homologas al nivel de aminoácido y en general, se consideran pertenece a la misma familia de alfa-amilasas. Las alfa-amilasas fúngicas derivadas de Arpergillus oryzae son comercialmente disponibles bajo el nombre comercial Fungamyl™ . Además, cuando una variante particular de una alfa- amilasa similar a Termamil (variante de la invención) , es referida -en una manera convencional- por referencia a modificación (por ejemplo, supresión o sustitución) de residuos de aminoácido específicos en la secuencia de aminoácido de una alfa-amilasa similar a Termamil específica, se entiende que variantes de otras alfa-amilasa similares a Termamil modificadas en la(s) posición(es) equivalentes (como se determina de la mejor alineación de secuencia de aminoácido posible entre las secuencias de aminoácido respectivas), son por este medio, abarcadas. Una modalidad preferida de una variante de la invención, es una derivada de una alfa-amilasa de B . licheniformis (como alfa-amilasa similar a Termamil precursora) , por ejemplo, una de aquellas referidas anteriormente, tales como alfa-amilasas de B . licheniformis que tienen la secuencia de aminoácido mostrada en la SEC ID NO: 4. Construcción de variantes de la invención La construcción de la variante de interés puede ser realizada cultivando un microorganismo que comprende una secuencia de ADN que codifica la variante bajo condiciones las cuales son conducivas para producir la variante. La variante puede entonces, ser subsecuentemente recuperada del caldo de cultivo resultante. Esta se describe en detalle adicional posteriormente.

Propiedades alteradas Lo siguiente discute la relación entre mutaciones, las cuales pueden estar presentes en las variantes de la invención, y alteraciones deseables en propiedades (con relación a aquellas de una alfa-amilasa similar a Termamil precursora), la cual puede resultar de ahí. En el primer aspecto, la invención se refiere a una variante de una alfa-amilasa similar a Termamil precursora, que tiene actividad alfa-amilasa precursora y que comprende la sustitución R437W, en donde la posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácido de la alfa-amilasa similar a Termamil precursora, que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO : 4. En el proceso de licuefacción de almidón como en otros procesos en donde las alfa-amilasas están involucradas, es benéfico para incrementar la afinidad de almidón de las alfa-amilasas y con ello, disminuir por ejemplo, la hidrólisis de almidón puro (RSH) . Los presentes inventores han encontrado que introduciendo un residuo de triptofano en el dominio C-terminal de una alfa-amilasa que tiene solamente uno de los dos triptofanos y con ello, creando un par de triptofanos, se forma un sitio de enlace putativo de almidón, el cual se encuentra por tener un papel principal en la adsorción al almidón y de este modo, es crítico para la alta relación de conversión de almidón. Se debe enfatizar que no solamente las alfa-amilasas similares a Termamil mencionadas específicamente posteriormente pueden ser usadas. También, pueden ser usadas otras alfa-amilasas similares a Termamil comerciales. Una lista no exhaustiva de tales alfa-amilasas es la siguiente: Alfa-amilasas producidas por la cepa de B. licheniformis descritas en el documento EP 0252666 (ATCC 27811) , y las alfa-amilasas identificadas en el documento WO 91/00353, y WO 94/18314. Otras alfa-amilasas de B . licheniformis similares a Termamil comerciales son, Optitherm™ y Takatherm™ (disponible de Solvay) , Maxamyl™ (disponible de Gist-brocades/Genencor) , Spezym AA™, Spezyme Delta AA™ (disponible de Genencor) , y Keistase™ (disponible de Daiwa) . Sin embargo, solamente las alfa-amilasa similares a Termamil las cuales no tienen dos residuos de triptofano en el C-terminal, pueden adecuadamente, ser usadas como estructura para preparar variantes de la invención. En una modalidad preferida de la invención, la alfa-amilasa similar a Termamil es una alfa-amilasa de la SEC ID NO: 4, ó SEC ID NO: 6 o una variante de la misma. En una modalidad particular, la variante comprende una o más de las siguientes mutaciones adicionales: R176*, G177*, N190F, E469N, más particular R176*+G177*+N190F, aún más particular R176*+G177*+N190F+E469N (usando la numeración en la SEC ID NO: 6) . En otra modalidad preferida de la invención, la alfa-amilasa similar a Termamil precursora, es una alfa-amilasa híbrida de la SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 6. Específicamente, la alfa-amilasa similar a Termamil precursora, puede ser una alfa-amilasa híbrida que comprende 445 residuos de aminoácido C-terminal de la alfa-amilasa de B . licheniformis mostrada en la SEC ID NO : 4 y 37 residuos de aminoácidos N-terminales de la alfa-amilasa madura derivada de B . amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO : 6 , la cual puede adecuadamente, tener las siguientes mutaciones: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando la numeración en la SEC ID NO: 4) . Este híbrido es referido como LE174. El híbrido LE174 puede ser combinado con una mutación adicional 1201F para formar una alfa-amilasa similar a Termamil híbrida precursora que tiene las siguientes mutaciones: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F (usando la SEC ID NO: 4 para la numeración) . Esta variante híbrida se muestra en la SEC ID NO: 2 y se usa en los ejemplos siguientes, y es referida como LEA429. Cuando se usa LE429 (mostrada en la SEC ID NO: 2) como la estructura (es decir, como la alfa-amilasa similar a Termamil precursora) , combinando LE174 con la mutación 1207F (numeración de SEC ID NO:4), las mutaciones/alteraciones, en particular, sustituciones, supresiones e inserciones, pueden hacerse de conformidad con la invención en una o más de las siguientes posiciones: R176*, G177*, E469N (usando la numeración en la SEC ID NO: 6). En una modalidad particular, la variante comprende la mutación adicional: E469N (usando la numeración en la SEC ID NO: 6). En una modalidad aún más particular, la variante comprende la mutación adicional: R176*+G177*+E469N (usando la numeración en la SEC ID NO: 6) .

Mutaciones generales en variantes de la invención Puede ser preferido que una variante de la invención comprenda una o más modificaciones además de aquellas resumidas anteriormente. Métodos para preparar variantes de alfa-amilasa Se conocen en la técnica, varios métodos para introducir mutaciones en los genes. Después de una breve discusión de la clonación de secuencias de ADN que codifican alfa-amilasas, se discutirán métodos para generar mutaciones en sitios específicos dentro de la secuencia que codifica a alfa-amilasa. Clonación de una secuencia de ADN que codifica una alfa-amilasa La secuencia de ADN que codifica una alfa-amilasa precursora, puede ser aislada a partir de cualquier célula o microorganismo que produce la alfa-amilasa en cuestión, usando varios métodos bien conocidos en la técnica. Primero, un ADN genómico y/o biblioteca de ADNc, debe ser construida usando ADN cromosomal o ARN mensajero a partir del organismo que produce la alfa-amilasa a ser estudiada. Después, si la secuencia de aminoácido de la alfa-amilasa se conoce, pueden ser sintetizadas sondas oligonucleótidas etiquetadas, homologas, y usadas para identificar las alfa-amilasas que codifican clones de una biblioteca genómica preparada a partir del organismo en cuestión. Alternativamente, una sonda de oligonucleótido etiquetada que contiene secuencias homologas a un gen alfa-amilasa conocido, podría ser usada como una sonda para identificar clones que codifican alfa-amilasa, usando condiciones de hibridización y lavado de rigurosidad más baja. Aún otro método para identificar genes que codifican alfa-amilasa, podría involucrar insertar fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformar bacterias alfa-amilasa negativas con la biblioteca de ADN genómico resultante, y después, plaquear la bacteria transformada sobre agar que contiene un sustrato para alfa-amilasa, con ello, permitiendo a los clones expresar la alfa-amilasa a ser identificada. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la enzima puede ser preparada sintéticamente, por métodos estándares establecidos, por ejemplo, el método de fosforamidita descrito por S. L. Beaucage and M. H. Cauthers (1981) o el método descrito por Matthes et al. (1984) . En el ' método de fosforamidita, son sintetizados oligonucleótidos, por ejemplo, en un sintetizador automático de ADN, purificados, templados, ligados y clonados en vectores apropiados . Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen genómico y sintético combinado, origen ADNc y sintético combinado o de origen de ADN c y genómico combinado, preparado por fragmentos ligantes de origen de ADNc o genómico, sintético (como sea apropiado, los fragmentos que corresponden a varias partes de la secuencia de ADN completa), de conformidad con técnicas estándares. La secuencia de ADN puede también ser preparada por reacción en cadena de la polimerasa (RCP) , usando cebadores específicos, por ejemplo, como se describe en el documento US 4,683,202 o R. K. Saiki et al. (1988). Mutagénesis dirigida al sitio Una vez que se ha aislado una secuencia de ADN que codifica a alfa-amilasa, y se han identificado sitios deseables para mutación, se pueden introducir mutaciones usando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados; los nucleótidos mutantes son insertados durante la síntesis de oligonucleótido. En un método específico, un gap de hebra única de ADN, que puentea la secuencia que codifica a alfa-amilasa, es creado en un vector que lleva el gen alfa-amilasa. Entonces, el nucleótido sintético, que porta la mutación deseada, es templado a una porción homologa del ADN de hebra única. El gap restante es entonces llenado con una polimerasa I de ADN (fragmento Klenow) y el constructo es ligado usando ligasa T4. Un ejemplo específico de este método se describe en Morinaga et al. (1984). El documento US 4,760,025 describe la introducción de oligonucleótidos que codifican mutaciones múltiples realizando alteraciones menores del cásete. Sin embargo, una variedad aún mayor de mutaciones, se puede introducir en cualquier ocasión por el método Morinaga, debido a una multitud de oligonucleótidos de longitudes varias, se pueden introducir. Otro método para introducir mutaciones en la secuencia de ADN que codifica alfa amilasa, es descrito en Nelson and Long (1989) . Involucra la generación en 3 etapas de un fragmento de RCP que contiene la mutación deseada producida usando una hebra de ADN químicamente sintetizada como uno de los cebadores en las reacciones de RCP. Del fragmento generado por RCP, un fragmento de ADN que lleva la mutación puede ser aislado, desdoblado por endonucleasas de restricción y reinsertado en un plásmido de expresión.

Mutagénesis Aleatoria La mutagénesis aleatoria es adecuadamente realizada ya sea como mutagénesis aleatoria específica de la región o localizada en al menos, tres partes del gen de traducción en la secuencia de aminoácido mostrada en cuestión, o dentro del gen completo. La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN que codifica una alfa-amilasa precursora, puede ser convenientemente realizada por el uso de cualquier método conocido en la técnica. Con relación a lo anterior, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método para generar una variante de una alfa-amilasa precursora, por ejemplo, en donde la variante exhibe una afinidad alterada con relación al precursor, el método comprende: (a) someter una secuencia de ADN que codifica la alfa-amilasa precursora a mutagénesis aleatoria, (b) expresar la secuencia de ADN mutada obtenida en la etapa (a) en una célula hospedera, y (c) seleccionar células hospederas que expresan una variante de alfa-amilasa la cual tiene una afinidad alterada de almidón con relación a la alfa-amilasa precursora. La etapa (a) del método anterior de la invención, es preferiblemente realizada usando cebadores dopados. Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria puede ser realizada por el uso de un agente mutagenizante químico o físico adecuado, por el uso de un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de ADN a mutagénesis generada por RCP. Además, la mutagénesis aleatoria puede ser realizada por el uso de cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes . El agente mutagenizante puede, por ejemplo, ser uno el cual induce transiciones, transversiones, inversiones, combinaciones, supresiones y/o inserciones. Ejemplos de un agente mutagenizante químico o físico adecuado para el presente propósito incluyen, irradiación ultravioleta (UV) , N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) , O-metilhidroxilamina, ácido nitroso, etilmetansulfonato (EMS) , bisulfito de sodio, ácido fórmico y análogos de nucleótidos. CUando se usan tales agentes, la mutagénesis es típicamente realizada incubando la secuencia de ADN que codifica la enzima precursora a ser mutagenizada en la presencia del agente mutagenizante o elección bajo condiciones adecuadas para que tome lugar la mutagénesis, y seleccionar el ADN mutado que tenga las propiedades deseadas. Cuando se realiza mutagénesis por el uso de un oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser dopado o fortalecido con los tres nucleótidos no precursores durante la síntesis de los oligonucleótidos en las posiciones, las cuales son cambiadas. El dopado o fortalecimiento se puede hacer de manera que los codones para aminoácidos indeseados se eviten. El dopado o fortalecimiento de oligonucleótidos se puede incorporar en el ADN que codifica la enzima alfa-amilasa por cualquier técnica publicada, usando, por ejemplo, RCP, LCR o cualquier polimerasa de ADN y ligada como se considere apropiado. Preferiblemente, el dopado es llevado a cabo usando "dopado aleatorio constante", en el cual, el porcentaje de mutación y tipo natural en cada posición es predefinido. Además, el dopado puede ser dirigido hacia una preferencia por la introducción de ciertos nucleótidos, y con ello, una preferencia para la introducción de uno o más residuos de aminoácido específicos. El dopado se puede hacer, por ejemplo, para permitir la introducción de 90% de tipo natural y 10% de mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la elección de un esquema de dopado se basa en la genética, así como también de restricciones estructurales de la proteína. El esquema de dopado puede ser elaborado usando el programa DOPE, el cual, entre otras cosas, asegura que se evite la introducción de codones de detención. Cuando se usa mutagénesis generada por PCR, ya sea un gen no tratado o tratado químicamente que codifica una alfa-amilasa precursora, es sometido a RCP bajo condiciones que incrementan la incorporación mis de nucleótidos (Deshler 1992; Leung et al., Tecnhique, Vol. 1, 1989, pp. 11-15). Se puede usar una cepa mutadora de E. coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp . 179-191), S. cereviseae o cualquier otro microorganismo microbiano, para la mutagénesis aleatoria del ADN que codifica la alfa-amilasa por ejemplo, transformando un plásmido que contiene la glicosilasa precursora en la cepa mutadora, haciendo crecer la cepa mutadora con el plásmido y aislando el plásmido mutado de la cepa mutadora . El plásmido mutado puede ser subsecuentemente transformado en el organismo de expresión. La secuencia de ADN a ser mutagenizada, puede estar convenientemente presente en una biblioteca de ADNc o genómica, preparada de un organismo que expresa la alfa-amilasa precursora. Alternativamente, la secuencia de ADN puede estar presente en un vector adecuado tal como un plásmido o bacteriófago, el cual como tal, puede ser incubado con o de otro modo, expuesto al agente mutagenizante. El ADN a ser mutagenizado, puede también estar presente en una célula hospedera ya sea siendo integrado en el genoma de dicha célula o estando presente en un vector albergado en la célula. Finalmente, el ADN a ser mutagenizado, puede estar en forma aislada. Se entenderá que la secuencia de ADN a ser sometida a mutagénesis aleatoria, es preferiblemente una secuencia de ADN genómico o ADNc. En algunos casos, puede ser conveniente amplificar la secuencia de ADN mutado antes de realizar la etapa de expresión b) o la etapa de selección c) . Tal amplificación puede ser realizada de conformidad con métodos conocidos en la técnica, el método actualmente preferido es la amplificación generada por RCP usando cebadores de oligonucleótidos preparados en base a la secuencia de aminoácido o ADN de la enzima precursora. Subsecuente a la incubación con o exposición al agente mutagenizante, el ADN mutado es expresado cultivando una célula hospedera adecuada que lleva la secuencia de ADN bajo condiciones que permiten que tome lugar la expresión. La célula hospedera usada para este propósito, puede ser una la cual ha sido transformada con la secuencia de ADN mutado, opcionalmente presente en un vector, o una en la cual se lleva la secuencia de ADN que codifica la enzima precursora durante el tratamiento de mutagénesis. Ejemplos de células hospederas adecuadas son los siguientes: bacterias gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis , Bacillus lentus, Bacillus jbrevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans , Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; y bacterias gram negativas tales como E. coli . La secuencia de ADN mutado puede además, comprende runa secuencia que codifica funciones que permiten la expresión de la secuencia de ADN mutado . Mutagénesis aleatoria localizada La mutagénesis aleatoria puede ser ventajosamente localizada en una parte de alfa-amilasa precursora en cuestión. Esto puede, por ejemplo, ser ventajoso cuando ciertas regiones de la enzima han sido identificadas por ser de importancia particular para una propiedad dada de la enzima, y cuando se esperan resultados modificados en una variante que tiene propiedades mejoradas. Tales regiones pueden normalmente, ser identificadas cuando la estructura terciaria de la enzima precursora ha sido elucidada y relacionada con la función de la enzima. La mutagénesis aleatoria, específica de la región o localizada, es convenientemente realizada por el uso de técnicas de mutagénesis generadas por RCP, como se describe anteriormente o cualquier otra técnica adecuada conocida en el arte. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la parte de la secuencia de ADN a ser modificada, puede ser aislada, por ejemplo, por inserción en un vector adecuado, y dicha parte puede ser subsecuentemente sometida a mutagénesis por el uso de cualquiera de los métodos de mutagénesis discutidos anteriormente. Métodos alternativos para proporcionar variantes de alfa-amilasa Los métodos alternativos para proporcionar variantes de la invención incluyen, método de intercambio de gen conocido en la técnica que incluye, métodos por ejemplo, descritos en el documento WO 95/22625 (de Affymax Technologies N. V.) y documento WO 96/00343 (de Novo Nordisk A/S) . Expresión de variantes alfa-amilasa De conformidad con la invención, una secuencia de ADN que codifica la variante producida por métodos descritos anteriormente, o por cualquier método alternativo conocido en la técnica, puede ser expresada en forma de enzima, usando un vector de expresión el cual, típicamente incluye secuencias de control que codifican un promotor, operador, sitio de enlace al ribosoma, señal de iniciación de traducción y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores. El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN que codifica una variante de alfa-amilasa de la invención, puede ser cualquier vector, el cual, puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinantes, y la elección del vector a menudo, dependerá de la célula hospedera en la cual es introducido. De este modo, el vector puede ser un vector autónomamente replicante, es decir, un vector el cual existe como una entidad extracromosomal, la replicación la cual es dependiente de la replicación cromosomal, por ejemplo, un plásmido, un bacteriófago, o un elemento extracromosomal, minicromosomas o un cromosoma artificial. Alternativamente, el vector puede ser uno el cual, cuando se introduce en una célula hospedera, es integrado en el genoma de la célula hospedera y replicado en conjunto con el (los) cromosoma (s) en los cuales ha sido integrado. En el vector, la secuencia de ADN debe ser operablemente conectada a un promotor adecuado. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN, el cual muestra actividad transcripcional en la célula hospedera de elección y puede ser derivado de genes que codifican proteínas ya sea homologas o heterólogas a la célula hospedera. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una variante de alfa-amilasa de la invención, especialmente en un hospedero bacteriano, son el promotor del operón lac de E. coli , promotores dagK del gen agarasa de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) , los promotores del gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus ( amyM.) , los promotores de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (¿amyQ) , los promotores de los genes Bacillus subtilis xylA y xylB, etc. Para transcripción en un hospedero fúngico, ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica a amilasa TAKA de A . oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei , alfa-amilasa neutral de A . niger, alfa-amilasa estable de ácido de A . niger, glu-coamilasa de A. niger, lipasa de Rhizomucor miehei , proteasa alcalina de A . oryzae, isomerasa fosfato triosa de A . oryzae o acetamidasa de A . nidulans . El vector de expresión de la invención, también puede comprender un terminador de transcripción adecuado y, en eucariotas, secuencias de póliadenilación operablemente conectadas a la secuencia de ADN que codifica la variante alfa-amilasa de la invención. Las secuencias de terminación y poliadenilación pueden ser adecuadamente derivadas de las mismas fuentes como el promotor. El vector puede además, comprender una secuencia de ADN que permite al vector, replicarse en la célula hospedera en cuestión. Ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de plásmidos pUC19, pACYC177, pUBllO, pE194, pAMBl y plJ702. El vector puede también comprender un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen el producto del cual complementa un defecto en la célula hospedera, tal como los genes dal de B . subtilis o B . licheniformis, o uno el cual confiere resistencia a antibiótico tal como resistencia a ampicilina, canamicina, cloramfenicol o tetraciclina. Además, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus, tales como amdS, argB, niaD y sC, un marcador que da origen a resistencia a hidromicina, o la selección se puede realizar por co-transfección por ejemplo, como se describe en el documento WO 91/17243. Mientras la expresión intracelular puede ser ventajosa en algunos sentidos, por ejemplo, cuando se usan ciertas bacterias como células hospedadoras, se prefiere en general, que la expresión sea extracelular. En general, las alfa-amilasas de Bacillus mencionadas en este documento, comprenden una pre-región que permite la secreción de la proteasa expresada en el medio de cultivo. Si es deseable, esta pre-región puede ser reemplazada por una pre-región o secuencia de señal diferente, convenientemente realizada por sustitución de las secuencias de ADN que codifican las pre-regiones respectivas. Los procedimientos usados para ligar el constructo de ADN de la invención que codifica una variante de alfa-amilasa, el promotor, terminador y otros elementos, respectivamente, e insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para replicación, son bien conocidos por personas expertas en la técnica (cotéjese, por ejemplo, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989). La célula de la invención, ya sea que comprende un constructo de ADN o un vector de expresión de la invención como se define anteriormente, es ventajosamente usado como una célula hospedera en la producción recombinante de una variante de alfa-amilasa de la invención. La célula puede ser transformada como el constructo de ADN de la invención que codifica la variante, convenientemente integrando el constructo de ADN (en una o más copias) , en el cromosoma del hospedero. Esta integración es en general, considerada por ser una ventaja conforme la secuencia de ADN es más probablemente establemente mantenida en la célula. La integración de constructos de ADN en el cromosoma hospedero, puede ser realizado de conformidad con métodos convencionales, por ejemplo, por recombinación homologa u heterologa. Alternativamente, la célula puede ser transformada con un vector de expresión como se describe anteriormente en conjunto con los diferentes tipos de células hospederas . La célula de la invención puede ser una célula de un organismo superior tal como un mamífero o un insecto, pero es preferiblemente una célula microbiana, por ejemplo, una célula fúngica (que incluye levadura) o bacteriana. Ejemplos de bacterias adecuadas son bacterias gram positiva, tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus , Bacillus alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis o Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; o bacterias gram negativas tales como E . coli . La transformación de la bacteria puede, por ejemplo, ser efectuada por transformación de protoplasto o usando células competentes en una manera conocida por se. El organismo de levadura puede ser favorablemente seleccionado de una especie de Saccharomyces o Schizosaccharomyces, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae . El hongo filamentoso puede ventajosamente, pertenecer a especies de Aspergillus , por ejemplo, Aspergillus oryzae o Aspergillus niger. Las células fúngicas pueden ser transformadas por un proceso que involucra formación de protoplasto y transformación de los protoplastos seguida por regeneración de la pared celular en una manera conocida por se. Un procedimiento adecuado para transformación de células hospederas Aspergillus se describe en el documento EP 238 023. En aún un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para producir una variante alfa-amilasa de la invención, en el cual, el método comprende cultivar una célula hospedera como se describe anteriormente bajo condiciones conductivas a la producción de la variante y recuperación de la variante a partir de las células y/o medio de cultivo. El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer la célula hospedera en cuestión y obtener expresión de la variante alfa-amilasa de la invención. Los medios adecuados son disponibles de proveedores comerciales o pueden ser preparados de conformidad con las recetas publicadas (por ejemplo, como se describe en los catálogos del American Type Culture Colection) . La variante alfa-amilasa secretada de las células hospederas, puede ser convenientemente recuperada del medio de cultivo por procedimientos bien conocidos, que incluyen, separación de las células a partir del medio por centrifugación o filtración, y precipitación de componentes proteináceos del medio, por medio de una sal tal como sulfato de amonio, seguido por el uso de procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similares. APLICACIONES INDUSTRIALES Las variantes alfa-amilasa de esta invención, poseen propiedades valiosas que permiten una variedad de aplicaciones industriales. En particular, las variantes de enzima de la invención, son aplicables como un componente en composiciones detergentes limpiadoras de superficies duras y lavado de platos, para el lavado. Las variantes de la invención con propiedades alteradas, pueden ser usadas para procesos de almidón, en particular, conversión de almidón, especialmente licuefacción de almidón (véase por ejemplo, documento US 3,912,590, solicitud de patentes EP Nos. 252 730 y 63 909, WO 99/19467, y WO 96/28567, todas las referencias se incorporan en este documento por referencia) . También se contemplan composiciones para propósitos de conversión de almidón, las cuales pueden además de la variante de la invención, también comprender una glucoamilasa, pululanasa y otras alfa-amilasas . Además, las variantes de la invención también son particularmente empleadas en la producción de endulzantes y etanol (véase por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,231,017, con ello incorporadas por referencia), tales como combustible, etanol industrial y para bebidas, de almidón o granos completos. Variantes de la invención pueden también ser empleadas para desencolado de textiles, telas y prendas de vestir (véase por ejemplo, documentos WO 95/21247, Patente Estadounidense 4,643,736, EP 119,920, con ello incorporados por referencia), elaboración de bebidas, preparación de cervezas, en producción de pulpa o papel, y en la producción de alimentos y productos alimenticios. Conversión de Almidón Los procesos convencionales de conversión de almidón, tales como procesos de licuefacción y sacarificación, se describen por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses No. 3,912,590, y publicaciones de patentes EP Nos. 252,730, y 63,909 con ello, incorporados por referencia. En una modalidad, el proceso de conversión que degrada el almidón a componentes de carbohidratos de peso molecular inferior, tales como azúcares o reemplazadores de grasas, incluyen' una etapa de desramificación.

Conversión de almidón a azúcar En el caso de convertir almidón en un azúcar, el azúcar es despolimerizado. Tal proceso de despolimerización consiste de una etapa de pre-tratamiento y dos o tres etapas de procesos consecutivos, viz. un proceso de licuefacción, un proceso de sacarificación y dependiente del producto terminal deseado opcionalmente un proceso de isomerización. Pre-tratamiento de almidón natural El almidón natural consiste de granulos microscópicos, los cuales son insolubles en agua a temperatura ambiente. Cuando se calienta una suspensión acuosa de almidón, el granulo se expande y eventualmente estalla, dispersando las moléculas de almidón en la solución. Durante este proceso de "gelatinización", existe un incremento dramático en viscosidad. Como el nivel de los sólidos es 30-40%, en un proceso típicamente industrial, el almidón tiene que ser más aldelgazado "licuado" de manera que puede ser manipulado. Esta reducción en viscosidad es hoy día mayormente obtenida por degradación enzimática. Licuefacción Durante la etapa de licuefacción, el almidón de cadena larga es degradado en unidades más cortas lineales y ramificadas (maltodextrinas) por una alfa-amilasa. El proceso de licuefacción se lleva a cabo a 1105-110°C por 5 a 10 minutos, seguido por 1-2 horas a 95°C. El pH cae entre 5.5 y 6.2 para asegurar estabilidad de enzima óptima bajo estas condiciones, se agrega 1 mM de calcio (40 ppm de iones de calcio libre) . Después de este tratamiento, el almidón licuado tendrá un "equivalente de dextrosa" (DE) de 10-15. Sacarificación Después del proceso de licuefacción, las maltodextrinas son convertidas en dextrosa por adición de una glucoamilasa (por ejemplo, AMG) y una enzima de desramificación, tal como isoamilasa (Patente Estadounidense No. 4,335,208) o pululanasa (por ejemplo, Promozyme™) (Patente Estadounidense No. 4,560,651). Antes de esta etapa, el pH es reducido a un valor por debajo de 4.5, manteniendo la temperatura elevada (arriba de 95°C) , para inactivar la alfa-amilasa licueficante para reducir la formación de oligosacáridos cortos llamados "precursores de panosa", los cuales no pueden ser hidrolizados apropiadamente por la enzima de desramificación. La temperatura es disminuida a 60°C, y la enzima glucoamilasa y de desramificación son agregadas. El proceso de sacarificación procede por 24-72 horas. Normalmente, cuando se desnaturaliza la a-amilasa después de la etapa de licuefacción, aproximadamente 0.2-0.5% del producto de sacarificación es la 62-alfa-glucosilmaltosa trisacárida ramificada (panosa) , la cual no puede ser degradada por una pululanasa. Si la amilasa activa de la etapa de licuefacción está presente durante la sacarificación (es decir, sin densaturalización) , este nivel puede ser tan alto como 1-2%, el cual es altamente indeseable conforme disminuye el rendimiento de sacarificación significantemente. Isomerización Cuando el producto de azúcar final deseado es por ejemplo, jarabe de alta fructuosa, el jarabe de dextrosa puede ser convertido en fructuosa. Después del proceso de sacarificación, el pH es incrementado a un valor en el intervalo de 6-8, preferiblemente a pH 7.5, y el calcio es removido por intercambio iónico. El jarabe de dextrosa es entonces convertido en el jarabe de alta fructuosa usando, por ejemplo, una glucoseisomerasa inmovilizada (tal como Sweetzyme™IT) . Producción de Etanol En la producción de alcohol general (etanol) a partir del grano completo, puede ser separada en 4 etapas principales -Molido -Licuefacción -Sacarificación -Fermentación Molido El grano es molido para abrir la estructura y permitir procesamiento adicional. Se usan dos procesos molido en húmedo o seco. En el molido en seco, el grano kernel completo es molido y usado en la parte restante del proceso. El molido en húmedo proporciona una muy buena separación de germen y harina (granulos de almidón y proteína) y son con algunas excepciones, aplicados en ubicaciones en donde existe una producción paralela de jarabes. Licuefacción En el proceso de licuefacción, los granulos de almidón son solubilizados por hidrólisis a maltodextrinas principalmente de un DP superior de 4. La hidrólisis se puede llevar a cabo por tratamiento ácido o enzimáticamente por alfa-amilasa. Se usa hidrólisis acida en una base limitada. El material puro puede ser grano completo molido o una corriente lateral de procesamiento de almidón. La licuefacción enzimática se lleva a cabo típicamente como un proceso de suspensión caliente de tres etapas. La suspensión se calienta entre 60-95°C, preferiblemente 80-85°C, y se agrega(n) la(s) enzima(s). Entonces, la suspensión es cocinada a chorro entre 95-140°C, preferiblemente 105-125°C, enfriada a 60-95°C y se agrega (n) más enzima (s) para obtener la hidrólisis final. El proceso de licuefacción se lleva a cabo a pH 4.5-6.5, típicamente a un pH entre 5 y 6. El grano molido y licuado es también conocido como una mezcolanza.

Sacarificación Para producir azúcares moleculares bajos DP1-3, que pueden ser metabolizados por levaduras, la ato-dextrina de la licuefacción debe ser además hidrolizada. La hidrólisis se hace típicamente enzimáticamente por glucoamilasas, alternativamente las alfa-glucosidasas, o alfa-amilasas de ácido pueden ser usadas. Una etapa de sacarificación completa puede durar hasta 72 horas, sin embargo, es común solamente para hacer una pre-sacarificación de típicamente 40-90 minutos, y después sacarificación completa durante la fermentación (SSE) . La sacarificación es típicamente realizada a temperaturas desde 30-65°C, típicamente alrededor de 60°C, y a pH de 4.5. Fermentación Las levaduras típicamente de Saccharomyces spp. , se agregan a la mezcolanza y la fermentación está en curso por 24-96 horas, tal como típicamente 35-60 horas. La temperatura está entre 26-34°C, típicamente a aproximadamente 32°C, y el pH es de pH 3-6, preferiblemente aproximadamente pH 4-5. Se nota que el proceso más ampliamente usado es un proceso simultáneo de sacarificación y fermentación (SSF) , en donde no existe etapa de mantenimiento para la sacarificación, significando que la levadura y enzima se agregan juntas. Cuando se hace SSF, es común introducir una etapa de pre-sacarificación a una temperatura arriba de 50°C, solo antes de la fermentación. Destilación Después de la fermentación, la mezcolanza es destilada para extraer el etanol. El etanol obtenido de conformidad con el proceso de la invención puede ser usado como, por ejemplo, etanol para combustible; etanol para bebidas, es decir, de almas neutrales potables, o etanol industrial. Derivados Dejado de la fermentación está el grano, el cual es típicamente usado para alimentación animal ya sea en forma líquida o seca. Detalles adicionales en como realizar la licuefacción, sacarificación, fermentación, destilación y recuperación de etanol, son bien conocidos por las personas expertas . De conformidad con el proceso de la invención, la sacarificación y fermentación se pueden llevar a cabo simultáneamente o separadamente. Producción de Pulpa y Papel La alfa-amilasa alcalina de la invención, puede también ser usada en la producción de materiales lignocelulósicos, tales como pulpa, papel y cartón, de desechos de papel y carbón reforzados con almidón, especialmente en donde ocurre la re-pulpación a pH arriba de 7 y en donde las amilasas facilitan la desintegración del material residual a través de la degradación del almidón reforzado. La alfa-amilasa de la invención es especialmente empleada en un proceso para producir una pulpa elaborada de papel de papel impreso revestido de almidón. El proceso puede además, ser realizado como se describe en el documento WO 95/14807, que comprende las etapas siguientes: a) desintegrar el papel para producir una pulpa, b) tratar con una enzima que degrada el almidón antes, durante o después de la etapa a) , y c) separar partículas de tinta de la pulpa después de las etapas a) y b) . Las alfa-amilasas de la invención, pueden también ser muy útiles en la modificación de almidón, en donde se usa el almidón enzimáticamente modificado en la elaboración de papel, junto con rellenadores alcalinos tales como carbonato de calcio, caolín y arcillas. Con las alfa-amilasas alcalinas de la invención, llega a ser posible modificar el almidón en la presencia del rellenador, permitiendo así un proceso integrado más simple. Desencolado de Textiles, Telas y Prendas de Vestir Una alfa-amilasa de la invención puede también ser muye útil en desencolado textil, de telas o prendas de vestir. En la industria de procesamiento textil, las alfa-amilasas son tradicionalmente usadas como auxiliares en el proceso de desencolado para facilitar la remoción del tamaño que contiene el almidón, el cual ha servido como un revestimiento protector en hilos de trama durante el tejido. La remoción completa del revestimiento de tamaño después del tejido es importante para asegurar los resultados óptimos en el proceso subsecuente, en los cuales, la tela es fregada, blanqueada y teñida. El rompimiento de almidón enzimático es preferido debido a que no involucra algún efecto peligroso en el material de fibra. Para reducir el procedimiento de costo e incrementar el rendimiento del molido, el procesamiento de desencolado es algunas veces combinado con las etapas de fregado y blanqueado. En tales casos, auxiliares no enzimáticos tales como agentes de oxidación o álcalis, son típicamente usados para romper el almidón, debido a que las alfa-amilasas tradicionales no son muy compatibles con niveles de pH elevados y agentes de blanqueo. El rompimiento no enzimático del tamaño del almidón conduce a algún daño de la fibra debido a los químicos preferentemente agresivos usados. Por consiguiente, podría ser deseable usar las alfa-amilasas de la invención conforme tengan un funcionamiento mejorado en soluciones alcalinas. Las alfa-amilasas pueden ser usadas solas o en combinación con una celulasa cuando se desencolan telas o textiles que contienen celulosa. Los procesos de desencolado y blanqueado son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, tales procesos se describen en los documentos WO 95/21247, Patente Estadounidense 4,643,736, EP 1119,920, con ello incorporado por referencia. Los productos comercialmente disponibles para desencolado incluyen, AQUAZYME® y AQUAZYME® ULTRA de Novozymes A/S. Elaboración de Cerveza Las alfa-amilasas de la invención pueden también ser muy empleadas en el proceso de elaboración de bebidas; las alfa-amilasas serán típicamente agregadas durante el proceso de mezcolanza. Composiciones Detergentes Las alfa-amilasas de la invención pueden ser agregadas a y de este modo, llegar a ser un componente de una composición detergente. La composición detergente de la invención puede por ejemplo, ser formulada como una composición detergente para lavandería a máquina o manual, que incluye, una composición aditiva para lavandería adecuada para pre-tratamiento de telas teñidas y una composición suavizante de telas agregada al enjuague, o ser formulada como una composición detergente para uso en operaciones de limpieza de superficies duras para el hogar en general, o ser formuladas para operaciones de lavado de platos a máquina o manual . En un aspecto específico, la invención proporciona una composición aditiva detergente que comprende la enzima de la invención. El aditivo de detergente así como también la composición detergente, puede comprender una o más de otras enzimas tales como proteasa, lipasa, peroxidasa, otras enzimas amilolíticas, por ejemplo, otras alfa-amilasas, glucoamilasa, amilasa maltogénica, CGTasa y/o una celulasa, mananasa (tal como MANNAWAY™ de Novozymes, Alemania) , pectinasa, pectina liasa, cutinasa y/o lacasa. En general, las propiedades de la(s) enzima (s) de elección deben ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la(s) enzima(s) deben estar presentes en cantidades efectivas. Proteasas: Las proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. El origen microbiano es preferido. Los mutantes diseñados por ingeniería de proteínas o químicamente modificados, están incluidos. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metalo proteasa, preferiblemente, una proteasa microbiana alcalina, o una proteasa similar a tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de Bacillus, por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en el documento Wo 89/06279) y la proteasa Furasium descrita en el documento WO 89/06270 y WO 94/25583. Ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en el documento WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/34946, especialmente las variantes con las sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274. Las enzimas proteasas comercialmente disponibles preferidas incluyen, ALCALASE®, SAVI-NASE®, PRIMASE®, DURALASE®, ESPERASE®, y KANNASE® (de Novozymes A/S), MAXATASE®, MAXACAL, MAXAPEM®, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT OXP®, FN2®, FN3®, FN4® (Genencor International Inc) . Lipasas: Las lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Están incluidos mutantes diseñados por ingeniería de proteína o químicamente modificados. Ejemplos de lipasas útiles incluyen, lipasas de Humicola (sinónimo Thermomyces) , por ejemplo, de H. lanuginosa ( T. lanuginosus) como se describe en los documentos EP 258 068 y EP 305 216 o de H. insolens como se describe en el documento WO 96/13580, una lipasa de Psudomonas , por ejemplo, de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB, 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp . , cepa SD 705 (WO 95%06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus por ejemplo, de B. subtilis (Dartois et al., (1983), Bichema et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B . stearothermophillus (JP 64/744992) o B . pumilus (WO 91/16422). Otros ejemplos son variantes de lipasa tal como aquellas descritas en los documentos WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202. Las enzimas lipasa comercialmente disponibles preferidas incluyen LIPOLASA™ y LIPOLASE ULTRA™ (Novozymes A/S) . Amilasas: Las amilasas adecuadas (alfa y/o beta), incluyen aquellas de origen fúngico o bacteriano. Están incluidos los mutantes diseñados por ingeniería de la proteína o químicamente modificados. Las amilasas incluyen, por ejemplo, alfa-amilasas obtenidas de Bacillus, por ejemplo, una cepa especial de B . licheniformis , descrita en más detalle en el documento GB 1,296,839. Ejemplos de alfa-amilasas útiles, son las variantes descritas en los documentos WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, y 444. Las alfa-amilasas comercialmente disponibles son DURAMYL™, LIQUEZYME™ TERMA-MYL™, NATALASE™, SUPRAMYL™, STAINZYME™, FUNGAMYL™ y BA?™ (?ovozymes A/S) , RAPIDASE™, PURASTAR™ y PURASTAR OXAM™ (de Genencor International Inc.). Celulasas: Las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriana o fúngica. Se incluyen mutantes diseñados por ingeniería de proteína o químicamente modificados. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas del género Bacillus , Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas de Humicola insulens, Myceliophtora thermophila y Fusarium oxysporum, descritos en los documentos US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y WO 89/09259. Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutrales que tienen beneficios de cuidado de color. Ejemplos de celulasas son celulasas descritas en los documentos EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasas tales como aquellos descritos en los documentos WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299. Las celulasas comercialmente disponibles incluyen CELLUZYME®, y CAREZYME® (?ovozymes A/S) , CLAZI?ASE®, y PURADAX HA® (Genencor International Inc.), y KAC-500(B)® (Kao Corporation) . Peroxidasas/Oxidasas : Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen de planta, bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes diseñados por ingeniería de proteína o químicamente modificadas. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas a partir de Coprinus, por ejemplo, de C. ninereus y variantes de las mismas, como aquellas descritas en los documentos WO 93/24618, WO 95/10602, y WO 98/15257. Las peroxidasas comercialmente disponibles incluyen GUARDZYME® (Novozymes A/S) . La(s) enzima (s) detergente (s) pueden ser incluidas en una composición detergente agregando aditivos separados que contienen una o más enzimas, o agregando un aditivo combinado que comprende todas estas enzimas. Un aditivo detergente de la invención, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, pueden ser formulados, por ejemplo, granulado, un líquido, una suspensión, etc. Formulaciones aditivas detergentes preferidas son granulos, en particular, granulos sin polvo, líquidos, en particular, líquidos o suspensiones estabilizadas. Se pueden producir granulados sin polvo, por ejemplo, como se describe en los documentos US 4,106,991 y 4,661,452 y pueden opcionalmente, ser revestidos por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de revestimiento ceroso son productos de poli (óxido de etileno) (polietilenglicol, PEG) con pesos moleares medios de 1000 hasta 20000; nonil-fenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los cuales, el alcohol contiene desde 12 hasta 20 átomos de carbono en los cuales, existen 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono y di y tri-glicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de revestimiento que forman películas adecuados para aplicación por técnicas de lecho fluido se dan en el documento GB 1483591. Preparaciones líquidas de enzima pueden, por ejemplo, ser estabilizadas agregando un poliol tal como propilenglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico, de conformidad con los métodos establecidos. Las enzimas protegidas pueden ser preparadas de conformidad con el método descrito en el documento EP 238,216. La composición detergente de la invención, puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una barra, una tableta, polvo, granulo, pasta o líquida. Un detergente líquido puede ser acuoso, típicamente conteniendo hasta 70% de agua y 0-30% de solvente orgánico o no acuoso. La composición detergente comprende uno o más tensioactivos, los cuales puede ser no iónicos, que incluyen zwiteriónico y/o catiónico y/o aniónico y/o semi-polar. Los tensioactivos son típicamente representados a un nivel de 0.1% hasta 60% en peso. Cuando se incluyen en este documento, el detergente usualmente contendrá de aproximadamente 1% hasta aproximadamente 40% de un tensioactivo aniónico tal como alquilbencensulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, alquil sulfato (sulfato de alcohol graso) , etoxisulfato de alcohol, alcansulfonato secundario, éster metílico del ácido alfa-sulfo graso, ácido alquil- o alquensuccínico o jabón. Cuando se incluye en este documento, el detergente usualmente contendrá de aproximadamente 0.2% hasta aproximadamente 40% de tensioactivo no iónico, tal como etoxilado de alcohol, etoxilado nonil-fenol, alquilpoli-glicósido, alquildimetilamino-óxido, monoetanol-amida del ácido graso etoxilado, monoetanolamida del ácido graso, amida del ácido graso polihidroxi alquilo o derivados de N-acil N-alquilo de glucosamina ( "glucamidas" ) . El detergente puede contener 0-65% de un agente que forma complejo o construye detergente tal como zeolita, difosfato, trifo-esfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilendiamintetraacético, ácido dietrilentri-aminpen-taacético, ácido alquil- o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos en capas (por ejemplo SKS-6 de Hoechst) . El detergente puede comprender uno o más polímeros. Ejemplos son carboximetilcelulosa, poli (vinil-pirrolidona) , poli (etilen glicol), poli (vinil alcohol), poli (vinilpiridin-N-óxido) , poli (vinilimidazol) , policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico y co- polímeros de ácido lauril metacrilato/acrílico. El detergente puede contener un sistema de blanqueo, el cual puede comprender una fuente H202, tal como perborato o percarbonato, el cual puede ser combinado con un activador de blanqueado que forma perácido, tal como tetraacetiletilendiamina o nonanoiloxibencensulfonato. Alternativamente, el sistema de blanqueo puede comprender peroxiácidos de, por ejemplo, tipo amida, imida o sufona. Las enzimas de la composición detergente de la invención, pueden ser estabilizadas usando agentes de estabilización convencionales, por ejemplo, un poliol tal como propilen glicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático, o un derivado de ácido fenil borónico, tal como ácido 4-formilfenil borónico, y la composición puede ser formulada como se describe en, por ejemplo, el documento WO 92/19709 y WO 92/19708. El detergente también puede contener otros ingredientes de detergente convencional, tal como por ejemplo, acondicionadores de tela, que incluyen arcilla, reforzador de espuma, supresores de espuma, agentes anti-corrosión, agentes que suspenden el suelo, agentes de redisposición anti-suelo, tintes, bactericidas, abrillantadores ópticos, hidrotopos, inhibidores de manchas o perfumes.

En la actualidad se contempla que en las composiciones de detergente cualquier enzima, en particular la enzima de la invención, se puede agregar en una cantidad que corresponde a 0.001-100 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado, preferiblemente 0.005-5 mg de proteína de enzima por litro o licor de lavado, más preferiblemente 0.01-1 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado y en particular 0.1-1 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado. La enzima de la invención, puede adicionalmente ser incorporada en el detergente para formulaciones descritas en WO 97/07202, las cuales se incorporan en este documento como referencia . Composiciones Detergentes para Lavadora de Platos La enzima de la invención puede también ser usada en composiciones de detergente para lavadora de platos, que incluyen lo siguiente: 1) COMPOSICIÓN EN POLVO PARA LAVADORA DE PLATOS AUTOMÁTICA 2) COMPOSICIÓN EN POLVO PARA LAVADORA DE PLATOS AUTOMÁTICA 3) COMPOSICIÓN EN POLVO PARA LAVADORA DE PLATOS AUTOMÁTICA 4) COMPOSICIÓN EN POLVO DE LAVADORA DE PLATOS AUTOMÁTICA 5) COMPOSICIÓN EN POLVO PARA LAVADORA DE PLATOS AUTOMÁTICA 6) COMPOSICIÓN EN POLVO Y LÍQUIDA PARA LAVADORA DE PLATOS CON SISTEMA DE TENSIOACTIVO DE LIMPIEZA 7) COMPOSICIÓN LÍQUIDA NO ACUOSA PARA LAVADORA DE PLATOS AUTOMÁTICA 8) COMPOSICIÓN LÍQUIDA NO ACUOSA PARA LAVADORA DE PLATOS 9) COMPOSICIÓN LÍQUIDA TIXOTRÓPICA PARA LAVADORA DE PLATOS AUTOMÁTICA 10) COMPOSICIÓN LÍQUIDA PARA LAVADORA DE PLATOS AUTOMÁTICA 11) COMPOSICIÓN LIQUIDA PARA LAVADORA DE PLATOS AUTOMÁTICA 12) Composiciones para lavadora de platos automática como se describen en 1), 2), 3), 4), 6) y 10), en donde se reemplaza perborato por percarbonato. 13) Composiciones para lavadora de platos automática como se describe en l)-6), las cuales adicionalmente contienen un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede, por ejemplo, ser uno de los compuestos descritos en "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, pp . 637-639. MATERIALES Y MÉTODOS Enzimas: LE174 variante alfa-amilasa hibrida: LE174 es una alfa-amilasa similar a Termamil híbrida siendo idéntica a la secuencia Termamil, es decir, la alfa-amilasa Baccillus licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4, excepto que los residuos aminoácido 35 N-terminal (de la proteína madura) se ha reemplazado por los residuos 33 N-terminal de BAN (proteína madura) , es decir, la alfa-amilasa Bacillus amyloliquefaciens en la SEC ID NO: 6, la cual además tiene las siguientes mutaciones : H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (SEC ID NO: 4) . LE429 variante alfa-amilasa hibrido: LE429 es una alfa-amilasa similar a Termamil híbrida siendo idéntica a la secuencia Termamil, es decir, la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4, excepto que los residuos amino ácido 35 de N-terminal (de la proteína madura) se ha reemplazado por los residuos 35 N-terminal de BAN (proteína madura) , es decir, la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en SEC ID NO: 6, la cual además tiene las siguientes mutaciones: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F (SEC ID NO: 4) . LE429 se muestra como SEC ID NO: 2 y se construyó por SOE-PCR (Higuchi et al. 1988, Nucleic Acids Research 16:7351). Glucoamilasa derivada de Aspergillus niger, que tiene la secuencia de aminoácido mostrada en WO00/04136 como SEC ID NO: 2 o una de las variantes descritas. Alfa-amilasa fúngico de ácido derivada de Aspergillus niger. Substrato: Se obtiene almidón de trigo (S-5127) de Sigma-Aldrich. Fermentación y purificación de variantes de alfa-amilasa Se mantiene una cepa de B . sub ti l i s que alberga el plásmido de expresión relevante en una placa LB-agar con 10 micron g/ml de canamicina de -80aC base, y se hace crecer durante la noche a 372C. Las colonias se transfieren a 100 ml del medio BPX suplementado con 10 micron g/ml de canamicina en un matraz de agitación de 500 ml . Composición de medio BPX: Almidón de papa 100 g/1 Harina de cebada 50 g/1 BAN 5000 SKB 0.1 g/1 Caseinato de sodio 10 g/1 Harina de grano de soya 20 g/1 Na2HP04, 12 H20 9 g/1 Pluronic TM 0.1 g/1 Los cultivos se agitaron a 37 SC a 270 rpm por 5 días . Se removieron las células y restos celulares del caldo de fermentación por centrifugación a 4500 rpm en 20-25 minutos. Después, los sobrenadante se filtró para obtener una solución completamente clara. Lo filtrado se concentró y se lavó en un filtro UF (membrana de corte 10000) y se cargó el amortiguador en 20 mM de acetato a pH 5.5. Lo filtrado UF se aplicó en un S-sefarosa F.F. y se llevó a cabo elución por etapa de alución con NaCl 0.2M en el mismo amortiguador. Lo eluido se dializó nuevamente en 10 mM de Tris, pH 9.0 y se aplicó en una Q-sefarosa F.F. y se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0-0.3M sobre volúmenes de 6 columnas. Se juntaron las fracciones que contienen la actividad (medición por el ensayo Phadebas) , se ajustó el pH a 7.5 y se removió el color restante por un tratamiento con carbón activo al 0.5% p/v por 5 minutos.

Determinación de Actividad (KNU) Se puede determinar la actividad amilótica usando almidón de para como sustrato. Este método se basa en el rompimiento de almidón de papa modificado por la enzima, y se siguió la reacción mezclando las muestras de la solución almidón/enzima con una solución de yoduro. Inicialmente, se formó el color azul negruzco, pero durante el rompimiento del almidón el color azul se pone más débil y gradualmente se torna en un roj izo-marrón, el cual se compara con un estándar vitreo coloreado. Se define una Unidad alfa amilasa Kilo Novo (KNU) como la cantidad de enzima, bajo condiciones estándar (es decir, a 37aC +/- 0.05; 0.0003 M Ca2+; y pH 5.6) dextrinizas 5.26 g de sustancia secad de almidón Merck Amylum solubile. Una carpeta AF 9/6 que describe este método analítico en más detalles, está disponible en solicitud para Novozymes A/S, Dinamarca, dicha carpeta se incluye por referencia en este documento. Actividad Glucoamilasa (AGU) Se define la Unidad Novo Glucoamilasa (AGU) como la cantidad de enzima, la cual hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto a 372C y pH 4.3. La actividad se determinó como AGU/ l por un método modificado después (AEL-SM-0131, disponibl en solicitud de Novozymes) usando el kit Glucosa GOD-Perid de Boehringer Mannheim, 124036. Estándar: AMG-estándar, lote 7-1195, 195 AGU/ml. Se incubó por 5 minutos, 375 microL de sustrato (maltosa 1% en 50 mM de acetato de sodio, pH 4.3) a 37aC. Se agregó 25 microL de enzima diluida en acetato de sodio. La reacción se detuvo después de 10 minutos agregando 100 microL 0.25 M de NaOH. Se transfirió 20 microL a una placa microtituladora de 96 cavidades y se agregó 200 microL de solución GOD-Perid (124036, Boehringer Mannheim). Después de 30 minutos a temperatura ambiente, se midió la absorbancia a 650 nm y se calculó la actividad en AGU/ml del estándar AMG. Una carpeta (AEL-SM-=131) que describe este método analítico en más detalle, está disponible en solicitud de Novozymes A/S, Dinamarca, dicha carpeta es incluida en este documento por referencia. Actividad alfa-amilasa de ácido (AFAU) Se puede medir la actividad alfa-amilada de ácido en AFAU (Unidades Alfa-amilasa del Ácido Fúngico) , las cuales se determinan relativas a un estándar de enzima. El estándar usado en AMG 300 1 (de Novozymes A/S, también se describe Aspergillus niger Gl de tipo natural de glucoamilasa, en Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102 y en el documento WO92/00381. La alfa-amilasa neutral es este AMG, baja después del almacenaje a temperatura ambiente por 3 semanas de aproximadamente. 1 FAU/ml debajo de 0.05 FAU/ml.

Se determinó la actividad alfa-amilasa del ácido en este estándar AMG de conformidad con la siguiente descripción. En este método, se define 1 AFAU como la cantidad de enzima, la cual degrada 5.26 mg de sólidos secos de almidón por una hora bajo condiciones estándar. El yodo forma un complejo azul con almidón, pero no con sus productos de degradación. La intensidad de color es por lo tanto directamente proporcional a la concentración de almidón. Se determinó la actividad de amilasa usando calorimetría inversa como una reducción en la concentración de almidón bajo condiciones analíticamente especificadas. Alfa-amilasa Almidón + yodo ¿ dextrinas + Oligosacáridos 40eC, pH 2.5 Azul/violeta t = 23 sec. Decoloración Condiciones estándar/condiciones de reacción: (por minuto) Sustrato: almidón, aproximadamente 0.17 g/1 Amortiguador : Citrato, aprox. 0.03 M Yodo (12) : 0.03 g/1 CaC12: 1.85 mM pH: 2.50-0.05 Temperatura de incubación: 40eC Tiempo de reacción: 23 segundos Longitud de onda: lambda=590 nm Concentración de enzima: 0.025 AFAU/ml Intervalo de funcionamiento de enzima 0.01-0.04 AFAU/ml En detalles adicionales, se prefieren estos que se pueden encontrar en EB-SM-0259.02/01 disponible en solicitud de Novozymes A/S, e incorporada por referencia. Determinación de perfil de azúcar y sólidos secos solubilizados Se determinó la composición de azúcar de los hidrolizados de almidón por CLAR y subsecuentemente se calculó el rendimiento de glucosa como DX. Se determinaron sólidos secos solubilizados (soluble) , aBRIX del almidón hidrolizado por medición de índice refractivo. Ensayo para Actividad Alfa-Amilasa Se determinó la actividad alfa-amilasa por un método que emplea tabletas Phadebas® como sustrato. Las tabletas Phadebas (Prueba de Amilasa Phadebas®, proporcionada por Pharmacia Diagnostic) contienen un polímero de almidón de color azul, insoluble reticulado, el cual se ha mezclado con albúmina suero de bovino y una sustancia amortiguada y formada en tableas . Para cada medición única, se suspendió una tableta en un tubo que contiene 5 ml de 50 mM de amortiguador Britton-Robinson (50 mM de ácido acético, 50 mM de ácido fosfórico, 50 M de ácido borónico, 0.1 mM de CaCl2, pH ajustado para el valor de interés con NaOH) . Se realizó la prueba en un baño de agua a la temperatura de interés . Se diluyó la alfa-amilasa para ser probada en x ml de 50 mM de amortiguador Britton-Robinson. Se agregó 1 ml de esta solución de alfa-amilasa a 5 ml de 50 mM de amortiguador Britton-Robinson. El almidón se hidrolizó por los fragmentos azules solubles dando alfa-amilasa. La absorbancia de la solución azul resultante, la medición expectrofotometrícamente a 620 nm, es una función de la actividad alfa-amilasa. Es importante que la medición 620 nm de absorbancia después de 10 ó 15 minutos de incubación (tiempo de prueba) es en el intervalo de 0.2 a 2.0 de unidades de absorbancia a 620 nm. En este rango de absorbancia hay linearidad entre actividad y absorbancia (ley Lambert-Beer) . La dilución de la enzima debe ser por lo tanto ajustada para fijar este criterio. Bajo una serie especificada de condiciones (temperatura, pH, tiempo de reacción, condiciones amortiguadas) 1 mg de un alfa-amilasa dada podrá hidrolizar una cierta cantidad de sustrato y se producirá un color azul. Se midió la intensidad de color a 620 nm. La absorbancia medida es directamente proporcional a la actividad específica (actividad/mg de proteína alfa-amilasa pura) del alfa-amilasa en cuestión bajo la serie de condiciones dadas.

Actividad Especifica Determinada Se determinó la actividad especifica usando el ensayo Phadebas (Pharmacia) como activación/mg de enzima. Medición del perfil de actividad de pH (estabilidad de pH) Se almacenó la variante en 20 mM de TRIS, pH 7.5, 0.1 mM de CaCl2 y se probó a 30aC, 50 mM de Britton-Robinson, 0.1 mM de CaCl2. Se midió la actividad de pH a pH 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 7.0, 8.0, 9.5, 9.5, 10 y 10.5, usando el ensayo Phadebas descrito anteriormente. EJEMPLOS Ejemplo 1 Construcción de variante LE429 de Termamil Se expresa Termamil (alfa-amilasa de SEC ID NO : 4 de B . licheniformis) en B . subtilis de un plásmido pDNl528 denotado. Este plásmido contiene el Termamil que codifica el gen completo, la expresión amyL de la cual se dirige por su propio promotor. Demás, el plásmido contiene el origen de replicación, ori , del plásmido pUBllO y el gen cat del plásmido pC194 que confiere resistencia hacia cloramfenicol. Se muestra pDNl528 en la fig. 9, del documento WO 96/23874. Se preparó un vector de metagénesis específico que contiene una parte mayor de la región codificante de la SEC ID NO : 3. Las características importantes de este vector, pJeENl denotado, incluye un origen de replicación derivado de los plásmidos pUC, el gen cat que confiere resistencia hacia cloranfenicol, y una versión que contiene una estructura del gel bla, el tipo silvestre del cual normalmente confiere resistencia hacia ampicilina (fenotipo ampR) . Esta versión mutada resulta en un fenotipo amps. Se muestra el plásmido pJeENl en la fig. 10, del documento WO 96/23874, y el origen E. coli de replicación, ori , bla, cat, la versión 5' truncada del gen Ternamil amilasa, y se indican sitios de restricción seleccionados en el plásmido. Se introducen mutaciones en amyL por el método descrito por Deng and Nickoloff (1992, Anal. Biochem. 200, pp. 81-88) excepto que el plásmido con el "cebador de selección" (cebador #6616; véase abajo) incorporado, se seleccionan en base al fenotipo ampR de las células E. coli tranformadas que alberga un plásmido con un gen bla reparado, el lugar de emplear la selección por digestión de enzima de restricción resumida por Deng and Nickoloff. Se obtienen químicos y enzimas usadas para la mutagénesis del kit de mutagénesis ChameleonO de Estragen (número de catálogo 200509) . Después de la verificación de la secuencia de ADN en plásmidos de variante, el gen truncado, que contiene la alteración deseada, se subclonó en pDN1528 como un fragmento Pstl -EcoRI y transformado en la cepa SHA273 de Bacillus subtilis de proteasa- y amilasa-reducida (descrito en W092/11357 y WO95/10603) para expresar el enzima variante.

La variante V54W de Termamilo se construyó por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrita 5' a 3' , izquierda a derecha) : PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC GCG TTG (SEC ID NO : 9) La variante A52W + V54W de Termamil se construyó por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrita 5' a 3', izquierda a derecha): PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CCA TTG GCT CG (SEC ID NO: 10) Cebador #6616 (escrito 5' a 3', izquierdo a derecho; P denota un fosfato 5 ' ) P CTG TGA CTG CTG AGT ACT CAÁ CCA AGT C (SEC ID NO : 11) Se construyó la variante V54E de Termamil por eluso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5 '-3', izquierda a derecha) : PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC TCA TCC GCT TG (SEC ID NO: 12) Se construyó la variante V54M de Termamil por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrita 5 '-3', izquierdo a derecho) : PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC ATA TCC GCT TG (SEC ID NO : 13) Se construyó la variante V54I de Termamil por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5 '-3', izquierda a derecha) : PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCA ATA TCC GCT TG (SEC ID NO: 14) Se construyeron las variantes Y290E y Y290K de Termamil por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5 '-3', izquierda a derecha): PGC AGC ATG GAA CTG CTY ATG AAG AGG CAC GTC AAA C (SEC ID NO: 15) Y representa una mezcla igual de C y T. Se verificó a presencia de un codón que codifica ya sea Glitamato o Lisina en posición 290 por secuenciamiento de ADN. Se construyó la variante N190F de Termamil por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5 '-3', izquierda a derecha) : PCA TAG TTG CCG AAT TCA TTG GAA ACT TCC C (SEC ID NO : 16) Se construyó la variante N188P+N190F de Termamil por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5'- 3', izquierda a derecha): PCA TAG TTG CCG AAT TCA GGG GAA ACT TCC CAÁ TC (SEC ID NO: 17) Se construyó la variante H140K+H142D de Termamil por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5'- 3', izquierda a derecha) : PCC GCG CCC CGG GAA ATC AAA TTT TGT CCA GGC TTT AAT TAG (SEC ID NO: 18) Se construyó la variante H156Y de Termamil por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5 '-3', izquierda a derecha) : PCA AAA TGG TAC CAÁ TAC CAC TTA AAA TCG CTG (SEC ID NO : 19) Se construyó la variante A181T de Termamil por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5 '-3', izquierda a derecha) : PCT TCC CAÁ TCC CAÁ GTC TTC CCT TGA AAC (SEC ID NO : 20) Se construyó la variante A209V de Termamil por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5 '-3', izquierda a derecha) : PCTT AAT TTC TGC TAC GAC GTC AGG ATG GTC ATA ATC (SEC ID NO: 21) Se construyó la variante Q264S de Termamil por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5 '-3', izquierda a derecha) : PCG CCC AAG TCA TTC GAC CAG TAC TCA GCT ACC GTA AAC (SEC ID NO: 22) Se construyó la variante S187D de Termamil por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5 '-3', izquierda a derecha) : PGC CGT TTT CAT TGT CGA CTT CCC AAT CCC (SEC ID NO : 23) Se construyó la variante DELTA (K370-G371-D372 ) de Termamil (es decir, supresión de residuos de aminoácido nos. 370, 371 y 372) por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5 '-3', izquierda a derecha): PGG AAT TTC GCG CTG ACT AGT CCC GTA CAT ATC CCC (SEC ID NO: 24) Se construyó la variante DELTA(D372-S373-Q374) de Termamil por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5 '-3', izquierda a derecha): PGG CAG GAA TTT CGC GAC CTT TCG TCC CGT ACÁ TAT C (SEC ID NO: 25) Se combinaron variantes A181T y A209V de Termamil a A181T+A209V digiriendo el plásmido similar a pDNl528 que contiene A181T (es decir, pDNl528 que contiene dentro de amyL la mutación resultante en la alteración de A181T) y el plásmido similar a pDN1528 que contiene A209V (es decir, pDNl528 que contiene dentro amyL la mutación resultante en la alteración A209V) con enzima Clal de restricción la cual corta los plásmidos similar a pDN1528 dos veces, resultando en un fragmento de 1116 pb y la parte del vector (es decir, contiene el origen de plásmido de replicación) de 3850 pb. Se purificaron el fragmento que contiene la mutación A209V y la parte del vector que contiene la mutación A181T por kit de extracción de gel QIAquick (adquirida de QUIAGEN) después de la separación en un gel de agarosa. Se ligaron el fragmento y el vector y se transformaron en la cepa Bacillus subtilis que suprime proteasa y amilasa referida anteriormente. Se analizaron el plásmido de amy+ (zonas de separación en las palcas de agar que contienen almidón) y se analizaron los transformantes resistentes a cloramfenicol, para determinar la presencia de ambas mutaciones en el plásmido. En una forma similar como se describe anteriormente, se combinaron H156Y y A209V, utilizando endonucleasas de restricción Acc651 y EcoRI, dando H156Y+A209V. Se combinaron H156Y +A209V y A181T+A209V en H156Y+ A181T+A209V, por el uso de endonucleasas de restricción Acc651 y HindIII. Los 35 residuos N-terminales de la parte madura de la variante H156Y+ A181T+A209V de Termamil, se sustituyeron por 33 residuos N-terminales de alfa-amilasa de B . amyloliquefaciens (SEC ID NO: 4) (en la cual, en el presente contexto es llamada BAN) , por un procedimiento SOE-RCP (Higuchi et al. 1988, Nucleic Acids Research 16:7351), como sigue: Cebador 19364 (secuencia 5'-3'): CCT CAT TCT GCA GCA GCA GCC GTA AAT GGC ACG CTG (SEC ID NO : 26) Cebador 19362: CCA GAC GGC AGT AAT ACC GAT ATC CGA TAA ATG TTC CG (SEC ID NO: 27) Cebador 19363: CGG ATA TCG GTA TTA CTG CCG TCT GGA TTC (SEC ID NO: 28) Cebador C: CTC GTC CCA ATC GGT TCC GTC (SEC ID NO : 29) . Se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa RCP, estándar, usando la polimerasa termoestable Pwo de Boehringer Mannheim de conformidad con las instrucciones del fabricante y los ciclos de temperatura: 5 minutos a 95°C, 25 ciclos de (94°C por 30 segundos, 50°C por 45 segundos, 72°C por 1 minuto), 72°C por 10 minutos. Se amplificó un fragmento de aproximadamente 130 pb en una primera RCP denotada RCPl con cebadores 19364 y 19362 en un fragmento de ADn que contiene el gen que codifica la alfa-amilasa de B . amyloliquefaciens . Se amplificón un fragmento de aproximadamente 400 pb en otra RCP denotada como RCP2 con cebadores 19363 y 1C en la plantilla pDNl528. Se purificaron RCPl y RCP2 a partir de un gel de agarosa y se usaron como plantillas en RCP3 con cebadores 19364 y 1C, lo cual resultó en un fragmento de aproximadamente 520 pb. Este fragmento de este modo, contiene una parte del ADN que codifica al N-término de BAN fusionado a una parte del AD? que codifica Termamil del aminoácido 35. El fragmento de 520 pb se subclonó en un plásmido similar a pD?1528 (que contiene el gen que codifica la variante H156Y+ A181T+A209V de Termamil) por digestión con endonucleasas de restricción Pstl y Sacll, ligación y transformación de la cepa B . subtilis como se describe previamente. La secuencia de AD? entre los sitios de restricción Pstl y Sacll, se verificó por secuenciamiento de AD? en plásmidos extraídos de amy+ y transformantes resistentes a cloranfenicol. El constructo final que contiene el ?-término correcto de BAN y HA156Y+ A181T+A209V, se denotró BA(l-35)+ H156Y+ A181T+ A209V. Se combinó N190F con BAN(l-35) +H156Y+A181T+A209V proporcionando BAN (1-35)+ H156Y+A181T+N190F+A209V, llevando a cabo la mutagénesis como se describe anteriormente, excepto que la secuencia de amyL en pJeENI se sustituyó por la secuencia de ADN que codifica la variante de Termamil BAN(1-35)+ H156Y+ A181T+A209V Q264S. Se combinó BAN (1-35) +H156Y+A181T+A209V proporcionando BAN (1-35) +H156Y+A181T+A209V+Q264S llevando a cabo la mutagénesis como se describe anteriormente, excepto que la secuencia de amyL en pJeEN se sustituyó por la secuencia de ADN que codifica la variante de Termamil BAN(1-5)+ H156Y+ A181T+A209V. Se combinaron BAN( 1-35) +H156Y+A181T+A209V+Q264S y BAN(l-35)+Hl56Y+Al81T+Nl90F+A209V en BAN(1- 35)+Hl56Y+A18lT+N190F+A209V+Q264S utilizando endonucleasas de restricción BsaHI (se introdujo el sitio BsaHI cercano a la mutación A209V) y Pstl. Se combinó I201F con BAN(1-35)+Hl56Y+Al8lT+Nl90F+A209V+Q264S proporcionando BAN(1-35)+H156Y+A18lT+N190F+A209V+Q264S+l20lF (SEC ID NO: 2) llavando a cabo la mutagénesis como se describe anteriormente. Se usó el cebador de mutagénesis AM100, se introdujo la sustitución I201F y se removió simultáneamente un sitio de restricción Cía I, el cual facilita el punto de sujeción fácil de mutantes. Cebador AM100: 5 ' GATGTATGCCGACTTCGATTATGACC 3' (SEC ID NO: 30) . Ejemplo 2 Construcción de variantes alfa-amilasa similar a Termamil con una afinidad alterada al almidón Construcción de LE1153 (LE429+R437W) : El cebador vector CAAX37 que se enlaza en dirección 3' del gen amilasa y cebador mutagénico CAAX447, se usan para amplificar por RCP, un fragmento de ADN de aproximadamente 450 pb, a partir de un plásmido similar a pDN1528 (que alberga las mutaciones BAN (1-35 ) +H156Y+A181T+N190F+1201 F+A209V+Q264S en el gen que codifica la amilasa de la SEC ID NO : 4) . El fragmento de 450 pb es purificado de un gel de agarosa y se usa como un cebador Mega junto con el cebador IB en una segunda RCP realizada en la misma plantilla. El fragmento de aproximadamente 1800 pb resultante, es digerido con enzimas de restricción Pst 1 y AVr II y el fragmento de ADN de aproximadamente 1600 pb resultante, es purificado y ligado con el plásmido similar a pDNl528 digerido con las mismas enzimas. Las células SHA273 de Bacillus subtilis competentes (amilasa y proteasa bajas) , son transformadas con la ligación y los transformantes resistentes a Cloranfenilol son verificados por secuenciamiento de ADN para verificar la presencia de las mutaciones correctas en el plásmido. Cebador CAAX37: 5' CTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGC 3' (SEC ID NO: 31) Cebador IB: 5' CCGATTGCTGACGCTGTTATTTGC 3' (SEC ID NO : 32) Cebador CAAX447: 5' CCCGGTGGGGCAAAGTGGATGTATGTCGGCCGG 3' (SEC ID NO : 33) Construcción de LE1154: BAN/Termamil híbrido + H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S + [R437W+E469N] se lleva a cabo en una forma similar, excepto que se usan ambos cebadores mutagénicos CAAX447 y CAAX448. Cebador CAAX448: 5' CGGAAGGCTGGGGAAATTTTCACGTAAACGGC 3' (SEC ID NO : 34). Ejemplo 3 Construcción de variantes alfa-amilasa similares a BAN con afinidad alterada para almidón: (R176*+G177*) Se expresa BAN (alfa-amilasa de B. amyloliquefaciens SEC ID NO: 6) , en B. subtilis, de un plásmido similar al pDN1528 descrito en el Ejemplo 1. Este plásmido BAN, denotado pCA330-BAN, contiene el gen que codifica la parte madura de BAN, definida como aminoácido 1 a 483 en la SEC ID NO: 6, en sustitución por el gen que codifica la parte madura de alfa-amilasa de B. licheniformis, definida como aminoácido 1 a 483 en SEC ID NO: 4. La variante de la alfa-amilasa de B . amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO: 2, que comprende la supresión de dos aminoácidos de R176 y G177 y la substitución N190F (usando la numeración en la SEC ID NO: 6), tiene estabilidad mejorada comparada con la alfa-amilasa B . amyloliquefaciens de tipo nativa. Esta variante es la siguiente referida como una BAN-var003. Para mejorar la afinidad y la capacidad de hidrólisis del almidón de dicha variante alfa-amilasa, se lleva a cabo mutagénesis dirigida al sitio usando el método de cebador Mega como se describe por Sarkar and Sommer, 1990 (BioTechniques 8:404-407): Construcción de BE1001:BA? - var003 + R437W: El cebador vector CAAX37 que se enlaza en dirección 3' del gen amilasa y cebador mutagénico CABX437, se usan para amplificar por RCP, un fragmento de AD? de aproximadamente 450 pb, a partir de un plásmido pCA330-BA? (que alberga las mutaciones BAN-var003 en el gen que codifica la amilasa de la SEC ID ?O: 6) . El fragmento de 450 pb es purificado de un gel de agarosa y se usa como un cebador Mega jinto con el cebador 2B en una segunda RCP realizada en la misma plantilla. El fragmento de aproximadamente 1800 pb resultante, es digerido con enzimas de restricción Pst 1 y AVr II y el fragmento de ADn de aproximadamente 1600 pb resultante, es purificado y ligado con el plásmido similar a pCA330 digerido con las mismas enzimas. Las células SHA273 de Bacillus subtilis competentes (amilasa y proteasa bajas) , son transformadas con la ligación y los transformantes resistentes a Cloranfenilol son verificados por secuenciamiento de ADN para verificar la presencia de las mutaciones correctas en el plásmido. Cebador CABX437: 5' GGTGGGGCAAAGTGGATGTATGTCGGC 3' (SEC ID NO : 35) Construcción de BE1004: Amilasa BAN-var003 + [R437W+E469N] se lleva a cabo en una forma similar, excepto que se usan ambos cebadores mutagénicos CABX437 y CABX438. CABX438: 5' GGAAGGCTGGGGAAACTTTCACGTAAACG 3' (SEC ID NO : 36). Ejemplo 4 Termamil LC contra LE1153 y LE1154 Este ejemplo ilustra la conversión de almidón de trigo granular en glucosa usando una alfa-amilasa bacteriana de conformidad con la presente invención (LE1153 y LE1154) comparados con el Termamil LC . Se preparó una suspensión con sólidos secos al 33% (DS) de almidón granular, agregando 247.5 g de almidón de trigo bajo agitaciones a 502.5 ml de agua. El pH se ajustó con HCl a 4.5. La suspensión de almidón granular se distribuyó en matraces Erlenmeyer de 100 ml con 75 g de cada matraz. Los matraces se incubaron con agitación magnética en un baño maría a 60°C. A cero horas, las actividades de la enzima dadas en la tabla 1, se dosificaron en los matraces. Las muestras se retiraron después de 24, 48 y 73 y 94 horas. Tabla 1. Niveles de Actividad enzimática usados +/- sustituciones Glucoamilasa Alfa-amilasa de alfa-amilasa AGU/kg DS fúngica de ácido KNU/kg DS AFAU/kg DS 100.0 200 50 Se determinó el almidón de sólidos secos usando el siguiente método. El almidón se hidrolizó completamente agregando una cantidad en exceso de alfa-amilasa (300 KNU/kg de sólidos secos) y la muestra se colocó en un baño de aceite a 95°C por 45 minutos. Subsecuentemente, las muestras se enfriaron a 60°C y se agregó una cantidad en exceso de glucoamilasa (600 AGU/kg DS) seguida por incubación por 2 horas a 60°C. Los sólidos secos solubles en el hidrolizado de almidón, se determinaron por mediciones del índice refractivo en muestras después de filtrar a través de un filtro de 0.22 microM. Los perfiles de azúcar se determinaron por CLAR. La cantidad de glucosa se calculó como DX . Los resultados se muestran en la Tabla 2 y 3.

Tabla 2. Sólidos secos solubles como porcentaje de sustancia seca total a 100 KNU/kg DS de dosificación de alfa-amilasa Enzima 24 horas 48 horas 73 horas 94 horas Termami1 83.7 87 89.7 90.3 LC LE1153 88.3 91.2 93.2 94.6 LE1154 86.7 90.3 91.9 93.0 _Tabla 3. El DX del hidrolizado soluble a 100 KNU/kg DS dosificación de alfa-amilasa Enzima 24 horas 48 horas 73 horas 94 horas Termami1 72.0 82.0 83.8 83.8 LC LE1153 77.1 87.1 88.4 88.5 LE1154 74.0 86.6 87.8 87.8 Ejemplo 5 Variante BAN contra R437 Este ejemplo ilustra la conversión de almidón de trigo granular en glucosa, usando una alfa-amilasa bacteriana de conformidad con la presente invención, la variante BAN R437W comaprada con BAN WT. Se preparó una suspensión con sólidos secos al 33% (DS) de almidón granular, agregando 247.5 g de almidón de trigo bajo agitaciones a 502.5 ml de agua. El pH se ajustó con HCl a 4.5. La suspensión de almidón granular se distribuyó en matraces Erlenmeyer de 100 ml con 75 g de cada matraz. Los matraces se incubaron con agitación magnética en un baño maría a 60°C. A cero horas, las actividades de la enzima dadas en la tabla 1, se dosificaron en los matraces. Las muestras se retiraron después de 24, 48 y 73 y 94 horas. Tabla 1. Niveles de Actividad enzimática usados +/- sustituciones Glucoamilasa Alfa-amilasa de alfa-amilasa AGU/kg DS fúngica de ácido KNU/kg DS AFAU/kg DS 100.0 200 50 Se determinó el almidón de sólidos secos usando el siguiente método. El almidón se hidrolizó completamente agregando una cantidad en exceso de alfa-amilasa (300 KNU/kg de sólidos secos) y la muestra se colocó en un baño de aceite a 95°C por 45 minutos. Subsecuentemente, las muestras se enfriaron a 60°C y se agregó una cantidad en exceso de glucoamilasa (600 AGU/kg DS) seguida por incubación por 2 horas a 60°C. Los sólidos secos solubles en el hidrolizado de almidón, se determinaron por mediciones del índice refractivo en muestras después de filtrar a través de un filtro de 0.22 microM. Los perfiles de azúcar se determinaron por CLAR. La cantidad de glucosa se calculó como DX . Los resultados se muestran en la Tabla 4 y 5.

Tabla 4. Sólidos secos solubles como porcentaje de sustancia seca total a 100 KNU/kg DS de dosificación de alfa-amilasa Enzima 96 horas BAN WT 95.6 Variante 95.8 R437N Tabla 5. El DX del hidrolizado soluble a 100 KNU/kg DS de osificación de alfa-amilasa Enzima 96 horas BAN WT 92.38 Variante 92.52 R437N REFERENCIAS CITADAS Klein, C, et al., Biochemistry 1992, 31, 8740- 8746, Mizuno, H., et al., J. Mol. Biol. (1993) 234, 1282-1283, Chang, C, et al, J. Mol. Biol. (1993) 229, 235- 238, Larson, S.B., J. Mol. Biol. (1994) 235, 1560-1584, Lawson, C.L., J. Mol. Biol. (1994) 236, 590-600, Qian, M., et al., J. Mol. Biol. (1993) 231, 785- 799, Brady, R.L., et al., Acta Crystallogr. sect . B, 47, 527-535, Swift, HJ., et al., Acta Crystallogr . sect . B, 47, 535-544 A. Kadziola, Ph.D. Thesis: "An alpha-amylase from Barley and its Complex with a Substrate Analogue Inhibitor Studied by X-ray Crystallography" , Department of Chemistry University of Copenhagen 1993 MacGregor, E.A., Food Hydrocolloids, 1987, Vol. 1, No . 5-6 , p . B. Diderichsen and L. Christiansen, Cloning of a maltogenic amylase from Bacillus stearothermophilus , FEMS Microbiol, letters: 56: pp . 53-60 (1988) Hudson et al., Practical Immunology, Third edition (1989), Blackwell Scientific Publications, Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor, 1989 S.L. Beaucage and M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp . 1859-1869 Matthes et al., The EMBO J. 3, 1984, pp. 801-805. R.K. Saiki et al., Science 239, 1988, pp. 487-491. Morinaga et al., (1984, Biotechnology 2:646-639) Nelson and Long, Analytical Biochemistry 180, 1989, pp. 147-151 Hunkapiller et al., 1984, Nature 310:105-111 R. Higuchi, B. Krummel, and R.K. Saiki (1988) . A general method of in vi tro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucí . Acids Res . 16:7351-7367. Dubnau et al., 1971, J. Mol. Biol. 56, pp. 209- 221 Gryczan et al., 1978, J. Bacteriol. 134, pp . 318- 329 S.D. Erlich, 1977. Proc. Nati. Acad. Sci 74, pp. 1680-1682 Boel et al., 1990, Biochemistry 29, pp . 6244-6249. Sarkar and Sommer, 1990. BioTechnigues 8. pp. 404- 407. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (20)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones .

1. Variante de una alfa-amilasa similar a Termamil, que tiene actividad alfa-amilasa y comprende la sustitución R437W, caracterizada porque la posición corresponde a una posiicón de la secuencia de aminoácido de la alfa-amilasa precursora similar a Termamil que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO : 4.

2. Variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la alfa-amilasa precursora es una alfa-amilasa híbrida de la SEC ID NO : 4 y SEC ID NO : 6.

3. Variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque la alfa-amilasa precursora híbrida es una alfa-amilasa híbrida que comprende 445 residuos de aminoácidos C-terminales de la alfa-amilasa de B . licheniformis mostrada en la SEC ID NO : 4 , y 37 residuos de aminoácido N-terminal de la alfa-amilasa derivada de B . amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO: 6.

4. Variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la alfa-amilasa similar a Termamil híbrida precursora, además tiene las siguientes mutaciones H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando la numeración en la SEC ID NO: 4) o LE174.

5. Variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la alfa-amilasa similar a Termamil híbrida precursora, además tiene las siguientes mutaciones H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F (usando la numeración en la SEC ID NO: 4) o LE429.

6. Variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque comprende una o más de las siguientes mutaciones adicionales: R176*, G177*, E469N (usando la numeración en la SEC ID NO:6).

7. Variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque comprende la mutación adicional: E469N (usando la numeración en la SEC ID NO : 6 ) .

8. Variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque comprende la mutación adicional: R176*+G177*+E469N (usando la numeración en la SEC ID NO: 6) .

9. Variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la alfa-amilasa precursora es una alfa-amilasa de la SEC ID NO : 4 ó SEC ID NO : 6.

10. Variante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque comprende una o más de las siguientes mutaciones adicionales: R176*, G177*, N190F, E469N (usando la numeración en la SEC ID NO: 6).

11. Variante de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque comprende la mutación adicional: R176 *+G177 *+N190F (usando la numeración en la SEC ID NO : 6 ) .

12. Variante de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la variante comprende la mutación adicional: E469N (usando la numeración en la SEC ID NO : 6 ) .

13. Variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque la alfa-amilasa precursora similar a Termamil tiene una secuencia de aminoácido la cual tiene un grado de identidad a la SEC ID NO : 4 de al menos, 60%, preferiblemente 70%, más preferiblemente al menos 80%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, aún más preferiblemente al menos 95%, aún más preferiblemente al menos 97%, y aún más preferiblemente al menos 99%.

14. Constructo de ADN, caracterizado porque comprende una secuencia de ADN que codifica una variante alfa-amilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

15. Vector de expresión recombinante, caracterizado porque lleva un constructo de ADN de conformidad con la reivindicación 14.

16. Célula, caracterizada porque se transforma con un constructo de ADN de conformidad con la reivindicación 14, o un vector de conformidad con la reivindicación 15.

17. Célula de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque es un microorganismo, en particular, una bacteria o un hongo, tal como una bacteria gram positiva tal como Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis , Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus , Bacillus alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans , Bacillus circulans , Bacillus lautus o Bacillus thuringiensis .

18. Composición, caracterizada porque comprende una variante alfa-amilasa de conformidad con las reivindicaciones 1-13.

19. Método para producir una variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque una célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-17, es cultivada bajo condiciones conductivas a la producción de la variante, y la variante es subsecuentemente recuperada del cultivo.

20. Uso de una variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, o una composición de conformidad con la reivindicación 18 para la licuefacción de almidón; en composición detergente tal como, composiciones limpiadoras de superficies duras y de lavador de platos, y lavandería; producción de etanol, tal como producción de etanol industrial, para bebidas y combustible; desencolado de textiles, telas o prendas de vestir.