BRPI0516504B1 - polipeptídeo tendo atividade fitase, seu uso, molécula de dna recombinante codificando o mesmo, construção de dna, vetor, célula hospedeira transformada, método para produzir o referido polipeptídeo, bem como composição compreendendo o mesmo - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO TENDO ATIVIDADE DE FITASE E SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO CODIFICANDO O MESMO. A invenção diz respeito a uma molécula de DNA recombinante que, sob expressão em uma célula hospedeira procarjótica ou eucariótica, codifica um polipeptídeo tendo atividade de fitase, em que a molécula de DNA recombinante compreende uma seqüência de DNA selecionada de a) seqüências de DNA que foram obtidas por variações da seqüência de fitase de E. coli do tipo selvagem madura, em que pelo menos um aminoácido na região de posição 189 a 211 e/ou um aminoácido na região de posição 137 a 152 é mutado quando comparado à seqüência do tipo selvagem, b) seqüências de DNA tendo uma homologia de 70 % a 100 % às seqüências de acordo com a), c) seqüências de DNA que estão relacionadas com as seqüências de acordo com a) e b) devido à degeneração do código genético, em que a molécula de DNA recombinante está, sob expressão em uma célula hospedeira adequada, associada a uma atividade aumentada da proteína desse modo codificada no sobrenadante de cultura, como também as proteínas codificadas pela mesma.

Description

A presente invenção refere-se a uma molécula de DNA recombi- nante que codifica um polipeptídeo tendo atividade de fitase, e o polipeptídeo codificado como tal. Especificamente, a invenção refere-se a uma molécula de DNA recombinante que codifica um polipeptídeo tendo atividade de fitase, em que a sequência de DNA foi obtida por uma variação da fitase de E. coli do tipo selvagem madura, em que as posições de aminoácido definidas são modificadas quando comparadas à sequência do tipo selvagem. Além disso, a invenção refere-se a um método para expressar a fitase recombinante como também seu uso em tecnologia de alimento e alimentação.

Ácido fítico ou mioinositol-1,2,3,4,5,6-hexaquisdiidrogenofosfato (abre-viado como hexaquisfosfato de mioinositol) é a fonte principal de inositol e a forma de armazenamento primária de fosfato em semente de planta. Nas sementes de legumes, aproximadamente 70 % do teor de fosfato estão presentes como um sal de potássio, magnésio e de cálcio misturado de ácido fítico. Semente, grãos de cereal e legumes são componentes importantes de preparações de alimento e alimentação, em particular de preparações de alimentação de animais; mas cere-ais e legumes também ganham importância crescente na nutrição humana.

As unidades de fosfato de ácido fítico ligam-se como um complexo de cátions bivalentes e trivalentes como íons de metal, isto é íons fisiologicamen- te importantes para a nutrição como cálcio, íon, zinco e magnésio como também os elementos de traço manganês, cobre e molibdênio. Além deste, ácido fítico também liga proteínas através de interação eletrostática até certo ponto.

Ácido fítico e seus sais, os fitatos, são freqüentemente não me- tabolizados visto que não podem ser absorvidos do trato gastrointestinal, isto é nem os fósforos contidos neles nem os íons de metal quelado nem as proteínas ligadas estão fisiologicamente disponíveis para nutrição.

Como fósforo é um elemento essencial para o crescimento de todos os organismos, alimento e alimentação têm que ser suplementados com fosfato inorgânico. Os íons essenciais fisioiogicamente para nutrição como ferro e cálcio muito freqüentemente têm que ser suplementados tam- bém.Além disso, o valor fisiológico de nutrição de qualquer dieta é reduzido visto que as proteínas estão ligadas através de ácido fítico. Por conseguinte, ácido fítico é freqüentemente denotado como um fator contrário ao valor nutricional ("Anti-Nãhrwertfaktor").

Além disso, os fósforos do fitato são excretados por meio do tra- to gastrointestinal dos animais devido a uma falta de metabolismo, que leva à poluição de fosfato indesejada do ambiente que pode, por exemplo, levar à eutroficação das águas e ao crescimento excessivo de algas.

Ácido fítico ou fitatos (no seguinte, estes termos são usados como sinônimos exceto do contrário indicado) podem ser degradados através de fitases. Semente de planta contendo ácido fítico contém enzimas de fita- ses endógenas. Sob sua ingestão, os fitatos em alimento e alimentação são teoricamente hidrolisáveis pelas fitases de plantas endógenas, pelas fitases da flora intestinal e pelas fitases da mucosa intestinal. Em prática, porém, o potencial de hidrólise das fitases de plantas endógenas e das fitases que ocorrem no intestino, se presentes, é sem dúvida insuficiente para assegurar significativamente a biodisponibilidade da ligação fosforosa nos fitatos. Desse modo, fitases exógenas são freqüentemente adicionadas ao alimento e alimentação.

Fitases podem ser produzidas através de plantas como também —através de microorganismos. Entre os microorganismos, bactérias produto- ras de fitase como também fungos e leveduras produtores de fitase são conhecidos.

Os produtores de fitase de ocorrência natural têm, porém, a desvantagem que a fitase é apenas formada em certas quantidades e com pro- priedades definidas.Como explicado acima, existe, porém, uma necessidade aumentada por fitase, especificamente para indústrias de alimento e alimentação.

Um objetivo da presente invenção é, desse modo, fornecer um polipeptídeo tendo atividade de fitase, que possa ser produzido economicamente.Especificamente, será possível produzir a fitase em custo eficaz. A fitase deve também manter as propriedades essenciais da fitase de É coli 5 do tipo selvagem natural, mas deverá se distinguir por uma atividade aumentada no sobrenadante de cultura e uma segregabilidade melhorada, respec-tivamente. Especificamente, a habilidade para melhorar a disponibilidade de fosfato in vivo e in vitro como também a adequabilidade de um auxiliar de assadura contam com as propriedades essenciais da fitase do tipo selvagem 10 natural.

Um outro objetivo da presente invenção é fornecer um gene para um polipeptídeo tendo atividade de fitase que, sob expressão em uma célula hospedeira, resulta em uma atividade aumentada da proteína assim codificada no sobrenadante de cultura e uma secreção aumentada do polipeptí- 15 deo, respectivamente. Será possível produzir o polipeptídeo de forma econômica e em custo eficaz. Especificamente, a expressão do polipeptídeo resultará em rendimentos aumentados em microorganismos eucarióticos comparado à expressão da fitase do tipo selvagem. Além disso, as sequências de DNA que codificam o polipeptídeo, construtos de DNA corresponden- 20 tes e vetores, como também uma fonte para a enzima recombinante sendo adequada para o uso comercial para alimento e alimentação e em processos industriais, e composições contendo a enzima de acordo com a invenção, serão fornecidos.

Foi agora surpreendentemente descoberto que uma mutação na 25 região do aminoácido inclusivo 189 ao 211 inclusivo e/ou da posição inclusi- va do aminoácido 137 ao 152 inclusivo da fitase de E. colido tipo selvagem resulta em uma atividade aumentada no sobrenadante de cultura inteira pela proteína fitase sem afetar os efeitos benéficos e propriedades essenciais da fitase de E. colido tipo selvagem.

Várias fitases de E. coli são descritas em literatura, por exemplo em Dassa et al., 1990, J., Bacteriol. 172:5997-5500 (no. de acesso M58708). Mutantes geneticamente modificados da fitase de E. coli que resultam em uma estabilidade térmica aumentada e/ou atividades específicas mais altas foram também descritos (Rodriguez et al., 2000, Arch. Biochem. Biophys., 382: 105112, Lanahan et al., 2003, Pedido de Patente US 2003 0157646 A1, WO 01/90333). Uma mutagênese sítio-específica de fitase Escherichia coli com propriedades enzimáticas melhoradas é também descrita em WO 01/36607. Porém, o mutante Val-Tyr na posição 200 descrito aqui não corresponde à mutação na posição 200 de acordo com a invenção, visto que outro modo de contar a seqüência foi usado de acordo com WO 01/36607, isto é a seqüência líder foi incluída na contagem. Desse modo, posição 222 na seqüência de acordo com a dita publicação (WO 01/36607) corresponde à posição 200 da contagem de acordo com a invenção. Outras proteínas tendo atividade de fitase são descritas em WO 99/08539, WO 01/90333, WO 02/095003, WO 03/038035, WO 03/038111, WO 04/015084 e WO 00/71728.

Além disso, a publicação Garrett et al., Applied Environ. Microbi- ol., 2004, 70 (5), 3041-3046 descreve mutantes da fitase de E. coli tendo estabilidade térmica e gastrointestinal aumentada.

Porém, a técnica anterior não contém uma descrição de mutações na fitase de E. coli que resulta em uma produção aumentada de uma enzima procariótica sob expressão por um microorganismo eucariótico. Além 20 disso, a técnica anterior não contém indicações sobre como alcançar uma atividade aumentada de tais enzimas produzidas no sobrenadante de cultura por uma variação e especificamente uma mutação da fitase de E. coli. Espe-cificamente, a técnica anterior não contém uma indicação sobre a significação funcional das posições 198 a 211 e/ou das posições 137 a 152 da se- qüêmarxte^fiteserde-ÊTTOífaic^^ anterior não contém uma indicação sobre a significação funcional de posição 200 da seqüência de fitase de E. colido tipo selvagem.

Este objetivo é solucionado por uma molécula de DNA recombi- nante que, em expressão em uma célula hospedeira procariótica ou eucarió- 30 tica, codifica um polipeptídeo tendo atividade de fitase, em que a molécula de DNA recombinante compreende uma seqüência de DNA selecionada de a) seqüências de DNA que foram obtidas por variações da seqüência de fi- tase de E. colido tipo selvagem madura, em que pelo menos um aminoácido na região de posição 189 a 211 e/ou um aminoácido na região de posição 137 a 152 é mutado quando comparado à sequência do tipo selvagem, b) seqüências de DNÀ tendo uma homologia de 70 % a 100 % às seqüências 5 de acordo com a), c) seqüências de DNA que estão relacionadas às seqüências de acordo com a) e b) devido à degeneração do código genético, em que a molécula de DNA recombinante está, sob expressão em uma célula hospedeira adequada, associada a uma atividade aumentada da proteína assim codificada no sobrenadante de cultura, como também por um polipep- 10 tídeo tendo atividade de fitase e sendo codificado por uma das ditas moléculas de DNA recombinantes.

A invenção também refere-se a um método para produzir um polipeptídeo tendo atividade de fitase de acordo com as técnicas recombinantes, compreendendo cultivar células hospedeiras procarióticas e/ou eu- 15 carióticas contendo uma sequência de ácido nucléico de acordo com a invenção, sob condições condutivas para a expressão da enzima como também a recuperação subseqüente da enzima. A invenção, além disso, refere- se ao uso do dito polipeptídeo tendo atividade de fitase em métodos convencionais, por exemplo, em métodos que liberam minerais de complexos de 20 fitato em materiais de planta em in vitro, por exemplo, no tratamento de alimentação, ou seu uso na assadura in vivo, isto é a administração do polipeptídeo tendo atividade de fitase a animais. Além disso, a invenção refere-se ao uso das seqüências de polinucieotídeos de acordo com a invenção para produzir sondas para encontrar seqüências similares, que codificam enzimas

Além disso, a invenção refere-se a uma seqüência sinal derivada do gene da fitase de Aspergillus niger. As figuras inclusas ilustram a invenção em mais detalhes: Figura 1: SDS-PAGE dos sobrenadantes de cultura de cepas transformadas com plasmídeos pKDa2 e pKDa4. Rotas 1 e 6 contêm proteínas marcadoras. A descrição específica está contida no exemplo 6 e tabela 3. Figura 2:mapa de plasmídeo de pKDa2 (mutante de Tyr200) Figura 3:mapa de plasmídeo de pKDa9 (tipo selvagem) Figura 4:mapa de plasmídeo de Da2pUC3 Figura 5: seqüência de DNA codificando a fitase de E coli do tipo selvagem (uso de códon de E coli) Dassa et al., 1990, J. Bacteriol. 172: 5497-5500, no. de acesso: M58704), proteína madura.

O plasmídeo Da2pUC3 foi depositado sob número de acesso DSM 16396 no dia 7 de maio de 2004 no Deutschen Sammlung von Mikro- 10 organismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig de acordo com as provisões do Tratado de Budapeste.

Foi surpreendentemente descoberto que mutação de aminoácido na região de posição 198 a 211 (incluindo os valores-limites) e/ou uma mutação de aminoácido na região de posição 137 a 152 (incluindo os valo- 15 res-limite) da seqüência de fitase de £ colido tipo selvagem está associada a uma atividade significativamente aumentada no sobrenadante de cultura sob expressão em uma célula hospedeira. Preferivelmente, pelo menos um aminoácido na região de posição 197 a 209 (incluindo os valores-limite) e/ou um aminoácido na região de posição 137 a 152 (incluindo os valores-limites) é mutado quando comparado à seqüência do tipo selvagem. Mais preferivelmente, pelo menos um aminoácido na posição 198, 200, 205 e 207 e/ou na posição 144, 145 e 152 é mutado. Mutações preferidas na região de posição 189 a 211 são Vai 200 -> Leu, Vai 200 lie, Vai 200 -► Pro, Vai 200 —> Tyr, Leu 198 -> lie, Vai 205Leu, Vai 205 —> He, Leu 207—> Tyr, Leu 207 —> Phe e na região de posição 137 a 152 lie 144 Tyr, Leu 145 —> He,

He 152 Phe.Outras mutações preferidas são Vai 200 Leu, Vai 200 Pro, Vai 200 Tyr e He 144 —> Tyr. É especialmente preferido que uma mutação esteja presente na posição Vai 200. Este aminoácido é preferivelmente substituído por um aminoácido aromático como tirosina, por um aminoáci- do hidrofóbico como leucina ou isoleucina ou através de prolina. Preferivelmente, a mutação na posição 200 é Tyr. Além disso, também mutantes duplos podem ser gerados com a condição que mutação lie 144 Tyr não seja associada a uma mutação de Vai 200, como também com a outra condição que mutação lie 152 -> Phe não seja combinada com qualquer mutação de Leu 207. Um mutante duplo preferido é Leu 198 -> lie em combinação com Leu 145 He. Sem estar preso pélã explanação teórica a seguir, e 5 esperado que alterações em duas regiões de estrutura espaçadamente adjacentes da fitase, isto é uma folha p e a hélice a seja um resultado da modificação de acordo com a invenção, e que estas regiões sejam desse modo, alteradas através de interação hidrofóbica para resultar em uma densidade de empacotamento melhor. A densidade de empacotamento por sua vez 10 resulta em uma atividade aumentada no sobrenadante de cultura e secreção de uma dessas enzimas modificadas, respectivamente. Dentro do escopo da condição acima, qualquer mutação pode ser feita e combinada nas ditas regiões contanto que um microorganismo transformado com uma seqüência de DNA correspondente segregue da célula a fitase codificada em quantida- 15 des aumentadas e, respectivamente, com a propriedade de resultar em atividade aumentada (atividade total) no sobrenadante de cultura, em que a atividade enzimática e outras as propriedades fisiológicas da fitase de E. coli do tipo selvagem são mantidas. Preferivelmente, a melhoria da atividade no sobrenadante de cultura e da eficiência de secreção de um mutante, respec- 20 tivamente, é de pelo menos 10 %, mais preferido pelo menos 20 %, quando comparado à fitase de E. coli do tipo selvagem em medição sob condições idênticas. A determinação da atividade enzimática da fitase e a medição de outras propriedades fisiológicas da fitase podem ser realizadas de acordo com métodos conhecidos per se.

A obtenção de um aumento da atividade no sobrenadante de cultura e da eficiência de secreção da fitase, respectivamente, em pelo menos 10 % quando comparado à eficiência de secreção da fitase do tipo selvagem foi surpreendente e não foi óbvio. Foi em particular surpreendente que o mutante Vai 200 Tyr estivesse associado a um aumento da eficiên- 30 cia de secreção em 100 % quando comparado à fitase do tipo selvagem (cf. exemplo 4).

Tentativas para melhorar as propriedades da fitase na técnica anterior são relatadas. Desse modo, a publicação Archives Biochem. Bio- phys., 2000, 382 (1), 105-122 descreve as atividades da fitase no sobrena- dante de cultura sob secreção pela levedura Pichia Pastoris na página 109, tabela 3. A fitase de E. colido tipo selvagem (que hão é precisamente de seqüência idêntica à sequência pKDa4 de acordo com a invenção) foi segregada a 117 ml'1 de unidades após 96 horas. É para ser observado que a determinação da atividade de acordo com a dita publicação não é idêntica à determinação da atividade de acordo com exemplo 4 da presente invenção. De acordo com a técnica anterior na publicação mencionada acima, o subs- trato é incubado com a enzima em pH 2,5. De acordo com a invenção, a incubação é realizada em pH 5,0. Como pode ser considerado das curvas na página 109, figura 3 da publicação, 117 U ml'1 em pH 2,5 corresponderiam aproximadamente a apenas 60 U ml'1 em pH 5 (52 % de atividade residual). Desse modo, a atividade enzimática da fitase de E coli do tipo selvagem segregada, codificada pelo uso de códon do tipo selvagem de E coli, na dita publicação é substancialmente menor que a atividade da enzima segregada de 158 a 188 U ml"1 obtida com a cepa de T. reesei transformada de pKDa4.

A seqüência de DNA que corresponde à seqüência de fitase mu- tada de acordo com a invenção pode ser realizada usando qualquer uso de 20 códon desde que o nível de secreção não seja afetado adversamente pelo uso de códon. Desse modo, por exemplo, a idade de códon do micro- organismo usado para expressão pode ser usada mas também o uso de códon de £ coli e uma variação deste, respectivamente, podem ser usados. Além disso, a seqüência de fitase de E coli mutada de acordo com a inven- ção pode conter também variações de seqüência. Assim, quaisquer variações podem ser feitas além das mutações descritas acima, contanto que a propriedade de alcançar uma atividade mais alta no sobrenadante de cultura e eficiência de secreção, respectivamente, não seja adversamente afetada e contanto que a atividade enzimática e outras propriedades essenciais da fitase do tipo selvagem de E coli sejam mantidas.

Variações correspondentes são bem-conhecidas por uma pessoa versada na técnica de DNA recombinante e compreendem as mutações acima como também as variações exemplares expostas abaixo.

De acordo com a invenção, adição e/ou deleção de moléculas do polipeptídeo modificadas de acordo com a invenção pode(m) ser usa- da(s). Desse modo, o polipeptídeo modificado de acordo com a invenção tendo uma atividade de fitase pode ser alongado adicionando sequências adicionais às extremidades N-terminal e/ou C-terminal. Assim, moléculas híbridas podem ser criadas tendo outras propriedades vantajosas. Por e- xemplo, proteínas de fusão e proteínas que são nativamente segregadas em altas quantidades, respectivamente, podem ser adicionadas por meio das quais a eficiência de secreção é também melhorada. Além disso, segmentos de seqüência ativos de outras enzimas podem ser adicionados para obter enzimas tendo especificidade múltipla. Além disso, seqüências polares e não-polares podem ser adicionadas para especificamente influenciar as propriedades de solubilidade e a capacidade para passar a membrana ("Membrangãngigkeit"), respectivamente, da tal enzima obtida. Preferivelmente, a extremidade N-terminal é ligada a uma fitase de Aspergillus ou uma fosfatase de ácido. Alongamentos do término C da seqüência de fitase de E. coli mutada podem ser feitos da mesma maneira. Assim, fitases tendo uma estrutura quaternária alterada podem ser obtidas.

De acordo com a invenção, também segmentos de seqüência do polipeptídeo tendo atividade de fitase podem ser deletados contanto que a propriedade da secreção aumentada e a atividade no sobrenadante de cultura, respectivamente, em que a atividade de fitase é mantida, não sejam afetadas.

As mutações, alongamentos e mutilações podem ser realizadas por métodos conhecidos per se na técnica anterior.

As modificações do polipeptídeo tendo atividade de fitase levadas em conta correspondem às respectivas mutações e modificações, respectivamente, da molécula de DNA correspondente. De acordo com a invenção, também tais seqüências hibridando sob condições relaxadas ou rigorosas com as seqüências de acordo com a invenção são levadas em conta. Além disso, a invenção também se refere a tais seqüências que exibem uma homologia de pelo menos 70 %, mais preferido de pelo menos 90 % e em particular pelo menos 95 % em relação à seqüência de nucleotídeo reivindicada e suas partes reivindicadas, respectivamente, contanto que as respectivas seqüências resultem em um aumento da atividade no sobrenadante de cultura e a eficiência de secreção, respectivamente, do polipeptídeo tendo atividade de fitase codificada por ele. Preferivelmente, a homologia é de 70 a 100 por cento. O grau de identidade é assim preferivelmente determinado, de forma que o número de resíduos da seqüência mais curta participando na comparação e tendo uma contraparte "correspondente" na outra seqüência é determinado. Para o propósito da presente invenção, a homologia é assim preferivelmente determinada como sempre usando os algoritmos usuais. De acordo com a invenção, apenas os cDNAs das proteínas maduras respectivas são levados em consideração para comparação. Similarmente, preferivelmente as contra partes de seqüência idênticas foram determinadas de acordo com a invenção como seqüências homólogas usando programas de computação conhecidos. Um exemplo para um tal programa é o programa Clone Manager Suite contendo a parte de programa Align Plus e sendo distribuído por Scientific & Educational Software, Durham, NC, EUA. Assim, uma comparação de duas seqüências de DNA como definidas acima é reali- zada usando o alinhamento local opcional ou de acordo com o método FastScan - MaxScore ou de acordo com o método Needleman-Wunsch e retendo os valores predefinidos. Especificamente, a versão de programa "Clone Manager 7 Align Plus 5" com as funções "Compare Two Sequen- ces/Local Fast Scan-Max Score/Compare DNA sequences" foi aplicado de acordo com a invenção para calcular a homologia. Assim, os algoritmos-acessíveis das fontes a seguir foram usados: Hirschberg, D. S. 1975. A liner space algorithm for computin longest commom subsequences. Commun Assoc Comput Mach 18: 341-343; Myers, E. W. e W. Miller. 1988. Optimal a- lignments in linear space. CABIOS 4:1, 11-17; Chao, K-M, W. R. Pearson e W. Miller. 1992. Aligning two sequences within a specified diagonal band. CABIOS 8:5, 481-487. Além disso, a invenção refere-se também às seqüências de DNA que estão relacionadas às seqüências de acordo com a inven- ção devido à degeneração do código genético como também variantes aléli- cas destes. A degeneração do código genético pode assim resultar devido à degeneração natural ou devido a um uso de códon especificamente selecionado. Variantes alélicas de ocorrência natural podem ser identificadas usan- 5 do técnicas bem-conhecidas de biologia molecular, como a reação em cadeia de polimerase (PCR) e técnicas de hibridação.

Uma seqüência de DNA que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção pode ser usada para transformar quaisquer células hospedeiras como células de fungos, leveduras, bactérias, plantas ou de mamífe- 10 ros. Desse modo, células transformadas se distinguem por uma secreção aumentada da fitase.A enzima de fitase assim produzida também resulta em uma liberação de fosfato eficiente dos fosfatos de mioinositol.

Os termos proteína, peptídeo e polipeptídeo são para ser usados alternadamente.Um polipeptídeo ou enzima tendo atividade de fitase ou 15 uma fitase deverá designar qualquer enzima sendo capaz de causar a liberação de fosfato inorgânico de vários fosfatos de mioinositol. Exemplos para tais substratos de fosfato de mioinositol (fitase) são ácido fítico e quaisquer sais deste, por exemplo, fitato de sódio ou fitato de potássio ou sais misturados. Quaisquer isômeros posicionais dos di-, tri-, tetra- ou pentafosfatos de mioinositol podem também servir como substrato de fitase. A atividade de fitase pode ser determinada usando qualquer ensaio em que um dos ditos substratos é usado. A variante de fitase de acordo com a invenção compreende variantes de polipeptídeo que derivam de uma fitase específica por deleção ou adição de um ou mais aminoácidos na extremidade N-terminal e/ou C-terminal da proteína nativa, deteção ou adição de um ou mais amino- ácidos em uma ou mais posições na proteína nativa, ou substituição de um ou mais aminoácidos em uma ou mais posições na fitase. A geração de tais variantes é comumente conhecida na técnica. Por exemplo, variantes de seqüência de aminoácido dos polipeptídeos podem ser feitas através de mu- tação no DNA. Métodos para mutagênese e alteração de seqüência de nu- cleotídeo são bem-conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488 (1985), Kunkel et al., Methods in Enzymol., 154:.367 (1987), Patente U. S. no.: 4.873.192, Walker e Gaastra, eds., Techniques in Molecular Biology, Mac Milian Publishing Company, Nova Iorque, (1983). Indicações em substituições de aminoácido adequadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse são encontradas no mode- lo de Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, Natl. Blamed. Res. Found., Washington, D. C. (1987). Substituição conservadora como a permuta de um aminoácido por outro aminoácido tendo propriedades similares é preferida.

A invenção também se refere às composições de ácido nucléico ou de proteína isolados ou substancialmente purificadas.Nelas, um polinu- cleotídeo/polipeptídeo purificado ou isolado e segmento destes, respectivamente, designam um polinucleotídeo e polipeptídeo e segmento destes, respectivamente, os quais estão presentes em uma forma isolada de seu ambiente nativo. Um segmento de ácido polinucléico ou polipeptídeo isolado po- de estar presente em uma forma purificada ou pode estar presente em um ambiente não nativo, como, por exemplo, uma célula hospedeira transgênica. Por exemplo, um segmento de polinucleotídeo ou proteína isolados ou purificados ou uma parte biologicamente ativa destes é essencialmente livre de outro material celular ou meio de cultura sob produção de acordo com técni- cas recombinantes ou é essencialmente livre de precursores químicos ou outros compostos químicos. Preferivelmente, um polinucleotídeo isolado está livre de seqüências (preferivelmente, seqüências de codificação de proteínas) naturalmente flanqueando o ácido nucléico (isto é seqüências localizadas nas extremidades 5' - e 31- do ácido nucléico) no DNA genômico do or- ganismo do qual o ácido nucléico é derivado. De acordo com modalidades diferentes, a molécula de ácido nucléico isolada pode, por exemplo, conter menos que aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de seqüências de nucleotídeo naturalmente flanqueando a molécula de ácido nucléico no DNA genômico da célula da qual o ácido nucléico deriva. Uma proteína que é essencialmente livre de material celular compreende composições de proteína ou polipeptídeo tendo menos que aproximadamente 70 %, 50 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % (em base do peso seco) de proteína de con- taminação. Quando a proteína de acordo com a invenção ou um fragmento biologicamente ativo desta for produzido recombinantemente, o meio de cultura preferivelmente compreende menos que aproximadamente 70 %, 50 %, 30 %, 20 %, 10 % ou 5 % (em base do peso seco) de precursores químicos ou substâncias químicas não-proteináceas. Fragmentos e variantes das seqüências de nucleotídeo de acordo com as invenções ou proteínas ou segmentos de proteína codificados por eles estão também dentro do escopo da invenção. Um fragmento designa uma parte da seqüência de nucleotídeo ou uma parte da seqüência de aminoácido e, desse modo, uma parte do polipeptídeo ou proteína, que é codificada por ele.

A invenção também se refere aos cassetes de expressão que podem ser usados para a transferência ("Einschleusung") de uma estrutura de leitura aberta que codifica uma fitase de acordo com a invenção em uma célula hospedeira. Eles preferivelmente compreendem uma região de iniciação de transcrição que é ligada à estrutura de leitura aberta. Um tal cassete de expressão pode conter uma pluralidade de sítios de restrição para inserir a estrutura de leitura aberta e/ou outros DNAs, por exemplo uma região reguladora de transcrição e/ou genes marcadores selecionáveis. O cassete de transcrição compreende na direção de 5’3' da transcrição uma região de iniciação de transcrição e de translação, a seqüência de DNA de interesse e uma região de terminação de transcrição e de translação, que é funcional em uma célula microbiana. A região de terminação pode ser nativa vis-à-vis à região de iniciação de transcrição, pode ser nativa vis-à-vis à seqüência de DNA de interesse ou pode derivar de qualquer outra fonte.

O termo "estrutura de leitura aberta" (ORF) designa a seqüência de aminoácido que é codificada entre os códons de começo e de interrupção de translação como uma seqüência de codificação. Os termos "códon de começo" e "códon de parada" designam uma unidade de três nucleotídeos contíguos (códons) em uma seqüência de codificação, que especifica o começo e a parada da cadeia da síntese de proteína (translação de mRNA). "Ligação operável" designa em conexão a um ácido nucléico uma ligação como uma parte da mesma molécula de ácido nucléico em um posicionamento e orientação apropriados para o começo transcripcional do promotor. DNA operavelmente ligado a um promotor está sob controle da regulação de iniciação de transcrição do promotor. Seqüências de codificação podem ser operavelmente ligadas com a seqüência reguladora em ori- 5 entação sentido ou anti-sentido. Com referência aos polipeptídeos, ligação operável significa a ligação como uma parte do mesmo polipeptídeo, isto é por meio de ligações de peptidila.

Quaisquer promotores podem ser usados de acordo com a invenção. Um promotor designa a seqüência de nucleotídeo, que está usual- 10 mente a montante (51) vis-à-vis à seqüência de codificação, e controla a expressão da seqüência de codificação fornecendo o reconhecimento para a RNA polimerase e outros fatores, que são necessários para uma transcrição correta. O promotor usado de acordo com a invenção pode compreender um promotor mínimo, isto é uma seqüência de DNA curta de uma caixa de TA- 15 TA e outras seqüências, que especificam o sítio de iniciação de transcrição, que são ligados aos elementos reguladores para controlar a expressão.

O promotor de acordo com a invenção pode também compreender uma seqüência de nucleotídeo que compreende um promotor mínimo e elementos reguladores, que é capaz de controlar a expressão de uma se- 20 qüência de codificação ou um RNA funcional. Este tipo de seqüência de promotor consiste em elementos a montante proximais e distais, em que os elementos posteriores são freqüentemente designados como intensificado- res. Por conseguinte, um intensificador é uma seqüência de DNA que pode estimular a atividade de promotor e pode ser um elemento intrínseco do 25 promotor ou um elemento heterólogo inserido para aumentar o nível de expressão ou especificidade de tecido de um promotor. Ele pode funcionar em ambas as orientações e pode até mesmo funcionar em um local a montante ou a jusante do promotor. Intensificadores como também outros elementos promotores a montante ligam as proteínas de ligação de DNA específicas da 30 seqüência que medeiam seus efeitos. Promotores podem ser derivados de um gene nativo em sua entidade ou podem ser compostos de elementos diferentes, que derivam de promotores de ocorrência natural diferentes ou podem até mesmo ser compostos de segmentos de DNA sintéticos. Um promotor pode também conter seqüências de DNA que estão envolvidas na ligação de fatores de proteína que controlam a eficiência da iniciação de transcrição como uma resposta às condições fisiológicas ou condições atrr- 5 buíveis ao desenvolvimento.

Elementos promotores, em particular elementos de TATA que são inativos ou têm uma atividade de promotor fortemente reduzida na ausência de uma ativação a montante são designadas como promotores mínimos ou promotores centrais. Na presença de um fator de transcrição apro- 10 priado ou de fatores de transcrição apropriados, respectivamente, a função do promotor mínimo resulta na permissão para a transcrição. Desse modo, um promotor mínimo ou central apenas consiste em todos os elementos básicos que são necessários para iniciação de transcrição, por exemplo uma caixa de TATA e/ou um iniciador.

A invenção também se refere aos vetores contendo o DNA de acordo com a invenção. Os ditos vetores compreendem quaisquer plasmí- deos, cosmídeos, fagos e outros vetores bifilamentares ou unifilamentares, de forma linear ou circular, que podem opcionalmente ser autotransmissíveis ou mobilizáveis, e que podem transformar um hospedeiro procariótico ou 20 eucariótico por meio de integração no genoma celular ou que são extra- cromossômicos (por exemplo autonomamente replicando plasmídeos tendo uma origem de replicação).

Vetores, plasmídeos, cosmídeos, cromossomos artificiais de levedura (YACs), cromossomos artificiais bacterianos (BACs) e segmentos de 25—DNA para uso para a transformação de células em geral compreendem o DNA que codifica fitase de acordo com a invenção como também um outro DNA, como cDNA, um gene ou genes, a serem transferidos ou introduzidos, respectivamente, nas células. Os ditos constructos de DNA podem compre-ender ainda estruturas como promotores, intensificadores, poli-ligantes ou 30 também genes reguladores, quando necessário. Um dos segmentos de DNA ou genes selecionados para introdução celular convenientemente codifica uma proteína que é expressa em células transformadas assim obtidas (re- combinantes) e que leva a um traço triável ou selecionável e/ou conversão de um fenótipo melhorado para a célula transformada.

A construção de vetores que podem ser usados de acordo com a invenção é conhecida por uma pessoa versada nã técnica fazendo réfe- 5 rência à descrição acima (cf. por exemplo Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2- edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y. (1989)). O cassete de expressão de acordo com a invenção pode conter um ou mais sítios de restrição para colocar o nucleotídeo de codificação de fitase sob regulação de uma seqüência de regulação. O cas- 10 sete de expressão pode também conter um sinal de terminação operavel- mente ligado ao polinucleotídeo como também seqüências de regulação, que são necessárias para uma translação correta do polinucleotídeo. O cassete de expressão contendo o polinucleotídeo de acordo com a invenção pode ser quimérico, isto é pelo menos um de seus componentes é heterólo- 15 go com relação a pelo menos um dos outros componentes. A expressão do polinucleotídeo no cassete de expressão pode estar sob controle de um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor regulado, um promotor virai ou um promotor sintético.

Os vetores já podem conter elementos reguladores, por exemplo, 20 promotores, ou as seqüências de DNA de acordo com a invenção podem ser manipuladas para conter tais elementos. Elementos promotores adequados que podem ser usados são conhecidos na técnica e são, por exemplo, o promotor de cbh 1 ou de cbh 2 para Tríchoderma ressei, o promotor de amy para Aspergillus oryzae, o promotor de xy1, glaA, alcA, aphA, tpiA, gpdA, 25—sac+ne^kíAnraTa-Asp^^ podem ser usados para expressão em levedura, são conhecidos na técnica e são, por exemplo, o promotor pho5 ou o promotor de gap para expressão em Saccharomyces Cervisiae e para Pichia pastoris, por exemplo promotor de aoxl ou o promotor de fmd ou o promotor de mox para H. polymorpha, DNA adequado para introdução em células pode compreender

DNA derivado ou isolado de qualquer fonte além do DNA de acordo com a invenção. Um exemplo para um DNA derivado é uma seqüência de DNA que foi identificada como um fragmento útil em um dado organismo e que foi depois quimicamente sintetizada em uma forma substancialmente pura. Um exemplo para um tal DNA é uma seqüência de DNA adequada que foi, por exemplo, obtída pelo uso de endonucleases de restrição, de forma que ele possa também ser manipulado de acordo com a invenção, por exemplo, ele possa ser amplificado. Tal DNA é usualmente chamado de um DNA recom- binante.Desse modo, um DNA adequado compreende DNA completamente sintético, DNA semi-sintético, DNA isolado de fontes biológicas e DNA derivado de RNA introduzido. Em geral, o DNA introduzido é nenhum constituin- te original do genótipo do DNA recipiente, mas, de acordo com a invenção, também um gene pode ser isolado de um genótipo dado e pode ser opcionalmente modificado e, subseqüentemente, cópias múltiplas do gene podem ser introduzidas no mesmo genótipo, por exemplo para intensificar a produção de um produto de um gene dado.

O DNA introduzido compreende sem limitação DNA de genes, como, por exemplo, de bactérias, leveduras, fungos ou vírus. O DNA introduzido pode compreender genes modificados ou sintéticos, porções de genes ou genes quiméricos incluindo genes do mesmo genótipo ou de um diferente.

O DNA usado de acordo com a invenção para transformação pode ser circular, linear, bifilamentar ou unifilamentar. Em geral, o DNA está presente em forma de um DNA quimérico, como um DNA de plasmídeo, também contendo regiões flanqueadas pelas seqüências de regulação que ajudam na expressão do DNA recombinante que está presente na célula —transformada. Por exemplo, o próprio DNA pode conter um promotor ou pode consistir neste que é ativo em uma célula e que é derivado de uma fonte que é diferente da dita célula, ou um promotor pode ser usado que já está presente na célula, isto é a célula alvo para transformação.

Em geral, o DNA introduzido é relativamente pequeno, menos que aproximadamente 30 kb para minimizar a suscetibilidade vis-à-vis degradação física, química ou enzimática aumentando com o tamanho do DNA.

A seleção de um vetor de expressão adequado depende das células hospedeiras. Vetores de expressão para levedura ou fungos podem compreender uma origem de replicação, um promotor adequado e intensifi- cador mas também quaisquer sítios de ligação de ribossoma necessários, sít io s d e po I iãdêni lação, sítiõsclõãdõr,,splicè'” é acepto rH spl ice", seqüê ncias de terminação de transcrição e seqüências de flanqueamento de 5' não- transcritas

Exemplos para células hospedeiras adequadas são: células fúngicas do gênero Aspergillus, Rhízopus, Tríchoderma, Neurospora, Mucor, Pencillium, etc como, por exemplo, leveduras do gênero Kluyveromyces,

Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Hansenula, Pichia e similares. Sistemas hospedeiros adequados são, por exemplo, fungos como Aspergilli, por exemplo Aspergillus n/ger(ATCC 9192) ou Aspergillus ficuum (NRLL 3135) ou Tríchoderma (por exemplo Trichoder- ma ressei QM6a) e leveduras como Saccharomyces, por exemplo e Saccha- romyces Cerevisiae ou Pichia, como, por exemplo, Pichia pastoris ou Hansenula, por exemplo H. polymorpha (DSMZ 70277). Tais microorganismos podem ser obtidos de depósitos reconhecidos, por exemplo da American Type Culture Collection (ATCC), o Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) ou o Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) ou quaisquer outros depósitos.

O cassete de expressão pode conter na direção 5‘-3'- transcripcional uma região de transcrição e iniciação de translação do polinucleotídeo de acordo com a invenção e uma região de transcrição e terminação que são funcionais in vivo ou in vitro. A região de terminação pode ser -25—nativa com relação à região de iniciação de transcrição pode ser nativo com respeito ao polinucleotídeo ou pode ser de outra origem. As seqüências reguladoras podem estar localizadas a montante (seqüências de não- codificação de 5') dentro (íntron) ou a jusante (seqüências de não- codificação de 31) de uma seqüência de codificação e podem influenciar a transcrição, o processamento de RNA ou a estabilidade e/ou a translação da seqüência de codificação associada. Seqüências reguladoras podem, sem limitação, compreender intensificadores, promotores, sítios de ligação de repressor, seqüências de líderes de translação, introns ou seqüências sinais de poliadenilação. Elas podem compreender seqüências naturais e sintéticas como também seqüências que são uma combinação de seqüências sintéticas e naturais. 5O vetor usado de acordo com a invenção pode também compre ender seqüências adequadas para amplificar a expressão.

Exemplos para promotores que podem ser usados de acordo com a invenção são os promotores que são conhecidos por controlarem a expressão nas células eucarióticas. Quaisquer promotores tendo a capaci- 10 dade para expressão em fungos filamentosos podem ser usados. Exemplos são um promotor que é fortemente induzido através de amido ou celulose, por exemplo um promotor para glucoamilase ou a-amilase do gênero Aspergillus ou celulase (celobioidrolase) do gênero Trichoderma, um promotor para enzimas na via glicolítica, como cinase de fosfoglicerat (PGK) e gliceralde- 15 ído-3-fosfato desidrogenase (GPD), etc. O promotor de celobioidrolase I, celobioidrolase II, amilase, glucoamilase, xilanase ou de enolase é preferido.

Dois métodos principais para controlar a expressão são conhecidos, isto é sobreexpressão e subexpressão. Sobreexpressão pode ser alcançada mediante inserção de uma ou mais cópias extras do gene selecio- 20 nado. Para subexpressão há dois métodos principais, que são usualmente designados como "sub-regulação anti-sentido" e "sub-regulação sentido" na técnica. Em geral estes métodos são designados como "silenciamento de gene". Ambos destes métodos resultam em uma inibição da expressão do gene alvo. 2-5 tos podem influenciar a expressão de transgenes. Foi especialmente mostrado que os íntrons têm um potencial para intensificar a expressão de transgene. O cassete de expressão pode até mesmo compreender outros elementos, por exemplo, aqueles que podem ser regulados através de ele- 30 mentos endógenos ou exógenos como proteínas de dedo de zinco incluindo proteínas de dedo de zinco de ocorrência natural ou proteínas de dedo de zinco quiméricas.

O cassete de expressão usado de acordo com a invenção pode também conter elementos intensificadores ou elementos promotores a montante.

Vetores para o uso de acordo com a invenção podem ser cons- 5 truídos para obter um elemento intensificador. Os constructos de acordo com a invenção, desse modo, compreendem o gene de interesse junto com uma seqüência de DNA de 31 que age como um sinal para terminar a transcrição e para permitir poliadenilação do mRNA desse modo obtido. Qualquer seqüência sinal que permite secreção do organismo hospedeiro escolhido po- 10 de ser usada. A seqüência sinal preferida é a seqüência sinal de fitase de Aspergillus niger ou seqüências sinais derivadas dela para secreção de fungos filamentosos.

Uma seqüência líder específica pode também ser usada, como a seqüência de DNA entre o sítio de iniciação de transcrição e o começo da 15 seqüência de codificação, isto é a seqüência líder não-transladada pode influenciar a expressão de gene. Seqüências líderes preferidas compreendem seqüências que controlam a ótima expressão do gene ligado, isto é eles compreendem uma seqüência líder de consenso preferida aumentando ou mantendo a estabilidade de mRNA e impedindo uma iniciação de translação 20 indevida. A seleção de tais seqüências é bem-conhecida a uma pessoa versada na técnica.

Um gene marcador selecionável ou triável pode ser introduzido no cassete de expressão para melhorar a possibilidade de identificar os transform antes. Tais genes marcadores são bem-conhecidos por uma pes- 2-5—soa versada na técnica.

O cassete de expressão ou um constructo de vetor contendo o cassete de expressão é introduzido em uma célula hospedeira. Uma pluralidade de técnicas está disponível e são bem-conhecidas por uma pessoa versada na técnica para introduzir constructos na célula hospedeira. A trans- 30 formação de células microbianas pode ser realizada usando polietileno glicol, cloreto de cálcio, infecção virai, DEAE-dextrana, infecções de fago, eletropo- ração e outros métodos conhecidos na técnica. A transformação de fungos pode ser realizada de acordo com Penttila et al., Gene 61:155164, 1987. A introdução de um vetor recombinante em leveduras pode ser realizada de acordo com métodos conhecidos per se incluindo eletroporação, uso de es- feroplastos, acetato de lítio e similares.

Assim que o cassete de expressão e a seqüência de DNA, res pectivamente, de acordo com a invenção são obtidos, eles podem ser inseridos em vetores por métodos conhecidos per se para sobreexpressar o polipeptídeo codificado em sistemas hospedeiros adequados. Porém, seqüências de DNA podem também ser usadas como tal para transformar sistemas 10 hospedeiros adequados da invenção para alcançar sobreexpressão do polipeptídeo codificado.

Assim que uma seqüência de DNA de acordo com a invenção foi expressada em uma célula hospedeira adequada em um meio adequado, a fitase codificada pode ser concentrada e/ou isolada de acordo com métodos 15 conhecidos per se ou do meio, no caso de a fitase ser segregada no meio, ou do organismo hospedeiro, no caso de a fitase estar intracelularmente presente, por exemplo no espaço periplasmático. Métodos conhecidos para separar os componentes insolúveis do meio de cultura e a biomassa seguidos pelos métodos para concentrar a fitase podem ser aplicados para a pro- 20 dução de soluções de fitase concentradas ou como uma preparação para secar a fitase. Por exemplo, métodos de filtração ou métodos de centrifugação podem ser usados para separar os componentes insolúveis, seguidos por métodos de ultrafiltração para concentrar, ou métodos de filtração de fluxo cruzado são aplicados. A secagem pode ser realizada por tentativas de lrofiiização_ouTüiveTizaç^ todos. Métodos conhecidos de purificação de proteína para isolar as fitases podem ser aplicados de acordo com a invenção. Por exemplo, métodos cromatográficos ou gelcromatográficos diferentes podem ser aplicados individualmente ou em combinação. Dependendo da célula hospedeira usada 30 em um método de produção recombinante, a enzima de acordo com a invenção pode ser modificada ou não covalentemente através de glicosilação. Em células eucarióticas, glicosilação das proteínas segregadas serve para modular o dobramento de proteína, a estabilidade conformacional, a estabilidade térmica e a resistência vis-à-vis proteólise. Devido a uma aplicação específica da fitase, uma variante glicosilada da enzima pode ser preferida a uma variante não-glicosilada. Por exemplo, o uso de uma fitase glicosilada 5 em alimentação de animal serve para proteger a enzima contra desnaturação térmica durante a peletização de alimentação ou contra inativação pro- teolítica na passagem através do estômago do animal, por meio da qual a distribuição da enzima ativa no trato intestinal e para o sítio de ação é promovida. Para usos em processamento de alimento, em que a atividade de 10 enzima é apenas desejada durante o processamento e não no produto final, uma fitase que é termo-lábil, isto é não-glicosilada, e suscetível à degradação proteolítica pode ser preferida.

A invenção também se refere às composições de fitase contendo o polipeptídeo de acordo com a invenção. Em geral, as composições de 15 fitase são líquidas ou secas. Composições líquidas contêm a enzima de fitase preferivelmente em uma forma purificada ou enriquecida. Porém, os a- gentes auxiliares como, por exemplo, um estabilizante com glicerol, Sorbitol ou monopropileno glicol, aditivos como sais, açúcar, conservantes, meios para ajustar o valor de pH, proteínas e sais de fitato ou de fosfato de mioino- 20 sitol (um substrato de fitase) podem ser adicionados. Tipicamente composições líquidas são suspensões aquosas ou oleosas ou pastas fluidas, respectivamente. As composições líquidas podem ser adicionadas a um alimento ou alimentadas antes ou seguindo uma possível etapa de peletização ou processamento. Composições secas podem ser composições liofilizadas, 25—secadas por atomização ou extrudadas, que podem exclusivamente conter a enzima. Composições secas podem ser grânulos que podem ser facilmente misturados com alimento ou componentes alimentícios, ou, mais preferivelmente, formar um componente de uma pré-mistura. O tamanho de partícula dos grânulos de enzima é preferível compatível para com os outros compo- 30 nentes da mistura. Isto permite dispositivos seguros e convenientes para incorporar as enzimas, por exemplo, em alimento processado, pré-misturas ou alimentação animal.

Uma formulação estável da enzima de fitase de acordo com a invenção pode, por exemplo, ser produzida pulverizando uma mistura de uma solução de enzima líquida sobre um agente de volume como farinha de feijão de soja moída e depois secando a mistura. A redução de umidade e as interações de ligação da fitase com o agente de volume protegem a enzima das influências ambientais como temperatura extrema, que pode ocorrer durante a produção da alimentação. Formulações secas e líquidas podem ser também estabilizadas quando a atividade das enzimas proteolíticas potenciais for reduzida, que pode estar presente como subprodutos na mistura de fermentação líquida usada para a produção da enzima de acordo com a invenção. A mistura de enzima seca desse modo obtida pode ser usada como um suplemento de alimentação para o uso em procriação avícula e suína. Por exemplo, a adição de 250 unidades de enzima da enzima de acordo com a invenção a 1 kg da dieta de trigo padrão mostra efeitos similares como 500 unidades de enzima de fitase de Aspergillus. Além disso, uma redução da suplementação de fosfato resulta em uma diminuição da poluição de fosfato que por sua vez significativamente reduz a tensão ambiental por procriação animal intensiva.

Assim que uma preparação de enzima seca é obtida, um granu-lado de aglomeração pode ser produzido. Portanto, um misturador de alto cisalhamento é usado, por meio do qual o agente de volume e a enzima co- aglomeram e um grânulo é formado. Grânulos de absorção são produzidos revestindo os núcleos de um material de suporte pela enzima de acordo com a invenção. Materiais de volume típicos são sal como sulfato de dissódio. Outros materiais de volume compreendem caulim, talco, silicato de-alumínio de magnésio e fibras de celulose. Opcionalmente, agentes de ligação como dextrinas são também incorporados nos grânulos de aglomeração.

Materiais de suporte típicos compreendem amido, por exemplo na forma de mandioca, batata, cereais, em particular milho, arroz e trigo ou proteína contendo produtos como por exemplo proteínas de soja. Sais po-dem também ser usados.Opcionalmente, o grânulo é revestido com uma mistura de revestimento. Um tal grânulo compreende agentes de revesti- mento, preferivelmente agentes de revestimento hidrofóbicos, óleo de palma desidrogenado e talco e opcionalmente outros aditivos como carbonato de cálcio ou caulim para melhorar a biodisponibilidade no sítio intencionado de ação.

Adicionalmente, as misturas com fitase podem conter outras substâncias como agentes corantes, aromas, estabilizantes, vitaminas, minerais, outras enzimas de alimento e de alimentação e outras. Isto se refere em particular às assim-chamadas pré-misturas.

Um aditivo de alimento ou de alimentação é um composto es- 10 sencialmente puro ou uma composição de vários compostos que são intencionados ou adequados para adição ao alimento ou alimentação.Especificamente, é uma substância que se torna um componente de um alimento ou uma alimentação de acordo com seu propósito intencionado ou influencia as propriedades de um produto de alimento ou alimentação. Desse modo, um 15 aditivo de fitase designará uma fitase que não é um constituinte natural das substâncias principalmente usadas para alimento e alimentação ou não está presente nele(a) em uma concentração natural. Por exemplo, a fitase é adicionada sozinha à alimentação separadamente das substâncias de alimentação ou em combinação com outros aditivos de alimentação. Uma pré- 20 mistura típica usualmente compreende um ou mais compostos como vitaminas, minerais ou enzimas de fortalecimento alimentício e portadores e/ou excipientes adequados.

Um aditivo de fitase pronto-para-usar é um aditivo que não é produzido in situ na alimentação ou em alimento processado. Um aditivo de 25—fitase pronto-para-usar pode ser administrado diretamente aos seres humanos ou animais ou preferivelmente diretamente após misturar com outros componentes de alimentação ou alimento. Por exemplo, um aditivo de ali-mentação de acordo com este aspecto da presente invenção é combinado com outras matérias-primas de aditivos de alimentação e alimento para obter 30 uma pré-mistura ou alimentação adicional. Tais outros componentes de alimentação compreendem um ou mais outros suplementos de enzima (preferivelmente termoestáveis), outros aditivos de alimentação, minerais e amino- ácidos. Os aditivos alimentícios desse modo obtidos (combinados) podem compreender tipos diferentes de compostos e podem, depois, ser misturados em sua quantidade apropriada com alimentações como cereal e portadores de proteína para obter uma alimentação animal combinada. O processamen- 5 to destes componentes para alimentação animal pode ser realizado seguindo mistura com dispositivos de processamento que são conhecidos per se, como uma máquina de peletização dupla, um peletizador a vapor, um ex- pansor ou uma extrusora. Similarmente, um aditivo alimentício de acordo com esta modali- 10 dade da presente invenção pode ser combinado com outros componentes alimentícios por meio dos quais produtos alimentícios processados são produzidos.Tais outros componentes alimentícios compreendem um ou mais suplementos de enzima, vitaminas, minerais e elementos de traço. O suplemento alimentício combinado desse modo obtido pode ser misturado em 15 uma quantidade apropriada com outros componentes alimentícios como cereais e proteínas vegetais para render um alimento processado. O processamento destes compostos em um alimento processado pode ser realizado usando dispositivos de processamento que são conhecidos per se.

Em uma modalidade preferida as composições de fitase de a- 20 cordo com a invenção adicionalmente compreendem uma quantidade eficaz de uma ou mais enzimas para alimento ou alimentação, preferivelmente selecionados de alfa-galactosidases, beta-galactosidases, laccases, outras fitases, fosfatases, endoglucanases, especialmente endo-beta-1,4-gluca- nases, endo-beta-1,3(4)-glucanases, endo-1,2-beta-glucanases e endo-1,3- 25—alfa-glucanases, celulases, xilosidasesT galactanases, especialmente-arabi- nogalactanendo-1,9-beta-galactosidases e arabinogalactanendo-1,3-beta- galactosidases, enzimas degradantes de pectina, especialmente pectinases, pectina esterases, pectinliases, poligalacturonases, arabananases, rhamno- galacturonases, rhamno-galacturonanacetilesterases, rhamnogalacturonan- 30 alfa-rhamnosidases, pectato liases e alfa-galacturonidases, mananases, especialmente beta-manosidases, manan acetilesterases, xilan acetilesterases, proteases, xilanases, arabinoxilanases e enzimas lipolíticas como lipases, fosfolipases e cutinases.

O aditivo de alimentação animal de acordo com a invenção é administrado ao animal antes ou simultaneamente com a alimentação. Preferivelmente, o aditivo de alimentação animal de acordo com a invenção é 5 administrado simultaneamente ao animal com a alimentação.

Uma quantidade eficaz de fitase no alimento e alimentação é aproximadamente 10 - 20.000 PPU/kg, de preferência aproximadamente 10 - 15.000 PPU/kg, mais preferido aproximadamente 10 - 10.000 PPU/kg, em especial aproximadamente 50 - 5.000 PPU/kg, em particular 50 - 2.000 10 PPU/kg de alimentação ou alimento.

A invenção também se refere ao uso de fitase para processar e fabricar alimento e alimentação. Cereais e farinhas para alimento podem ser enzimaticamente tratados com fitase para reduzir o teor de fitina ou dos materiais brutos. Teores de fitina reduzidos melhoram a qualidade do alimento 15 aumentando a disponibilidade dos minerais essenciais como ferro, cálcio e zinco. Além do aumento da qualidade do alimento, o uso de fitase durante o processamento pode melhorar a eficiência total de produção do alimento. Por exemplo, a adição de fitase aos flocos de feijão de soja branco durante a produção de um isolado de proteína de soja pode significativamente aumen- 20 tar o rendimento e a qualidade da proteína extraível. Assim, a fitase é apenas ativa durante a produção e processamento, e não se encontra mais ativa no produto final. Este aspecto é em particular de importância na produção de massa e em assadura e na produção de outro alimento pronto-para-usar com base em cereal. Similarmente, componentes alimentícios para animais 25—como farinha de feijão de soja torrada ou farinha de óleo de canola podem ser pré-tratados com fitase antes do processo de produção de fato. A remoção dos fatores antinutritivos nos componentes alimentícios para animais antes da produção leva a uma qualidade fisiologicamente mais alta e a ingredientes de alimentação animal mais valiosos. Nestes métodos de proces- 30 sarnento, a fitase é ativa durante a produção e usualmente não é mais ativa no trato digestivo do animal sob ingestão da alimentação tratada.

Além do uso de fitase como um meio auxiliar no processamento de alimentação, a presente invenção também se refere ao uso da fitase de acordo com a invenção como um auxiliador de digestão ("Verdauungshilfe"). Fitase na forma de conservantes pode ser ingerida juntamente com ingestão de alimento para distribuir a enzima ativa no trato gastrointestinal.

A fitase de acordo com a invenção pode ser vantajosamente empregada também tanto em animais monogástricos quanto poligástricos, especialmente em bezerros. Alimento para peixe e molusco ("Schalentiere") pode também ser suplementado com fitase para melhorar a exploração do alimento e para reduzir o teor de fósforos excretados na procriação animal intensiva. A alimentação de acordo com a invenção pode também ser administrada em animais como avícula, por exemplo frangos, perus, gansos, patos como também porcos, cavalos, gado, ovelhas, cabras, cachorros e gatos como também peixe e molusco. Porém, administrar a alimentação de acordo com a invenção para porcos ou avícula é particularmente preferido.

Formulações de fitase de acordo com a invenção podem tam bém ser combinadas com outros ingredientes, por meio dos quais composições de alimentação novas e particularmente vantajosas são criadas. Como explicado acima, a disponibilidade de fosfato de planta é baixa em farinha de feijão de soja e cereais devido à ligação ao ácido fítico. Desse modo, fosfato 20 inorgânico é adicionado à alimentação para assegurar uma provisão fosforo- sa adequada dos animais. Porém, estas alimentações contêm muito fosfato total e desse modo levam a uma poluição do ambiente com fosfato. Especifi-camente, a alimentação animal de acordo com a invenção compreende a combinação de uma fitase de acordo com a invenção com ingredientes de -25—alimentação de animais para fornecer uma alimentação contendo teores essencialmente reduzidos de fosforoso inorgânico adicionado. Em uma modalidade preferida a alimentação de acordo com a invenção compreende ingredientes de alimentação típicos, micronutrientes, elementos de traço, vi-taminas, etc. como também uma quantidade eficaz de fitase e fósforoso i- 30 norgânico, em que a quantidade da fitase do fósforo é entre 50 e 20.000 unidades de fitase/kg de alimentação e menos que 0,45 % de fósforo inorgânico, preferivelmente entre teores de 100 - 10.000 unidades de fitase/kg de ali- mentação e menos que 0,225 % de fósforo inorgânico, em particular teores de 150 - 10.000 unidades de fitase/kg de alimentação e menos que 0,15 % de fosforoso inorgânico, em particular teores de 200 - 20.000 unidades de fitase/kg de alimentação e nenhum fósforo inorgânico adicional.

A invenção também se refere a melhorar o ganho de peso e a razão de conversão de alimentação (FOR) em nutrição animal como também o uso da fitase de acordo com a invenção em um destes métodos. Uma fitase de acordo com a invenção permite ganho de peso melhorado e uma razão de conversão de alimentação melhorada, em particular em associação 10 com a alimentação tendo pouco fosfato inorgânico. De acordo com os métodos da invenção, o teor de fosfato inorgânico na alimentação pode ser reduzido para teores abaixo de 0,45 %, preferivelmente abaixo de 0,225 %. Preferivelmente, nenhum fosfato inorgânico é adicionado.Por uma disponibilidade de fosfato aumentada devido à adição da enzima de acordo com a in- 15 venção, a mineralização de osso dos animais pode ser significativamente melhorada, que é em particular de importância em animais de crescimento rápido.

De acordo com outra modalidade a invenção também refere-se ao uso da enzima de acordo com a invenção em assadura, por meio do qual 20 o desenvolvimento, elasticidade e/ou estabilidade da massa e/ou o volume, a estrutura friável e/ou a resistência do bem assando ("Backgut") ao envelhecimento ("Altbackenwerden") é/são melhorada(s). Embora a preparação da enzima de acordo com a invenção possa ser usada para a produção de massa ou produtos assados de qualquer tipo de farinha, por exemplo com 25—base em centeio, cevada, aveias ou milho, a preparação de enzima de acordo com a invenção provou ser particularmente útil na produção de massa ou produtos de padaria de trigo ou de uma proporção substancialmente de trigo. Os produtos de padaria que podem ser produzidos com uma preparação de enzima de acordo com a invenção compreendem pão, pãezinhos franceses, 30 baguetes e similares. Para assadura, a preparação de enzima de acordo com a invenção pode ser usada com uma outra atividade de enzima, como, por exemplo, xilanase, lipase, amilase, oxidase ou laccase além da fitase ou pode ser usada em combinação com outras enzimas como lipase, amilase, oxidase (por exemplo glicoseoxidase, peroxidase).

Os exemplos a seguir ilustram a invenção em mais detalhes.

EXEMPLO 1: DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE FITASE

A atividade da fitase foi medida em uma mistura de ensaio de ácido fítico de 0,5 % (aproximadamente 5 mM), citrato de sódio 200 mM, pH 5,0. Após 15 minutos de incubação a 37e C a reação foi parada adicionando um mesmo volume de 15 % de ácido tricloroacético. Os íons de fosfato liberados foram quantitativamente determinados a 820 nm misturando 100 pl da mistura de ensaio com 900 pl de H2O e 1 ml de H2SO40,6 M, 2 % de ácido ascórbico e 0,5 % de molibdato de amónio após incubação a 50s C e uma duração de 20 min. Soluções de fosfato de potássio padrão foram usadas como uma referência.

EXEMPLO 2: CONSTRUÇÃO DOS PLASMÍDEOS pKDa2 E pKDa4

A seqüência de codificação de fitase de E. coli (Dassa et al. 1990, J. Bacteriol. 172:5497-5500, no. de acesso: M58704) foi gerada e sintetizada usando o uso de códon de T. reesei (http://www.kazusa.or.jp/codon). Todos os fragmentos sintetizados foram seqüenciados e os fragmentos com e sem mutações foram associados, por meio dos quais agora variantes de fitase foram produzidas. Em uma das variantes por fim obtidas, o aminoácido Vai200 (GTG) do gene de fitase foi alterado para Tyr200 (TAC). Esta variante foi chamada Da2. O polinucleotídeo original não-mutado ("Stammpolynu- cleotid") foi chamado Da4. Os clones de gene de fitase de £ coli maduros foram amplificados por PCr. A seqüência de DNA tendo o códon de CAG -25—(Gin) na posição 1 compreende uma estrutura de leitura aberta de 1.230 pb e codifica uma enzima tendo 410 aminoácidos (SEQ ID NO: 1/2).

O peptídeo sinal (18 aminoácidos) de fitase de A. niger (SEQ ID NO: 3/4) foi usado para segregar a fitase de E coli de Tríchoderma reesei. O gene sintético tendo a seqüência sinal de fitase de A. niger modificada e a seqüência de fitase de E coli madura que contem a mutação V200Y foi cio- nado no plasmídeo pUC18. O vetor desse modo desenvolvido foi chamado Da2pUC3 e foi depositado de acordo com as condições acima como DSM 16396. O plasmídeo depositado contém o DNA com o uso de códon fúngico com modificações leves de acordo com os sítios de clivagem requeridos para as enzimas de restrição como pode ser deduzido da tabela 1 a seguir:TABELA 1:

No plasm ideo pKDa2 (Tyr200 mutante), o gene sintético está flanqueado a montante por um sítio de restrição de Sacll de 16 pares de base do códon de começo e por um sítio de restrição BamHI imediatamente a ju-sante do códon de parada. Os 16 pares de base a montante do códon de começo pertencem ao promotor de cbh\ de T reesei (Shoemaker et al., 1983, Biotechnology 1, 691-696). O gene sintético foi clivado com Sacll e BamHI e foi inserido nos sítios de clivagem Sacll e BamHI seguindo o promotor de celobioidrolase I de T. reesei no plasmídeo pALK487 (WO 94/28117). Este constructo de plasmídeo foi chamado pKDal. Um fragmento de EcoRI/Spel de 4,78 kb de comprimento cego nas extremidades do plasmídeo pALK424 (WO 93/24621) contendo o marcador amdS e as seqüências de cbhl de flanqueamento de 3' foi clonado para o sítio de clivagem Stu] de pKDal, por meio do qual a vetor de expressão de fitase pKDa2 foi obtido. O dito vetor foi mapeado por endonucleases de restrição e a seqüência completa do frag- mento sintetizado foi confirmada através de seqüenciação.

A construção do vetor de expressão kPDa4 (tipo selvagem) foi analogamente realizada.

Os cassetes de expressão isolados dos plasmídeos pKDa2 e pKDa4, respectiva mente, contêm o material genético a seguir: Promotor cbh\ (celobioidrolase I): O fragmento de EcoRI/Sacll de 2,2 kb contendo o promotor de cbh\ é derivado de Tríchoderma reesei QM6a.

A região de promotor também trabalha como DNA homólogo (junto com o fragmento de 3' de cbhl; ver abaixo) para controlar a integração do DNA transformante no iocus de cbhl.

Seqüência sinal: O peptídeo sinal de fitase de A. niger (SEQ ID NO: 3/4) foi usado para segregar a fitase de E. coli de Trichoderma reesei. Gene de fitase de E. coli: O gene de fitase de E. coli sintética (SEQ ID NO: 1) incluindo a seqüência sinal de fitase de A. niger modificada para expressão em T. reesei foi fundida entre o promotor de cbhl e o termi-nado r de cbhl. Terminador de cbhl: O fragmento de BamHl/Stul de 0,75 kb de comprimento contendo o terminador de cbhl foi adicionado subseqüente à fitase de E. coli para assegurar a terminação da transcrição. Gene de amdS: O gene, incluindo seu promotor e seu termina-dor, foi isolado de Aspergillus nidulans VH1-TRSX6 e codifica acetamidase (Hynes et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 14301439; Kelly e Hynes, 1985, EMBO J., 4: 475-47). Acetamidase permite que a cepa cresça usando acetamida como a fonte de nitrogênio simples, e esta característica foi usada para selecionar o transformante. O fragmento de 3,1 kb (Spel/BamHl com as extremidades cegas) contém 1,007 bps da região de promotor, 1,897 bps da região de codificação (incluindo introns) e 183 bps da região de terminador do gene de amdS. Fragmento de cbhl de 31: O fragmento (1,7 kb, BamHl/EcoRl, iniciando 1,4 kb após o códon de parada do gene) foi isolado de T. reesei ALKO2466. A cepa ALKO2466 é derivada da cepa ALKO233 (Harkki et al., 1991, Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233). O fragmento de 3* é usado junto" com a região de promotorpara_integração alvejada do cassete~de-ex- pressão de fitase no Iocus de cbhl através de recombinação homóloga.

O constructo foi escolhida quanto à descoberta direcionada e substituição do gene de cbhl de cópia simples que está presente em T. reesei RH3780d, para estudar o efeito da mutação por uma cópia simples do gene.

EXEMPLO 3: TRANSFORMAÇÃO DE Trichoderma reesei COM pKDa2 E pKDa4 PARA OBTER TRANSFORMANTE DE CÓPIA SIMPLES

RH 3780d de T. reesei foi transformado separadamente com os cassetes de expressão linearizados isolados dos plasm ídeos pKDA2 e pK- Da4. As técnicas para transformar e manter o T. reesei foras aquelas de a- cordo com Penttila et al (1987, Gene 61: 155-164). Os transformantes foram selecionados e purificados duas vezes através de isolamento de”esporo“ simples. Aqueles transformantes tendo a eficiência de secreção mais alta foram selecionados de todos os transformantes. Estes transformantes com DNA do plasmídeo pKDa2 foram designados RH 31068 e RH 31069, trans-formantes com DNA de pKDa4 foram designados RH 31071-31075, e usa-dos para outra caracterização.

EXEMPLO 4: SECREÇÃO DE FITASE EM FRASCOS AGITADOS

Transformantes que carregam os cassetes de expressão de pK- Da2 e pKDa4, respectiva mente, foram cultivadas em frascos agitados em meio de indução de celulase tendo a composição a seguir: concentrado de proteína de leite Nutrica 2 %, lactose 1 %, DSG 1,5 %, KH2PO4 5 %, (NH4)2SO4 0,5 %, pó de infusão de milho 0,5 %, água de torneira de equilí brio, ajuste do valor de pH antes da esterilização para 5,3. Os filtrados da cultura obtidos após o crescimento de 6 dias foram usados para análise de SDS-PAGE e para determinação da atividade de fitase. Os resultados mos-traram que as atividades de fitase mais altas foram observadas no meio de cultura com transformante contendo o cassete de expressão de pKDa2. As atividades expostas na tabela 2 abaixo são atividades máximas que foram obtidas na fermentação dos melhores transformantes no período de 6 dias.Tabela 2: PRODUÇÃO DE FITASE DE E. coli POR TRANSFORMANTE CONTENDO O CASSETE DE EXPRESSÃO DE pKDa2 OU pKDa4.

Os resultados acima mostram que as cepas transformadas com o cassete de expressão pKDa2 contendo o mutante Tyr200 exibem a secreção de fitase, que é aproximadamente duas vezes tão alta quanto aquela das cepas transformadas com a seqüência fitase de E. coli do tipo selvagem pKDa4.

EXEMPLO 5: SOUTHERN BLOTTING

A análise de Southern Blot foi executada em DNAs genômicos que foram isolados da cepa hospedeira RH3780d e transformantes de ambos os constructos para avaliar o resultado de integração do cassete de expressão no genoma. Seguindo clivagem do DNA genômico com EcoRI e 10 triagem com um fragmento de EcoRI de 9,0 kb, uma banda de hibridação em 9,0 kb estava presente em todos os transformantes. O tamanho daquela banda correspondeu ao fragmento do cassete de expressão de 9,0 kb sugerindo uma integração intacta do cassete completo no genoma.

A clivagem do DNA com Xba\ mostrou duas bandas de hibrida- 15 ção em 1,7 e 9,0 kb na cepa hospedeira, enquanto que três bandas de hibridação em 1,7, 4,0 e 7,0 kb estavam presentes em todos os transformantes. Como esperado do evento de permuta dupla, uma integração de uma cópia do cassete de expressão no locus de c/?/?l leva a três bandas de 1,7, 4,0 e 7,0 kb e na ausência da banda do tipo selvagem de 9,0 kb. As bandas de 4,0 20como também as de 7,0 substituem a banda de 9,0 do locus de cbh] do hos pedeiro e a banda de 1,7 kb ficou inalterada.

As intensidades dos sinais de hibridação não diferem entre os transformantes e aqueles constructos.

Os resultados da análise Southern Blotting, SDS-PAGE e deter- 25 minação das atividades de fitase estão mostrados acima na tabela 2. A aná- lise de Southern Blot mostrou que todos os transformantes selecionados continham o gene de fitase de E. coli e o gene mutado, respectivamente, como cópia simples no locus alvo de cbhl.

EXEMPLO 6: CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DAS VARIANTES DE Fl- 5 TASE

Sobrenadantes de cepas recombinantes foram separados em Nu- Page BisTris a 10 % de gel de SDS-PAGE e tingidos com Coomassie (Figura 1). Devido à glicosilação pela cepa hospedeira a fitase ocorreu como três bandas entre 44,2 e 53,2 kDa. Todas as amostras foram aplicadas com atividades de fitase iguais.Os géis foram secados e varridos em um escâner de leito chato Agfa com o software Phoretix ID Advanced. As áreas das três bandas foram integradas e os dados estão resumidos na tabela 3 a seguir. Para todas as quatro cepas testadas, a soma da área de todas as três bandas de fitase é igual dentro do escopo da precisão de medição. Isto mostra que a mutação em Da2 não resulta em alterações na atividade específica da enzima e, desse modo, demonstra que a mutação é responsável pela secreção aumentada da proteína de fitase.TABELA 3: INTEGRAÇÃO DA ÁREA DAS BANDAS DE FITASE NO GEL DE SDS-PAGE USANDO O PROGRAMA PHORETIX ID ADVANCED

Exemplo 7: MELHORIA DA DISPONIBILIDADE DE FOSFATO POR FITASE DE ACORDO COM A INVENÇÃO (MUTANTE DE Tyr200) EM PORCOS

Um experimento de digestão foi realizado com porcos em dois- 5 períodos de coletânea subsequentes de 5 dias sugerindo um período de condicionamento de 9 dias em cada caso. Uma ração com teor reduzido de fosfato digestível com base em malte de milho e malte de feijão de soja extraído foi usada como um controle negativo e foi suplementada com a fitase de acordo com a invenção (o mutante de fitase Tyr200 de E. coli) em quanti- 10 dades de alimentação de 125, 250, 500 e 750 PPU/kg. A fitase foi adicionada à alimentação inteira por meio de uma pré-mistura. No total, 40 porcos machos castrados em 5 grupos de tratamento foram usados. Todos os grupos de tratamento consistiram em 8 porcos (4 porcos em dois períodos de coletânea subseqüente). Os tratamentos foram como segue: 15 controle negativo1 (NC) NC +fitase (125 PPU/kg'1) NC + fitase (250 PPU/kg’1) NC +fitase (500 PPU/kg’1) NC +fitase (750 PPU/kg’1) 20 1alimentação: 71,5 % de farinha de milho, 28,8 % de malte de feijão de soja extraído 4,4 g kg"1 P total; 1,9 g kg’1 de não-fitato P; 5,5 g kg’1 de Ca; fitase nativa: 90 PPU/kg’1.

Os parâmetros medidos compreendem fosfato e digestibilidade 25—de cálcio como também retenção de fosfato e de cálcio. Retenção e excreção de fosfato:

Os resultados mostram que a digestibilidade de fosfato foi signi-ficativamente aumentada em 42,5 % no controle negativo para 59,3, 65,3, 65,0 e 66,3 %, respectivamente, (p < 0,05) em todas as quantidades 30 adicionadas de fitase (125; 250; 500 e 750 PPU/kg’1 de alimentação). Isto levou a uma diminuição significativa da excreção de fosfato fecal de 203 mg kg'1 0,75 d’1, medida no grupo de controle negativo, para 142, 120, 121 e 116 mg kg'1 0,75 d'1 nos grupos de tratamento com alimentação enriquecida de fitase (p < 0,05). A retenção de fosfato melhorou significativamente de 152 mg kg'1 0,75 d'1, medida no controle negativo, para 221, 232, 231 e 236 Q 75 nos grUp0S de-tratamento com alimentação enriquecida de 5 fitase (p < 0,05). As diferenças entre os tratamentos de fitase foram significa-tivas entre a dosagem mais baixa (125 PPU kg'1 de alimentação) e todas as outras administrações (p < 0,05).

RETENÇÃO E EXCREÇÃO DE CÁLCIO

A adição de fitase de acordo com a invenção aumentou significa- 10 tivamente a utilização de cálcio (p < 0,05) em 12,1, 14,3, 15,2 e 14,6 % quando comparado ao grupo de controle. A excreção de cálcio por meio da urina foi relativamente alta (114 mg kg'1 0,75 d'1) no controle negativo, que foi presumivelmente para designar o baixo teor de P na alimentação. A excreção de cálcio por meio da urina foi reduzida para 108, 118, 95 e 88 mg 15 kg'1 0,75 d’1 nos grupos de tratamento de fitase, que foi significativa para a quantidade mais alta administrada (750 PPU kg'1, p < 0,05) quando comparado com o controle negativo. A retenção de cálcio medida no controle negativo foi significativamente aumentada (p < 0,05) de 181 mg kg-1 0,75 d'1 para 240, 245, 266 e 270 mg kg'1 0,75 d'1 para todos os tratamentos de fitase. As 20 diferenças entre as quantidades adicionadas de fitase foram significativas (p < 0,05) entre as dosagens mais altas (500 e 750 PPU kg‘1 de alimentação) quando comparadas às dosagens inferiores (125 e 250 PPU kg'1).

Os resultados mostram que a fitase de acordo com a invenção tiveram um efeito bom na degradação de fitato no trato digestivo de porcos. 25—Baixas quantidades da fitase de acordo com a invenção já podem promover a digestibilidade e retenção de cálcio e de fosfato em uma extensão similar como quantidades adicionadas mais altas.

Exemplo 8: MELHORIA DA DISPONIBILIDADE DE FOSFATO PELA FI-TASE DE ACORDO COM A INVENÇÃO (MUTANTE DE Tyr200) EM 30 FRANGOS

Um experimento de digestão foi realizado com galinhas ("Mas- thühner") em dois períodos de coletânea. Um período de coletânea de 4 dias foi realizado seguindo um período de condicionamento em gaiolas de tam-bém 4 dias. Os períodos de coletânea foram realizados ao término da fase inicial e ao término da fase de crescimento. Uma ração com teor reduzido de fosfato digestível, com base em malte de milho e malte de soja extraído, foi 5 usada como um controle negativo e foi suplementada com a fitase de acordo com a invenção em quantidades de 125 e 250 PPU kg’1 de alimentação. A- dicionalmente, um outro tratamento foi realizado com o teor de fosfato reco-mendado sem adição de fitase. No total 24 frangos foram atribuídos a 4 grupos de tratamento. Os grupos de tratamento consistiram em 6 frangos por 10 período de coletânea. O tratamento é como segue: Controle negativo1 (NC) NC + fitase (125 PPU kg'1) NC +fitase (250 PPU kg1) Controle positivo2 1Alimentação: 53,6-56,5 % de farinha de milho; 37,9-34,5 % de malte de feijão de soja extraído; 4,4-4,7 g kg'1 de P total; 2,0 g kg’1 de P de não-fitato; 6,4-5,9 g kg'1 de Ca 2Alimentação: 50,4-54,3 % de farinha de milho; 35,9-35,0 % malte de feijão de soja extraído; 7,3-6,4 g kg'1 de P total; 4,5-3,5 g kg’1 de P de não-fitato; 209,8-7,8 g kg’1 de Ca

Os parâmetros medidos compreendem excreção de fosfato e retenção de fosfato. Os resultados mostram que ambas as quantidades adi-cionadas de fitase P (125 e 250 PPU kg’1 de alimentação) aumentaram a retenção de fosfato e diminuíram a excreção de fosfato. As medições ao 25 término da fase inicial mostraram um aumento significativo da retenção de fosfato de 58,7 % no controle negativo para 64,2 e 63,9 % para o tratamento de fitase (p < 0,05). Isto levou a uma redução da excreção de fosfato em frangos tendo recebido a fitase que foi reduzida em 11,4 e 12,7 % (tendência) quando comparada ao controle negativo. Medições ao término da fase de 30 crescimento também mostrou um aumento da retenção de fosfato de 54,7 % no controle negativo para 58,2 e 58,9 % para tratamentos de fitase (tendência). Isto levou a uma diminuição da excreção de fosfato em frangos tendo recebido a fitase que foi significativamente reduzida (p < 0,05) em 11 % e 12,7 % quando comparado ao controle negativo.

EXEMPLO 9: EXPERIMENTO DE ASSADURA: PÃO DE VIENA

Pão de Viena foi assado de_320_g pedaços de massa obtidos misturando 1,000 g de farinha de trigo (Pfalzer Mühlenwerke, Mannheim, Tipo 550), 30 g de levedura comprimida (Fala GmbH, Alemanha), 20 g de sal, 50 mg de ácido ascórbico, 580 g de água. Após misturar todos os ingredientes em velocidade lenta durante 2 minutos e misturar durante 6 minutos em velocidade alta (Misturador Diosna SP12), a massa teve uma temperatura de 27s C e foi deixada durante 10 minutos em temperatura ambiente (22- C) abaixo de uma cobertura de pano. Seguindo o primeiro período de repouso da massa, a massa foi dividida em pedaços de 320 g cada (±1 g de tolerância) e configurada em uma forma redonda. Depois disso, um segundo período de repouso da massa de 20 minutos seguiu. Seguindo o segundo período de repouso de massa, a massa foi formada em um dispositivo mecânico e foi colocada em placas de fermentação cobertas com pano. A massa de pão foi depois fermentada a 32- C sob 85 % de umidade relativa (maturação final) e foi assada após um tempo de maturação de 70 minutos. A massa/o pão foi assada(o) com uma injeção de vapor de 5 segundos durante 35 minutos a 235- Ceo forno tendo níveis de inserção múltiplos ("in einem mehrschieni- gen Ofen") (Winkler & Wachtel, Alemanha).

Os efeitos diferentes da fitase de acordo com a invenção (o mu-tante Tyr200 de fitase de E. coli) nos experimentos de assar foram comparados com uma massa de controle sem adição de fitase em paralelo. O volume 25—dos pães de controle foi tirada para 100 %.

O volume dos pães de pão foi determinado pelo método de des-locamento de semente de colza ("Rapssamenverdrãngungsverfahren"). A reologia da massa e as propriedades do pão foram sensoriamente avaliadas por padeiro especializado/de teste de aplicação qualificada e o volume mé- 30 dio dos três pães por teste foi medido.

Os resultados do experimento de assadura estão resumidos na tabela 9 a seguir: TABELA 4

Critérios de avaliação:

Explanação dos critérios de avaliação: Resistências: dureza da massa, avaliada por um padeiro experi ente.

Volume; avaliação visual do volume do pedaço de massa ("Tei- gling") após prova final.

Estabilidade: teste da capacidade de retenção de gás por pres- surização do pedaço de massa após prova final e avaliação do volume dimi- nuído, que ocorreu.

Os resultados acima mostram que a fitase de acordo com a in-venção teve um efeito de estabilização na massa.

A fitase de acordo com a invenção teve um efeito de éstãbilizã- 5 ção na massa.

Os experimentos de acordo com os Exemplos 7 a 9 mostram que o mutante de fitase Tyr200 de E. coli de acordo com a invenção não é diferente da fitase do tipo selvagem em seu efeito. Porém, o mutante de fitase Tyr200 de E. coli de acordo com a invenção é caracterizado pela vantagem de uma atividade 10 mais alta no sobrenadante de cultura em total e uma eficiência de secreção mais alta, respectivamente, quando comparado ao tipo selvagem.

Exemplo 10: CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO pKDa41

O plasm ideo pKDa41 compreende o gene de fitase de E. coli (WT) sob controle do promotor de cbhl de T. reesei e o terminador de cbhl. A 15 construção é comparável à construção do plasmídeo pKDa4 com a exceção que os 16 pares de base que estavam localizados a montante para o códon de começo de fitase CCGCGGACTGCGCATC ATG foram alterados para CCGCGGACTAGGC ATC e um sítio de restrição de Pad imediatamente a jusante do códon de parada.

Para construir o plasmídeo pKDa41, o gene de fitase de E. coli (WT) foi amplificado do plasmídeo pKDa4 por meio de PCR. O produto de PCR foi clivado com Avril e Pad e foi inserido nos sítios de clivagem de Spel e Pad seguindo o promotor de cbhl de T. reesei no plasmídeo pAB489. O plasmídeo resultante tem a designação pKDa41 e foi mapeado por endonu- -25—cl eases de restrição e a seqüência de fitase foi confirmada através de se- qüenciação. O cassete de expressão (fragmento de Notl) isolado do plasmídeo pKDa41 contém materiais genéticos idênticos como aqueles do plasmídeo pKDa4. O plasmídeo pKDa41 foi usado como material de partida para reduzir as variantes de fitase diversas e como uma referência no exame da expressão de fitase em RH3780d de T. reesei.

O plasmídeo pAB489 é o resultado do plasmídeo pALK487 (WO 94/28117) por inserção de outros sítios de restrição (Spel e Pad) no sítio de

Sacll entre o promotor de cbhl e o terminador de cbhl contidos em pALK487 como também o fragmento de EcoRI/Spel de 4,78 kb de comprimento do plasmídeo pALK424 (WO 93/24621) apresentado no Exemplo 2 e contendo o-rrrarcadorde-ãrndS^e as seqüências de cbhl de flanqueamento de 3‘. O 5 posicionamento dos elementos é o mesmo que em pKDa4 e permite a clonagem direta das variantes de gene para os sítios de divagem de Spel e Pad do sítio de multiclonagem seguindo o promotor de cbhl de T. reesei.

EXEMPLO 11: CONSTRUÇÃO DOS PLASMÍDEOS DE VARIANTE FITASE

Os plasmídeos de variante de fitase a seguir foram construídos: 10 pPhy-V200L, pPhy-V200P, pPhy-L207F

Para produzir as variantes de fitase, as mutações do gene de fitase foram realizadas pelo método de PCR analogamente ao princípio que é relatado em Nucleic Acids Research 1989, 17 (2), 723-733 e Nucleic Acids Research 1990, 18 (6), 1656. A construção como também a clonagem dos 15 plasmídeos de variante de fitase é idêntica à produção do plasmídeo pK- Da41 relatado no Exemplo 10. As seqüências das variantes de fitase foram confirmadas através de seqüenciação.

EXEMPLO 12: TRANSFORMAÇÃO DE RH3780d DE T. reesei COM pK- Da41 E VARIANTES, RESPECTIVAMENTE

A transformação de RH3780d de T. reesei com os cassetes de expressão isolados do plasmídeo pKDa41 do Exemplo 10 e os plasmídeos de variante de fitase do Exemplo 11 foi analogamente realizada à transformação com os cassetes de expressão isolados dos plasmídeos pKDa2 e pKDa4 (Exemplo 3). Os cassetes de expressão foram isolados como frag- variante de fitase.

Exemplo 13: PRODUÇÃO DE FITASE DE E. coli POR CASSETES DE EX-PRESSÃO DE pKDa41 E DE VARIANTE DE FITASE EM FRASCOS AGITADOS

Os transformantes foram crescidos como descritos no Exemplo 4 e a fitase nos filtrados de cultura foi usada para outros exames. TABELA 5: PRODUÇÃO DE FITASE DE E. coli POR TRANSFORMANTES CONTENDO OS CASSETES DE EXPRESSÃO DE pKDa41 OU DE VARIANTE DE FITASE

LISTAGEM DE SEQUENCIA

Claims (18)

1.Molécula de DNA recombinante que, sob expressão em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, codifica um polipeptídeo tendo atividade de fitase, caracterizada pelo fato de que a molécula de DNA re- combinante compreende uma sequência de DNA selecionada de: a)sequências de DNA que foram obtidas por variações da sequência de fitase de E. coli do tipo selvagem madura, em que as sequên-cias de DNA apresentam pelo menos uma mutação selecionada a partir do grupo Val 200 ^ Leu, Val 200 ^ Ile, Val 200 ^ Pro, Val 200 ^ Tyr, Leu 207 ^ Tyr, Leu 207 ^ Phe, b)sequências de DNA que estão relacionadas às sequên-cias de acordo com a) devido à degeneração do código genético, em que a molécula de DNA recombinante é, sob expressão em uma célula hospedeira adequada, associada a uma atividade aumentada da proteína desse modo codificada no sobrenadante de cultura.

2.Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindica-ção 1, caracterizada pelo fato de que tem a sequência de SEQ ID NO: 1.

3.Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindica-ção 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma sequên-cia sinal com a sequência de SEQ ID NO: 3 derivada do gene da fitase de Aspergillus niger.

4.Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que tem atividade de fitase e é codificado por uma molécula de DNA recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou é obtido por expressão de uma célula hospedeira transformada com o mesmo.

5.Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que tem a sequência de SEQ ID NO: 2.

6.Construção de DNA tendo a capacidade para controlar a ex-pressão de um gene de fitase mutado em um hospedeiro sob introdução em uma célula hospedeira adequada, caracterizada pelo fato de que opcional-mente contém um promotor, opcionalmente sequências sinais e marcadoras, uma sequência de DNA como definida na reivindicação 1 ou 2, um termina- dor e opcionalmente sequências de flanqueamento de 5' e 3'.

7.Construção de DNA de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o promotor é o promotor de celobioidrolase I, celobi- oidrolase II, amilase, glucoamilase, xilanase ou de enolase.

8.Construção de DNA de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a sequência sinal é uma sequência sinal de fitase opcionalmente modificada de Aspergillus niger., preferencialmente a sequência de SEQ ID NO: 3.

9.Vetor tendo a capacidade para transformar uma célula hospedeira, caracterizado pelo fato de que contém uma construção como definida na reivindicação 6.

10.Vetor de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que é o plasmídeo Da2pUC3, depositado sob o número de acesso DSM 16396.

11.Célula hospedeira transformada, caracterizada pelo fato de que é selecionada de fungo, levedura e bactérias, contendo uma molécula de DNA recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e sendo fornecida com a capacidade de expressar um polipeptídeo tendo atividade de fitase.

12.Célula hospedeira transformada de acordo com a reivindica-ção 11, caracterizada pelo fato de que pertence ao gênero Aspergillus, Rhi- zopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor ou Penicillium.

13.Método para produzir fitase, caracterizado pelo fato de que uma célula hospedeira transformada como definida na reivindicação 11 ou 12 é cultivada sob condições condutivas para a formação de fitase, e a fitase desse modo produzida é isolada.

14.Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo como definido na reivindicação 4 ou 5, opcionalmente junto com outros agentes auxiliares e/ou ativos.

15.Composição de acordo com a reivindicação 14, caracteriza-da pelo fato de que é uma composição alimentícia ou de ração.

16.Composição de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- da pelo fato de que a composição é um auxílio de panificação.

17.Uso de um polipeptídeo como definido na reivindicação 4 ou 5 , caracterizado pelo fato de que é para a manufatura de uma preparação para melhorar a utilização de fosfato de nutrição em animais e humanos.

18. Uso de um polipeptídeo como definido na reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que é para melhorar as propriedades reológicas das massas para a produção de produtos de padaria..

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