JPH11276167A - 新規なモノクローナル抗体及び癌遺伝子産物ｃ−Ｓｋｉタンパク質の免疫学的分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトｃ−Ｓｋｉタンパク質に特異的なモノク
ローナル抗体を提供し、特異性が高く、しかも再現性の
あるｃ−Ｓｋｉタンパク質の免疫学的分析方法を提供す
る。 【解決手段】 本発明のモノクローナル抗体は、ヒトｃ
−Ｓｋｉタンパク質と反応する。本発明の免疫学的分析
方法は、前記モノクローナル抗体を使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトｃ−Ｓｋｉタ
ンパク質に特異的に反応する新規モノクローナル抗体及
び抗体フラグメント、前記モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ、ｃ−Ｓｋｉタンパク質の免疫学的分
析方法、並びに癌化の検出法に関する。ｃ−Ｓｋｉタン
パク質は、細胞性癌遺伝子の１つであるｃ−ｓｋｉ遺伝
子の遺伝子産物である。本発明の前記モノクローナル抗
体又はその抗体フラグメントは、被検試料（例えば、生
体液）中の癌遺伝子産物であるｃ−Ｓｋｉタンパク質の
免疫学的分析方法の試薬として有用である。また、本発
明の免疫学的分析方法を用いると、癌遺伝子産物である
ｃ−Ｓｋｉタンパク質が、動物細胞中で正常な状態から
逸脱して発現されることに伴う細胞の癌化を検出するこ
とができる。

【０００２】

【従来の技術】ｃ−Ｓｋｉタンパク質は、細胞性癌遺伝
子の１つであるｃ−ｓｋｉ遺伝子の遺伝子産物であり、
ヒトｃ−Ｓｋｉタンパク質は、アミノ酸７２８個からな
る約１００ｋＤａのリン酸化タンパク質であり、細胞の
核内に局在する［野村ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１７巻，５４８９〜５５００頁，
（１９８９年）；長瀬ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１８巻，３３７〜３４３頁，（１
９９０年）］。ｃ−Ｓｋｉタンパク質は、Ｃ末端側の約
１／５の領域に存在するα−ヘリックス構造を介して複
合体を形成して存在することが知られている。その複合
体としては、ｃ−Ｓｋｉタンパク質同士からなる２量体
［ｃ−Ｓｋｉタンパク質複合体（ホモダイマー）、以
下、単にホモダイマーと称することがある］、あるい
は、ｃ−Ｓｋｉタンパク質と、別の核内癌遺伝子産物で
あるＳｎｏＮタンパク質との２量体［ｃ−Ｓｋｉタンパ
ク質−ＳｎｏＮタンパク質複合体（ヘテロダイマー）、
以下、単にヘテロダイマーと称することがある］があ
る。これら２種類の複合体のうち、ホモダイマーはＤＮ
Ａに結合しないが、ヘテロダイマーはＤＮＡに結合する
ことができる。このことから、ｃ−Ｓｋｉタンパク質
は、細胞核内においてＳｎｏＮタンパク質と複合体を形
成することにより、他の遺伝子の転写調節領域に結合
し、転写を制御する転写調節因子であると考えられてい
る［長瀬ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２６８巻，１３７１０〜
１３７１６頁，（１９９３年）；ハイマン（Ｈｅｙｍａ
ｎ）ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２６９巻，２６９９６〜２７
００３頁，（１９９４年）］。従って、細胞核内でのｃ
−Ｓｋｉタンパク質の正常状態から逸脱した発現は、細
胞の恒常性を乱す原因となり、細胞の癌化につながるも
のと考えられる。既に、ｃ−Ｓｋｉタンパク質の過剰発
現により細胞の癌化が起こり得ることが報告されている
［コルメナレス（Ｃｏｌｍｅｎａｒｅｓ）ら，Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，第６５巻，４９２９〜
４９３５頁，（１９９１年）］。

【０００３】細胞が様々な活動（例えば、増殖又は分
化）を行う上で、細胞内における機能分子としてのタン
パク質の役割は非常に大きい。タンパク質が機能分子と
して働く際に、特定の存在様式をとることがある。酵素
が活性を発現するときに何らかの金属イオンを分子内に
結合する必要があることなどは良い例である。先に述べ
たように、ｃ−Ｓｋｉタンパク質は、別の核内癌遺伝子
産物であるＳｎｏＮタンパク質と複合体を形成すること
により、他の遺伝子の転写調節領域に結合し、転写を制
御する転写調節因子であると考えられている。すなわ
ち、ｃ−Ｓｋｉタンパク質が機能分子として働くために
は、ＳｎｏＮタンパク質との複合体としての存在様式を
とる必要がある。従って、細胞の癌化を診断する上で、
ｃ−Ｓｋｉタンパク質複合体（ホモダイマー）の量を測
定するだけでなく、ｃ−Ｓｋｉタンパク質−ＳｎｏＮタ
ンパク質複合体（ヘテロダイマー）の量を測定すること
が重要となる。このｃ−Ｓｋｉタンパク質複合体（ホモ
ダイマー）及び／又はｃ−Ｓｋｉタンパク質−ＳｎｏＮ
タンパク質複合体（ヘテロダイマー）の測定を行う際
に、ｃ−Ｓｋｉタンパク質に反応する抗体（特には、モ
ノクローナル抗体の場合）のエピトープは、ｃ−Ｓｋｉ
タンパク質分子上に存在する複合体形成部位以外にある
ことが必要である。

【０００４】従来、ｃ−Ｓｋｉタンパク質複合体（ホモ
ダイマー）及び／又はｃ−Ｓｋｉタンパク質−ＳｎｏＮ
タンパク質複合体（ヘテロダイマー）の測定において、
ｃ−Ｓｋｉタンパク質で免役した動物から得られた抗血
清に含まれているポリクローナル抗体が用いられていた
ので、特異性が低く、再現性に欠けるという欠点があっ
た。このため、ｃ−Ｓｋｉタンパク質に特異的に反応す
るモノクローナル抗体、しかもｃ−Ｓｋｉタンパク質複
合体（ホモダイマー）及び／又はｃ−Ｓｋｉタンパク質
−ＳｎｏＮタンパク質複合体（ヘテロダイマー）の量を
測定することができるモノクローナル抗体の確立が望ま
れていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、従来
技術における前記欠点を解消し、ｃ−Ｓｋｉタンパク質
に特異的なモノクローナル抗体を提供し、特異性が高
く、しかも再現性のあるｃ−Ｓｋｉタンパク質の免疫学
的分析方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】前記の課題は、本発明に
よる、ヒトｃ−Ｓｋｉタンパク質と反応することを特徴
とする、モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント
によって達成することができる。また、本発明は、前記
のモノクローナル抗体又は抗体フラグメント１種以上を
用いることを特徴とする、ｃ−Ｓｋｉタンパク質の免疫
学的分析方法に関する。更には、本発明は、ｃ−Ｓｋｉ
タンパク質を分析することを特徴とする、癌化の検出法
に関する。

【０００７】本明細書において、「ｃ−Ｓｋｉタンパク
質」とは、細胞性癌遺伝子の１つであるｃ−ｓｋｉ遺伝
子の遺伝子産物を意味し、特に断らない限り、ヒトｃ−
Ｓｋｉタンパク質を意味するものとする。ｃ−ｓｋｉ遺
伝子は、種々の動物、例えば、哺乳動物、又は鳥類など
に存在し、その遺伝子にコードされるｃ−Ｓｋｉタンパ
ク質の分子量は、約６０，０００〜１００，０００であ
る。例えば、ヒトｃ−ｓｋｉ遺伝子の塩基配列は、野村
ら［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第
１７巻，５４８９〜５５００頁，（１９８９年）］に開
示されており、ヒトｃ−Ｓｋｉタンパク質は、アミノ酸
残基７２８個からなり、分子量は約１００，０００であ
る。また、ニワトリｃ−ｓｋｉ遺伝子の塩基配列は、ス
トラーブ（Ｓｕｔｒａｖｅ）ら［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，第９巻，４０４６〜４０５１頁，（１９８９
年）］に開示されており、ニワトリｃ−Ｓｋｉタンパク
質は、アミノ酸残基７５０個からなり、分子量は約９
０，０００である。なお、本明細書においては、前記ヒ
トｃ−Ｓｋｉタンパク質を「全ヒトｃ−Ｓｋｉタンパク
質」と称することがあり、ヒトｃ−Ｓｋｉタンパク質か
ら特定の領域を欠失させた各種ｃ−Ｓｋｉタンパク質変
異体と区別することがある。

【０００８】また、本明細書において、「ｃ−Ｓｋｉタ
ンパク質」とは、特に断らない限り、その「ｃ−Ｓｋｉ
タンパク質」がダイマーを形成しているか否かとは無関
係に、１つの単体としての「ｃ−Ｓｋｉタンパク質」を
意味する。従って、例えば、前記のホモダイマー又はヘ
テロダイマーを構成する２つの成分の内の一方である
「ｃ−Ｓｋｉタンパク質」、あるいは、前記ダイマーを
構成していないモノマーとしての「ｃ−Ｓｋｉタンパク
質」などを意味する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体は、
ヒトｃ−Ｓｋｉタンパク質（分子量＝約１００，００
０）と反応する。本発明の好ましいモノクローナル抗体
は、ｃ−Ｓｋｉタンパク質以外のタンパク質とは実質的
に反応しない。また、本発明の好ましいモノクローナル
抗体は、ｃ−Ｓｋｉタンパク質分子上に存在する複合体
形成部位以外の領域と反応する。本発明のより好ましい
モノクローナル抗体としては、例えば、（１）ヒトｃ−
Ｓｋｉタンパク質における第１番目のアミノ酸残基〜第
４５番目のアミノ酸残基からなる領域と反応するモノク
ローナル抗体（以下、本発明の第１のモノクローナル抗
体と称することがある）、又は（２）ヒトｃ−Ｓｋｉタ
ンパク質における第４６番目のアミノ酸残基〜第２６０
番目のアミノ酸残基からなる領域と反応するモノクロー
ナル抗体（以下、本発明の第２のモノクローナル抗体と
称することがある）を挙げることができる。本発明の第
１のモノクローナル抗体（例えば、後述する実施例で得
られるモノクローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−１又はモノクロ
ーナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−３）のエピトープは、ヒトｃ−
Ｓｋｉタンパク質における第１番目のアミノ酸残基〜第
４５番目のアミノ酸残基からなる領域に存在する。ま
た、本発明の第２のモノクローナル抗体（例えば、後述
する実施例で得られるモノクローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−
２又はモノクローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−４）のエピトー
プは、ヒトｃ−Ｓｋｉタンパク質における第４６番目の
アミノ酸残基〜第２６０番目のアミノ酸残基からなる領
域に存在する。

【００１０】本発明のモノクローナル抗体は、例えば、
近年各方面で行われている細胞融合法で作成されたハイ
ブリドーマによるモノクローナル抗体産生法により得る
ことができる。すなわち、ｃ−Ｓｋｉタンパク質を抗原
として使用し、種々のｃ−Ｓｋｉタンパク質及び／又は
ｃ−Ｓｋｉタンパク質フラグメントを用いてスクリーニ
ングを実施することによって、本発明のモノクローナル
抗体を産生する本発明のハイブリドーマを調製すること
ができ、そのハイブリドーマから本発明のモノクローナ
ル抗体を調製することができる。本発明のハイブリドー
マ及びモノクローナル抗体の調製は、常法、例えば、続
生化学実験講座（日本生化学会編）又は免疫生化学研究
法（日本生化学会編）に記載の方法に従って行うことが
できる。

【００１１】本発明のモノクローナル抗体は、そのモノ
クローナル抗体を産生することのできる本発明のハイブ
リドーマ（例えば、マウス・ハイブリドーマ）を、例え
ば、適当な培地又は哺乳動物（例えば、マウス）の腹腔
内で培養することにより製造することができる。本発明
のハイブリドーマは、一般的には、例えば、ｃ−Ｓｋｉ
タンパク質で免疫した哺乳動物又は鳥類（例えば、マウ
ス）の脾臓細胞と哺乳動物（例えば、マウス）のミエロ
ーマ細胞（骨髄腫細胞）とを、Ｎａｔｕｒｅ，第２５６
巻，４９５頁，（１９７５年）に記載の方法により細胞
融合して製造することが可能である。詳細には、下記実
施例に記載の方法によって製造することができる。

【００１２】前記のハイブリドーマを培養することので
きる培地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地
であればよく、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最
小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｅｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａ
ｌ ｍｅｄｉｕｍ：以下、ＤＭＥと称する）にウシ胎児
血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸、及び抗生物質
（ペニシリンＧとストレプトマイシン）を含む培地が用
いられる。前記のハイブリドーマの培養は、培地中で行
う場合には、例えば、５％ＣＯ₂濃度及び３７℃の条件
下で約３日間行う。あるいは、マウスの腹腔内で行う場
合には、例えば、約１４日間行う。

【００１３】このようにして製造された培養液又は哺乳
動物の腹水から、例えば、タンパク質の単離・精製に一
般的に用いられている方法により、本発明のモノクロー
ナル抗体を分離・精製することが可能である。そのよう
な方法としては、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロ
ースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分
子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プ
ロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグ
ラフィー、透析、又は凍結乾燥等を挙げることができ
る。

【００１４】本発明の抗体フラグメントは、本発明のモ
ノクローナル抗体のフラグメントであって、しかも、も
とのモノクローナル抗体と同じ反応特異性を有する抗体
フラグメントである。すなわち、本発明の抗体フラグメ
ントは、ｃ−Ｓｋｉタンパク質、好ましくは分子量約１
００，０００のヒトｃ−Ｓｋｉタンパク質と反応する。
本発明の好ましい抗体フラグメントは、ｃ−Ｓｋｉタン
パク質以外のタンパク質とは実質的に反応しない。ま
た、本発明の好ましい抗体フラグメントは、ｃ−Ｓｋｉ
タンパク質分子上に存在する複合体形成部位以外の領域
と反応する。本発明のより好ましい抗体フラグメントと
しては、例えば、（１）ヒトｃ−Ｓｋｉタンパク質にお
ける第１番目のアミノ酸残基〜第４５番目のアミノ酸残
基からなる領域と反応する抗体フラグメント、又は
（２）ヒトｃ−Ｓｋｉタンパク質における第４６番目の
アミノ酸残基〜第２６０番目のアミノ酸残基からなる領
域と反応する抗体フラグメントを挙げることができる。
本発明の抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａ
ｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、又はＦｖ等が含まれる。これら
のフラグメントは、例えば、本発明のモノクローナル抗
体を常法によりタンパク質分解酵素によって消化し、続
いて、タンパク質の分離・精製の常法に従って得ること
ができる。

【００１５】このようにして得られた本発明の抗ｃ−Ｓ
ｋｉタンパク質モノクローナル抗体及びその抗体フラグ
メントは、他の癌遺伝子産物とは反応せず、ｃ−Ｓｋｉ
タンパク質とだけ特異的に結合する能力を有するので、
ｃ−Ｓｋｉタンパク質がダイマーとして存在するか否か
とは無関係に、ｃ−Ｓｋｉタンパク質の免疫学的分析方
法に用いることができる。

【００１６】本発明の抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質モノクロ
ーナル抗体（例えば、本発明の第１のモノクローナル抗
体及び／又は本発明の第２のモノクローナル抗体）は、
各種の免疫学的分析方法における試薬として使用するこ
とができる。なお、本明細書においては、「分析方法」
には、分析対象物質の存在の有無を確認する検出方法
と、分析対象物質の量を測定する定量方法の両方が含ま
れる。本発明によるｃ−Ｓｋｉタンパク質の免疫学的分
析方法は、ｃ−Ｓｋｉタンパク質に特異的に反応するモ
ノクローナル抗体及び／又は抗体フラグメントを使用す
ることを除けば、それ以外の点では従来公知の免疫学的
分析方法、例えば、イムノブロット定量法、免疫細胞染
色法、免疫組織染色法、酵素免疫定量法、化学発光免疫
定量法、放射性免疫定量法、又はラテックス凝集法など
にそのまま適用することができる。

【００１７】例えば、イムノブロット定量法は、一般的
には１種類又は２種類以上の抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質モ
ノクローナル抗体及び／又は抗体フラグメントを用いて
行うことができる。まず、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動で被検試料（例えば、細胞溶解
質）を処理する。この際に、被検試料をそのまま電気泳
動する代わりに、抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質モノクローナ
ル抗体を固定化した不溶性担体（例えば、アガロースゲ
ル）を用いた免疫沈降法により、被検試料中のｃ−Ｓｋ
ｉタンパク質を予め回収し、回収したｃ−Ｓｋｉタンパ
ク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳
動で処理することもできる。

【００１８】電気泳動に続いて、このゲル中のタンパク
質をニトロセルロース膜又は他の膜に転写し、転写後の
膜を抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質モノクローナル抗体１種類
又は２種類以上（例えば、本発明の第１のモノクローナ
ル抗体及び／又は本発明の第２のモノクローナル抗体）
を含む溶液に１時間程度浸す。反応しなかったモノクロ
ーナル抗体を洗浄により除去した後に、適当な手段（例
えば、放射性同位元素、酵素、又は発光体）で標識した
２次抗体（例えば、標識化抗マウス免疫グロブリン抗
体）を加えて１時間程度インキュベーションする。反応
しなかった標識化抗体を洗浄により除去した後に、前記
標識を検出する反応を行う（例えば、酵素標識の場合に
は、酵素基質を加えて３０分間程度、酵素反応を行
う）。反応終了後、例えば、デンシトメーターを用いた
比色法によって反応の生成物等（例えば、シグナル）を
測定することにより、被検試料中のｃ−Ｓｋｉタンパク
質を定量することができる。

【００１９】また、本発明による２種以上のモノクロー
ナル抗体（ｃ−Ｓｋｉタンパク質との結合部位が互いに
異なるモノクローナル抗体）は、一方のモノクローナル
抗体を固定化した（例えば、マイクロタイタープレート
のウェルに付着させた）形状の試薬とし、もう一方のモ
ノクローナル抗体を適当な手段（例えば、放射性同位元
素、酵素、又は発光体）で標識した形状の試薬とし、こ
れらの試薬と水性液体試料（例えば、細胞溶解質）中の
ｃ−Ｓｋｉタンパク質とを結合させることに基づく免疫
学的分析方法に用いることができる。

【００２０】例えば、酵素免疫定量法は、一般的には、
ｃ−Ｓｋｉタンパク質の互いに異なる抗原決定基を認識
する２種類以上の抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質モノクローナ
ル抗体を用いて行うことができる。まず、例えば、マイ
クロタイタープレートのウェル又はプラスチックチュー
ブを、一次抗体として、１種類以上の抗体（例えば、本
発明の第１のモノクローナル抗体）で感作させる。次
に、このウェル又はプラスチックチューブに、ｃ−Ｓｋ
ｉタンパク質を含む被検試料（例えば、細胞溶解質）
と、二次抗体として酵素標識した別種の抗体（例えば、
本発明の第２のモノクローナル抗体）の溶液とを入れ、
約３０分間静置した後に洗浄し、酵素基質溶液を加えて
３０分間程度、酵素反応を行う。反応終了後、例えば、
比色法等により、被検試料中のｃ−Ｓｋｉタンパク質を
定量することができる。

【００２１】また、化学発光免疫定量法は、一般的に
は、ｃ−Ｓｋｉタンパク質の互いに異なる抗原決定基を
認識する２種類以上の抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質モノクロ
ーナル抗体を用いて行うことができる。まず、マイクロ
タイタープレートのウェル又はプラスチックチューブ
を、一次抗体として、１種類以上の抗体（例えば、本発
明の第１のモノクローナル抗体）で感作させる。次に、
このウェル又はプラスチックチューブに、ｃ−Ｓｋｉタ
ンパク質を含む被検試料（例えば、細胞溶解質）と、二
次抗体として化学発光化合物で標識した別種の抗体（例
えば、本発明の第２のモノクローナル抗体）の溶液とを
入れ、約３０分間静置した後に洗浄し、過酸化水素を加
えて化学発光を起こさせ、ルミノメーターを用いて被検
試料中のｃ−Ｓｋｉタンパク質を定量することができ
る。

【００２２】本発明のｃ−Ｓｋｉタンパク質の免疫学的
分析方法を用いて検出又は測定することのできる被検試
料としては、癌遺伝子産物であるｃ−Ｓｋｉタンパク質
を含むか、あるいは含む可能性のある被検試料であれば
特に限定されるものではないが、生体液（例えば、細胞
溶解質、血液、血清、血漿、又は尿）などを例示するこ
とができる。

【００２３】本発明による抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質モノ
クローナル抗体と、後述する抗ＳｎｏＮタンパク質モノ
クローナル抗体（例えば、特願平０９−０９１６９４号
明細書に記載のモノクローナル抗体）とを組み合わせた
酵素免疫定量法、化学発光免疫定量法、放射性免疫定量
法、又はラテックス凝集法を用いることによって、ｃ−
Ｓｋｉタンパク質−ＳｎｏＮタンパク質複合体（ヘテロ
ダイマー）の量を特異的に測定することができる。

【００２４】例えば、本発明による抗ｃ−Ｓｋｉタンパ
ク質モノクローナル抗体、又は抗ＳｎｏＮタンパク質モ
ノクローナル抗体のいずれか一方を一次抗体とし、もう
一方のモノクローナル抗体を適当な手段（例えば、放射
性同位元素、酵素、又は発光体）で標識して二次抗体と
する。一次抗体を、マイクロタイタープレートのウェル
又はプラスチックチューブに感作させる。次に、このウ
ェル又はプラスチックチューブに、ｃ−Ｓｋｉタンパク
質−ＳｎｏＮタンパク質複合体（ヘテロダイマー）を含
む被検試料（例えば、細胞溶解質）と、二次抗体として
適当な手段で標識したモノクローナル抗体の溶液とを入
れ、以下、前記標識手段に応じて適宜選択することので
きる公知方法により、被検試料中のｃ−Ｓｋｉタンパク
質−ＳｎｏＮタンパク質複合体（ヘテロダイマー）を定
量することができる。

【００２５】標識手段として酵素を用いた場合には、被
検試料及び二次抗体溶液の前記添加の後に、例えば、約
３０分間静置した後に洗浄し、酵素基質溶液を加えて３
０分間程度、酵素反応を行い、反応終了後、例えば、比
色法等により、被検試料中のｃ−Ｓｋｉタンパク質−Ｓ
ｎｏＮタンパク質複合体（ヘテロダイマー）を定量する
ことができる。標識手段として化学発光化合物を用いた
場合には、被検試料及び二次抗体溶液の前記添加の後
に、例えば、約３０分間静置した後に洗浄し、過酸化水
素を加えて化学発光を起こさせ、ルミノメーターを用い
て被検試料中のｃ−Ｓｋｉタンパク質−ＳｎｏＮタンパ
ク質複合体（ヘテロダイマー）を定量することができ
る。

【００２６】本発明による抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質モノ
クローナル抗体１種を使用する酵素免疫定量法、化学発
光免疫定量法、放射性免疫定量法、又はラテックス凝集
法を用いることによって、ｃ−Ｓｋｉタンパク質複合体
（ホモダイマー）の量を特異的に測定することができ
る。

【００２７】例えば、一次抗体として本発明による抗ｃ
−Ｓｋｉタンパク質モノクローナル抗体を、マイクロタ
イタープレートのウェル又はプラスチックチューブに感
作させる。次に、このウェル又はプラスチックチューブ
に、ｃ−Ｓｋｉタンパク質複合体（ホモダイマー）を含
む被検試料（例えば、細胞溶解質）と、二次抗体とし
て、前記モノクローナル抗体（一次抗体として用いたモ
ノクローナル抗体）を適当な手段で標識した標識化モノ
クローナル抗体の溶液とを入れ、以下、前記標識手段に
応じて適宜選択することのできる公知方法により、被検
試料中のｃ−Ｓｋｉタンパク質複合体（ホモダイマー）
を特異的に定量することができる。

【００２８】ホモダイマーは、本発明による抗ｃ−Ｓｋ
ｉタンパク質モノクローナル抗体のエピトープを必ず２
つ有するので、前記の反応溶液中、すなわち、一次抗
体、二次抗体、及びホモダイマーの共存下においては、
ホモダイマーを構成する２つのｃ−Ｓｋｉタンパク質の
内、一方のｃ−Ｓｋｉタンパク質と一次抗体とが結合
し、もう一方のｃ−Ｓｋｉタンパク質と二次抗体とが結
合することができる。それに対して、ホモダイマーを形
成していないｃ−Ｓｋｉタンパク質（例えば、ヘテロダ
イマー又はモノマー）では、エピトープを１つしか有し
ないので、一次抗体と二次抗体とが同時に同一分子に結
合することができない。従って、前記方法を用いること
により、被検試料中のｃ−Ｓｋｉタンパク質複合体（ホ
モダイマー）を特異的に定量することができる。

【００２９】ｃ−Ｓｋｉタンパク質は、細胞核内におい
てＳｎｏＮタンパク質と複合体を形成することにより、
他の遺伝子の転写調節領域に結合し、転写を制御する転
写調節因子であると考えられている。従って、ｃ−Ｓｋ
ｉタンパク質の量的変化及びｃ−Ｓｋｉタンパク質−Ｓ
ｎｏＮタンパク質複合体（ヘテロダイマー）の量的変化
は、細胞の恒常性の乱れ又は異常の発生、例えば、細胞
の癌化につながるものと考えられる。すなわち、ｃ−Ｓ
ｋｉタンパク質の量的変化及びｃ−Ｓｋｉタンパク質−
ＳｎｏＮタンパク質複合体（ヘテロダイマー）の量的変
化は、細胞恒常性の乱れ又は異常の発生（例えば、細胞
の癌化）の有無及び／又は程度を反映していると考えら
れる。従って、本発明のモノクローナル抗体又は抗体フ
ラグメントを用いて、細胞核内における各種状態のｃ−
Ｓｋｉタンパク質を検出することによって、あるいは、
各存在量を測定し、その測定値と健常人の平均値とを比
較することによって、癌化の有無及び／又は癌化の程度
を検出することができる。

【００３０】本発明方法に用いることのできる抗Ｓｎｏ
Ｎタンパク質モノクローナル抗体は、ＳｎｏＮタンパク
質、好ましくは分子量約８０キロダルトンのヒトＳｎｏ
Ｎタンパク質と反応するモノクローナル抗体である。Ｓ
ｎｏＮタンパク質以外のタンパク質とは実質的に反応し
ないモノクローナル抗体であることが好ましい。本明細
書において、「ＳｎｏＮタンパク質」とは、細胞性癌遺
伝子の１つであるｓｎｏＮ遺伝子の遺伝子産物を意味す
る。ｓｎｏＮ遺伝子は、種々の動物、例えば、哺乳動
物、鳥類などに存在し、その分子量は、約８０キロダル
トンである。例えば、ヒトｓｎｏＮ遺伝子の塩基配列
は、野村ら［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ，第１７巻，５４８９−５５００頁，（１９８９
年）］に開示されており、ヒトＳｎｏＮタンパク質は、
６８４個のアミノ酸からなり、分子量は約８０キロダル
トンである。また、ニワトリｓｎｏＮ遺伝子の塩基配列
は、ボイヤー（Ｂｏｙｅｒ）ら［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，第
８巻，４５７−４６６頁，（１９９３年）］に開示され
ており、ニワトリＳｎｏＮタンパク質は、６９０個のア
ミノ酸からなる。ニワトリＳｎｏＮタンパク質の予想さ
れる分子量は約８１キロダルトンである。

【００３１】また、本発明方法に用いることのできる抗
ＳｎｏＮタンパク質モノクローナル抗体は、ＳｎｏＮタ
ンパク質分子上に存在する、ｃ−Ｓｋｉタンパク質とＳ
ｎｏＮタンパク質との複合体形成部位以外の領域と反応
するモノクローナル抗体であることが好ましい。本発明
方法に用いることのできる抗ＳｎｏＮタンパク質モノク
ローナル抗体としては、分子量約８０キロダルトンのＳ
ｎｏＮタンパク質と反応し、しかも、分子量約４２キロ
ダルトンのＣ末端側ＳｎｏＮタンパク質フラグメントと
も反応するモノクローナル抗体がより好ましい。従っ
て、本発明方法に用いることのできる好適なモノクロー
ナル抗体のエピトープは、Ｃ末端側ＳｎｏＮタンパク質
フラグメントに存在する。

【００３２】本明細書において、「Ｃ末端側ＳｎｏＮタ
ンパク質フラグメント」とは、前記のＳｎｏＮタンパク
質全体から、Ｎ末端ポリペプチド部分が欠失したタンパ
ク質フラグメントを意味し、特に「分子量約４２キロダ
ルトンのＣ末端側ＳｎｏＮタンパク質フラグメント」と
は、前記のＳｎｏＮタンパク質全体から、分子量約３８
キロダルトンのＮ末端ポリペプチド部分が欠失した残り
の分子量約４２キロダルトンのタンパク質フラグメント
を意味する。例えば、ヒトＳｎｏＮタンパク質において
は、「分子量約４２キロダルトンのＣ末端側ＳｎｏＮタ
ンパク質フラグメント」として、Ｎ末端から第３１０番
目のアミノ酸〜Ｃ末端アミノ酸からなるタンパク質フラ
グメントを挙げることができる。なお、本明細書におい
ては、前記ＳｎｏＮタンパク質を「全ＳｎｏＮタンパク
質」と称することがあり、前記の分子量約４２キロダル
トンのＣ末端側ＳｎｏＮタンパク質フラグメントを「Ｓ
ｎｏＮタンパク質４２」と称することがある。

【００３３】本発明方法に用いることのできる抗Ｓｎｏ
Ｎタンパク質モノクローナル抗体としては、例えば、 （１）Ｃ末端側ＳｎｏＮタンパク質フラグメントにエピ
トープが存在し、しかも高リン酸化型ＳｎｏＮタンパク
質と反応し、低リン酸化型ＳｎｏＮタンパク質とは反応
しないモノクローナル抗体（例えば、後述する実施例で
得られるモノクローナル抗体ＳｎｏＮ−２又はＳｎｏＮ
−３）； （２）Ｃ末端側ＳｎｏＮタンパク質フラグメントにエピ
トープが存在し、しかも低リン酸化型ＳｎｏＮタンパク
質と反応し、高リン酸化型ＳｎｏＮタンパク質とは反応
しないモノクローナル抗体（例えば、後述する実施例で
得られるモノクローナル抗体ＳｎｏＮ−１）；又は （３）Ｃ末端側ＳｎｏＮタンパク質フラグメントにエピ
トープが存在し、しかも高リン酸化型ＳｎｏＮタンパク
質及び低リン酸化型ＳｎｏＮタンパク質のいずれとも反
応するモノクローナル抗体（例えば、後述する実施例で
得られるモノクローナル抗体ＳｎｏＮ−４）を挙げるこ
とができる。

【００３４】本明細書において、「高リン酸化型Ｓｎｏ
Ｎタンパク質」とは、ＳｎｏＮタンパク質のリン酸化ド
メイン内の特定のアミノ酸（例えば、セリン、トレオニ
ン、又はチロシン）に、細胞内のプロテインキナーゼに
よって多数のリン酸基が転移された状態のＳｎｏＮタン
パク質を意味し、「低リン酸化型ＳｎｏＮタンパク質」
とは、細胞内のホスファターゼにより、高リン酸化型Ｓ
ｎｏＮタンパク質から一部又はすべてのリン酸基が脱離
された状態のＳｎｏＮタンパク質を意味する。

【００３５】本発明方法に用いることのできる抗Ｓｎｏ
Ｎタンパク質モノクローナル抗体は、例えば、近年各方
面で行われている細胞融合法で作成されたハイブリドー
マによるモノクローナル抗体産生法により得ることがで
きる。すなわち、ＳｎｏＮタンパク質を抗原として使用
し、種々のＳｎｏＮタンパク質及び／又はＳｎｏＮタン
パク質フラグメントを用いてスクリーニングを実施する
ことによって、本発明方法に用いることのできる抗Ｓｎ
ｏＮタンパク質モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを調製することができ、そのハイブリドーマから
所望のモノクローナル抗体を調製することができる。前
記ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の調製は、例
えば、本発明のハイブリドーマ及びモノクローナル抗体
に関して先に説明した方法により実施することができ
る。

【００３６】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。

【実施例１】《ｃ−Ｓｋｉタンパク質の調製》 （ａ）全ｃ−Ｓｋｉタンパク質の調製 全ｃ−Ｓｋｉタンパク質（分子量約１００，０００）の
調製は、長瀬ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ，第１８巻，３３７〜３４３頁，（１９９０
年）に記載の方法に従って実施した。すなわち、ヒト癌
遺伝子ｃ−ｓｋｉ−ｃＤＮＡの制限酵素ＮｃｏＩ／Ｅｃ
ｏＲＩ−ＤＮＡ断片（第７１番目のヌクレオチド〜第２
５６２番目のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片）を含む
発現ベクターｐＡＲ２１５６ｓｋｉを大腸菌（Ｅｓｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１株にトランスフォー
メーションして得た大腸菌ＢＬ２１（ｐＡＲ２１５６ｓ
ｋｉ）株（理化学研究所ジーンバンク）を培地中で十分
に増殖させた。次に、ラクトースオペロンの非代謝性誘
導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクシド
（ＩＰＴＧ）を培養液に添加した。

【００３７】１時間培養した後、大腸菌ＢＬ２１（ｐＡ
Ｒ２１５６ｓｋｉ）株を集菌し、溶菌用バッファー［５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ，０．５ｍＭ−ＥＤＴＡ，０．４
Ｍ−ＮａＣｌ，５ｍＭ−ＭｇＣｌ₂ ，５％（Ｖ／Ｖ）グ
リセロール，０．１ｍＭフェニルメタンスルホニルフル
オリド（ＰＭＳＦ），０．１ｍＭジチオトレイトール
（ＤＴＴ），及び１ｍｇ／ｍｌリゾチーム；ｐＨ８．
０］に懸濁し、氷浴中に１時間放置した後、凍結融解を
２回繰り返し溶菌させた。この溶菌液に更に、ＥＤＴＡ
及びノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０を終濃度が
それぞれ１ｍＭ及び０．５％（Ｖ／Ｖ）となるように添
加した後、超音波処理にて可溶化を行った。

【００３８】遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分間）
を行い、沈殿として不溶性画分を得た。この不溶性画分
を洗浄バッファー［１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１ｍＭ−
ＥＤＴＡ，０．４Ｍ−ＮａＣｌ，０．５％（Ｖ／Ｖ）ノ
ニデットＰ−４０，５％（Ｖ／Ｖ）グリセロール，０．
１ｍＭ−ＰＭＳＦ，及び０．１ｍＭ−ＤＴＴ；ｐＨ７．
８］で洗浄し、遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分
間）で得られた最終不溶性画分を可溶化バッファー［５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１％（Ｖ／Ｖ）トリトン（Ｔｒ
ｉｔｏｎ）Ｘ−１００，８Ｍ尿素，５％（Ｖ／Ｖ）グリ
セロール，０．１ｍＭ−ＰＭＳＦ，及び０．１ｍＭ−Ｄ
ＴＴ；ｐＨ８．０］に懸濁した後、氷浴中に２時間放置
した。遠心分離（１００，０００×ｇ，２時間）を行
い、上清を透析バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，
０．２ｍＭ−ＤＴＴ，７０ｍＭ−ＫＣｌ，及び２ｍＭ−
ＭｇＣｌ₂ ；ｐＨ７．４）に対して透析した。

【００３９】こうして得た精製全ｃ−Ｓｋｉタンパク質
（Ａ２８０ｎｍ＝１．０，１０ｍｌ）を免疫原として、
また、抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを選別するためのＥＬＩＳＡ用抗原とし
て、更には、抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質モノクローナル抗
体の認識部位の同定に使用した。

【００４０】（ｂ）ｃ−Ｓｋｉタンパク質から特定の領
域を欠失させた各種ｃ−Ｓｋｉタンパク質変異体の調製 ｃ−Ｓｋｉタンパク質から特定の領域を欠失させた各種
ｃ−Ｓｋｉタンパク質変異体の調製は、長瀬ら，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１８巻，３
３７〜３４３頁，（１９９０年）に記載の方法に従って
実施した。ｃ−ＳｋｉΔ４６−２６０タンパク質（７２
８個のアミノ酸残基からなる全ｃ−Ｓｋｉタンパク質の
４６〜２６０番目のアミノ酸部分を欠失したタンパク
質）は、上記の実施例１（ａ）で調製したｐＡＲ２１５
６ｓｋｉのｃ−Ｓｋｉタンパク質コード領域から制限酵
素ＳｔｕＩ／ＡｐａＬＩによるＤＮＡ断片（２４９２塩
基対からなるコード領域の２０７〜８５３塩基番号に相
当する）を欠失させたｐＡＲ２１５６ｓｋｉΔ４６−２
６０より調製した。ｃ−ＳｋｉΔ２６３−４９０タンパ
ク質（７２８個のアミノ酸残基からなる全ｃ−Ｓｋｉタ
ンパク質の２６３〜４９０番目のアミノ酸部分を欠失し
たタンパク質）は、ｐＡＲ２１５６ｓｋｉのｃ−Ｓｋｉ
タンパク質コード領域から制限酵素ＡｐａＬＩ／Ｅｃｏ
ＲＩによるＤＮＡ断片（２４９２塩基対からなるコード
領域の８５４〜１５４３塩基番号に相当する）を欠失さ
せたｐＡＲ２１５６ｓｋｉΔ２６３−４９０より調製し
た。ｃ−ＳｋｉΔ４９３−７２８タンパク質（７２８個
のアミノ酸残基からなる全ｃ−Ｓｋｉタンパク質の４９
３〜７２８番目のアミノ酸部分を欠失したタンパク質）
は、ｐＡＲ２１５６ｓｋｉのｃ−Ｓｋｉタンパク質コー
ド領域から制限酵素ＥｃｏＲＩによるＤＮＡ断片（２４
９２塩基対からなるコード領域の１５４３〜２４９２塩
基番号に相当する）を欠失させたｐＡＲ２１５６ｓｋｉ
Δ４９３−７２８より調製した。

【００４１】このようにして得たｐＡＲ２１５６ｓｋｉ
Δ４６−２６０、ｐＡＲ２１５６ｓｋｉΔ２６３−４９
０、及びｐＡＲ２１５６ｓｋｉΔ４９３−７２８を、そ
れぞれ別々に大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）ＢＬ２１株にトランスフォーメーションして得た大
腸菌ＢＬ２１（ｐＡＲ２１５６ｓｋｉΔ４６−２６０）
株（理化学研究所ジーンバンク）、大腸菌ＢＬ２１（ｐ
ＡＲ２１５６ｓｋｉΔ２６３−４９０）株（理化学研究
所ジーンバンク）、及び大腸菌ＢＬ２１（ｐＡＲ２１５
６ｓｋｉΔ４９３−７２８）株（理化学研究所ジーンバ
ンク）を培地中で十分に増殖させ、以下、前記の全ｃ−
Ｓｋｉタンパク質の調製方法と同様の方法で精製ｃ−Ｓ
ｋｉΔ４６−２６０タンパク質、精製ｃ−ＳｋｉΔ２６
３−４９０タンパク質、及び精製ｃ−ＳｋｉΔ４９３−
７２８タンパク質を得た。こうして得た精製ｃ−Ｓｋｉ
Δ４６−２６０タンパク質、精製ｃ−ＳｋｉΔ２６３−
４９０タンパク質、及び精製ｃ−ＳｋｉΔ４９３−７２
８タンパク質を、抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質モノクローナ
ル抗体の認識部位の同定に使用した。

【００４２】

【実施例２】《抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質抗体産生ハイブ
リドーマの調製》 （ａ）免疫化した脾臓細胞の調製 前記実施例１（ａ）で得られた全ｃ−Ｓｋｉタンパク質
免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝１．０）を等量のフロイン
ド氏完全アジュバンドと乳化するまで混和し、その混合
液０．１ｍｌをマウス腹腔内に投与することにより免疫
を行った（第１回免疫）。３０日経過後に、そのマウス
に前記と同様の方法で腹腔内に投与した（第２回免
疫）。第２回免疫から、２１日経過後に、全ｃ−Ｓｋｉ
タンパク質免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝１．０）を等量
の生理的食塩水で希釈し、その希釈液０．１ｍｌを、マ
ウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３
日経過後に、マウスから脾臓を無菌的に摘出し、以下の
工程に使用した。

【００４３】（ｂ）細胞融合 無菌的に摘出した前記の脾臓を、１５％ウシ胎児血清を
含むＤＭＥ培地５ｍｌを入れたシャーレーに入れた。次
に、脾臓を１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５
ｍｌで還流して脾細胞を流出させた後、この脾細胞懸濁
液をナイロンメッシュに通した。この脾細胞を５０ｍｌ
遠心チューブに集めて５００×ｇで１０分間遠心した。
こうして得たペレットにヘモライジング溶液（１５５ｍ
Ｍ−ＮＨ₄ Ｃｌ，１０ｍＭ−ＫＨＣＯ₃ ，及び１ｍＭ−
Ｎａ₂ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．０）５ｍｌを加え、懸濁させ
た。０℃で５分間放置すると、懸濁液中の赤血球が破壊
された。１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地１５ｍｌ
を加えてから遠心分離した。このようにして得た細胞ペ
レットをＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生きてい
る脾細胞数を測定した。

【００４４】一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細
胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／０−Ａｇ１４（約２×１
０⁷ 個）に前記脾臓細胞（１×１０⁸ 個）を加え、ＤＭ
Ｅ培地中でよく混合し、遠心分離を行った（５００×
ｇ，１０分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解
きほぐし、３８℃に保温しておいた４０％ポリエチレン
グリコール４０００溶液０．５ｍｌを滴下し、遠心チュ
ーブを手で、１分間穏やかに回転することによってポリ
エチレングリコール溶液と細胞ペレットとを混合させ
た。次に、３８℃に保温しておいたＤＭＥ培地を３０秒
毎に１ｍｌずつ加えてチューブを穏やかに回転させた。
この操作を１０回繰り返した後、１５％ウシ胎児血清を
含むＤＭＥ培地２０ｍｌを加えて、遠心分離（５００×
ｇ，１０分間）を行った。上清を除去した後、細胞ペレ
ットを１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培
地にアミノプテリン４×１０^-7Ｍ、チミジン１．６×１
０^-5Ｍ、及びヒポキサンチン１×１０^-4Ｍになるように
添加したもの）で、遠心法によって２回洗浄した後、前
記ＨＡＴ培地４０ｍｌに懸濁した。

【００４５】この細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレ
ートの各ウェルに２００μｌずつ分注し、５％炭酸ガス
を含む３７℃の炭酸ガス培養器で培養を開始した。培養
中、２〜３日間隔で各ウェルの培地約１００μｌを除
き、新たに前記のＨＡＴ培地１００μｌを加えることに
よりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを選択し
た。８日頃から１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地（Ｄ
ＭＥ培地にチミジン１．６×１０^-5Ｍ及びヒポキサンチ
ン１×１０^-4Ｍになるように添加したもの）に交換し、
ハイブリドーマの増殖を観察するとともに、約１０日目
に、後述するＥＬＩＳＡ法により、抗ｃ−Ｓｋｉタンパ
ク質抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。

【００４６】（Ｃ）ハイブリドーマの樹立 ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無をＥＬＩＳ
Ａ法により測定した。９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート
（Ｉｍｍｕｌｏｎ II；日本ダイナテック株式会社）の
各ウェルに、前述の精製全ｃ−Ｓｋｉタンパク質溶液
（Ａ２８０ｎｍ＝０．０５；生理食塩水で希釈した）を
５０μｌずつ分注し、２５℃で２時間放置した。次に、
０．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含む生理食
塩水（以下、トウィーン２０−生理食塩水と称する）で
３回洗浄した後、各ウェルの培養上清を５０μｌ加え、
２５℃で１時間反応させた。次に、トウィーン２０−生
理食塩水で２００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗マ
ウス免疫グロブリン・ウサギＩｇＧ抗体（ダコ社、デン
マーク）５０μｌを各ウェルに加えた。反応終了後、ト
ウィーン２０−生理食塩水で各ウェルを３回洗浄し、酵
素基質溶液（０．５ｍＭ−４−アミノアンチピリン、１
０ｍＭフェノール、及び０．００５％過酸化水素水を含
む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液；ｐＨ７．４）２５０μ
ｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間反応させ、各ウ
ェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。

【００４７】その結果、２７８ウェル中４ウェルに抗体
産生が認められた。その４ウェル中の各ハイブリドーマ
を２４ウェルプレートに移し、１５％ウシ胎児血清を含
むＨＴ培地で４〜５日間培養した。その後、再度ＥＬＩ
ＳＡ法によって抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質モノクローナル
抗体の産生の有無を確認してから、限界希釈法によりク
ローニングした。１０日後に、ＥＬＩＳＡ法によって抗
ｃ−Ｓｋｉタンパク質特異抗体を産生するハイブリドー
マのクローンをスクリーニングした。その結果、各ハイ
ブリドーマにつき、２０〜４０個の抗体産生クローンが
得られた。これらのクローンの中から、増殖の良い、抗
体分泌能の高い、しかも安定なクローンを選び、前述と
同様の方法により再クローン化を行い、本発明の抗ｃ−
Ｓｋｉタンパク質特異抗体産生ハイブリドーマｃ−Ｓｋ
ｉ−１、ｃ−Ｓｋｉ−２、ｃ−Ｓｋｉ−３、及びｃ−Ｓ
ｋｉ−４を樹立した。

【００４８】

【実施例３】《抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質特異モノクロー
ナル抗体の製造》 （ａ）イン・ビトロ法 マウスハイブリドーマｃ−Ｓｋｉ−１を、１５％ウシ胎
児血清を含むＤＭＥ培地で３７度にて５％二酸化炭素雰
囲気中において７２〜９６時間培養した。培養物を遠心
分離（１０，０００×ｇ，１０分間）した後、上清に固
形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度となるように徐
々に加えた。混合物を氷冷下で３０分間撹拌した後、６
０分間放置し、遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分）
した後、得られた沈渣を少量の１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の１０ｍＭリン
酸緩衝液に対して透析した。

【００４９】これを、１０ｍＭリン酸緩衝液で予め平衡
化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充填した。モノ
クローナル抗体の溶出は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）と０．２Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０）との間で濃度勾配法により行った。
溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で濃縮し、
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し
た。ウシ血清ＩｇＧを除くために、透析物をヤギ抗ウシ
血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムに通した。次に
通過液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化
したプロテインＡ−セファロース４Ｂのカラムに充填し
た。カラムをｐＨ３．５の緩衝液で溶出して、精製した
本発明の抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質特異抗体ｃ−Ｓｋｉ−
１を得た。なお、本明細書においては、各ハイブリドー
マの名称を、そのハイブリドーマから産生されるモノク
ローナル抗体の名称としても使用する。ハイブリドーマ
ｃ−Ｓｋｉ−２、ｃ−Ｓｋｉ−３、及びｃ−Ｓｋｉ−４
についても、ハイブリドーマｃ−Ｓｋｉ−１と同様の前
記操作をそれぞれ実施し、本発明のモノクローナル抗体
ｃ−Ｓｋｉ−２、ｃ−Ｓｋｉ−３、及びｃ−Ｓｋｉ−４
を得た。

【００５０】（ｂ）イン・ビボ法 プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）０．５ｍｌを１０〜１２週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系
マウスの腹腔内に投与し、投与後１４〜２０日目のマウ
ス腹腔内にインビトロで増殖させたハイブリドーマｃ−
Ｓｋｉ−１、ｃ−Ｓｋｉ−２、ｃ−Ｓｋｉ−３、又はｃ
−Ｓｋｉ−４をマウス一匹あたり２×１０⁶ 細胞となる
ように接種した。各ハイブリドーマにつき、一匹のマウ
スから約１０〜１５ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃
度は、５〜１０ｍｇ／ｍｌであった。腹水中のモノクロ
ーナル抗体の精製は、前記のイン・ビトロ法と同様の方
法で行った（但し、ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロー
ス４Ｂのカラムを通す操作を除く）。

【００５１】

【実施例４】《抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質特異モノクロー
ナル抗体の免疫グロブリンクラスの同定》本発明の抗ｃ
−Ｓｋｉタンパク質特異モノクローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ
−１、ｃ−Ｓｋｉ−２、ｃ−Ｓｋｉ−３、及びｃ−Ｓｋ
ｉ−４の免疫グロブリンクラスの同定は、オクテロニー
免疫拡散法により行った。結果を表１に示す。

【００５２】

【表１】モノクローナル抗体 免疫グロブリンのクラス ｃ−Ｓｋｉ−１ ＩｇＧ２ｂ，κ ｃ−Ｓｋｉ−２ ＩｇＧ１，κ ｃ−Ｓｋｉ−３ ＩｇＧ１，κｃ−Ｓｋｉ−４ ＩｇＧ１，κ

【００５３】

【実施例５】《抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質特異モノクロー
ナル抗体の認識部位の同定》抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質特
異モノクローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−１、ｃ−Ｓｋｉ−
２、ｃ−Ｓｋｉ−３、及びｃ−Ｓｋｉ−４の認識部位の
同定は、イムノブロティング法によって行った。実験操
作は以下の通りである。前記実施例１で調製した精製全
ｃ−Ｓｋｉタンパク質及びｃ−Ｓｋｉタンパク質から特
定の領域を欠失させた各種ｃ−Ｓｋｉタンパク質変異体
（ｃ−ＳｋｉΔ４６−２６０タンパク質、ｃ−ＳｋｉΔ
２６３−４９０タンパク質、及びｃ−ＳｋｉΔ４９３−
７２８）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し
た後、ゲル中のタンパク質をニトロセルロースメンブレ
ンに電気的に転写した。このメンブレンを、５％スキム
ミルク及び０．１５Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中に２５℃で３０分間浸
した後、一次抗体として各抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質モノ
クローナル抗体（モノクローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−１、
ｃ−Ｓｋｉ−２、ｃ−Ｓｋｉ−３、又はｃ−Ｓｋｉ−
４）を２５℃で１時間反応させた。この際、ブランクと
して、各抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質モノクローナル抗体の
代わりに、ＳＰ２／０細胞をマウス腹腔に投与して採取
した腹水を反応させた。

【００５４】０．０５％トウィーン−２０及び０．１５
Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）でメンブレンを３回洗浄した後、二次抗体と
してアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ
（バイオラッド社）を２５℃で１時間反応させた。前記
と同様の方法でメンブレンを洗浄した後、５ｍＭ−Ｍｇ
Ｃｌ₂ を含む０．１Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
９．５）に、終濃度０．３３ｍｇ／ｍｌのニトロブルー
テトラゾリウム及び０．１７ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルホスフェート−ｐ−トルイ
ジンを加えた溶液を発色液として用いた。この発色液を
２５℃で５〜１０分間反応させた。反応停止は、メンブ
レンを蒸留水で数回洗浄することで行った。各モノクロ
ーナル抗体と各抗原との結合反応の結果を表２又は表３
に示す。表２又は表３において、「＋」は結合反応性を
有することを示し、「−」は結合反応性がないことを示
す。

【００５５】

【表２】 全ｃ−Ｓｋｉタンパク質 ｃ−ＳｋｉΔ４６−２６０モノクローナル抗体 に対する反応性 タンパク質に対する反応性 ｃ−Ｓｋｉ−１ ＋ ＋ ｃ−Ｓｋｉ−２ ＋ − ｃ−Ｓｋｉ−３ ＋ ＋ ｃ−Ｓｋｉ−４ ＋ − 腹水 − −

【００５６】

【表３】 ｃ−ＳｋｉΔ263−490 ｃ−ＳｋｉΔ493−728モノクローナル抗体 タンパク質に対する反応性 タンパク質に対する反応性 ｃ−Ｓｋｉ−１ ＋ ＋ ｃ−Ｓｋｉ−２ ＋ ＋ ｃ−Ｓｋｉ−３ ＋ ＋ ｃ−Ｓｋｉ−４ ＋ ＋ 腹水 − −

【００５７】表２及び表３の結果から明らかなように、
抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質特異モノクローナル抗体ｃ−Ｓ
ｋｉ−１又はｃ−Ｓｋｉ−３は、全ｃ−Ｓｋｉタンパク
質、ｃ−ＳｋｉΔ４６−２６０タンパク質、ｃ−Ｓｋｉ
Δ２６３−４９０タンパク質、及びｃ−ＳｋｉΔ４９３
−７２８のいずれとも反応する。抗ｃ−Ｓｋｉタンパク
質特異モノクローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−２又はｃ−Ｓｋ
ｉ−４は、全ｃ−Ｓｋｉタンパク質、ｃ−ＳｋｉΔ２６
３−４９０タンパク質、及びｃ−ＳｋｉΔ４９３−７２
８とは反応するが、ｃ−ＳｋｉΔ４６−２６０タンパク
質とは反応しない。すなわち、抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質
特異モノクローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−１及びｃ−Ｓｋｉ
−３の反応部位は、ｃ−Ｓｋｉタンパク質の第１番目の
アミノ酸残基から第４５番目のアミノ酸残基までの領域
に存在する。また、抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質特異モノク
ローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−２及びｃ−Ｓｋｉ−４の反応
部位は、ｃ−Ｓｋｉタンパク質の第４６番目のアミノ酸
残基から第２６０番目のアミノ酸残基までの領域に存在
する。先に述べたように、ｃ−Ｓｋｉタンパク質は、Ｃ
末端側の約１／５の領域に存在するα−ヘリックス構造
を介して複合体を形成することが知られている。その複
合体としては、ｃ−Ｓｋｉタンパク質同士からなる２量
体（ホモダイマー）、あるいは、ｃ−Ｓｋｉタンパク質
と、別の核内癌遺伝子産物であるＳｎｏＮタンパク質と
の２量体（ヘテロダイマー）がある。これらの複合体を
免疫学的手法で捕らえようとするときに、複合体形成に
関与する領域以外の部位をエピトープとして認識するモ
ノクローナル抗体を用いることが望ましい。本発明のモ
ノクローナル抗体であるｃ−Ｓｋｉ−１、ｃ−Ｓｋｉ−
２、ｃ−Ｓｋｉ−３、又はｃ−Ｓｋｉ−４は、いずれも
複合体形成に関与する領域以外の部位をエピトープとし
て認識する。

【００５８】

【実施例６】《抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質特異モノクロー
ナル抗体を用いたイムノブロット定量法》以下の各細胞
の細胞溶解質中のｃ−Ｓｋｉタンパク質の量をイムノブ
ロット法で定量した。使用した細胞は、ＮＢ３９−ｎｕ
（神経芽腫由来細胞）［理化学研究所ジーンバンク］、
ＮＢ１（神経芽腫由来細胞）［理化学研究所ジーンバン
ク］、Ａ４１３（外陰癌由来細胞）［理化学研究所ジー
ンバンク］、ＮＭＳ９２（胃癌由来細胞）［理化学研究
所ジーンバンク］、ＴＣ７８（甲状腺癌由来細胞）［理
化学研究所ジーンバンク］、ＮＭＳ８３（肺癌由来細
胞）［理化学研究所ジーンバンク］、ＪＢＬ−５（Ｂｕ
ｒｋｉｔｔリンパ腫由来細胞）［理化学研究所ジーンバ
ンク］、及びＰＣ３（前立腺癌由来細胞）［理化学研究
所ジーンバンク］である。

【００５９】１３５ｍＭ−ＮａＣｌ、０．９％トリトン
Ｘ−１００、０．９％デオキシコール酸ナトリウム、
０．０９％ＳＤＳ、２２ｍＭ−ＥＤＴＡ、及び１％トラ
ジロールを含む４５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
０．１ｍｌに各細胞（５×１０⁶ 個）を懸濁して、細胞
を溶解させた。各細胞溶解液を遠心分離（１０，０００
×ｇ，１５分間）し、上清を集めた。各上清１０μｌを
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ゲル
中のタンパク質をニトロセルロースメンブレンに電気的
に転写した。このメンブレンを、５％スキムミルク及び
０．１５Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ７．５）中に２５℃で３０分間浸した後、一
次抗体として抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質モノクローナル抗
体ｃ−Ｓｋｉ−１を２５℃で１時間反応させた。

【００６０】０．０５％トウィーン−２０及び０．１５
Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）でメンブレンを３回洗浄した後、二次抗体と
してペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（バイオ
ラッド社）を２５℃で１時間反応させた。前記と同様の
方法でメンブレンを洗浄した後、ＥＣＬウェスタンブロ
ティング検出キット（アマシャム株式会社）を用いて、
ペルオキシダーゼと過酸化水素とによって触媒されるル
ミノールの発光反応を行わせた。この発光をオートラジ
オグラフィーフィルムに感光させ、得られたオートラジ
オグラム上に出現したバンドの強さをデンシトメーター
で測定した。この測定値をグラフ化して図１に示す。一
次抗体として、抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質モノクローナル
抗体ｃ−Ｓｋｉ−１の代わりに、抗ｃ−Ｓｋｉタンパク
質モノクローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−２、ｃ−Ｓｋｉ−
３、又はｃ−Ｓｋｉ−４を用いた時にもほぼ同様の結果
が得られた。

【００６１】

【実施例７】《ワン・ステップ・サンドイッチ酵素免疫
定量法によるｃ−Ｓｋｉタンパク質複合体（ホモダイマ
ー）の測定》ナカネ及びカワオイ［ジャーナル・オブ・
ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２２巻，１０
８４〜１０９１頁，（１９７４年）］の方法に準じて、
西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを抗ｃ−Ｓｋｉタンパク
質モノクローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−２に結合させた。こ
の酵素ラベル抗体を用いてｃ−Ｓｋｉタンパク質のワン
・ステップ・サンドイッチ酵素免疫定量を以下のように
して行った。

【００６２】モノクローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−２を２０
μｇ／ｍｌの濃度で含有する５０ｍＭ炭酸水素ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ９．５）１００μｌを９６ウェル平底型
ポリスチレン型マイクロタイタープレートの各ウェルに
入れて、２５℃で１時間放置した。そのプレートを０．
０５％トウィーン−２０を含む生理食塩水で３回洗浄し
た。このようにして抗体を感作したプレートのウェル
に、被検試料［１３５ｍＭ−ＮａＣｌ，０．９％トリト
ンＸ−１００，０．９％デオキシコール酸ナトリウム，
０．０９％ＳＤＳ，２２ｍＭ−ＥＤＴＡ，及び１％トラ
ジロールを含む４５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
で処理したＮＭＳ８３細胞２５μｌと、前記で調製した
ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−
２、０．１５Ｍ−ＮａＣｌ、及び２％ウシアルブミンを
含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）７５
μｌとを加えた。２５℃で３０分間静置した後、０．０
５％トウィーン−２０を含む生理食塩水でプレートを３
回洗浄した。

【００６３】次いで、酵素基質液［１ｍＭ−２，２’−
アジノ−ジ〔３−エチルベンツチアゾリン−６−スルホ
ン酸〕ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び０．００２５
％過酸化水素水を含む溶液，ｐＨ４．５］２００μｌず
つを各ウェルに加え、２５℃で４０分間反応させた後
に、各ウェルの４０５ｎｍにおける吸光度をマイクロプ
レートリーダー（ＭＰＲ Ａ４ｉ型；東ソー）で測定し
た。別に作成した図２に示す検量線を用いて、前記測定
値からｃ−Ｓｋｉタンパク質複合体（ホモダイマー）の
量を測定することができた。なお、検量線は、被検試料
の代わりに、各種濃度に調製したｃ−Ｓｋｉタンパク質
複合体（ホモダイマー）の溶液を用いて、前記と同様の
操作を繰り返すことにより作成し、１０ｐｇ／ｍｌ〜１
０ｎｇ／ｍｌの範囲で良好なデータを得ることができる
ことを確認した。

【００６４】

【実施例８】《化学発光定量法によるｃ−Ｓｋｉタンパ
ク質−ＳｎｏＮタンパク質複合体（ヘテロダイマー）の
測定》化学発光物質をモノクローナル抗体に結合させる
方法としては、一般的には、スクシンイミド基が導入さ
れた化学発光物質と抗体とを混合し、非結合の化学発光
物質の除去をＰＤ−１０カラム（ファルマシア・バイオ
テク）を用いて実施する。本実施例では、抗体として、
後述の実施例９〜実施例１３で調製及び評価した抗Ｓｎ
ｏＮタンパク質モノクローナル抗体ＳｎｏＮ−４（特願
平０９−０９１６９４号明細書に記載のモノクローナル
抗体）を、そして化学発光物質としてアクリジニウム−
Ｉ（Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ−Ｉ；ドージン）を使用し
た。

【００６５】モノクローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−３を２０
μｇ／ｍｌの濃度で含有する５０ｍＭ炭酸水素ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ９．５）１００μｌをプラスチックチュ
ーブに入れて、２５℃で１時間静置した。そのチューブ
を０．０５％トウィーン−２０を含む生理食塩水で３回
洗浄した。このようにして抗体を感作したチューブに、
被検試料［１３５ｍＭ−ＮａＣｌ，０．９％トリトンＸ
−１００，０．９％デオキシコール酸ナトリウム，０．
０９％−ＳＤＳ，２２ｍＭ−ＥＤＴＡ，及び１％トラジ
ロールを含む４５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で
処理したＮＭＳ８３細胞２５μｌと、アクリジニウム−
Ｉ標識モノクローナル抗体ＳｎｏＮ−４、０．１５Ｍ−
ＮａＣｌ、及び２％ウシアルブミンを含む２０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）７５μｌとを加えた。
２５℃で３０分間静置した後、チューブを０．０５％ト
ウィーン−２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。次い
で、１０ｍＭ過酸化水素水を２００μｌ加え、発光量を
ルミノス９０００Ｄ（ダイアヤトロン）で測定した。別
に作成した図３に示す検量線を用いて、前記測定値から
ｃ−Ｓｋｉタンパク質−ＳｎｏＮタンパク質複合体（ヘ
テロダイマー）の量を測定することができた。なお、検
量線は、被検試料の代わりに、各種濃度に調製したｃ−
Ｓｋｉタンパク質−ＳｎｏＮタンパク質複合体（ヘテロ
ダイマー）の溶液を用いて、前記と同様の操作を繰り返
すことにより作成し、１ｐｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌの範
囲で良好なデータを得ることができることを確認した。

【００６６】

【実施例９】《ＳｎｏＮタンパク質の調製》 （ａ）全ＳｎｏＮタンパク質の調製 全ＳｎｏＮタンパク質（分子量約８０キロダルトン）の
調製は、Ｇｅｎｅ，５６（１９８７）第１２５頁〜第１
３５頁に記載の方法に従って実施した。すなわち、ヒト
癌遺伝子ｓｎｏＮ−ｃＤＮＡのＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ−
ＤＮＡ断片（第６６１番目のヌクレオチド〜第２７８７
番目のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片）を含む発現ベ
クターｐＡＲ２１１３ｓｎｏＮを大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１株にトランスフォーメー
ションして大腸菌ＢＬ２１（ｐＡＲ２１１３ｓｎｏＮ）
株（理化学研究所ジーンバンク）を得た。以下、前記実
施例１（ａ）で得られた大腸菌ＢＬ２１（ｐＡＲ２１５
６ｓｋｉ）株（理化学研究所ジーンバンク）の代わり
に、大腸菌ＢＬ２１（ｐＡＲ２１１３ｓｎｏＮ）株を用
いたこと以外は、実施例１（ａ）に記載の手順を繰り返
すことにより精製全ＳｎｏＮタンパク質を得た。こうし
て得た精製全ＳｎｏＮタンパク質（Ａ２８０ｎｍ＝１．
０，１０ｍｌ）を免疫原として、また、抗ＳｎｏＮタン
パク質モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選別す
るためのＥＬＩＳＡ用抗原として、更には、抗ＳｎｏＮ
タンパク質モノクローナル抗体の認識部位の同定に使用
した。

【００６７】（ｂ）ＳｎｏＮタンパク質からＮ末端ペプ
チド約３８キロダルトンを欠失させたＳｎｏＮタンパク
質変異体の調製 ＳｎｏＮタンパク質４２（約８０キロダルトンの全Ｓｎ
ｏＮタンパク質からＮ末端ペプチド約３８キロダルトン
が欠失したタンパク質で分子量約４２キロダルトン）の
調製は、ヒト癌遺伝子ｓｎｏＮ−ｃＤＮＡの一部分に対
応するＤＮＡ断片（第１５８７番目のヌクレオチド〜第
２７８７番目のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片であ
り、ＳｎｏＮタンパク質のアミノ酸配列番号３１０から
Ｃ末端までのタンパク質フラグメントをコードする）を
含む発現ベクターｐＡＲ２１１３ｓｎｏＮ Δ１−３０
９を大腸菌ＢＬ２１株にトランスフォーメーションして
得た大腸菌ＢＬ２１（ｐＡＲ２１１３ｓｎｏＮ Δ１−
３０９）株（理化学研究所ジーンバンク）を培地中で十
分に増殖させ、以下、前記の全ＳｎｏＮタンパク質の調
製方法と同様の方法で精製ＳｎｏＮタンパク質４２を得
た。こうして得た精製ＳｎｏＮタンパク質４２（Ａ２８
０ｎｍ＝１．０，８ｍｌ）を抗ＳｎｏＮタンパク質モノ
クローナル抗体の認識部位の同定に使用した。

【００６８】

【実施例１０】《抗ＳｎｏＮタンパク質特異抗体産生ハ
イブリドーマの調製》免疫原溶液として、全ｃ−Ｓｋｉ
タンパク質免疫原溶液の代わりに、前記実施例９（ａ）
で得られた全ＳｎｏＮタンパク質免疫原溶液を用いたこ
と、及びＥＬＩＳＡ用抗原として、精製全ｃ−Ｓｋｉタ
ンパク質溶液の代わりに、前記実施例９（ａ）で得られ
た全ＳｎｏＮタンパク質溶液を用いたこと以外は、前記
実施例２（ａ）〜（ｃ）に記載の手順を繰り返した。Ｅ
ＬＩＳＡ法による第１回目のスクリーニングの結果、１
９２ウェル中４ウェルに抗体産生が認められ、これらを
クローニングすることにより、抗ＳｎｏＮタンパク質特
異抗体産生ハイブリドーマＳｎｏＮ−１、ＳｎｏＮ−
２、ＳｎｏＮ−３、及びＳｎｏＮ−４を樹立した。

【００６９】

【実施例１１】《抗ＳｎｏＮタンパク質特異モノクロー
ナル抗体の製造と免疫グロブリンクラスの同定》ハイブ
リドーマとして、ハイブリドーマｃ−Ｓｋｉ−１、ｃ−
Ｓｋｉ−２、ｃ−Ｓｋｉ−３、及びｃ−Ｓｋｉ−４の代
わりに、前記実施例１０で得られたハイブリドーマＳｎ
ｏＮ−１、ＳｎｏＮ−２、ＳｎｏＮ−３、及びＳｎｏＮ
−４を用いたこと以外は、前記実施例３及び実施例４に
記載の手順を繰り返した。得られた抗ＳｎｏＮタンパク
質特異モノクローナル抗体ＳｎｏＮ−１、ＳｎｏＮ−
２、ＳｎｏＮ−３、及びＳｎｏＮ−４の免疫グロブリン
クラスを同定した結果を表４に示す。

【００７０】

【表４】モノクローナル抗体 免疫グロブリンのクラス ＳｎｏＮ−１ ＩｇＧ１，λ ＳｎｏＮ−２ ＩｇＧ１，κ ＳｎｏＮ−３ ＩｇＧ１，λＳｎｏＮ−４ ＩｇＧ１，κ

【００７１】

【実施例１２】《抗ＳｎｏＮタンパク質特異モノクロー
ナル抗体の認識部位の同定》モノクローナル抗体とし
て、抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質特異モノクローナル抗体ｃ
−Ｓｋｉ−１、ｃ−Ｓｋｉ−２、ｃ−Ｓｋｉ−３、及び
ｃ−Ｓｋｉ−４の代わりに、前記実施例１１で得られた
抗ＳｎｏＮタンパク質特異モノクローナル抗体ＳｎｏＮ
−１、ＳｎｏＮ−２、ＳｎｏＮ−３、及びＳｎｏＮ−４
を用いたこと、並びに認識部位同定用タンパク質とし
て、精製全ｃ−Ｓｋｉタンパク質及び各種ｃ−Ｓｋｉタ
ンパク質変異体の代わりに、前記実施例９で得られた精
製全ＳｎｏＮタンパク質及び精製ＳｎｏＮタンパク質４
２を用いたこと以外は、前記実施例５に記載の手順を繰
り返した。各モノクローナル抗体と各抗原との結合反応
の結果を表５に示す。表５において、「＋」は結合反応
性を有することを示し、「−」は結合反応性がないこと
を示す。

【００７２】

【表５】 全ＳｎｏＮタンパク質 ＳｎｏＮタンパク質４２モノクローナル抗体 に対する反応性 に対する反応性 ＳｎｏＮ−１ ＋ ＋ ＳｎｏＮ−２ ＋ ＋ ＳｎｏＮ−３ ＋ ＋ ＳｎｏＮ−４ ＋ ＋ 腹水 − −

【００７３】表５の結果から明らかなように、抗Ｓｎｏ
Ｎタンパク質特異モノクローナル抗体ＳｎｏＮ−１、Ｓ
ｎｏＮ−２、ＳｎｏＮ−３、及びＳｎｏＮ−４は、分子
量約８０キロダルトンの全ＳｎｏＮタンパク質全体と反
応し、しかもこの約８０キロダルトンのタンパク質全体
からＮ末端ペプチド約３８キロダルトンが欠失したタン
パク質（ＳｎｏＮタンパク質４２）とも反応する。すな
わち、抗ＳｎｏＮタンパク質特異モノクローナル抗体Ｓ
ｎｏＮ−１、ＳｎｏＮ−２、ＳｎｏＮ−３、及びＳｎｏ
Ｎ−４の認識部位は、ＳｎｏＮタンパク質の第３１０番
目のアミノ酸からＣ末端までの領域に存在する。

【００７４】

【実施例１３】《抗ＳｎｏＮタンパク質特異モノクロー
ナル抗体を用いたイムノブロット定量法》細胞として、
前記実施例６に記載の各細胞の代わりに、Ａ４１３（外
陰癌由来細胞）［理化学研究所ジーンバンク］、ＮＭＳ
９２（胃癌由来細胞）［理化学研究所ジーンバンク］、
ＴＣ７８（甲状腺癌由来細胞）［理化学研究所ジーンバ
ンク］、ＮＭＳ８３（肺癌由来細胞）［理化学研究所ジ
ーンバンク］、及びＪＢＬ−５（Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ
腫由来細胞）［理化学研究所ジーンバンク］を用いたこ
と、並びに一次抗体として、抗ｃ−Ｓｋｉタンパク質モ
ノクローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−１の代わりに、抗Ｓｎｏ
Ｎタンパク質モノクローナル抗体ＳｎｏＮ−４を使用し
たこと以外は、前記実施例６に記載の手順を繰り返し
た。得られたオートラジオグラム上に出現したバンドの
強さをデンシトメーターで測定し、その測定値をグラフ
化した結果を図４に示す。

【００７５】次に、前記のイムノブロット定量法でＳｎ
ｏＮタンパク質の測定値が最も高かったＮＭＳ８３細胞
（図４参照）について、前記と同様の方法で細胞溶解液
を調製し、Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｙ−ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ
ｓ−（ファルマシア・バイオテク）に従って調製した抗
ＳｎｏＮタンパク質モノクローナル抗体（モノクローナ
ル抗体ＳｎｏＮ−１、ＳｎｏＮ−２、ＳｎｏＮ−３、又
はＳｎｏＮ−４）固定化セファロースゲル（ファルマシ
ア・バイオテク）を用いた免疫沈降法で細胞溶解液中の
ＳｎｏＮタンパク質を回収した後に、ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲルを用いた電気泳動を行った。

【００７６】泳動終了後、ゲル中のタンパク質をニトロ
セルロースメンブレンに電気的に転写した。このメンブ
レンを、５％スキムミルク及び０．１５Ｍ−ＮａＣｌを
含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中に
２５℃で３０分間浸した後、一次抗体として抗ＳｎｏＮ
タンパク質モノクローナル抗体ＳｎｏＮ−４を２５℃で
１時間反応させた。０．０５％トウィーン−２０及び
０．１５Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ７．５）でメンブレンを３回洗浄した後、二
次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ
（バイオラッド社）を２５℃で１時間反応させた。

【００７７】前記と同様の方法でメンブレンを洗浄した
後、ＥＣＬウェスタンブロティング検出キット（アマシ
ャム株式会社）を用いて、ペルオキシダーゼと過酸化水
素とによって触媒されるルミノールの発光反応を行わせ
た。この発光をオートラジオグラフィーフィルムに感光
させ、オートラジオグラムを得た。このオートラジオグ
ラムの結果を図５に示す。

【００７８】図５において、レーンＡは抗ＳｎｏＮタン
パク質モノクローナル抗体ＳｎｏＮ−１固定化セファロ
ースゲル、レーンＢは抗ＳｎｏＮタンパク質モノクロー
ナル抗体ＳｎｏＮ−２固定化セファロースゲル、レーン
Ｃは抗ＳｎｏＮタンパク質モノクローナル抗体ＳｎｏＮ
−３固定化セファロースゲル、レーンＤは抗ＳｎｏＮタ
ンパク質モノクローナル抗体ＳｎｏＮ−４固定化セファ
ロースゲルで予め免疫沈降したサンプルの結果を示す。

【００７９】図５から明らかなように、抗ＳｎｏＮタン
パク質モノクローナル抗体ＳｎｏＮ−１固定化セファロ
ースゲルで予め免疫沈降した場合には、ＳｎｏＮタンパ
ク質の内、電気泳動的移動度の大きい（すなわち、分子
量が小さい）低リン酸化型ＳｎｏＮタンパク質のみが検
出された（レーンＡ参照）。一方、抗ＳｎｏＮタンパク
質モノクローナル抗体ＳｎｏＮ−２又はＳｎｏＮ−３固
定化セファロースゲルで予め免疫沈降した場合には、Ｓ
ｎｏＮタンパク質のうち電気泳動的移動度の小さい（す
なわち、分子量が大きい）高リン酸化型ＳｎｏＮタンパ
ク質のみが検出された（レーンＢ及びレーンＣ参照）。
また、抗ＳｎｏＮタンパク質モノクローナル抗体Ｓｎｏ
Ｎ−４固定化セファロースゲルで予め免疫沈降した場合
には、低リン酸化型及び高リン酸化型ＳｎｏＮタンパク
質が検出された（レーンＤ参照）。

【００８０】実施例１２に示したように、大腸菌で産生
させたリン酸化を受けていないＳｎｏＮタンパク質を、
ニトロセルロースメンブレンに吸着させた場合には、抗
ＳｎｏＮタンパク質モノクローナル抗体４種（モノクロ
ーナル抗体ＳｎｏＮ−１、ＳｎｏＮ−２、ＳｎｏＮ−
３、ＳｎｏＮ−４）のいずれもが反応した。図５の結果
及び実施例１２に示す結果より、それぞれの抗ＳｎｏＮ
タンパク質モノクローナル抗体のエピトープは、Ｓｎｏ
Ｎタンパク質がニトロセルロースメンブレンなどに吸着
してネイティブな構造を保持できない場合には、Ｓｎｏ
Ｎタンパク質のリン酸化状態に依存することなく出現す
るが、ＳｎｏＮタンパク質が溶液中に存在してネイティ
ブな構造を保持することができる場合には、ＳｎｏＮタ
ンパク質のリン酸化状態に基づいて出現することが確認
できた。

【００８１】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、ｃ−Ｓ
ｋｉタンパク質に特異的なモノクローナル抗体であるの
で、被検試料（特には生体試料）中のｃ−Ｓｋｉタンパ
ク質の有効な免疫学的分析方法、すなわち、特異性が高
く、しかも再現性のあるｃ−Ｓｋｉタンパク質の免疫学
的分析方法を提供することができる。また、本発明のモ
ノクローナル抗体を単独で、あるいは、抗ＳｎｏＮタン
パク質モノクローナル抗体と組合わせて用いることによ
り、ｃ−Ｓｋｉタンパク質複合体（ホモダイマー）、又
はｃ−Ｓｋｉタンパク質−ＳｎｏＮタンパク質複合体
（ヘテロダイマー）をそれぞれ特異的に分析することが
できる。更に、本発明の免疫学的測定法によれば、細胞
核内のｃ−Ｓｋｉタンパク質複合体（ホモダイマー）及
び／又はｃ−Ｓｋｉタンパク質−ＳｎｏＮタンパク質複
合体（ヘテロダイマー）の量的変化を捉えることができ
るので、癌化の有無及び／又は癌化の程度を検出するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるモノクローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−
１を用いてイムノブロット法により定量した、種々な細
胞中のｃ−Ｓｋｉタンパク質の発現量を示すグラフであ
る。

【図２】本発明によるモノクローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−
２を用いたワン・ステップ・サンドイッチ酵素免疫定量
法により、各種濃度に調製したｃ−Ｓｋｉタンパク質複
合体（ホモダイマー）の測定を行った検量線を示すグラ
フである。

【図３】本発明によるモノクローナル抗体ｃ−Ｓｋｉ−
３と、抗ＳｎｏＮタンパク質モノクローナル抗体Ｓｎｏ
Ｎ−４とを用いた化学発光定量法により、各種濃度に調
製したｃ−Ｓｋｉタンパク質−ＳｎｏＮタンパク質複合
体（ヘテロダイマー）の測定を行った検量線を示すグラ
フである。

【図４】モノクローナル抗体ＳｎｏＮ−４を用いてイム
ノブロット法により定量した、種々な細胞中のＳｎｏＮ
タンパク質の発現量を示すグラフである。

【図５】リン酸化状態の異なるＳｎｏＮタンパク質に対
するモノクローナル抗体４種の反応特異性をイムノブロ
ット法により確認した結果を示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 石井 俊輔 茨城県つくば市高野台３丁目１番１号 理 化学研究所筑波ライフサイエンスセンター 内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトｃ−Ｓｋｉタンパク質と反応するこ
   とを特徴とする、モノクローナル抗体又はその抗体フラ
   グメント。
2. 【請求項２】 ヒトｃ−Ｓｋｉタンパク質における第１
   番目のアミノ酸残基〜第４５番目のアミノ酸残基からな
   る領域に反応する、請求項１に記載のモノクローナル抗
   体又はその抗体フラグメント。
3. 【請求項３】 ヒトｃ−Ｓｋｉタンパク質における第４
   ６番目のアミノ酸残基〜第２６０番目のアミノ酸残基か
   らなる領域に反応する、請求項１に記載のモノクローナ
   ル抗体又はその抗体フラグメント。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか一項に記載のモ
   ノクローナル抗体を産生することを特徴とする、ハイブ
   リドーマ。
5. 【請求項５】 請求項１〜３のいずれか一項に記載のモ
   ノクローナル抗体又は抗体フラグメント１種以上を用い
   ることを特徴とする、ｃ−Ｓｋｉタンパク質の免疫学的
   分析方法。
6. 【請求項６】 ｃ−Ｓｋｉタンパク質を分析することを
   特徴とする、癌化の検出法。