KR940005593B1 - Revelation and gene of o-growth hormones - Google Patents
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Abstract
Description
제1도는 본 발명에 따라 설계된 양 성장호르몬 유전자의 염기 서열과 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,Figure 1 shows the nucleotide sequence of both growth hormone genes designed according to the present invention and the amino acid sequence inferred therefrom,
제2도는 제1도의 양 성장 호르몬 유전자를 합성하기 위한 전략을 도시한 것이고,2 shows a strategy for synthesizing the sheep growth hormone gene of FIG.
제3도는 본 발명에 따른 양 성장호르몬 유전자를 대장균 발현 벡터로 클로닝하는 과정은 도시한 것이고,Figure 3 shows the procedure for cloning the sheep growth hormone gene according to the present invention E. coli expression vector,
제4도는 본 발명의 양 성장호르몬 발현 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여서 양 성장호르몬 유전자를 발현시킨 결과를 소듐도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 나타낸 것이다.4 shows the results of expressing both growth hormone genes by culturing E. coli transformed with the growth hormone expression vector of the present invention by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.
본 발명은 인공합성한 변형된 양 성장호르몬(이하 "OGH"라함) 유전자와 그의 발현에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유전공학적인 방법으로 양 성장호르몬을 대량 생산하는데 유용하도록 설계된 변형된 양 성장호르몬 유전자와 이러한 유전자를 함유하고 있는 발현 벡터 및 대장균 형질전환체에 관한 것이다.The present invention relates to artificially synthesized modified sheep growth hormone (hereinafter referred to as "OGH") gene and its expression, more specifically modified sheep growth hormone designed to be useful for mass production of sheep growth hormone by genetic engineering method Genes and expression vectors containing these genes and E. coli transformants.
동물 성장호르몬은 지방 및 탄수화물 대사작용은 물론 단백질대사를 조절하고 조직성장을 촉진하는 단백질의 일종으로, 일반적으로 단일가닥의 구형 단백질의 일종으로, 일반적으로 단일가닥의 구형 단백질(globular protein)이며 성숙형 성장호르몬은 약 190-200개의 아미노산으로 구성되어 있다(일반적인 성장호르몬에 관한 참고문헌:Barrington, et al., Academic Press, N.Y., Vol.2(1979)).Animal growth hormone is a type of protein that regulates protein metabolism and promotes tissue growth as well as fat and carbohydrate metabolism. Generally, it is a single-stranded globular protein and is generally a single-stranded globular protein. Type growth hormones consist of approximately 190-200 amino acids (see General Growth Hormones: Barrington, et al., Academic Press, NY, Vol. 2 (1979)).
이들 성장호르몬은 뇌하수체 전엽에서 생성되며, 처음에는 세포내에서 아미노말단에 신호 서열을 갖고 있는 전구 물질로서 합성되고, ER(endoplasmic reticulum)막을 거쳐 신호서열이 절단되어 성숙형 성장호르몬으로 만들어진다(Davies et al., Nature 283, 433438(1980)).These growth hormones are produced in the anterior pituitary gland, initially synthesized as precursors with an amino-terminal signal sequence in cells, and cleaved through ER (endoplasmic reticulum) membranes to form mature growth hormones (Davies et. al., Nature 283, 433438 (1980)).
성장호르몬은 어린 동물들의 균형된 성장을 위해 요구되기 때문에 특히 가축산업에 유용하게 이용될 수 있다. 이들은 주로 아미노산들의 세포내로의 전달을 증가시키고 전령 RNA의 해독을 자극함시킴으로써 동물들의 성장을 촉진시킨다. 또한 이들은 성장에 중요한 요소인 세포의 분열 작용을 증가시킨다. 따라서 성장호르몬을 투여받은 동물은 증가된 조직 단백질의 결과로서 사료량의 증가없이 부가적인 체중의 증가로 인하여 사료의 효율을 증대시킬 수 있다.Growth hormone is particularly useful in the livestock industry because it is required for balanced growth of young animals. They primarily promote the growth of animals by increasing the delivery of amino acids into cells and stimulating the translation of messenger RNA. They also increase cell division, an important factor for growth. Thus, animals receiving growth hormone can increase feed efficiency due to additional weight gain without increasing feed volume as a result of increased tissue protein.
이러한 성장호르몬은 종에 특이적으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 대부분의 동물 성장호르몬에 대한 전체 저열이 이미 공지되어 있으며 지금까지 인간, 소, 돼지, 및 쥐를 포함하는 몇몇 종의 동물 성장호르몬들이 클로닝되어 대장균 세포내에서 발현되었다. (Miller et al., JBC 255, 7521-7524; Martial et al., Science 205, 602-607(1979); Seeburg et al., Nature 270, 486-494(1977)).These growth hormones are known to act specifically on species. Total low fever for most animal growth hormones is already known and to date several animal growth hormones, including humans, cattle, pigs, and mice, have been cloned and expressed in E. coli cells. (Miller et al., JBC 255, 7521-7524; Martial et al., Science 205, 602-607 (1979); Seeburg et al., Nature 270, 486-494 (1977)).
그러나, 천연 양 성장호르몬의 아미노산 서열을 동일하게 유지하면서 대장균에서 대량 발현시키는데 성공한 예는 찾아 볼 수 없는 바, 이에 본 발명자들은 이미 알려진 양 성장호르몬의 아미노산 서열을 바탕으로 하여 대장균에서 양 성장호르몬을 대량 발현시키는데 적합한 양 성장호르몬 유전자를 설계하고 이로써 양 성장호르몬을 대량발현시키는데 성공하였다.However, there is no example of success in mass expression in E. coli while maintaining the same amino acid sequence of natural sheep growth hormone. Therefore, the present inventors based on the amino acid sequence of sheep growth hormone known in the present invention, We have designed a sheep growth hormone gene suitable for mass expression and have succeeded in mass expression of sheep growth hormone.
즉, 본 발명의 목적은 양 성장호르몬을 유전공학적인 방법에 따라 대장균을 발현체로 하여 대량생산하는 데 적합하도록 설계된 양 성장호르몬 유전자를 포함하며 상기 유전자의 양 말단 부분에 제한 효소인식부위를 가지고 있어서 상기 유전자의 벡터로의 클로닝을 용이하게 하는 DNA 절편을 제공하는 것이며, 또한 이러한 유전자를 함유하는 양 성장호르몬 발현 벡터와 대장균 형질전환체를 제공하는 것이다.In other words, an object of the present invention includes a sheep growth hormone gene designed to mass-produce Escherichia coli as an expression material according to genetic engineering method, and has a restriction enzyme recognition site at both ends of the gene. It is to provide a DNA fragment to facilitate cloning of the gene into a vector, and to provide a positive growth hormone expression vector and E. coli transformants containing the gene.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에서는 리 등의 문헌(Li, H. et al., Biochem. Biophys. Acta. 29, 493(1973))에 개시된 양 성장호르몬의 아미노산 서열을 기초로 하여 양 성장호르몬 유전자를 포함하는 DNA 절편을 다음과 같이 설계하였다.In the present invention, a DNA fragment comprising a sheep growth hormone gene based on the amino acid sequence of sheep growth hormone disclosed in Li et al. (Li, H. et al., Biochem. Biophys. Acta. 29, 493 (1973)). Was designed as follows.
(1) 성숙형의 양 성장호르몬이 만들어지도록 시작 코오돈인 메티오닌의 다음이 성숙형 양 성장호르몬의 아미노말단 아미노산인 페닐알라닌이 되도록 하고, 아울러 발현 벡터로의 클로닝을 용이하게 하기 위하여 제한효소 Nde I 의 인식부위(5-CATATG-3')를 갖도록 하였으며 ;(1) Start of the production of mature sheep growth hormone The methionine codon is next to the amino terminal amino acid phenylalanine of the mature sheep growth hormone, and the restriction enzyme Nde I to facilitate cloning into the expression vector. Has a recognition site of (5-CATATG-3 ');
(2) 카르복시말단은 성숙형 양 성장호르몬의 카르복시말단 아미노산dls 페닐알라닌에서 해독이 종료되도록 페닐알라닌 다음 두개의 종료 코오돈 TAG와 TAA를 삽입하고, 동시에 발현 벡터로의 클로닝을 용이하게 하기 위하여 제한효소 Sal I 인식부위(5'-GTCGAC-3')를 삽입하였으며,(2) The carboxy terminus is a phenylalanine followed by insertion of two terminating codons TAG and TAA to terminate the detoxification at the carboxy terminal amino acid dls phenylalanine of the mature sheep growth hormone, and at the same time the restriction enzyme Sal to facilitate cloning into the expression vector. I recognition site (5'-GTCGAC-3 ') is inserted.
(3) 양 성장호르몬 유전자내에 독특한 제한효소의 인식부위 ,즉 제한효소 Sac I 인식부위(5'-GAGCTC-3'; 17번째 아미노산인 알지닌 위치), Pst I 인식부위(5'-CTGCAG-3';90번째 아미노산인 루이신 위치) 및 XbaI 인식부위(5'-TCTAGA-3' ; 116번째 아미노산인 루이신 위치)를 갖도록 고안하여 양 성장호르몬 유전자의 변환을 용이하게 할 수 있도록 하였으며,(3) Recognition sites of restriction enzymes unique to both growth hormone genes, namely restriction enzyme Sac I recognition sites (5'-GAGCTC-3 '; 17th amino acid arginine), Pst I recognition sites (5'-CTGCAG- 3 '; 90th amino acid leucine position) and XbaI recognition site (5'-TCTAGA-3'; 116th amino acid leucine position) was designed to facilitate the conversion of both growth hormone genes,
(4) 가능한 2차구조를 형성할 수 있는 요소를 제거함으로써 전사수준 및 해독수준에서의 양성장호르몬의 발현을 최적화 시켜주었다. 상기를 만족시킨 구체적인 양 성장호르몬 유전자의 염기 서열은 제1도에 개시한 바와 같으며 이를 포함하는 본 발명의 DNA 절편은 상기 유전자의 5' 말단부분에 NdeI 인식부위를 3'말단 부분의 종료코돈 다음에 Sal I 인식부위를 가지고 있다.(4) By optimizing the expression of positive intestinal hormones at the level of transcription and translation by removing elements that could form possible secondary structures. The nucleotide sequence of the specific amount of growth hormone gene satisfying the above is as described in FIG. Next I have Sal I recognition.
상기 양 성장호르몬의 전체 유전자를 포함하는 DNA 절편은 DNA 합성기를 이용한 합성법과 중합효소 연쇄반응(PCR: Polymerase Chain Reaction)등의 통상적인 방법에 따라 합성할 수 있을 것이며 구체적으로는 하기의 실시예에 의거하여 합성할 수 있다.DNA fragments containing the entire genes of both growth hormones can be synthesized according to conventional methods such as synthesis using a DNA synthesizer and polymerase chain reaction (PCR). It can synthesize | combine based on.
본 발명에서는 상기 양 성장호르몬 유전자를 대장균에서 발현시키기 위해 본 발명들에 의해 대장균을 발현체로하여 성장호르몬을 발현시키는 것으로 밝혀진 대한민국 특허출원 제89-18090호(특허공고 제91-457호)에 개시된 ptrp322H-HGH(이 발현 벡터 ptrp322H-HGH를 함유하는 대장균, E. coli W3110은 한국종균협회에 KFCC-10667호에 기탁되어 있음)의 발현시스템을 이용하였다. 이는 ptrp322H-HGH의 인간 성장호르몬 유전자 대신에 제1도에 개시한 바와 같은 양 성장호르몬 유전자를 포함하는 본 발명의 DNA 절편을 Nde I 및 Sal I 제한효소로 절단한 후 같은 제한효소로 절단하여 인간성장 호르몬 유전자를 제거한 ptrp322H-HGH와 연결시킴으로써 별도의 복합한 DNA 조작없이 간단하게 제조할 수 있다.In the present invention, it is disclosed in Korean Patent Application No. 89-18090 (Patent Publication No. 91-457) found to express growth hormone by using the present invention E. coli as an expression in order to express the growth hormone gene in E. coli The expression system of ptrp322H-HGH (E. coli W3110, E. coli containing this expression vector ptrp322H-HGH, deposited in KFCC-10667 with the Korean spawn association) was used. This was done by cutting the DNA fragment of the present invention containing Nde I and Sal I restriction enzymes as described in FIG. 1 in place of the human growth hormone gene of ptrp322H-HGH, followed by cleavage with the same restriction enzymes. By connecting with ptrp322H-HGH from which the growth hormone gene has been removed, it can be prepared simply without any complex DNA manipulation.
본 출원인은 상기와 같이 ptrp322H-HGH(KFCC-10667)에서 인간 성장호르몬 유전자 대신에 제1도 양 성장호르몬 유전자를 대체시킨 양 성장호르몬 발현 벡터를 하기 실시예에 따라 제조하고 ptrp -OST라 명명하였다. 이 ptrp-OST를 대장균 E. coli W3110(ATCC 27325)에 삽입시켜 1991년 6월 26일자로 부다페스트조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 KCCM-10006호로 기탁하였다.Applicant prepared a sheep growth hormone expression vector in the ptrp322H-HGH (KFCC-10667) in place of the human growth hormone gene in place of the human growth hormone gene as described above according to the following example and named ptrp -OST . This ptrp-OST was inserted into Escherichia coli E. coli W3110 (ATCC 27325) and deposited as KCCM-10006 at the Korea Microorganism Conservation Center, an international depository under the Treaty of Budapest on June 26, 1991.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하겠다. 다음의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐이고 발명의 범위를 제한하지 않는다. 다음의 실시예에서 사용된 방법들은 특별한 언급이 없는 한 다음의 참조예에 따라 실시하였다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. The following examples merely illustrate the invention and do not limit the scope of the invention. The methods used in the following examples were carried out according to the following reference examples unless otherwise noted.
[참조예 I : 제한효소를 이용한 DNA의 절단]Reference Example I Cleavage of DNA Using Restriction Enzymes
사용된 제한효소와 반응 완충용액은 NEB(New England Biolabs., 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA. U.S.A.)사로부터 구매하였으며 멸균된 1.5ml 에펜돌프튜브에서 보통 반응부피가 50μl에서 100μl가 되도록 하였다. 반응은 37℃에서 1 내지 2시간 동안 실시하였으며 반응이 완료된 후에는 65℃에서 15분간 열처리 하거나 또는 내열성인 제한효소는 페놀 추출과 에탄올 침전법을 이용하여 불활성화 시켰다.Restriction enzymes and reaction buffers used were purchased from NEB (New England Biolabs., 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA. USA) and were typically prepared from 50 μl to 100 μl in sterile 1.5 ml eppendorf tubes. It was. The reaction was carried out at 37 ° C. for 1 to 2 hours. After the reaction was completed, heat treatment was performed at 65 ° C. for 15 minutes or heat-resistant restriction enzyme was inactivated by phenol extraction and ethanol precipitation.
제한 효소반응에 사용하는 10배 완충용액의 조성은 다음과 같다.The composition of the 10-fold buffer used for restriction enzyme reaction is as follows.
10배 NEB 완충용액 1: 100mM 비스트리스프로판-HCl, 100mM MgCl2,10mM DTT(dithiothreitol), pH 7.010-fold NEB buffer 1: 100 mM bistrispropane-HCl, 100 mM MgCl 2, 10 mM dithiothreitol (DTT), pH 7.0
10배 NEB 완충용액 2 : 100mM 트리스-HCl, 100mM MgCl2,500mM NaCl, 10mM DTT, pH 7.010-fold NEB buffer 2: 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl 2, 500 mM NaCl, 10 mM DTT, pH 7.0
10배 NEB 완충용액 3 : 100mM 트리스-HCl, 100mM MgCl2, 1000mM NaCl, 10mM DTT, pH 7.010-fold NEB buffer 3: 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl 2 , 1000 mM NaCl, 10 mM DTT, pH 7.0
10배 NEB 완충용액 4 : 200mM 트리스-아세테이트,100mM 마그네슘 아세테이트, 500mM 칼륨 아세테이트, 10mM DTT, pH 7.010-fold NEB buffer 4: 200 mM tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 500 mM potassium acetate, 10 mM DTT, pH 7.0
[참조예 2 : 페놀 추출 및 에탄올 침전]Reference Example 2: Phenol Extraction and Ethanol Precipitation
페놀 추출은 제한효소 반응이 완료된 후 제한효소를 불활성화시키거나 DNA를 추출할 때 사용하였다. 페놀은 10mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)용액으로 평형화시켜 사용하였다. 페놀 추출은 시료와 페놀을 1:1(부피/부피)의 비율로 섞고 강하게 흔들어 혼합시킨 후 원심분리(15,000rpm, 5분)시켜 상등액을 새 튜브로 옮기고, 동일 과정을 3회 반복한 다음, 동일 부피의 클로로포름(클로로포름과 이소부탄올 비율이 24:1인 용액)으로 추출하고, 0.1부피의 3M 나트륨 아세테이트와 2.5배 부피의 에탄올을 가하여 -70℃에서 30분간 혹은 -20℃에서 약 12시간 정치한 후 원심분리(15,000rpm, 20분, 4℃)하여 DNA를 침전시켰다.Phenol extraction was used to deactivate the restriction enzyme or to extract DNA after the restriction enzyme reaction was completed. Phenol was used by equilibrating with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) solution. For phenol extraction, sample and phenol are mixed at a ratio of 1: 1 (volume / volume), shaken vigorously, and centrifuged (15,000 rpm, 5 minutes) to transfer the supernatant to a new tube, and the same process is repeated three times. Extract with an equal volume of chloroform (a solution with a 24: 1 ratio of chloroform and isobutanol), and add 0.1 volume of 3M sodium acetate and 2.5 times the volume of ethanol for 30 minutes at -70 ° C or about 12 hours at -20 ° C. After centrifugation (15,000rpm, 20 minutes, 4 ℃) to precipitate the DNA.
[참조예 3 : 연결반응]Reference Example 3: Linking Reaction
연결 반응은 NEB사의 T4 DNA 리가제와 10배 리가제 완충용액(0.5 트리스-HCl, 0.1M MgCl2, 0.2M DTT, 10mM ATP, 0.5mg/ml BSA(소혈청 알부민), pH 7.8)을 사용하였으며 보통 20μl 부피에서 10단위의 리가제를 사용하고, 평활말단을 갖는 DNA 연결은 100단위의 리가제를 사용하였다. 반응조건은 보통 16℃에서 적어도 5시간 이상 또는 4℃에서 14시간 이상 반응시켰으며 반응이 완료된 후에 65℃에서 15분간 가열하여 리가제를 불활성화 시켰다.The ligation reaction was performed using NEB's T4 DNA ligase and 10-fold ligase buffer solution (0.5 Tris-HCl, 0.1M MgCl 2 , 0.2M DTT, 10mM ATP, 0.5mg / ml BSA (bovine serum albumin), pH 7.8). Usually, 10 units of ligase was used in a volume of 20 μl, and 100 units of ligase was used for DNA ligation having a smooth end. The reaction conditions were usually at least 5 hours at 16 ℃ or at least 14 hours at 4 ℃ and after the reaction was completed by heating at 65 ℃ for 15 minutes to inactivate the ligase.
[참조예 4 : 대장균의 형질전환]Reference Example 4 Transformation of Escherichia Coli
대장균 숙주세포로는 국제기탁기관에서 용이하게 입수할 수 있는 공지의 대장균인 E.coli HB101(ATCC 33694), W3110(ATCC 27325) 또는 JM105(ATCC 47016)등을 사용하였다. 숙주세포를 100ml 액체 LB배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모추출물, 0.5% 염화나트륨)에 접종한 후 37℃에서 650nm에서의 광학 밀도 값이 0.25 내지 0.5에 달할 때까지 배양한 다음, 원심분리기로 세포들을 분리하였다. 그 침전물을 50ml의 0.1M 염화마그네슘 용액에 가하여 세척한 후 원심분리시키고 침전물에 50ml의 0.1M CaCl2, 0.05M MgCl2용액을 가하여 얼음위에서 30분간 정치시켰다. 이들 세포를 다시 원심분리시켜 동일 용액 5ml에 균일하게 현탁시켰다. 위에서 사용한 모든 용액 및 용기는 0℃에서 냉각시켜 사용하였다. 형질전환은 위에서 얻은 세포 현탁액중 0.2ml을 취한 후 여기에 연결반응 혼합물 10μl을 가하여 0℃에서 40분간 정치시키고, 42℃에서 1분동안 열처리한 후 2.0ml 액체 LB배지를 가하여 37℃에서 1시간동안 배양한 다음, 50㎍/ml 앰피실린을 함유하고 있는 고체 LB배지에 도포하고 37℃에서 배양하였다. M13 백터 DNA는 열처리후 여기에 100μl JM105 세포, 15μl 100mM IPTG(isoproply-β-thiogalactoside), 25μL 4% X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) 및 48℃로 미리 데워 놓은 3ml 2배 연성 고체 YT배지(1% NaCl, 1% 효모추출물, 1.6% 박토트립톤, 0.7% 박토아가)를 가하여 잘 섞어준 후 2배 고체 YT배지(1% 효모추출물, 1.6%박토트립톤, 1.5% 박토아가)에 도포하였다.As E. coli host cells, E. coli HB101 (ATCC 33694), W3110 (ATCC 27325), JM105 (ATCC 47016), and the like, which are readily available from international deposit facilities, were used. Host cells were inoculated in 100 ml liquid LB medium (1% bactotrypton, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride) and then incubated at 37 ° C. until the optical density value of 650 nm reaches 0.25 to 0.5, followed by centrifugation. The cells were separated by. The precipitate was added to 50 ml of 0.1 M magnesium chloride solution, washed, and centrifuged. The precipitate was allowed to stand on ice for 30 minutes by adding 50 ml of 0.1 M CaCl 2 and 0.05 M MgCl 2 solutions. These cells were centrifuged again and evenly suspended in 5 ml of the same solution. All solutions and vessels used above were used after cooling at 0 ° C. For transformation, take 0.2 ml of the cell suspension obtained above, add 10 μl of the ligation reaction mixture to it, and leave it at 0 ° C. for 40 minutes, heat-treat at 42 ° C. for 1 minute, and add 2.0 ml liquid LB medium for 1 hour at 37 ° C. Incubated in a solid LB medium containing 50 μg / ml ampicillin and incubated at 37 ° C. After heat treatment, the M13 vector DNA contained 100 μl JM105 cells, 15 μl 100 mM IPTG (isoproply-β-thiogalactoside), 25 μL 4% X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) and 48 μl. 3 ml double soft YT medium (1% NaCl, 1% yeast extract, 1.6% bactotryptone, 0.7% bactoagar) preheated to ℃ and mixed well, then double solid YT medium (1% yeast extract, 1.6% bactotryptone, 1.5% bactoagar).
[참조예 5 : 올리고뉴클레오티드의 합성]Reference Example 5: Synthesis of Oligonucleotide
올리고뉴클레오티드는 자동화된 고체상 포스포아미다이트 케미스트리(solid phase phosphoamidite chemistry)를 이용하는 DNA합성기(Applide Biosystems, 380 B, U.S.A)로 합성한 후, 변성 폴리아크릴 아미드 젤(2M 우레아, 12% 아크릴아미드:비스(29 : 1,w/w), 50mM 트리스, 50mM 붕산, 1mM EDTA-Na2)을 이용한 전기영동으로 분리하고, C18칼럼인 SEP-PAK(Waters Inc., U.S.A)에 부착시킨 후, 50:50(v/v)의 아세토니트릴 : 물 혼합액으로 용출하여 순수 정제하고, 260nm에서의 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다.Oligonucleotides were synthesized by DNA synthesizer (Applide Biosystems, 380 B, USA) using automated solid phase phosphoamidite chemistry, followed by modified polyacrylamide gels (2M urea, 12% acrylamide: After separation by electrophoresis using bis (29: 1, w / w), 50mM Tris, 50mM boric acid, 1mM EDTA-Na 2 ), and attached to C 18 column SEP-PAK (Waters Inc., USA), The product was purified by elution with 50:50 (v / v) acetonitrile: water mixture and purified purely. The absorbance at 260 nm was measured to determine the concentration.
[참조예 6 : 중합효소 연쇄 반응 (PCR)]Reference Example 6: Polymerase Chain Reaction (PCR)
주형 DNA (10ng 내지 100ng), 10μl의 10배 농도 타크(Tag) 폴리머라제 완충용액(10mM 트리스-HCl, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.1%(w/v) 젤라틴, pH 8.3), 10μl의 dNTP'S 혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP가 각각 1.25mM), 프라이머 2μg씩(보통 2개의 프라이머를 사용하며, 3개의 프라이머를 동시에 사용할 때는 중간에 위치한 프라이머를 0.02㎍을 사용하였다), 0.5μl의 앰플리타크(AmpliTaq) DNA 폴리머라제(Perkin Elmer Cetus, U.S.A)에 증류수를 가하여 총 부피를 100μl로 하였다. 여기에 용액의 증발을 막기 위해50μl의 미네랄 오일을 첨가하였다. 온도 순환기(Perkin-Elmer Cetus, USA)를 이용하였으며, 순환프로그램은 95℃ 1분; 55℃1분; 72℃ 2분간의 순환을 25회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다.Template DNA (10 ng to 100 ng), 10 μl of 10-fold concentration Tag polymerase buffer (10 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.1% (w / v) gelatin, pH 8.3), 10 μl of dNTP'S Mixed solution (1.25 mM of dGTP, dATP, dTTP, and dCTP), 2 μg of primer (usually 2 primers, 0.02 μg of primer in the middle when 3 primers are used simultaneously), 0.5 μl of ampli Distilled water was added to AmpliTaq DNA polymerase (Perkin Elmer Cetus, USA) to make a total volume of 100 μl. To this was added 50 μl of mineral oil to prevent evaporation of the solution. Temperature cycler (Perkin-Elmer Cetus, USA) was used, the cycle program was 95 ℃ 1 minute; 55 ° C. 1 minute; The cycle of 72 ° C. for 2 minutes was repeated 25 times and finally further reacted for 10 minutes at 72 ° C.
폴리머라제를 제거하기 위하여 반응 혼합물에 동일 부피의 페놀/클로로포름을 넣고 잘 섞은 후 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브에 옮기고 1/10부피의 3M 나트륨 아세테이트, 2개 부피의 100% 에탄올을 넣고 혼합한후 원심분리하여 이중 나선의 핵산을 얻었다. 이 핵산을 20μl의 TE완충액(10mM 트리스-HCl, 1mMEDTA, pH 7.5)에 녹인 후 다음 실험에 이용하였다.In order to remove the polymerase, an equal volume of phenol / chloroform was added to the reaction mixture, mixed well, and centrifuged. The supernatant was transferred to a new tube, mixed with 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2 volumes of 100% ethanol, followed by centrifugation to obtain a double helix nucleic acid. This nucleic acid was dissolved in 20 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) and used for the next experiment.
[실시예 1]Example 1
:양 성장호르몬 유전자 염기서열의 설계: Design of sheep growth hormone gene sequence
5'말단에 Nde I 제한효소 인지부위를 3'말단에 2개의 종료코돈과 Sal I 제한효소 인지부위를 포함하도록 다음과 같은 10개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.The following 10 oligonucleotides were synthesized to include Nde I restriction enzyme recognition sites at the 5 'end and two termination codons and Sal I restriction enzyme recognition sites at the 3' end.
올리고뉴클레오티드 OGH1은 5'말단쪽에 제한효소 Nde I 인식부위 5'-CATATG-3'를 갖고 있으며, 3'말단쪽에 20개의 염기가 올리고뉴클레오티드 OGH2의 5'말단 20개의 염기와 상보적이고, 올리고뉴클레오티드 OGH3의 5'말단의 20개 염기는 올리고뉴클레오티드 OGH4의 3'말단의 20개 염기와 서로 상보적이며, 올리고뉴클레오티드 OGH5의 5'말단의 20개 염기는 올리고뉴클레오티드 OGH6의 3'말단의 20개 염기와 서로 상보적이고, 올리고뉴클레오티드 OGH7의 5'말단의 20개 염기는 올리고뉴클레오티드 OGH8의 3'말단의 20개 염기와 서로 상보적이며, 올리고뉴클레오티드 OGH9의 5'말단의 20개 염기는 올리고뉴클레오티드 OGH10의 3'말단의 20개 염기와 서로 상보적이고, 올리고뉴클레오티드 OGH10의 3'말단쪽에는 두개의 종료코든 5'-TAA-3' 및 5'-TAG-3'과 발현 백터로의 클로닝을 용이하게 하기 위한 제한효소 Sal I 인식부위 5'-GTCGAC-3'를 삽입하였다.Oligonucleotide OGH1 has restriction enzyme Nde I recognition site 5'-CATATG-3 'at the 5' end, and 20 bases at the 3 'end are complementary to 20 bases at the 5' end of oligonucleotide OGH2, and oligonucleotide OGH3 The 20 bases at the 5 'end of the oligonucleotide OGH4 are complementary to the 20 bases at the 3' end of the oligonucleotide OGH4, and the 20 bases at the 5 'end of the oligonucleotide OGH5 are 20 bases at the 3' end of the oligonucleotide OGH6. Complementary to each other, 20 bases at the 5 'end of oligonucleotide OGH7 are complementary to 20 bases at the 3' end of oligonucleotide OGH8, and 20 bases at the 5 'end of oligonucleotide OGH9 are 3 'Complemented with the 20 bases at the end, and at the 3' end of the oligonucleotide OGH10 to facilitate cloning into two expression codes 5'-TAA-3 'and 5'-TAG-3' and expression vector A restriction enzyme Sal I recognition site was inserted into the 5'-GTCGAC-3 '.
[실시예 2]Example 2
: 양 성장호르몬 전체 유전자를 포함하는 DNA 절편의 제조: Preparation of DNA Fragment Comprising Whole Growth Hormone Gene
상기 실시예에서 얻은 올리고뉴클레오티드들을 이용하여 제2도의 전략에 따라 중합효소 연쇄반응을 실시하여 양 성장호르몬 전체 유전자를 포함하는 DNA절편을 제조하였다.Using the oligonucleotides obtained in the above Example was subjected to a polymerase chain reaction according to the strategy of Figure 2 to prepare a DNA fragment containing the entire growth hormone gene.
먼저 제1차 PCR 반응을 다음과 같이 실시하였다.First, the first PCR reaction was performed as follows.
반응튜브 A에 2㎍의 올리고뉴클레오티드 OGH1, 0.02㎍의 올리고뉴클레오티드 OGH2, 0.02㎍의 올리고뉴클레오티드 OGH3 및 2㎍의 올리고뉴클레오티드 OGH4를 투입하고, 반응튜브 B에는 2㎍의 올리고뉴클레오티드 OGH5, 0.02㎍의 올리고뉴클레오티드 OGH6, 0.02㎍의 올리고뉴클레오티드 OGH7 및 2㎍의 올리고뉴클레오티드 OGH8를 투입하고, 반응튜브 C에는 2㎍의 올리고뉴클레오티드 OGH9 및 2㎍의 올리고뉴클레오티드 OGH10을 투입하였다. 각 반응튜브에 10μl의 10×타크 폴리머라제 완충용액(100mM Tris. Cl, pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.1%(w/v)젤라틴, 10μl의 dNTP'S 혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP가 각각 1.25mM), 67μl 증류수에 0.5μl(5단위/μl)의 앰플리타크 DNA 폴리머라제(Perkin-Elmer Cetus, U.S.A)를 넣고 잘 혼합시켰다. 온도 순환기(Perkin Elmer-Cetus, U.S.A.)를 이용하였으며, 순환 프로그램은 95℃ 30초, 55℃ 30초 ; 72℃ 1분간의 순환의 4회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가반응을 시켰다. 반응이 완료된 후 이 제1 차PCR 산물을 폴리아크릴아미드 젤 전기 영동을 통해 분리하고 이를 일루팁(Elutip)으로 정제하여 20μl의 TE 완충용액(10mM Tris. Cl, pH 7.5, 1mM EDTA)에 용존시켰다.2 μg oligonucleotide OGH1, 0.02 μg oligonucleotide OGH2, 0.02 μg oligonucleotide OGH3 and 2 μg oligonucleotide OGH4 were added to the reaction tube A, and 2 μg oligonucleotide OGH5 and 0.02 μg oligo were added to the reaction tube B. Nucleotide OGH6, 0.02 μg oligonucleotide OGH7 and 2 μg oligonucleotide OGH8 were added, and 2 μg oligonucleotide OGH9 and 2 μg oligonucleotide OGH10 were added to the reaction tube C. 10 μl of 10 × Tak polymerase buffer solution (100 mM Tris.Cl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.1% (w / v) gelatin, 10 μl of dNTP'S mixture (dGTP, dATP, dTTP, dCTP) 1.25mM) and 0.5μl (5 units / μl) of Amplitac DNA polymerase (Perkin-Elmer Cetus, USA) were added to 67μl distilled water and mixed well.The temperature circulator (Perkin Elmer-Cetus, USA) was used. The cycle program was repeated four times with a cycle of 95 ° C. 30 sec, 55 ° C. 30 sec; 72 ° C. for 1 minute and finally a further reaction for 10 min at 72 ° C. After the reaction was completed, the primary PCR product was polyacrylamide. Isolation was carried out by amide gel electrophoresis and purified by Elutip and dissolved in 20 μl of TE buffer (10 mM Tris. Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA).
이들 제1차 PCR 산물을 이용하여 제2차 PCR 반응을 다음과 같이 실시하였다.The secondary PCR reaction was carried out using these primary PCR products as follows.
반응튜브 D에 약 100ng의 반응튜브 A의 PCR산물, 약 100ng의 반응튜브 B의 PCR산물, 2㎍의 올리고뉴클레오티드 OGH1, 2㎍의 올리고뉴클레오티드 OGH8, 10μl의 10×타크 폴리머라제 완충용액(100mM Tris. Cl, pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.1%(w/v)젤라틴), 10μl의 dNTP'S 혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP가 각각 1.25mM), 67μl 증류수에 0.5μl(5단위/μl)의 앰플리타크 DNA 폴리머라제(Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)를 넣고 잘 혼합하여 위와 동일한 조건으로 PCR 반응을 20회 실시하였다. 반응이 완료된 후 이 제 2차 PCR 산물을 폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 통해 분리한 후 이를 일루팁으로 정제하여 20μl의 TE 완충용액을 용존시켰다.In reaction tube D, about 100 ng of PCR product of reaction tube A, about 100 ng of PCR product of reaction tube B, 2 μg of oligonucleotide OGH1, 2 μg of oligonucleotide OGH8, 10 μl of 10 × tact polymerase buffer solution (100 mM Tris Cl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.1% (w / v) gelatin), 10 μl of dNTP'S mixture (1.25 mM each for dGTP, dATP, dTTP, dCTP), 0.5 μl (5 units / μl) of Amplitac DNA polymerase (Perkin Elmer Cetus, USA) was added and mixed well, and PCR reaction was performed 20 times under the same conditions as above. After the reaction was completed, the second PCR product was separated by polyacrylamide gel electrophoresis and purified by illuminator to dissolve 20 μl of TE buffer solution.
이들 제2차 PCR 산물을 이용하여 제3차 PCR 반응을 다음과 같이 실시하였다.The third PCR reaction was carried out using these secondary PCR products as follows.
반응튜브 E에 약 100ng의 반응튜브 D의 PCR산물, 약 100ng의 반응튜브 D의 PCR산물, 2㎍의 올리고뉴클레오티드 OGH1, 2㎍의 올리고뉴클레오티드 OGH10, 10μl의 10×타크 폴리머라제 완충용액(100mM Tris. Cl, pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.1%(w/v)젤라틴), 10μl의 dNTP'S 혼합액 (dGTP, dATP, dTTP, dCTP가 각각 1.25mM), 67μl 증류수에 0.5μl(5단위/μl)의 앰플리타크 DNA 폴리머라제(Perkin Elmer-Cetus, U.S.A.)를 넣고 잘 혼합하여 위와 동일한 조건으로 PCR 반응은 20회 실시하였다. 반응이 완료된 후 PCR 산물을 폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 통해 분리한 후, 일루팁으로 정제하였다. 이렇게 하여 얻어진 양 성장호르몬 전체 유전자(이하 이 단편을 단편 OGH라 칭한다)를 20μl의 TE 완충용액에 용존시켰다.In reaction tube E, about 100 ng of PCR product of reaction tube D, about 100 ng of reaction tube D of PCR product, 2 μg of oligonucleotide OGH1, 2 μg of oligonucleotide OGH10, 10 μl of 10 × tak polymerase buffer solution (100 mM Tris Cl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.1% (w / v) gelatin), 10 μl of dNTP'S mixture (1.25 mM of dGTP, dATP, dTTP, dCTP), 0.5 μl (5 units /) in 67 μl distilled water. μl) of Amplitac DNA polymerase (Perkin Elmer-Cetus, USA) was added and mixed well, and the PCR reaction was performed 20 times under the same conditions. After the reaction was completed, the PCR product was separated by polyacrylamide gel electrophoresis, and then purified by Illutip. The whole growth hormone whole gene thus obtained (hereinafter, this fragment is called fragment OGH) was dissolved in 20 µl of TE buffer solution.
[실시예 3]Example 3
:발현 벡터의 제조: Production of Expression Vectors
상기 실시예 2에서 얻은, 양 성장호르몬 전체 유전자를 포함하는 DNA 절편을 이용하여 제3도에 도시한 방법에 따라 발현 벡터를 제조하였다.An expression vector was prepared according to the method shown in FIG. 3 using a DNA fragment containing the entire gene for growth hormone obtained in Example 2.
상기 DNA 절편 약 2㎍을 총부피 50μl에서 NEB 완충용액 4의 조건하에서 37℃에서 제한효소 Nde I(10단위)으로 절단한 후 페놀-클로로포름 추출법에 의해 추출한 뒤 에탄올 침전시켰다. 침전된 핵산을 5μl의 NEB 완충용액 3으로 용존시킨 다음, 다시 제한효소 Sal I (10단위)으로 37℃에서 2시간 처리하였다.About 2 μg of the DNA fragments were digested with restriction enzyme Nde I (10 units) at 37 ° C. under NEB buffer 4 at a total volume of 50 μl and extracted by phenol-chloroform extraction followed by ethanol precipitation. The precipitated nucleic acid was dissolved in 5 μl of NEB buffer 3 and then treated with restriction enzyme Sal I (10 units) at 37 ° C. for 2 hours.
한편, E. Coli W3110(KFCC-10667)로부터 분리한 플라스미드 ptrp322H-HCH 2㎍을 상기와 동일한 방법에 따라 제한효소 Pst I와 제한효소 Sal I로 처리하고 동일 플라스미드 2㎍을 제한효소 Pst I과 제한효소 Nde I으로 처리하여 각각 완전 절단하였다. 이를 0.7% 아가로오스 젤으로 분리하여 약 0.6kb, 1.5kb및 0.8kb 크기의 단편을 얻었다. 이하, 이들 단편을 각각 단편 OGH-N/L, 단편 PL, 단편 PN이라 칭한다.Meanwhile, 2 µg of plasmid ptrp322H-HCH isolated from E. Coli W3110 (KFCC-10667) was treated with restriction enzymes Pst I and restriction enzyme Sal I according to the same method as above, and 2 µg of the same plasmid was restricted with restriction enzyme Pst I. Each complete digestion was performed with the enzyme Nde I. This was separated by 0.7% agarose gel to obtain fragments of about 0.6 kb, 1.5 kb and 0.8 kb in size. Hereinafter, these fragments are called fragment OGH-N / L, fragment PL, and fragment PN, respectively.
상기에서 얻은 단편들을 다음과 같이 연결반응시켰다.The fragments obtained above were ligated as follows.
약 100ng의 단편 OGH-N/L, 100ng의 단편 PN, 2μl의 10배 리가제 완충용액, 10단위의 T4 DNA 리가제와 총부피가 20μl가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 대장균 HB101(ATCC 33694)을 형질전환시켜서 양성장호르몬 유전자 단편을 함유하고 있는 ptrp-OST을 선별하고, 이들을 염기서열 결정용 시발체인 시발체 2090(5'-CATCACCGAAACGCGCGAG-3')와 시발체 ptrp(5'-GACAATTAATCATCGAACTA-3')를 사용하여 디데옥시 염기서열결정방법(PNAS 74, 5463(1977)에 따라 전체 양 성장호르몬 유전자의 염기서열을 확인하였다.About 100 ng of fragment OGH-N / L, 100 ng of fragment PN, 2 μl of 10-fold ligase buffer, 10 units of T4 DNA ligase and distilled water were added so that the total volume was 20 μl, followed by reaction at 16 ° C. for 12 hours. After the reaction, E. coli HB101 (ATCC 33694) was transformed to select ptrp-OST containing a positive enterohormone gene fragment, and these were used as primer 2090 (5'-CATCACCGAAACGCGCGAG-3 ') and primer Using the ptrp (5'-GACAATTAATCATCGAACTA-3 ') was confirmed the base sequence of the whole sheep growth hormone gene according to the dideoxy sequencing method (PNAS 74, 5463 (1977)).
[실시예 4]Example 4
: 대장균으로서의 형질전환 및 양 성장호르몬 유전자 발현의 확인: Confirmation of E. coli transformation and expression of sheep growth hormone gene
상기 실시예 3에서 얻은 ptrp-OST를 함유하고 있는 플라스미드를 발현용 대장균인 W3110(ATTC 27325)에 형질전환시킨 후 이들을 50㎍/ml의 앰피실린이 함유된 액체 LB 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨)에서 12시간동안 진탕배양하였다. 이중 5㎖을 1ι의 M9을 배양액(40mM K2HPO4, 22mM KH2PO4, 8.5mM NaCl, 18.7mM NH4Cl, 1% 글루코스, 0.1mM MgSo4, 0.1mM CaCl2, 0.4% 카사미노산, 10㎍/ml VitB1,40㎍/ml 앰피실린)으로 옮긴 후 37℃에서 약 3-4시간동안 진탕 배양하여 대장균의 성장이 650nm에서 흡광도가 0.5정도가 될 때 여러 가지 농도(0.1mM부터 시작하여 0.1mM씩 증가시켜 1.0mM까지)의 1AA(indoleacrylic acid)를첨가하여 양 성장호르몬 유전자가 발현되도록 하였다.The plasmid containing ptrp-OST obtained in Example 3 was transformed into E. coli W3110 (ATTC 27325) for expression, and these were transformed into liquid LB medium containing 50 µg / ml of ampicillin (1% bactotrypton, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride) was incubated for 12 hours. 5 ml of 1ι M9 medium (40 mM K 2 HPO 4 , 22 mM KH 2 PO 4 , 8.5 mM NaCl, 18.7 mM NH 4 Cl, 1% glucose, 0.1 mM MgSo 4 , 0.1 mM CaCl 2 , 0.4% casamino acid , 10µg / ml VitB 1, 40µg / ml ampicillin) and shake culture at 37 ° C for about 3-4 hours. Increasing 0.1mM by up to 1.0mM (indoleacrylic acid) was added to the expression of both growth hormone genes.
또는 IAA 첨가없이 밤새 배양하여 양 성장호르몬 유전자가 자동적으로 발현되도록 하였다. IAA를 첨가하여 강제로 발현을 유도한 경우에는 IAA를 첨가한 지 약 5시간후에, 자동유도하였을 때는 12시간에서 24시간이 경과한 후에 세포배양액을 원심분리기(Beckman J16-B, Rotor JS 4.2)를 이용하여 3000rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아세포 침전물을 수집하였다. 세포 균질액을 라엠리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970)에 따라 소듐도데실설페이트의 존재하에 12% 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동하여 유전자산물의 발현을 확인하고 이를 제4도에 나타내었다.Or overnight culture without IAA was added so that both growth hormone genes are automatically expressed. When IAA was added to induce expression, the cell culture solution was centrifuged after about 5 hours after IAA addition and 12 to 24 hours after autoinduction (Beckman J16-B, Rotor JS 4.2). Bacterial cell precipitates were collected by centrifugation at 3000 rpm for 25 minutes. Cell homogenates were electrophoresed on 12% polyacrylamide gels in the presence of sodium dodecyl sulfate in accordance with Laemli's method (Laemmli, Nature 227, 680 (1970)) to confirm the expression of the gene product and shown in FIG. .
제4도의 제1열은 양 성장호르몬 유전자를 함유하고 있지 않은 대장균의 단백질 젤 패턴이고, 제2열부터 제9열까지는 ptrp-OST를 함유하고 있는 대장균으로 제2열은 강제유도시 IAA의 농도를 0.1mM로, 제3열은 강제유도시 IAA의 농도를 0.2mM로, 제4열은 강제유도시, IAA의 농도를, 0.3mM로, 제5열은 강제유도시 IAA의 농도를 0.4mM로, 제6열은 강제유도시 IAA의 농도를 0.5mM로, 제7열은 강제유도시, IAA의 농도를 0.6mM로, 제8열은 강제유도시 IAA의 농도를 0.7mM로, 제9열은 강제유도시 IAA의 농도를 0.8mM로 했을 때의 단백질 젤 패턴이다.The first column of FIG. 4 shows the protein gel pattern of E. coli that does not contain both growth hormone genes, and the second column shows E. coli containing ptrp-OST. At 0.1 mM, the third column has a concentration of 0.2 mM at the forced induction IAA, the fourth column has a concentration of the forced induction and IAA at 0.3 mM, and the fifth column has a concentration of 0.4 mM at the forced induction IAA. Row 6, the concentration of forced induction IAA is 0.5 mM, column 7 is the concentration of forced induction, IAA is 0.6 mM, column 8 is the concentration of forced induction IAA is 0.7 mM, and ninth The heat is the protein gel pattern when the concentration of forced induction IAA is 0.8 mM.
제4도로부터 알수 있는 바와 같이 제2열 내지 제9열에서는 약21킬로달톤 위치에 뚜렷한 밴드가 나타났는 바, 양 성장호르몬의 발현을 확인할 수 있었다.As can be seen from FIG. 4, in the second to ninth columns, a distinct band appeared at the position of about 21 kilodaltons, thereby confirming the expression of both growth hormones.
상기 실시예에서 본 발명의 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 갖는 전문가에게 자명한 방법으로 변현되어 수행될 수 있으며, 이러한 변형은 당연히 본 발명의 범주를 벗어나지 않는다.In the above embodiment can be carried out in a manner that will be obvious to those skilled in the art to which the present invention pertains, and such modifications naturally do not depart from the scope of the present invention.
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