MX2007004524A - Polipeptido que tiene actividad de fitasa y secuencia nucleotida que lo codifica. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a una molecula de ADN recombinante que despues de la expresion en una celula anfitriona procariotica o eucariotica codifica a un polipeptido con actividad de fitasa, conteniendo la molecula de ADN recombinante una secuencia de ADN seleccionada de a) secuencias de ADN que se obtienen por medio de las variaciones de secuencias fitasa de E. coli tipo nativo, en la cual cuando menos uno de los aminoacidos en la zona de la posicion 189 a 211 y/o uno de los aminoacidos 137 a 152 estan mutado en comparacion con la secuencia tipo nativo, b) las secuencias de ADN, que poseen una homologia del 70 al 100% a las secuencias de ADN de acuerdo con a), c) secuencias de ADN que debido a una degeneracion del codigo genetico estan relacionadas con las secuencias de acuerdo con a) o b), en donde la molecula de ADN recombinante participa en la expresion en una celula anfitriona adecuada con una elevada actividad de la proteina asi codificada en la nata del cultivo, asi como la proteina codificada.

Description

POLIPEPTIDO QUE TIENE ACTIVIDAD DE FITASA Y SECUENCIA NUCLEÓTIDA QUE LO CODIFICA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que codifica a un polipéptido con actividad de fitasa asi como el polipéptido codificado como tal, en especial la invención se refiere a una molécula de ADN recombmante que codifica a un polipéptido con actividad de fitasa, en la cual la secuencia de ADN se obtiene por medio de una variación del tipo nativo maduro de fitasa de E . col i , en la cual están modificadas posiciones ammoácidas definidas en comparación a la secuencia del tipo nativo. La invención se refiere además a un método para la expresión de fitasas recombinantes así como su uso en la tecnología de los alimentos y forraj es . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El ácido fitimco o 1,2,3,4,5,6-hexakisdihidrofosfato de ioinositol (abreviado hexakisfosfato de mioinositol) es la fuente principal de inositol y la forma de almacenamien o primaria de fosfato en las semillas de las plantas. En las semillas de las leguminosas se encuentra aproximadamente el 70% del contenido de fosfato como mezcla de sales de potasio, magnesio y calcio del ácido fitimco. Las semillas, las gramíneas t las leguminosas son componentes importantes de las preparaciones alimenticias y forrajes, en especial de preparados para forrajes; pero también en la alimentación humana ha aumentado la importancia de los granos y las leguminosas . Las unidades de fosfato del ácido fitínico forman como complejos cationes bivalentes y trivalentes como iones metálicos, esto es iones importantes para la fisiología alimenticia como calcio, hierro, zinc y magnesio así como oligoele entos como manganeso, cobre y molibdeno. Además el ácido fitínico se enlaza también en un cierto grado a las proteinas por medio de una interacción electrostática. El ácido fitinico y sus sales, los fitatos, frecuentemente no son metabolizados ya que no son absorbidos en el tracto gastrointestinal, esto es no están fisiológicamente disponibles para la alimentación el fosforo en ellos contenidos ni los iones metálicos quelatizados, ni las proteínas enlazadas . Ya que el fósforo es un elemento esencial para el crecimiento de todos los organismos, los alimentos y forrajes deben ser suplementados con fosfato inorgánico. Muy frecuentemente deben también suplementarse iones fisiológicamente esenciales para la nutrición como hierro y calcio. Además se reduce el valor fisiológico alimenticio de cada dieta, ya que las proteínas se enlazan al ácido fitínico. Como consecuencia el ácido fitínico se considera como un factor anti-alimenticio. Además debido a la mala metabolización del ácido fitínico del fósforo del fitato se elimina a través del tracto gastrointestinal de los animales, lo que conduce a una indeseable contaminación con fosfatos del ambiente, lo que como consecuencia puede producir a eutroficación de los cuerpos de agua y a un crecimiento excesivo de las algas. El ácido fitínico o los fitatos (estas expresiones se utilizaran a continuación como sinónimos a menos que se diga otra cosa) pueden ser degradados por medio de fitasas. Las semillas vegetales que contienen ácido fítico contienen las enzimas fitasa endóngeas . Durante su ingestión los fitatos en los alimentos o forrajes teóricamente son hidrolizables por las fitasas endógenas de las plantas, por medio de las fitasas en la f] ora intestina y por medio de las fitasas en la mucosa intestinal. En la práctica sin embargo el potencial de hidrólisis de las fitasas vegetales endógenas y de las fitasas intestinales, si es que están presentes, no es para nada suficiente para garantizar una biodispombilidad suficiente. Por lo tanto frecuentemente se agregan fitasas exógenas a los alimentos y los forrajes. Las fitasas pueden se producidas por medio de plantas así como por microorganismos. Ba o microorganismos se conocen bacterias productoras de fitasas así como hongos y levaduras productores de fitasas . Los productores de fitasa de origen natural tienen sin embargo la desventaja de que las fitasas solo se producen en cantidades determinadas y con propiedades definidas. Como se menciona antes existe sin embargo una alta necesidad de fitasas en especial para la industria alimenticia y forrajera. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se propone por lo tanto la tarea de producir un polipeptido con actividad de fitasa, que pueda producirse de forma económica. En especial las fitasas deben producirse de forma económica. Las fitasas deben además conservar las propiedades esenciales de las fitasas naturales de E . col i tipo nativo, sin embargo deben caracterizarse por una mayor actividad en el efluente del cultivo o por una mejor capacidad de secreción. A las propiedades esenciales de las fitasas tipo nativo náfrales pertenecen en especial la capacidad de mejorar la disponibilidad de fosfato ín vivo e ín vitro, así como su adecuación como aditivos para hornear . La presente invención se propone además la tarea de producir un gen para un polipéptido con actividad de fitasa, el cual durante la expresión en una célula anfitriona tenga como consecuencia una mayor actividad de la proteína así codificada en la nata de cultivo o una mayor secreción del polipéptido. El polipeptido debe ser de producción económica y ventajosa. En especial debe la expresión del polipéptido debe conducir a altos rendimientos en microorganismos eucapontes en comparación con la expresión de la fitasa tipo nativo. Deben prepararse además las secuencias de ADN que codifican al polipéptido, las construcciones de ADN correspondientes y los vectores así como una fuente para la enzima recombmante, que sea adecuada para el uso para alimentos y forrajes y en procesos industriales y las composiciones de acuerdo con la invención que contengan la enzima. Ahora se encontró sorprendentemente que una mutación en la zona de los aminoácidos 189 a 211 inclusive y/o de los aminoácidos 137 a 152 inclusive de la fitasa tipo nativo de E . col i conduce a una mayor actividad en todo la nata de cultivo por medio de la proteína fitasa, sin perjudicar los efectos ventajosos y las propiedades esenciales de la fitasa de E . col a, del tipo nativo. Varias fitasas de E . col i se describen en la literatura, por ejemplo en Dassa et al., 1990, J. Bacteriol. 172:5497-5500 (acceso no. M58708) . Mutantes modificados genéticamente de fitasa de E . col i igualmente ya han sido descritas, que conducen a una mayor termoestabilidad y/o alta actividad específica (Rodríguez et al., 2000, Arch. Biochem. Biophys., 382:105-112, Lanahan et al., 2003, solicitud de patente norteamericana 2003 0157646 Al, WO 01/90333) . Una mutagénesis de fitasa de Escheri ch ia col con mejores propiedades enzimáticas se describe además en la WO 01/36607. El mutante Val-Tyr descrito en la posición 200 sin embargo no corresponde a la mutación en la posición 200 de acuerdo con la invención, ya que de acuerdo con la WO 01/36607 utiliza otra forma de numeración de la secuencia, esto es se incluyo en el conteo la secuencia líder. La posición 222 en la secuencia de acuerdo con este documento (WO 01/36607) corresponde así a la posición 2000 del conteo de acuerdo con la invención. Otras proteínas con actividad de fitasa se describen en WO 99/08539, WO 01/90333, WO 02/095003, WO 03/038035, WO 03/038111, WO 04/015084 y WO 00/71728. Además el documento de Garrett et al.; Applied Envión. Microbiol. 2004, 70(5), 3041-3046, describe mutantes de fitasa de E . col con mayor estabilidad térmica y gastrointestinal. Sin embargo el estado de la técnica no contiene ninguna descripción de mutaciones en la fitasa de E. coli, que conducen a una mayor producción de una enzima procariótica por medio de la expresión a través de un microorganismo eucarionte. Además el estado de la técnica no cont Lene indicaciones de cómo a través de una variación y en especial una mutación de la fitasa de E . col l , obtener una mayor actividad en la nata del cultivo por medio de la enzima así producida. En especial el estado de la técnica no contiene ninguna indicación sobre el significado funcional de las posiciones 189 a 211 y/o las posiciones 137 a 152 de la secuencia de fitasa de E . col i tipo nativo. Muy especialmente el estado de la técnica no contiene indicaciones sobre el significado funcional de la posición 200 de la secuencia de fitasa de E . col tipo nativo. Se resuelve esta tarea por medio de una molécula de ADN recombinante que después de la expresión en una célula anfitpona procariótica o eucariótica codifica a un polipéptido con actividad de fitasa, conteniendo la molécula de ADN recombmante una secuencia de ADN seleccionada de a) secuencias de ADN que se obtienen por medio de las variaciones de secuencias fitasa de E . col i tipo nativo, en la cual cuando menos uno de los aminoácidos en la zona de la posición 189 a 211 y/o uno de los aminoácidos 137 a 152 están mutado en comparación con la secuencia tipo nativo, b) las secuencias de ADN, que poseen una homología del 70 al 100% a las secuencias de ADN de acuerdo con a), c) secuencias de ADN que debido a una degeneración del código genético están relacionadas con las secuencias de acuerdo con a) o b) , en donde la molécula de ADN recombinante participa en la expresión en una célula anfitriona adecuada con una elevada actividad de la proteina así codificada en la nata del cultivo, así como por medio de un polipéptido, que presenta actividad de fitasa y que es codificado por una de las moléculas de ADN recombinante mencionada. La invención se refiere además a un método para producir un polipéptido con actividad de fitasa de acuerdo con técnicas recombinantes que incluye la crianza de células anfitrionas procarióticas y/o eucarióticas recombmantes , que contienen una secuencia de ácidos nucleico de acuerdo con la invención obtenida ba o condiciones que promueven la expresión de la enzima así como la subsecuente obtención de la enzima. Además la invención se refiere al uso del polipéptido con actividad de fitasa en un método habitual, por ejemplo en un método que libera los minerales de los complejos de fitato en materiales vegetales ya sea ín vitro, por ejemplo durante el tratamiento de los forrajes o su uso al hornear, o ín vivo por ejemplo al administrar el polipétido con actividad de fitasa a los animales. Además la invención se refiere al uso de las seucencias polinucleótidas de acuerdocon la invención para producir sondas para encontrar secuencias similares que codifiquen a las enzimas correspondientes en otros organismos así como para la transformación de células anfitrionas .

La invención se refiere además una secuencia de señal derivada del gen de fitasa de Aspergi l l us niger . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras adjuntas describen la invención más detalladamente. La figura 1 muestra un SDA-PAGE de las natas de cultivo de cepas transformadas con los plasmidos pKDa2 y pKDa4. Las bandas 1 y 6 contienen proteínas ras. La descripción exacta se encuentra en el ejemplo 6 y en la tabla 3. La figura 2 muestra un mapa de plasmido de pKDa2 (mutante Tyr200) . La figura 3 muestra un mapa de plasmido de pKDa2 (tipo nativo) . La figura 4 muestra un mapa de plasmido de Da2pUC3. La figura 5 muestra la secuencia de ADN que codifica a la fitasa de E . col tipo nativo (uso de codón de E . col i ) (Dassa et al., 1990, J. Bactepol. 172:5497-5500, no. de acceso M58704), proteína madura . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El plasmido Da2pUC3 se depositó bajo el número de depósito DSM 16396 el 7 de mayo de 2004 en la Deutschen Sammiung von Mikroorgamsmen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Brauschweig de acuerdo con las condiciones del Acuerdo de Budapest. Sorprendentemente se encontró que una mutación en un aminoácido en la zona de las posiciones 189 a 211 (incluyendo los valores límites) y/o una mutación de aminoácidos en la zona de la posición 137 a 152 (incluyendo los valores límite) de la secuencia fitasa de tipo nativo de E . col i con una actividad claramente elevada en la nata de cultivo en la expresión en una célula anfitriona. Preferentemente está mutado cuando menos un aminoácido en la zona de la posición 197 a 209 (incluyendo los valores límite) y/o un aminoácido en la zona de la posición 137 a 152 (incluyendo los valores límites) en comparación con la secuencia tipo nativo. Todavía más preferentemente está mutado cuando menos un aminoácido en la posición 198, 200, 205 y 207 y/o en la posición 144, 145 y 152. Las mutaciones preferidas en la zona de la posición 189 a 211 son Val 200 ? Leu, Val 200 ? He, Val 200 ? Pro, Val 200 -. Tyr, Leu 198 ? He, Val 205 ? Leu, Val 205 ? He, Leu 207 ? Tyr, Leu 207 ? Phe y en el rango de posiciones 137 a 152 He 144 — Tyr, Leu 145 ? He, He 152 — Phe. Otras mutaciones son Val 200 ? Leu, Val 200 ? Pro, Val 200 ? Tyr y He 144 - Tyr. En especial la mutación se encuentra en la posición Val 200.

Este aminoácido está sustituido preferentemente por medio de un aminoácido aromático como tirosina, por medio de un aminoácido hidrófobo como leucina o isoleucina o por medio de prolina. Se prefiere la mutación en la posición 200 Tyr.

Además pueden producirse mutantes dobles con la condición de que la mutación He 144 -> Tyr no se presenta con una mutación de Val 200 así como con la condición de que la mutación He 152 -> Phe no se combina con cualquier mutación de Leu 207. Una mutante doble preferida es Leu 198 — He en combinación con Leu 145 -> He. Sin querer quedar limitado por la siguiente aclaración teórica, se supone que por medio de la modificación de acuerdo con la invención se producen modificaciones en dos zonas estructurales espacialmente vecinas de la fitasa, esto es la ho a plegada ß y de la hélice OÍ y estas zonas se modifican por medio e la interacción hidrófoba de tal forma que se obtiene una mejor densidad de empaque. Esto a su vez conduce a una mayor actividad en el residuo de cultivo o secreción de una enzima modificada de ese tipo. En el marco de la medida anterior, en las zonas antes mencionadas pueden realizarse y combinarse las mutaciones deseadas, siempre y cuando el microorganismos transformado con una correspondiente secuencia de ADN, se cercena de la célula anf triona la fitasa codificada manteniendo la actividad enzimática y las otras propiedades fisiológicas del la fitasa de E . coli tipo nativo con cantidades elevadas o con las propiedades de actividad elevada (actividad total) en la nata de cultivo. Preferentemente la mejora de la actividad en la nata d ecultivo o el coeficente de secreción d euna mutante en comparación con la fitasa de E . col l tipo nativo asciende a cuando menos 10%, preferentemente cuando menos 20% en el caos de mediciones bajo condiciones idénticas. La determinación de la actividad enzimática de la fitasa así como la medición de otras propiedades fisiológicas de la fitasa pueden realizarse de acuerdo con un método en si conocido . La obtención de cuando menos un aumento del 10% de la actividad en el residuo de cultivo o la eficiencia de secreción de la fitasa en comparación con la eficiencia de secreción de la fitasa tipo nativo fue sorprendente y no se parece a nada. En especial fue sorprendente que la mutante Val 200 -» Tyr se presenta con un aumento el 100% de la eficiencia de secreción en comparación con la fitasa de tipo nativo (ejemplo 4) . En el estado de la técnica se describen pruebas que mejoran las propiedades de fitasa. Así el documento Archives Biochem. Biophys., 2000, 382(1), 105-112 en la página 109, Tabla 3 describe las actividades de la fitasa en la nata de cultivo durante la secreción por medio de la levadura Pichia pas toris . La fitasa de E . col i tipo nativo (que no es idéntica en secuencia a la secuencia pKDa4) fue secretada después de 96 hora sen una cantidad de 117 unidades/ml. Aquí debe observarse que la determinación de la actividad de acuerdo con este documento no es idéntica a la determinación de la actividad de acuerdo con el ejemplo 4 de la presente invención. De acuerdo con el estado de la técnica en el documento antes mencionado se incuba el sustrato con la enzima a un pH de 2.5. De acuerdo con la invención se realiza la incubación a un pH de 5.0. De las curvas de la página 109, figura 3 del documento se obtiene que 117 U/ml a un pH de 2.5 solo corresponden a 60 U/ml a un pH de 5 (52% de actividad residual) . Así en este documento la actividad enzimática medida de la fitasa de E . col i tipo nativo secretada, codifica por medio del uso del codón de E . col i tipo nativo mucho menos que por medio de la actividad enzimática secretada obtenida por medio de la cepa T. reeseí transformada con pKDa4 de 158 a 188 U/ml. La secuencia de ADN correspondiente a la secuencia de fitasa mutada de acuerdo con la invención puede realizarse por medio del uso del codón deseado, siempre y cuando por el uso del codón no se perjudique el monto de la secreción. Así por ejemplo puede utilizarse el uso de codón del microorganismo utilizado para la expresión, pero también puede utilizarse el uso de codón de E . col i o una variante del mismo. Además la secuencia de fitasa de E . coli mutada de acuerdo con la invención puede contener otras variaciones de secuencia. Aquí pueden realizarse las variaciones deseadas adic onalmente a las mutaciones ya descritas, siempre y cuando no se perjudique la obtención de una mayor actividad en la nata de cultivo o la eficiencia de secreción y siempre cuando se mantenga la actividad enzimática y las otras propiedades esenciales de la fitasa de E . coli tipo nativo. Las variaciones correspondientes son bien conocidas para el experto en el campo de la técnica del ADN recombmante y abarcan las anteriores mutaciones asi como las siguientes variaciones ejemplares. De acuerdo con la invención pueden utilizarse moléculas de adición y/o deleción del polipéptido modificado de acuerdo con la invención. Así puede el polipéptido modificado de acuerdo con la invención puede alargarse por medio de la introducción de otras secuencias en los extremos terminal N y/o terminal C. Con esto pueden producirse moléculas híbridas, que poseen otras propiedades ventajosas. Por ejemplo pueden agregarse proteínas de fusión o nativas en proteínas secretadas en grado elevado, con lo cual se mejora aun más la eficiencia de secreción. Además pueden agregarse secciones de secuencia activa de otras enzimas, para obtener enzimas con especifidad múltiple. Además pueden agregarse secuencias polares o no polares, para influir de forma especial sobre las propiedades de solubilidad o acceso a la membrana de las enzimas así obtenidas. Preferentemente aquí el extremo terminal N se acopla con una fitasa de Asperfil l us o con una fosfatasa acida. De la misma manera pueden realizarse alargamientos de la terminal C de la secuencia de fitasa de E . col i mutada. Así pueden obtenerse fitasas con una estructura cuaternaria modificada. De acuerdo con la invención también delecionarse secciones de la secuencia del polipéptido con actividad de fitasa, siempre y cuando no se modifiquen las propiedades de secreción elevada o la actividad en el residuo de cultivo conservando la actividad de fitasa. Las mutaciones, los alargamientos y los acortamientos pueden realizarse de una manera conocida por medio de un método bien conocido en la técnica. Las modificaciones antes consideradas del polipéptido con actividad de fitasa corresponden a las mutaciones o modificaciones correspondientes de la molécula de ADN correspondiente. De acuerdo con la invención se consideran también aquellas secuencias que ba o condiciones relajadas o estrictas se hibpdizan con las secuencias de acuerdo con la invención. Además la invención se refiere también a aquellas secuencias que presenten una homología con a secuencia nucleótida reivindicada o una parte de las mismas de cuando menos 70%, preferentemente de cuando menos 90% y en especial cuando menos 95%, siempre y cuando las secuencias en cuestión conduzcan a un aumento de la actividad en la nata de cultivo o de la eficiencia de secreción del polipéptido codificado con actividad de fitasa. Preferentemente la homología asciende a 70 a 100 por ciento. El grado de identidad preferentemente se determina de tal forma que el número de los radicales de la secuencia más corta, que participa en la comparación y posee una contraparte "correspondiente" con la otra secuencia. De acuerdo con la invención para la comparación solo se utilizan aquellas proteínas maduras. Como secuencias homologas se determinan piezas de secuencia similares de acuerdo con la invención, preferentemente idénticas, con la ayuda de programas de computadora conocidas. Un ejemplo de un programa de ese tipo es el programa Clone Manager Suite, que contiene la parte de programa Align Plur y que es proporcionada por Scientif.c & Edicational Software, Durham, NC, EE.UU. Aquí se realiza una comparación entre dos de las secuencias de ADN antes definidas, bajo la opción de alineación local ya sea de acuerdo con el método FastScan-MaxScore o de acuerdo con el método Needleman-Wunsch manteniendo los valores por omisión. En especial de acuerdo con la invención para calcular la homología se usó la versión del programa „Clone Manager 7 Align Plus 5" con las funciones „Compare Two Sequences/Local Fast Sean-Max Score/Compare DNA sequen-ees". Para esto se usaron los algoritmos obtenidos de las siguientes fuentes: Hirschberg, D.S. 1975. A linear space algorithm for Computing longest common subsequences . Commun Assoc Comput Mach 18:341-343; Myers, E.W. and W. Mi 11er. 1988. Optimal alignments ín linear space. CABIOS 4:1 , 11-17; Chao, K-M, W.R. Pearson and W. Miller. 1992. Alignmg two sequences within a specified diagonal band. CABIOS 8:5, 481-487. La invención se refiere además a secuencias de ADN, que debido a la degeneración del código genético está relacionado con las secuencias de acuerdo con la invención así como con sus variante alélicos. La degeneración del código genético puede presentarse aquí debido a la generación natural o debido al uso del codón especialmente seleccionado. Las variantes alélicas de origen natral pueden identificarse utilizando técnicas bien conocidas de la biología molecular como por ejemplo la reacción de cadenas de polimerasa (PCR) y técnicas de hibridización . Una secuencia de ADN que codifica al polipéptido de acuerdo con la invención puede utilizarse para transformar por ejemplo células de hongos, levaduras, bacterias, vegetales o mamíferos. Las células transformadas de esa forma se caracterizan por una mayor secreción de fitasa. La enzima de fitasa así producida conduce también a una eficiente liberación de fosfato de los fosfatos de mioinositol . Las expresiones proteínas, péptido y polipéptido deben utilizarse de forma intercambiable. Un polipéptido o enzima con actividad de fitasa o una fitasa designan cualquier enzima que puede efectuar la liberación de fosfato inorgánico de diferentes fosfatos de mioinositol. Ejemplos de esos sustratos de fosfatos de mioinositol (fitasa) son ácido fitinico y sus sales, por ejemplo fitato de sodio o de potasio o sales mixtas. También los isómeros de posición de los di-, tri-, tetra- o penatafosfato de mioinositol pueden servir como sustrato de fitasa. La actividad de fitasa puede determinarse usando cualquier ensayo, en el cual se utilicen esos sustratos. La variante de fitasa de acuerdo con la invención incluye variantes de polipéptidos que se derivan de una fitasa especial por medio de deleción o adición de uno o varios aminoácidos en los extremos terminal N y/o terminal C de la proteína nativa, la deleción o adición de uno o más aminoácidos en uno o varios puntos de la proteina nativa, o la sustitución de uno o varios aminoácidos en una o varias posiciones en la fitasa. La producción de esas variantes es en general conocida en el campo técnico. Por ejemplo pueden producirse variantes de secuencias ammoácidas de los polipéptidos por medio de mutación en el AD. Los métodos para la mutagenésis y la modificación de la secuencia nucleótida son bien conocidos en el campo técnico (ver por ejemplo Kunkel, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 82:488 (1985), Kunkel et al., Methods ín Enzymol., 154:367 (1987), patente norteamericana no. 4,873,192, Walker und Gaastra, eds., Techmques ín Molecular Biology, Mac Milian Publishing Company, Nueva York (1983) ) . Indicaciones sobre las sustituciones de ammoácidas, que no perjudican la actividad biológica de las proteínas de ínteres, se encuentran en el modelo de Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D.C. (1978). Las sustituciones conservadoras como el intercambio de aminoácidos por otros con propiedades similares. La invención se refiere también a composiciones de ácido nucleico o de proteínas aisladas o en esencial purificadas. Aquí un polinucleótido/polipéptido aislado y purificado o un segmento del mismo designan a un polinucleótido o polipéptido o segmento, que se encuentra aislado de su ambiente nativo. Un segmento de ácido polinucleico aislado o polipéptido puede encontrarse en forma purificada o puede encontrarse en un ambiente no nativo, como por ejemplo en una célula anfitpona transgénica. Por ejemplo es un segmento polinucleótido o proteína aislado o purificado o una parte biológicamente activa del mismo, en lo esencial está libre de otro material celular o medio de cultivo durante la producción de acuerdo con técnicas recombmantes o en esencial libres de promotores químicos o de otros compuestos químicos . Se refiere un polmucleotido aislado libre de secuencias (preferentemente secuencias codificadas de proteínas) que naturalmente franquean a los ácidos nucleicos (esto es las secuencias que están localizadas en los extremos 5' y 3' de los ácidos nucleicos) en el ADN genómico del orgánico del cual se obtuvo el ácido nucleico. Por ejemplo de acuerdo con otras formas de realización la molécula de ácidos nucleicos puede contener secuencias de nucleótidos menores a aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb, que de forma natural franquean a la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula, de la cual se ha derivado el ácido nucleico. Una proteína que está esencialmente libre de material celular, incluye composiciones de proteínas o polipéptidos con menos de aproximadamente 70%, 50%, 30%, 20%, 10%, 5% (en relación al peso seco) del promotor químico o las sustancias químicas que no sean del tipo proteína. Los fragmentos y variantes de las secuencias nucleotidas o proteínas o segmentos de proteína de acuerdo con la invención, que se codifican de esa manera, también forman parte de la invención. El fragmento designa una parte de la secuencia nucleótida o una parte de la secuencia ammoácida y por lo tanto una parte del polipéptido o la proteína, que son codificados. La invención se refiere también a cartuchos de expresión, que pueden utilizarse para infiltrar las fitasas de acuerdo con la invención codifican a los marcos de lectura en una célula anfitriona. Abarcan preferentemente una región de inicio de transcripción, que está acoplada con el marco de lectura abierto. Un cartucho de expresión de ese tipo puede contener una pluralidad de puntos de restricción para la inserción del marco de lectura abierta y/u otro ADN, por ejemplo una región reguladora de transcripción y/o genes marcadores seleccionables . El cartucho de transcripción incluye en la dirección 5'-» 3 ' de la transcripción de una región de inicio transcripción y de de translación, la secuencia de ADN de interés y una región de paro de transcripción y translación, que es funcional en la célula microbiana. La región de terminación puede ser nativa en relación a la región de inicio de trascripción, puede ser nativa en relación a la secuencia de ADN de interés o puede derivarse de cualquier otra fuente deseada. La expresión "marco de lectura" (ORF) designa una secuencia ammoacida, que se codifica entre el codón de inicio de translación y el de paro de una secuencia codificante. Las expresiones "codón de inicio" y "codón de paro" designan una unidad de tres nucleótidos vecinos (codones) en una secuencia codificante, que especifican el inicio y el paro de la cadena de la síntesis de proteína (translación mARN) . El "acoplamiento funcional" designa en relación con los ácidos nucleicos un compuesto como parte de la misma molécula de ácido nucleico en la posición y orientación adecuadas en el inicio de trascripción del promotor. El ADN en acoplamiento funcional con un promotor se encuentra bajo la regulación del inicio de trascripción del promotor. Las secuencias codificantes pueden funcionalmente estar acopladas con la secuencia reguladora en la orientación sentido o antisentido. Al hacer referencia a los polipéptidos el acoplamiento funcional del compuesto como parte del mismo polipéptidos, esto es a través de enlaces de peptidilo. De acuerdo con la invención pueden usarse cualquier promotor deseado. Promotor designa la secuencia nucleótida formada habitualmente corriente arriba (5') en relación a la secuencia codificante y controla la expresión de la secuencia codificante, en la cual el reconocimiento de la polimerasa de ARM y otros factores que son necesarios para la correcta transcripción. El promotor utilizado de acuerdo con la invención puede incluir un promotor mínimo, esto es una secuencia de ADN corta de un TATA-Box y otra secuencias, que especifican los puntos de inicio de trascripción en la cual están unidos los elementos del regulador para controlar la expresión. El promotor de acuerdo con la invención puede también incluir una secuencia nucleótida, que incluya un promotor mínimo y elementos reguladores, que pueden controlar la expresión de una secuencia codificadora o del ARN funcional. Este tipo de secuencia promotora consiste de elementos colocados proximal y distalmente corriente arriba, estos elementos recientemente mencionados frecuentemente se designan como refuerzos. Como consecuencia un refuerzo es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad del promotor y puede se un elemento interno del promotor o un elemento heterólogo insertado, para reforzar el grado de expresión o la especificidad al tejido de un promotor. Puede funcionar en ambas orientaciones o puede funcionar cuando el promotor se encuentra colocado corriente arriba o corriente abajo. Tanto el refuerzo como también otro elemento promotor colocado corriente arriba se une a proteínas ligantes a ADN con secuencia específica, que determinan su efecto. Los promotores pueden totalmente derivarse de de un gen nativo o pueden estar conformados de diferentes elementos, que se derivan de diferentes promotores de origen natural o pueden hasta conformarse de segmentos de ADN sintéticos. Un promotor también puede contener secuencias de ADN que participan en el enlace de los factores de proteína, que controlan la eficiencia del inicio de trascripción como respuesta a las condiciones fisiológicas o condicionadas por el desarrollo. Los elementos promotores en especial los elementos TATA, que son inactivos o que poseen una actividad promotora fuertemente reducida en la ausencia de activación corriente arriba, se designan como promotores mínimos o promotores núcleo. En la presencia de uno o varios factores de trascripción adecuados, la función de promotor mínimo consiste en hacer posible la trascripción. Un promotor mínimo o núcleo consiste por lo tanto de todos los elementos básicos que son necesarios para iniciar la transcripción, por ejemplo una TATA-Box y/o un iniciador. La invención se refiere además a vectores que contienen ADN de acuerdo con la invención. Esos vectores incluyen plsmidos, cosmidos, fagos y otros vectores de forma de tira doble de tira sencilla, lineales o circulares, que eventualmente puede ser propiamente transmitible o movilizable y pueden transformarse en el anfitrión procariótico o eucariótico ya sea por medio de integración en el genoma celulosa o pueden encontrarse extracromosomalmente (por ejemplo plasmidos de replicación autónoma con un origen de replicación) .

Los vectores, plasmidos, cosmidos, cromosomas de levaduras artificiales (YAC) , cromosomas de bacterias artificiales (BAC) y segmentos de ADN para usar la transformación de células incluyen en general ADN que codifica a fitasa de acuerdo con la invención así como otros ADN, como cADN, uno o varios genes que deben ser transferidas. Esas construcciones de ADN pueden incluir otras estructuras como promotores, reforzadores, polienlazantes o también generes reguladores, siempre que se requiera. Uno de los segmentos de ADN o genes, que fueron seleccionados para la transferencia celular, codifica ventajosamente a un proteína, en la cual se expresan las celias transformadas (recombmantes) , lo que conduce a una característica explorablemente o seleccionable y/o las células transformadas proporcionan un fenotipo mejorado. La construcción de los vectores, que pueden utilizarse de acuerdo con la invención, es conocida para un técnico en el campo de la presentación anterior (ver por ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. edición, Coldsppng Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y. (1989)). El cartucho de expresión de acuerdo con la invención puede presentar uno o varios puntos de restricción para colocar un nucleótido codificante a la fitasa bajo la regulación de una secuencia reguladora. El cartucho de expresión puede también contener una señal de terminación en acoplamiento funcional con el polinucleótido asi como secuencias reguladoras, que se necesitan para la translación ordenada del polinucleótido . El cartucho de expresión, que contiene el polinucléotido de acuerdo con la invención, puede ser quimérico, esto es cuando menos uno de sus componentes es heterólogo en relación a cuando menos otro componente. La expresión del polinucleótido en el cartucho de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo, un promotor mducible, un promotor regulable, un promotor viral o un promotor sintético. Los vectores pueden contener elementos reguladores, por ejemplo promotores o las secuencias de ADN de acuerdo con la invención pueden manipularse de tal forma que contengan esos elementos. Los elementos promotores adecuados, que pueden utilizarse son conocidos en la técnica y son por ejemplo para Tichoderma reeseí del promotor cbh 1 o cbh 2, para Aspergillus oryzae del promotor amy, para Aspergillus niger del promotor xyl, glaA, alcA, aphA, tpiA, gpdA, sucl y pkiA. Los elementos promotores adecuados que pueden utilizarse para la expresión de levadura son conocidos en la técnica y son por ejemplo los promotores pho5 o gap para la expresión de Sa ccharomyces cerevisiae y para Pi chia pa s toris, por ejemplo el promotor aoxl o fmd o el promotor mox para H. polymorpha . El ADN que es adecuado para la infiltración en las células, además del ADN de acuerdo con la invención, puede utilizarse ADN que se deriva o se aisla de cualquier fuente. Un ejemplo de un ADN derivado es una secuencia de ADN que como fragmento útil fue identificado en un organismo dado y que entonces se sintetizo químicamente esencialmente en forma pura. Un ejemplo de ese ADN es una secuencia de ADN adecuada que se obtiene por ejemplo utilizando endonucleasas de restricción, de tal forma que puede ser manipulada adicionalmente de acuerdo con la invención, por ejemplo puede ser manipulada. Un ADN de ese tipo se designa habitualmente como ADN recombinante . Para esto el ADN adecuado contiene ADN completamente sintético, ADN semisintético, ADN aislado de fuentes biológicas, y ADN derivado de ARN infiltrado. En general el ADN infiltrado no es un componente original del genotipo del ADN receptor, pero de acuerdo con la invención puede también aislarse un gen del genotipo dado y eventualmente puede modificarse y a continuación pueden infiltrarse múltiples copias del gen en el mismo genotipo, por ejemplo para reforzar la producción del producto genético dado. El ADN infiltrado incluye sin limitación ADN de genes por ejemplo de bacterias, levaduras, hongos o virus.

EL ADN infiltrado puede incluir genes modificados o sintéticos, partes de genes o genes quiméricos incluyendo genes del mismo o de diferente genotipo. El ADN utilizado de acuerdo con la invención para la transformación puede ser circular o lineal, de cadena doble o sencilla. EN general el ADN se encuentra en forma de un ADN quimérico como un ADN de plasmido, que también contienen regiones codificadas que son franqueadas por secuencias reguladoras, que apoyan la expresión del ADN recombmante presente en las células transformadas. Por ejemplo el ADN puede contener un promotor o consistir de un promotor, que es activo en una célula, que se deriva de una fuente que se diferencie de la célula o puede utilizarse un promotor que ya este presente en la célula, esto es la célula objetivo de transformación. En general el ADN infiltrado es relativamente pequeño, menor a aproximadamente 30 kb, para minimizar la sensibilidad frente a la degradación física, química o enzimática, que coincide con el tamaño del ADN. La selección de un vector de expresión adecuado depende de las células anfitponas. Los vectores de expresión en levaduras u hongos pueden abarcar un origen de replicación, un promotor adecuado y un refuerzo, y también cualquier punto de enlace a ribosomas, puntos de poliadenilación, puntos de donador y aceptor de empalme, secuencias de termino de trascripción y secuencias franqueadas de 5' no transcritas deseados. Ejemplos de células anfitrionas adecuadas son: células de hongos de la especie Aspergil l us , Rhizop?s , Trichoderma , Neurospora , Mucor, Penicilli um, etc., como por ejemplo levaduras de las especies Zuyveromyces, Sa ccharomyces , Schizosaccharomyces , Tpchosporon , Schwanmomyces , Hansenula , Pichia y similares. Sistemas anfitriones adecuados son por ejemplo hongos como Aspergill , por ejemplo Aspergill us niger (ATCC 9142) o Aspergill us fi cu um (NRLL 3135) o Tpchoderma (por ejemplo Tri choderma reseei QM6a) y levaduras como Sa ccha romyces , por ejemplo Sa ccha romyces cerevisiae o Pi chia , como por ejemplo Pi chia pa s toris o Hansenula , por ejemplo H. polymorpha (DSMZ 70277) . Ese tipo de microorganismos pueden obtenerse de productores conocidos como por ejemplo la American Type Culture Collection (ATCC) , el Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) o el Deutschen Sammiung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) o otros depósitos similares. El cartucho de expresión puede contener en la dirección de transcripción 5' -3' de una región de inicio de transcripción y translación del polinucleótido de acuerdo con la invención y una región de transcripción y terminación, que es funcional m vivo o ín vitro. La región de terminación puede ser nativa con referencia a la región de inicio de transcripción o puede ser nativo o de otro origen en reacción al polinucleótido . Las secuencias reguladoras pueden estar localizadas corriente arriba (secuencias no codificante 5'), dentro (intron) o corriente abajo (secuencias no codificadoras 3') de una secuencia codificada e influir sobre la transcripción, el procesamiento de ARN o la estabilidad y/o la translación de la secuencia codificante. Las secuencias reguladores pueden abarcar sin limitaciones refuerzos, promotores, puntos de enlace de represores, secuencias guías de translación, intrones o secuencias de señales de poliadenilación . Pueden incluir secuencias naturales y sintéticas así como secuencias que son una combinación de secuencias naturales y sintéticas. El vector utilizado de acuerdo con la invención puede también incluir las secuencias adecuadas para la amplificación de la expresión. Ejemplos de promotores que pueden utilizarse de acuerdo con la invención son promotores de los cuales se sabe que controlan la expresión en las células eucarióticas . Cualquier promotor con la capacidad de expresarse en dermatofítos . Ejemplos son un promotor que es individuo fuertemente por medio de almidones o celulosa, como por ejemplo un promotor para celuloamilasa o a-amilasa de la especie Aspergil l us o celulasa (celobiohidrolasa) de la especie Tpchoderma , un promotor para enzimas en el metabolismo glicolítico, como por ejemplo cinasa de fosfoglicerato (PGK) y gl?cermaldeh?d-3-fosfato-dihidrogenasa (GPD), etc. Se prefiere el promotor de celobiohidrolasa I, de celohiohidrolasa II, de amilasa, de glucoamilasa, de xilasa o de enolasa. Se conocen dos métodos principales para controlar la expresión, esto es la sobre-expresión y la sub-expresión. La sobre-expresión puede obtenerse por medio de la inserción de una o varias copias extras del gen seleccionado. Para la sub-expresión existen dos métodos principales que habitualmente en la técnica son designados como "subregulación antisentido" y "subregulacion en sentido". En general esos métodos se designan como "silenciamiento genético". Ambos métodos conducen a una reducción de la expresión del gen objetivo. El cartucho de expresión puede abarcar otros elementos, por ejemplo aquellos que pueden ser regulados por medio de elementos endógenos o exógenos como proteínas de dedos de zinc, incluyendo proteínas de dedos de zinc de origen natural o proteínas de dedos de zinc quiméricos. El cartucho de expresión utilizado de acuerdo con la invención puede contener además elementos de refuerzo o elementos promotores corriente arriba.

Los vectores para utilizarse de acuerdo con la invención pueden construirse de tal forma que contienen un elemento de refuerzo. Las construcciones de acuerdo con la invención incluyen así el gen de interés junto con una secuencia 3' -ADN, que funciona como señal, para terminar la transcripción y permitir la poliadenilación del mARN. Puede utilizarse cualquier secuencial de señal deseada que permita la secreción desde el organismo anfitrión seleccionado. La secuencia de señal preferida es la secuencia de señal de fitasa de Asperfi ll us niger o secuencias de señal derivadas del mismo para la secreción desde hongos filamentosos. También puede utilizarse una secuencia guía especial, ya que la secuencia de ADN entre el punto de inicio de trascripción y el inicio de la secuencia codificante, esto es la secuencia guía no trasladada que puede influir sobre la expresión genética. Las secuencias guía preferidas incluyen secuencias que controlan la expresión óptima del gen enmarcado, esto es abarcan preferentemente una secuencia guía de consenso que eleva o mantiene la estabilidad de mARN y que evita un inicio de translación no adecuado. La sección de esas secuencias es bien conocida para los técnicos en ese campo. Para mejorar la posibilidad de identificar los transformantes, puede aceptarse un gen marcador seleccionable o explorable en el cartucho de expresión. Ese tipo de genes marcadores son bien conocidos. El cartucho de expresión o una construcción de vector que contiene al cartucho de expresión se introducen en una célula anfitriona. Existen una pluralidad de técnicas y conocidas para el técnico en el campo de la infiltración de construcciones en una célula anfitpona. La transformación de células microbianas puede realizarse por utilizando polietilenglicol, cloruro de calcio, infección viral, DEAE-dextrano, infecciones con fagos, electroporación y otros métodos conocidos en la técnica. La transformación de los hongos puede realizarse de acuerdo con Penttila et al., Gene 61 :155-164, 1987. La infiltración de un vector recombmante en levaduras puede realizarse por medio de métodos conocidos incluyendo electroporación, uso de esperoplastos, acetato de litio y similares . Tan pronto como se obtenga el cartucho de expresión de acuerdo con la invención o la secuencia de ADN, puede introducirse en vectores de acuerdo con métodos conocidos, para sobre-expresar el polipéptido codificado en sistemas anfitriones adecuados. Sin embargo también pueden utilizarse las secuencias de ADN tal cual, para transformar los sistemas anfitriones adecuados de la invención, para obtener la sobre-expresión del polipéptido codificado.

Tan pronto como una secuencia de ADN de acuerdo con la invención sea expresada en una célula anfitriona adecuada en un medio adecuado, puede aislarse la fitasa codificada ya sea del medio, en caso de que la fitasa se cercene del medio o del organismo anfitrión, en caso de en el caso de que la fitasa intracelular este presente por ejemplo en el espacio periplasmático, se concentra y/o se aisla de acuerdo con un método conocido. Los métodos conocidos para la separación de componentes insolubles del medio de cultivo y la biomasa seguido por el método para concentrar las fitasas pueden utilizarse para la producción de soluciones concentradas de fitasa o como preparación para secar la fitasa. Por ejemplo pueden utilizarse métodos de filtrado o de centrifugación para separar los componentes insolubles seguido por un método de ultrafíltración para la concentración o se utilizan métodos de filtrado de flujo cruzado. El secado puede realizarse por medio de secado por congelación o por rocío, el método de granulación, la extrusión u otro método. Métodos conocidos para la purificación de proteína pueden utilizarse para aislar las fitasas de acuerdo con la invención. Por ejemplo pueden utilizarse diferentes métodos cromatográficos o de cromatografía de gel individualmente o en combinación. Dependiendo de las células anfitrionas utilizadas en el método de producción recombinante puede la enzima de acuerdo con la invención modificarse o no de forma covalente por medio de glicosilación . En células eucarióticas la glicosilación de las proteínas cercenadas sirve para modular el plegado de las proteínas, la estabilidad a la conformación, la estabilidad térmica y la resistencia frente a la proteolisis En vista de un uso específico de la fitasa puede preferirse una variante glicosilada de la enzima frente a una variante no glicosilada. Por ejemplo el uso de una fitasa glicosilada en el forraje sirve para proteger la enzima de la desnaturalización térmica durante el granulado de forrajes y de la inactivación proteolítica durante el paso a través del estómago del animal con lo cual se promueve la distribución de la enzima activa en el tracto intestinal y a la zona de acción. Para los usos en la preparación de alimentos, en el cual solo se desea la actividad enzimática durante la preparación y no en el producto final, puede preferirse una fitasa termolábil, esto es no glicosilada y sensible frente a la degradación protolitica. La invención se refiere además a composiciones de fitasa, que contienen polipéptidos de acuerdo con la invención. En general las composiciones de fitasa son líquidas o sólidas. Las composiciones líquidas contienen a la enzima fitasa preferentemente en forma purificada o enriquecida. Sin embargo pueden agregarse también aditivos como por ejemplo un estabilizador con glicepna, sorbita o monopropilenglicol , aditivos como sales, azucares, conservadores, medios para ajustar el valor de pH, proteínas y fitato o sales de fosfatos de mioisnositol (un sustrato de fitasa) . Las composiciones líquidas típicas son pastas acuosas o aceitosas. Las composiciones líquidas pueden agregarse a un alimento o un forraje antes o después de una etapa de granulación o preparación posible. Las composiciones secas pueden ser composiciones secadas por congelación, secadas por rocío o composiciones extruídas, que pueden contener exclusivamente a la enzima. Las composiciones secas pueden ser granulados que pueden mezclarse fácilmente por ejemplo con alimentos o componentes de forrajes o pueden formar preferentemente los componentes de una pre-mezcla. El tamaño de partícula del granulado enzimático preferentemente es compatible con los otros componentes de la mezcla. Esto hace posible un agente seguro y expediente para introducir por ejemplo las enzimas en alimentos procesados, premezclas o forrajes. Por ejemplo puede producirse una formulación estable de la enzima fitasa de acuerdo con la invención de tal forma que una mezcla de una solución enzimática líquida se rocía sobre un material de relleno como harina de soya molida y luego la mezcla se seca. La reducción de la humedad y las interacciones de enlace de la fitasa con el relleno protegen la enzima de las influencias ambientales tales como las temperaturas extremas, que pueden presentarse durante la producción del forraje. Las formulaciones secas y líquidas pueden ser estabilizadas cuando se reduce la actividad de las enzimas potencialmente proteolíticas, que pueden estar como productos secundarios en la mezcla de fermentación líquida, que se utiliza para la producción de la enzima de acuerdo con la invención. La mezcla de enzima seca así obtenida puede utilizarse como complemento alimenticio para utilizarse en la crianza de aves y cerdos. Por ejemplo una adición de 250 unidades enzimáticas de la enzima de acuerdo con la invención a ] kg de una alimento de trigo estándar, muestra efectos similares a 500 unidades enzimáticas de fitasa de Aspergil l us . Además una reducción del suplemento de fosfato conduce a una reducción de las impurezas por fosfato que por su lado reduce significantemente la contaminación ambiental por medio de la crianza intensiva de los animales . Tan pronto como se obtenga un preparado enzimático seco, puede producirse un granulado por aglomeración. Para esto se utiliza un mezclador con altas fuerzas de desgarre, con lo cual el material de relleno y la enzima se co-aglomeran y se forma un granulado. Se producen granulados por absorción, en los cuales el núcleo de un material portador es recubierto con la enzima de acuerdo con la invención. Los materiales de relleno típicos son sales como sulfato disodico. Otros materiales incluyen caolín, talco, silicato de magnesioalumimo y fibras de celulosa. Eventualmente los ligantes como dextrina también son absorbidos en el granulado de aglomeración. Los materiales portadores típicos incluyen almidones, por ejemplo en forma de yuca, papa y cereales, en especial maíz, arroz y trigo o productos que contengan proteínas como por ejemplo proteínas de soyas. También pueden utilizarse sales. El granulado eventualmente se recubre con una mezcla de recubrimiento. Una mezcla de ese tipo incluye medios de recubrimiento, preferentemente medios de recubrimiento hidrófobas, aceite de palma deshidratado y talco y eventualmente otros aditivos como carbonato de calcio o caolín para la biod sponibilidad en los estados de efecto de acuerdo con las determinaciones. Adicionalmente las mezclas con fitasas pueden contener otros materiales como agentes colorantes, compuestos aromáticos, estabilizadores, vitaminas, minerales, otras enzimas alimenticias o para forrajes y similares. Esto se aplica en especial para las premezclas mencionadas . Un aditivo para alimentos y forrajes es en lo esencial un compuesto puro o una composición de varios compuestos, que son especiales o adecuados para ser agregados para los alimentos o forrajes. En especial es una sustancia que de acuerdo con su fin de uso es un componente de un alimento o forraje o que influye sobre las propiedades del producto alimenticio o forraje. As un aditivo de fitasa representa una fitasa que no es n.ngún componente natural de las sustancias principales utilizadas para el alimento o el forraje o su concentración natural no está presente. Por ejemplo la fitasa del forraje se agrega separado de las sustancias del forraje o en combinación con otros aditivos del forraje. Una premezcla típica incluye habitualmente uno o más compuestos como vitaminas, minerales o enzimas de refuerzo del forraje y portadores y/o excipientes adecuados. Un aditivo de fitasa listo para usarse en un aditivo que no se produce ín situ en el forraje o en un alimento procesado. Un aditivo de fitasa listo para usarse puede administrarse a humanos o animales directamente o preferentemente directamente después del mezclado con otro componentes del forraje o del alimento. Por ejemplo un aditivo de forraje de acuerdo con este aspecto de la presente invención se unifica con otro forraje y aditivo manteniendo una premezcla o complemento alimenticio. Esos otros componentes de los alimentos incluyen uno o más suplementos enzimáticos adicionales (preferentemente termoestables), otros aditivos de forrajes, forrajes minerales y aminoácidos. Los aditivos (combinados) así obtenidos pueden incluir varios tipos de compuestos diferentes y pueden mezclarse en su cantidad adecuada con los forrajes como portadores de granos y proteína formando un forraje compuesto. La preparación de esos componentes a un forraje puede realizarse después del mezclado den dispositivos de preparación en si conocidos como una máquina granuladora doble, una granuladora a presión, un expansor o un extrusor. De manera similar puede combinarse un aditivo alimenticio de acuerdo con una forma de realización de la presente invención con otros componentes de agentes alimenticios, con lo cual se producen productos alimenticios preparados. Esos otros componentes alimenticios incluyen uno o varios suplementos enzimáticos, vitaminas, minerales y oligoelementos . El complemento alimenticio combinado puede mezclarse con una cantidad adecuada con otros componentes alimenticios como cereales y proteínas vegetales, para dar un alimento procesado. El procesamiento de esos componentes para dar un alimento procesado puede realizarse utilizando dispositivos de procesamiento conocidos . En una forma de realización preferida las composiciones de fitasa de acuerdo con la invención adicionalmente presentan una cantidad efectiva de una o varias enzimas para alimentos o forrajes, preferente seleccionadas de galactosidasas , laccasas, otras fitasas, fosfatasas, endoglucanasas, en especial endo-beta-1, 4-glucanasas, endo-beta-1, 3 ( 4 ) -glucanasas , endo-1, 2-beta-glucanasas y endo-1, 3-alfa- glucanasas, celulasas, xilosidasas, galactanasas , en especial arabinogalactan-endo-1 4-beta-galactos?dasas y arab?nogalactan-endo-1 , 3-beta-galactosidasas , enzimas degradadoras de la pectina, en especial pectmasas, pectinesterasas, pectinliasas, poligalacturonasas, arabananasas, ramnogalacturonasas, ramnogalacturonanacetilesterasas, ramnogalacturonan-alfa-ramnosidasas, pectatliasas y alfa-galacturonidasas, mannanasas, beta-mannosidasas, mannanacetilesterasas, xilanacetilesterasas, proteasas, xilanasas, arabinoxilanasas y enzimas lipoliticas como lipasas, fosfolipasas y cutmasas. Los aditivos para forrajes de acuerdo con la invención se suministran al animal antes o simultáneamente con el alimento. Preferentemente el aditivo de forraje de acuerdo con la invención se suministra al animal simultáneamente con el forraje. Una cantidad efectiva de fitasa en los alimentos o forrajes aproximadamente 10 - 20.000 PPU/kg, preferentemente aproximadamente 10 - 15.000 PPU/kg, más preferentemente aproximadamente 10 - 10.000 PPU/kg, en especial aproximadamente 50 - 5.000 PPU/kg, en especial 50 - 2.000 PPU/kg alimento o forraje. La invención se refiere también al uso de fitasa para la preparación y producción de alimentos y forrajes. Cereales y harinas para os alimentos pueden tratarse enzimaticamente con fitasa, para reducir el contenido de fitina de las materias primas. Los contenidos menores de fitina reducen la calidad del alimento, al elevarse la biodispombildiad de los minerales esenciales como hierro, calcio y cinco. Adicionalmente para elevar la calidad de los alimentos el uso de fitasa durante la preparación puede mejorarse la eficiencia total de la producción de los alimentos. Por ejemplo la adición de fitasas a hojuelas de soya blanca durante la producción de un aislado de proteina de soya aumenta significantemente el rendimiento y la calidad de las proteínas extraibles. Apara esto la fitasa solo es actva durante la producción y la preparación y en el producto final ya no es activo. Este aspecto es en especial importante durante la producción de masas y al hornear y producir otros productos fermentables a base de cereales. De igual manera pueden tratarse previamente los componentes de forrajes como harina de soya tostada o harina de cañóla con fitasa antes del propio proceso de preparación. Esta separación de factores anti-nutritivos en los componentes alimenticios del forraje antes de la preparación conduce a una calidad fisiológica mayor y a valiosos ingredientes en el forraje. En este método de preparación la fitasa durante la producción es activa y en el tracto digestivo del animal después de ingerir el alimento tratado por lo regular ya no es activo. Adicionalmente para la preparación de fitasas como aditivos de preparación de forrajes la presente invención se refiere al uso de las fitasas de acuerdo con la invención como auxiliares de digestión. Las fitasas en forma de tabletas pueden tomarse conjuntamente con los animales para distribuir la enzima activa en el tracto gastrointestinal . Las fitasas de acuerdo con la invención también de forma ventajosa pueden utilizarse en animales monogástricos o poligástpcos , en especial en terneros jóvenes. Los forrajes para peces y moluscos también pueden suplementarse con fitasas para mejorar el rendimiento del forraje y el reducir el contenido de fósforo eliminado en el caso de crianza de animales intensiva. El forraje de acuerdo con la invención puede también utilizarse en animales como aves, por ejemplo pollos, pavos, gansos, patos así como cerdos, caballos, reses, borregos, cabras, perros y gatos así como peces y moluscos. Sin embargo se prefiere en especial que el forraje de acuerdo con la invención sea administrado a cerdos y aves. Las formulaciones de fitasa de acuerdo con la invención pueden también combinarse con otros ingredientes formándose composiciones de forrajes especialmente ventajosas. Ya que como se indica antes, la disponibilidad de fosfato vegetal, que en la harina de soya y los cereales es ba a como consecuencia del enlace al ácido fítinico, se agrega fosfato inorgánico al forraje para garantizar un suministro adecuado de fosforo a los alimentos. Sin embargo estos forrajes contienen demasiado fosfato total y conducen por lo tanto a la contaminación del ambiente con fosfato. En especial el forraje de acuerdo con la combinación contiene la combinación de una fitasa de acuerdo con la invención con los ingredientes del forraje para producir un forraje, que contenga en lo esencial cantidades reducidos de fósforo inorgánico agregado. En una forma de realización preferida el forraje de acuerdo con la invención contiene típicos componentes de forraje, sustancias nutritivas micronizadas, oligoelementos, vitaminas, etc. así como una cantidad efectiva de fitasa y fósforo inorgánico, en donde las cantidades de fitasa y de fósforo se encuentra entre 40 y 20000 unidades de fitasa/kg de forraje y menos de 0.45% de fósforo inorgánico, preferentemente entre contenidos de 100-10,000 unidades de fitasa/kg de forraje y menos de 0.225% de fósforo inorgánico, en especial contenidos de 150-10,000 unidades de fitasa/kg de forraje y meno de 0.15% de fósforo inorgánico, en especial contenidos de 200-20,000 unidades de fitasa/kg de forraje y no contienen ninguna adición de fósforo inorgánico. La invención se refiere además a un método para mejorar el aumento del peso y el aprovechamiento del forraje (Feed Conversión Ratio FCR - Proporción de conversión del alimento) en la alimentación animal así como el uso de fitasas en ese método. Una fitasa de acuerdo con la invención permite un mejor aumento de peso y un mejor aprovechamiento del alimento, en especial en relación con el forraje que contiene poco fosfato inorgánico. De acuerdo con el método de la invención puede reducirse el contenido de fosfato en el alimento por debajo de contenidos de 0.45%, preferentemente por debajo de 0.225%. Preferentemente no se agrega ningún fosfato inorgánico. Por medio del aumento de la disponibilidad de fosfato como consecuencia de la adición de las enzimas de acuerdo con la invención puede mejorarse de manera significante la mmeralizacion osea en los animales, lo que es especialmente importante para animales de crecimiento rápido . De acuerdo con otra forma de realización la invención se refiere al uso de la enzima de acuerdo con la invención para hornear, con lo cual se mejora el crecimiento, la elasticidad y/o estabilidad de la masa y/o el volumen, la estructura de la miga y/o la resistencia del producto horneado en comparación con los panes anteriores. Aunque el preparado enzimatico de acuerdo con la invención se puede utilizar para la producción de masa o productos horneados de cualquier tipo de harina, por ejemplo a base de centeno, cebada, avena o maíz, el preparado enzimatico de acuerdo con la invención ha demostrado ser especialmente útil en la producción de masas o productos horneados de trigo o con una proporción de trigo esencial. Los productos horneados que pueden prepararse con el preparado enzimático de acuerdo con la invención incluyen panes, panecillos, barras y similares. Para hornear puede utilizarse el preparado enzimatico de acuerdo con la invención con una actividad enzimática adicional como por ejemplo xilanasa, lipasa, amilasa, oxidasa o laccasa ademas de fitasa o puede utilizarse en combinación con otras enzimas como lipasa, amilasa, oxidasa (por ejemplo glucosaoxidasa, peroxidasa) . Los siguientes ejemplos ilustran más detalladamente la invención. Ejemplo 1 : Determinación de la actividad de fi asa La actividad de fitasa se midió en una mezcla de ensayo de 0.5% de ácido fitinico (aproximadamente 5 mM) , 200 mM de citrato de sodio, pH 5.0. Después de una incubación de 15 minutos a 37° C se detuvo la reacción por medio de la adición de un volumen igual de 15% de ácido tricloroacético. Los iones de fosfato liberados se determinan cuantitativamente al mezclar 100 µl de la mezcla de ensayo con 900 µl de H20 y 1 ml de H2S04 0.6 M, 2% de ácido ascórbico y 0.5% de molibdato de amonio después de la incubación a 50° C y una duración de 20 minutos, a 820 nm. Las soluciones estándar de fosfato de potasio se utilizan como referencia. Ejemplo 2 : construcción de los plasmidos pJDa2 y pKDa4 Se desarrolló la secuencia de E . col i que codifica a la fitasa (Dassa et al. 1990, J. Bacteriol. 172:5497-5500, no. de acceso M58704) y se sintetizó utilizando el uso de codón de T. reesei (http: //www. kazusa . or . jp/codon) . Todos los fragmentos sintetizados se secuenciaron y los fragmentos con y sin mutaciones se asocian, con o cual se produjeron nuevas variantes de fitasa. En las variantes obtenidas finalmente se modifico el aminoácido Val200 (GTG) del gen de fitasa a Tyr200 (TAC). Esta variante se designo como Da2. El polinucleótido de cepa no mutado se designo como Da4. Los clones genéticos maduros de fitasa de E . col i se amplificaron con PCR. La secuencia de ADN con el codón CAG (Gln) en la posición 1 abarca un marco de lectura abierto de 1230 bp y codifica a una enzima con 410 aminoácidos (SEQ ID NO: 1/2) .

Se utilizó el péptido de señal (18 aminoácidos) de fitasa de A . niger (SEQ ID NO: 3/4), para cercenar la fitasa de E . col i de Trichoderma reesei . El gen sintético con la secuencia de señal modificada de fitasa de A . niger y la secuencia de fitasa madura de E . coli que contiene la mutación de V200Y se clono en el plasmido pUC18. El vector formado se designó como Da2pUC3 y se depositó como DSM 16396 de acuerdo con las condiciones anteriores. El plasmido depositado contiene el ADN con el uso de codón de hongos con pequeñas modificaciones corresponden a los puntos de corte necesarios para las enzimas de restricción como se desprende en la siguiente tabla 1: Tabla 1: 15 20 15 20 En el plasmido pKDa2 (mutante Tyr200) el gen sintético esta franqueado por medio de punto de restricción Sacll 16 pares de bases corriente arriba del codón de inició y un punto de restricción BamHl directamente corriente abajo del codon de paro. Las 16 pares de bases corriente arriba del codon de inicio pertenecen al promotor T. reeseí cbhl (Shoemaker et al., 1983, Bio/Technology 1, 691-696) . El gen sintético se disocio con Sacll y BamHl y se inserta en los puntos de disociación Sacll y BamHl después del promotor de celobiohidrolasa I T. reeseí en el plasmido pALK487 (WO 94/28117) . Esta construcción de plasmido se designa como pKDal. Un fragmento EcoRI/Spel de extremo plano de 4.78 kb de longitud del plasmido pALK424 (WO 93/24621), y contiene el marcador amdS y las secuencias cbhl franqueado 3' , se clono en la posición de disociación, con lo cual se obtuvo el vector de expresión de fitasa pKDa2. El vector se mapeo por medio de endonucleasas de restricción y se comprobó la secuencia completa del fragmento sintetizado por medio de secuenciación . De forma análoga se realiza la construcción del vector de expresión pKDa4 (tipo nativo) . Los cartuchos de expresión aislados de los plasmidos pKDa2 o pKDa4 contienen el siguiente material genético : Promotor de Cbhl (celobiohidrolasa I): El fragmento EcoRI/SacII de 2.2 kb, que contiene al promotor cbhl , proviene de Trichoderma reeseí QM6a. La zona promotora funciona también como ADN homologo (junto con el fragmento c¿> l 3'; ver adelante), para controlar la integración del ADN transformante en el locus cihl . Secuencia de señal: Se utilizo péptido de señal de A . niger Phyta sa (SEQ. ID. NO. 3/4), para cercenar la fitasa de E . coli de Tpchodera reeseí . Gen de fitasa de E . coli : El gen de fitasa de E . col i (SEQ ID NO: 1) incluye la secuencia de señal de fitasa modificada de A . niger para la expresión en T. reeseí se fusiono entre el promotor cbhl y la terminal c£>hl . Terminal cbhl : El fragmento Ba Hl / Stul de 0.75 kb de longitud, que contiene el termmador c¿> l, se agrego a la fitasa de E . coli , parta garantizar la terminación de la transcripción . Gen amdS : El gen incluyendo sus promotores y terminales se aisló de Aspergill us nidulans VH1-TRSX6 y codifico a la acetamidasa (Hynes et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1430-1439; Kelly and Hynes, 1985, EMBO J. 4:475-47) . La acetamidasa permite que la cepa crezca utilizando acetamida como única fuente de nitrógeno y esta característica se utilizo para seleccionar a los transformantes. El fragmento de 3.1 kb de tamaño ( Spel / BamHl ) contiene 1007 bps del rango promotor, 1897 bps de la región codificadora (incluyendo el intrón) y 183 bps de la zona terminal del gen amdS . Fragmento cbhl 3': el fragmento (1.7 kb, BamHl / EcoRl , empezando a 1.4 kb después del codón de paro del gen), se aislo de T . reeseí ALK02466. La cepa ALK02466 proviene de la cepa ALK0233 (Harkki et al., 1991, Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233). El fragmento 3' se utiliza conjuntamente con el rango promotor, para integrar específicamente el cartucho de expresión de fitasa en el locus cbhl por medio de recombmación homologa. La construcción se selecciono para encontrar específicamente y sustituir la única copia del gen cbhl , presente en T. reeseí RH3780d, para estudiar el efecto de la mutación por medio de una copia única del gen, Ejemplo 3: Transformación von Tpchoderma reeseí con pKDa2 y pKDa4 , T. reeseí RH3780d se transformo por separado con los cartuchos de expresión lmeapzados aislados de los plasmidos pKDa2 y pKDa . Las técnicas utilizadas para la transformación y el manejo de T. reeseí fueron aquellos de acuerdo con Penttila et al. (1987, Gene 61: 155-164). Los transformantes se seleccionaron y se purificaron dos veces por medio de aislamiento de esporas individuales. De todos los transformantes se seleccionaron aquellos con mayor potencia de secreción. De estos los transformantes con ADN del plasmido pKDa2 se designaron como RH 31068 y RH31069, las transformantes con ADN de pKDa4 se designaron como RH 31071-31075 y se utilizaron para la posterior caracterización . Ejemplo 4: Secreción de fitasa en un matraz agitado Los transformantes que portan los cartuchos de expresión de pJDa2 o pKDa4, se cultivaron en un matraz agitado sobre medio inductor de celulasa con la siguiente composición: concentrado de proteína de leche Nutrica 2%, lactosa 1%, DSG 1.5%, KH2P04 5% (NH4)2S04 0.5%, polvo de remojo de maíz 0.5%, el resto es agua corriente, ajuste del valor pH de la esterilización a 5.3. Los filtrados de cultivo obtenidos después del cultivo de 6 días se utilizaron para los análisis SDS-PAGE y para la determinación de la actividad de fitasa. Los resultados muestran que se observaron las mayores actividades de fitasa en el medio de cultivo con transformantes que contienen los cartuchos de expresión pKDa2. En las siguiente tabla 2 se muestran actividades que son las actividades máximas, que durante la fermentación de los mejores transformantes en el periodo de tiempo de 6 días.

Tabla 2: Producción de fitasa de E . coll por medio de transformantes , que contienen los cartuchos de expresión pKDa2 o pKDa4 Los resultados anteriores muestran que las cepas transformadas con el cartucho de expresión pKDa2, que contiene al mutante Tyr200 , presentan una secreción de fitasa de aproximadamente el doble que las cepas transformadas con la secuencia de E . col i tipo nativo pKDa4.

Ejemplo 5: Southern Blotting El análisis Southern-Blot se realizo en ADN genómico, que había sido aislado de la cepa anfitriona RH3780d y los transformantes de ambas construcciones, para evaluar los resultados de integración del cartucho de expresión en el genoma. Después de la disociación del ADN genómico con EcoRI y el muestreo con un fragmento de EcoRI de 9.0 kb estuvo presente una banda hibridizante a 9.0 kb en todos los transformantes. El tamaño de esas bandas corresponde al fragmento de 9.0 kb del cartucho de expresión, lo que se asemeja a una integración intacta de todo el cartucho en el genoma. La disociación del ADN con Xbal muestra dos bandas hibridizantes en 1.7 y 9.0 kb en la cepa anfitpona, por el contrario en todos los transformantes estuvieron presentes tres bandas hibpdizantes en 1.7, 4.0 y 7.0 kb . Como se espera del resultado del cruce doble, la integración de una copia del cartucho de expresión en el locus c£>hl a tres bandas en 1.7, 4.0 y 7.0kb y la ausencia de las bandas tipo nativo 9.0 kb . Sustituyen las bandas 4.0 como también las 7.0 a las bandas 9.0 del locus cbhl del anfitrión y las bandas 1.7 kb permanecen sin cambios. Las intensidades de las señales hibridizantes entre los transformantes y ambas construcciones no se diferencian . Los resultados de los análisis Southern-Blot, SDS-PAGE y la determinación de las actividades de fitasa se muestran en la anterior tabla 2. El análisis Souther-Blot mostró que todos los transformantes seleccionados del gen de fitasa de E . col l , o el gen mutado contenían como copia única el locus objetivo cbhl .

Ejemplo 6: Caracterización bioquímica de las variantes de fitasa Las natas de las cepas recombmantes se separaron sobre gel de SDS-PAGE de NuPage BisTris 10% y se tiñe con Coomassie (figura 1) . Como consecuencia de la glicosilación por medio de la cepa anfitponas aparecen las fitasas como tres bandas entre 44.2 y 53.2 kDA. Todas las muestras se aplicaron con las mismas actividades de fitasa. Los geles se secaron y se exploraron con el software Proretix ID Advanced sobe un explotador de lecho plano Agfa. Las superficies de las tres bandas se integraron y los datos se muestran en la siguiente tabla 3. La suma de las superficies de tres bandas de fitasa es igual para todas las cepas probadas en el marco de la precisión de medición del método. Esto muestra que la mutación en Da2 no produce modificaciones en la actividad específica de la enzima y demuestra con esto que la mutación es responsable de la alta secreción de la proteína de fitasa.

Tabla 3 : Integración de la superficie de las bandas de fitasa sobre el gel SDS-PAFE utilizado el programa Phoretix ID Advanced Ejemplo 7: Mejora la de disponibilidad de fosfato por medio de la fitasa de acuerdo con la invención (Mutante Tyr200) en cerdos La prueba de digestión se realizo en cerdos en don periodos de recolección subsecuentes de 5 días después de un periodo de ajuste de sendos 9 días. Una ración con un contenido reducido de fosfato digestible a base de desperdicio de la extracción de maíz y soya se utilizo como control negativo y se suplemento con las fitasas de acuerdo con la invención en (mutante Tyr200 de fitasa de E . col i) en cantidades de 125, 250, 500 y 750 PPU/kg de forraje. En total se utilizaron 40 cerdos macho castrado en 5 grupos de tratamiento. Todos los grupos de tratamiento consistieron de 8 cerdos (4 cerdos en 2 periodos de recolección secuenciales ) . Los tratamientos fueron los siguientes: Controles negativos1 (NC) NC + Fitasa (125 PPU/kg) NC + Fitasa (250 PPU/kg) NC + Fitasa (500 PPU/kg) NC + Fitasa (750 PPU/kg) 1 Forraje: 71.5% harina de maíz, 28,8% de residuos de extracción de soya 4.4 g/kg P total; 1.9g/kg P no de fitato; 5.5 g/kg Ca; fitasa nativa: 90 PPU/kg. Los parámetros medidos incluyen digestibilidad de fosfato y de calcio. Retención y Excreción de fosfato: Los resultados muestran que con todas las cantidades suministradas de fitasa ((125; 250; 500 y 750 PPU/kg de forraje) la digestibilidad de fosfato se elevo significantemente de 42,5% en el control negativo a 59.3, 65.3, 65.0 o 66.3% (p<0,05) . Esto condujo a una reducción significante de la eliminación fecal de fosfato de 203 mg/ kg 0.75/d medio en el grupo de control 142, 120, 121 y 116 mg/kg 0,75/d en los grupos de tratamiento con forraje enriquecido con los grupos de tratamiento (p<0,05) . La retención de fosfato se mejora significantemente de 152 mg kg"1 0,75/d medido en el control negativo, a 212, 233, 231 y 236 mg/kg 0,75/d en los grupos de tratamiento en los grupos de tratamiento con forraje enriquecido con fitasa (p<0,05) . Las diferencias entre los tratamientos con fitasa fueron significantes entre la dosis más baja (125 PPU/kg de forraje) y todas las demás administraciones (p<0.05). Retención y Excreción de calcio: La adición de fitasa de acuerdo con la invención en comparación con el grupo de control (p<0.05) elevo significantemente el aprovechamiento del calcio 12.1, 14.3, 15.2 y 14.6%. La eliminación de calcio a través de la orina es relativamente alta (114 mg/kg 0,75/d) en el control negativo que se asume al bajo contenido de P en el forraje. En los grupos de tratamiento de fitasa se redujo la eliminación a través de la orina a 108, 118, 95 y 88 mg/kg1 0,75/d, lo que comparado con el control negativo para la cantidad de administración más alta (750 PPU/kg, p<0.05). La retención de calcio medida en el control negativo mejor significantemente a través de todos los tratamientos de fitasa de 181 mg/kg 0.75/d a 240, 245, 266 y 270 mg/kg 0,75/d (p<0,05). Las diferencias entre las cantidades suministradas de fitasa fueron significantes (p<0.05 entre las dosis superiores (500 y 750 PPE/kg de forraje) en comparación con las dosificaciones menores (125 y 250 PPU/kg) . Los resultados muestran que la fitasa de acuerdo con la invención tuvo un efecto sobre la degradación de fitato en el tracto digestivo de los cerdos . Ya en cantidades pequeñas de la fitasa de acuerdo con la invención pudieron promover la digestibilidad y retención de calcio y fosfato en un rango similar a las cantidades mayores . Ejemplo 8: Mejora la de disponibilidad de fosfato por medio de la fitasa de acuerdo con la invención (Mutante Tyr ) en pollos de crianza Una prueba de digestión se realizo con pollos de crianza en 2 periodos de recolección. Se realizo un periodo de recolección de 4 días después de un periodo de ajuste en las jaulas de igualmente 4 días. Los periodos de recolección se realizaron al final de la fase de inicio y al final de la fase de crecimiento. Una ración con un contenido reducido de fosfato digerido a base de residuos de extracción de maíz y soya se utilizo como control negativo y con las fitasas de acuerdo con la invención en cantidades de 125 y 250 PPU/kg de forraje. Adicionalmente se probó un tratamiento con el contenido de fosfato recomendado sin la adición de fitato. En total se dividieron 24 pollos macho en 4 grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento consistieron de 6 pollos para cada periodo de recolección. Los tratamientos fueron de la siguiente forma: Controles negativos1 (NC) NC + Fitasa (125 PPU/kg) NC + Fitasa (250 PPU/kg) Controles positivos2 1 Forraje: 53.3-56.5% de harina de maíz, 37.9-34.5% de residuos de extracción de soya; 4.4-4.7 g/kg P total; 2.0 g/kg P no de fitato; 6.4-5.9 g/kg Ca; 2 Forraje: 50.4-54.3% de harina de maíz, 35.9-35.0% de residuos de extracción de soya; 7.4-6.4 g/kg P total; 4.5-3.5 g/kg P no de fitato; 9.8-7.8 g/kg Ca Los parámetros medidos abarcan la eliminación de fosfato y la retención de fosfato. Los resultados muestran, que ambas cantidades agregadas de fitasa P (125 y 250 PPU/kg forraje) que aumentan la retención de fosfato y reduce la excreción de fosfato. Las medidas al final de la fase inicial muestran un aumento importante en la retención de fosfato de 58.7% en el control negativo a 64.2 y 63.9% para los tratamientos con fitasa (p<0.05) . Esto conduce a una reducción de la eliminación de fosfato por los pollos de crianza, que habían recibido fitasa, que en comparación con los controles negativos se redujeron en 11.4 y 12.7% (tendencia) . Las mediciones al final de la fase de crecimiento muestran igualmente un aumento de la retención de fosfato de 54.7% en el control negativo a 58.2 y 58.9% para el tratamiento de fitasa (tendencia) . Esto conduce a una reducción de la excreción de fosfato en el caso de pollos de crianza que habían recibido fitasa, que en comparación con los controles negativos se habían reducido significantemente en aproximadamente 11% y 12.7% (p<0.05). Ejemplo 9: Prueba de horneado: Pan vienes Se horneo pan vienes a partir de piezas de masa de 320 g obtenida al mezclar de 1000 g de harina de trigo (Pfalzer Muhlenwerke, Mannheim, tipo 550=, 30 g levadura comprimida (Fala GmbH, Alemania), 20 g de sal, 50 mg de ácido ascórbico y 580 g de agua. Después de mezclar durante 2 minutos todos los ingredientes a una baja velocidad y mezclar 6 minutos a una alta velocidad (mezclador Diosna SP12) la masa tenía una temperatura de 27° C y se dejo reposar durante 10 minutos a una temperatura ambiente (22° C) cubierta con un trapo. Después del primer reposo de la masa se dividió la masa en piezas de 320 g cada una (+ 1 g de tolerancia) y se le dio forma redonda. Después siguió un segundo reposo de la masa durante 20 minutos. Después del segundo reposo de el asa la masa se formo en un dispositivo mecánico y se coloco sobre una lamina de fermentación cubierta con un trapo. La masa del pan se fermentó entonces a 32° C bajo una humedad relativa del 85% (subsecuente maduración) y se hornea después de un tiempo de maduración de 70 minutos. La mezcla/el pan se horneo en un horno e varias capas (Winkler & achtel, Alemania) con una inyección de vapor de 5 segundos durante 35 minutos a 235° C. Los diferentes efectos de la fitasa de acuerdo con la invención (mutante Tyr200 de fitasa de E . col i) en los experimentos de horneado se realizaron en paralelo con una masa de control sin adición de fitasa. El volumen de los panes de control se considero como el 100%. El volumen de las hogazas de pan se determino por medio del método de desplazamiento de semillas de colza. La reología de la masa y las propiedades de la masa se evaluaron sensorialmente por medio de un especialista panadero calificado y el se midió el volumen promedio de tres hogazas por prueba. Los resultados de la prueba de horneado se resumen en la siguiente tabla 4 : Tabla 4 Prueba Unidades por kg de harina 0 110 220 430 870 1730 3460 6930 13860 27715 55430 Masa después de amasar Resistencia 4 4 5 4 5 5 5 5 5 5 6 6 6 Masa después de la fermentación final Volumen 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Estabilidad 4 5 5 5 5 5 5,5 5,5 5,5 Criterios de evaluación: Explicación de los criterios de evaluación: Consistencia: la rigidez de la masa evaluada por medio de un panadero experimentado. Volumen: evaluación visual del volumen de la masa después de la fermentación visual Estabilidad: Prueba de la capacidad de retención de gas por medio de la aplicación de presión sobre la masa después de la fermentación final evaluación de la reducción de volumen. Los anteriores resultados muestran que la fitasa de acuerdo con la invención tiene un efecto estabilizante sobre la masa. La fitasa de acuerdo con la invención presento un efecto estabilizante sobre la masa. Las pruebas de acuerdo con los ejemplos 7 a 9 muestran que el mutante Tyr200 de fitasa de E . col i no se diferencia en su efecto de la fitasa tipo nativo. El mutante Tyr200 de fitasa de E . col i de acuerdo con la invención se caracteriza por la ventaja de una alta actividad en la nata del cultivo en la eficiencia de secreción total o mayor en comparación con el tipo nativo. Ejemplo 10: Construcción del El plasmido pKDa41 contiene el gen de fitasa de E . coli (WT) bajo el control del promotor T . reeseí cbhl y del termmador cbhl . La construcción es comparable con la construcción del plasmido pKDa4, además de que se modificaron las 16 pares de bases corriente arriba del codón de inicio de fitasa, de CCGCGGACTGCGCATC ATG a CCGCGGACTAGGCATC ATG y se localizo el punto de disociación de restricción Pací directamente corriente abajo del codón de paro. Para la construcción del plasmido pKDa41 se amplifico el gen de fitasa de E . col i (WT) del plasmido pKDa4 por medio de PCR. El producto PCR se disocio con Avrll y Pací y se inserto en los puntos de disociación Spel y Pací después del promotor T . reeseí cbhl en el plasrrudo pAB489. El plasmido formado recibió la designación pKDa4] y se mapeo por medio de endonucleasas de restricción y se confirma la secuencia de fitasa por medio de secuenciacion . El cartucho de expresión aislado del plasmido pKDa41 (fragmento Notl) contiene los mismos materiales genéticos, como el plasmido pKDa4. El plasmido pKDa41 se utilizo como material de partida para la producción de diferentes variantes de fitasa asi como referencia en el estudio de la expresión de fitasa en T. reeseí RH3780d. El plasmido pAB489 se obtiene del plasmido pALK487 (WO 94/28117) por medio de la inserción de otros puntos de corte (Speí y Pací) y en el sitio Sacn entre el promotor cbhl y la terminal cbhl obtenidos en pALK487, así como el fragmento EcoRI/Spel del plasmido pALK424 (WO 93/24621) de 4.78 kb de longitud presentada en el ejemplo 2, que contiene el marcador amds y las secuencias cbhl franqueadas 30. La colocación de los elementos es como en pKDa4 y permite una clonación directa de la variante del gen en los puntos de disociación Spel y Pací del sitio de multiclonación después del promotor T . reeseí cbhl . Ejemplo 11: Construcción de plasmido de variantes de fitasa Se construyeron los siguientes plasmidos de variantes de fitasa: pPhy-V200L, pPhy-V200P, pPhy-L207F Para la producción de las variantes de fitasa se realizan mutaciones del gen de fitasa por medio del método PCR análogamente al principio que se describe en Nucleic Acids Research 1989, 17(2), 723-733 y Nucleic Acids Research 1990, 18(6), 1656. La construcción así como la clonación de los plasmidos de la variante de fitasa son idénticas a la producción del plasmido pKDa41 descrito en el ejemplo 10. Las secuencias de las variantes de fitasa se confirman por medio de secuenciación . Ejemplo 12: Transformación de T. reesei RH3780d con pKDa41 o variantes La transformación de T. reeseí RH3780d con los cartuchos de expresión aislados del plasmido pKDa41 del ejemplo 10 y de los plasmidos de variantes de fitasa del ejemplo 11 se realizó análogamente a la transformación de los cartucho de expresión asilados de los plasmidos pKDa2 y pKDa4 (ejemplo 3) . Los cartuchos de expresión de los plasmidos pKDa2, pKDa4, pKDa41 y los plasmidos de variantes de fitasa se aislaron como fragmentos Notl. Ejemplo 13: Producción de fitasa de E . coli por medio de cartuchos de expresión de pKDa41 y variantes de fitasa en matraz agitado. Los transformantes se cosecharon tal como se describe en el ejemplo 4 y las fitasas en los filtrados de cultivo se sometieron a otros exámenes .

Tabla 5: Producción de fitasa de E . coli por medio de transformantes que contienen ya sea cartuchos de expresión pKDa41 o variantes de fitasa.

Claims (21)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Una molécula de ADN recombinamte que después de la expresión en una célula anfitriona procariótica o eucariótica codifica a un polipéptido con actividad de fitasa, la molécula de ADN recombmante contiene una secuencia de ADN seleccionada de a) secuencias de ADN que se obtienen por medio de las variaciones de secuencias fitasa de E . col tipo nativo, en la cual cuando menos uno de los aminoácidos en la zona de la posición 189 a 211 y/o uno de los aminoácidos 137 a 152 están mutado en comparación con la secuencia tipo nativo, b) las secuencias de ADN, que poseen una homología del 70 al 100% a las secuencias de ADN de acuerdo con a) , c) secuencias de ADN que debido a una degeneración del código genético están relacionadas con las secuencias de acuerdo con a) o b) , en donde la molécula de ADN recombmante participa en la expresión en una célula anfitriona adecuada con una elevada actividad de la proteína así codificada en la nata del cultivo.
2. 2. El ADN recombmante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque está mutado cuando menos un aminoácido en la zona de la posición 197 a 209 y/o un aminoácido en la zona de la posición 137 a 152 en comparación con la secuencia de fitasa de E . coli tipo nativo .
3. 3. La molécula de ADN recombmante de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque está mutado cuando menos un aminoácido en la posición 198, 200, 205 y 207 y/o en la posición 144, 145 y 152.
4. 4. La secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por cuando menos una mutación seleccionada del grupo Val 200 — Leu, Val 200 -. He, Val 200 ? Pro, Val 200 ? Tyr, Leu 198 -> He, Val 205 -. Leu, Val 205 -> He, Leu 207 ? Tyr, Leu 207 - Phe y/o el grupo He 144 ? Tyr, Leu 145 ? He, He 152 ? Phe.
5. 5. LA molécula de ADN recombmante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4 , caracterizado porque presenta la secuencia SEQ ID NO: 1.
6. 6. Un polipept do que posee actividad de fitasa y que es codificado por una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5 o que se obtiene por medio de la expresión de una célula anfitriona transformada con la misma molécula.
7. 7. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque posee la secuencia SEQ ID NO: 2.
8. 8. Una construcción de ADN que después de su introducción en una célula anfitpona adecuada controlar tiene la capacidad de controlar la expresión de un gen de fitasa mutado en un anfitrión, caracterizado porque eventualmente contiene un promotor, eventualmente secuencias de señal y marcador, una secuencia de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, una terminal y eventualmente secuencias franqueantes 5' y 3' .
9. 9. La construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque el promotor se trata de promotores de celobiohidrolasa I, de celohiohidrolasa II, de amilasa, de glucoamilasa, de xilasa o de enolasa.
10. 10. La construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia de señal se trata eventualmente de una secuencia modificada de señal de fitasa de Asperfillus niger.
11. 11. Un vector con la capacidad de transformar una célula anfitriona, caracterizado porque el vector contiene una construcción de acuerdo con la reivindicación 8.
12. 12. El vector de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque el plasmido Da2pUC3 se depositó bajo el número de depósito DSM 16396.
13. 13. Una célula anfitriona transformada seleccionada de células de hongos, levaduras, bacterias y mamíferos, caracterizada porque contiene una molécula de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5 y provista con la capacidad de expresar un polipéptido con actividad de fitasa.
14. 14. La célula anfitpona transformada de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizada porque pertenece a la especie Aspergillus, Rhizopus, Tpchoderma, Neurospora, Mucor, Penicillium.
15. 15. Un método para la producción de fitasas caracterizado porque se cultiva una célula anfitriona transformada de acuerdo con la reivindicación 13 o 14 ba o condiciones que son necesarias para la formación de fitasa y la fitasa así producida se aisla.
16. 16. Una composición que incluye un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, eventualmente junto con otros aditivos y/o sustancias activas.
17. 17. Una composición de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizada porque es una composición alimenticia o un forraje.
18. 18. Una composición de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, caracterizada porque la composición es un polvo para hornear.
19. 19. El uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 6 o 7 para la producción de un preparado para mejorar el aprovechamiento del fosfato de la alimentación en animales y humanos.
20. 20. El uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 6 o 7 para mejorar las propiedades reológicas de las masas para producir productos de panadería .
21. 21. Una secuencia de señal de fitasa derivada del gen de Aspergil l us niger con la secuencia SEQ ID NO: 3.