KR960005729B1 - 안티트롬빈-iii의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

안티트롬빈-III의 제조방법

본 발명은 고순도로 정제된 안티트롬빈-III의 제조방법에 관한 것이다.

더욱자세하게는 인혈장이나 큰(cohn) 분획IV로 부터 고순도의 안티트롬빈-III를 고수율로 정제하는 방법에 관한 것이다.

안티트롬빈-III는 정상인의 혈액내에 0.1-2.0mg/㎖존재하는 분자량 58,000정도의 당단백질로서, 혈액내의 트롬빈, 활성화된 IX인자, X인자, XI 인자등의 활성을 저해하여 혈액응고 조절에 매우 중요한 역활을 한다.

안티트롬빈-III는 혈액응고의 활성화 및 섬유소 용해기작에 관여하는 각종 세린프로테아제의 저해제로서, 선천성 안티트롬빈-III 결손증, 간질환 특히 간경변으로 안티트롬빈-III의 생성감소를 보이는 증상, 신장기능 장애로 안티트롬빈-III를 뇨로 배출하는 중상등의 치료에 널리 사용되고 있는 항혈액응고제이다.

종래에 사용중인 안티트롬빈 제제는 여러가지 공지된 제조방법에 의하여 생산되어 왔다. 즉, 박스터(Baxter)사에서 제조하는 안티트롬-III는 혈장을 헤파린 세파로스 겔로 흡착 정제하고 20% PEG 처리한 후, 다시 헤파린 세파로스 겔로 흡착 정제하며, 독일 베링베르케(Behringwerke)에서는, 분획 I 상증을 헤파린 프락토겔(Fractogel)에 흡착 정제하고 31.3% 황산암모늄에 불순물을 제거한 후 45.9% 황산암모늄에 다시 안티트롬빈-III를 정제하는 공정을 사용한다. 또한 미국의 커터(Cutter)사는 분획IV-1 침전물을 헤파린 올트로겔(Ultrogel)에 흡착 정제하여 농축 투석한 후 재차 헤파린 울트로겔로 정제한다. 그리고 카비비트럼(Kabivitrum AB) 사는 분획 I 상청을 헤파린 세파로스에 흡착 정제하여 양이온 교환수지를 통하여 이종단백을 제거한 후 이온교환수지를 통하여 재차 안티트롬빈-III를 정제한다. (Seminars in Hematology, Vol 28. No 1(Jan), 1991, p24-30) 그러나, 상기 방법들은 2, 3차에 걸친 많은 정제공정으로 인하여 수율이 20-39%로 높지 않은 단점이 있으며, 대량생산시 공정이 복잡하고 공정중에 수율이 높지 못해 원가에 커다란 부담을 주어 왔다.

본 발명은, 공지된 제조방법에 비하여 단축된 정제공정 및 순도와 수율이 월등히 향상된 안티트롬빈-III의 제조방법을 제공한다.

본 발명은, 혈장 또는 콘 분획VI에 에탄올을 10-25% 되게 첨가하고 pH를 6.5-8.0으로 고정한 후 헤파린 흡착겔에 안티트롬빈-III를 흡착 정제함을 특징으로 하는 고순도, 고수율의 안티트롬빈-III 제조방법을 제공한다.

본 발명에 사용되는 헤파린 흡착겔은 셀루파인 설페이트, 세파로즈, 셀룰로즈, 울트로겔, 트리아실 등의 공지된 겔을 사용할 수 있다. 냉동 인혈장을 용해한 후 원심분리하여 얻은 상층(Cryosupernatant)이나 콘 분획IV에 20mM인산 완충액을 사용하여 pH 6.5-8.0으로 조정하고 에탄올이 10-25% 되도록 첨가한다. 따로 셀루파인 설페이트 수지등의 친화성 크로마트그라피 수지를 기질(Matrix)로 사용하여 수지 ㎖당 0.2g의 브로모시아노겐(CNBr)로 수지를 pH 11로 고정활성화 시킨후, MW 6000 이상의 헤파린과 그 이하의 헤파린을 0.5M 염화나트륨이 함유된 탄산나트륨 완충액(pH8.3)에 용해하여 혼합교반 후 헤파린과 수지를 결합시킨다. 제조된 헤파린 흡착 친화성 수지에 에탄올이 10-25%인 혈장상층이나 콘 분획IV를 혼합교반하여 안티트롬빈-III를 수지에 결합시킨다. 에탄올의 농도가 적정 수준에 못미치거나 지나치면 안티트롬빈-III의 흡착이 타물질에 의하여 많은 방행을 나타내어 수율이 떨어짐을 알 수 있다. 다음, pH가 7.3인 인산염 완충액을 수지부피의 10배 정도 사용하여 수지에 흡착되어 있지 않은 단백질 및 지질을 제거하기 위해 세척한다. 그후, 수지를 2.0M 염화나트륨이 함유된 상기와 동일한 완충액으로 수저부피의 2배 량으로 안티트롬빈-III를 용출시킨다.

이렇게 제조된 안티트롬빈-III는 비활성도(활성도/단백mg)가 10, 회수율은 약 50%로 고순도 고수율임을 알수 있다.

이하 실시예에서 본 발명은 더욱 상세하게 설명하나, 실시예가 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

[실시예 1]

냉동 인혈장(plasma)을 용해 후 원심분리하여 얻은 상층(Cryosupernatant)120ℓ를 에탄올 농도가 20%가 되도록 가하고 pH7.2로 조정하였다. 생성된 침전을 제거한 용액에 헤파린 세파로즈겔을 2.4ℓ첨가하여 90분 동안 교반하여 안티트롬빈-III를 겔에 흡착시켰다. 이 겔을 칼람에 충진 후 20mM 인산 완충액에 염화나트륨 농도가 0.15M이 되도록 한 용액 12ℓ로 겔을 씻어내고 동일한 완충액에 염화나트륨의 농도가 2.0M이 되도록 조정한 용액 3ℓ로 안티트롬빈-III를 용출시켰다. 그 결과는 표 1에 나타나 있다.

1) Lowry법에 의하여 정량하였다.

2) 1 I. U는 정상인의 혈액 1㎖에 존재하는 안티트롬빈-III의 양으로 정의한다.

[실시예 2]

인 현장 분획 공정중 콘 분획 IV-1 또는 IV-3, 20kg을 0.15M 염화나트륨을 함유한 인산완충액 200ℓ와 혼합한 후 pH를 7.2로 조정하고 에탄올을 첨가하여 에탄올의 농도가 20%가 되도록 한다. 이 혼합액을 90분 동안 교반한 후 3000rpm에서 20분간 원심분리하여 침전물을 버리고 상층을 취한다. 이 상층에 헤파린 세파로즈겔 800㎖을 혼합하여 90분동안 교반하여 상층에 함유되어 있는 안티트롬빈-III를 겔에 흡착시켰다. 안티트롬빈-III를 흡착시킨 겔을 칼람에 충진후, 20mM 인산완충액에 염화나트륨의 농도가 0.15M이 되도록 한 용액 1.25ℓ로 겔을 씻어내고 동일한 완충액에 염화나트륨의 농도가 2.0M이 되도록 조정한 용액으로 안티트롬빈-III를 용출시켰다. 그 결과는 표-2에 나타나 있다.

1) Lowry법에 의하여 정량하였다.

2) 1 I. U는 정상인의 혈액 1㎖에 존재하는 안티트롬빈-III의 양으로 정의한다.

Claims (2)

1. 인혈장 또는 콘 분획 IV의 용출액에 헤파린 흡착겔을 통하여 안티트롬빈-III를 제조함에 있어서, 인혈장 또는 콘 분획IV의 용출액에 에탄올을 농도가 10-25% 되게 첨가하고 pH를 6.5-8.0으로 조절함을 특징으로 하는 안티트롬빈-III의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 헤파린 흡착겔이 헤파린 세파로즈겔, 헤파린 아가로즈겔, 헤파린 세파덱스겔, 헤파린 셀룰로즈겔, 헤파린 울트로겔, 헤파린 트리아실겔임을 특징으로 하는 안티트롬빈-III의 제조방법.