KR970005487B1 - 내열성 d-히단토이나제 활성을 갖는 고온성 신규 미생물을 이용한 n-카르바모일-d-아미노산의 제조 방법 - Google Patents

내열성 d-히단토이나제 활성을 갖는 고온성 신규 미생물을 이용한 n-카르바모일-d-아미노산의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

내용없음.

Description

내열성 D-히단토이나제 활성을 갖는 고온성 신규 미생물을 이용한 N-카르바모일-D-아미노산의 제조 방법
제1도는 마그네슘 알루미늄 실리케이트 담체에 고정화시킨 D-히단토이나제 효소를 반복 사용하는 경우 산물의 생산성을 나타내는 그래프임.
본 발명은 내열성 D-히단토이나제 활성을 갖는 신규 미생물을 이용한 N-카르바모일-D-아미노산의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 말하자면, 본 발명은 바실러스 스티아로더모필러스(Bacillus stearothermophilus) 종의 고온성 미생물이 생산하는 내열성 D-히단토이나제를 이용하여 히단토인 유도체를 N-카르바모일-D-아미노산으로 전환시키는 방법에 관한 것이다.
히단토인 유도체들은 히단토인 고리의 5번 탄소에 파라-히드록시페닐, 이소프로필 등이 치환된 물질로서 부허러-버어그(Bucherer-Berg)의 방법 등에 의해 유기 합성된다. 이러한 5-일치환 히단토인 유도체의 3번 질소와 4번 탄소 사이의 아미드 결합을 미생물 유래의 D-히단토이나제로 가수 분해시켜서 N-카르바모일-D-아미노산으로 전환시킨 후 화학적 또는 효소적 방법으로 N-카르바모일기를 제거시킴으로써 D-아미노산을 얻을 수 있다. D-아미노산은 기질인 히단토인 유도체의 종류에 따라 D-파라-히드록시페닐글리신, D-발린 등일 수 있다[C. Syldatk, A. Laufer, R. Muller, H. Hoke, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 41 : 29(1990)참조]. 이와같이 하여 제조되는 D-아미노산은 의약품 원료, 식품 첨가물, 농약 등의 합성에 있어서 단위 구조체로서 산업적으로 널리 이용되고 있다.
D-아미노산의 제조에 이용되는 D-히단토이나제의 활성은 슈도모나스(Pseudomonas)속, 에어로박터(Aerobacter)속, 코리네박테리엄(Corynebacterium)속, 스트렙토미세스(Streptomyces)속, 바실러스(Bacillus)속, 아그로박테리엄(Agrobacterium)속, 아트로박터(Arthrobacter)속 등의 여러 미생물에서 발견되었으며[H. Yamada, S. Takahashi, Y. kii, H. Kumagai, J. Ferment. Technol. 56 : 484(1978); S. Takahashi, Y. Kii, Kumagai, H. Yamada, J. Ferment. Technol., 57 : 328(1979); H. Yamada et al,. Biochimie, 62 : 395(1980); R. Olivieri, E. Fascetti, L. Angelini, L. Degen, Enzyme Microb. Technol., 1 : 201(1979); A. Moller, C. Syldatk, M. Schulze, F. Wagner, Enzyme Microb. Technol., 10 : 618(1988)참조], 이들 각 균주의 D-히단토이나제가 분리 정제되어 각각의 효소의 특성이 밝혀지고 있다[A. Morin, W. Hummel, H. Schutte, MR. Kular, Biotechnol. Appl. Biochem. 8 : 564(1986); K. Yokozeki, K. Kubota, Agric. Biol. Chem., 51 : 721(1987); A. Moller, C. Syldatk, M. Schulze, F. Wagner, Enzyme Microb. Technol., 10 : 618(1988)].
상기 D-아미노산 제조 방법에 있어서 기질로 사용되는 히단토인 유도체들은 대부분이 수용액 중에서의 용해도가 낮은데, 이는 효과적인 효소 반응 및 연속 공정을 수행하는데 장해가 되고 있다. 효소 반응을 효과적으로 진행시키기 위해 기질의 용해도를 증가시키는 방법으로는, 효소 반응계에 유기 용매 등을 첨가하거나[D. M. Kim, H. S. Kim, Enzyme Microb. Technol., 15 : 530(1933)참조], 반응 온도를 높이는 것을 들수 있다. 반응 온도를 높여서 수행하는 경우, 기질인 히단토인 유도체들의 낮은 용해도를 증가시켜서 반응속도가 증가될 뿐만 아니라 연속적인 조업이 가능해지고 미생물의 오염을 방지한다는 장점을 갖는다. 따라서, 공정의 경제성을 고려할 때, 높은 열안정성 및 역가를 갖는 D-히단토이나제가 요구되고 있으며, 이를 위해서는 이러한 효소를 생산하는 균주의 분리가 선행되어야 한다.
본 발명자들은 높은 열안정성 및 역가를 갖는 D-히단토이나제를 얻기 위해 연구한 결과, 내열성 D-히단토이나제 활성을 갖는 바실러스 스티아로더모필러스(Bacillus stearothermophilus) SD-1을 토양으로부터 분리하였다. 이 균주는 한국과학기술연구원 유전공학 연구소에 KCTC 8551P의 수탁 번호로 기탁되어 있으며, 이 미생물에 관해서는 동일자 대한민국 특허 출원 제 호에 기재되어 있다.
본 발명은 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1이 생산하는 내열성 D-히단토이나제를 사용하여 5-치환 히단토인 유도체로부터 N-카르바모일-D-아미노산을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 N-카르바모일-D-아미노산의 제조 방법 중 하나는 D-히단토이나제 효소원으로서 고온성 균주인 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1 균체 자체를 사용하는 균체 반응(whole cell rection)을 이용하는 것이다.
균체 반응은 균체를 수확한 후 바로 효소원으로 이용할 수 있어 간편하다는 점에서 유리한 반면, 기질의 물질 전달이 장애를 받고 균체의 자기 분해 등으로 효소원이 불안정하다는 단점이 있다. 이러한 단점은, 균체를 유기 용매, 특히 톨루엔 또는 트리톤(Triton) X-100으로 처리하여 투과성을 증진시킴으로써 세포막에서의 물질 전달이 자유로와지게 할 수 있고 또한 글로타르알데히드로 처리하여 세포막 상에 가교를 형성시킴으로써 세품의 자기 분해 등으로 인한 효소 반응 도중의 세포 구조 파괴를 완화시킬 수 있기 때문에 해결될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 D-히단토이나제 효소원은 다음과 같은 방법으로 제조한다 : 효모 추출물 10g/1, 고기 추출물 2g/1, 글루코스 2g/1, K2HOP42g/1, KH2OP42g/1, MgSO4·7H2O 0.5g/1 및 MnCL2·4H2O 0.00g/1를 함유하는 살균된 액체 배지(pH7.2-7.4) 3ℓ에 3%(v/v)의 비율로 균주 배약액을 접종하고, 55℃에서 0.5vvm, 450rpm의 통기 조건 하에서 배양한다. 효소 생산은 대수 증식기에서는 미미하다가 정체기 초기부터 급격히 증가한다. 정체기에 들어간 후 1내지 2시간 후 배양액을 회수하고 8000g에서 20분간 원심 분리하여 균체를 수확한다. 수확된 균체를 0.1M K2HPO4-KH2PO4완충액(pH8.0)으로 2회 세척한 후 D-히단토이나제 효소원으로 사용한다.
본 발명에 의한 N-카르바모일-D-아미노산의 제조 방법 중 다른 하나는 내열성 D-히단토이나제를 고정화한 고정화 효소를 이용하는 것이다.
이 방법은 균체를 이용하는 방법보다 효소원이 안정하여 반복 사용이 가능할 뿐만 아니라 효소가 기질과 접촉하는데에 장애가 없어 효소 반응성이 증가한다는 장점이 있다.
고정화할 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1의 D-히단토이나제 조효소액은, 배양하여 수확한 균체 20g/1(건조량)를 완충액에 현탁시키고, 리소자임(미합중국 Sigma사 제품) 50mg/1를 첨가하여 37℃에서 1시간동안 분해시키고, 파쇄된 균체액을 28000g로 원심 분리시키고, 얻어진 상징액을 투석시킴으로써 얻어진다.
효소의 고정화 방법으로는 흡착법, 공유 결합법, 겔에 의한 포집법 및 마이크로캡슐에 의한 포괄법 등이 있다. 이 중, 흡착에 의한 효소 고정화 방법이 간단하고, 효소 활성 회수율이 높으며, 비용이 적게 들어 경제적이다.
효소를 고정할 담체로는 일반적인 D-히단토이나제 반응 pH인 pH8-10에 적합한 이온 흡착성 담체인 DEAE-셀룰로오스, DEAE-세파덱스, DEAE-세파로스, 및 활성탄, 제올라이트, 실리카겔, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 셀라이트(CeliteR)등과 같은 일반 흡착제가 이용된다.
본 발명에서 이용되는 고정화 효소는 다음과 같은 방법으로 제조된다.
D-히단토이나제 조효소액을 단백질 농도가 1mg/㎖가 되도록 희석시키고, 담체(일반 흡착제의 경우, 입자 크기는 212-300㎛임)를 약 3%(w/v)[단, DEAE-류는 9%(v/v)]정도 첨가하고, 30℃에서 1시간 동안 교반시키면서 흡착시킨다. 흡착된 담체를 0.01 M K2HPO4-KH2PO4완충액(pH8.0)으로 3회 세척하고, 이와 같이 세척한 담체를 동일 완충액에 3%(w/v)[단, DEAE-류는 9%(v/v)]정도 첨가하고, 여기에 글루타르알데히드 용액을 25mM 농도가 첨가한 후, 30℃에서 1시간 동안 교반시켜서 흡착된 단백질 간의 가교화를 유도한 후, 동일 완충액으로 충분히 세척한다.
보다 효율적인 반응을 수행하기 위해서는 사용되는 고정화 효소의 활성 회수율이 높아야 한다.
본 발명에서는 16.5mg의 단백질을 함유하는 조효소액을 상기 각각의 담체 1g(단, DEAE-류 3㎖)에 고정화하여 단백질 흡착율 및 활성 회수율을 비교하였다. 그 결과, 가장 높은 단백질 흡착율은 마그네슘 알루미늄 실리케이트 담체에서 얻어졌고, 흡착된 단백질의 활성 회수율은 DEAE-류가 95%이상으로 가장 높았다. 즉, 동일 부피(3㎖)의 DEAE-셀룰로오스와 마그네슘 알루미늄 실리케이트에 동일양의 조효소를 흡착시킬 경우, 단백질 흡착량은 후자가 더 높지만, 활성도는 전자가 약간 더 우세하다. 그러나, 조사 결과, 마그네슘 알루미늄 실리케이트에 고정화시킨 효소가 더 안정된 효소 반응을 유지하였으므로, 본 발명에서는 마그네슘 알루미늄 실리케이트를 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1의 D-히단토이나제 조효소를 고정화시킬 담체로서 선정하였다.
마그네슘 알루미늄 실리케이트는 단백질 흡착율이 1g당 100㎎까지 가능하며, 유리 조효소와 비교해 볼 때 활성 회수율이 50%이상이었다. 활성 회수율과 단백질 흡착 안정도를 고려해 볼 때, 담체 1g당 50㎎이하의 단백질을 흡착시키는 것이 바람직하다. 더 바람직한 것은 담체 1g 당 20 내지 40㎎의 단백질을 흡착시키는 것이다. 이 경우, 단백질 흡착율은 95%이상이었으며, 활성 회수율은 80%이상이었다.
또한, 이 고정화 D-히단토이나제를 함유시킨 충진 반응기에 0.1M 트리스-HCl 완충액(pH8.0)중의 1%히단토인 용액을 연속적으로 공급하여 N-카르바모일-D-글리신 생산성을 관찰한 결과, 고정화 효소의 조업 안정성이 55℃에서 1개월 이상 활성이 그대로 유지하였다.
따라서, 고온성 신규 미생물인 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1의 내열성 D-히단토이나제 조효소를 마그네슘 알루미늄 실리케이트 담체에 고정화시키면 활성 회수율이 높고 열안정성이 우수하여, 고온에서 히단토인 유도체로부터 N-카르바모일-D-아미노산을 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 기질인 5-치환 히단토인 유도체를 가수 분해시킴으로써 각종 N-카르바모일-D-아미노산을 생산할 수 있다. 기질로서 사용될 수 있는 히단토인 유도체로는 DL-5-(파라-히드록시페닐)히단토인, DL-5-(2'-메틸티오에틸렌)히단토인, DL-5-페닐히단토인, 5-이소프로필히단토인 등이 있다. 본 발명에 따라 생산되는 N-카르바모일-D-아미노산은 N-카르바모일-D-파라-히드록시페닐글리신, N-카르바모일-D-메티오닌, N-카르바모일-D-페닐글리신, N-카르바모일-D-발린 등이다. 반응은 본 발명의 신규미생물 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1을 사용하여 통상적인 효소 반응 방법에 따라 수행될 수 있다. 반응은 약 55℃이상의 고온에서 수행될 수 있다.
본 발명의 방법을 실시예에 따라 더욱 상세히 설명하겠다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
0.1M NaHCO3-Na2CO3완충액(pH9.0) 100㎖에 균체 0.1g(건조량), DL-5-(파라-히드록시페닐)히단토인 1g을 첨가하고, 55내지 60℃에서 질소 기류 하에 교반시키면서 15시간 동안 반응시켰다.
반응을 중단시킨 후, 반응액을 HPLC로 크로마토그래피시키거나 또는 발색시켜서 흡광도를 측정함으로써 N-카르바모일-D-파라-히드록시페닐글리신을 정량하였다. 그 결과, 수율은 약 90%이었다.
이때, HPLC는 CLS-ODS(M)(일본 Schimadzu사 제품) 칼럼을 사용하고, 용출제로서 10% 아세토니트릴용액(pH3)을 사용하여 1㎖/분의 유속으로 수행하였으며, 214nm에서 흡광도를 측정하였다.
발색 반응은 6N 염산 용액에 용해시킨 10%(w/v) 파라-디메틸아미노벤즈알데히드 용액 0.5㎖를 반응액에 첨가시켜 발색시키고, 440nm에서 흡광도를 측정하였다.
[실시예 2]
기질로서 -DL-5-(2'-메틸티오에틸렌)히단토인을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여, N-카르바모일-D-메티오닌을 약 80%의 수율로 얻었다.
[실시예 3]
기질로서 DL-5-페닐히단토인을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 N-카르바모일-D-페닐글리신을 약 90%의 수율로 얻었다.
[실시예 4]
기질로서 DL-5-이소프로필히단토인을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여, N-카르바모일-D-발린을 약 90%의 수율로 얻었다.
[실시예 5]
균체 0.1g(건조량)을 0.1 M K2HPO4-KH2PO4완충액(pH8.0) 10㎖에 혼탁시키고, 25mM 글루타르알데히드 용액 1㎖를 첨가한 후 30℃에서 20분간 교반하여 반응시키고, 처리된 균체를 동일 완충액으로 2회 세척한 후 이를 효소원으로 하여 실시예 1과 동일한 방법으로 반응을 수행하여, N-카르바모일-D-파라-히드록시페닐글리신을 약 90%의 수율로 얻었다.
균체를 글루타르알데히드로 처리하여 세포막 상에 가교를 형성시키면 세포의 자기 분해 등에 의한 효소반응 중의 세포 구조의 파괴를 완화시킬 수 있었다.
[실시예 6]
균체 0.1g(건조량)을 0.1 M K2HPO4-KH2PO4완충액(pH8.0) 20㎖에 혼탁시키고, 톨루엔 1㎖ 또는 10% 트리톤 X-100(미합중국 Sigma사 제품) 용액 0.2㎖를 첨가한 후 30℃에서 10분간 교반하여 처리하고, 균체를 2회 세척한다. 이어서, 실시예 5와 같이 글루타르알데히드로 처리하고, 처리된 균체를 동일 완충액으로 2회 세척한 후 이를 효소원으로 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 반응을 수행하여, N-카르바모일-D-파라-히드록시페닐글리신을 약 90%의 수율로 얻었다.
균체에 유기 용매 등을 처리하여 투과시키면 세포막에서의 물질 전달이 자유로와져서 균체에 의한 효소반응성이 향상되었다.
[실시예 7]
0.1M NaHCO3-NaCO3-KH2PO4완충액(pH9.0) 100㎖에 마그네슘 알루미늄 실리케이트 담체에 D-히단토이나제를 고정화시킨 고정화 효소 1.5g 및 DL-5-(파라-히드록시페닐)히단토인 1g을 첨가하고, 55내지 60℃에서 질소 기류 하에 교반시키면서 12시간 동안 반응시켰다.
반응을 중단시킨 후, 반응액을 실시예 1과 기재한 바와 같이 HPLC로 크로마토그래피시키거나 또는 발색시켜서 흡광도를 측정함으로써 N-카르바모일-D-파라-히드록시페닐글리신을 정량하였다. 그 결과, 수율은 약 90%이상이었다.
[실시예 8]
기질로서 DL-5-(2'-메틸티오에틸렌)히단토인을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 7과 동일한 방법으로 수행하여, N-카르바모일-D-메티오닌을 약 90%이상의 수율로 얻었다.
[실시예 9]
기질로서 DL-5-페닐히단토인을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 7과 동일한 방법으로 수행하여, N-카르바모일-D-페닐글리신을 약 90%이상의 수율로 얻었다.
[실시예 10]
기질로서 DL-5-이소프로필히단토인을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 7과 동일한 방법으로 수행하여, N-카르바모일-D-발린을 약 90%이상의 수율로 얻었다.
[실시예 11]
실시예 7의 반응 조건 하에서 고정화 효소를 반복 사용하여 DL-5-(파라-히드록시페닐)히단토인으로부터 N-카르바모일-D-파라-히드록시페닐글리신을 반복 생산하였다. 그 결과를 제1도에 나타내었다.
5g/1의 기질을 90% 전환하는 것을 1회 반응으로 하여 55℃에서 고정화 효소를 9회까지 반복 사용하여도 활성 감소율이 거의 없었다. 이때, 평균 생산성은 14g/h/kg-촉매이었으며, 이 값은 종래의 상온에서의 공정보다 2내지 3배이상 우수한 결과이다.

Claims (11)

  1. 5-치환 히단토인 유도체를 약 55℃이상의 온도에서 고온성 바실러스 스티아 로더모필러스(Bacillus stearothermophilus) SD-1의 효소와 반응시키는 것을 특징으로 하는 대응하는 N-카르바모일-D-아미노산의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효소는 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1 균체 자체 또는 그의 변형물인 것을 이용하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 균체 또는 그의 변형물은 고정화된 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 효소는 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1 유래의 추출물, 부분 정제, 또는 완전 정제된 효소인 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 추출물, 부분 정제, 또는 완전 정제된 효소는 담체에 고정화된 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 담체는 마그네슘 알루미늄 실리케이트인 것인 방법.
  7. 제1항 내지 6항에 있어서, 상기 효소는 히단토인 가수 분해 효소(히단토이나제)인 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 5-치환 히단토인 유도체는 DL-5-(파라-히드록시페닐)히단토인, DL-5-(2'-메틸티오에틸렌)히단토인, DL-5-페닐히단토인, 또는 DL-5-이소프로필히단토인인 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, N-카르바모일-D-아미노산은 N-카르바모일-D-파라-히드록시페닐글리신, N-카르바모일-D-페티오닌, N-카르바모일-D-페닐글리신, 또는 N-카르바모일-D-발린인 것인 방법.
  10. 바실러스 스티아로더모필러스 SD-1 유래의 추출물, 부분 정제, 또는 완전 정제된 효소를 마그네슘 알루미늄 실리케이트에 고정화시키는 것을 특징으로 하는 고정화 효소의 제조 방법.
  11. 마그네슘 알루미늄 실리케이트에 고정화된 것이 특징인 바실러스 스티아로더 모필러스 SD-1의 효소.
KR1019940005833A 1994-03-23 1994-03-23 내열성 d-히단토이나제 활성을 갖는 고온성 신규 미생물을 이용한 n-카르바모일-d-아미노산의 제조 방법 KR970005487B1 (ko)

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