KR960015199B1

KR960015199B1 - 인터페론-γ의 억제제로서의 BCRF1 단백질

Info

Publication number: KR960015199B1
Application number: KR1019920701474A
Authority: KR
Inventors: 더블유. 무어 케빈; 에이.카스텔레인 로버트
Original assignee: 쉐링 코포레이션; 제임스 알. 넬슨
Priority date: 1989-12-20
Filing date: 1990-12-18
Publication date: 1996-11-01
Also published as: CZ283049B6; MX9203409A; ES2064082T3; AU652732B2; WO1991009127A1; US5736390A; OA09703A; DK0506836T3; FI922770A0; MY107449A; HUT65369A; IE904588A1; IE72203B1; PT96231B; JPH05503846A; CN1057012C; NO922456D0; NZ236512A; IL96715A0; PT96231A

Abstract

내용없음.

Description

[발명의 명칭]

인터페론-γ의 억제제로서의 BCRF1 단백질

[도면의 간단한 설명]

제1도는 BCRF1의 생산에 유용한 포유 동물 발현 벡터를 도시한다.

제2도는 BCRF1의 생산에 유용한 세균 발현 벡터를 도시한다.

[발명의 상세한 설명]

[발명의 분야]

본 발명은 일반적으로 과잉 인터페론-γ(IFN-γ) 생성과 관련된 질환을 치료하는 방법 및 조성물, 보다 특정하게는 IFN-γ의 수준을 효과적으로 감소시키기 위해 엡스타인 바르 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV) 단백질 BCRF1을 사용하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

[배경]

면역계는 조직, 세포 타입 및 가용성 인자의 고도로 상호 작용성인 복합체를 포함한다. 최근, 몇몇 질환 및 면역 장해가 면역계의 특정 성분, 특히 사이토킨 간의 불균형과 연관될 수 있음이 제시된 바 있다[참조 : Mosmann et al., Ann. Rev. Immunol., Vol. 7, pgs. 145~173(1989); Cher et al., J. Immunol., Vol 138, pgs. 3688~3694(1987); Mosmann et al., Immunol. Today, Vol. 8, pgs. 223~227(1987); and Heinzel et al., J. Exp. Med., Vol. 169, pgs. 59~72(1989)]

예를 들면 감마 인터페론(IFN-γ)의 과잉 생산이 주요 조직 적합성 컴플렉스(MHC)와 관련된 자가 면역 질환에 책임이 있음을 제시하는 다수의 증거가 있다[참조 : Hooks et al., New England J. Med., Vol. 301, pgs. 5~8(1979)(자가 면역성과 상호관련된 IFN-γ의 상승된 혈청 수준); Basham et al., J. Immunol., Vol 130, pgs.1492~1494(1983)(IFN-γ은 MHC 유전자 생성물 발현을 증가시킬 수 있다); Battazzo et al., Lancet, pgs. 1115~1119(11/12/83)(특정 형태의 자가 면역성과 상호 관련된 변체 MHC 유전자 생성물 발현); Hooks et al., Ann. N.Y.Acad. Sci., Vol. 301, pgs.21~32(1980)(SLE 환자의 질환의 보다 큰 심각성과 상호 관련된 보다 높은 IFN-γ수준, 및 인터페론의 히스타민 방출 상승 활성은 항-인터페론 혈청에 의해 억제될 수 있다); Jacob et al., J. Exp. Med. Vol., 166, pgs. 798~803(1987)(항-IFN-γ 모노클로날 항체를 차단하여 전신적 홍반성 낭창에 걸린 마우스 모델에서 질환 상태의 개시를 경감시키거나 지연시킴); 및 Iwatani et al., J. Clin. Endocrin. and Metabol., Vol. 63, pgs. 695~708(항-IFN-γ 모노클로날 항체는 류코아글루티닌-자극된 T 세포의 HLA-DR 발현을 야기시키는 능력을 제거한다)]. 과잉의 IFN-γ는 MHC 유전자 산물의 비적절한 발현을 야기시키고, 계속하여 이들의 세포가 MHC 산물을 비적절하게 발현시키고 산물의 컨텍스트(context)에 있어 자가 항원을 나타내는 조직에 대해 자가 면역 반응을 야기시킨다고 가정되어 왔다. 따라서 문헌[참조 : McDevit, Clin, Res., Vol. 34, pgs. 163~175(1985)은 자가면역 환자에게, 예를 들면 IFN-γ 길항제를 투여함으로써 IFN-γ 수준을 감소시키면 이로운 효과를 야시키킬수 있다고 제안하고 있다.

상기 증거 이외에도, IFN-γ는 또한 단핵 세포상에서 Fcε수용체의 수 및 밀도를 증가시키는 이의 능력에 의해 앨러지에 있어 중요한 역할을 할 수 있고; 또한 유육종증 및 건선의 발병에 연루되어 있으며; 세포-매개된 면역성을 증가시켜, 알로제닉(allogenic)이식 환자의 조직 거부에 있어 중요한 역할을 한다고 간주되고 있다.

상기의 관점에서, IFN-γ 수준을 감소시킬 수 있는 화합물의 입수 가능성이, 류마티스 관절염, 전신적 홍반성 난창(SLE), 중증성 근무력증, 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 갑상선염 등을 포함하여, 몇몇 기생충 질환, 앨러지 및 MHC-관련된 면역 장해와 같은 비적절한 면역 반응과 관련된 질환 치료에 매우 유리할 수 있다.

[발명의 요약]

본 발명은 고수준의 IFN-γ 생성과 관련된 질환을 치료하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 엡스타인-바르 바이러스로부터 유도된 단백질인 BCRF1을 질환-조절량으로 투여하는 단계를 포함함을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 재조합 BCRF1 제조용 발현벡터, 정제된 BCRF1 및 본 방법으로 사용하기 위한 약제학적 조성물을 포함한다. 바람직하게, 본 발명에 따라 사용되는 BCRF1은 본원중 서열 확인번호 1(여기서, 약어는 L형 아미노산이고, 아미노산은 N-말단으로부터 출발하는 것으로 열거되어 있다)에 도시된 아미노산 서열에 의해 정의되는 개방 판독 프레임의 성숙한 폴리펩타이드 그룹중에서 선택된다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 과잉의 IFN-γ생성과 관련된 질환을 치료하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 부분적으로, 최근 발견된 단백질[사이토킨 합성 억제 인자(CSIF)로 지칭됨]을 암호화하는 헥산 서열이 EBV BCRF1전사 해독 프레임(open reading frame)과 높은 정도로 상동성을 갖고 있다는 발견을 근거로 하고 있다. EBV는 모든 사람 집단에서의 풍토성 사람 헤르페스 바이러스로서, 여러 질환과 관련되어 있다[참조 : Dillner et al., Adv. Cancer Res., Vol 50, pgs. 95~158(1988); Thorley -Lawson, Biochim. Biophys. Acta, Vol. 948, pgs. 263~286(1988); 및 Tasato, Adv. Cancer Res., Vol. 49, pgs. 75~125(1987)]. EBV는 약 172kbp의 이본쇄 DNA 게놈을 갖는다[참조 : Baer et al., Nature, Vol. 310, pgs. 207~211(1984)]. 게놈은 EBV에 의해 생성되는 단백질에 명백히 상응하는 다수의 전사 해독 프레임을 함유하는데, 이중 하나가 BCRF1이다.

본 발명은 BCRF1 전사 해독 프레임의 성숙한 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 분비되는 단백질에 있어서, 전사 해독 프레임은 보통, 이의 N-말단이 시그날 펩타이드와 공유 결합된 성숙한 또는 분비되는 생성물로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화한다. 시그날 펩타이드는 성숙한 또는 활성인 폴리펩타이드 분비 이전에 절단된다. 절단 부위는 실험적 규칙으로부터 고도의 정확성으로 예상될 수 있고[참조 : von Heijne, Nucleic Acids Research, Vol. 14, pgs. 4683~4690(1986)], 시그날 펩타이드의 정확한 아미노산 조성은 이의 기능에 비제한적인 것으로 나타난다[참조 : Randall et al., Science. Vol. 243, pgs. 1156~1159(1989); Kaiser et al., Science, Vol. 235, pgs. 312~317(1987)]. 결과적으로, 성숙한 단백질은 일반식(Ⅰ)에 의해 정의된 전사 해독 프레임에 의해 암호화되는 것과 매우 상이한 시그날 펙타이드를 암호화하는 벡터에 의해 용이하게 발현된다.

매우 다양한 발현 시스템(예 : 숙주-발현 벡터 결합체)을 사용하여 본 발명의 단백질을 제조할 수 있다. 가능한 숙주 세포 타입에는 세균, 효모, 곤충, 포유동물 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 발현 시스템의 선택 및/또는 변형의 수행을 보장해주는 다양한 문헌이 입수 가능하다[참조 : de Boer and Shepard, "Strategies of Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli", pgs. 205~247, in Kroon, ed, Genes : Structure and Expression(John Wiley & Sons, New York, 1983), (다수의 이 콜라이 발현 시스템에 대해 논함); Kucherlapati et al., Critical Reviews in Biochemistry, Vol, 16, Issus 4, pgs. 349~379(1984), and Banerji et al., Genetic Engineering, Vol. 5, pgs. 19~31(1983)(포유동물 세포의 형질감염 및 형질전환 방법을 논함); Keznikoff and Gold, eds., Maximizing Gene Expression(Butterworths, Boston, 1986)(이. 콜라이, 효모 및 포유동물 세포내 유전자 발현의 선별된 총론에 대해 논함); 및 Thilly, Mammalian Cell Technology(Butterworths, Boston, 1986)(포유동물 발현 시스템에 대해 논함)]. 이와 마찬가지로, 본 발명에 사용하기 적합한 발현 벡터를 생산 및/또는 변형시키기 위하여 특정 cDNA 및 발현 조절 서열을 결합시키고/시키거나 조작하는 기술 및 조건을 기술하는 다수의 문헌이 입수 가능하다[참조 : Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 1989]

이. 콜라이 발현 시스템은 본원중 참조로서 인용되고 있는 리그스(Riggs)의 미합중국 특허 제4,431,739호에 기술되어 있다. 이. 콜라이 내에서의 고도의 발현을 위해 특히 유용한 원핵성 프로모터는, 본원중 참조로서 인용되고 있는 문헌[참조 : 드 보어(de Boer)의 미합중국 특허 제4,551,433호]에 기술되어 있는 tac 프로모터 및 또한 본원중 참조로서 인용되고 있는 문헌[참조 : Remaut et al., Gene, Vol 15, pgs. 81~93 (1981)]에 기술되어 있는 pL 프로모터이다. 이. 콜라이 숙주에 대한 분비 발현 벡터 또한 입수가 가능하다. 특히 유용한 것은 문헌[참조 : Ghrayeb et al., in EMBO J., Vol. 3, pgs. 2437~2442(1984)]에 기술되어 있는 pIN-Ⅲ-ompA 벡터로서, 여기서 전사되는 cDNA는 ompA 단백질의 시그날 펩타이드를 암호화하는 이. 콜라이 OmpA 유전자 분획에 융합됨으로써, 계속하여 세균의 페리플라스마 공간(periplasmic space)내로 성숙한 단백질의 분비를 야기시킨다. 미합중국 특허 제4,336,336호, 제4,411,994호, 제4,332,892호 및 제4,338,397호 또한 원핵생물용 분비 발현 벡터를 기술하고 있다. 따라서 상기 문헌들은 본원중 참조로서 인용되고 있다. 이. 콜라이 균주[예 : W3110(ATCC No. 27325), JA221, C600, ED767, DH1, LE392, HB101, X1776(ATCC No. 31244), X2282, RR1(ATCC No. 31343)MRC1], 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주; 및 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르세신스(Serratia marcescens)와 같은 기타 장내균과 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속의 다양한 종들을 포함하여 다수의 세균 균주가 원핵성 발현 벡터를 위한 적합한 숙주이다. 진핵성 단백질 발현에 유용한 이. 콜라이 K12X1776과 같은 세균 균주를 유도하는 일반적 방법은 커디스 3세(Curtis Ⅲ)의 미합중국 특허 제4,190,495호에 기술되어 있다. 이에 따라, 상기 문헌은 본원중 참조로서 인용되고 있다. 원핵성 및 진핵성 미생물 이외에, 다세포 유기체로부터 유도한 세포를 포함하는 발현 시스템을 또한 사용하여 본 발명의 단백질을 생성시킬 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 해독후 프로세싱 기작이 생물학적으로 활성인 포유동물 단백질을 보다 잘 생산하기 때문에 포유동물 발현 시스템이 특히 관심의 대상이 된다.

몇몇 DNA 종양 바이러스가 포유동물 숙주용 벡터로서 사용되어 왔다. 특히 중요한 것은 세균성 복제 조절서열에 결합된 SV40 복제, 전사 및/또는 해독 조절 서열을 포함하는 다수의 벡터, 즉, 오카야마 및 베르그[참조 : Okayama and Berg, Mol. Cell. Biol. Vol. 2, pgs. 161~170(1982) 및 Mol. Cell. Biol. Vol. 3pgs. 280~289(1983)]에 의해 개발되고 다케베 등[참조 : Takebe et al., 특히 Mol. Cell. Biol. Vol. 8 pgs. 466~472(1988)]에 의해 개선된 pcD 벡터를 들 수 있다. 따라서, 상기 문헌들은 본원중 참조로서 인용되고 있다. 또다른 SV40-기본의 포유동물 발현 벡터에는 문헌[참조 : Kaufman 및 Sharp, Mol. Cell. Biol. Vol. 2 pgs. 1304~1319(1982), 및 Clark et al., U.S.patent 4,675,285, 모두 본원중 참조로서 인용됨]에 기술된 아데노 바이러스 조절 인자를 함유하는 벡터를 포함한다. 멍키 세포는 통상 상기 벡터에 있어 바람직한 숙주이다. SV40 ori 서열 및 완전한 A 유전자를 함유하는 상기 벡터는 멍키 세포내에서 자가 복제될 수 있다(비자가복제 플라스미드보다 고도의 복제수 및 또는 보다 안정한 복제수를 제공한다). 또한 완전한 A 유전자를 함유하지 않고 SV40 ori 서열을 함유하는 벡터는 COS7 멍키 세포내에서 고도의 복제수(비안정적임)로 자가복제될 수 있다[참조 : Gluzman, Cell, Vol. 23, pgs. 175~182(1981), ATCC(기탁번호 CRL 1651)로부터 입수 가능]. 상기 SV40-기본의 벡터 또한 숙주 세포 DNA내로 혼입시킴으로써 마우스 L세포와 같은 기타 포유 동물 세포를 형질전환시킬 수 있다.

본 발명의 BCRF1의 생물학적 활성은 IFN-γ 억제 검정으로 용이하게 측정한다. 이러한 검정은 IFN-γ를 합성하는 세포주 또는 세포 집단을 필요로 한다. 편리하게는, 식물성 혈구 응집소(PHA)와 같은 유사 분열 물질(mitogen)로 자극되는 말초 혈액 임파구(PBLs)는 상기 세포 집단으로 작용할 수 있다. 대략 상기 검정은 하기와 같이 수행한다 : PHA-자극된 PBLs을 두개의 동일한 부분으로 분할한다. 한 부분에, BCRF1을 함유하는 샘플을 가한다. 다른 부분은 대조로서 작용한다. 수일후 두 배양물의 상동액중 IFN-γ를 시험한다. 이것은 편리하게는 통상 시판되는 IFN-γ에 대한 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 사용하여 표준 ELISA 검정으로 수행한다[참조 : Genzyme Inc. (Boston, MA)]. 달리는, 검정 수행에 의한 정보는 예를 들면 RNA-블롯팅, PCR 또는 기타 방법을 통해 특정한 전사된 IFN-γ mRAN의 양일 수 있다. PBLs은 문헌[참조 : Mishell et al., eds., Selected Methods in Cellular Immunology(Freeman, New York, 1980).]중의 표준 기술을 사용하여 수득한다.

본 발명의 폴리펩타이드가, 예를 들면 형질전환된 효모 또는 포유 동물 세포의 분비 산물로서 가용형으로 발현되는 경우, 황산암모늄 침전법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 전기 영동, 친화성 크로마토그래피등의 단계를 포함하여 당해 분야의 표준 방법에 따라 이들을 정제할 수 있다 : 문헌[참조 : Enzyme Purification and Related Techniques, Methods in Enzymology, 22 : 233-577(1977), 및 Scopes, Protein Purification Principles and Practice(Springer-Verlag, New York, 1982)]은 상기 정제법에 대한 지침서이다. 마찬가지로, 본 발명의 폴리펩타이드가 예를 들면 응집체, 봉입체 등의 불용성 형태로 발현되는 경우, 원심분리에 의해 파괴된 숙주 세포로부터 봉입체를 분리하고, 카오트로픽제(chaotropic agent) 및 환원제를 사용하여 봉입체를 용해하며, 용해된 혼합물을 희석한 후 카오트로픽제 및 환원제의 농도를 저하시키는 단계를 포함하여 당해 분야의 표준 방법을 사용하여 이들을 정제함으로써 폴리펩타이드가 생물학적으로 활성인 구조를 갖게 한다. 상기 후자의 방법은 본원중 참조로서 인용된 하기 문헌에 기술되어 있다[참조 : Winkler et al., Biochemistry, 25 : 4041~4045(1986); Winkler et al., Biotechnology, 3 : 922~998(1985); Koths et al., 미합중국 특허 제4,569,790호; 및 유럽 특허원 제86306917.5 및 86306353.3호]

본원중 사용된 용어 "유효량"이란 과잉의 IFN-γ에 의해 조절되는 질환 상태의 증상을 경감시키기에 충분한 양을 의미한다. 특정 환자에 대한 유효량은 치료되어질 질환 상태, 환자의 전체적인 건강, 투여 방법, 부작용의 경중도 등과 같은 요인에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로 BCRF1은 유효량의 BCRF1 및 약제학적 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서 투여한다. 약제학적 담체는 본 발명의 조성물을 환자에게 운반하기에 적합한 어떠한 친화성, 비-독성 기재일 수 있다. 일반적으로, 상기 약물의 비경구 투여에 유용한 조성물은 널리 공지되어 있다[참조 : Remington's Pharmaceutical Science, 15th Ed.(Mack Publishing Company, Easton, PA (1980)]. 달리, 본 발명의 조성물을 이식성 약물 운반 시스템에 의해 환자 체내로 도입시킬 수 있다[참조 : Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., Vol 24, pgs. 199~236(1984); Lewis, ed. Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals(Plenum Press, New York, 1981); 미합중국 특허 제3,773,919호; 제3,270,960호; 등].

비경구 투여하는경우, BCRF1을 약제학적 담체와 함께 단위 용량 주사형(예 : 액제, 현탁제 또는 에멀존)으로 제형화한다. 상기 담체는 본질적으로 비독성이고 비치료성이다. 상기 담체의 예로 보통의 식염수, 링거용액, 덱스트로스 용액 및 행크 용액(Hank's solution)을 들 수 있다. 고정된 오일 및 에틸 올리에이트와 같은 비수성 담체 또한 사용될 수 있다. 바람직한 담체는 5% 덱스트로스/식염수이다. 담체는 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 기재로서 예를 들면 완충제 및 방부제와 같은 부가제 미량을 함유할 수 있다. BCRF1은 바람직하게는 약 5 내지 20㎍/㎖의 농도로, 응집체 및 기타 단백질을 실질적으로 함유하지 않는 정제형으로 제형화된다. 바람직하게, BCRF1을 연속 주사로 투여함으로써 1일당 약 50 내지 800㎍의 양이 투여되도록 한다(예 : 약 1 내지 16㎍/㎏/일). 1일 주입률은 부작용, 혈액 세포수 등을 모니터함에 따라 다양할 수 있다.

[실시예]

[실시예 1]

COS7 멍키 세포내에서 BCRF1의 발현

BCRF1에 대한 개방 판독 프레임을 암호화하는 유전자를 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응으로 증폭시켜 증폭된 단편을 EcoRI-분해된 pcD(SRα) 벡터(제1도)내로 나중에 삽입시킨다. 삽입되는 단편의 암호화 쇄가 서열확인번호 2에 도시되어 있다.

적절한 방향으로 삽입물을 갖게 되는 클론은 BCRF1의 발현 및/또는 제한 분해물의 전기영동 패턴에 의해 확인된다. BCRF1 유전자를 갖는 상기와 같은 벡터를 pBCRF1(SRα)로 지정되는데 이는 기탁번호 제68193호로 ATCC에 기탁되어 있다. 표준 기술로 분리한 이.콜라이 MC1061 내에서 pBCRF1(SRα)를 증폭시키고 하기와 같이 COS7 멍키 세포를 형질전환시키는데 사용한다 : 형질 감염시키기 하루전에, 약 1.5×10⁶개 COS7멍키 세포를, 5% 태 송아지 혈청(FCS) 및 2mM 글루타민을 함유하는 둘베코의 변형된 이글 배지(DME)내 각각 100mm 평판으로 씨이딩한다. 형질감염 수행을 위해, COS7 세포를 트립신과 함께 배양시켜 디쉬로부터 COS7 세포를 제거하고, 혈청-비함유된 DME 중에서 2회 세척한 후 혈청-비함유된 DME중 10⁷세포/㎖로 현탁시키다. 분취량 0.75㎖를 DNA 20㎍과 혼합하고 0.4cm 멸균 전기영동 큐벳트로 옮긴다. 10분후, 세포를 200볼트, 960μF로 바이오래드 진 펄서 유니트(BioRad Gene Pulser Unit)내에서 펄스한다. 추가로 10분후, 큐벳트로부터 세포를 제거하고 5% FCS, 2mM 글루타민, 페니실린, 스트렙토 마이신, 및 젠타마이신을 함유하는 DME 20㎖에 가한다. 혼합물을 4개의 100mm 조직 배양 디쉬로 분취한다. 37℃ 5% CO₂하에 12 내지 24시간후, 1% FCS만을 함유하는 유사한 배지로 배지를 교환하고 37℃, 5% CO²하에 72시간 동안 좀 더 배양한 후 배지를 회수하여 IFN-γ합성을 억제하는 이의 능력에 대해 검정한다.

새로이 분리시킨 PBLs(약 2×10⁶세포/㎖) 분취량 10㎖를, (i) 5% FCS 및 2mM 글루타민으로 보충시킨90% DME 및 (ii) pBCRF1(SRα)으로 미리 형질감염시킨 COS7세포로부터의 10% 상등액으로 이루어진 배지내 PHA(100㎎/㎖)과 함께 37℃에서 배양한다. 24시간 후 세포 및 상등액을 수거하여 각각 IFN-γ mRNA 또는 IFN-γ 단백질의 존재에 대하여 검정한다. 비관련된 cDNA 삽입물을 함유하는 플라스미드로 미리 형질감염시킨 COS7 배양물로부터의 10% 상등액을 사용하는 점을 제외하고 대조 또한 동일하게 처리한다. BCRF1-처리된 샘플은 대조에 비해 IFN-γ 합성을 약 50% 억제하였다.

[실시예 2]

에스케리챠 콜라이내 BCRF1의 발현

서열확인번호 3에 제시된 서열을 갖는 성숙한 BCRF1을 암호화 하는 유전자를이.콜라이 내에서 발현시킬 수 있다.

pBCRF1(SRα)의 cDNA 삽입물을 M13 플라스미드내로 재클로닝하는데, 여기서 부위-지정된 돌연변이로 2회 변형된다 : 처음에는 성숙한 BCRF1 폴리펩타이드에 대한 암호화 영역의 5' 말단에서 ClaI 부위를 형성하고, 두번째는 성숙한 BCRF1 폴리펩타이드에 대한 암호화 영역 3' 말단에서 BamHI 부위를 형성한다. 그런다음 돌연변이화된 서열을 하기 TRPC11 발현 벡터내로 용이하게 삽입시킨다.

합성 콘센서스 RBS 단편을 ClaI 링커(ATGCAT)에 연결시키고 수득한 단편을 ClaI-제한된 pMTllhc(ClaI 부위를 함유하도록 미리 변형시킴)내로 클로닝시킴으로써 TRPC 11 벡터를 작제한다. pMTllhc는 pBR322의 소형(2.3kbp) 고복제수의, AMP^R, TET^S유도체로서 πVX 플라스미드 EcoRI-HindⅢ 폴리링커 영역을 함유한다[πVX는 문헌(참조 : Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)에 기술되어 있다]. 이것은 pMTllhc를 EcoRI 및 BamHI으로 제한하고 수득된 5-스틱키 밑단을 충진시키며 ClaI 링커(CATCGATG)로 연결시킴으로써 ClaI 부위를 형성하도록 변형시킴으로써 EcoRI 및 BamHI 부위를 회복하고 SmaI 부위를 ClaI 부위로 대체하게 된다. TRPC11 작제물로부터의 하나의 형질 전환체는 ClaI 부위가 측면에 위치한 템덤 RBS 서열을 갖는다. ClaI 부위중 하나 및 RBS 서열의 두번째 복제물 일부를, 상기 플라스미드를 PstI으로 분해하고 Baβ1 뉴클레아제로 처리한 후 EcoRI으로 제한하고 4개의 모든 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트의 존재하에 T4 DNA 폴리머라제로 처리함으로써 제거한다. 수득된 30 내지 40개 bp 단편을 PAGE로 회수하고 SmaI-제한된 pUC12 내로 클로닝한다. 그런 다음 pKC101[참조 : Nichols et al., in Methods in Enzymology, vol. 101, pg. 155(Academic Press, N.Y. 1983)]로부터 유도한 248bp 이.콜라이 trpP-함유 EcoRI 부위로 클로닝 하여 TRPC11 작제물을 완성시킨다(제2도). TRPC11을 먼저 ClaI 및 BamHI으로 분해하고, 정제한 후 이를 표준 결합 용액중에서 성숙한 BCRF1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 M13의 ClaI-BamHI 단편과 혼합함으로써, BCRF1에 대한 벡터로서 사용한다. TRPC11-BCRF1으로 명명된 삽입물-함유 TRPC11을, ATCC에서 기탁 번호 제33876호로 입수가능한 이.콜라이 K12 균주 JM101내에서 증식시킨다.

본 발명자는 pBCRF1(SRα)를 함유하는 이.콜라이 MC1061을 미합중국 메릴랜드 록크빌 소재의 아메리칸 타입 걸쳐 컬렉션에 기탁번호 제68193호로 기탁하였다. 상기 기탁은 특허 목적을 위한 배양물 기탁에 대한 ATCC의 약정에 따라 제공된 조건하에 1989년 12월 20일 이루어짐으로써, 상기 기탁물은 35 USC 122 및 37 CFR 1.14에 따라 미합중국 상무성 특허 상표청에서 입수 가능하고, 미합중국 특허 허여시 대중에서 분양되어져야 하므로 상기 기탁물은 보존되어야 한다. 기탁된 균주의 입수 가능성은, 특허법에 따라 어떠한 정부 기구하에 인정된 권리에 위반하여 발명을 실행하는 인가로서 해석되어서는 안된다.

상기 기탁물은 미생물 기탁에 대한 부다페스트 조약의 요구에 부합되도록 변형되었다.

본 발명의 상기 양태에 대한 기재는 설명 및 기술을 목적으로 제시되었다. 이들은 기재된 상세한 형태로 발명을 전적으로 설명하거나 제한하려는 의도는 없고, 상기 교시의 측면에서 명백한 다수의 변형 및 변화가 가능하다. 본 발명의 원리를 최적으로 설명하기 위해 본 발명의 양태를 선별하여 기술함으로써 당해 분야의 숙련가로 하여금 숙지될 수 있는 특정 용도에 적합하도록 다양한 양태 및 다양한 변형을 가해 본 발명을 최대로 사용할 수 있도록 하였다. 발명의 영역은 첨부된 특허 청구의 범위에 의해 제한시키고자 한다.

서열 리스트

서열확인번호 : 1

서열 타입 : 아미노산

서열 길이 : 170개 아미노산 잔기

본쇄 : 일본쇄

형태 : 선형

분자타입 : 단백질/폴리펩타이드

공급원 유기체 : 엡스타인-바르 바이러스

특성 : BCRF-1

서열확인번호 : 2

서열 타입 : 뉴클레오타이드

서열 길이 : 498개 염기

본쇄 : 일본쇄

형태 : 선형

분자 타입 : DNA 서열

공급원 유기체 : 엡스타인-바르 바이러스

특성 : BCRF-1

서열확인번호 : 3

서열 타입 : 아미노산

서열 길이 : 147개 아미노산 잔기

본쇄 : 일본쇄

형태 : 선형

분자 타입 : 단백질/폴리펩타이드

공급원 유기체 : 엡스타인-바르 바이러스

특성 : BCRF-1

Claims

하기에 도시된 아미노산 서열(서열확인번호 3)을 갖는, 인터페론-γ의 합성을 억제할 수 있는 BCRF1단백질.
세균, 효모, 곤충 및 포유동물 세포중에서 독립적으로 선택된 숙주내에서 BCRF1 단백질을 발현시킬 수 있고, SV40 기본 벡터, pIN-Ⅲ-OmpA 벡터 및 pBR322 벡터중에서 선택되는 벡터로부터 작제된 재조합 발현 벡터.
인터페론-γ의 양을 감소시켜 인터페론-γ의 과잉 생성으로 매개되는 질환의 증상을 경감시키는데 효과적인 양의, 서열 확인번호 1 또는 3의 아미노산 서열을 갖는 BCRF1을, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는, 인테페론-γ의 과잉 생성과 관련된 질환을 조절하기 위한 약제학적 조성물.
하기에 도시된 아미노산 서열(서열확인번호 1)을 갖는, 인터페론-γ의 합성을 억제할 수 있는 BCRF1 단백질.
제2항에 있어서, pBCRF1(SRα)인 재조합 발현 벡터.
제3항에 있어서, BCRF1이 약 1 내지 16㎍/㎏(체중)/일의 양을 정맥내 투여되도록 적응된 조성물.
제3항에 있어서, 5 내지 29㎍/㎖의 BCRF1을 포함하는 조성물.
제3항에 있어서, 치료되는 질환이 기생추 질환인 조성물.
제3항에 있어서, 치료되는 질환이 앨러지성 질환인 조성물.
제3항에 있어서, 치료되는 질환이 MHC-관련된 면역장해인 조성물.
제10항에 있어서, MHC-관련된 면역 장해가 류마티스 관절염, 전신적 홍반성 낭창(SLE), 중증성 근무력증, 인슐린-의존성 진성 당뇨병 또는 갑상선염인 조성물.
서열확인번호 1 또는 서열확인번호 3에 도시된 아미노산 서열에 의해 정의되는 BCRF1 단백질을 암호화하는 그룹중에서 선택되는, 엡스타인 바르 바이러스의 BCRF1 단백질을 암호화하고, 벡터를 함유하는 숙주에 의해 발현될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 작제하는 단계, 수득된 벡터를 숙주내로 혼입시키는 단계, 및 뉴클레오타이드 서열의 단백질로의 발현에 적합한 조건하에서 배양 배지중에 숙주를 유지하는 단계들을 포함하는, 인터페론-γ의 합성을 억제할 수 있는 서열확인번호 1 또는 3의 아미노산 서열을 갖는 엡스타인-바르 바이러스 단백질 BCRF1의 제조 방법.
제12항에 있어서, 벡터를 함유하는 숙주가 세균, 효모, 곤충, 또는 포유동물 세포인 방법.
제12항에 있어서, 벡터가 pBCRF1(SRα)인 방법.