HU193866B - Process for preparing plasmid and e.coli bakterium comprising dna sequence and coding humane growth hormone - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás egy adott fehérje genetikai kódját meghatározó különleges nukleotid-sorrendű DNS (dezoxi-ribonukleinsav) izolálására, ennek a különleges nukleotid-sorrendű DNS szintézisére és ezen DNS bejuttatására egy mikroorganiz- musba, ahol ez replikálódhat. Részletesebben, a találmány a növekedési hormon szintézisét meghatározó gének izolálására, tisztítására, átvitelükre mikroorganizmusokba, replikációjukra, továbbá az ezt követő jellemzésükre vonatkozik. -1-The present invention relates to a method for isolating DNA of a specific nucleotide sequence (DNA) that determines the genetic code of a particular protein for the synthesis of this particular nucleotide sequence DNA and for introducing said DNA into a microorganism where it can replicate. More specifically, the invention relates to the isolation, purification, transfer of genes for growth hormone synthesis, their transfer to microorganisms, their replication, and their subsequent characterization. -1-

Description

A találmány tárgya eljárás egy adott fehérje genetikai kódját meghatározó különleges nukleotid-sorrendű DNS (dezoxi-ribonukleinsav) izolálására, ennek a különleges nukleotid-sorrendű DNS szintézisére és ezen DNS bejuttatására egy mikroorganizmusba, ahol ez replikálódhat. Részletesebben, a találmány a növekedési hormon szintézisét meghatározó gének izolálására, tisztítására, átvitelükre mikroorganizmusokba, replikációjukra, továbbá az ezt követő jellemezésükre vonatkozik.The present invention relates to a method for isolating a specific nucleotide sequence DNA (DNA) which determines the genetic code of a particular protein, to synthesize that particular nucleotide sequence DNA and to introduce this DNA into a microorganism where it can be replicated. More particularly, the present invention relates to the isolation, purification, transfer to germs, replication, and subsequent characterization of genes that determine growth hormone synthesis.

A találmány szerinti eljárással új termékeket állítunk elő. Az új termékek közé tartozik a magasabbrendíí organizmusból származó különleges nukleotid-sorrendű DNS-t tartalmazó rekombináns plazmid és a új mikroorganizmus, amely genetikai készlete részeként tartalmazza a magasabbrendű organizmusból származó különleges nukleotid-sorrendü DNS-t. A szabadalmi leírás során a következő rövidítéseket használjuk:The present invention provides novel products. The new products include a recombinant plasmid containing a specific nucleotide sequence from a higher organism and a novel microorganism which contains a specific nucleotide sequence from a higher organism as part of its genetic stock. The following abbreviations are used in the specification:

DNS — dezoxi-ribonukleinsavDNA - DNA

RNS — ribonukleinsav cDNS—komplementer DNS (egy mRNA-ból enzimatikusan szintetizált termék) mRNS — hírvivő (messenger) RNS tRNS — oldható (transzfer) RNS dATP — dezoxi-adenozin-trifoszfát dGTP —dezoxi-guanozin-trifoszfát dCTP — dezoxi-citidin-trifoszfátRNA - ribonucleic acid cDNA - complementary DNA (a product enzymatically synthesized from mRNA) mRNA - messenger RNA tRNA - soluble (transfer) RNA dATP - deoxyadenosine triphosphate dGTP - deoxyguanosine triphosphate diphosphate triphosphate

A —adenin T — timinA —adenin T - timin

G — guaninG - guanine

C — citozinC - cytosine

Trisz — 2-amino-2-hidroxi-etil-1,3-propán-diolTris-2-amino-2-hydroxyethyl-1,3-propanediol

EDTA — etilén-diamin-tetraecetsav ATP — adenozin-trifoszfát TTP — timidin-trifoszfát.EDTA - ethylenediaminetetraacetic acid ATP - adenosine triphosphate TTP - thymidine triphosphate.

A DNS bázis-sorrendjének biológiai jelentősége abban áll, hogy hordozza a genetikai információt. Ismeretes, hogy a DNS bázissorrendje meghatározza a sejt által szintetizált összes fehérje aminosav-sorrendjét. Ezenfelül a DNS bázisainak egy része szabályozó szerepet tölt be, szabályozza az összes szintetizált fehérje mennyiségét és a szintézis idejét. Ezeknek a szabályozó elemeknek a természete csak részben ismeretes. Végül a DNS egy-egy száljának bázisait használja fel a sejt a sejtosztódás során bekövetkező DNS-repIikációhoz mintaként.The biological significance of the DNA base sequence is that it carries genetic information. It is known that the base sequence of DNA determines the amino acid sequence of all proteins synthesized by a cell. In addition, some of the DNA bases play a regulatory role, regulating the amount of all synthesized proteins and the time of synthesis. The nature of these regulatory elements is only partially known. Finally, the bases of each strand of DNA are used by the cell as a template for DNA replication during cell division.

Az a mód, ahogy a DNS-ben a bázis-sorrend által meghatározott információ felhasználódik a fehérjék aminosav sorrendjének kialakulásában, olyan alapvető folyamat, amely legfőbb vonásaiban minden elő organizmusban jelen van. Kimutatták, hogy mindegyik aminosav, amely a fehérjékben megtalálható, egy vagy több trinukleotid vagy triplett által van meghatározva. így miiydegyik fehérjének megfelel egy olyan DNS darab, amely az aminosav-sorrendnek megfelelően 2 tartalmazza a tripletteket. A genetikai kódot az 1. táblázatban ismertetjük.The way in which DNA-based information in the base sequence is utilized in the formation of the amino acid sequence of proteins is a fundamental process that is present in all its prime features in the body. It has been shown that each of the amino acids contained in the proteins is defined by one or more trinucleotides or triplets. Thus, each protein corresponds to a piece of DNA containing triplets according to the amino acid sequence. The genetic code is shown in Table 1.

1. táblázatTable 1

A genetikai kódThe genetic code

Fenilalanin (Phe) Phenylalanine (Phe) TTK TTK Leucin (Leu) Leucin (Leu) XTY XTY Izoleucin (Ile) Izoleucin (Ile) ATM ATM Metionin (Met) Methion (Met) ATG ATG Valin (Val) Valin (Val) GTL GTL Szerin (Ser) Serin (Ser) QRS QRS Prolin (Pro) Prolin (Pro) CCL CCL Treonin (Thr) Threon (Thr) ACL ACL Alanín (Alá) Alanín gcL GCL Tirozin (Tyr) Tyrosine (Tyr) TAK TAK Hisztidin (His) Histidine (His) CAK CAK Glutamin (Gin) Glutamine (Gin) CAJ CAJ Aszparagin (Asn) Asparagine (Asn) AAK AAK Lizin (Lys) Lizin (Lys) AAJ AAJ Aszparaginsav (ASP) Aspartic Acid (ASP) GAK GAK Glutaminsav (Glu) Glutamic acid (Glu) GAJ GAJ Cisztein (Cya) Cysteine (Cya) TGK TGK Triptofán (Try) Tryptophan (Try) TGG TGG Arginin (Arg) Arginin (Arg) WGZ WGZ Glicin (Gly) Glycine (Gly) GGL GGL Befejező jel Finishing sign TÁJ LANDSCAPE Befejező jel Finishing sign TGA TGA Mindegyik hárombetűs triplett a Each three-letter triplet a DNS tri- DNA tri-

nukleotidjait jelöli, amelynek (Vvége a baloldalon és a 3’ vége a jobb oldalon helyezkedik el. A betűk a purin- vagy a pirimidin-bázisokat jelentik, amelyek a nukleotid-sorrendet kialakítják. A táblázatban a következő rövidítéseket használtuk:denotes the nucleotides of which (the terminus is on the left and the 3 'end is on the right. The letters refer to the purine or pyrimidine bases which form the nucleotide sequence. In the table the following abbreviations are used:

A adenin G guanin C citozin T timinA adenine G guanine C cytosine T thymine

X T vagy C, ha Y jelentése A vagy G X C, ha Y jelentése C vagy TX is T or C when Y is A or G is X C if Y is C or T

Y A, G, C vagy T, ha X jelentése CY is A, G, C or T when X is C

Y A vagy G, ha X jelentése TY is A or G when X is T

W C vagy A, ha Z jelentése A vagy G W C, ha Z jelentése C vagy T Z A, G, C vagy T, ha W jelentése C Z A vagy G, ha W jelentése A QR TC, ha S jelentése A, G, C vagy T QR AG, ha S jelentése T vagy C S A, G, C vagy T, ha QR jelentése TC S T vagy C, ha QR jelentése AG J A vagy GWC or A if Z is A or GWC, if Z is C or TZA, G, C or T, if W is CZA or G, if W is QR TC, if S is A, G, C or T QR AG if S is T or CSA, G, C or T, if QR is TC ST or C, if QR is AG JA or G

K T vagy C L A, T, C vagy G M A, C vagy T.K T or C L A, T, C or G M A, C or T.

A nukleotid-sorrend átírását aminosav-sorrenddé célzó biológiai folyamatok első lépése a transzkripció (átírás). Ebben a lépésben az elkészítendő fehérje összetételét meghatározó lokális DNS szegmens egy RNS molekulára másolódik. Az RNS a DNS-hez hasonló polinukleotid, azzal a különbséggel, hogy az RNS-ben ribóz van a dezoxi-ribőz helyett és uracil a timin helyett. Az RNS molekulát felépítő bázisok képesek a DNS-ben lévő bázis-párokhoz hasonló párokat kialakítani. Ily módon a DNS-t leíró RNS nukleotid-23The first step in the biological process of transcribing a nucleotide sequence into an amino acid sequence is transcription (transcription). In this step, the local DNA segment that determines the composition of the protein to be produced is copied to an RNA molecule. RNA is a polynucleotide similar to DNA except that RNA contains ribose instead of deoxyribose and uracil instead of thymine. The bases that make up the RNA molecule are capable of forming pairs similar to the base pairs in DNA. In this way, the RNA describing the DNA is nucleotide-23

-sorrendje megfelel egymásnak. Ezt az RNS-t hírvivő vagy messenger RNS-nek (mRNS-nek) nevezzük, mivel feladata a genetikai készlet és a fehérje-szintetizáló rendszer öszszekötése.The order of the matches. This RNA is referred to as messenger or messenger RNA (mRNA) because of its function to link the genetic pool to the protein synthesizing system.

A sejten belül az mRNS mintaként szerepel abban a komplex folyamatban, amelynek része a sejten belül lévő enzimek és sejtszervecskék sokszorozódása, amely a különleges aminosav-sorrendű fehérjék szintézisének az eredménye. Ez utóbbi folyamatot az mRNS transzlációjának (átfordításának) nevezzük.Within the cell, mRNA plays a role in the complex process that involves the multiplication of intracellular enzymes and cellular organs resulting from the synthesis of specific amino acid sequence proteins. This latter process is called translation (translation) of mRNA.

Számtalan olyan fehérje ismeretes, amelynek gyógyászati vagy kutatási jelentősége van, és amelyeket a magasabbrendü szervezetekben, például gerincesekben találhatunk meg, vagy azok szintetizálják őket. Ilyenek például az inzulin vagy más fehérje hormonok, mint például a növekedési hormon, továbbá a vérnyomás szabályozásban résztvevő fehérjék, ipari, orvosi vagy kutatási jelentőséggel bíró enzimek. Rendszerint igen nehéz megfelelő mennyiségű ilyen fehérjét előállítani az adott organizmusból például extrakcióval, és ez a nehézség különösen akut módon jelentkezik az emberi eredetű fehérjék esetén. Ezért van szükségünk olyan eljárásokra, amelyek segítségével ezeket a proteineket a magasabbrendű organizmus részvétele nélkül megfelelő mennyiségben rendelkezésre álló más sejtekben állíthatjuk elő. Bizonyos esetekben lehetséges megfelelő mennyiségű sejteket hosszú időn át a szövettenyésztés megfelelő módszereivel fenntartanunk. Azonban a szövettenyészetek sejtjeinek növekedése igen lassú, a táptalaj drága, a tenyésztés körülményeit igen pontosan be kell tartanunk, ugyanakkor a kitermelés alacsony. Ezenfelül gyakran nagyon nehézkes egy olyan adott sejtvonal fentartása, amely a megkívánt jellemzőkkel rendelkezik.Numerous proteins of therapeutic or research interest are known and can be found or synthesized in higher organisms such as vertebrates. These include, for example, insulin or other protein hormones, such as growth hormone, and proteins involved in controlling blood pressure, enzymes of industrial, medical, or research interest. It is usually very difficult to produce sufficient amounts of such protein from a given organism, for example by extraction, and this difficulty is particularly acute in the case of human-derived proteins. Therefore, there is a need for methods for producing these proteins in other cells available in sufficient quantities without the involvement of the higher organism. In some cases, it is possible to maintain sufficient numbers of cells for a long period of time by appropriate tissue culture techniques. However, the growth of tissue culture cells is very slow, the culture medium is expensive, the culture conditions have to be very strictly observed, and the yield is low. In addition, it is often very difficult to maintain a particular cell line with the required characteristics.

Ezzel szemben a mikroorganizmusok, mint például a baktériumok, viszonylag könnyen növeszthetők kémiailag meghatározott összetételű táptalajon. A fermentációs technológiák igen fejlettek, és jól szabályozhatók. A mikroorganizmusok növekedése gyors és magas kitermelés érhető el. Ezenfelül bizonyos mikroorganizmusok genetikusán jól jellemezettek, más szóval a legjobban jellemzett és legismertebb organizmusok közé tartoznak.In contrast, microorganisms, such as bacteria, can grow relatively easily on chemically defined media. Fermentation technologies are highly advanced and well controlled. The growth of microorganisms is rapid and high yields can be achieved. In addition, certain microorganisms are genetically well characterized, in other words, among the best characterized and most well-known organisms.

A fentiek alapján igen előnyös egy olyan gén bejuttatása egy megfelelő organizmusba, amely orvosilag jelentős fehérjét határoz meg. Ezen a módon az eredetileg magasabbrendü organizmusban szintetizálódó fehérjét nagy mennyiségben állíthatjuk elő szabályozott körülmények között növesztett mikroorganizmusokkal. Ugyancsak lehetséges ily módon a megfelelő protein olcsó előállítása. További előnyt jelent, hogy az adott protein termelését meghatározó genetikai kód izolálásával és átvitelével a jól ismert genetikai háttérrel rendelkező mikroorganizmusba, tanulmányozhatjuk a protein szintézisének szabályozását és a szintézis utáni sorsát. Ezenkívül az izolált genetikai kód (DNS) szekvenciájának változtatásával előállíthatunk olyan új bázissorrendet, amely különböző, más terápiás vagy funkcionális tulajdonságokkal rendelkező proteineket határoz meg.Accordingly, it is highly advantageous to introduce a gene which defines a medically relevant protein into a suitable organism. In this way, the protein originally synthesized in a higher organism can be produced in large quantities by microorganisms grown under controlled conditions. It is also possible to produce the corresponding protein cheaply. A further advantage is that by isolating and transferring the genetic code that determines the production of a given protein to a microorganism with a well-known genetic background, the regulation of protein synthesis and its post-synthesis fate can be studied. In addition, by altering the sequence of the isolated genetic code (DNA), a new base sequence can be obtained that defines various proteins with other therapeutic or functional properties.

A találmány szerinti eljárással a fenti célokat elérjük. Az eljárást enzimek által katalizált reakciókat magába foglaló lépések komplex sorozatán át ismertetjük. Az enzimreakciók természetét, amennyire ezeket az irodalom a'apján ismerjük, részletesen tárgyaljukThe present invention achieves the above objectives. The process is described in a complex series of steps involving enzyme-catalyzed reactions. The nature of the enzyme reactions, as far as they are known in the art, is discussed in detail

A reverz transzkriptáz az RNS templáttal komplementer DNS szintézisét katalizálja az RNS templát, egy oligo-dezoxi-nukleotid primer és négy dezoxi-nukleotid-trifoszfát, a dATP, dGTP, dCTP és a TTP jelenlétében. A reakció úgy indul,hogy az oligo-dezoxi-nukleotid primer nem-kovalensen kötődik az mRNS molekula 3*-végéhez, majd az mRNS nukleoti í-sorrendjének megfelelően lépésenként hozzákapcsolódnak a növekvő lánc 3’-végéhez a megfelelő dezoxi-nukleotidok. Az így létrejövő molekulát hajtű-szer kezeiként Írhatjuk le, amely tartalmazza az eredeti RNS-t és egy egyszálú DNS hurokkal hozzákapcsolódó komplementer DNS-láncot. A reverz transzkriptáz ugyancsak katalizálja azt a reakciót, amely templátként (mintaként) egyszálú DNS-t használ, és amikor olyan kétszálú hajtű-szerű, DNS molekula jön létre, amelynek a végein egyszálú DNS hurkot találunk [Aviv és Leder, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 1408, 1972; és Efstratiadis, Kafatos, Maxam és Maniatis, Cell, 7, 279, 1976],The reverse transcriptase catalyzes the synthesis of DNA complementary to the RNA template in the presence of the RNA template, an oligodeoxynucleotide primer and four deoxynucleotide triphosphates, dATP, dGTP, dCTP and TTP. The reaction is initiated by priming the oligodeoxynucleotide primer non-covalently to the 3 * end of the mRNA molecule and then sequentially attaching the corresponding deoxy nucleotides to the 3 'end of the growing chain according to the nucleotide sequence of the mRNA. The resulting molecule may be described as a hairpin arm comprising the original RNA and a complementary DNA strand linked by a single-stranded DNA loop. Reverse transcriptase also catalyzes a reaction that uses single-stranded DNA as a template (template) and when a double-stranded DNA molecule is formed with a single-stranded DNA loop at its ends [Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 1408, 1972; and Efstratiadis, Kafatos, Maxam and Maniatis, Cell, 7, 279, 1976],

A restrikciós endonukleázok olyan enzimek, amelyek a kétszálú DNS molekula foszfodiészter-kötéseit hidrolizálják, ezzel a DNS-láncban töréseket hoznak létre. Ha a DNS molekula zárt körként létezik, úgy az az enzimek hatására lineáris szerkezetűvé alakul át. Alapvető tulajdonsága ezen enzimeknek, hogy a hidrolitikus hatás csak különleges nukleotid-sorrenddel rendelkező molekula részeken következik be. Ezeket a bázis-sorrendeket a restrikciós endonukleázok felis nerik. Különböző forrásokból izoláltak restr kciós endonukleázokat, és oly módon jellemezték őket, hogy meghatározták azokat a nukleotid-sorrendeket, amelyeket felismernek.Restriction endonucleases are enzymes that hydrolyze the phosphodiester linkages of a double-stranded DNA molecule, thereby creating breakages in the DNA chain. When a DNA molecule exists as a closed loop, it is converted into a linear structure by the action of enzymes. The basic property of these enzymes is that the hydrolytic action occurs only on molecules with a specific nucleotide order. These base sequences are upregulated by restriction endonucleases. Restructuring endonucleases have been isolated from various sources and characterized by determining the nucleotide sequences they recognize.

Egyes restrikciós endonukleázok mindkét szálon hasonló ponton hidrolizálják a foszfoíiészter-kötéseket, amikor serült végű molekulák jönnek létre. Más enzimek néhány nrkleotiddal egymástól elválasztott kötéseket hidrolizálnak, amikor a megtámadott molekula mindként végén szabad egyszálas szakaszok jönnek létre. Ezek az egyszálas végek önmaguk komplementerjei, kohézív erőkkel újra összekapcsolhatják a hidrolizált DNS-t. m vei bármely, ezen enzimekre érzékeny DNS-rrolekula azonos, a felismerést elősegítő bá3 zis-sorrendet kell hogy tartalmazzon, azonos kohézív végek jönnek létre, így a restrikciós endonukleázokkal kezelt különböző szekvenciájú DNS-molekulák összekapcsolódhatnak (Roberts, Crit. Rév. Biochem., 4. 123, 1976). A restrikciós helyek általában ritkán fordulnak elő, azonban a restrikciós endonukleázok felhasználhatóságát nagymértékben erősíthetjük a restrikciós helyekre jellemző bázis-szekvenciókat tartalmazó kétszálas oligo-nukleotidok kémiai szintézisével. Ily módon gyakorlatilag bármely DNS szegmenst hozzákapcsolhatunk bármely más szegmenshez oly módon, hogy a megfelelő restrikciós oligonukleotidot hozzákapcsoljuk a molekula végéhez, majd az így előállított vegyületet a megfelelő restrikciós endonukleázzal hidrolizáljuk, és így előállítjuk a kohézív végű molekulákat (Heynekker, Shine, Goodman, Boyer, Rosenberg, Dickerson, Narang, Itakura, Lin és Riggs, Natúré, 264, 748, 1976; és Scheller, Dickerson, Boyer, Riggs és Bakura, Schience, 196, 177, 1977).Some restriction endonucleases hydrolyze the phospholyl ester bonds at similar points on both strands to form molecules with truncated ends. Other enzymes hydrolyze separate bonds with a few nucleotides to form free single-stranded sites at each end of the attacked molecule. These single-stranded ends are themselves complementary to re-link hydrolyzed DNA to cohesive forces. Since all DNA-responsive DNA sequences sensitive to these enzymes must have the same recognition base sequence, the same cohesive ends are created so that DNA sequences of different sequences treated with restriction endonucleases can be linked (Roberts, Crit. Rev. Biochem., 4. 123, 1976). Restriction sites are generally rare, but the utility of the restriction endonucleases can be greatly enhanced by chemical synthesis of double-stranded oligonucleotides containing the basic sequences specific for the restriction sites. In this way, virtually any DNA segment can be linked to any other segment by attaching the appropriate restriction oligonucleotide to the end of the molecule, and then hydrolyzing the resulting compound with the appropriate restriction endonuclease to produce cohesive end molecules (Heynekker, Shine, Goodman, Boyer, Rosenberg, Dickerson, Narang, Itakura, Lin and Riggs, Naturre, 264, 748, 1976; and Scheller, Dickerson, Boyer, Riggs and Bakura, Schience, 196, 177, 1977).

Az SÍ jelű endonukleáz olyan enzim, amely hidrolizálja az egyszálú DNS foszfodiészter-kötéseit, vagy az egyébként kétszálú DNS egyszálú részeit vagy köralakú végeit (Vogt, Eur. J. Biochem., 33, 192, 1973)·.The S1 endonuclease is an enzyme that hydrolyzes the phosphodiester bonds of single-stranded DNA, or single-stranded or circular ends of otherwise double-stranded DNA (Vogt, Eur. J. Biochem., 33, 192, 1973).

A DNS-ligáz katalizálja az 5’-foszfát- és a 3’-hidroxil-csoporttal rendelkező DNS-szegmensek közötti foszfodiészter-kötés kialakulását; ilyenek akkor alakulhatnak ki, amikor két DNS-darab kohézív végekkel kapcsolódik össze. Az enzim funkciója abban áll, hogy egyébként készálú DNS-molekulában lévő egyszálú részeket összekapcsoljon. Megfelelő körülmények között azonban a DNS-ligáz katalizálja két sérült végű molekula kovalens összekapcsolását (Sgaramella, Van de Sande és Khorana, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 67, 1468, 1970).DNA ligase catalyzes the formation of phosphodiester bonds between DNA segments having the 5'-phosphate and 3'-hydroxyl groups; they can occur when two pieces of DNA are joined by cohesive ends. The function of the enzyme is to link the single-stranded portions of an otherwise prepared DNA molecule. Under appropriate conditions, however, DNA ligase catalyzes the covalent attachment of two damaged end molecules (Sgaramella, Van de Sande, and Khorana, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 67, 1468, 1970).

Az alkálikus foszfatáz hidrolizálja a foszfát-észtereket, köztük a DNS 5’-terminális foszfátcsoportjait.Alkaline phosphatase hydrolyzes phosphate esters, including the 5'-terminal phosphate groups of DNA.

A továbbiakban, mint az egész folyamat egy lépését ismertetjük egy különleges DNS-fragmens bevezetését egy DNS-vektorba, mint például egy plazmidba. A plazmidot olyan autonóm replikálódó DNS egységek elnevezésére használjuk, amelyek megtalálhatók a mikroorganizmusok sejtjeiben, és amelyek a gazdasejt genomjától függetlenül léteznek. A plazmid genetikailag nincs a gazdasejt kromoszómájához kapcsolva. A plazmid DNS kétszálú, gyűrűvé kapcsolódó molekulaként létezik, molekulasúlya általában néhány millió, bár néhány esetben 10⁸ is lehet, és általában a sejt ossz DNS-tartalmának csak kis %-át képviseli. A plazmid DNS a gazdasejt DNS-étől a kettő közötti méretkülönbség alapján általában elkülöníthető. A plazmidok a gazdasejt osztódásától függetlenül replikálódhatnak, egyes esetekben a kutató szabályozhatja replikációjukat a növekedési kö4 rülmények változtatásával. Bár a plazmid zárt gyűrűként létezik, mesterséges eljárással bevezethetünk egy DNS szegmenset a plazmidba, amikor nagyobb molekulasúlyú rekombináns plazmidot kapunk, anélkül, hogy lényegesen befolyásoltuk volna azt a képeségét, hogy replikálódjon, vagy hogy kifejezhesse a benne hordozott információkat. Ily módon a plazmid igen jól használható arra, hogy egy DNS darabot átvigyünk egy új sejtbe. A rekombináns DNS technológiára használható plazmidok általában szelekciós célokra használható géneket tartalmaznak, például gyógyszerekre való rezisztenciát eredményező géneket.Hereinafter, introduction of a specific DNA fragment into a DNA vector, such as a plasmid, will be described as a step of the whole process. The plasmid is used to name autonomous replicating DNA units that are found in cells of microorganisms and exist independently of the host cell genome. The plasmid is not genetically linked to the host cell chromosome. Plasmid DNA exists as a double-stranded ring-linked molecule, generally having a molecular weight of a few millions, although in some cases it may be from 10 to ⁸ , and generally represents only a small percentage of the cellular DNA content. Plasmid DNA is generally distinguishable from host cell DNA by the size difference between the two. Plasmids can replicate independently of host cell division, and in some cases, the researcher may control their replication by altering growth conditions. Although the plasmid exists as a closed ring, an artificial segment can be introduced into the plasmid to obtain a higher molecular weight recombinant plasmid without significantly affecting its ability to replicate or express the information contained therein. In this way, the plasmid is very useful for transferring a piece of DNA into a new cell. Plasmids for recombinant DNA technology generally contain genes for selection purposes, such as genes conferring drug resistance.

A találmány szerinti eljárás részletes szemléltetésére megadjuk a növekedési hormon génjének izolálását és átvitelét.To further illustrate the method of the invention, the isolation and transfer of the growth hormone gene is provided.

Egy adott fehérje genetikai kódját jelentő specifikus bázis-sorrendű DNS-molekula előállításának ismeretében lehetségessé válik az adott nukleotid-sorrend módosítása kémiai vagy biológiai módszerekkel, amit követően a kódolt fehérje szerkezete szintén módosul. Ily módon előállíthatunk például olyan módosított inzulint, amely különleges gyógyászati igényeknek tesz eleget. A mikroorganizmusokat képessé tehetjük bármely olyan inzulinnal rokon aminosav-sorrendű fehérjék szintézisére, amelyek rendelkeznek az inzulin alapvető funkcionális tulajdonságaival. Hasonló meggondolások érvényesek a növekedési hormonok esetén is.Knowing the production of a specific base-order DNA molecule, which represents the genetic code for a particular protein, it is possible to modify that nucleotide sequence by chemical or biological methods, after which the structure of the encoded protein is also modified. In this way, for example, modified insulin can be prepared to meet specific medical needs. Microorganisms may be capable of synthesizing any insulin-related amino acid sequence protein which possesses the essential functional properties of insulin. Similar considerations apply to growth hormones.

Ha át tudjuk vinni egy magasabbrendű organizmus közönséges anyagcseréjében részt vevő jellegzetes fehérje genetikai kódját egy baktériumba, úgy lehetőségünk nyílik ennek a fehérjének a baktérium tenyésztésével való előállítására. Megnyílik annak lehetősége, hogy a találmány szerinti módon megváltoztatott mikroorganizmusok által szintetizált proteinnel helyettesítsük a magasabbrendű organizmus protein-igényét, amikor annak képessége ennek a proteinnek a termelésére megszűnt. Felmerül továbbá például annak a lehetősége, hogy a találmány szerinti mikroorganizmus és az ember között szimbiotikus kapcsolatot létesítsünk krónikus vagy akut hiánybetegségek esetén, amikor a találmány szerinti eljárással genetikailag megváltoztatott mikroorganizmust beültethetjük, vagy más módon kapcsolatba hozhatjuk az emberrel, ez utóbbi patológiás anyagcsere-hiányának kompenzálására.If we can transfer the genetic code of a typical protein involved in the normal metabolism of a higher organism into a bacterium, we have the opportunity to produce that protein by culturing the bacterium. It is possible to replace the protein requirement of a higher organism with a protein synthesized by the microorganisms modified by the methods of the invention when its ability to produce this protein is lost. It is also possible, for example, to establish a symbiotic relationship between a microorganism of the invention and a human in chronic or acute deficiency disorders by implanting or otherwise contacting a genetically modified microorganism according to the invention to compensate for the latter's pathological metabolism. .

A találmány tárgya eljárás genetikai információt tartalmazó különleges bázis-sorrendű nukleotidok izolálására, a különleges nukleotid-sorrendű DNS szintézisére és a DNS bevitelére egy mikroorganizmusba.The present invention relates to a method for the isolation of specific base-sequence nucleotides containing genetic information, for the synthesis of the specific nucleotide-sequence DNA and for introduction of the DNA into a microorganism.

A találmány szerint úgy járunk el, hogy (1 humán hipofizis-sejtekből mRNS-t izolálunk kaotrop kationt, kaotrop aniont és diszulfid-kötést hasító szert tartalmazó ribonukleáz-gátló szer jelenlétében végzet homogenizálással.According to the invention, mRNA is isolated from human pituitary cells by homogenization in the presence of a ribonuclease inhibitor containing a chaotropic cation, a chaotropic anion and a disulfide bond cleavage agent.

-4193866 (2) az elválasztott mRNS-t dATP, dCTP, dGTP és TTP jelenlétében egy reverz transzkriptázzal inkubáljuk, (3) az így szintetizált cDNS-t dATP, dCTP, dGTP és TTP jelenlétében egy reverz transzkriptázzal vagy egy DNS polimerázzal inkubáljuk, (4) az így nyert kétszálú cDNS végeihez önmagában ismert módon olyan kapcsoló DNS láncot kapcsolunk,mely komplementer valamely E.coli plazmid restrikciós endonukleázzal végzett hasítása után keletkezett láncvégekkel, (5) valamely E.coli-ból eredő plazmidot restrikciós endonukleázzal hasítunk és a hasított plazmidról alkalikus foszfatázzal eltávolítjuk az 5’-terminális foszfát-csoportot, és (7) a kapcsoló DNS-szekvenciát tartalmazó kétszálú DNS-láncot és a kezelt plazmidot egy DNS-ligáz és ATP jelenlétében inkubáljuk.-4193866 (2) incubating the isolated mRNA with a reverse transcriptase in the presence of dATP, dCTP, dGTP and TTP, (3) incubating the cDNA thus synthesized with a reverse transcriptase or a DNA polymerase in the presence of dATP, dCTP, dGTP and TTP. 4) linking the ends of the resulting double-stranded cDNA in a manner known per se with complementary ends formed after restriction endonuclease digestion of an E.coli plasmid, (5) restriction endonuclease plasmid derived from E.coli and cleaving the plasmid. removing the 5'-terminal phosphate group with alkaline phosphatase; and (7) incubating the double-stranded DNA chain containing the linker DNA sequence and the treated plasmid in the presence of DNA ligase and ATP.

A találmány szerinti eljárást olyan specifikus DNS-sel szemléltetjük, amelyet baktériumba helyezünk, és amely tartalmazza a patkány preproinzulinjának, a patkány növekedési hormonjának és az ember növekedési hormonjának génjeit. Ezzel bizonyítjuk, hogy a találmány szerinti eljárás alkalmas bármely magasabbrendű szervezetből, például gerincesekből származó DNS bevitelére bármely mikroorganizmusba. Magasabbrendű szervezetek alatt értjük az eukariota szervezeteket, amelyeknek differenciált szöveteik vannak, például a rovarok, puhatestűek, növények, gerincesek, köztük az emlőzök, mint például a szarvasmarhák, sertések, vagy maga az ember. Mikroorganizmusként használhatunk bármely mikroszkopikus élő szervezetet, mint például protozoát, prokariotát vagy cukariotát, mint például baktériumokat, protozoákat, algákat vagy gombákat, mint például élesztőket.The process of the present invention is illustrated by specific DNA inserted into a bacterium that contains the genes for rat preproinsulin, rat growth hormone and human growth hormone. This proves that the method of the invention is suitable for introducing DNA from any higher organism, such as vertebrates, into any microorganism. Higher organisms are understood to be eukaryotic organisms that have differentiated tissues, such as insects, molluscs, plants, vertebrates, including mammals such as cattle, pigs, or humans themselves. As the microorganism, any microscopic living organism, such as a protozoa, prokaryote or a sugaryota, such as bacteria, protozoa, algae or fungi, such as yeast, may be used.

A találmány szerinti eljárás során először továbbfejlesztett eljárással elkészítjük a kiválasztott sejttenyészetet. A sejtekből új eljárással sértetlen mRNS-t extrahálunk, miközben gyakorlatilag a teljes ribonukleáz aktivitást gátoljuk. A sértetlen mRNS-t oszlopkromatográfiával különítjük el az extraktumból, majd a négy dezoxi-nukleozid-trifoszfát jelenlétében a reverz transzkriptáz enzim hatásának tesszük ki, amiután megkapjuk a komplementer (cDNS) dezoxi-ribonukleinsav szálat. A reverz transzkriptáz enzimmel kivitelezett első reakció után a termékből szelektíve eltávolítjuk a megfelelő ribonukleotid-szekvenciát tartalmazó részt. Az így kapott dezoxi-nukleotid-molekulát, amely az eredeti mRNS-vel komplementer, a reverz transzkriptáz vagy a DNS-polimeráz és a négy dezoxi-nukleozid-trifoszfát jelenlétében inkubáljuk. Az így kapott vegyület egy kettős szálú cDNS molekula, amely az egyik végüknél egyszálú hurokkal összekapcsolt komplemen tér szálakból áll. Ezt a vegyületet ezután az egyszálú darabra specifikus nukleáz8 za 1 reagáltatjuk, amely enzim lehasítja az egyszálú hurkot. A reakció után kapott kétszálú -cDNS-t ezután meghosszabbítjuk oly módon, hogy mindkét végéhez hozzákapcsolunk egy a restrikciós enzimre érzékeny bázis-szekvenciát tartalmazó specifikus DNS-t. Ezt a reakciót a DNS-ligáz enzim katalizálja. A meghosszabbított -cDNS.-t ezután a restrikciós endonukleázzal kezeljük, amely mindegyik szál 5’-végén önmagára komplementer egyszálú végeket tartalmazó kétszálú molekulát hoz létre.In the process of the invention, the selected cell culture is first prepared by an improved process. A fresh method is used to extract intact mRNA from the cells while substantially inhibiting total ribonuclease activity. The intact mRNA is separated from the extract by column chromatography and then exposed to the reverse transcriptase enzyme in the presence of the four DNAs to obtain the complementary (cDNA) DNA strand. After the first reaction with the reverse transcriptase enzyme, the portion containing the appropriate ribonucleotide sequence is selectively removed from the product. The resulting deoxynucleotide molecule, which is complementary to the original mRNA, is incubated in the presence of the four deoxynucleoside triphosphates, reverse transcriptase or DNA polymerase. The compound thus obtained is a double-stranded cDNA molecule consisting of complementary strand fibers linked at one end by a single-stranded loop. This compound is then reacted with single-stranded nuclease-specific nuclease, which cleaves the single-stranded loop. The double-stranded cDNA obtained after the reaction is then extended by attaching to each end a specific DNA containing the restriction enzyme-sensitive base sequence. This reaction is catalyzed by the enzyme DNA ligase. The extended cDNA is then treated with a restriction endonuclease which produces a double-stranded single-stranded molecule at its 5 'end which is self-complementing.

A plazmid DNS-t, amely ugyanarra a restrikciós endonukleázra érzékeny bázis-szekvenci át tartalmaz, reagáltatjuk az enzimmel, amikor lehasad a polinukleotid-szál, és olyan molekulát kapunk, amely az 5’-végen önmagában komplementer egyszálú darabot tartalmaz. Ezután eltávolítjuk az egyszálú DNS darab 5’-termínális foszfát-csoportjait, abból a célból, hogy megakadályozzuk a plazm dót a gyűrűs szerkezet felvételében.The plasmid DNA, which contains a base sequence sensitive to the same restriction endonuclease, is reacted with the enzyme to cleave the polynucleotide strand, resulting in a molecule containing at its 5 'end a complementary single-stranded moiety. The 5'-terminal phosphate groups of the single-stranded DNA are then removed in order to prevent the plasma donation of the ring structure.

Az előállított cDNS-t és a plazmid DNS-t a DNS-ligáz jelenlétében együtt inkubáljuk. A későbbiekben részletesen megadott reakciókörülmények között csak abban az esetbe! jön létre a plazmid DNS-ből előnyös tulajdonságú, két végén zárt gyűrű, ha a cDNS-ből egy darab beépül a molekulába. A cDNS-szekvenciát tartalmazó plazmidot ezután bejuttatjuk a megfelelő gazdasejtbe. Az életképes plazmidot befogadó sejteket úgy mutatjuk ki, hogy az ezekből a sejtéiből kifejlődött telepek a plazmid által megha'ározott genetikai tulajdonsággal rendelkeznek, például rezisztensek bizonyos gyógyszerekre. A beépített cDNS darabot hordozó relombináns plazmidot tartalmazó tiszta baktérium törzseket ezután tenyésztjük, majd újra izoláljuk a rekombináns plazmidot. Ily módon nagymennyiségű rekombinálódott plazmid DNS-t különíthetünk el, a specifikus cDNS darabot ebből a megfelelő restrikció 5 enzim endonukleotikus hatását kihasználva elkülöníthetjük.The resulting cDNA and plasmid DNA were incubated together in the presence of DNA ligase. Under the reaction conditions detailed below, just in case! a ring closed at both ends of the plasmid DNA has the advantageous feature when a piece of cDNA is incorporated into the molecule. The plasmid containing the cDNA sequence is then introduced into the appropriate host cell. Cells that host a viable plasmid are shown to have colonies derived from these cells that possess the genetic property of the plasmid, for example, resistance to certain drugs. Pure bacterial strains containing the recombinant plasmid carrying the integrated cDNA fragment were then cultured and the recombinant plasmid was re-isolated. In this way, a large amount of recombinant plasmid DNA can be isolated and the specific cDNA fragment isolated from it, utilizing the endonucleotide activity of the appropriate restriction enzyme.

A találmány szerinti eljárás alaplépése bármely magasabbrendű szervezetből, például az emberből nyert nukleotid-szekvencia izolálása és bevitele egy mikroorganizmusba. A találmány szerinti eljárást felhasználhatjuk egy gyógyszerészeti vagy ipari értékű különleges protein szintézisét meghatározó gén átv telére és ennek a proteinnek a mikrobiológiai szintézisére. A találmány szerinti eljárás szemléltetésére a patkány inzulint kódoló nukleotid-darabot izoláltuk, baktériumokba juttattuk és ott replikáitok. Ugyancsak izoláltuk a patkány növekedési homonját meghatározó nukleotid-darabot, majd ezt baktériumokba juttattuk, és ott replikáltuk. A találmány szerinti eljárás felhasználható az emberből izolált DNS átvitelére, így példám az emberi inzulin és növekedési hormon, vagy más polipeptid hormonok átvite'ére is.The basic step of the process of the invention is the isolation and introduction of a nucleotide sequence obtained from any higher organism, such as a human, into a microorganism. The method of the present invention can be used to transfer a gene that determines the synthesis of a specific protein of pharmaceutical or industrial value and to microbiological synthesis of that protein. To illustrate the method of the present invention, a nucleotide fragment encoding rat insulin was isolated, introduced into bacteria and replicated there. A nucleotide fragment defining the rat growth homon was also isolated and introduced into bacteria and replicated there. The method of the invention can be used to transfer DNA isolated from human beings, such as human insulin and growth hormone, or other polypeptide hormones.

-5193866-5193866

A továbbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti eljárást.The process according to the invention will now be described in detail.

A találmány során ismetrtetjük egy specifikus nukleotid-sorrendíí DNS-molekula izolálásának módszerét, ennek átvitelét egy mikroorganizmusba, ahol a DNS eredeti nukleotid-sorrendje replikáció után újra kimutatható.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a method of isolating a specific nucleotide sequence DNA molecule by transferring it to a microorganism, wherein the original nucleotide sequence of the DNA can be re-detected after replication.

A találmány szerinti eljárás lépéseit négy általánosan érvényes fejezetre oszthatjuk fel:The steps of the process according to the invention can be divided into four generally valid chapters:

1. A kívánt sejttenyészet izolálása egy magasabbrendű szervezetből.1. Isolation of the desired cell culture from a higher organism.

Egy adott fehérjét meghatározó genetikai bázis-sorrendnek két lehetséges forrása van: az organizmus saját DNS-e a DNS-t másoló RNS. Az Egyesült Államok National Institutes of Hoalth jelenleg érvényes biztonsági követelményei szerint bármely emberi gént csak abban az esetben helyezhetünk rekombinálódó DNS-be, majd ezután baktériumba, ha a géneket igen gondosan tisztítottuk, vagy a kísérleteket különleges, a nagy kockázatot figyelembe vevő (P4) körülmények között végezzük (erre vonatkozóan lásd Federal Register, 41. kötet, 131 szám, 1967. júliusThere are two possible sources of the genetic basis for a given protein: the body's own DNA is RNA that copies DNA. According to current US National Institutes of Hoalth safety requirements, any human gene can only be inserted into recombinant DNA and then bacterialized if the genes have been thoroughly purified, or experiments have been performed under special, high-risk (P4) conditions. (See, to that effect, Federal Register, Vol. 41, No. 131, July 1967

7., 27, 902—27 943. oldal), fgy bármely olyan eljárást, amelynek potenciális felhasználása emberi protein előállítása lehet, mint például a jelen leírás is, az előállítandó proteint kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó mRNS izolálásával kezdünk. Ennek a módszernek az a további előnye, hogy a mRNS sokkal könnyebben tisztítható, mint a sejtből extrahált DNS. Különösen előnyösen használható fel az a tény, hogy a magasabbrendű szervezetekben, mint például a gerincesekben meghatározhatjuk a szervezeten belül azon sejtek elhelyezkedését, amelyek működése a kérdéses protein termeléséhez vezet. Előfordulhat, hogy ez a sejttenyészet az organizmus átmeneti fejlődési stádiumainak egyikében létezik. Ezekből a sejtekből izolált nagymennyiségű mRNS tartalmazza a kívánt nukleotid-szekvenciát. Az izolált mRNS tisztasága szempontjából lényeges az izolált sejtpopuláció kiválasztása és az izolálás módja.7, 27, 902-27, 943, and thus any method that has the potential use of producing a human protein, such as the present disclosure, begins by isolating the mRNA containing the nucleotide sequence encoding the protein to be produced. A further advantage of this method is that the mRNA is much easier to purify than the DNA extracted from the cell. Particularly advantageous is the fact that in higher organisms, such as vertebrates, the location within the body of cells that function to produce the protein of interest can be determined. This cell culture may exist at one of the transient stages of development of the organism. Large amounts of mRNA isolated from these cells contain the desired nucleotide sequence. The selection of the isolated cell population and the method of isolation are essential for the purity of the isolated mRNA.

Legtöbb szövetben, mirigyben vagy szervben a sejteket fibrózus szövetháló tartja össze, amely főképpen kollagénből áll, de a szövettől függően más szerkezeti proteineket, poliszaharidokat és ásványi anyagokat is tartalmazhat. Egy adott szövetből sejteket izolálva fel kell használnunk azokat az eljárásokat, amelyek lehetővé teszik a sejtek felszabadítását a környező szöveti anyagból. Egy specifikusan differenciálódott sejttípus izolálása és tisztítása két fő lépésből áll: a sejtek elkülönítése a környező szöveti anyagból, továbbá a sejtek elkülönítése a szövetben lévő összes más típusú sejtből. A találmány szerinti eljárás során ismertetett alapelveket felhasználhatjuk egy sor más szövet sejtjeinek izolálására is. Részletesen is6 mertetjuk a hasnyálmirigy Langerhans-szigeteinek izolálását, amelyek az'inzulint kódoló mRNS izolálására használhatók fel.In most tissues, glands, or organs, cells are held together by a fibrotic mesh, which is composed primarily of collagen, but may also contain other structural proteins, polysaccharides, and minerals, depending on the tissue. When isolating cells from a given tissue, we must employ procedures that allow the cells to be released from the surrounding tissue material. Isolation and purification of a specifically differentiated cell type consists of two major steps: isolation of cells from surrounding tissue material and isolation of cells from all other types of cells in the tissue. The principles described in the method of the invention can also be used to isolate cells from a variety of other tissues. The isolation of Langerhans islands of the pancreas, which can be used to isolate mRNA encoding insulin, is also contemplated.

Az inzulint termelő sejteket elkülöníthetjük más forrásokból is, például borjú-hasnyálmirigyből vagy tenyésztett Langerhans tumorsejtekből. A tiszta Langerhans sejtek elkülönítése ilyen esetben jóval egyszerűbb, különösen ha tiszta sejttenyészetet kívánunk használni. A későbbiekben ismertetett módszer a Langerhans sejtek izolálására ebben az esetben nem szükséges, ugyanakkor a módszer mégis előnyös általános alkalmazhatósága miatt.Insulin producing cells may also be isolated from other sources, such as calf pancreas or cultured Langerhans tumor cells. The separation of pure Langerhans cells in such a case is much easier, especially when using pure cell culture. The method described below for isolating Langerhans cells is not necessary in this case, however, because of its general applicability.

Sok esetben úgy találtuk, hogy az izolálandó mRNS mennyisége növelhető a tenyésztés körülményeinek változtatásával. Így például hormonos kezeléssel növelhetjük az izolálható mRNS mennyiségét. Ezt elérhetjük más módszerrel is. például egy adott hőmérsékleten való tenyésztéssel, a táptalajhoz egy különleges tápanyagot, vagy más kémiai vegyületet keverve. A patkány növekedési hormonját kódoló mRNS izolálásakor az mRNS mennyisége szinergista módon és szignifikánsan nőtt. ha a tenyésztett patkány mirigysejteket tíroid hormonnal és glükokortikoidokkal kezeljük.In many cases, it has been found that the amount of mRNA to be isolated can be increased by varying the culture conditions. For example, hormone treatment can increase the amount of mRNA that can be isolated. This can be achieved by other methods. for example, by culturing at a specific temperature, mixing a particular nutrient or other chemical compound with the medium. Isolation of mRNA encoding rat growth hormone increased synergistically and significantly. treating cultured rat glandular cells with thyroid hormone and glucocorticoids.

2. Az mRNS extrakciója2. Extraction of mRNA

A találmány szerinti eljárás lényeges része a sejt extraktumban lévő ribonukleáz enzim gyakorlatilag teljes eltávolítása. Az extrahált mRNS molekula egyszálú polinukleotid, semmiféle komplementer szálat nem tartalmaz, fgy egyetlen foszfodiészter-kötés hidrolitikus hasítása azt eredményezi, hogy az egész, molekula értéktelenné válik mint teljes genetikai kód. Ahogy azt az előzőekben már közöltük, a ribonukleáz enzim mindenütt előfordul, aktív és különlegesen állandó. Megtalálható a bőrön, nem veszti el aktivitását az általánosan használt mosási eljárások során, és néha még a szerves vegyületeket is szennyezi. Különösen jelentős a probléma, ha a hasnyálmirigy sejtjeinek extraktumával dolgozunk, mivel a hasnyálmirigy az emésztő enzimek forrása, így igen gazdag ribonukleázban. A ribonukleázos szennyeződés problémája azonban fennáll minden szövet esetén; a jelen szabadalmi leírásban közölt módszer a ribonukleáz aktivitás megszüntetésére minden szövetre alkalmazható. A módszer rendkívül hatásosságát a hasnyálmirigy Langerhans sejtjeiben lévő intakt mRNS sikeres izolálásával mutatjuk be.An essential part of the process of the invention is the virtually complete removal of the ribonuclease enzyme in the cell extract. The extracted mRNA molecule is a single-stranded polynucleotide, containing no complementary strands, so that the hydrolytic cleavage of a single phosphodiester linkage renders the entire molecule worthless as a complete genetic code. As stated above, the ribonuclease enzyme is ubiquitous, active, and extremely stable. It is found on the skin, does not lose its activity in commonly used washing procedures, and sometimes even contaminates organic compounds. The problem is particularly significant when working with an extract of pancreatic cells, since the pancreas is a source of digestive enzymes and is therefore very rich in ribonuclease. However, ribonuclease contamination is a problem for all tissues; the method disclosed in this patent can be applied to all tissues to eliminate ribonuclease activity. The extreme efficacy of the method is demonstrated by the successful isolation of intact mRNA in Langerhans cells of the pancreas.

A találmány szerinti eljárás során, amikor fehérjétől gyakorlatilag mentes RNS-t izolálunk, mind a sejt feltárása, mind a további lépések során kaotrop aniont, kaotrop kationt és a diszulfid-kémiai kötéseket hasító vegyületet használunk. Az ismertetett vegyületek együttes hatását a patkány hasnyálmirigy Langerhans-szigeteiből jó kitermeléssel izolált mRNS-vel szemléltetjük, amely termék gyakorlatilag intakt molekulákat tartalmaz.In the process of the present invention, when RNA is substantially free of protein, both the cell lysis and subsequent steps use a chaotropic anion, a chaotropic cation, and a disulfide bond cleavage compound. The combined action of the compounds described is illustrated by mRNA isolated from Langerhans islands of rat pancreas, which contains essentially intact molecules.

-6193866-6193866

A megfelelő kaotrop ionokat vizes elegyben való oldhatóságuk és hozzáférhetőségük alapján választjuk ki. Előnyös kaotrop kationok például a guanidium-, karbamoil-guanidium-, guanil-guanidium- és a lítium-ion. Kaotrop anionként előnyösen használhatunk jodid-, perklorát-, tiocianát, vagy például dijód-szalicilát-ionokat. Ezen kationok és anionok kombinációjakor keletkező sók relatív hatásosságát részben oldhatóságuk határozza meg. fgy például a lítium-dijód-szalicilát hatásosabb denatruáló-szer mint a guanidium-tiocianát, oldhatósága azonban csak körülbelül 0,1 mól és ugyanakkor viszonylag drága. A guanidium-tiocianát előnyös kation-anion-kombinációt reprezentál, mert könnyen hozzáréfhető, és vizes elegyben jól oldódik (5 mól).Suitable chaotropic ions are selected on the basis of their solubility in water and their availability. Preferred chaotropic cations are, for example, guanidium, carbamoylguanidium, guanylguanidium and lithium ions. Preferred cathotropic anions are iodide, perchlorate, thiocyanate or diiodic salicylate. The relative potency of the salts formed by the combination of these cations and anions is partly determined by their solubility. For example, lithium diiodosalicylate is a more potent denaturing agent than guanidium thiocyanate, but its solubility is only about 0.1 mole and yet relatively expensive. Guanidium thiocyanate represents a preferred cation-anion combination because it is readily available and readily soluble in an aqueous mixture (5 mol).

A tiol-származékok, mint például a β-merkaptoetanol hasítja a fehérjét intramolekuláris diszulfid-kötéseit; a hasítás tiol-diszulfid kicserélődési reakción alapszik. Számtalan tiol-származék hatásos, köztük a β-merkaptoetanol mellett a ditio-treitol, cisztein, propanol-dimerkaptán és mások. A vízben való oldhatóságuk lényeges, mivel a tiol-származék az intramolekuláris diszulfid-hidakhoz képest nagy feleslegben kell hogy jelen legyen, mivel csak ekkor teljes a kicserélődési reakció. Előnyösen β-merkaptoetanolt használunk, mivel könnyen beszerezhető és viszonylag olcsó.Thiol derivatives such as β-mercaptoethanol cleave the intramolecular disulfide bonds of the protein; the cleavage is based on a thiol disulfide exchange reaction. Numerous thiol derivatives are active, including, in addition to β-mercaptoethanol, dithiothreitol, cysteine, propanol dimercaptan, and others. Their solubility in water is important because the thiol derivative must be present in a large excess relative to the intramolecular disulfide bridges, since only then is the complete exchange reaction complete. Β-mercaptoethanol is preferred because it is readily available and relatively inexpensive.

Az RNS sejtekből vagy szövetekből történő extrakciója során gátoljuk a ribonukleázt; egy adott kaotrop só hatása egyenesen arányos koncentrációjával. Előgyös koncentráció tehát a használható legmagasabb koncentráció. A jelen eljárás során az mRNS sérülés nélküli megőrzése az extrakció során függ a ribonukleáz denaturálásának gyorsaságától a denaturálás mértéke mellett. Valószínűleg ezért használható előnyösebben a guanidium-tiocianát, mint a guanidium-hidrogénklorid, annak ellenére, hogy az utóbbi csak kismértékben gyengébb denaturáló szer. Egy denaturáló szer hatásosságát azzal a küszöb-koncentrációval jellemezzük, amely az adott fehérje teljes denaturálódásához szükséges. Más részről sok protein denaturálódásának sebessége is függ a denaturáló szer koncentrációjától; az adott küszöb értéken ötszörös-tízszeres különbségek is lehetnek (Tanford, Adv. Prot. Chem., 23, 121, 1968). Éz az összefüggés azt jelenti, hogy a guanidium-hidrogénkloridnál csak kevéssé hatásosabb denaturáló szer egy fehérjét azonos koncentráción sokkal gyorsabban denaturálhat. A ribonukleáz denaturálódásának kinetikája és a sejtekből való extrakció közben az mRNS állandósítása közötti összefüggést a jelen leírás előtt nem ismerték fel, és nem használták, Az előzőekben ismertetett elgondolás, ha teljes mértékben igaz, azt jelenti, hogy előnyős denaturáló szer az a vegyület, amelynek a denaturálást kiváltó küszöb-koncent12 rációja alacsony, és amely vízben jól oldódik Ezért a guanidium-tiocianátot előnyösebben használhatjuk, mint a lítium-dijód-szálicilátot, még abban az esetben is, ha az utóbbi erősebb denaturáló szer, mivel a guanidium-tiocianát oldhatósága jóval nagyobb, és így olyan koncentrációban használhatjuk, amely gyors ribonukleáz-ínaktivációt eredményez. Az előzőekben az is nyilvánvaló, miért előnyösebb a guanidium-tiocianát, mint az oldékonyabb hidrogénklorid-só. Az ok: az előző valamivel erősebb denaturáló szer.During extraction of RNA from cells or tissues, ribonuclease is inhibited; the effect of a given chaotropic salt with its proportional concentration. Thus, the preferred concentration is the highest concentration that can be used. In the present process, the intact preservation of mRNA during extraction depends on the rate of denaturation of the ribonuclease at the rate of denaturation. This is probably why guanidium thiocyanate is preferred over guanidium hydrochloride, although the latter is only a slightly weaker denaturing agent. The efficacy of a denaturing agent is characterized by the threshold concentration required for complete denaturation of that protein. On the other hand, the rate of denaturation of many proteins also depends on the concentration of denaturing agent; there may be five to ten times the difference at a given threshold (Tanford, Adv. Prot. Chem., 23, 121, 1968). This connection means that only a less potent denaturing agent than guanidium hydrochloride can denature a protein at much the same concentration much faster. The relationship between the kinetics of ribonuclease denaturation and cellular stabilization of mRNA during extraction from cells has not been recognized or used prior to the present disclosure. The above idea, if fully true, implies that the preferred denaturing agent is The threshold concentration causing the denaturation is low and is highly soluble in water. Therefore, guanidium thiocyanate may be used more preferably than lithium diiodosalicylate, even though the latter is a more potent denaturing agent, since the solubility of guanidium thiocyanate is much higher. and can thus be used at a concentration that results in rapid ribonuclease activation. It is also evident from the foregoing why guanidium thiocyanate is preferred over the more soluble hydrochloride salt. The reason: the previous one is a slightly stronger denaturing agent.

Ha a denaturáló szerrel egy díszülfid-kötést hasító szert együtt használunk, úgy az előbbi hatása nő, mivel a diszulfid-kötéseket hasító szer jelenléte a ribonukleáz molekulát kiegyenesíti. A tiol-származék valószínűleg növeli a denaturáció sebességét is, oly módon, hogy megakadályozza az intramolekuláris diszulfid-kötések jelenlétekor bekövetkező gyors renaturációt. Ezenfelül az mRNS készítményben szennyeződésként megmaradó ribonukleáz gyakorlatilag inaktív marad, még a denaturáló szer és a tiol hiányában is. A tioicsoportot tartalmazó és a diszulfid-kötéseket hasító vegyületek bármely koncentrációban bizonyos mértékig hatásosak, bár általában az intramolekuláris diszulfid-kötésekre számítva nagy fölöslegben kell adnunk a tiolcsoportokat tartalmazó vegyületeket ahhoz, hogy a kicserélődési reakció az intramolekuláris diszulfid-kötések hasadása irányában folyjon. Másrészről több tiolvegyület kellemetlen szagú, és nagy koncentrációban kellemetlen a velük végzett munka, 'gy gyakorlati szempontból létezik egy felső koncentrációhatár. Hatásosnak találtuk a β-merkaptoetanolt, a hatásos koncent áció 0,05 mól és 1,0 mól közé esik, az előnyös koncentráció a patkány hasnyálmirigy sértetlen RNS-ének izolálásakor 0,2 mól.When used with a denaturing agent in combination with an ornithide bond cleaving agent, the effect of the former increases because the presence of the disulfide bond cleaving agent straightens the ribonuclease molecule. The thiol derivative is also likely to increase the rate of denaturation by preventing rapid renaturation in the presence of intramolecular disulfide bonds. In addition, the ribonuclease remaining as a contaminant in the mRNA composition remains virtually inactive, even in the absence of denaturing agent and thiol. Thiol-containing compounds and disulfide bond cleavers are to some extent effective at any concentration, although in general, thiol-containing compounds need to be added in excess in order to effect the exchange reaction on the intramolecular disulfide bond cleavage. On the other hand, several thiol compounds have an unpleasant odor and a high concentration of work with them, so in practice there is an upper concentration limit. Β-mercaptoethanol has been found to be effective, with an effective concentration ranging from 0.05 mol to 1.0 mol, the preferred concentration being 0.2 mol for the isolation of intact RNA of rat pancreas.

Az mRNS sejtből való extrakciójakor az extraháló elegy pH-ja 5,0 és 8,0 közötti.When extracting mRNA from the cell, the pH of the extraction mixture is between 5.0 and 8.0.

A sejt-feltárás után az RNS-t elkülönítjük a sejtben lévő proteintől és DNS-től. Erre a céíra több eljárást fejlesztettek ki, bármely két használhatjuk, mindegyik jól ismert az irodalomban. Az irodalom szerinti egyik eljárás értelmében etanolos kicsapást végzünk. az etanol szelektíve kicsapja az RNS-t. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kivitt lezési változata szerint a kicsapási lépést kihagyjuk, és a homogenizátumot közvetlenül centrifugáló csőben lévő 5,7 mólos céziurnkloridra rétegezzük. Ezután Glisin, Crkvenjakov és Byus módszere szerint (Biochemistry, 13, 2633, 1974) centrifugálunk. Ez a módszer azért előnyös, mert a körülmények az egész centrifugálás során nem kedveznek a ribonukleáz működésének, így az RNS jó kitermeléssel különíthető el, a termék mentes DNS-től és fehérjétől.After cell digestion, RNA is isolated from protein and DNA in the cell. Several methods have been developed for this purpose, any two of which can be used, all well known in the literature. According to one method according to the literature, ethanol precipitation is carried out. ethanol selectively precipitates RNA. In a preferred embodiment of the process according to the invention, the precipitation step is omitted and the homogenate is layered directly on 5.7 M cesium chloride in a centrifuge tube. It is then centrifuged according to the method of Glisin, Crkvenjakov and Byus (Biochemistry, 13, 2633, 1974). This method is advantageous because the conditions do not favor the function of the ribonuclease throughout the centrifugation, so that RNA can be isolated in good yield, free from product and DNA.

A fentiek értelmében eljárva a sejthomogenizát imból megkapjuk a tiszta, teljes menynyiségű RNS-t. Az elkülönített RNS-nek csak 7Proceeding as described above, the cell homogenate yields pure total RNA. Only 7 of the isolated RNA

-7193866 egy része azonban az általunk használható mRNS-nek. Az mRNS további tisztítása érdekében felhasználjuk azt a tényt, hogy a magasabbrendíí szervezetek sejtjeiben az mRNS a transzkripciós lépés után további reakciókban vesz részt, nevezetesen poliadenilsavhoz kötődik. Az ilyen poliadenilsavat tartalmazó mRNS cellulóz-oligo-timídilát kromatografáló oszlopon elkülöníthető (Aviv és Leder, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 1408, 1972). A fentiek értelmében kivitelezett tisztítás elegendően tiszta, intaktés más sejtbe átvihető mRNS-t biztosít ribonukleáz enzimben gazdag kiindulási anyagból. Az mRNS fentiekben kivitelezett tisztítását és az azt követő in vitro eljárást lényegében hasonló módon végezhetjük bármely organizmusból nyert mRNS esetén is.However, -7193866 is part of the mRNA we use. To further purify the mRNA, we utilize the fact that, in cells of higher organisms, mRNA undergoes further reactions after the transcription step, namely, polyadenylic acid. The mRNA containing such polyadenylic acid can be separated on a cellulose oligo-thymidylate chromatography column (Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 1408, 1972). Purification as described above provides a sufficiently pure, intact mRNA that can be transferred to another cell from a ribonuclease-rich starting material. The above purification of the mRNA and the subsequent in vitro procedure may be carried out in substantially the same manner for mRNA obtained from any organism.

Bizonyos körülmények között, például akkor, ha az mRNS forrása szövettenyészet sejtje, a ribonukleáz szennyeződés olyan alacsony lehet, hogy a megadott ribonukleáz-gátlást biztosító módszert nem kell alkalmaznunk. Ilyen esetekben elegendő lehet az irodalomban már ismert ribonukleáz-aktivitást csökkentő módszerek használata.Under certain circumstances, such as when the source of the mRNA is a tissue culture cell, the ribonuclease contamination may be so low that the indicated method of inhibiting ribonuclease does not need to be used. In such cases, it may be sufficient to use methods known in the art for reducing ribonuclease activity.

3. A cDNS előkészítése3. Preparation of the cDNA

Ezen lépés elején elkészítjük a tisztított mRNS-val komplementer DNS-t. A reakciót a reverz transzkriptázzal végezzük, bár használhatunk bármely olyan enzimet, amely képes az mRNS templátból megfelelő komplementer DNS láncot kialakítani. A reakciót végezhetjük az irodalomból már ismert körülmények között, nevezetesen mRNS templát és mint a DNS molekula -prekurzorai, a négy dezoxi-nukleozid-trifoszfát jelenlétében. Előnyös, ha az egyik dezoxi-nukleozid-trifoszfátot az α-helyzetü foszfornál izotóppal jelöljük (32 p), ily módon követhetjük a reakciót, az elkülönítési eljárás, például a kromatográfia vagy az elektroforézis után vizsgálhatjuk a terméket, továbbá mennyiségi szempontból becsülhetjük a vegyület visszanyerését (Efstratiadis, Kafatos, Maxam és Maniatis, Cell, 7, 279, 1976).At the beginning of this step, DNA complementary to the purified mRNA is prepared. The reaction is carried out by reverse transcriptase, although any enzyme capable of forming an appropriate complementary DNA strand from the mRNA template may be used. The reaction may be carried out under conditions well known in the art, namely, in the presence of the mRNA template and, as precursors of the DNA molecule, in the presence of the four deoxynucleoside triphosphates. It is preferred that one of the deoxynucleoside triphosphates is labeled with the isotope at 32 for phosphorus alpha, thereby monitoring the reaction, assaying the product after isolation such as chromatography or electrophoresis, and quantifying the recovery of the compound. (Efstratiadis, Kafatos, Maxam and Maniatis, Cell, 7, 279, 1976).

Ahogy azt az 1. ábrán látjuk, a reverz transzkriptáz enzimmel katalizált reakció terméke egy kétszálú, hajtühöz hasonló alakú molekula, ahol az RNS és a DNS szálak között nem-kovalens kötések létesültek.As shown in Figure 1, the reverse transcriptase-catalyzed reaction product is a double-stranded, hair-like molecule with non-covalent bonds between RNA and DNA strands.

A reverz transzkriptáz enzimmel végzett reakció termékét az irodalomban ismert módszerekkel különítjük el a reakcióelegyből. Használhatjuk a fenolos extrakciót, de izolálható a termék a Sephadex G-10 gyantával (Pharmacia Inc., Uppsala, Svédország) végzett kromatográfiával vagy etanolos kicsapással, vagy ezen módszerek kombinációjával.The product of the reaction with the reverse transcriptase enzyme is isolated from the reaction mixture by methods known in the art. Phenolic extraction may be used, but the product may be isolated by chromatography on Sephadex G-10 resin (Pharmacia Inc., Uppsala, Sweden) or by ethanol precipitation or by a combination of these methods.

Amikor a cDNS-t enzimatikus szintézissel előállítottuk, az RNS templátot eltávolíthatjuk. Az irdalomban több módszer ismeretes az RNS bontására DNS jelenlétében. Előnyös módszer az alkálikus hidrolízis, amely 8 igen szelektív és a reakcióelegy pH-jának beállításával könnyen szabályozható.Once the cDNA is prepared by enzymatic synthesis, the RNA template can be removed. Several methods are known in the art for cleaving RNA in the presence of DNA. A preferred method is alkaline hydrolysis which is highly selective and can be easily controlled by adjusting the pH of the reaction mixture.

Az alkálikus hidrolízis után semlegesítjük a reakcióelegyet, majd a P³²-jelzett cDNS-t adott esetben etanolos kicsapással töményítjük.After the alkaline hydrolysis, the reaction mixture is neutralized, and the ³² P-labeled cDNA is optionally concentrated by ethanol precipitation.

A kétszálú, hajtű alakú cDNS szintézisét megfelelő enzimmel, mint például DNS-polimerázzal vagy reverz transz-kriptázzal katalizált reakcióval végezzük. A reakciót az előző reakció kapcsán megadottak szerint végezzük, beleértve az α-P -jelzett nukleozid-trifoszfát használatát is. A reverz transzkriptáz enzimet több helyről izolálhatjuk. A legelőnyösebb enzimforrás a madarak mieloblasztózis vírusa. A vírust dr. Beard-tól kaptuk (Life Science Incorporated, St. Petersburg, Florida, Egyesült Államok), aki a vírust a National Institutes of Health felügyelete alatt állította elő.Synthesis of double-stranded hairpin cDNA is accomplished by reaction with a suitable enzyme, such as DNA polymerase or reverse transcriptase. The reaction is carried out as described for the previous reaction, including the use of α-β-labeled nucleoside triphosphate. The reverse transcriptase enzyme can be isolated from multiple sites. The most preferred source of enzymes is avian myeloblastosis virus. The virus was dr. It was obtained from Beard, Life Science Incorporated, St. Petersburg, Florida, United States, who produced the virus under the supervision of the National Institutes of Health.

A cDNS előállítása után előnyösen elkülönítjük azt a reakcióelegyből. Ahogy azt az előbbiekben ismertettük, az izolálást fenolos extrakcióval. Sephadex G—100 gyantával készült oszlopon kivitelezett kromatográfiával vagy etanolos kicsapással végezzük. Az így kapott DNS nem tartalmaz szennyező fehérjét.After preparation of the cDNA, it is preferably isolated from the reaction mixture. As described above, isolation by phenol extraction. Sephadex G-100 resin column chromatography or ethanol precipitation. The DNA thus obtained does not contain any contaminating protein.

Az így előállított DNS hajtű-szerű szerkezete átalakítható az ismert kétszálú szerkezetté oly módon, hogy eltávolítjuk a molekuláról a komplementer szálak végeit összekötő egyszálú hurkot. A DNS kétszálú szakaszainak specifikus hidrolízisét végző enzimek nagy száma ismert, és ezek könnyen beszerezhetők. Előnyösen az Aspergillus oryzaeből izolált SÍ nukleázt használjuk. Áz enzim megvásárolható a következő cégtől: Miles Research Products, Elkhart, Indiana, Egyesült Államok. Ha a hajtű alakú DNS molekulát az SÍ nukleázzal kezeljük, úgy jó kitermeléssel olyan cDNS molekulákat kapunk, amelyek végein bázispárok vannak. Ezután az előzőekben megadottak szerint extrakciót, kromatográfiát és etanolos kicsapást végzünk. A reverz transzkriptáz és az SÍ nukleáz használatát az mRNS templátról leírt kétszálú cDNS szintézisekor Efstratiadis és munkatársai ismertetik (Cell, 7, 279, 1976).The hairpin-like structure of the DNA thus produced can be converted to the known double-stranded structure by removing from the molecule a single-stranded loop connecting the ends of the complementary strands. Many enzymes for specific hydrolysis of double-stranded DNA are known and readily available. Preferably, Si nuclease isolated from Aspergillus oryzae is used. The enzyme is available from Miles Research Products, Elkhart, Indiana, United States. Treatment of the hairpin DNA molecule with S1 nuclease yields good yields of cDNA molecules with base pairs at the ends. Then extraction, chromatography and ethanol precipitation are performed as described above. The use of reverse transcriptase and S1 nuclease in the synthesis of double stranded cDNA from the mRNA template is described by Efstratiadis et al., Cell, 7, 279, 1976.

Adott esetben növelhetjük azoknak a cDNS molekuláknak a számát, amelyek végei bázispárokból állnak, oly módon, hogy a molekulát a négy dezoxi-nukleozid-trifoszfát jelenlétében E. coli-ból származó DNS-polimeráz I enzimmel kezeljük. Az enzim exonukleáz és polimeráz aktivitása oly módon hat, hogy eltávolítja a molekula 3’-végéről a kinyúló egyszálú végeket, és ugyanakkor hozzászintetizálja az 5’-végeken lévő egyszálú részekhez a megfelelő bázispárokat. Ily módon biztosítjuk a cDNS-molekulák maximális részvételét a következő reakciókban.Optionally, the number of cDNA molecules having ends of base pairs may be increased by treating the molecule with DNA polymerase I from E. coli in the presence of the four deoxynucleoside triphosphates. The exonuclease and polymerase activity of the enzyme acts by removing the protruding single-stranded ends from the 3'-end of the molecule while synthesizing the corresponding base pairs at the 5'-end single-stranded portions. This ensures maximum involvement of cDNA molecules in the following reactions.

Az eljárás következő lépésében a cDNS termékben lévő molekulák végeit kezeljük, amiután olyan molekulákat kapunk, amelyeketIn the next step of the process, the ends of the molecules in the cDNA product are treated to give the molecules which are

-8193866 a restrikciós endonukleázok felismernek. Azt, hogy milyen DNS fragmenset kapcsolunk a molekulához, az szabja meg, hogy milyen manipulációs eszközök állnak rendelkezésünkre. A molekulához kapcsolt bázis-szekven ciát azon az alapon választjuk ki, hogy milyen specifikus restrikciós endonukleázt kívánunk használni, ugyanakkor a választás attól is függ, hogy milyen a cDNS-vel rekombinált DNS vektormolekula. A kiválasztott plazmidnak olyannak kell lennie, hogy legalább egy olyan hellyel rendelkezzék, ami érzékeny a restrikciós endonukleázra. így pl. a pMB9 plazmid egy restrikciós helyet tartalmaz a Hind III enzimre. A Hind III enzimet a Hemophilus influenzae-ből izoláljuk, és Smith és Wilcox módszerével (J. Mól. Bioi., 51, 379, 1970) tisztítjuk. A Hae III jelű enzimet a Hemophilus aegypticus mikroorganizmusból állítjuk elő és Middleton, Edgell és Hutchison módszerével (J. Virol., 10, 42, 1972) tisztítjuk. A Hemophilus s.uis mikroorganizmusból izolált Hau I jelű enzim hasonló helyekre specifikus hidrolízist katalizál, mint a Hind III enzim. Ezt a két enzimet ezért funkcionálisan kicserélhetőnek tekintjük.-8193866 restriction endonucleases are recognized. What DNA fragment is attached to the molecule is determined by the means of manipulation available to it. The base sequence attached to the molecule is selected based on the specific restriction endonuclease to be used, but also depends on the DNA vector molecule recombined with the cDNA. The plasmid chosen must be at least one site sensitive to the restriction endonuclease. so e.g. plasmid pMB9 contains a restriction site on Hind III. Hind III is isolated from Hemophilus influenzae and purified by the method of Smith and Wilcox (J.Mol. Bioi., 51, 379, 1970). Hae III is prepared from Hemophilus aegypticus and purified by the method of Middleton, Edgell and Hutchison (J. Virol., 10, 42, 1972). Hau I, an enzyme isolated from Hemophilus s.uis, catalyzes site-specific hydrolysis like Hind III. These two enzymes are therefore considered to be functionally interchangeable.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint olyan kémiailag szintetizált kétszálú dekanukleotidot kapcsolunk a cDNS duplexhez, amely a Hind III enzimre érzékeny szekvenciát tartalmaz. A kétszálú dekanukleotid bázis-sorrendjét az 1. ábrán mutatjuk be (Heynekker és munkatársai, Natúré, 263, 748, 1976 és Scheller és munkatársai, Science, 196, 177, 1977). Az irodalomban több ilyen szintetikus, a restrikciós enzimet által felismert bázis-sorrend ismeretes, így előállíthatunk többféle olyan, a kétszálú DNS végeihez kötött egyszálú DNS-t, amely egy sor restrikciós endonukleáz hatására érzékeny.In a preferred embodiment of the method of the invention, a chemically synthesized double-stranded decanucleotide comprising a Hind III enzyme-sensitive sequence is coupled to the cDNA duplex. The base sequence of the double-stranded decanucleotide is shown in Figure 1 (Heynekker et al., Natur. 263, 748, 1976 and Scheller et al., Science 196, 177, 1977). Many of these synthetic base sequences recognized by the restriction enzyme are known in the art, allowing the production of a variety of single-stranded DNA bound to the ends of double-stranded DNA which is sensitive to a number of restriction endonucleases.

A cDNS végeihez kapcsolt és a restrikciós enzimekre érzékeny molekularészt az irodalomban ismert módszerekkel köthetjük. A találmány szerinti eljárás során az úgynevezett „sérült végű ligációs reakciót végezzük, amelyet a Panet és munkatársai által kidolgozott módszer (Biochemistry, 12, 5045, 1973) szerint tisztított DNS-ligáz enzim katalizál. Ezt a reakciót Sgaramella és munkatársai írták le (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 67, 1468, 1970). Ennek az úgynevezett „sérült végű ligációs reakciónak a terméke, amely reakció kettős szálú végekkel rendelkező cDNS molekulák és a nagy feleslegben jelenlévő kétszálú, a Hind III endonukleázra érzékeny bázis-sorrendet tartalmazó kétszálú dekanukleotid között megy végbe, egy olyan cDNS, amely mindkét végén tartalmazza a Hind III restrikciós helyeket. Ha a reakció termékét a Hind III endonukleázzal reagáltatjuk, olyan, az I. ábrán bemutatott molekulát kapunk, amely a restrikciós helyek hasadása következményeképpen, az 5’-végeken egyszálú önmagával komplementer részeket tartalmaz.The restriction enzyme sensitive portion of the cDNA can be linked by methods known in the art. The process of the present invention involves a so-called "damaged end ligation reaction" catalyzed by a purified DNA ligase enzyme according to the method of Panet et al., Biochemistry, 12, 5045, 1973. This reaction is described by Sgaramella et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 67, 1468 (1970). The product of this so-called "damaged end ligation reaction" which takes place between double-stranded cDNA molecules and a large excess of double-stranded double-stranded decanucleotides that are sensitive to Hind III endonuclease, is a cDNA containing at each end Hind III restriction sites. Reaction of the reaction product with Hind III endonuclease results in the molecule shown in Figure I which contains single-stranded self-complementing moieties at the 5 'end as a result of cleavage of the restriction sites.

4. A rekombináns DNS tarnszfer vektor előállítása4. Preparation of the recombinant DNA tarnfer vector

Nagyszámú vírus vagy plazmid DNS használható a fentiekben megadott módon előállított cDNS molekulával való rekombináns képzésére. Az alapvető követelmény az, hogy az átvihető DNS molekula képes legyen belépni a gazdasejtbe, ott replikálódjón, ezenfelül hordoznia kell olyan genetikailag meghatározott tulajdonságot, amely lehetővé teszi, hogy kiválasszuk azokat a gazdasejteket, amelyekbe ez a DNS molekula belépett. A közbiztonság miatt azonban csak olyan átvihető DNS molekulát válaszhatunk, amely az Egyesült Államok National Institutes of Health követelményeinek megfelel (lásd előbb). Az átvihető DNS molekulák listája állandóan lő, ahogy új molekulákat fedeznek fel, amelyeket a National Institute of Health Recombinent DNS Safety Committee elfogad. A jelenleg alkalmazott előnyös átvihető molekulák között nagyszámban szerepelnek a λ-bakteí iofágból származók (Blatter, Williams, Denniston-Thompson, Faber, Furlong, Grunwald, Kiefer, Moore, Schumm, Sheldon és Smithies, Science, 196, 161, 1977), továbbá a col El plaznidból származók (például Rodriguez, Bolivár, Coodman, Boyer, Betlach, ICN-UCLA Symposium on Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression; Ed,: Nierlich, Putter és Fox: Academic Press, N.Y., 1976. 471—477. oldal).A large number of virus or plasmid DNA can be used to recombinantly generate a cDNA molecule prepared as described above. The basic requirement is that the transferable DNA molecule be able to enter and replicate in the host cell, in addition to carrying a genetically determined property that allows the host cells to which this DNA molecule has been introduced to be selected. However, for public security reasons, we can only select a transferable DNA molecule that meets the requirements of the United States National Institutes of Health (see above). The list of transferable DNA molecules is constantly being fired as new molecules are discovered and accepted by the National Institute of Health Recombinant DNA Safety Committee. Currently, a number of preferred transferable molecules include those derived from λ bacteriophage (Blatter, Williams, Denniston-Thompson, Faber, Furlong, Grunwald, Kiefer, Moore, Schumm, Sheldon and Smithies, Science, 1961, 161, 1977), and from Col E1 plasmin (e.g., Rodriguez, Bolivar, Coodman, Boyer, Betlach, ICN-UCLA Symposium on Molecular Mechanisms in Control of Gene Expression; Ed, Nierlich, Putter and Fox, Academic Press, NY, 1976. 471-477 page).

A col El-ből származó plazmidokra az jelit mző, hogy viszonylag kicsik, molekulasílyúk néhány millió, és azzal a különleges tulajdonsággal rendelkeznek, hogy az egy sejtben jelenlévő plazmid DNS molekulák szán a a közönséges körülmények közötti 20— 40-ről a gazdasejt klóramfenikolos kezelésével 1000-re vagy többre növelhető. Megfelelő, a kísérletező szabályozásával kialakítctt körülmények között a gazdasejten belüli gének számának növelése lehetővé teszi, hogy a gazdasejt a plazmid génjei által kódolt elsődleges proteineket termelje.For plasmids derived from col E1, it is indicated that it is relatively small, has a molecular weight of several million, and has the unique property that plasmid DNA molecules present in a single cell range from 20-40 under normal conditions to 1000- or more. Under appropriate conditions, created under the control of the experimenter, increasing the number of genes within the host cell allows the host cell to produce primary proteins encoded by the genes of the plasmid.

A col El ilyen származékai ezért előnyös átvihető DNS-ként jönnek számításba a találmány szerinti eljárásban. A col El előnyös származékai például a tetraciklin rezisztenciát okozó géneket hordozó pMB—9 plazmid, továbbá a pBR—313, pBR—315, pER—316, pBR—317 és pBR—322 plazmidok, amelyek a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát okozó géneken kívül tartalmazzák az ampicillin-rezisztencia génjeit is. A gyógyszerekkel szembeni rezisztenciát okozó gének jelenléte biztosítja azt az előnyt, hogy kivá'aszthatjuk a plazmiddal fertőzött sejteket, mi/el az ilyen sejtekből kialakult telepek a gyógyszer jelenlétében nőnek, míg a plazmído' nem kapott sejtek nem nőnek, illetve nem fejlesztenek telepeket. A találmány szerinti eljárást szemléltető példákban olyan plazmidot használunk, amely a col El-ből szár9Such derivatives of col E1 are therefore preferred as transferable DNA in the process of the invention. Preferred derivatives of col E1 include, for example, plasmids pMB-9 carrying the tetracycline resistance-conferring genes, and plasmids pBR-313, pBR-315, pER-316, pBR-317 and pBR-322, which contain genes that confer resistance to tetracycline. genes for ampicillin resistance. The presence of drug resistance genes provides the advantage of selecting cells infected with the plasmid, since colonies formed from such cells grow in the presence of the drug, whereas non-plasmid-derived cells do not grow or develop colonies. In the examples illustrating the method of the invention, a plasmid derived from col E1 is used

-9193866 mazik, és amely a fentiekben ismertetett rezisztens markereken kívül egy, a Hind III enzimre érzékeny bázis-sorrendet is tartalmaz.-9193866 and comprising, in addition to the resistant markers described above, a Hind III enzyme-sensitive base sequence.

A plazmid kiválasztásához hasonlóan a megfelelő gazdabaktérium kiválasztásakor is sok mikroorganizmus között választhatunk, azonban közbiztonsági okokból a felhasználható mikroorganizmusok száma igen kevés. A National Institute of Health engedélyét megkapta egy kitenyésztett E.coli törzs, ami az X-1776 sorszámot kapta, és aminek a jelen találmányban megadott eljáráshoz hasonló körülmények közötti használatkor a P2 rendelkezéseket kell figyelembe venni (Curtiss, Ann. Rév. Microbiol., 30, 507, 1976). Azokon a helyeken, ahol a P3 lehetőségek állnak fenn, az E.coli RR—1 törzset lehet használni, Ahogy ezt a plazmidok tárgyalásánál már megadtuk, a találmány szerinti eljárás vonatkozik bármely olyan gazdasejtre, amely képes felvenni a kiválasztott DNS molekulát, ilyen gazdasejt lehet a baktériumokon kívül például élesztő, abban az esetben, ha a törzsek kielégítik a National Institute of Health előírásait.As with plasmid selection, there are many microorganisms to choose from when selecting the appropriate host bacterium, but for public safety reasons the number of microorganisms that can be used is very limited. The National Institute of Health is licensed by a cultured E.coli strain bearing the serial number X-1776, which, when used in conditions similar to those of the present invention, must comply with the provisions of P2 (Curtiss, Ann. Rev. Microbiol., 30 , 507, 1976). Where P3 opportunities exist, the E. coli RR-1 strain may be used. As stated in the discussion of plasmids, the method of the invention applies to any host cell capable of uptake of the selected DNA molecule, for example, yeast other than bacteria, provided that the strains meet the requirements of the National Institute of Health.

A rekombináns plazmidok előállítására a restrikciós endonukleáz enzimmel kezelt plazmid DNS-t olyan cDNS molekulákkal keverjük, amelyek hasonlóan kezelt végcsoportokat tartalmaznak. Annak a lehetőségnek a csökkentésére, hogy a cDNS darabok egymással kombinálódjanak, a plazmid DNS-t a cDNS-hez képest moláris feleslegben adjuk. Az eddig ismert módszerek szerint eljárva a feleslegben adott plazmid molekulák anélkül záródtak köralakúvá, hogy beépültek volna a cDNS molekulákba. A gazdasejtbe való bejuttatás után a sejtek elsősorban plazmidot és nem cDNS rekombináns plazmidokat tartalmaztak. Ennek az eredménye az volt, hogy a szelekciós eljárás igen fá18 rasztóvá és időrablóvá vált. Napjainkig ezt a nehézséget úgy kísérleték megoldani, hogy olyan DNS vektort terveztek, amely egy megfelelő marker gén közepén restrikciós endo5 nukleázra érzékeny szakaszt tartalmaz, ily módon az adott rekombinánsnak a gazdasejt DNS molekulába való beépülésekor a gén ketté vált, aminek következményeként a gén által kódolt funkció elveszett.To produce recombinant plasmids, restriction endonuclease-treated plasmid DNA is mixed with cDNAs containing similarly treated end groups. To reduce the possibility of cDNA fragments being combined, plasmid DNA is added in molar excess to cDNA. By methods known to date, excess plasmid molecules are circularized without being incorporated into the cDNA molecules. After introduction into the host cell, the cells primarily contained plasmid and non-cDNA recombinant plasmids. As a result, the selection process became very fatiguing and time-consuming. To date, this difficulty has been addressed by designing a DNA vector that contains a restriction endo5 nuclease-sensitive region in the middle of a suitable marker gene, so that when a particular recombinant is incorporated into a host cell DNA molecule, the gene is lost.

Előnyösen úgy járunk el, hogy a rekombináns plazmidok kiválasztására átvizsgálandó telepek számát kíséreljük meg csökkenteni. A módszer többek között abban áll, hogy a restrikciós endonukleáz enzimmel hasított plaz15 mid DNS-t alkálikus foszfatázzal kezeljük, amely enzim több forrásból, például a Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey, Egyesült Államok, beszerezhető. Az alkálikus foszfatázzal való kezelés során a plazmid endonukleázzal kialakított végeiről lehasadnak az 5’-terminális foszfátcsoportok, így megszűnik a lehetőség a plazmid DNS molekulák egymáshoz való kapcsolódására. Ennek az a következménye, hogy a mole25 kula köralakúivá való alakulása, így a transzformáció is az 5’-terminális foszfátcsoportokat tartalmazó DNS szakaszba való beépüléstől függ. Az így végzett kísérlet során a rekombináció nélkül bekövetkező transzformá30 ció (a gazdasejtbe való behatolás) rela tív gyakorisága 1 — 10⁴-nél kisebb lesz.Preferably, attempts are made to reduce the number of colonies to be screened for the selection of recombinant plasmids. The method involves, inter alia, treating plasmid DNA cleaved with restriction endonuclease with alkaline phosphatase, which is available from several sources, such as Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey, United States. During treatment with alkaline phosphatase, the 5'-terminal phosphate groups are cleaved from the ends of the plasmid by endonuclease, thus eliminating the possibility of plasmid DNA molecules being linked together. The consequence of this is that the transformation of mole25 to the circular shape of the mole25, including the transformation, depends on its incorporation into the DNA region containing the 5'-terminal phosphate groups. In this experiment, the relative frequency of transformation without recombination (penetration into the host cell) will be less than 1 to 10 ⁴ .

A találmány szerinti eljárás azon a tényen alapszik, hogy a DNS-ligáz enzim által katalizált reakció a DNS 5’-foszfát-végcsoportja és a DNS 3’-hidroxil-végcsoportjai között következik be. Ha a terminális 5’-foszfát-csoportot eltávolítjuk, a kapcsolódási reakció nem következik be. Abban az esetben, ha kétszálú DNS molekulákat kapcsolunk össze, úgy 3 lehetőség áll fenn, a lehetőségeket a 2. táblázatban mutatjuk be.The process of the invention is based on the fact that the DNA ligase-catalyzed reaction takes place between the 5'-phosphate end group of the DNA and the 3'-hydroxyl end group of the DNA. If the terminal 5'-phosphate group is removed, the coupling reaction does not occur. In the case of double-stranded DNA molecules, there are 3 possibilities, the possibilities are shown in Table 2.

EsetCase

2, táblázat Reagáló vegyületekTable 2 Reactive Compounds

A ligáz hatására kialakuló termékProduct formed by ligase

IIII

IIIIII

3' 5'3 '5'

-----OH H2O3PO-------------OPO3H2+HO--------5' 3'----- OH H2O3PO ------------- OPO3H2 + HO -------- 5 '3'

3' 5'3 '5'

-----OH H2O3P-O-------0H⁺ OH----5' 3'----- OH H2O3P-O ------- 0H ⁺ OH ---- 5 '3'

3' 5'3 '5'

-----OH HO---------OH HO----5' 3'----- OH HO --------- OH HO ---- 5 '3'

3' 5'3 '5'

----O-P-O-------------O-P-O-----+2H₂O---- OPO ------------- OPO ----- + 2H ₂ O

5' 3'5 '3'

3' 5'3 '5'

----Oh H0------+H2O---- Oh H0 ------ + H2O

5' 3' nincs reakció5 '3' no reaction

A 2. táblázatban a kétszálú DNS molekulákat kihúzott párhuzamos vonalakkal jelöljük, 5’- és 3’-végcsoportjaikat hidroxil- vagy foszfátcsoporttal (OH vagy OPO₃H₂) jelöljük. Az I esetben mindkét reagáló vegyület végén van 5’-foszfát-csoport, így mindkétTable 2 shows the double stranded DNA molecules are drawn with parallel lines indicated, the 5'- and 3'-terminal groups denote hydroxyl or phosphate group (OH or OPO ₃ H _2). In the case of I, both reacting compounds have a 5'-phosphate group at the end, so both

-10193866 szál kovalensen lesz kötve a reakció után. A II esetben az összekötendő szálak közül csak az egyik rendelkezik 5’-foszfát-csoporttal, aminek következményeképpen reakció után egy kovalens kötés marad fenn (egyetlen egyszálú kötés), ugyanakkor a másik szálban egy törés marad. A kovalensen nem kötött szál kapcsolatban marad az összekapcsolódott szállal, mint ahogy ez az irodalomban jól ismert, a két szálat alkotó komplementer bázispárok között kialakuló hidrogén-hidak révén. A III esetben a reagáló DNS molekulák végei nem tartalmaznak 5’-foszfát-csoportot, így a kötődési reakció nem jön létre.-10193866 strands will be covalently bound after the reaction. In Case II, only one of the strands to be joined has a 5'-phosphate group, which results in a covalent bond (a single single bond) after the reaction, while the other strand has a break. The covalently non-bonded fiber remains in contact with the bonded fiber as is well known in the art through the formation of hydrogen bridges between complementary base pairs forming the two fibers. In the case of III, the reacting DNA molecules do not contain 5'-phosphate ends at the ends, so that no binding reaction takes place.

A nem kívánatos kötődési reakciókat oly módon akadályozhatjuk meg, hogy a megfelelő reagáló molekulák végeit, ahol a kötődést meg kívánjuk akadályozni, az 5’-foszfát-csoportok eltávolítására kezeljük. Az 5’-foszfát-csoportok hasítására bármely olyan módszert használhatunk, amely más helyeken nem sérti a DNS molekula szerkezetét. Előnyösen az alkálikus foszfatáz enzim által katalizált hidrolizises reakciót választjuk.Unwanted binding reactions can be prevented by treating the ends of the corresponding reactive molecules where the binding is desired to remove the 5'-phosphate groups. Any method which cleaves the 5'-phosphate groups can be used which does not otherwise damage the structure of the DNA molecule. Preferably, the alkaline phosphatase catalyzed hydrolysis reaction is selected.

Az előzőekben ismertetett eljárás szemléltetésére a patkány inzulin szintézisét meghatározó cDNS-t izoláljuk és egy plazmiddal rekombináljuk. Az így nyert DNS molekulákat E. coli X-1776 törzs transzformálására használjuk. A transzformánsokat tetraciklint tartalmazó táptalajon növesztve szelektáljuk. A transzformált sejtekből kapott rekombináns plazmid DNS olyan beépült DNS szakaszt tartalmazott, amely 410 nukleotidból állt. Hasonló eljárással izolált más rekombinánsokat ís kaptunk és vizsgáltunk. A plazmidból a beépült DNS szakaszokat a Hind III vagy a Hsu I endonukleázzal kivitlezett emésztéssel Szabadítottuk fel, majd Maxam és Gilbert módszerével (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 560, 1977) szekvencia-analízist végeztünk. A beépült DNS szakaszok nukleotid-sorrendje átfedő volt, és tartalmazta a patkány proinzulin I teljes kódját, továbbá a prepeptid 23 aminosav közül 13-ét. Az ismertetett szakasz nukleotid-sorrendjét az alábbiakban ismertetettek szerint készítettük el.To illustrate the above procedure, the rat cDNA that determines the synthesis of rat insulin is isolated and recombined with a plasmid. The resulting DNA molecules were used to transform E. coli strain X-1776. Transformants are selected by growing on medium containing tetracycline. The recombinant plasmid DNA obtained from the transformed cells contained an integrated DNA segment consisting of 410 nucleotides. Other recombinants isolated by a similar procedure were also obtained and tested. The inserted DNA sections from the plasmid were freed by Hind III or Hsu I endonuclease digestion and then sequenced by the method of Maxam and Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 560, 1977). The nucleotide sequences of the inserted DNA sections were overlapping and contained the complete code for rat proinsulin I and 13 of the 23 amino acids of the prepeptide. The nucleotide sequence of the described sequence was prepared as described below.

Hasonló módon izoláltuk a patkány növekedési hormonját kódoló cDNS-t, majd plazmiddal rekombináltuk és E. coliba juttattuk. Az E. coli sejtek intenzív replikációja után olyan DNS molekulákat izoláltunk, amelyek körülbelül 800 nukleotidból álltak, és tartalmazták a patkány növekedési hormon teljes kódját, továbbá a prekurzor fehérje kódjának egy részét és az 5’-nem transzformált szakasz egy részét is.Similarly, cDNA encoding rat growth hormone was isolated and recombined with plasmid and introduced into E. coli. After intense replication of E. coli cells, DNA molecules consisting of about 800 nucleotides containing the complete rat growth hormone code, part of the precursor protein code and part of the 5'-untransformed region were isolated.

A találmány szerinti eljárás általánosan alkalmazható magasabbrendü szervezetek, köztük az ember génjeinek elkülönítésére és tisztítására, a gének mikroorganizmusokba való átvitelére és ugyanott bekövetkező replikációjukra. Olyan új rekombináns plazmidokat ismertetünk, amelyek az izolált géni teljesen vagy részben tartalmazzák. A természetben eddig ismeretlen új mikroorganizmu20 sokat írunk le, amelyek génjeikben egy magasabbrendü szervezetből származó géneket tartalmaznak. A találmány szerinti eljárás részletfes'Szemléltetésére részletes példákat ismertetünk a találmány minden lépésére, a patkány inzulin génjeinek izolálására, tisztítására és bevitelére E.coli sejtekbe. A példákba jellemezzük a patkány inzulin génjét, a patkány növekedési hormonjának génjét, az ember inzulin génjét és az ember növekedési hormonjának génjét tartalmazó rekombináns plazmidokat és az ezeket a géneket tartalmazó új mikroorganizmusokat. Az 1—4. példák nem konkrétan a találmány tárgyára a növekedési hormon előállítására vonatkoznok, de ezek a példák segítenek jobban meg/ilágítani a találmány szerinti eljárás technkai részleteit.The method of the invention is generally applicable to the isolation and purification of genes from higher organisms, including humans, to the transfer of genes to microorganisms and their replication therein. Novel recombinant plasmids containing all or part of the isolated gene are described. New microorganisms, hitherto unknown in nature, are described which contain genes derived from a higher organism in their genes. DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Detailed steps for isolating, purifying, and introducing rat insulin genes into E. coli cells are provided for each step of the invention. The examples describe recombinant plasmids containing the rat insulin gene, rat growth hormone gene, human insulin gene and human growth hormone gene, and novel microorganisms containing these genes. 1-4. Examples 1 to 4 do not specifically relate to the production of growth hormone, but they serve to further elucidate the technical details of the method of the invention.

1. példaExample 1

Ismertetjük a patkány inzulin mRNS cxtrakcióját és izolálását, az erre komplementer DNS szintézisét és a komplementer DNS jellemzését.We describe the extraction and isolation of rat insulin mRNA, the synthesis of complementary DNA, and the characterization of complementary DNA.

A patkány Langerhans sejtjeinek elkülönítésére egy altatott patkány hasnyálmirigyét Ilank-sóoldattal kezeljük a hasnyálmirigy rdrográd infúziójával. A Hank-sóoldat összetétele ismeretes az irodalomban, és több forrásból beszerezhető, például: Grand Island Biological Süpply Company, Grand Island, New York, Egyesült Államok. Ezután eltávolítjuk a hasnyálmirigyet, a Hank-oldatban 0 C° hőmérsékleten felvagdaljuk, majd kollagenáz enzimmel és szójabab tripszin-inhibitorral emésztjük. Minden ezt követő lépést 0 ’C és 4 C° közötti hőmérsékleten végzünk, kivéve ha másként nem adjuk meg. Az emésztés körülményei rendkívül fontosak. 8 ml (leljes térfogat) Hank-sóoldatban lévő két apróra vágott patkány hasnyálmirigyet 30 ml térfogatú kémcsőbe helyezünk. Az összes használt kémcsövet szilikonnal előkezeljük (a szilikon beszerzési helye a következő: márkanév: Siliclad, Clay-Adams Division, Becton-Dickinson Inc., Parsippany, New Jersey, Egyesült Államok). Az inkubációs elegy 12 mg kollagenázt tartalmaz, amelyet Clostridium histolyticum-ből állítottak elő lényegében Mandl, Machennan és Howes módszerével (J. Clin. Invest., 32, 1323, 1943), az enzim jele CLS IV, és a beszerzési hely: Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey; az inkubációs elegy ezenfelül 1 mg, a Sigma Chemical Company-tól (St. Louis, Missouri, Egyesült Államok) vásárod tripszin-inhibitort tartalmaz.To isolate rat Langerhans cells, anesthetized rat pancreas was treated with Ilank's saline by rdrograde infusion of the pancreas. The composition of Hank's saline solution is known in the literature and is available from a variety of sources, such as the Grand Island Biological Süpply Company, Grand Island, New York, United States. The pancreas is then removed, sliced in Hank's solution at 0 ° C and digested with collagenase and soybean trypsin inhibitor. All subsequent steps are performed at a temperature between 0 ° C and 4 ° C unless otherwise specified. The digestive conditions are extremely important. Two small rat rat pancreas in 8 ml (full volume) of Hank's saline were placed in a 30 ml test tube. All used test tubes were pre-treated with silicone (available from Siliclad, Clay-Adams Division, Becton-Dickinson Inc., Parsippany, New Jersey, USA). The incubation mixture contains 12 mg of collagenase prepared from Clostridium histolyticum essentially by the method of Mandl, Machennan and Howes (J. Clin. Invest., 32, 1323, 1943), the enzyme is CLS IV, and purchased from Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey; the incubation mixture also contains 1 mg of a trypsin inhibitor purchased from Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, United States.

C° hőmérsékleten 25 percen át inkubáljuk az elegyet, miközben percenként 90 szer kitérő rázóasztalon rázzuk. A rázatás során folyamatosan vizsgáljuk azt, hogy a kollagenáz emésztés elérte-e az optimális mértéket. Ha az inkubációs idő túl rövid, a Langerhans sejtek felszabadulása nem teljes, ug/anakkor, ha az inkubációs idő túl hosszú, egy a sejtek lízise következhet be. Az inku11Incubate at 25 ° C for 25 minutes while shaking 90 times per minute on a rotary shaker. During shaking, we continuously monitor whether collagenase digestion has reached optimum levels. If the incubation time is too short, the release of Langerhans cells is incomplete, whereas if the incubation time is too long, a lysis of the cells may occur. Inca11

-11193866 báció után egy percen át 200 g nehézségi gyorsulással . centrifugálunk. A felülúszót kiöntjük, az üledéket Hank-oldattal mossuk, majd ezt 5 alkalommal megismételjük. Az utolsó centrifurálás után 15 ml Ficoll-ban (Pharmacia Chemical Company, Uppsala, Svédország) szuszpendáljuk az üledéket (ajrasznált Ficoll sűrűsége 1,085). Ezután 8 ml 1,080 sűrűségű Ficoll-t, majd 5 ml 1,060 sűrűségű Ficoll-t rétegezünk a szuszpenzióra, majd 5 percen át 5000, majd 5 percen át 2000 g nehézségi gyorsulással centrifugáljuk szögrotorban. A centrifugálás eredményeképpen az egyéb sejtek a centrifugacső alján maradnak, míg a Langerhans sejtek a gradiens mentén felemelkednek, és a két felső réteg között egy sávot alkotnak. A Langerhans sejteket tartalmazó rész ganglionsejtekkel, limfomasejtekkel és szövetsejtekkel van fertőzve. A nagyméretű fertőző fragmenseket magában a centrifugacsőben távolítjuk el. Az így kapott készítményt mikroszkóp alá helyezzük, és az ott látható fertőző anyagokat kézzel, mikropipettával távolítjuk el. Ezután Hank-oldattal hígítjuk a sejtkészítményt és centrifugáljuk. A felülúszót kiöntjük, a sejteket tartalmazó üledéket pedig folyékony nitrogénben fagyasztva tároljuk.-11193866 for one minute at 200 g gravity acceleration. We were centrifuged. The supernatant was discarded, the pellet washed with Hank's solution and repeated 5 times. After the final centrifugation, the pellet was resuspended in 15 ml of Ficoll (Pharmacia Chemical Company, Uppsala, Sweden) (density of Ficoll used was 1.085). Then 8 ml of 1.080 Ficoll, 5 ml of 1.060 Ficoll were layered on the slurry and centrifuged for 5 minutes at 5000 g and then 5 minutes at 2000 g gravity rotator. As a result of centrifugation, other cells remain at the bottom of the centrifuge tube, while Langerhans cells rise along the gradient and form a band between the two upper layers. The portion containing Langerhans cells is infected with ganglion cells, lymphoma cells and tissue cells. The large infectious fragments are removed in the centrifuge tube itself. The resulting composition is placed under a microscope and the infectious material visible therein is removed manually with a micropipette. The cell solution was then diluted with Hank's solution and centrifuged. The supernatant is discarded and the cell-containing pellet is frozen in liquid nitrogen.

mólos guanidium-tiocianátban (Tridom; Fluka AG Chemische Fabrik, Buchs, Svájc), amely 1 mól β-merkaptoetanolt tartalmaz, és amelynek pH-ját 5,0-re állítottuk be, és 4 C° hőmérsékletre hűtöttük, 200 patkányból származó Langerhans sejteket homogenizálunk. A homogenizátumot 1,2 ml, 100 mM EDTA-t tartalmazó 5,7 mólos céziumkloridra rétegezzük, majd 18 órán át 15 C° hőmérsékleten 37 000 percenkénti fordulat mellett Beckman ultracentrifugában SV 50,1 rotorban centrifugáljuk. (Beckman Instrument Company, Fullerton, California, Egyesült Államok). Az RNS a centrifugacső alsó részén gyűlik össze.Langerhans cells from 200 rats in mole guanidium thiocyanate (Tridom; Fluka AG Chemische Fabrik, Buchs, Switzerland) containing 1 mole of β-mercaptoethanol adjusted to pH 5.0 and cooled to 4 ° C. homogenized. The homogenate was layered on 1.2 ml of 5.7M cesium chloride containing 100 mM EDTA and centrifuged for 18 hours at 15 ° C and 37,000 rpm in a Beckman ultracentrifuge in a SV 50.1 rotor. (Beckman Instrument Company, Fullerton, California, United States). RNA is collected in the lower part of the centrifuge tube.

A poliadenilezett RNS-t a teljes RNS frakcióból oligo-(dT)-cellulóz oszlopon végzett kromatográfiával különítjük el Aviv és Leder módszere (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 1408, 1972) szerint.The polyadenylated RNA is separated from the total RNA fraction by chromatography on an oligo- (dT) -cellulose column according to the method of Aviv and Leder (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 1408, 1972).

A patkány Langerhans sejtjeiből izolált teljes poliadenilezett RNS átmásolására cDNS-é mieloblasztózis vírusból izolált reverz transzkriptáz enzimet használunk; az enzimet Beardtól kaptuk (Life Science Inc., ST. Petersburg, Florida, Egyesült Államok): a reakciót 50 mM pH 8,3 trisz-HCl-t, 9 mM magnéziumkloridot, 30 mM nátriumkloridot, 20 mM β-merkaptoetanolt, egyenként 1 — 1 mM-nyi három nem radioaktív dezoxi-ribonukleozid-trifoszfátot, 250 μΜ negyedik, a—p³² jelzett (specifikus aktivitás 50—200 c/mól) dezoxi-nukleozid-trifoszfátot, 20 pg/ml oligo dT₁₂-ie-t (Collaborative Research, Waltham, Massachusetts, Egyesült Államok), 100 pg/ml poliadenilezett RNS-t és 200 É/ml reverz transzkriptáz enzimet tartalmazó reakció12 elegyben végezzük. A reakcióelegyet 45 C° hőmérsékleten 15 percen át inkubáljuk. Ezután 25 mM EDTA—Na₂—t adunk hozzá, majd azonos térfogatú vízzel telített fenollal extraháljuk. Elkülönítjük a vizest fázist, majd 0,3 cm átmérőjű és 10 cm magas Sephadex G—100 gyantából készült kromatográfáló oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot 10 mM trisz-HCl-ot, pH 9,0, 100 mM nátriumkloridot és 2 mM EDTA-t tartalmazó eleggyel egyensúlyozzuk ki. A nukleinsavat etanollal csapjuk ki az eluátumból, miután 0,25 M pH 6,0, ammóniumacetátot adtunk hozzá. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, a centrifugálás után kapott üledéket 50 μΐ frissen készített 0,1 M nátriumhidroxid oldatban oldjuk, majd az RNS hidrolízisére 20 percen át 70 C° hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 1 mólos pH 4,5 nátriumacetátot adunk az oldathoz annak semlegesítésére, majd a cDNS-P³²-t etanollal kicsapjuk, és vízben újra oldjuk. Az egyszálú cDNS alikvot mintáit poliakril-amid gélen analizáljuk Dingman és Peacock módszerével (Biochemistry, 7, 659, 1968). A gélt megszárítjuk, majd a DNS—P³²-t Kodak No-Schreen NS—2T filmmel (Eastman Kodak Corporation, Rochester, New York, Egyesült Államok) kivitelezett autoradiográfiával határozzuk meg. A cDNS heterodiszperz, ahogy azt az elektroforézises vizsgálat jelzi, A termék túlsúlyban körülbelül 450 nukleotidból álló cDNS molekulákat tartalmaz, amint azt ismert anyaggal való összehasonlítás alapján kimutattuk.To reverse the entire polyadenylated RNA isolated from rat Langerhans cells, the reverse transcriptase enzyme isolated from myeloblastosis virus was used as its cDNA; enzyme was obtained from Beard (Life Science Inc., ST. Petersburg, Florida, USA): the reaction was 50 mM pH 8.3 Tris-HCl, 9 mM magnesium chloride, 30 mM sodium chloride, 20 mM β-mercaptoethanol, 1 - 1 mM three non-radioactive DNAs, 250 μΜ fourth, a-p ³² labeled (specific activity 50-200 c / mole) deoxynucleoside triphosphate, 20 pg / ml oligo dT ₁₂ -ie (Collaborative Research, Waltham, Massachusetts, United States), in a reaction mixture containing 100 pg / ml polyadenylated RNA and 200 U / ml reverse transcriptase. The reaction mixture was incubated at 45 ° C for 15 minutes. 25 mM EDTA-Na ₂ is then added and the mixture is extracted with an equal volume of water-saturated phenol. The aqueous phase was separated and chromatographed on a 0.3 cm diameter and 10 cm high Sephadex G-100 chromatography column. The column was equilibrated with a mixture of 10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 100 mM sodium chloride and 2 mM EDTA. The nucleic acid was precipitated from the eluate with ethanol, after 0.25 M pH 6.0, ammonium acetate was added. The precipitate was collected by centrifugation, and the pellet obtained after centrifugation was dissolved in 50 μΐ of freshly prepared 0.1 M sodium hydroxide solution and incubated for 20 minutes at 70 ° C for RNA hydrolysis. 1M sodium acetate pH 4.5 was added to the solution to neutralize it, and then the ³² -t-P cDNA is ethanol precipitated and redissolved in water. Aliquots of single-stranded cDNA were analyzed on a polyacrylamide gel according to Dingman and Peacock (Biochemistry, 7, 659, 1968). The gel was dried and then the DNA is assessed according to ³² P-executed Kodak No-Schrenk NS-2T film (Eastman Kodak Corporation, Rochester, New York, United States) by autoradiography. The cDNA is heterodispersed, as indicated by electrophoresis assay. The product predominantly contains cDNA molecules of about 450 nucleotides, as detected by comparison with known material.

2. példaExample 2

Ismertetjük a patkány inzulin genetikai kódját tartalmazó kettős szálú cDNS szintézisét és jellemzését.The synthesis and characterization of double-stranded cDNA containing the rat insulin gene code is described.

Az 1. példa szerinti módon előállított egyszálú cDNS terméket a komplementer szál szintézise céljából reverz transzkriptáz enzimmel kezeljük. A reakciót a következő vegyületeket tartalmazó reakcióelegyben végezzük: 50 mM trisz-HCl, pH 8,3. 9 mM magnéziumklorid, 10 mM ditio-treitol, egyenként 50—50 mM a három nem jelzett dezoxt-ribonukleozid-trifoszfátból, 1 mM a—P³²-jelzett nukleozid-trifoszfát (specifikus aktivitás 1 —10 c/mM), 50 pg/ml cDNS és 220 E/ml reverz transzkriptáz. 120 percen át 45 C° hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet. A reakciót 25 mM EDTA—Na₂ adagolásával állítjuk le, majd fenollal extraháljuk, és az extraktumot Sephadex G—100 oszlopon kromatografáljuk. Az eluátumból a terméket etanollal kicsapjuk. A reakciótermék egy alikvot mintáját, amelynek aktivitása 500 cpm 1000 cpm közé esik, az 1. példában megadottak szerint gél-elektroforézissel vizsgáljuk. 450 nukleotidnak megfelelő helyen egy heterodiszperz sáv látható (sztenderd mintákkal való összehasonlítás alapján).The single-stranded cDNA product of Example 1 was treated with reverse transcriptase to synthesize the complementary strand. The reaction is carried out in a reaction mixture containing 50 mM Tris-HCl, pH 8.3. 9 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 50 to 50 mM of each of the three unlabeled deoxyribonucleoside triphosphates, 1mM ^a-32 P-labeled nucleoside triphosphate (specific activity 1 -10 c / mM), 50 pg / ml cDNA and 220 U / ml reverse transcriptase. The reaction mixture was incubated for 120 minutes at 45 ° C. The reaction was stopped by the addition of 25 mM EDTA-Na ₂ , extracted with phenol and chromatographed on a Sephadex G-100 column. The product was precipitated from the eluate with ethanol. An aliquot of the reaction product having an activity of 500 cpm to 1000 cpm was assayed by gel electrophoresis as in Example 1. At 450 nucleotides, a heterodisperse band is displayed (by comparison with standard samples).

Az 1. és 2. példákban megadottak szerinti előállított DNS alikvot mintáit fölösAn aliquot of the DNA produced as described in Examples 1 and 2 is superfluous

-12193866 mennyiségű restrkciós endonukleázzkal (Hae 111) kezeljük, és a fentiek szerint eljárva gélelektroforézissel vizsgáljuk. Mindkét terméket hasítja az endonukleáz, így a radioaktivitás alapján meghatározott gélelektroforézises képen két sáv látható.-12193866 was treated with restriction endonuclease (Hae 111) and assayed by gel electrophoresis as described above. Both products are cleaved by the endonuclease, so that two bands can be seen in the gel electrophoresis image determined by radioactivity.

A sávok a kettős szálú cDNS hasadásából származó termékekből adódnak, amik lényegében hasonló hosszúságú hasított termék jelenlétére utalnak, mint amit az egyszálú cDNS hasítása után kapunk.The bands are derived from products derived from double-stranded cDNA cleavage, which indicates the presence of a substantially similar length of cleavage product as obtained after cleavage of single-stranded cDNA.

3. példaExample 3

Ismertetjük a Hind III érzékeny bázissorrendet tartalmazó kétszálú dekanukleotid (a továbbiakban HindlII dekanukleotid) hozzákapcsolását a 2. példa szerinti eljárással előállított és patkány Langerhans sejtekből izolált kétszálú cDNS egyszálú szakaszt nem tartalmazó végeihez.It is disclosed that the double-stranded decanucleotide comprising the Hind III sensitive base sequence (hereinafter referred to as "HindIII") is linked to the non-single stranded ends of double stranded cDNA prepared by the method of Example 2 and isolated from rat Langerhans cells.

A 2. példa szerinti módon előállított kettős szálú reakcióterméket 2 pg/ml és 5 pg/ml koncentrációhatárok között 30 E, 1200 E/ml aktivitású, a Miles Laboratoriestől (Elkhart, Indiana, Egyesült Államok) vásárolt SÍ nukleázzal kezeljük. A reakciót 0,03 mól pH 4,6 nátriumacetátot, 0,3 mól nátriumkloridot és 4,5 mM cinkkloridot tartalmazó reakcióelegyben végezzük. 30 percen át 22 C° hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 15 percen át 10 C° hőmérsékleten folytatjuk az inkubációt. Az emésztés leállítására 0,1 mól (végkoncentráció) trisz-bázist, 25 mM EDTA-t és Ehrenstein módszere szerint (Methods in Enzymology, Colowick és Káplán, 12A kötet, 588. oldal, 1967) előállított 40 pg/ml E. coli tRNS-t adunk a reakcióelegyhez.The double-stranded reaction product prepared in Example 2 was treated with Si nuclease at 30 U, 1200 U / ml, purchased from Miles Laboratories (Elkhart, Indiana, United States) at concentrations ranging from 2 pg / ml to 5 pg / ml. The reaction is carried out in a reaction mixture containing 0.03 moles of pH 4.6 sodium acetate, 0.3 moles of sodium chloride and 4.5 mM zinc chloride. The reaction mixture was incubated at 22 ° C for 30 minutes and then incubated at 10 ° C for 15 minutes. To stop digestion, 0.1 µM (final concentration) of tris-base, 25 mM EDTA, and 40 pg / ml of E. coli tRNA was prepared according to the method of Ehrenstein (Methods in Enzymology, Colowick and Kaplan, Vol. 12A, p. 588, 1967). is added to the reaction mixture.

Fenollal extraháljuk az elegyet, majd Sephadex G—100 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk, az eluált cDNS—P³²-t etanollal kicsapjuk az oldatból.The mixture is extracted with phenol and chromatographed on a column of Sephadex G-100 resin, and the eluted cDNA-P ³² is precipitated from the solution with ethanol.

Ezután jó kitermeléssel a kémiailag szintetizált dekanukleotidhoz való kapcsoláshoz szükséges, végükön bázispárokat tartalmazó cDNS molekulákat kapunk. A Hind III dekanukleotidok előállítására Scheller, Dickerson, Boyer, Riggs és Itakura módszere szerint (Science, 196, 177, 1977) járunk el. A Hind III dekanukleotidok és a cDNS összekapcsolását 14 C°-on való inkubációval végezzük a következő reakcióelegyben: 66 mM trisz-hidrogénklorid, pH 7,6, 6,6 MM magnéziumkloridí 1 mM ATP, 10 mM ditio-treitol, 3 mM Hind III dekanukleotid (10⁵ cpm/pmól) és 500 E/ml T4 DNS-ligáz. Az inkubációt egy órán át végezzük. Ezután a ligáz enzim inaktiválására 5 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet. Végkoncentrációra számolva a következő vegyületeket adjuk az elegyhez: 50 mM káliumklorid, 1 mM β-merkaptoetanol és 0,1 mM EDTA. Ezután 2 órán át 37 C° hőmérsékleten 150 E/ml Hsu I vagy Hind III endonukleázzal emésztjük a terméket. A Hind III vagy a Hae III endonukleáz beszerezhető az Egyesült Államokban: New England Bio-Labs, Beverly, Massachusetts.Subsequently, good yields are obtained of the cDNA molecules having base pairs which are required for their coupling to the chemically synthesized decanucleotide. Hind III decanucleotides are prepared according to the method of Scheller, Dickerson, Boyer, Riggs, and Itakura (Science, 196, 177, 1977). Coupling of Hind III decanucleotides to cDNA was performed by incubation at 14 ° C in the following reaction mixture: 66 mM Tris-Hydrochloride, pH 7.6, 6.6MM Magnesium Chloride 1mM ATP, 10mM Dithiothreitol, 3mM Hind III decanucleotide (10 ⁵ cpm / pmol) and 500 U / ml T4 DNA ligase. Incubation is carried out for one hour. The reaction mixture was then heated at 65 ° C for 5 minutes to inactivate the ligase enzyme. Based on the final concentration, the following compounds were added: 50 mM potassium chloride, 1 mM β-mercaptoethanol and 0.1 mM EDTA. The product is then digested with 150 U / ml Hsu I or Hind III endonuclease for 2 hours at 37 ° C. Hind III or Hae III endonucleases are available from New England Bio-Labs, Beverly, Massachusetts.

Az előállított terméket az 1. példában megadott módon gélelektroforézissel analizáljuk. 450 nukleotídból álló termék jelenlétére utaló sávot figyelhetünk meg, a hasított Hind III dekanukleotidok fragmensein kívülThe product obtained was analyzed by gel electrophoresis as in Example 1. A band indicating the presence of a product of 450 nucleotides can be observed in addition to fragments of the cleaved Hind III decanucleotides

4. példaExample 4

Ismertetjük a rekombináns plazmid létrejöttét és a replikációt követően jellemezzük.The formation of the recombinant plasmid is described and characterized following replication.

A Rodrigues, Bolivár, Goodman, Boyer és Betlach által megadott módon (ICN-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, Kiadd: Wierlich, Rutter és Fox, Academic Press, New York, 1976, 471—477. oldal) előállított pMB—9 DNS-plazmidot a Hind III restrikciós szakaszon Hsu I endonukleázzal hasítjuk, majd alkálikus foszfatázzal kezeljük (BAPF típus, Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey, Egyesült Államok). Az enzim koncpentrációja a reakcióelegyben 0,1 E/pg. DNS, a reakcióelegyet é,0 pH-jú 25 mM-os trisz-hidrogénklorid pufferben inkubáljuk 30 percen át 65 C° hőmérsékleten, majd a foszfatáz eltávolítására fenollal extraháljuk. Etanollal kicsapjuk a reakcióelegyből a foszfatázzal kezelt plazmid DNS-t, majd Hind III kohézív végeket tartalmazó cDNS-hez adjuk 3 mól plazmid.l inól cDNS arányban. 7,6 pH-jú 66 mM-os trisz-hidrogénklorid pufferben inkubáljuk a DNS-t: a reakcióelegy 6,6 mM magnéziumkloridot 10 mM ditio-treitolt és 1 mM ATP-t artalmaz, az inkubációt egy órán át 14 C° hőmérsékleten végezzük. 50 E/ml 14 DNS-li*áz jelenlétében.PMB-9 prepared as described by Rodrigues, Bolivar, Goodman, Boyer, and Betlach (ICN-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, Wierlich, Rutter and Fox, Academic Press, New York, 1976, pp. 471-477). The plasmid DNA was cleaved with Hsu I endonuclease at the Hind III restriction site and treated with alkaline phosphatase (BAPF type, Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey, USA). The enzyme concentration in the reaction mixture is 0.1 U / pg. The DNA and reaction mixture were incubated in 25 mM Tris-HCl buffer at pH 0 for 30 minutes at 65 ° C and then extracted with phenol to remove phosphatase. Phosphatase-treated plasmid DNA is precipitated from the reaction mixture with ethanol and added to cDNA containing Hind III cohesive ends in a ratio of 3 moles of plasmid to 1 cDNA. The DNA was incubated in 66 mM Tris-Hydrochloride pH 7.6: 6.6 mM magnesium chloride, 10 mM dithiothreitol and 1 mM ATP were incubated for one hour at 14 ° C. . 50 U / ml in the presence of 14 DNA lyases.

A reakcióelegyet az inkubáció befejezése jtán az alábbiakban megadott módon előkészített E. coli X—1776 sejtekhez adjuk. 50 ml, az alábbiakban megadott összetételű táptalajon 2X10⁸ sejt/ml sejtkoncentrációig növesztjük a tenyészetet: tripton 10 g/1; élesztőkivonat 5 g/1: nátrium-klorid 10 g/1; nátriumhidroxid 2 mM; diamino-pimelinsav 100 pg/ml és timin 40 pg/ml. A tenyésztést 37 C° hőmérsékleten végezzük.Upon completion of the incubation, the reaction mixture is added to E. coli X-1776 cells prepared as follows. Grow the culture to a concentration of 2 x 10 ⁸ cells / ml in 50 ml of the following medium: Tryptone 10 g / L; yeast extract 5 g / l: sodium chloride 10 g / l; sodium hydroxide 2 mM; diaminopimellic acid 100 pg / ml and thymine 40 pg / ml. The culture was carried out at 37 ° C.

A tenyésztés befejezése után 5 C° hőmérsékleten 5000 g nehézségi gyorsulás mellett 5 percen át centrifugáljuk a sejtszuszpenziót, az üledéket 20 ml 10 mM-os hideg nátriumklorid oldatban szuszpendáljuk. Megismételjük a centrifugálást, majd a következő öszszetételű 20 ml térfogatú transzformációs pufferben szuszpendáljuk a sejteket: 75 mM kalciumklorid, 140 mM nátriumklorid és 10 mM trisz-hidrogénklorid, pH 7,5. 5 percen át jégfürdőben tartjuk a sejtszuszpenziót. Ezután újra centrifugáljuk a sejteket, majd 0,5 ml a fenti összetételű transzformációs pufferben szuszpendáljuk. A transzformációra 100 μόΐ ilyen sejtszuszpenziót 50 μΐ rekombináns DNS-val keverünk (1 pg/ml). 15 perces át 0 C° hőmérsékleten inkubáljuk a keveréket, 13After culturing, the cell suspension is centrifuged at 5 ° C for 5 minutes at 5,000 g gravity acceleration, and the pellet is suspended in 20 ml of 10 mM cold sodium chloride solution. The centrifugation is repeated and the cells are resuspended in 20 ml of transformation buffer: 75 mM calcium chloride, 140 mM sodium chloride, and 10 mM tris-hydrogen chloride, pH 7.5. The cell suspension is kept in an ice bath for 5 minutes. The cells are then centrifuged again and resuspended in 0.5 ml of transformation buffer of the above composition. For transformation, 100 μόΐ of such cell suspension was mixed with 50 μΐ of recombinant DNA (1 pg / ml). Incubate for 15 minutes at 0 ° C

-13193866 majd 4 percen át 25 C°-on, végül 30 percen át 0 C° hőmérsékleten folytatjuk az inkubációt. Ezután a megfelelő szelekciós körülmények között agar-lemezekre széletsztjük a sejteket.-13193866 and incubation was continued for 4 minutes at 25 ° C and finally for 30 minutes at 0 ° C. The cells are then seeded on agar plates under appropriate selection conditions.

A rekombináns plazmidok kutatására, azaz a Hind III szakasz transzformációjának kimutatására 5 pg/ml tetraciklint használunk. Ily módon egy pAU_l jelű rekombinánst izolálunk. A pAU—1 rekombinánsból izolált 2 pg—5 pg DNS plazmid-készítmények emésztünk Hsu 1 endonukleáz fölöslegével. Ezután végkoncentrációra számolva 10 mM EDTA—Na₂—t és 10% (súlyszázalék) szacharózt adunk a reakcióelegyhez, majd 8% poliakrilamid gélen szétválasztjuk az elegyet. Az elektroforézises vizsgálat szerint a DNS a 410 bázispárnak megfelelő helyen található.5 µg / ml tetracycline is used for the study of recombinant plasmids, i.e. for the detection of Hind III region transformation. In this way, a recombinant pAU_1 is isolated. Two pg-5 pg DNA plasmid preparations isolated from the pAU-1 recombinant were digested with excess Hsu 1 endonuclease. Thereafter, 10 mM EDTA-Na ₂ and 10% w / w sucrose were added to the final concentration and the mixture was separated on an 8% polyacrylamide gel. Electrophoretic analysis showed that the DNA was located at 410 base pairs.

A fenti kísérletet pBR—322 plazmiddal megismételjük. Minden a fentiekben megadottak szerint végzünk, kivéve a rekombináns telepek szelekcióját, amit 20 pg/ml ampicillint tartalmazó lemezeken végzünk.The above experiment was repeated with pBR-322. All were performed as above except selection of recombinant colonies was performed on plates containing 20 pg / ml ampicillin.

5. példaExample 5

Ismertetjük a patkány növekedési hormonjának megfelelő teljes struktúrális gén-sorrendet tartalmazó DNS izolálását és tisztítását, továbbá a patkány növekedési hormonjának teljes struktúrális génkészletét tartalmazó DNS szinézisét és a patkány növekedési hormonjának génjét génkészletének részeként tartalmazó mikroorganizmus törzs előállítását.Disclosed is the isolation and purification of DNA comprising the complete structural gene sequence of rat growth hormone, the synthesis of DNA containing the complete structural gene set of rat growth hormone, and the preparation of a microorganism strain containing a rat growth hormone gene as part of its gene set.

Abban az esetben, ha az izolált gének nem emberi eredetűek, úgy az Egyesült Államokban érvényes biztonsági korlátozások nem kívánják meg a cDNS olyan nagyfokú tisztaságban való izolálását, mint amikor emberi eredetű cDNS-ekkel dolgozunk. Ily módon lehetséges az, hogy a patkány növekedési hormonjának strukturális génjét tartalmazó cDNS-t elektroforetikus úton különítjük el: az elkülönített DNS a patkány növekedési hormonjának ismert aminosav-szekvenciája szerint körülbelül 800 bázispárt tartalmaz.In the case where the isolated genes are of non-human origin, the safety restrictions in the United States do not require isolation of the cDNA in the same purity as when working with human-derived cDNAs. Thus, it is possible that the cDNA containing the structural gene for rat growth hormone is electrophoretically isolated: the isolated DNA contains about 800 base pairs according to the known amino acid sequence of rat growth hormone.

A patkány növekedési hormonját leíró mRNS forrásaként az American Type Culture Collection-ból beszerezhető GH—1 szubklónozott és tenyésztett patkány sejteket használjuk (Tashjian és munkatársai, Endochrinology, 82, 342, 1968). Ezekben a sejtekben közönséges körülmények között kivitelezett tenyésztéskor a növekedési hormont leíró mRNS az összes poli-A-t tartalmazó RNS-nek kicsinyrésze, 1—3 %-a. A növekedési hormonnak megfelelő mRNS mennyiségét azonban tiroid hormonok és glukokortikoidok szinergista hatásával oly módon növeltük, hogy az meghaladta a többi sejtben lévő mRNS mennyiségét. Az RNS izolálására szuszpenziós tenyészetben 5/E10⁸ sejtet növesztettünk, majd 4 nappal a sejtek összegyűjtése előtt ¹⁴ többek között 1 mM dexametason és 10 mM L-trijód-tironin adagolásával indukáltuk a növekedési hormon termelésére. A poliadenilezett RNS-t a tenyésztett sejtek citoplazmatikus membrán-frakciójából izoláltuk az irodalomban megadottak szerint eljárva (Martial, Baxter, Goodman és Seeburg, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 1816, 1977: és Bancroft, Wu és Zubay, Proc. Natl. Acad, Sci., USA, 70, 3646, 1973). Ezután az előzőekben az 1—3. példában megadottak szerint eljárva tovább tisztítjuk az mRNS-t és kétszálú cDNS-t készítünk belőle. Gélelektroforézises frakcionálással egy gyenge, de jól elkülöníthető sávot kapunk a 800 bázispárnak megfelelő DNS-nek jelölt helyen.GH-1 subcloned and cultured rat cells from the American Type Culture Collection (Tashjian et al., Endochrinology, 82, 342, 1968) were used as sources of mRNA for rat growth hormone. When cultured in these cells under normal conditions, the growth hormone mRNA is a small portion, 1-3%, of the total polyA-containing RNA. However, the amount of mRNA corresponding to growth hormone was increased by the synergistic action of thyroid hormones and glucocorticoids so that it exceeded that of other cells. The isolation of RNA were grown in suspension culture in a ^5/8 cell E10, and 4 days before collecting the cells was induced with ¹⁴ including dexamethasone and 10 mM L-triiodothyronine adding 1 mM for the production of growth hormone. Polyadenylated RNA was isolated from the cytoplasmic membrane fraction of cultured cells according to literature procedures (Martial, Baxter, Goodman and Seeburg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 1816, 1977) and Bancroft, Wu and Zubay. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 3646, 1973). Then, the above steps 1-3. mRNA was further purified and double-stranded cDNA was prepared. Gel electrophoresis fractionation yields a weak, but distinct, band at the location labeled with 800 base pairs of DNA.

A teljes mRNS-ből kapott cDNS-t Hha 1 endonukleázzal kezeljük, amikor az elektroforézises elkülönítés után két DNS-nek mégfelelő fragmenset kapunk, amely közelítőleg 320 nukleotidnak (A fragmens) és 240 nukleotidnak (B fragmens) felel meg. Meghatározzuk az A és B fragmensek nukleotid-sorrendjét, és a vizsgálatok szerint ezek valóban a patkány növekedési hormonjának megfelelő kódokat tartalmazzák, azaz megfelelnek az irodalomban megadott patkány növekedési hormon aminosav-szekvenciára vonatkozó adatoknak és a más ismert növekedési hormon szekvenciáknak (Wallis és Davies, Growth Hormoné and Related Peptides; szerkesztő: Copecile és Müller, Elsevier, New York, 1976, 1 —14. oldal: továbbá Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, (2) 120—121. oldal. National Biomedical Research Foundation, Washington, 1976). Abban az esetben, ha a 800 bázispárból álló kétszálú cDNS-t a megadott módon elektroforézissel izoláljuk, majd szintén a megadott módon Hha I endonukleázzal kezeljük, egy a nagyobb hasítási termékek között az A és B fragmenseknek tnegfelelő hosszúságú két fragmenst találunk.The cDNA obtained from the complete mRNA was treated with Hha1 endonuclease to give, after electrophoresis separation, two DNA-equivalent fragments, corresponding to approximately 320 nucleotides (fragment A) and 240 nucleotides (fragment B). The nucleotide sequences of fragments A and B are determined and have been found to contain codes corresponding to rat growth hormone, i.e., to the literature data on the rat growth hormone amino acid sequence and other known growth hormone sequences (Wallis and Davies, Growth Hormones and Related Peptides, edited by Copecile and Müller, Elsevier, New York, 1976, pp. 1-14, and also Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, (2) pages 120-121, National Biomedical Research Foundation, Washington, 1976). In the event that the 800 bp double-stranded cDNA is isolated by electrophoresis as described and then treated with Hha I endonuclease as described above, one of the larger cleavage products has two fragments of similar length to A and B.

Mivel a körülbelül 800 bázispárból álló és a patkány növekedési hormonját leíró cDNS-t a restrikciós endonukleázzal nem tisztítottuk, kezelnünk kell a DNS-t a bázispárok nélküli egyszálú végek eltávolítására. Gyakorlatilag úgy járunk el, hogy a pár nélküli szálakat az elektroforetikus elkülönítés előtt távolítjuk el 25 μΐ 60 mM-os pH 7,5 trisz-hidrogénkloridot, 8 mM magnézíumkloridot, 10 mM β-merkaptoetanolt, 1 mM ATP-t és egyenként 200 μΜ dATP-t, dTTP-t, dGTP-t és dCTP-t tartalmazó reakcióelegyben. A reakcióelegyhez 1 E E. coli DNS-polimeráz I-et adunk, majd 10 percen át 10 C° hőmérsékleten exonukleolitikusan eltávolítunk minden 3’-véget és szintetizáljuk az 5’-pár nélküli végek megfelelő párját. A DNS-polimeráz I beszerezhető a következő helyen: Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianpolis, Indiana, Egyesült Államok.Since the cDNA of about 800 base pairs describing rat growth hormone was not purified by restriction endonuclease, it is necessary to treat the DNA to remove single-stranded ends without base pairs. In practice, the unpaired fibers are removed before electrophoretic separation with 25 μΐ 60 mM pH 7.5 Tris-hydrogen chloride, 8 mM magnesium chloride, 10 mM β-mercaptoethanol, 1 mM ATP and 200 μΜ dATP each dTTP, dGTP and dCTP. To the reaction mixture was added 1 U of E. coli DNA polymerase I, and all 3'-ends were exonucleolytically removed for 10 minutes at 10 ° C and the corresponding pair of 5'-unpaired ends was synthesized. DNA Polymerase I is available from Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianpolis, Indiana, United States.

a A körülbelül 800 bázispárból álló cDNS-t amely a patkány növekedési hormonjánaka cDNA of about 800 bp which is the growth hormone of the rat

-14193866 génjét tartalmazza,jezután a 3. példában megadottak szerint eljárva kémiailag szintetizált Hind III dekanukleotiddal reagáltatjuk. Ampicillin rezisztenciát okozó gént és a tetraciklin-rezisztencia génben egy Hind III támadóhelyet tartalmazó pBR—322 plazmidot a 4. példában megadottakat megismételve Hind III endonukleázal és alkálikus foszfatázzal kezeljük. Ezután a 3. példában megadottak szerint reagáltatjuk a DNS-ligáz 10 jelenlétében a kezelt.plazmidot és a 800 bázispárból álló, a patkány növekedési hormonját kódoló cDNS-t. Magában ebben a reakcióelegyben jutattjuk be a DNS-t a szuszpenzióként adagolt E. coli X—1776 sejtekbe, 15 amiket a 3. példában megadottak szerint előkezeltünk. A rekombináns telepeket úgy szelektáljuk, hogy azokat a sejteket különítjük el, amelyek ampicillint tartalmazó tápközegeken nőni tudnak, 20 Mg/ml tetraciklin jelen- 20 létében viszont nem képesek nőni. 10 ilyen telepet kapunk, mindegyikük hordozza a 800 bázispárt tartalmazó plazmidot, amit a Hind III enzimmel kivitelezett hasítással teszünk szabaddá.-14193866, followed by reaction with chemically synthesized Hind III decanucleotide as in Example 3. The plasmid pBR-322, which contains the Ampicillin resistance gene and a Hind III site in the tetracycline resistance gene, was repeated with Example III endonuclease and alkaline phosphatase. Then, in the presence of DNA ligase 10, the treated plasmid and the 800 bp cDNA encoding rat growth hormone were reacted. In this reaction mixture itself, DNA was introduced into E. coli X-1776 cells as a suspension, pretreated as in Example 3. Recombinant colonies are selected by isolating cells that can grow on media containing ampicillin but cannot grow in the presence of 20 mg / ml tetracycline. Ten such colonies are obtained, each carrying a 800 bp plasmid which is released by digestion with Hind III.

A patkány növekedési hormonját leíró 800 bázispárt tartalmazó DNS-t preperatív menynyiségben a rekombináns pRGH—1 telepek28 bői izoláljuk, és meghatározzuk nukleotid-sörrendjét. Ebben az esetben meghatároztuk az 5’-vég át nem másolt nukleotid-sorrendjét, továbbá a növekedési hormon szekréció előtt 5 prekurzor fehérjében lévő 26 aminosav sorrendjét is. A 3. táblázatban adjuk meg a meghatározott gén-szekvenciából konstruált mRNS bázis-sorrendjét. A jósolt aunihosav-sorrend az 1. és 8. hely kivételével jól egyezik a patkány növekedési hormonjának részleges aminosav-sorrendjével, amit Wallis és Davies ad meg (Growth Hormoné and Related Peptides, szerkesztő: Copecile és Müller: Else\ier, New York, 1976, 1 —14. oldal) és amely í z 1—43,65—69, 108—113, 133—143 és 150— 190 (lásd a 3. táblázat) csoportokat tartalmazza).DNA containing 800 base pairs of rat growth hormone was isolated in preperative amount from recombinant pRGH-1 colonies28 and its nucleotide beer order was determined. In this case, the nucleotide sequence of the 5 'untranslated nucleotide sequence as well as the 26 amino acid residues in 5 precursor proteins before growth hormone secretion were determined. Table 3 shows the base sequence of the mRNA constructed from the defined gene sequence. The predicted aunic acid sequence, with the exception of positions 1 and 8, closely matches the partial amino acid sequence of rat growth hormone given by Wallis and Davies (Growth Hormones and Related Peptides, edited by Copecile and Muller, Else \ ier, New York, 1976, pp. 1-14, and containing the groups 1-43,65-69, 108-113, 133-143 and 150-190 (see Table 3)).

3. táblázatTable 3

A patkány növekedési hormonját leíró DNS egy szálának teljes nukleotid-sorrendje. A megfelelő aminosavakat is megadjuk, az amino-terminális végtől kezdődő számozással. A negatív előjellel számozott aminosavak 25 a növekedési hormon előfehérjejének aminosav-sorrendjét jelzik. A megfelelő mRNS bázis-szekvenciája hasonló, azzal a különbséggel, hogy az mRNS-ban U helyett T áll.The complete nucleotide sequence of a strand of DNA that describes rat growth hormone. The corresponding amino acids are also given, with numbering starting from the amino-terminal end. Negative numbered amino acids indicate the amino acid sequence of the growth hormone precursor protein. The corresponding mRNA has a similar base sequence except that U is replaced by T in the mRNA.

Met Ala Ala Asp Ser Gla ATG GCT GCA GAC TCT CAGMet Ala Ala Asp Ser Gla ATG GCT GCA GAC TCT CAG

5' ---GTGGACAGATCACTGAGTGGCG5 '--- GTGGACAGATCACTGAGTGGCG

Thr Thr Pro Pro Trp Trp Leu Leu Leu Leu Thr Thr Phe Phe Ser Ser Leu Leu Leu Leu Gys Gys Leu Leu Leu Leu Trp Trp Pro Pro ACT ACT CCC CCC TGG TGG CTC CTC CTG CTG ACC 1 Leu ACC 1 Leu TTC TTC AGC AGC CTG CTG CTC CTC TGC TGC CTG CTG CTG CTG TGG TGG CCT CCT Gla Gla Glu Glu Ala Ala Gly Gly Ala Ala Pro Pro Ala Ala Met Met Pro Pro Leu Leu Ser Ser Ser Ser Leu Leu Phe Phe CAA CAA GAG GAG GCT GCT GGT GGT GCT GCT TTA TTA CCT CCT GCC GCC ATG ATG CCC CCC TTG TTG TCC TCC AGT AGT CUG CUG TTT TTT Ala Ala Asn Asn Ala Ala Val With Leu Leu Arg Arg Ala Ala Gin Gin Hi s Hi s Leu Leu His His Gin Gin Leu Leu Ala Ala Ala Ala GCC GCC AAT AAT GCT GCT GTG GTG CTC CTC CGA CGA GCC GCC CAG CAG CAC CAC CTG CTG CAC CAC CAG CAG CTG CTG GCT GCT GCT 40 Gin GCT 40 Gin Asp asp Thr Thr Tyr Tyr Lys Lys Glu Glu Phe Phe Glu Glu Arg Arg Al a Al a Tyr Tyr Ile Ile Pro Pro Glu Glu Gly Gly GAC GAC ACC ACC TAG BROAD AAA AAA GAG GAG TTC TTC GAG GAG CGT CGT GCC GCC TAC TAC ATT ATT CCC CCC GAG GAG GGA GGA CAG CAG Arg Arg Tyr Tyr Ser Ser Ile Ile Gin Gin Asn Asn Ala Ala Gin Gin Al a Al a Ala Ala Phe Phe Cys Cys Phe Phe Ser Ser Glu Glu CGC CGC TAT TAT TCC TCC ATT ATT CAG 60 Pro CAG 60 Pro AAT AAT CCC CCC CAG CAG GCT GCT CCT CCT TTC TTC TGC TGC TTC TTC TCA TCA GAG GAG Thr Thr Ile Ile Pro Pro Ala Ala Thr Thr Gly Gly Lys Lys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Gin Gin Gin Gin Arg Arg Thr Thr ACC ACC ATC ATC CCA CCA GCC GCC CCC CCC ACC ACC GGC GGC AAG AAG GAG GAG GAG 80 Leu GAG 80 Leu CCC CCC CAG CAG GAG GAG AGA AGA ACT ACT Asp asp Met Met Glu Glu Leu Leu Leu Leu Arg Arg Phe Phe Ser Ser Leu Leu Leu Leu Ile Ile Gin Gin Ser Ser Trp Trp GAC GAC ATC ATC GAA GAA TTG TTG CTT CTT CGC CGC TTC TTC TGG TGG CTG CTG CTG CTG CTC CTC ATC ATC CAG CAG TCA TCA TGG 100 TGG 100 Leu Leu Gly Gly Pro Pro Val With Gin Gin Phe Phe Leu Leu Ser Ser Arg Arg Ile Ile Phe Phe Thr Thr Asn Asn Ser Ser Leu Leu CTG CTG GGG GGG CCC CCC GTG GTG CAG CAG TTT TTT CTC CTC AGC AGC AGG AGG ATC ATC TTT TTT ACC ACC AAC AAC AGC AGC CTG CTG Met Met Phe Phe Gly Gly Thr Thr Ser Ser Asp asp Arg Arg Val With Tyr Tyr Glu Glu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Asp asp Leu Leu ATG ATG TTT TTT GGT GGT ACC ACC TCG 120 TCG 120 GAC GAC CGC CGC GTC GTC TAT TAT GAG GAG AAA AAA CTG CTG AAG AAG GAC GAC CTG CTG Glu Glu Glu Glu Gly Gly Ile Ile Gin Gin Ala Ala Leu Leu Met Met Gin Gin Glu Glu Leu Leu Glu Glu Asp asp Gly Gly Ser Ser GAA GAA GAG GAG GGC GGC ATC ATC CAG CAG GCT GCT TCG TCG ATG ATG CAG CAG GAG GAG CTG CTG GAA GAA GAC GAC GGC GGC AGC AGC

-15193866-15193866

3. táblázat (folytatás)Table 3 (continued)

140140

Pro Pro Arg Arg Ile Ile Gly Gly Gin Gin Ile Ile Leu Leu Lys Lys Gin Gin Thr Thr Tyr Tyr Asp asp Lys Lys Phe Phe Asp asp CCC CCC CGT CGT ATT ATT GGG GGG CAG CAG ATC ATC CTC CTC AAG AAG CAA CAA ACC ACC TAT TAT GAC GAC AAG AAG TTP TTP GAC 160 GAC 160 Alá below Asn Asn Met Met Arg Arg Ser Ser Asp asp Asp asp Al a Al a Leu Leu Leu Leu Lys Lys Asn Asn Tyr Tyr Gly Gly Leu Leu GCC GCC AAC AAC ATG ATG CGG CGG AGC AGC GAT DAM GAC GAC GCT GCT CTG CTG CTC CTC AAA AAA AAC AAC TAT TAT GGG GGG CTG CTG Leu Leu Ser Ser Cys Cys Phe Phe Lys Lys Lys Lys Asp asp Leu Leu His His Lys Lys Alá below Glu Glu Thr Thr Tyr Tyr Leu Leu CTC CTC TCC TCC TGC TGC TTC TTC AAG 180 AAG 180 AAG AAG GAC GAC CTG CTG CAC CAC AAG AAG GCA GCA GAG GAG ACC ACC TAC TAC CTG CTG Arg Arg Val With Met Met Lys Lys Gys Gys Arg Arg Arg Arg Phe Phe Alá below Glu Glu Ser Ser Ser Ser Cys Cys Alá below Phe Phe CGG CGG GTC GTC ATG ATG AAG AAG TGT TGT CGC CGC CGC CGC T”T T "T GCG GCG GAA GAA AGC AGC AGC AGC TGT TGT GCT GCT TTC TTC

TAG GCACACACTGGTGTCTCGCGGCACTGCCCCGTTACCCCCCTGTACTCTGGCAAC TGCCACCCCCTACACTTTGTCCTAATAAAYTTAATGATGCATATC poli (A)---3'TAG GCACACACTGGTGTCTCGCGGCACTGCCCCGTTACCCCCCTGTACTCTGGCAAC TGCCACCCCCTACACTTTGTCCTAATAAAYTTAATGATGCATATC poly (A) --- 3 '

6. példaExample 6

Ismeretjük az emberi növekedési hormon aminosavait meghatározó teljes génkészlet izolálását és tisztítását, továbbá az emberi növekedési hormon teljes struktúrális génkészletét tartalmazó rekombináns piazmid szintézisét és az emberi növekedési hormon teljes struktúrális génjét genetikai készletében tartalmazó mikroorganizmus előállítását.It is known to isolate and purify a complete set of human growth hormone amino acids, to synthesize a recombinant plasmid containing a complete structural set of human growth hormone, and to prepare a microorganism containing a complete structural gene for human growth hormone.

Az emberi növekedési hormon mRNS-ének izolálását lényegében az 5. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a biológiai kiindulási anyag az ember hipofízis tumorszövete, öt jóindulatú emberi hipofízis tumort sebészeti eltávolítást követően folyékony nitrogénben gyorsan megfagyasztunk, majd a 0,4 g és 1,5 g közötti súlyú készítményt apró darabkákra vágjuk és 4 mólos, 1 mól merkaptoetanolt tartalmazó és 5,0 pH-jú guanidium-tiocianátban 4 C° hőmérsékleten homogenizáljuk. A homogenizátumot 1,2 ml 5,7 mólos, 100 mM EDTA-t tartalmazó céziumkorid fölé rétegezzük, majd 18 órán át percenként 37 OOO-et forduló SW 50,1 rotorban Beckman ultracentrifugában 15 C° hőmérsékleten centrifugáljuk. Az RNS a centrifugacső alsó részébe vándolol. További tisztításhoz oligo-dT oszlopot és szacharóz grádiens ülepítést használunk az 1., 2. és 3. példában megadottak szerint eljárva. Az így izolált RNS körülbelül 10%-a a növekedési hormont kólodja, amit a radioaktív aminosav prekurzornak búzamagból származó sejtementes transzlációs rendszerével végzett kísérlet során az antinövekedési hormon csapadékba való beépülésével bizonyítunk (Roberts és Patterson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 70, 2330, 1973). Az emberi növekedési hormon cDNS-ének előállítását lényegében az 5. példában megadottak szerint végezzük.Isolation of human growth hormone mRNA was performed essentially as described in Example 5, except that the biological starting material was human pituitary tumor tissue, five benign human pituitary tumors were rapidly frozen in liquid nitrogen after surgical removal and 0.4 g The composition weighing between about 1.5 g and 1.5 g is cut into small pieces and homogenized in 4 M guanidium thiocyanate, 1 M mercaptoethanol, pH 5.0 at 4 ° C. The homogenate was layered over 1.2 ml of 5.7 M cesium chloride in 100 mM EDTA and centrifuged at 37 ° C in a SW 50.1 rotor for 18 hours at 15 ° C in a Beckman ultracentrifuge. RNA migrates to the lower part of the centrifuge tube. For further purification, an oligo-dT column and sucrose gradient settling were performed as described in Examples 1, 2 and 3. Approximately 10% of the RNA isolated in this way is encoded by growth hormone, as demonstrated by the incorporation of the antisense hormone into the precipitate by experiment with a cell-free translation system of the radioactive amino acid precursor (Roberts and Patterson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70). , 2330, 1973). The human growth hormone cDNA was prepared essentially as described in Example 5.

Az emberi növekedési hormon cDNS-ét gé^2b lelektroforézissel frakcionáljuk, majd klonozáshoz elkülönítjük a körülbelül 800 nukleotidnak megfelelő helyre vándorló anyagot. Az elkülönített frakciót az 5. példában megadottak szerint eljárva DNS-polimerázThe human growth hormone cDNA is fractionated by gel ^2b electrophoresis and the material migrating to about 800 nucleotides for cloning is isolated. The isolated fraction was performed as described in Example 5 by DNA polymerase

I enzimmel kezeljük, majd végéhez hozzákapcsoljuk a Hind III dekanukleotidot. Ezután a cDNS-t alkálikus foszfatázzal kezelt pBR—322 plazmiddal rekombináljuk DNS-ligázt használva. Az így előállított nuklein35 savat E. coli X—1776 törzsbe transzformáljuk, majd olyan telepeket izolálunk, amelyek tartalmazzák az emberi növekedési hormon DNS-t. Preparatív mennyiségben tenyészttük az emberi növekedési hormonjának ⁴⁰ DNS-ét tartalmazó törzset, majd az emberi növekedési hormon DNS-ét izoláljuk, és meghatározzuk nukleotid-sorrendjét.The enzyme I is treated with the Hind III decanucleotide attached to its end. The cDNA is then recombined with alkaline phosphatase-treated plasmid pBR-322 using DNA ligase. The nucleic acid thus produced is transformed into E. coli strain X-1776 and colonies containing human growth hormone DNA are isolated. Prepare cultures of ⁴⁰ strains of human growth hormone DNA and isolate human growth hormone DNA and determine the nucleotide sequence.

Ügy találtuk, hogy a klonozott emberi növekedési hormon DNS az emberi növeke45 dési hormon teljes aminosav-sorrendjét kódoló nukleotidokat tartalmazza. Az emberi növekedési hormon első 23 aminosav-sorrendje a következő: H_aN—Phe-Pro-Thr-Ile10It has been found that cloned human growth hormone DNA contains nucleotides encoding the entire amino acid sequence of human growth hormone. The first 23 amino acid sequences of human growth hormone are: H _a N-Phe-Pro-Thr-Ile10

-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met20-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met20

-Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leu-His-Gln-Leu.Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leu-His-Gln-Leu.

A további aminosav-sorrendet a 4. táblázatban mutatjuk be.The additional amino acid sequence is shown in Table 4.

4. táblázatTable 4

Az emberi növekedési hormon DNS egy szálának nukleotid-sorrendje. A szekvenciá0Q bán megadott számok az amino-terminális aminosavtól számítva az emberi növekedési hormon megfelelő aminosavjainak számát adja meg. A DNS megadott bázis-sorrendje megfelelő az mRNS bázis-sorrendjének, azzal a különbséggel, hogy az mRNS-ben ⁶⁵ T helyett U áll.Nucleotide sequence of a strand of human growth hormone DNA. The numbers in the sequence represent the number of corresponding amino acids of human growth hormone from the amino-terminal amino acid. The given base sequence of DNA corresponds to the base sequence of mRNA, except that U is present at ⁶⁵ T in the mRNA.

-16193866-16193866

34 , Ala Phe Asp Thr Tyr Gin Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys34, Ala Phe Asp Thr Tyr Gin Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys

5'----g GCC TTT CAC ACC TAC GAG GAG TTT GAA GAA CCC TAT ATC CCA AAG5 '---- g GCC TTT CAC ACC TAC GAG GAG TTT GAA GAA CCC TAT ATC CCA AAG

4343

Glu Gin Lys Tyr Ser Phe Leu Gin Asa Pro Gin Thr Ser Leu CysGlu Gin Lys Tyr Ser Phe Leu Gin Asa Pro Gin Thr Ser Leu Cys

GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGTGAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT

Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr GinPhe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gin

TTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAATTC TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA

Gin Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu IleGin Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile

CAG AAA TCC AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATCCAG AAA TCC AAC CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC

Gin Ser Trp Leu Glu Pro Val Gin Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala CAG TCG TGG CTG CAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT CTC TTC GCCGin Ser Trp Leu Glu Pro Val Gin Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala CAG TCG TGG CTG CAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT CTC TTC GCC

Asn Asn 100 Ser 100 Ser Leu Leu Val With Tyr Tyr Gly Gly Ala Ala Ser Ser Asp asp Ser Ser Asn Asn Val With Tyr Tyr Asp asp Leu Leu AAC AAC AGC AGC CTG CTG GTG GTG TAC TAC GGC GGC GCC GCC TCT TCT GAC GAC AGC AGC AAC AAC GTC GTC TAT TAT GAC GAC CTC CTC Leu Leu Lys Lys Asp asp Leu Leu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Ile Ile Gin Gin Thr Thr Leu Leu Met Met Gly Gly Arg Arg Leu Leu CTA CTA AAG AAG GAC GAC CTA CTA GAG GAG GAA GAA GGC GGC ATC ATC CAA CAA ACG ACG CTG CTG ATG ATG GGG GGG AGG AGG CTG CTG Glu Glu Asp asp Gly Gly Ser Ser Pro Pro Arg Arg Thr Thr Gly Gly Gin Gin Ile Ile Phe Phe 140 Lys 140 Lys Gin Gin Thr Thr Tyr Tyr GAA GAA GAC GAC GGC GGC AGC AGC CCC CCC CGG CGG ACT ACT GGG GGG CAG CAG ATC ATC TTC TTC AAG AAG CAG CAG ACC ACC TAC TAC Ser Ser Lys Lys Phe Phe Asp asp Thr Thr Asn Asn Ser Ser His His Asn Asn Asp asp Asp asp Ala Ala Leu Leu Leu Leu Lys Lys AGC AGC AAG AAG TTC TTC GAC GAC ACA ACA AAC AAC TCA TCA CAC CAC AAC AAC GAT DAM GAC GAC GCA GCA CTA CTA CTC CTC AAG AAG Asn Asn 160 Tyr 160 Tyr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Tyr Tyr Cys Cys Phe Phe Arg Arg Lys Lys Asp asp Met Met Asp asp Lys Lys Val With AAC AAC TAC TAC CGG CGG CTG CTG CTC CTC TAC TAC TGC TGC TTC TTC AGG AGG AAG AAG GAC GAC ATG ATG GAC GAC AAG AAG GTC GTC Glu Glu Thr Thr Phe Phe Leu Leu Arg Arg Ile Ile 180 Val 180 With Gin Gin Cys Cys Arg Arg Ser Ser Val With Glu Glu Gly Gly Ser Ser GAG GAG ACA ACA TTC 191 Phe TTC TTC 191 Phe TTC CTG CTG CGG CGG ATC ATC GTG GTG CAG CAG TGC TGC CGC CGC TCT TCT GTG GTG GAG GAG GGC GGC AGC AGC Cys TGT Cys TGT Gly GGC Gly GGC TAG BROAD CTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTC CTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTC CTGGCC - CTGGCC - ____ ____ 3' 3 '

A találmány szerinti eljárással először vált 45 lehetségessé egy magasabbrendű szervezetből, például gerincesből származó specifikus reguláió fehérjét kódoló adott nukleotid-sorrendű nukleinsav izolálása, az ebben lévő genetikai információ átvitele egy mikroorga- 50 nizmusba, ahol az függetlenül replikálódik.The method of the present invention first made it possible to isolate a particular nucleotide sequence encoding a specific regulatory protein from a higher organism, such as a vertebrate, to transfer the genetic information contained therein to a microorganism, where it is replicated independently.

A találmány szerinti eljárást felhasználhatjuk az emberi inzulin gén izolálására és tisztítására, továbbá ennek mikroorganizmusba való bevitelére. Ugyancsak elkülö- 55 níthetjük az emberi növekedési hormon génjét és más fehérjét kódoló géneket, bejuttathatjuk őket mikroorganizmusokba, ahol azok replikálódnak. A találmány szerinti eljárás során több új rekombináns plazmidot ismer- qq tétünk, mindegyik saját adott nukléotid-sorrendű nukleinsaván belül egy magasabbrendű szervezetből származó gént tartalmaz. A találmány szerinti eljárás során több új mikroorganizmust ismertetünk, mindegyiket az jellemzi, hogy egy magasabbrendű ⁶⁵ szervezetből származó adott nukleotid-sorrendű nukleinsavat tartalmaz.The method of the invention can be used to isolate and purify the human insulin gene and to introduce it into a microorganism. Alternatively, genes encoding the human growth hormone gene and other proteins can be isolated and introduced into microorganisms where they replicate. Several novel recombinant plasmids are disclosed in the method of the present invention, each containing a gene from a higher organism within its own particular nucleotide sequence. Several novel microorganisms are disclosed in the method of the invention, each characterized by containing a particular nucleotide sequence from a higher order of ⁶⁵ organisms.

A találmány szerinti eljárás gyakorlati felhasználhatóságát azzal szemléltettük, hogy a patkány preinzulin I proteinjét kódoló gélt Escherichia coli törzsbe juttattuk, ugyancsak bejuttattuk egy Escherichia coli törzsbe a pa-kány növekedési hormonjának génjét. Az átvitt gén fő részének szekvenciáját minden esetben meghatároztuk, úgy találtuk, hogy az tartalmazza a patkány proinzulin I teljes aminosav-sorrendjének vagy a patkány növekedési hormon teljes aminosav-sorrendjének kódját; a vizsgálatokat az ismert genetikai kóddal összehasonlítva végeztük, amely minden élőlényben azonos.The practical utility of the method of the present invention was demonstrated by introducing a rat encoding rat preinsulin I protein into an Escherichia coli strain and also introducing a rat growth hormone gene into an Escherichia coli strain. The sequence of the major part of the transferred gene was always determined and was found to contain the code for the complete amino acid sequence of rat proinsulin I or the complete amino acid sequence of rat growth hormone; the assays were performed in comparison with the known genetic code, which is the same in all organisms.

A találmány szerinti eljárást adott kiviteli példákkal szemléltettük, érthető módon azcnban a találmány oltalmi köréhez tartozik bármely olyan eljárás, amely gyakorlatában, alapgondolataiban vagy szellemében a jelen leírásban megadottakkal kapcsolatos.The process of the invention is illustrated by reference to specific embodiments, it being understood that the invention encompasses any process which, in practice, in principle, or in spirit, relates to that described herein.

Claims (4)

SZABADALMI IGÉNYPONTOKPATENT CLAIMS 1. Eljárás humán növekedési hormont kódoló génnek Escherichia coli ba történő transzformálására alkalmas plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy (1) humán hipofízis-sejtekből mRNS-t izolálunk kaotrop kationt, kaotrop amiont és diszulfid-kötést hasító szert tartalmazó ribonukleáz-gátló szer jelenlétében végzett homogenizálással, (2) az elválasztott mRNS-t dATP, dCTP, dGTP és TTP jelenlétében valamely reverz transzkriptázzal inkubáljuk, (3) az így szintetizált cDNS-t dATP, dCTP, dGTP és TTP jelenlétében valamely reverz transzkriptázzal vagy DNS polimerázzal inkubáljuk, (4) az így nyert kétszálú cDNS végeihez önmagában ismert módon olyan kapcsoló DNS láncot kapcsolunk, mely komplementer egy E. coli plazmid restrikciós endonukleázzal végzett hasítása után keletkezett láncvégekkel, (5) E. coli plazmidot valamely restrikciós endonukleázzal hasítunk és a hasított plazmidról alkalikus foszfatázzal eltávolítjuk az 5’-terminális foszfát-csoportot, és (6) a kapcsoló DNS-szekvenciát tartalmazó kétszálú DNS-láncot és a kezelt plazmidot DNS-ligáz és ATP jelenlétében inkubáljuk. (Elsőbbsége: 1978.04.19.)A method for producing a plasmid for transforming a gene encoding human growth hormone into Escherichia coli comprising (1) isolating mRNA from human pituitary cells in the presence of a ribonuclease inhibitor comprising a chaotropic cation, a chaotropic amion and a disulfide bond cleaving agent. homogenization, (2) incubating the isolated mRNA with a reverse transcriptase in the presence of dATP, dCTP, dGTP and TTP, (3) incubating the cDNA thus synthesized with dATP, dCTP, dGTP and TTP with a reverse transcriptase or incubating with DNA polymerase 4. ) coupling to the ends of the resulting double-stranded cDNA in a manner known per se which is complementary to the ends of the plasmid after restriction endonuclease digestion of an E. coli plasmid, (5) digestion of the E. coli plasmid with a restriction endonuclease and alkaline phosphorylation of the cleaved plasmid. incubating the 5'-terminal phosphate group and (6) the double-stranded DNA chain containing the linker DNA sequence and the treated plasmid in the presence of DNA ligase and ATP. (Priority: April 19, 1978) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan ribonukleáz-gátló szert alkalmazunk, mely kaotrop kation34 ként guanidinium-iont, kaotrop anionként tiocianát-iont és diszulfid-kötést hasító szerként β-merkapto-etanolt tartalmaz. (Elsőbbsége: 1978.04.19.)2. The method of claim 1, wherein the ribonuclease inhibitor comprises a guanidinium ion as a chaotropic cation34, a thiocyanate ion as a chaotropic anion and β-mercaptoethanol as a disintegrant. (Priority: April 19, 1978) 5 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan ribonukleáz-gátló szert alkalmazunk, mely a 4 M guanidinium-tiocianátot és 0,2 m β-merkapto-etanolt tartalmaz. (Elsőbbsége: 1977.05.27.)3. The method of claim 2, wherein the ribonuclease inhibitor comprises 4 M guanidinium thiocyanate and 0.2 m β-mercaptoethanol. (Priority: May 27, 1977) 10 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (5) lépésben az E. coli plazmidot HindlII, Hsul vagy EcoRI endonukleázzal hasítjuk pH=7,6 értéknél 37°C hőmérsékleten. (Elsőbbsége: 1978.04.19.) ^1E' 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli plazmádként pBR322 plazmidot alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1978.04.19.)4. The method of claim 1, wherein, in step (5), the E. coli plasmid is cleaved with HindIII, Hsul or EcoRI endonuclease at pH 7.6 at 37 ° C. (Priority:. 04.19.1978) ^1E '5. The method of claim 1, wherein the E. coli plasmid pBR322 plazmádként used. (Priority: April 19, 1978) 2C2C 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli plazmidként pMB—9 plazmidot alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1978.04.19.)6. The method of claim 1, wherein the plasmid E. coli is pMB-9. (Priority: April 19, 1978) 25 7. Eljárás humán növekedési hormont kódoló nukleotid szekvenciával rendelkező Escherichia coli baktérium előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1—6. igénypontok bármelyike szerint előállított plazmidot E. co3Q lival inkubáljuk. (Elsőbbsége: 1977.05.27.) 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan ribonukleáz-gátló szert alkalmazunk, mely kaotrop kationként guanidinium-iont tartalmaz.7. A method for producing an Escherichia coli bacterium having a nucleotide sequence encoding human growth hormone, characterized in that the nucleic acid sequence of any one of claims 1-6. The plasmid produced according to any one of claims 1 to 4 is incubated with E. coli. 8. A process according to claim 1, wherein the ribonuclease inhibitor comprises a guanidinium ion as the chaotropic cation. (Elsőbbsége: 1977.06.09.)(Priority: June 9, 1977)