JP2521551B2 - 抗血友病因子の製造方法 - Google Patents
抗血友病因子の製造方法Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、本質的には極めて高純度な抗血友病因子
（FVIIIc）の製造方法、この方法により得られる抗血友
病因子（FVIIIc）およびそれを含む医薬組成物に関する
ものである。
（FVIIIc）の製造方法、この方法により得られる抗血友
病因子（FVIIIc）およびそれを含む医薬組成物に関する
ものである。
抗血友病因子（FVIIIc）を精製する種々の方法が、従
来技術で知られている。たとえば、国際出願の特許明細
書WO86/04486（ニューヨーク大学）には、糖、多価アル
コール、アミノ酸または塩の存在下、カラムクロマトグ
ラフィー手法を用いて抗血友病因子を精製する方法が記
載されている（同明細書の１ページ、16-23行および請
求項１、30ページを参照）。
来技術で知られている。たとえば、国際出願の特許明細
書WO86/04486（ニューヨーク大学）には、糖、多価アル
コール、アミノ酸または塩の存在下、カラムクロマトグ
ラフィー手法を用いて抗血友病因子を精製する方法が記
載されている（同明細書の１ページ、16-23行および請
求項１、30ページを参照）。
従来技術におけるこの方法では、糖、多価アルコー
ル、アミノ酸または塩類を含むこれらの添加物は、クロ
マトグラフィーの前、途中ないし終了時のいずれの段階
ででも加えられる。
ル、アミノ酸または塩類を含むこれらの添加物は、クロ
マトグラフィーの前、途中ないし終了時のいずれの段階
ででも加えられる。
クロマトグラフィーによる因子VIIIcの精製に関する
種々の文献が、この明細書の本文の３および４ページに
引用されているように、この糖の添加が従来技術で広く
用いられていることは、注目すべきである。これに関連
して、シュツットガルトにて出版のスロンブ・ヘモスタ
ス（Thromb.Haemostas）の48巻１号46ページ（1982年）
中にアウステン（Austen）により書かれた文献を参考に
することが有効である。ここでは、アミノヘキシルセフ
ァロースカラムでカラムの溶出に酢酸リジン緩衝液と食
塩水の勾配溶出を用いたクロマトグラフィーによる血漿
処理のための方法が述べられている。同様に、ジェイ・
クロマトグ（J.Chromatog.）257巻387ページ（1983年）
には、フォーレ（Faure）により、クロマトグラフ用の
カラムにアミノヘキシルセファロースを使用した冷却沈
澱物のクロマトグラフィーの際に、酢酸リジン緩衝液に
１ないし10％の蔗糖を使用して因子VIIIcを好収率で得
たことが記載されている。著者らは、糖の使用が分子複
合体の形成を阻害し得ることを示している。当該文献
は、アメリカ特許明細書4 743 680に対応している。
種々の文献が、この明細書の本文の３および４ページに
引用されているように、この糖の添加が従来技術で広く
用いられていることは、注目すべきである。これに関連
して、シュツットガルトにて出版のスロンブ・ヘモスタ
ス（Thromb.Haemostas）の48巻１号46ページ（1982年）
中にアウステン（Austen）により書かれた文献を参考に
することが有効である。ここでは、アミノヘキシルセフ
ァロースカラムでカラムの溶出に酢酸リジン緩衝液と食
塩水の勾配溶出を用いたクロマトグラフィーによる血漿
処理のための方法が述べられている。同様に、ジェイ・
クロマトグ（J.Chromatog.）257巻387ページ（1983年）
には、フォーレ（Faure）により、クロマトグラフ用の
カラムにアミノヘキシルセファロースを使用した冷却沈
澱物のクロマトグラフィーの際に、酢酸リジン緩衝液に
１ないし10％の蔗糖を使用して因子VIIIcを好収率で得
たことが記載されている。著者らは、糖の使用が分子複
合体の形成を阻害し得ることを示している。当該文献
は、アメリカ特許明細書4 743 680に対応している。
他の従来技術に関する明細書の例としては、アメリカ
特許4 508 709（EP-A-144 957に対応）ないしアメリカ
特許4 578 218（DE-A-3 504 385に対応）がある。従来
技術の他の方法がフランス特許明細書570 276に述べら
れている。これはマウス由来の免疫グロブリンが混在す
る結果となり、ヒトの治療の場合には不利になることは
当業者には容易に理解できる。
特許4 508 709（EP-A-144 957に対応）ないしアメリカ
特許4 578 218（DE-A-3 504 385に対応）がある。従来
技術の他の方法がフランス特許明細書570 276に述べら
れている。これはマウス由来の免疫グロブリンが混在す
る結果となり、ヒトの治療の場合には不利になることは
当業者には容易に理解できる。
特に、アルモール（ARMOUR）のヨーロッパ特許明細書
144 957（US-A-4 508 709に対応）では、因子VIIIcとビ
レブランド（Willebrand）因子の合併吸着につづき、ビ
レブランド因子を除くための因子VIIIcとビレブランド
因子の選択的脱着に基礎を置いた、因子VIIIcの精製の
方法が述べられている。この操作は、本発明の方法とは
根本的に異なっており、本発明の目的は、以下に見られ
るように、本質的にビレブランド因子不存の状態で、因
子VIIIcのみを吸着させることである。さらに、因子VII
Ic/ビレブランド因子混合物の吸着には、アルモールは
「緩衝液Ａ」と呼ぶpH約6.8の溶出液を用いているが、
これは塩化カルシウムを含んでいない（同明細書の５ペ
ージ6-18行および６ページ14-26行を参照）。
144 957（US-A-4 508 709に対応）では、因子VIIIcとビ
レブランド（Willebrand）因子の合併吸着につづき、ビ
レブランド因子を除くための因子VIIIcとビレブランド
因子の選択的脱着に基礎を置いた、因子VIIIcの精製の
方法が述べられている。この操作は、本発明の方法とは
根本的に異なっており、本発明の目的は、以下に見られ
るように、本質的にビレブランド因子不存の状態で、因
子VIIIcのみを吸着させることである。さらに、因子VII
Ic/ビレブランド因子混合物の吸着には、アルモールは
「緩衝液Ａ」と呼ぶpH約6.8の溶出液を用いているが、
これは塩化カルシウムを含んでいない（同明細書の５ペ
ージ6-18行および６ページ14-26行を参照）。
次に、アルモールは10mmolの塩化カルシウムを含む修
正緩衝液での洗浄を行っている。アルモールは、塩化カ
ルシウムは従来技術では因子VIIIcの安定化作用を有す
ることが知られているが、従来技術では用いられなかっ
たとし、それは凝血因子を活性化する危険があり、樹脂
上にフィブリン凝血が生じ、因子VIIIcの可及的な分解
につながるためであることを強調している（６ページ27
行目から７ページ５行目を参照）。
正緩衝液での洗浄を行っている。アルモールは、塩化カ
ルシウムは従来技術では因子VIIIcの安定化作用を有す
ることが知られているが、従来技術では用いられなかっ
たとし、それは凝血因子を活性化する危険があり、樹脂
上にフィブリン凝血が生じ、因子VIIIcの可及的な分解
につながるためであることを強調している（６ページ27
行目から７ページ５行目を参照）。
このように、塩化カルシウム含有の溶出液を最初に用
いることに対し、当該技術分野においては偏見があっ
た。
いることに対し、当該技術分野においては偏見があっ
た。
さて、以下に見られるように、本発明は、本質的には
ビレブランド因子を吸着させず因子VIIIcの選択的吸着
を目的とし、その目的のために塩化カルシウム10mmolを
含む第１緩衝溶出液を用いるものであり、従来技術の偏
見に抗するものである。
ビレブランド因子を吸着させず因子VIIIcの選択的吸着
を目的とし、その目的のために塩化カルシウム10mmolを
含む第１緩衝溶出液を用いるものであり、従来技術の偏
見に抗するものである。
したがって、本発明の１つの目的は、血友病患者に問
題を起こすことのある不純物としてのマウス免疫グロブ
リンを含まない極度に高純度な抗血友病因子（FVIIIc）
の製造方法を提供することに伴う、新たな技術上の課題
を解決することにある。
題を起こすことのある不純物としてのマウス免疫グロブ
リンを含まない極度に高純度な抗血友病因子（FVIIIc）
の製造方法を提供することに伴う、新たな技術上の課題
を解決することにある。
本発明のもう１つの目的は、ビレブランド因子のバル
クから単離される抗血友病因子（FVIIIc）の製造方法を
提供するに伴う新たな技術上の課題を解決することにあ
り、これは従来技術におけるいくつかの関連技術、とく
にフランス特許明細書2 570 276ないしヨーロッパ特許
明細書144 957（US-A-4-508 709に対応）に書かれた技
術に対比され、従って、本発明の結果として得た抗血友
病因子の活性を蛋白質1mg当たり250国際単位（IU）の値
にまで著しく高めることを可能にすることである。
クから単離される抗血友病因子（FVIIIc）の製造方法を
提供するに伴う新たな技術上の課題を解決することにあ
り、これは従来技術におけるいくつかの関連技術、とく
にフランス特許明細書2 570 276ないしヨーロッパ特許
明細書144 957（US-A-4-508 709に対応）に書かれた技
術に対比され、従って、本発明の結果として得た抗血友
病因子の活性を蛋白質1mg当たり250国際単位（IU）の値
にまで著しく高めることを可能にすることである。
さらに本発明のもう１つの目的は、工業的規模で使用
可能な、とくに簡単で再現性のある製造方法を提供する
ことに伴う新たな技術上の課題を解決することにある。
可能な、とくに簡単で再現性のある製造方法を提供する
ことに伴う新たな技術上の課題を解決することにある。
本発明は、これらの技術上の問題に対し、量的制限の
ない大量を取り扱うことを可能にする工業規模で使用可
能な、満足のいく解決策を始めて提供しており、これは
実験室にしか適用されなかった従来技術に対比される。
ない大量を取り扱うことを可能にする工業規模で使用可
能な、満足のいく解決策を始めて提供しており、これは
実験室にしか適用されなかった従来技術に対比される。
さらに本発明は、従来の技術明細書の項目にはなかっ
たウイルスの不活性化にも効果がある。
たウイルスの不活性化にも効果がある。
〔課題を解決するための手段、作用及び効果〕 このように、第１の特徴によれば、本発明はビレブラ
ンド因子のバルクを含まない、極めて高純度な抗血友病
因子（FVIIIc）の製造方法を提供し、それはゲルを有す
るクロマトグラフィーカラムを用いるイオン交換クロマ
トグラフィーによる精製過程から成っており、上記精製
過程は当該カラムのゲルへの抗血友病因子の吸着過程
と、精製された抗血友病因子の脱着過程から成ってい
る。この精製された抗血友病因子は、ビレブランド因子
のバルクおよび主な血漿不純物からの因子VIIIcの分離
を可能にするイオン強度を有する、第１緩衝溶出液によ
り回収される。因子VIIIcの粗製溶液は冷却沈澱物から
製造され、当該粗製溶液は第１緩衝溶出液とほぼ同じイ
オン強度を有し、本質的にビレブランド因子を含まない
因子VIIIcはカラムのゲルに選択的に吸着され、上記因
子VIIIcの粗製溶液はまず第１緩衝溶出液で溶出され、
第１緩衝溶出液によってはカラム内のゲルに吸着したま
まの因子VIIIcは、第１緩衝溶出液よりイオン強度の高
い第２緩衝溶出液を用いて脱着され、このようにして、
ビレブランド因子のバルクおよび主な血漿不純物の含ま
ない、極めて高純度な因子VIIIcの精製溶液を与える。
ンド因子のバルクを含まない、極めて高純度な抗血友病
因子（FVIIIc）の製造方法を提供し、それはゲルを有す
るクロマトグラフィーカラムを用いるイオン交換クロマ
トグラフィーによる精製過程から成っており、上記精製
過程は当該カラムのゲルへの抗血友病因子の吸着過程
と、精製された抗血友病因子の脱着過程から成ってい
る。この精製された抗血友病因子は、ビレブランド因子
のバルクおよび主な血漿不純物からの因子VIIIcの分離
を可能にするイオン強度を有する、第１緩衝溶出液によ
り回収される。因子VIIIcの粗製溶液は冷却沈澱物から
製造され、当該粗製溶液は第１緩衝溶出液とほぼ同じイ
オン強度を有し、本質的にビレブランド因子を含まない
因子VIIIcはカラムのゲルに選択的に吸着され、上記因
子VIIIcの粗製溶液はまず第１緩衝溶出液で溶出され、
第１緩衝溶出液によってはカラム内のゲルに吸着したま
まの因子VIIIcは、第１緩衝溶出液よりイオン強度の高
い第２緩衝溶出液を用いて脱着され、このようにして、
ビレブランド因子のバルクおよび主な血漿不純物の含ま
ない、極めて高純度な因子VIIIcの精製溶液を与える。
本発明の方法の有利な変形では、好ましくは静脈内注
射が可能になるような透析濾過（ダイアフィルトレーシ
ョン（diafiltration））が第３緩衝溶出液で行われ
る。もう一つの有利な特徴によれば、因子VIIIcの精製
溶液は濃縮され、さらに好ましくは凍結乾燥されること
があげられる。
射が可能になるような透析濾過（ダイアフィルトレーシ
ョン（diafiltration））が第３緩衝溶出液で行われ
る。もう一つの有利な特徴によれば、因子VIIIcの精製
溶液は濃縮され、さらに好ましくは凍結乾燥されること
があげられる。
発明の方法の有利な変形では、精製されるべき因子VI
IIcの粗製溶液は、ヒトの血漿から抽出した冷却沈澱物
を溶解することによって作られる。
IIcの粗製溶液は、ヒトの血漿から抽出した冷却沈澱物
を溶解することによって作られる。
本発明の方法のもう一つの有利な特徴によれば、ヘパ
リンを都合よく加えた水に冷却沈澱物を溶かして得られ
る溶液を水酸化アルミニウムで処理する。水酸化アルミ
ニウムの加える割合は重要ではなく、幅広く変えられ得
る。しかし、因子VIIIcを含む溶液の総量に比して、10
％v/vより多い割合を使用するのが好ましい。目下の好
ましい割合は量で15％v/vのオーダーである。
リンを都合よく加えた水に冷却沈澱物を溶かして得られ
る溶液を水酸化アルミニウムで処理する。水酸化アルミ
ニウムの加える割合は重要ではなく、幅広く変えられ得
る。しかし、因子VIIIcを含む溶液の総量に比して、10
％v/vより多い割合を使用するのが好ましい。目下の好
ましい割合は量で15％v/vのオーダーである。
つぎに、因子VIIIcの溶液から水酸化アルミニウムを
分離するために、遠心分離を行うのが有利である。その
際、ビタミンＫ依存因子が除かれる。本発明の方法の有
利な変形では、因子VIIIcを含む溶液は、ヨーロッパ特
許明細書0 131 740またはアメリカ特許明細書4 540 573
に記載のように、溶媒と界面活性剤の混合物を含む緩衝
液によりウイルスを失活させることができる。
分離するために、遠心分離を行うのが有利である。その
際、ビタミンＫ依存因子が除かれる。本発明の方法の有
利な変形では、因子VIIIcを含む溶液は、ヨーロッパ特
許明細書0 131 740またはアメリカ特許明細書4 540 573
に記載のように、溶媒と界面活性剤の混合物を含む緩衝
液によりウイルスを失活させることができる。
精製されるべき因子VIIIcの粗製溶液は、カラムの吸
着過程に移す前に、カラム溶出に用いる第１緩衝溶出液
中で透析濾過にかけるのが好ましい。
着過程に移す前に、カラム溶出に用いる第１緩衝溶出液
中で透析濾過にかけるのが好ましい。
本発明の方法の一つの有利な特徴によれば、イオン交
換クロマトグラフィーカラムに用いる精製用ゲルは、以
下のような本質的特徴を持つゲルである。
換クロマトグラフィーカラムに用いる精製用ゲルは、以
下のような本質的特徴を持つゲルである。
このゲルは、とくに６％（ただし、架橋反応時に生じ
る誤差範囲、品質のバラツキの範囲は含まれる）の割合
で架橋結合したアガロースを基にした陰イオンタイプの
イオン交換樹脂でビーズ型をしたもので、好ましくは４
級アミンタイプのものとくに例えばアガロースビーズに
結合したC1-C6アルキレン型のような短いスペーサーの
腕の末端に結合した第４級アミンタイプが良い。
る誤差範囲、品質のバラツキの範囲は含まれる）の割合
で架橋結合したアガロースを基にした陰イオンタイプの
イオン交換樹脂でビーズ型をしたもので、好ましくは４
級アミンタイプのものとくに例えばアガロースビーズに
結合したC1-C6アルキレン型のような短いスペーサーの
腕の末端に結合した第４級アミンタイプが良い。
このような特徴に当てはまる市販のゲルとしては、Ｑ
−セファロース・ファースト・フロー（Sepharose fast
FlowR）の商品名で知られ、スイスの会社ファルマシア
（Pharmacia）社から発売されており、湿潤状態で45-16
5μｍの直径のものである。
−セファロース・ファースト・フロー（Sepharose fast
FlowR）の商品名で知られ、スイスの会社ファルマシア
（Pharmacia）社から発売されており、湿潤状態で45-16
5μｍの直径のものである。
本発明の方法のもう一つの有利な特徴によれば、第１
緩衝溶出液は以下の組成を持っている。
緩衝溶出液は以下の組成を持っている。
塩化ナトリウム……250 mmol トリス……20 mmol 塩化カルシウム・２水和物……10 mmol この組成物を12Nの濃塩酸でpH6.6にする。
本発明の方法のもう一つの有利な特徴によれば、カラ
ムから因子VIIIcを脱着するのに用いる第２緩衝溶出液
は、以下の組成を持っている。
ムから因子VIIIcを脱着するのに用いる第２緩衝溶出液
は、以下の組成を持っている。
塩化ナトリウム……700 mmol トリス……20 mmol 塩化カルシウム・２水和物……10 mmol この組成物もまた12Nの濃塩酸でpH6.6にする。
本発明の方法のさらにもう一つの有利な特徴によれ
ば、精製され、溶出された因子VIIIcの透析濾過に用い
られる、上記の第３緩衝溶出液は、以下の組成を持って
いる。
ば、精製され、溶出された因子VIIIcの透析濾過に用い
られる、上記の第３緩衝溶出液は、以下の組成を持って
いる。
塩化ナトリウム……100 mmol トリス……20 mmol 塩化カルシウム・２水和物……0.6 mmol Ｌ−アルギニン……17 mmol Ｌ−リジン塩酸塩……20 mmol この溶液もまた12Nの濃塩酸でpH7にする。
本発明の方法の一つの有利な特徴によれば、第３緩衝
溶出液で透析濾過を行う前に１リットルの溶液につき17
mmolのＬ−アルギニンと20mmolのＬ−リジン塩酸塩を精
製、溶出した因子VIIIc溶液に加える。
溶出液で透析濾過を行う前に１リットルの溶液につき17
mmolのＬ−アルギニンと20mmolのＬ−リジン塩酸塩を精
製、溶出した因子VIIIc溶液に加える。
本発明の方法の一つの有利な特徴によれば、上記透析
濾過は、30g/lのパイロジェン不含のヒトアルブミンお
よび容量で0.1％v/vの乳化剤を含むpH9.6の0.1M重炭酸
塩緩衝液で処理した透析濾過膜を用いて行う。
濾過は、30g/lのパイロジェン不含のヒトアルブミンお
よび容量で0.1％v/vの乳化剤を含むpH9.6の0.1M重炭酸
塩緩衝液で処理した透析濾過膜を用いて行う。
このようにして得た、ビレブランド因子のバルク不含
で、少なくとも250IU/mgタンパク質の抗血友病活性Ａを
持つ因子VIIIcの極めて高純度な溶出液を保存するに
は、孔の直径0.22μｍの殺菌用濾過器での滅菌濾過を施
し、精製、滅菌した因子VIIIc溶液はつぎにシリコン処
理したフラスコに導入される。
で、少なくとも250IU/mgタンパク質の抗血友病活性Ａを
持つ因子VIIIcの極めて高純度な溶出液を保存するに
は、孔の直径0.22μｍの殺菌用濾過器での滅菌濾過を施
し、精製、滅菌した因子VIIIc溶液はつぎにシリコン処
理したフラスコに導入される。
第２の特徴によれば、本発明はまた、上記の方法で得
た極めて高純度な因子VIIIcを提供する。さらに、本発
明はビレブランド因子のバルクを含まない極めて高純度
な因子VIIIcを含む。本発明による因子VIIIcの抗血友病
活性Ａは、少なくとも250IU/mgタンパク質であるのが好
ましい。
た極めて高純度な因子VIIIcを提供する。さらに、本発
明はビレブランド因子のバルクを含まない極めて高純度
な因子VIIIcを含む。本発明による因子VIIIcの抗血友病
活性Ａは、少なくとも250IU/mgタンパク質であるのが好
ましい。
第３の特徴によれば、本発明はさらに、本発明ないし
上記に詳述した方法で得た因子VIIIcを含む医薬組成物
を包含する。好ましくは、この治療用組成物は即時使用
に適した注射用製剤となる凍結乾燥型の因子VIIIcを含
む。
上記に詳述した方法で得た因子VIIIcを含む医薬組成物
を包含する。好ましくは、この治療用組成物は即時使用
に適した注射用製剤となる凍結乾燥型の因子VIIIcを含
む。
それ以上の本発明の目的、特徴および有利性は、以下
の具体的な実施例にある説明で明らかである。実施例は
単なる例示であり、いかなる意味においても本発明の範
囲を限定するものではない。この実施例では特に記す以
外、パーセントは重量パーセントのことである。
の具体的な実施例にある説明で明らかである。実施例は
単なる例示であり、いかなる意味においても本発明の範
囲を限定するものではない。この実施例では特に記す以
外、パーセントは重量パーセントのことである。
300lのヒトの血漿から得た3kgのヒト血漿冷却沈澱物
を、3IU/mlの割合でヘパリンを加えた、3.2倍容量のリ
ムルス（Limulus）陰性の透析水溶液に溶かし、実験室
温度で２時間撹拌して、完全に溶解させる。
を、3IU/mlの割合でヘパリンを加えた、3.2倍容量のリ
ムルス（Limulus）陰性の透析水溶液に溶かし、実験室
温度で２時間撹拌して、完全に溶解させる。
最終容量を測定の後、この溶液に、ビタミンＫ依存因
子を除くために全容量に対して容量で15％v/vの割合で
水酸化アルミニウムを加える。混合物を５分間撹拌して
ビタミンＫ依存因子を水酸化アルミニウムに吸着させ
る。
子を除くために全容量に対して容量で15％v/vの割合で
水酸化アルミニウムを加える。混合物を５分間撹拌して
ビタミンＫ依存因子を水酸化アルミニウムに吸着させ
る。
この水酸化アルミニウムを6,000Gで遠心し、溶液から
除く。
除く。
つぎに、因子VIIIcを含む溶液をヨーロッパ特許明細
書0 131 740またはアメリカ特許明細書4 540 573に記載
の方法により処理し、ウイルスの不活性化を行う。
書0 131 740またはアメリカ特許明細書4 540 573に記載
の方法により処理し、ウイルスの不活性化を行う。
つぎに、不活性化された因子VIIIcを含むこの溶液
を、第１緩衝溶出液を用いて透析濾過する。この第１緩
衝溶出液は、続いて平衡化とカラムクロマトグラフィー
の最初の溶出に用いられるもので、以下の組成を有す
る。
を、第１緩衝溶出液を用いて透析濾過する。この第１緩
衝溶出液は、続いて平衡化とカラムクロマトグラフィー
の最初の溶出に用いられるもので、以下の組成を有す
る。
塩化ナトリウム……250 mmol トリス……20 mmol 塩化カルシウム・２水和物……10 mmol この溶液を12Nの濃塩酸でpH6.6にする。
透析濾過は、因子VIIIcの不活性溶液の２倍容量の溶
液で行い、ウイルス不活化に用いた生成物のバルクを除
去する。透析濾過用の最初の膜は、分離閾値100,000の
ミリポアメンブレン4PTHKである。この操作により、透
析濾過された因子VIIIcの不活性溶液が得られ、全量10l
に濃縮されている。
液で行い、ウイルス不活化に用いた生成物のバルクを除
去する。透析濾過用の最初の膜は、分離閾値100,000の
ミリポアメンブレン4PTHKである。この操作により、透
析濾過された因子VIIIcの不活性溶液が得られ、全量10l
に濃縮されている。
10lに濃縮された溶液は、クロマトグラフィーカラム
溶出用の第１緩衝溶出液とイオン強度が実質的に同じで
あることを確かめる。クロマトグァフィーカラムは、た
とえば高さ25cm直径が40cmのカラムで、ファルマシア社
から得たQ-Sepharose fast flowRを32l詰める。
溶出用の第１緩衝溶出液とイオン強度が実質的に同じで
あることを確かめる。クロマトグァフィーカラムは、た
とえば高さ25cm直径が40cmのカラムで、ファルマシア社
から得たQ-Sepharose fast flowRを32l詰める。
このゲルは第１緩衝溶出液で平衡化した後、精製する
ための因子VIIIcの10lを１時間に25lの割合で注入し、
ついで同じ速度で第１緩衝溶出液をタンパク質のピーク
が280nmの分光光度計でカラム溶出部分にもはや見られ
なくなる迄、注入する。当該ピークは、おもに除去を目
的とするビレブランド因子、フィブリノーゲン、アルブ
ミンおよびγ−グロブリンに対応している。
ための因子VIIIcの10lを１時間に25lの割合で注入し、
ついで同じ速度で第１緩衝溶出液をタンパク質のピーク
が280nmの分光光度計でカラム溶出部分にもはや見られ
なくなる迄、注入する。当該ピークは、おもに除去を目
的とするビレブランド因子、フィブリノーゲン、アルブ
ミンおよびγ−グロブリンに対応している。
第１緩衝溶出液でカラムを溶出した後、より高いイオ
ン強度の第２の緩衝溶出液を用いる。
ン強度の第２の緩衝溶出液を用いる。
この緩衝液は以下の組成を有する。
塩化ナトリウム……700 mmol トリス……20 mmol 塩化カルシウム・２水和物……10 mmol この組成物を12Nの濃塩酸の添加でpH6.6にし、溶出液
として用いる。
として用いる。
第２緩衝溶出液での溶出は、以前と同様の速度で、因
子VIIIcに相当するピークが見られる迄行う。検出は当
業者にはごく明白な方法で、分光光度計の感度を調節す
ることにより行われる。
子VIIIcに相当するピークが見られる迄行う。検出は当
業者にはごく明白な方法で、分光光度計の感度を調節す
ることにより行われる。
ビレブランド因子を含むあらゆる不純物をとくに含有
する不要の最初のピークでは、80ないし100l容量の溶液
の採れることが分かる。これは保存しておき、精製ビレ
ブランド因子の分離に用いても良い。これはビレブラン
ド病と関連して、当業者にはよく知られた治療上の価値
がある。
する不要の最初のピークでは、80ないし100l容量の溶液
の採れることが分かる。これは保存しておき、精製ビレ
ブランド因子の分離に用いても良い。これはビレブラン
ド病と関連して、当業者にはよく知られた治療上の価値
がある。
さらに、溶出後に得られる因子VIIIcの溶液は、全量4
0ないし50lであり、因子VIIIcはたとえば0.5ないし1IU/
mlというごく少量で存在する。
0ないし50lであり、因子VIIIcはたとえば0.5ないし1IU/
mlというごく少量で存在する。
Ｌ−アルギニン17mmol/lおよびＬ−リジン塩酸塩20mm
ol/lを、このようにして得た希釈溶液に加える。
ol/lを、このようにして得た希釈溶液に加える。
つぎに、この溶液は以下の成分を持つ第３緩衝溶出液
で透析濾過し、濃縮する。
で透析濾過し、濃縮する。
塩化ナトリウム……100 mmol トリス……20 mmol 塩化カルシウム・２水和物……0.6 mmol Ｌ−アルギニン……17 mmol Ｌ−リジン塩酸塩……20 mmol この組成物を12Nの濃塩酸でpH7にする。
この操作で、ナトリウムの割合を100mmol/lにまで減
少し、因子VIIIcを30IU/mlに濃縮することができる。こ
の操作で用いる透析濾過膜は、分離閾値30,000のミリポ
アメンブレン4PTTKである。
少し、因子VIIIcを30IU/mlに濃縮することができる。こ
の操作で用いる透析濾過膜は、分離閾値30,000のミリポ
アメンブレン4PTTKである。
すべての透析濾過膜は、リムルス（Limulus）陰性透
析水で充分に洗浄して前処理するのが非常に重要である
ことに留意する。分離操作では、30g/lのパイロジェン
不含ヒトアルブミンおよび、たとえばツイーン（Twee
n）80Rのような乳化剤を容量で0.1％v/v含むpH9.6の0.1
M重炭酸塩緩衝液5lを調製し、閉じた系でテフロンピス
トンとパイレックス本体をもつAS-TIRポンプで、これら
の膜を通して２時間で注入する。つぎに、膜はリムルス
陰性透析水で１時間洗浄した後、上記の第２緩衝溶出液
20lを通す。分析生化学（ANALYTICAL BIOCHEMISTRY）の
72巻248-254ページ（1976年）でマリオン．エム．ブラ
ッドフォード（Marion M. Bradford）が述べているミク
ロ方法を用いるタンパク質定量により、透析濾過の流出
口のタンパク質レベルがゼロであることの確認を行な
う。
析水で充分に洗浄して前処理するのが非常に重要である
ことに留意する。分離操作では、30g/lのパイロジェン
不含ヒトアルブミンおよび、たとえばツイーン（Twee
n）80Rのような乳化剤を容量で0.1％v/v含むpH9.6の0.1
M重炭酸塩緩衝液5lを調製し、閉じた系でテフロンピス
トンとパイレックス本体をもつAS-TIRポンプで、これら
の膜を通して２時間で注入する。つぎに、膜はリムルス
陰性透析水で１時間洗浄した後、上記の第２緩衝溶出液
20lを通す。分析生化学（ANALYTICAL BIOCHEMISTRY）の
72巻248-254ページ（1976年）でマリオン．エム．ブラ
ッドフォード（Marion M. Bradford）が述べているミク
ロ方法を用いるタンパク質定量により、透析濾過の流出
口のタンパク質レベルがゼロであることの確認を行な
う。
つぎに、因子VIIIc溶液の滅菌濾過を、たとえば孔の
直径0.22μｍのミリポア、より一般的にはミリディスク
（Millidisk）のような滅菌膜を用いて行なう。
直径0.22μｍのミリポア、より一般的にはミリディスク
（Millidisk）のような滅菌膜を用いて行なう。
これにより滅菌された著しく高純度な因子VIIIc溶液
が得られ、つぎに、とくに凍結乾燥などの目的で製品保
存用にシリコン処理したフラスコに分注されるが、これ
は全く常法により行なわれる。この操作で、少なくとも
250IU/mgタンパク質比活性を有する30IU/mlの因子VIIIc
が得られる。
が得られ、つぎに、とくに凍結乾燥などの目的で製品保
存用にシリコン処理したフラスコに分注されるが、これ
は全く常法により行なわれる。この操作で、少なくとも
250IU/mgタンパク質比活性を有する30IU/mlの因子VIIIc
が得られる。
この因子VIIIcは凍結乾燥するに有利であり、非常に
価値の高い医薬用成分を構成しており、血友病治療にち
ょうど必要なだけの製品量を血友病患者に注射できるよ
うになる。このことは、従来の当業者には全く予期でき
なかった決定的な技術進歩を表している。
価値の高い医薬用成分を構成しており、血友病治療にち
ょうど必要なだけの製品量を血友病患者に注射できるよ
うになる。このことは、従来の当業者には全く予期でき
なかった決定的な技術進歩を表している。
さらに、この製品が経時的に非常に安定であることを
認めるべきである。とくに、凍結乾燥後の因子VIIIcの
活性低下は24時間後に10％以下である。
認めるべきである。とくに、凍結乾燥後の因子VIIIcの
活性低下は24時間後に10％以下である。
さらに、本発明の操作により、工業的スケールにおい
て高収量で得られ、回収率は最初に溶解した冷却沈澱物
に対し50ないし55％のオーダーである。
て高収量で得られ、回収率は最初に溶解した冷却沈澱物
に対し50ないし55％のオーダーである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジェラール・ベゾン フランス国 33670 キールサン・レ・ ボワ・ド・バルラン（無番地)
Claims (15)
- 【請求項１】ビレブランド因子のバルクを含まない極め
て高純度の抗血友病因子（因子VIIIc）の製造方法であ
って、ゲルを含むクロマトグラフィーカラムを使用した
イオン交換クロマトグラフィーによる精製過程を有し、
前記精製過程は前記カラム中のゲルへの因子VIIIcの吸
着過程と、精製された因子VIIIcを脱着し、収集する過
程を有し、前記各工程は、具体的には因子VIIIcをビレ
ブランド因子と主血漿不純物より分離することが可能な
イオン強度であって、NaCl 250mmol/l（mM）、Tris 20m
M、CaCl2・2H2O 10mMを含む第１緩衝溶出液を調整し、
因子VIIIcの精製溶液を冷却沈殿物より製造するととも
に第１緩衝溶出液と実質的に同一のイオン強度に調整
し、実質的にビレブランド因子を含まない因子VIIIcを
選択的に吸着させ、前記因子VIIIcの粗製溶液を第１緩
衝溶出液にて溶出し、第１緩衝溶出液によりカラム中の
ゲルに吸着された因子VIIIcを第１緩衝溶出液よりもイ
オン強度の高い第２緩衝溶出液を用いて脱着させること
によりビレブランド因子のバルクと主血漿不純物を含ま
ない極めて高純度の因子VIIIcの精製溶液を得ることを
含む、ビレブランド因子のバルクを含まない極めて高純
度の抗血友病因子を製造する方法。 - 【請求項２】静脈内注射が可能となるように、第３の緩
衝溶液で透析濾過する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】因子VIIIcの精製溶液を濃縮し、凍結乾燥
する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】精製すべき因子VIIIcの粗製溶液をヒトの
血漿抽出物の冷却沈澱物を溶解させることにより製造す
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】有利にヘパリンを加えた水に、冷却沈澱物
を溶解して得る溶液を水酸化アルミニウムで処理する、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】因子VIIIcを含む溶液の全量に対し、容量
で10％以上の水酸化アルミニウムを混合する、請求項５
に記載の方法。 - 【請求項７】因子VIIIcの溶液から水酸化アルミニウム
を遠心分離により分離し、その際、因子VIIIcの溶液か
らビタミンＫ依存因子を除去する請求項５に記載の方
法。 - 【請求項８】因子VIIIcを含む溶液を溶媒／界面活性剤
混合物を含む緩衝液でウィルスを不活化させる、請求項
５に記載の方法。 - 【請求項９】精製した因子VIIIcの粗製溶液を、カラム
の吸着過程に移す前に、カラムの溶出に用いる上記の第
１緩衝溶出液で透析濾過する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】イオン交換クロマトグラフィーカラムに
用いる精製用ゲルが、以下の特徴を有する、請求項１に
記載の方法。 該ゲルは、６％の範囲で架橋結合したアガロースをベー
スとするビーズ状の陰イオン型のイオン交換ゲルであっ
て、第４級アンモニウムタイプであり、該アンモニウム
基が、アガロースビーズに結合するC1〜C6アルキレンタ
イプの短いスペーサのアームの末端にあるものであり、
該ゲルは、ビーズが湿潤状態で45〜165μｍのもの。 - 【請求項１１】カラムから因子VIIIcを脱着させるのに
用いる上記の第２緩衝溶出液が以下の組成を有し、この
組成物を12Nの濃塩酸の添加でpH6.6にする請求項１に記
載の方法。 塩化ナトリウム……700 mmol トリス……20 mmol 塩化カルシウム・２水和物……10 mmol - 【請求項１２】精製し、溶出した因子VIIIcの透析濾過
に用いられる、上記の第３の緩衝溶出液が以下の組成を
有し、この組成物を12Nの濃塩酸でpH7にする請求項２に
記載の方法。 塩化ナトリウム……100 mmol トリス……20 mmol 塩化カルシウム・２水和物……0.6 mmol Ｌ−アルギニン……17 mmol Ｌ−リジン塩酸塩……20 mmol - 【請求項１３】第３緩衝溶出液で、この透析濾過を行な
う前に、溶液１リットル当たり17mmolのＬ−アルギニン
および20mmolのＬ−リジン塩酸塩を因子VIIIcの精製、
溶出液に加える請求項２に記載の方法。 - 【請求項１４】抗血友病因子VIIIcの極めて高純度な溶
出液を、孔の直径0.22μｍの滅菌フィルターで滅菌濾過
し、ついでこの因子VIIIcの精製、滅菌溶液をシリコン
処理したフラスコへ導入する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１５】透析濾過を、パイロジェン不含のヒトア
ルブミン30g/lおよび容量で0.1％v/vの乳化剤を含むpH
9.6の0.1M重炭酸塩緩衝液で処理した透析濾過膜を用い
て行なう、請求項２に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR892136 | 1989-02-17 | ||
| FR8902136A FR2644064B1 (fr) | 1989-02-17 | 1989-02-17 | Procede de fabrication du facteur antihemophilique fviiic ayant une tres haute purete et facteur antihemophilique fviiic ainsi obtenu, ainsi que composition pharmaceutique le contenant |
| FR8902136 | 1989-02-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02282400A JPH02282400A (ja) | 1990-11-19 |
| JP2521551B2 true JP2521551B2 (ja) | 1996-08-07 |
Family
ID=9378912
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2037113A Expired - Lifetime JP2521551B2 (ja) | 1989-02-17 | 1990-02-17 | 抗血友病因子の製造方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0383645B1 (ja) |
| JP (1) | JP2521551B2 (ja) |
| AT (1) | ATE88188T1 (ja) |
| DE (1) | DE69001309T2 (ja) |
| DK (1) | DK0383645T3 (ja) |
| ES (1) | ES2055875T3 (ja) |
| FR (1) | FR2644064B1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2665449B1 (fr) * | 1990-08-02 | 1995-04-14 | Aquitaine Developp Transf Sang | Procede de fabrication de facteur von willebrand ayant une tres haute purete, depourvu en majeure partie de facteur antihemophilique (fviiic), et facteur von willebrand ainsi obtenu, ainsi qu'une composition pharmaceutique le contenant. |
| US5760183A (en) * | 1989-02-17 | 1998-06-02 | Association D'aquitaine Pour De Developpment De La Transfusion Sanguine Et Des Recherches Hematologiques | Process for the manufacture of very high-purity antithaemophilic factor (FVIIIC), and von Willebrand factor, and pharmaceutical compositions containing same |
| IT1248723B (it) * | 1990-06-12 | 1995-01-26 | Scalvo S P A | Processo per la purificazione del fattore viii e fattore viii ottenuto con tale processo |
| DE4111393A1 (de) * | 1991-04-09 | 1992-10-15 | Behringwerke Ag | Stabilisierte faktor viii-praeparationen |
| FR2686883B1 (fr) * | 1992-02-04 | 1994-05-13 | Aquitaine Develop Transf Sanguin | Procede de fabrication de fibrinogene de tres haute purete, fibrinogene de tres haute purete obtenu ainsi qu'une composition pharmaceutique le contenant. |
| FR2772381B1 (fr) * | 1997-12-15 | 2001-06-08 | Lab Francais Du Fractionnement | Procede de preparation par filtration d'une solution de facteur viii securisee viralement |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4508709A (en) * | 1983-12-05 | 1985-04-02 | Armour Pharmaceutical Company | Process for purifying factor VIII:C |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4361509A (en) * | 1981-12-14 | 1982-11-30 | Scripps Clinic And Research Foundation | Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies |
| US4495175A (en) * | 1982-08-05 | 1985-01-22 | University Of Rochester | Preparation of highly purified human antihemophilic factor |
| US4743680A (en) * | 1985-02-01 | 1988-05-10 | New York University | Method for purifying antihemophilic factor |
| NL8701915A (nl) * | 1987-08-14 | 1989-03-01 | Waander Riethorst | Adsorbensmateriaal en toepassing daarvan voor het isoleren van stollingsfaktoren. |
| FR2632309B1 (fr) * | 1988-06-07 | 1990-08-24 | Lille Transfusion Sanguine | Procede de purification par voie chromatographique de proteines, notamment de facteur viii, et les produits obtenus |
| DE3904354A1 (de) * | 1989-02-14 | 1990-08-16 | Behringwerke Ag | Pasteurisiertes, gereinigtes von willebrand-faktor-konzentrat und verfahren zu seiner herstellung |
-
1989
- 1989-02-17 FR FR8902136A patent/FR2644064B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-01-24 DE DE9090400203T patent/DE69001309T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-01-24 DK DK90400203.7T patent/DK0383645T3/da active
- 1990-01-24 AT AT90400203T patent/ATE88188T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-01-24 EP EP90400203A patent/EP0383645B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-24 ES ES90400203T patent/ES2055875T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-17 JP JP2037113A patent/JP2521551B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4508709A (en) * | 1983-12-05 | 1985-04-02 | Armour Pharmaceutical Company | Process for purifying factor VIII:C |
Also Published As
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|---|---|
| FR2644064B1 (fr) | 1994-05-27 |
| JPH02282400A (ja) | 1990-11-19 |
| FR2644064A1 (fr) | 1990-09-14 |
| ES2055875T3 (es) | 1994-09-01 |
| DK0383645T3 (da) | 1993-08-02 |
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| EP0383645A1 (fr) | 1990-08-22 |
| DE69001309D1 (de) | 1993-05-19 |
| EP0383645B1 (fr) | 1993-04-14 |
| DE69001309T2 (de) | 1993-08-05 |
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