KR960005722B1 - Expression vector and e.coli - Google Patents

Abstract

This invention is a preparing method of expression vector for mass production of remixed potein by regulating Trp promoter effectively and activating the growth of E.coli. The expression vector contains lactose expression repressor gene for expressing TrpR gene by lacIq promotor, a gene obtained by fusing TrpR gene and Trp promotor. The final expression vector is ptrpIQTRBGH-BK. It(KCTC 0076BP) is obtained by converting a character of E.coli W3110(ATCC 27325).

Description

신규 발현 벡터 및 그를 포함하는 대장균New Expression Vectors and E. Coli

제1도는 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 lacI^q유전자와 TrpR 유전자를 중합효소연쇄반응으로 증폭한 후 전체 재조합 단백질 유전자와 함께 대장균 발현 벡터에 재조합하는 과정을 나타낸 것이다.1 shows a process of amplifying the lacI ^q gene and the TrpR gene by a polymerase chain reaction using a synthetic oligonucleotide and then recombining the E. coli expression vector together with the entire recombinant protein gene.

제2도는 재조합 단백질 발현 벡터의 유전자 지도를 나타낸 것이다.2 shows a genetic map of a recombinant protein expression vector.

제3도는 대장균에서 대량 발현된 재조합 단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.Figure 3 shows the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of the recombinant protein expressed in Escherichia coli mass.

본 발명은 재조합 단백질을 대장균에서 대량 발현시키기 위한 신규 발현 벡터 및 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 구체적으로는 발현 벡터의 trp 프로모터를 효과적으로 조절하여 초기배양식이 재조합 단백질의 발현을 막음으로써 대장균의 생장을 활성화시켜서 결과적으로 재조합 단백질이 대량 발현될 수 있도록 고안한 신규 발현 벡터 및 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel expression vector and a method for producing a recombinant protein for mass expression of a recombinant protein in Escherichia coli, and more specifically, by effectively controlling the trp promoter of the expression vector to prevent the expression of the recombinant protein in the early culture of E. coli. The present invention relates to a novel expression vector and a method for producing a recombinant protein designed to activate growth and to result in large expression of the recombinant protein.

trp 프로모터로부터 발현은 보통 트립토판을 포함한 배지에서는 효과적인 억제가 일어나지만, 트립토판이 없는 배지에서 발현할 때는 trp 프로모터의 효과적인 억제가 일어나지 않게 되어 생장 초기에서 유전자 발현이 높아지게 되어 대장균의 생장이 억제됨으로써 높은 밀도의 대장균 배양이 어렵게 되고 아울러 결과적으로 발현 단백질의 수율이 크게 감소한다. 이는 trp 프로모터를 억제하는 trpR 유전자가 대장균 게놈에 하나밖에 존재하지 않아 충분한 TrpR 단백질이 생산되지 않기 때문이다.Expression from the trp promoter usually results in effective inhibition in the medium containing tryptophan, but when expressed in a medium without tryptophan, the effective suppression of the trp promoter does not occur, resulting in higher gene expression at the early stage of growth, thereby inhibiting the growth of E. coli. E. coli culture becomes difficult and as a result, the yield of the expressed protein is greatly reduced. This is because there is only one trpR gene that inhibits the trp promoter in the E. coli genome, so that sufficient TrpR protein is not produced.

따라서, TrpR 단백질을 충분히 발현시켜 trp 프로모터로부터의 특정 유전자 발현을 대장균 생장 초기에는 억제시키다가, 원하는 시점에서 인위적으로 개시하게끔 하는 발현 벡터를 제조하기 위한 많은 연구가 이루어져 왔다.Therefore, many studies have been made to prepare expression vectors that sufficiently express the TrpR protein to inhibit the expression of certain genes from the trp promoter at the early stage of E. coli growth and then artificially initiate at desired time points.

시몬(Simon) 등은 trp 프로모터를 효율적으로 조절하려는 목적으로 TrpR 유전자를 발현 벡터내에 직접 클로닝하였는데[Simon et al., 46, 103(1986)], 이 벡터에서는 앰피실린 저항성 유전자의 프로모터를 TrpR의 프로모터로서 사용하기 때문에 가장 일반적으로 쓰이고 있는 앰피실린을 대장균의 선별 표지로 사용할 수 없을 뿐 아니라 발현 배지에도 플라스미드의 카피수를 유지하기 위하여 테트라사이클린을 사용해야 하는 단점이 있었다.Simon et al. Cloned the TrpR gene directly into an expression vector for the purpose of efficiently regulating the trp promoter [Simon et al., 46, 103 (1986)]. In this vector, the promoter of the ampicillin resistance gene was expressed in TrpR. Ampicillin, which is most commonly used as a promoter, cannot be used as a screening label for E. coli, and tetracycline must be used to maintain the copy number of the plasmid in the expression medium.

본 발명자들은 이러한 단점들을 해결하기 위하여 예의 연구한 결과 trp 프로모토러부터의 생장 초기의 발현을 효과적으로 조절하기 위하여 시몬의 벡터에서와는 달리(제2도에 나타나 있듯이) 상시 발현하는 락토오스 발현 리프세서 lacI^q유전자의 해독종료부위 바로 다음에 트립토판 발현 리프레서 TrpR 유전자를 융합시켜 lacI^q유전자의 프로모터를 TrpR 유전자의 프로모터로서 사용하고 또한 보다 효과적인 발현과 억제를 위해 lacI^q유전자내 인위적으로 8개의 해독종료코돈을 갖도록 함으로써 trp 프로모터를 효과적으로 조절하여 재조합 단백질을 대량 생산할 수 있는 발현 벡터를 제조하게 되었다.The present inventors earnestly studied to solve these shortcomings, and in order to effectively regulate the expression of early growth from the trp promoter, the lactose expression lifter lacI ^{q which is} expressed at all times unlike the Simon vector (as shown in FIG. 2) is shown. Immediately after the end of translation of the gene, the tryptophan expression-repressor TrpR gene is fused to use the promoter of the lacI ^q gene as a promoter of the TrpR gene, and also artificially 8 detoxification codons within the lacI ^q gene for more effective expression and inhibition. By effectively controlling the trp promoter to produce an expression vector capable of mass production of recombinant proteins.

본 발명의 발현 벡터는 대장균내에서 TrpR 단백질에 의한 trp 프로모터의 조절을 극대화하여 대량 발현시 문제가 되는 trp 프로모터의 비효과적인 조절에 기인한 대장균의 생장저해를 근본적으로 해결하여 trp 프로모터하에서 재조합 단백질을 대량 발현시키는 것으로 대장균에서 trp 프로모터하에 조절되는 모든 재조합 단백질의 생산에 활용될 수 있으나, 이하에서는 소성장 호르몬을 재조합 단백질의 예로 들어 본 발명을 예시하고자 한다. 그러나 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.The expression vector of the present invention maximizes the control of the trp promoter by the TrpR protein in E. coli and fundamentally solves the growth inhibition of E. coli caused by ineffective regulation of the trp promoter, which is a problem in mass expression. Mass expression can be utilized in the production of all recombinant proteins regulated under the trp promoter in E. coli, but the present invention is exemplified below by using the ectopic growth hormone as an example of the recombinant protein. However, the present invention is not limited thereto.

먼저, 이 콜라이(E. coli) W3110(ATCC 2325)의 게놈 DNA를 주형으로 하여, XbaI 인지부위와 HindIII의 인지부위가 존재하는 하기 합성 올리고뉴클레오타이드 P1 및 P2를 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응으로 TrpR 유전자를 선택적으로 증폭한다.First, the genomic DNA of E. coli W3110 (ATCC 2325) was used as a template, and the following synthetic oligonucleotides P1 and P2 containing XbaI recognition site and HindIII recognition site were used as polymerase chain reaction. Selectively amplify the TrpR gene.

P1; 5'-ATC GAA TTC ATC GAA TGG CGC AAA ACC TTT C-3' (31mer)P1; 5'-ATC GAA TTC ATC GAA TGG CGC AAA ACC TTT C-3 '(31mer)

P2; 5'-ACC CTC TAG ATT ACT GCC CGC TTT CCA GT-3' (29mer)P2; 5'-ACC CTC TAG ATT ACT GCC CGC TTT CCA GT-3 '(29mer)

한편, 상기와 유사한 방법으로, 발현 벡터 pMAL-p2(New England Biolabs, Catalog No. 800, Protein Fusion and Purification System) DNA를 주형으로 하여, EcoRI 인지부위와 XbaI 인지부위가 존재하는 하기 올리고 뉴클레오타이드 프라이머 P3 및 P4를 사용하여 lacI^q유전자를 증폭한다.On the other hand, by the method similar to the above, the expression vector pMAL-p2 (New England Biolabs, Catalog No. 800, Protein Fusion and Purification System) DNA as a template, the following oligonucleotide primer P3 in which EcoRI recognition site and XbaI recognition site exist And amplify the lacI ^q gene using P4.

P3 : 5'-GTA ATC TAG AGG GTA CAT ATT ATG GCC CAA CAA T-3' (34mer)P3: 5'-GTA ATC TAG AGG GTA CAT ATT ATG GCC CAA CAA T-3 '(34mer)

P4; 5'-TAT TAA GCT TAC GGG TAT TTG TAG GAC GGA T-3' (31mer)P4; 5'-TAT TAA GCT TAC GGG TAT TTG TAG GAC GGA T-3 '(31mer)

이들 두 유전자를 소성장 호르몬의 cDNA 유전자 염기 서열 및 trp 프로모터 염기서열과 접합전략에 따라 접합시키고 대장균 벡터에 클로닝하여 최종 발현 벡터를 대장균에서 발현시킨다.These two genes are conjugated according to the cDNA gene sequence of truncation hormone and trp promoter sequence and conjugation strategy and cloned into E. coli vector to express the final expression vector in E. coli.

상기 발현 벡터의 lacI^q유전자의 3'-말단에는 XbaI 인지부위가 생성되어 있고 TrpR 유전자의 5' 말단 올리고뉴클레오타이드 프라이머에는 XbaI 인지부위와 샤인달가노(SD) 염기서열이 차례로 포함되어 있다. 따라서, XbaI 인지부위에서 lacI^q유전자와 접합된 TrpR 유전자는 lacI^q유전자와 함께 전사되어 하나의 mRNA를 만든다. lacI^q유전자가 완전히 해독종결된 다음 리보솜이 다시 TrpR 유전자 해독개시코돈 앞의 SD 서열에 결합하여 TrpR 억제인자를 합성하게 된다. TrpR 유전자의 3' 말단 프라이머에는 HindIII 인지부위가 생성되고 중합효소연쇄반응결과 TrpR 유전자의 3' 말단부위에는 TrpR 유전자 고유의 전사종결신호 염기서열이 포함되어 있어 뒤의 염기서열로 전사가 계속됨을 방지한다. 그 결과 최종 발현벡터에서는 소성장 호르몬이 lacI^qTrpR 유전자와 별개로 발현되게끔 만들어진다.An XbaI recognition site is generated at the 3'-end of the lacI ^q gene of the expression vector, and the 5 'terminal oligonucleotide primer of the TrpR gene includes an XbaI recognition site and a Shindallagano (SD) sequence. Thus, the TrpR gene conjugated with the lacI ^q gene at the XbaI recognition site is transcribed with the lacI ^q gene to form a single mRNA. After the lacI ^q gene is completely detoxified, the ribosome binds to the SD sequence preceding the TrpR detoxification codon to synthesize a TrpR inhibitor. HindIII recognition site is generated at 3 'terminal primer of TrpR gene and 3' terminal region of TrpR gene contains transcription termination signal sequence unique to TrpR gene as a result of polymerase chain reaction. . As a result, in the final expression vector, the ectopic growth hormone is made to be expressed separately from the lacI ^q TrpR gene.

상기의 특성을 갖는 소성장 호르몬 발현 벡터는 대장균에 도입된 후 발현 실험한 결과 인돌아크릴산(IAA)을 처리하고도 뚜렷한 소성장 호르몬의 발현을 보이지 않았다. 이는 TrpR 유전자가 5' 말단의 상위에 존재하는 lacI^q유전자의 상시 발현에 따라 동시에 발현됨으로써 TrpR 단백질이 lacI^q프로모터에 의해 과도하게 발현되어 TrpR 단백질이 trp 프로모터의 조절량 보다 과다하게 존재하기 때문이다.As a result of the experiment of expression of the ectopic growth hormone after the introduction into E. coli, the indole acrylic acid (IAA) treatment did not show a distinct ectopic expression of the ectopic growth hormone. This is because the TrpR gene is simultaneously expressed according to the constant expression of the lacI ^q gene at the upper 5 'end, so that the TrpR protein is overexpressed by the lacI ^q promoter and the TrpR protein is present in excess of the trp promoter.

따라서, TrpR 단백질의 발현을 부분적으로 억제하기 위해 lacI^q유전자 내부에 8개의 해독종결코돈을 생성시키는 데 즉, lacI^q유전자 염기서열내 BclI 인지부위를 절단한 후 다시 클레나우(klenow) 효소로 처리하여 평활말단(blunt end)을 생성시킨 후 다시 접합시켜 원래의 BclI 인지부위 이후에 8개의 해독종결코돈을 만든다. 이 해독종결코돈을 해독개시코돈의 첫번째 뉴클레오타이드를 +1로 하였을 때 +553, +561, +637, +697, +808, +937, +967, +1036에 위치한다.Therefore, in order to partially inhibit the expression of TrpR protein, eight translational stop codons are generated inside the lacI ^q gene, ie, the BclI recognition site in the lacI ^q gene sequence is cleaved and then treated with the klenow enzyme. The blunt end was then generated and spliced again to produce eight translational stop codons after the original BclI recognition site. This detoxification codon is located at +553, +561, +637, +697, +808, +937, +967, and +1036 when the first nucleotide of the detoxification codon is +1.

이와 같이 하여 제조한 대장균 발현 벡터(ptrpIQTRBGH-BK)로 이. 콜라이 W3110(ATCC 27325)을 형질전환시키고, 이를 한국 유전자은행에 1993. 2. 3일자로 기탁하였다(기탁번호 : KCTC 0076BP).E. coli expression vector (ptrpIQTRBGH-BK) prepared as described above. E. coli W3110 (ATCC 27325) was transformed and deposited with Korea Gene Bank on Feb. 2, 1993 (Accession No .: KCTC 0076BP).

이하 실시예를 통여 본 발명을 예시하고자 하며, 이로써 본 발명이 제한되는 것은 아니다.The present invention is intended to illustrate the following examples, which are not intended to limit the invention.

[실시예 1] :Example 1

lacI^q유전자 및 TrpR 유전자를 합성 소성장호르몬 유전자와 접합하는 전략 및 방법Strategies and Methods for Conjugating lacI ^q and TrpR Genes to Synthetic Plasma Hormone Genes

lacI^q유전자를 클로닝하기 위하여, 상기 올리고뉴클레오타이드 P1과 P2를 포스포아미티드 방법에 따라 유전자 합성기(Applied Biosystem Model 308 B U.S.A.)로 합성하였다. 제1도와 같은 방법으로 lacI^q유전자를 함유하는 발현 벡타인 pMAL-p2(New England Biolabs, #800, Protein dATP)을 주형으로 하여 dNTPs(dGTP, dCTP, dTTP, dATP)를 최종 농도가 0.2mM이 되도록 첨가하고 완충액(25mM Tris-HCl, pH 8.8, 50mM KCl, 2mM MgCl₃, 1mM 디티오트레이톨) 조건하에서 중합효소 연쇄반응을 실시하여 lacI^q유전자 DNA 절편을 증폭한 후 다시 5단위의 클레나우 효소를 첨가하여 37℃에서 30분간 추가반응시켰다.In order to clone the lacI ^q gene, the oligonucleotides P1 and P2 were synthesized by a gene synthesizer (Applied Biosystem Model 308 B USA) according to the phosphoramide method. As a template, the expression vector pMAL-p2 (New England Biolabs, # 800, Protein dATP) containing lacI ^q gene was used as a template, and the final concentration of dNTPs (dGTP, dCTP, dTTP, dATP) was 0.2 mM. Amplify the lacI ^q gene DNA fragment by polymerase chain reaction under buffer (25mM Tris-HCl, pH 8.8, 50mM KCl, 2mM MgCl ₃ , 1mM dithiothreitol), and then repeat 5 units of Klenow The enzyme was added and further reacted at 37 ° C. for 30 minutes.

또한 TrpR 유전자를 얻기 위하여, 상기 올리고뉴클레오타이드 P3, P4를 상기와 같은 방법으로 합성한 후 이. 콜라이 W3110(ATCC 27325) 게놈 DNA를 뮤라이의 방법[Nucl. Acids Res. 8, 4321(1980)]으로 분리하고 이를 주형으로 하여 상기의 조건에서 중합효소 연쇄반응으로 TrpR 유전자 DNA를 증폭시킨 후 클레나우 효소로 37℃에서 30분간 반응시켰다. 얻어진 두 lacI^q및 TrpR DNA 용액 각각을 페놀과 클로로포름으로 처리한 후 에탄올 침전시켜 DNA 펠릿을 얻고 이를 건조시켰다. 60mM Tris-HCl, 10mM MgCl₂, 100mM NaCl 완충액 조건하에서, lacI^q유전자 DNA에는 제한효소 EcoRI과 XbaI, TrpR 유전자 DNA에는 XbaI과 HindIII를 각각 10단위씩 가하여 37℃에서 1시간 반응 시킨 후 7% 폴리아크릴아미드겔 전기영동시키고 겔에서 1170 염기쌍(lacI^q유전자)과 450염기쌍(TrpR 유전자)에 해당하는 부분을 도려내어 전기용출(electroelution)시킨 후 일루팁 디컬럼(elutip-dcolumn, Schleicher and Schuell U. S. A)을 통과시킨 뒤 에탄올 침전 및 건조시키고 DNA를 20μl의 증류수에 녹였다. 이 각각의 DNA 3μl와 제한효소 EcoRI 및 HindIII로 절단된 소성장 호르몬 발현 벡터 ptrphsBGH(1990년 5월 25일자로 KFCC에 기탁번호 KFCC-10693로 기탁됨, 특허출원 제90-7876호 참조)를 접합조건(60mM Tris-HCl pH 7.5, 10mM DTT, 10mM MgCl₂, 1mM ATP, 10단위의 T4 DNA 리가제)하에서 14℃에서 16시간 접합반응시켰다.In addition, in order to obtain the TrpR gene, the oligonucleotides P3 and P4 were synthesized in the same manner as described above. E. coli W3110 (ATCC 27325) genomic DNA of Murray [Nucl. Acids Res. 8, 4321 (1980)], which was used as a template to amplify the TrpR gene DNA by polymerase chain reaction under the above conditions, and then reacted with Klenow enzyme at 37 ° C. for 30 minutes. Each of the two lacI ^q and TrpR DNA solutions obtained was treated with phenol and chloroform and then ethanol precipitated to obtain DNA pellets and dried. Under 60mM Tris-HCl, 10mM MgCl ₂ and 100mM NaCl buffer conditions, 10 units of restriction enzymes EcoRI and XbaI and XbaI and HindIII were added to lacI ^q gene DNA and reacted for 1 hour at 37 ° C for 7% poly. Acrylamide gel electrophoresis and electroellution of the 1170 base pairs (lacI ^q gene) and 450 base pairs (TrpR gene) by electroelution followed by elutip-dcolumn, Schleicher and Schuell US A ), Ethanol was precipitated and dried, and DNA was dissolved in 20 μl of distilled water. 3 μl of each DNA and the truncated hormone hormone expression vector ptrphsBGH cut with the restriction enzymes EcoRI and HindIII (deposited with the accession number KFCC-10693 to KFCC on May 25, 1990, see patent application No. 90-7876) The reaction was carried out at 14 ° C. for 16 hours under conditions (60 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM DTT, 10 mM MgCl ₂ , 1 mM ATP, 10 units of T4 DNA ligase).

이어 하나한(Hanahan)의 방법[J. Mol. Biol. 116, 557(1983)]에 따라 이. 콜라이 HB101(ATCC 33694)을 형질전환시켜 lacI^q유전자와 TrpR 유전자를 기존의 소성장 발현 벡터 ptrphsBGH에 접합시킨 발현 벡터를 얻었다.Then Hanahan's method [J. Mol. Biol. 116, 557 (1983). E. coli HB101 (ATCC 33694) was transformed to obtain an expression vector obtained by conjugating the lacI ^q gene and the TrpR gene to the existing plastic field expression vector ptrphsBGH.

[실시예 2] :Example 2

최종 발현 벡터 ptrpIQTRBGH-BK의 유전자 조작과정Genetic engineering of the final expression vector ptrpIQTRBGH-BK

실시예 1에서 제조된 접합체를 완충액[150mM NaCl, 6mM Tris-HCl pH 7.9, 6mM MgCl₂] 조건하에서 제한효소 BclI으로 50℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 페놀, 클로로포름으로 추출 처리하고 이를 에탄올 침전시킨 후 건조시키고 DNA를 31.5μl의 증류수에 녹인 후 dNTP 최종 농도가 250μM이 되도록 첨가한 뒤 완충액(50mM Tris-HCl pH 8.0, 10mM MgCl₂, 50mm NaCl) 조건하에서 2.5단위의 클레나우 효소로 상온에서 20분간 반응시켰다. 그후 95℃에서 2시간 방치 후 1% 아가로스겔 전기영동, 전기용출 및 일루팁 디 방법으로 DNA 절편을 정제한 뒤 이를 15μl의 TE 완충용액에 녹였다. 이와 같이 얻은 DNA를 접합조건(60mM Tris-HCl pH 7.5, 10mM DTT, 10mM MgCl₂, 1mM ATP, 10단위 T4 DNA 리가제)하에서 14℃에서 16시간 접합반응시킨 후, 하나한의 방법[J. Mol. Biol. 116, 557(1983)]에 따라 E. coli HB101을 형질전환시킨 다음 바른 보임과 돌리의 방법[Meth. Enzymol. 100, 243(1983)]으로 재조합 벡터 ptrpIQTRBGH-BK를 함유하는 균주를 선발하였다.The conjugate prepared in Example 1 was reacted with a restriction enzyme BclI for 1 hour at 50 ° C. under buffer [150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 7.9, 6 mM MgCl ₂ ] and extracted with phenol, chloroform and ethanol precipitated. After drying, DNA was dissolved in 31.5 μl of distilled water, and the final concentration of dNTP was added to 250 μM, followed by 2.5 units of Klenau enzyme at room temperature under buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl ₂ , 50 mm NaCl). The reaction was carried out for a minute. After 2 hours at 95 ℃, the DNA fragments were purified by 1% agarose gel electrophoresis, electroelution, and Illumina tip D method, and then dissolved in 15 μl of TE buffer. The DNA thus obtained was conjugated at 14 ° C. for 16 hours under conjugation conditions (60 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM DTT, 10 mM MgCl ₂ , 1 mM ATP, 10 unit T4 DNA ligase), followed by one method [J. Mol. Biol. 116, 557 (1983)] and transformed E. coli HB101, followed by corrective and dolly methods [Meth. Enzymol. 100, 243 (1983)] was used to select strains containing the recombinant vector ptrpIQTRBGH-BK.

[실시예 3] :Example 3

대장균 숙주 W3110에서 소성장 호르몬의 발현Expression of Plasma Hormone in Escherichia Coli Host W3110

발현 벡터 ptrpIQTRBGH-BK을 지닌 대장균 W3110을 M9 배지(40mM K₂HPO₄, 22mM KH₂PO₄, 8.5mM NaCl, 18.7mM NH₄Cl, 1mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂, 10μg/ml Vit Bl, 0.4% CAA(Casamino acid), 1% 글루코즈, 40μg/ml 앰피실린 함유)에서 37℃에서 16시간 진탕 배양하고 650nm에서의 흡광도가 0.5되는 시점에서 lAA를 60μg/ml이 되도록 첨가한 후 37℃에서 배양하였다. 배양시간 3시간, 7시간, 24시간 후 650nm에서의 흡광도가 1.0에 해당하는 배양액으로부터 균을 원심분리시킨 후 100μl의 램리 완충용액[Laemmli sample buffur; Laemmli U. K., Nature 227, 680P(1970)]에 녹인 뒤 100℃에서 5분간 가열하였다. 얻어진 세포 균질액 10μl를 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동시켰다. 그 결과는 제4도에서 나타내었다. 제4도에서 1열은 IAA를 처리한 후 3시간째, 2열은 7시간째, 제3열은 24시간째의 샘플이고, 제4열은 IAA를 처리하지 않고 배양 후 3시간째, 제5열은 7시간째, 제6열은 24시간째의 샘플이다.E. coli W3110 with the expression vector ptrpIQTRBGH-BK was transferred to M9 medium (40 mM K ₂ HPO ₄ , 22 mM KH ₂ PO ₄ , 8.5 mM NaCl, 18.7 mM NH ₄ Cl, 1 mM MgSO ₄ , 0.1 mM CaCl ₂ , 10 μg / ml Vit Bl, Shake incubated for 16 hours at 37 ° C in 0.4% CAA (1% glucose, containing 40 μg / ml ampicillin), add lAA to 60 μg / ml at absorbance at 650 nm, and then at 37 ° C. Incubated. After 3 hours, 7 hours, and 24 hours of incubation, the microorganisms were centrifuged from the culture solution having an absorbance at 650 nm of 1.0, and 100 µl of Laemmli sample buffur; Laemmli UK, Nature 227, 680P (1970)] and then heated at 100 ℃ for 5 minutes. 10 μl of the obtained cell homogenate was electrophoresed on a 12.5% SDS-polyacrylamide gel. The results are shown in FIG. In FIG. 4, column 1 is a sample at 3 hours after treatment with IAA, column 2 at 7 hours, and column 3 at 24 hours, and column 4 is 3 hours after incubation without treatment with IAA. Row 5 is the sample at 7 hours and row 6 is the 24 hour sample.

제4도에서 볼 수 있는 바와 같이, IAA 처리한 후 3시간, 7시간, 24시간째의 샘플에서 소성장 호르몬에 해당하는 22,000달톤의 단백질 밴드가 나타남으로써 소성장 호르몬이 대장균 전체 단백질의 30% 정도로 발현되었으나, IAA를 첨가하지 않은 경우에는 시간의 경과에도 소성장 호르몬의 발현이 확인되지 않았다. 이러한 결과는 최종 벡터인 ptrpIQTRBGH-BK의 trp 프로모터가 같은 벡터내에 존재하는 TrpR 유전자에 의해 효과적으로 조절됨을 의미한다.As can be seen in Figure 4, samples of 32,000, 7, and 24 hours after IAA treatment showed a protein band of 22,000 Daltons corresponding to calcination hormone, resulting in 30% of total E. coli protein. Although expressed to a degree, when IAA was not added, the expression of calcination hormone was not confirmed even after time. This result means that the trp promoter of the final vector, ptrpIQTRBGH-BK, is effectively regulated by the TrpR gene present in the same vector.

Claims (9)

lacI^q프로모터에 의해 TrpR 유전자가 발현되도록 락토오스 발현 리프레서(lacI^q)유전자와 트립토판 발현 리프레서(TrpR) 유전자를 융합시킨 유전자와 트립토판(trp) 프로모터를 포함하는 것임을 특징으로 하는 대장균 발현 벡터.An E. coli expression vector comprising a tryptophan (trp) promoter and a gene in which a lactose expression repressor (lacI ^q ) gene and a tryptophan expression repressor (TrpR) gene are fused to express a TrpR gene by a lacI ^q promoter. 제1항에 있어서, lacI^q유전자가 새로운 해독종결코돈을 가지는 것을 특징으로 하는 대장균 발현 벡터.The E. coli expression vector according to claim 1, wherein the lacI ^q gene has a new translation stop codon. 제2항에 있어서, 상기 해독종결코돈이 lacI^q유전자내의 제한효소 BclI 인지부위를 절단 한 후 클레나우로 처리하여 생성된 것임을 특징으로 하는 대장균 발현 벡터.The E. coli expression vector according to claim 2, wherein the detoxification codon is produced by cleaving the restriction enzyme BclI recognition site in the lacI ^q gene and treating it with Klenow. 제1항에 있어서, TrpR 유전자 발현을 위한 리보오솜 결합부위 및 해독개시 부위가 하기의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 대장균 발현 벡터.The E. coli expression vector according to claim 1, wherein the ribosome binding site and the translation start site for TrpR gene expression have the following nucleotide sequence. 제1항에 있어서, ptrpIQTRBGH-BK(KCTC 0076BP)임을 특징으로 하는 대장균 발현 벡터.The E. coli expression vector according to claim 1, which is ptrpIQTRBGH-BK (KCTC 0076BP). 제1항에 있어서, 상기 트립토판 프로모터의 조절하에 발현시킬 유전자를 삽입시킨 대장균 발현 벡터.The E. coli expression vector according to claim 1, wherein a gene to be expressed is inserted under the control of the tryptophan promoter. 제6항의 대장균 발현 벡터에 의해 형질전환된 대장균.E. coli transformed with the E. coli expression vector of claim 6. 제7항의 대장균을 트립토판 프로모터의 작동이 억제되는 조건에서 배양한 후 트립토판 프로모터가 작동되는 조건에서 추가로 배양시킴을 포함하는, 트립토판 프로모터 조절하의 유전자를 발현시켜 발현 생성물을 제조하는 방법.A method of preparing an expression product by expressing a gene under tryptophan promoter control, comprising culturing the E. coli of claim 7 under conditions in which the operation of the tryptophan promoter is inhibited and then further culturing in a condition in which the tryptophan promoter is operated. 제8항에 있어서, ptrpIQTRBGH-BK(KCTC 0076BP)를 사용하여 소성장 호르몬을 제조하는 방법.The method of claim 8, wherein ptrpIQTRBGH-BK (KCTC 0076BP) is used to prepare the ectopic growth hormone.