KR930006757B1 - 종양세포에 세포독성물질의 전달시 전구약물과 배합되는 항체-효소 결합체 - Google Patents

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내용 없음.

Description

종양세포에 세포독성물질의 전달시 전구약물과 배합되는 항체-효소 결합체

제1도는 종양세포에서 항체-효소 결합체와 결합하는 전구약물을 활성화시키는데 이용되는 방법을 설명한 도면.

제2도는 (A) 96.5-AP 면역결합체 ; (B) L6-AP 면역결합체 ; (C) AP ; (D) 모노클로날 항체 96.5 및 (E) 모노클로날 항체 L6의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 분석도(5-12.5% 구배 겔, 비-감소).

제3도는 본 발명의 에토포시드 포스페이트 및 에토포시드 티오포스페이트 전구약물의 제조 및 가수분해 방법을 설명한 도면.

제4도는 (A) 에토포시드-4'-포스페이트 단독, 즉 AP 또는 AP-L6 부재시 ; (B) 에토포시드 단독 ; (C) 에토포시드-4'-포스페이트 전구약물과 AP와의 반응 5분후에 생성된 생성물 ; 및 (D) 에토포시드-4'-포스페이트 전구약물과 본 발명의 L6-AP 결합체와의 반응 5분 후에 생성된 생성물의 고압 크로마토그래피(HPLC)(254㎜에서 모니터함)를 도시한 도면.

제5도는 에토포시드-4'-포스페이트 또는 에토포시드-4'-티오포스페이트가 알칼린 포스파타제에 노출된 시간에 대한 에토포시드의 방출 백분율을 비교 그래프로 나타낸 도면.

제6도는 본 발명의 LP-AP 및 96.5-AP 결합체와 L6 및 96.5 모노클로날 항체의 H3347 종양세포에 대한 결합을 비교 도시한 도면.

제7도는 본 발명의 L6-AP 및 1F5-AP 결합체와 L6 및 1F5 모노클로날 항체의 H3347 종양세포에 대한 결합을 비교 도시한 도면.

제8도는 사멸된 종양세포의 백분율 대 에토포시드 또는 에토포시드 포스페이트 전구약물의 몰 농도를 나타낸 비교 그래표. 이 그래프는 비교적 비-세포독성인 전구약물과 본 발명의 L6-AP 결합체 또는 96.5-AP 결합체와의 반응에 기인한 증대된 사멸 백분율을 도시한 것임.

제9도는 ● : 에토포시드, ○ : EP, □ : L6-AP+EP 또는 ■ : 1F5-AP+EP 처리한 H3347 종양세포의 DNA로의³H-티미딘의 인코포레이션의 저해 백분율을 그래프적으로 도시한 도면. 그래프는 종양세포를 L6-AP 및 EP로 처리하자 EP로 단독 처리한 때보다 세포 독성 활성이 증가했음을 보여준다.

제10도는 본 발명의 결합체로 처리되거나 미처리된 종양에 있어서의 포스파타제 활성을 분석한 도면. 제10a도는 미치리된 새앙쥐에 있어서의 시간에 대한 H3347 종양의 총 포스파타제 활성대 본 발명의 L6-AP 결합체로 24시간전에 처리한 새앙쥐의 상기 활성을 나타낸다. 제10b도는 헤마톡실린 및 에오신 또는 AP기질로 염색한 미처리된 새앙쥐 또는 L6-AP 또는 1F5-AP-예비처리 새앙쥐의 종양 단면도를 나타낸다. 어두운 면은 포스파타제 활성이 높음을 가리킨다.

제11도는 새앙쥐에 있어서 시간에대한 종양부피의 비교 그래프를 나타낸 도면. ● : 미처리, ○ : 에토포시드 처리, ■ : EF 처리, □ : 1F5-AP＋EP 처리, ▲ : L6-AP＋EP처리 화살표는 약물처리 시작점을 표시하며 투여 가능한 경우, 결합체는 18-24시간 미리 투여하였다. 그래프는 L6-AP 및 EP로 처리한데서 관찰된 분명한 항종양 효과를 도시한다.

제12도는 본 발명에 따라 사용된 신규약물인 7-(2'-아미노에틸 포스페이트) 미토마이신("MOP")를 포함하여 미토마이신 유도체의 화학 구조를 나타낸 도면.

제13도는 시간에 대한 MOP와 알칼린 포스파타제 효소와의 반응을 도시한 도면. 반응 경과는 HPLC로 MOH, 즉 MOP의 미토마이신 알코올 유도체의 방출에 대해 모니터하였다.

제14도는 H2981 종양세포에 대한 L6 및 1F5 모노클로날 항체의 결합 및 본 발명의 L6-AP 및 1F5-AP 결합체의 결합을 나타낸 도면.

제15도는 ▲ : 에토포시드, ■ : EP, □ : AP＋EP, ● : L6-AP＋EP 또는 ○ : 1F5-AP＋EP 로 처리한 H2981 종양세포의 DNA로의³H-티미딘 인코포레이션의 저해 백분율을 나타낸 비교 그래프로 나타낸 도면. 그래프는 EP를 단독 사용했을 때보다 본 발명의 L6-AP로 예비처리한 종양세포에서 세포독성 활성이 증가되었음을 나타낸다.

제16도는 □ : 미토마이신 C(MMC), ▲ : MOH, ■ : MOP, △ : MOP＋AP, ● : L6-AP＋MOP 또는 ○ : 1F5-AP＋MOP로 처리한 H2981 종양세포의 DNA로의³H-티미닌 인코포레이션의 저해 백분율을 비교 그래프 도면. 그래프는 MOP를 단독 처리했을 때에 비해 종양세포를 본 발명의 L6-AP 결합체로 예비처리한 후 이어서 MOP로 처리하면 세포 독성 활성이 증가함을 나타낸다.

제17도는 ▲ : MMC, □ : MOH, ■ : MOP, ● : L6-AP＋MOP 또는 ○ : 1F5-AP＋MOP로 처리한 CEM 세포의 DNA로의³H-티미딘 인코포레이션의 저해 백분율을 비교 그래프 도면. 이 그래프는 상기 제16도에 나탄난 향상된 세포독성의특이성을 입증하는데 이것은 L6 항원이 결여된 CEM 세포상에서는 중요한 향상이 보이지 않기 때문이다.

제18도는 ● : 미처리(대조군)되거나 ■ : MOH, ○ : MOP, ▲ : 1F5-AP＋MOP또는 □ : L6-AP＋MOP로 처리된 새앙쥐에 있어서 시간에 대한 종양 부피의 비교 그래프를 나타낸 도면. 화살표는 약물처리 간격을 나타내며 가능한 경우, 결합체는 각 약물 처리보다 18-24시간 전에 투여하였다. 그래프는 종양을 L6-AP＋MOP로 처리했을 때 분명히 항종양 효과가 관찰됨을 나타낸다.

제19도는 ■ : 미처리(대조군)되거나 □ : MOP/EP, ○ : 1F5-AP＋MOP/EP 또는 ● : L6-AP＋MOP/EP로 처리된 새앙쥐에 있어서 시간에 대한 종양부피의 비교그래프를 나타낸 도면. 화살표는 약물처리 간격을 나타내며 가능하면 결합체는 각 약물처리보다 18-24시간 먼저 투여하였다. 그래프는 본 발명의 L6-AP 결합체 및 전구약물인 MOP 및 EP 배합물로 처리한 종양에서 항종양 효과가 분명함을 입증한다.

제20도는 본 발명의 아드리아마이신 전구약물(APO)의 화학구조와 아드리아마이신으로부터의 제조를 나타낸 도면.

제21도는 APO와 △ : 유리 페니실린 V아미다제 효소 또는 ○ 및 □ : 각각 10 및 100㎍ 총 단백질/㎖에서 본 발명의 L6-PVA 결합체와의 반응시 시간에 대한 방출된 아드리아마이신의 백분율을 나타낸 비교 그래프 도면. 반응경과는 HPLC로 모니터 하였다.

제22도는 L6 모노클로날 항체 및 본 발명의 L6-PVA 및 1F5-PVA 결합체의 H2981 종양세포에 대한 결합을 비교하여 나타낸 도면.

제23도는 ○ : 아드리아마이신(ADM), ● : APO, △ : L6-PVA＋APO 또는 ▲ : 1F5-PVA＋APO로 처리한 H2981 종양 세포의 DNA로의³H-티미딘 인코포레이션의 저해 백분율을 나타낸 비교 그래프 도면. 그래프는 APO로 단독 처리했을 때보다 종양세포를 L6-PVA 결합체로 처리한 다음 이어서 APO로 처리했을 때 관찰된 세포 독성 활성이 증가함을 나타낸다.

제24도는 L6 및 1F5 모노클로날 항체와 본 발명의 L6-PVA 및 1F5-PVA 결합체에 대한 다우디 임파종세포의 비교결합을 나타낸 도면.

제25도는 ● : ADM, ○ : APO, ■ : L6-PVA＋APO 또는 □ : 1F5-PVA＋APO로 처리한 다우디 임파종 세포의 DNA로의³H-티미딘 인코포레이션의 저해 백분율을 나타낸 비교 그래프 도면. 그래프는 종양세포를 APO 단독으로 처리했을 때보다 1F5-PVA 결합체로 예비처리한 후 이어서 APO 처리했을 때 관찰된 세포 독성 활성이 증가함을 나타낸다.

제26도는 5-플루오로시토신("5-FC")와 5-플루오로우라실 ("5-FU")의 화학구조를 나타낸 도면. 5-FC는 본 발명에 따라 5-FU로 전환되는 전구약물이다.

제27도는 시토신(cyto)와 ● : CD, ○ : L6-CD 또는 ■ : 1F5-CD과의 반응 또는 5FC와 □ : CD, ▲ : L6-CD 또는 △ : 1F5-CD와의 반응시 시간에 대한 생성물 생성량을 나타낸 비교 그래프 도면. 기질로써 시토신을 사용하여 생성된 생성물은 우라실 이었으며 기질로써 5-FC를 사용하여 생성된 생성물은 5-FU였다. 반응 결과는 분광 광도계로 측정하였다.

제28도는 H2981 종양세포에 대한 L6 모토클로날 항체와 본 발명의 L6-CD 및 1F5-CD 결합체의 비교결합을 나타낸 도면.

제29도는 ● : 5-FU, □ : 5-FC, ○ : L6-CD-FC 또는 ■ : F5-CD＋5-FC로 처리한 H2981 종양세포의 단백질로의³H-류신 인코포레이션의 저해 백분율을 나타낸 비교 그래프 도면. 그래프는 종양세포를 5-FC로 단독 처리했을 때보다 L6-CD 결합체로 예비처리하고 이어서 5-FC로 처리했을 때 세포독성활성이 증가함을 나타낸다.

본 발명은 항체-효소 결합체와 전구약물을 함께 사용함으로써 종양세포에 세포독성물질을 전달하는 새로운 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 말하자면, 본 발명은 종양세포에 결합하는 종양-특이항체-효소결합체를 투여하고, 항체-결합효소의 존재하에서, 종양부위에서 활성 세포독성 약물로 전환하는 전구약물을 부가적으로 투여함으로써 종양부위로 세포독성 약물을 전달하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포독성물질 결합체 및 전구약물을 사용하는 방법은 암 및 기타 종양치료에 이용되는 현행의 항체-매개 약물 전달계의 여러 결점들을 극복한다.

암치료시 종양세포로 세포독성물질을 선별적으로 전달하는 면역결합체의 이용이 이 기술 분야에 알려져 있다. 이러한 물질을 전신에 투여하면 제거되어야할 종양세포뿐 아니라 체내 정상세포마저 종종사멸 시키게 되기 때문에 종양세포가 있는 부위로 세포독성물질을 전달하는 것이 매우 요망되고 있다. 현재 이용되고 있는 항종양 약물 전달계에 따르면, 세포독성물질은 종양-특이 항체와 결합하여 종양세포에 결합하는 면역결합체를 형성함으로써 세포독성물질을 종양부위로 "전달"한다. 이 표적 시스템에 사용되는 면역결합체에는 항체-약물결합체[예컨대 알.더블유.볼드윈의 공동연구자의 "Monoclonal Antibodies For Cancer Treatment" Lancet, pp.603-05(1986.3.15)참조]와 항체-독소 결합체[Monoclonal Antibodies '84 : Biological And Clinical Applications, 에이. 핀체라외 공동연구자 (ed.S), pp,475-506(1985) 중의 피. 이. 토르프 외 공동연구자의 "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy : A Review"]가 있다.

이 두가지 폴리클로날 항체와 모토클로날 항체 모두 이 면역 결합체에서 이용되었다. [예컨대 케이.오가와 외 공동연구자, "Selective In Vitro And In Vivo Growth Inhibition Against Human Yolk Sac Tumor Cell Lines By Purified Against Humanα-Fetoprotein Conjugated With Mitomycin C Via Human Serum Albumin," Cancer Immunol. Immunother., 23, pp.81-86(1986) 및 지.에프.롤란드 외 공동연구자의 "약물국소화 및 인체 종양 크세노그라프트에 있어서의 빈데신-모노클로날 항-CEA결합체의 생육억제 연구" Cancer Immunol. Immunother., 21, pp.183-87(1986)참고]이 면역결합체에 사용된 약물로는 다우노마이신 [예컨대 제이. 갈레고외 공동연구자의 "항종양 활성이 있는 4개의 다우노마이신-모노클로날 항체 791t/36 결합체의 제조" Int.J.Cancer, 33, pp.737-44(1984) 및 알. 아르논외 공동연구자의 "다우노마이신과 항종양 항체와의 결합체의 생체외 및 생체내 효능" Immunological Rev., 62, pp.5-27(1982)참고], 메토트렉세이트 [엔.엔도외 공동연구자의 "인체 혈청 알부민으로 매개된 메토트렉세이트와 항-MM46 모노클로날 항체와의 결합체의 생체외 세포독성" Cancer Research, 47, pp.1076-80(1987)], 미토마이신 C[케이.오가와의 공동연구자의 상기 문헌 참고], 및 빈데신 [지프.에프. 롤란드외 공동연구자의 상기 문헌 참고]을 들 수 있다. 항체-독소 결합체에 사용되는 독소로는 디프테리아 독소와 같은 세균성 독소와 리신과 같은 식물독소를 들 수 있다. [예컨대 에프.엘.물텐외 공동연구자의 "특이 항종양물질로서 잠재성 세포독소에 결합한 항체", Immunol. Rev., 62, pp. 47-73(1982)참고].

여러가지 연구가 치료목적을 위한 면역결합체의 이용에 촛점을 맞추었으나, 이 전달 접근과 관련한 몇가지 제한사항이 드러나기 시작했다. [예컨데.엠,제이,엠블렌톤의 공동연구자의 "모노클로날 항체에 의한 항암 치료제의 겨냥" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 393-395(615차 회의, 벨파스트 1986) 참고] 우선, 세포표면상의 종양관련 항원의 숫자와 주어진 어떠한 항체 분자에 접착할 수 있는 약물 분자의 숫자가 제한되어 있기 때문에 세포를 죽이기 위해 표적세포로 전달되는데 필요한 대량의 약물을 종종 얻을 수 없다. 이 제한은 결합체에 있어 식물 독소와 같은 더욱 강력한 세포독성물질을 사용하게 하였고 약물다용성(multiplicity ratios)이 매우 높은 폴리머-결합항체-약물 결합체를 발달시키게 하였다. [예컨대 피. 이. 토로프의 상기 문헌, pp. 475-506 및 Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, pp. 215-31(알란 알. 리스, Inc. 1985)의 "모노클로날 항체 791T/36-메토트렉세이트 결합체의 목적 및 치료평가" 참고] 그러나, 약물을 대량으로 적하하고 강력한 독소를 사용하여도 많은 면역결합체는 여전히 그다지 적절하지 않은 세포독성 활성을 나타내었으며, 이용 가능한 항원 부위를 모두 이용하는 정도의 투여량으로서도 완전히 사멸시킬 수 없었다.

두번째로, 면역결합체의 세포독성활성이 종종 그의 흡수에 의존하며, 결합체의 항체성분에 의해 종양세포로 매개된다는 것이 인식되어왔다. [예컨대 제이.엠.램버트외 공동연구자의 "인체임파세포와 반응성인 정제 면역독소" J.Biol.Chem., 260(No.22), pp.12035-12041(1985)참고]. 이 내면화(internalization)는 그 약물이 세포내 작용 부위를 갖는 경우의 항체-약물 결합체나 항체-독소 결합체를 사용할 때 매우 중요하다. 그러나, 종양-관련 항원의 대다수와 이들 황원에 결합하는 항체-약물 또는 항체-독소 결합체는 내면화되지 않는다. 내면화되는 결합체들은 약물이나 독소를 분해하는 세포내 리소조옴으로 종종 이동된다. [예컨대, 이.에스.비테타외 공동연구자, Science, 238, pp. 1098-1104(1987) 참고]. 따라서 항체-약물 또는 항체-독소결합체의 종양-결합 특성이 우수하다고 해도, 그의 세포내 작용부위에 도달하는 능력이 없기 때문에 이 결합체의 세포독성 이용성은 제한적이게 된다.

게다가, 종양세포군(tumor cell population)이 항원 발현과는 종종 이질적이라는 것은 잘 입증된 사실이다. [예컨대, 에이.피.알비노의 공동연구자의 "동일한 환자의 상이한 흑색 세포종 전이로부터 유도된 세포주의 당단백질 발현과 표면항원에 있어서의 이질성" J.Exp.Med., 154, pp. 1764-78(1981) 참고]. 더우기 항원-양성 종양세포가 항원-음성 후손을 낳을 수 있다는 것이 입증되었다. [예컨대. 엠.예외 공동연구자의 "모노클로날 항체에 의해 정의된 인체 흑색 세포종 항원의 발현을 위한 클론 변화" J.Immunol., 126(No.4), pp. 1312-17(1981)참고]. 따라서, 어떠한 종양세포군에도 특정한 항원결합체에 대해 특이적인 항원을 갖지 않는 세포가 얼마간 존재하기 마련이다. 이렇게 되면 면역결합체는 이 세포들에 결합할 수 없을 것이고 그들의 사멸을 증개할 수도 없다.

이러한 결점 때문에, 현재 사용되는 항종양 약물이나 독소전달계는 그 성공률이 제한적이었으며 특히 생체내 치료에 사용될 땐 더욱 그러했다.

전술한 면역결합체에 덧붙여, 항체-매개 세포독성을 확대시키기 위해 요오드화물이나 아르스페나민을 그의 독소 형태로 전환시키기 위한 제2비표적 효소와 함께 생체외 항체-효소 결합체가 연구되어왔다. [예컨대, 씨.더블유.파커외 공동연구자의 "루미놀-치환 펩티드 및 단백질의 효소활성과 트래핑. 항종양 항체의 세포독성을 확대시키는 가능한 수단" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72(No 1), pp. 338-42(1975) 및 지.더블유.필포트외 공동연구자의 "항체-글루코스 옥시다제 결합체, 페록시다체 및 아르스페나민과 종양세포의 친화 세포독성", Cancer Research, 34, pp.2159-64(1974) 참고].

이 생체외 연구에 따르면 효소 글루코스 옥시다제를 항체에 결합시키고 비표적 페록시다제와 함께 사용하여 요오드화물이나 아르스페나민을 각각 세포독성 요오드화물이나 아르세니칼로 전환시킨다. 그러므로, 이 접근법은 항체와 함께 종양세포로 글루코스 옥시다제를 표적시켜야 할 뿐 아니라, 종양부위에 2가지 다른 비교적 물질이 존재해야 할 필요가 있다. 이 세가지 물질이 모두 생체내 종양부위에 동시에 존재할 가망성은 적으므로 이 접근방식은 치료용으로는 그리 중요하지 않다.

1987년 1월 20일자 에프.쟌센외 공동발명자의 캐나다 특허 제1,216,791호에는 기질로부터 암모늄 이온을 방출시킬 수 있는 효소를 항체에 결합시키는 것에 대해 기재되어 있다. 암모늄 이온은 종양부위에 표적된 어떤 면역 독소의 세포 독성작용을 강화한다고 한다.

마지막으로, 유럽 특허 출원 제84302218.7호에는 대사할 수 없는 항원을 종양세포로 표적시키는데 항체를 사용하는 종양과 같은 병든 세포군을 치료하는 방법이 기재되어 있다. 항원은 적어도 종양세포의 1% 내에 축적되며, 다음 종양세포는 용해되어 종양부위에 형성된 도처에 산재하는 피브로넥틴 포획 매트릭스로 항원을 방출시킨다. 이 발명에서는 이때, 매트릭스에 접착된 항원에 특이적이고 이 항원에 결합하는 요오드-함유 배위자를 투여한다. 그러면 이 부위에서 세포독성요오드는 종양세포를 죽이는 작용을 한다.

상기 출원에는 많은 변법이 기재되어 있으며 그중 한가지에서는 효소를 종양부위에 표적시키는 항체-효소 결합체를 사용할 것과 효소에 의해 세포독성물질로 전환될 수 있는 비-치명적인 기질을 첨가할 것을 제시하고 있다. [유럽 출원, pp.34-35 참고]. 그러나, 이것을 구체화 할 수 있는 방안이 이 출원의 어디에도 없다. 이와 유사하게 헬수트롬외 공동연구자는 Controlled Drug Delivery(2판, 로빈슨 및 리 편집 p.639(1987)중의 "약물 전달을 위한 항체"에서 "국소화된 어떤물질(예컨대 효소)에 의해 '활성화' 되기전까지는 종양에 대해 비독성인 'd' 약물을 또다른 접근방식으로써 고려할 수 있다"고 하였다.

그러나 오늘날까지는, 상기에 제공된 접근 방식을 어떻게 수행하는지가 기재되거나 제시된 바가 없으며 누구도 실제로 이 방법을 약물 표적에 시도해 본 이가 없다.

본 발명은 항체-효소 결합체와 전구약물을 함께 사용함으로써 종양세포에 독성물질을 전달하는 새로운 방법을 제공함으로써 상기 언급된 문제점들을 겨냥한다. 본 발명에 따라서, 독성이 약하거나 비독성인 전구 약물을 활성적인 세포독성 약물로 전환시킬 수 있는 효소를 종양-특이 항체와 결합시킨다. 이 항체-효소결합체를 종양이 있는 포유류 숙주에게 투여하면, 항체 특이성에 의해, 항체-효소 결합체는 이 항체가 특이성을 보이는 종양 항원을 갖는 종양세포의 표면에 결합하게 된다. 그다음 전구약물을 숙주에게 투여하면 이 전구약물은 항체-결합 효소의 작용에 의해 종양부위에서 더욱 활성적인 세포독성 약물로 전환된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는, 효소 알칼린 포스파타제("AP")를 함유하는 항체-효소 결합체를 신규약물인 에토포시드-4'-포스페이트나 7-(아미노에틸포스페이트)미토마이신 또는 그의 배합물과 병용하여 종양세표를 사멸시켜왔다. 본 발명의 다른 실시예에서는 효소 페니실린 V 아미다제("PVA")를 함유하는 항체-효소 결합체를 신규 약물인 N-(p-히드록시-페녹시아세틸) 아드리아마이신과 함께 사용하여 종양세포를 사멸시켰다. 본 발명의 또다른 실시예에서는 효소 시토신 데아미나제("CD")를 함유하는 항체-효소 결합체를 신규 약물인 5-플루오로시토신과 함께 사용함으로써 종양세포를 사멸시켰다.

본 발명의 면역결합체와 전구체는 본 발명의 적어도 한가지의 면역결합체 또는 전구약물과 약리적으로 허용되는 담체를 함유하는 것과 같은 항종양 조성물에 이용될 수 있다. 게다가, 면역결합체와 전구약물은 배합되어 사용될 수 있고 또한 본 발명의 조성물을 포유류에게 약리적으로 유효한 양으로 처리하는 단계로 이루어진 포유류에 있어서의 종양치로방법에도 이용될 수 있다.

유리하게도, 본 발명의 방법, 면역결합체, 전구약물, 약리적 조성물 및 배합물은 종양세포에 세포독성약물을 전달하는데 있어 비교적 간단하고 직접적인 방법을 제공하며, 종래의 항체-지향 면역요법 기술에 내재된 이질적인 항원 발현, 항원/항체 내면화 및 불충분한 약물강도를 피하면서 향상된 세포독성 선택성을 나타낸다.

본 발명은 종양세포로 세포독성 물직을 전달하는 새로운 방법에 관한 것으로써 기타 종양뿐 아니라 암종 및 흑색 세포종과 같은 암의 치료시 종양세포를 선택적으로 사멸시키는 개선된 사멸법을 제공한다.

본 발명의 방법에 따라, 항체-효소 결합체를 종양이 있는 포유류 숙주에게 투여한다. 이 항체-효소 결합체는 종양세포에 대해 모약물보다 세포독성이 약한 전구약물을 보다 활설적인 모약물로 전환시킬 수 있는 효소와 이에 결합된 종양 특이 항체로 구성된다.

종양세포상에서 발견되는 항원과 반응성인, 결합체의 항체성분은 숙주내로 도입되면 결합체를 종양부위로 지향시켜 종양세포에 결합시킨다. 이렇게 하여 항체는 효소를 종양부위로 전달시키는 것으로 볼 수 있다.

다음 효소의 기질인 전구약물을 숙주내로 도입시켜, 종양부위에서 효소에 의해 활성 세포독성 약물로 전환시킨다. 이리하여 약물은 세포외로 활성화되며 이 부위의 종양세포 모두에, 즉 그 항원에 대해 음성적임에도 불구하고 종양부위에 존재하는 세포들 뿐만 아니라 결합체의 항체가 특이성을 보이는 특정 종양항원을 가지며 그것에 항체가 결합되는 세포 모두에 확산될 수 있다(제1도에 참고). 그러므로 본 발명의 방법은 종래의 면역결합체 약물 전달기술과 관련한 종양 항원 이질성과 항원/결합체 내면화 요구성을 극복한다.

더우기, 본 발명은 약물이 항체로 직접 결합할 것을 요구치 않으며 따라서 전달될 수 있는 약물의 양을 제한하지 않으므로 종양부위에서 흔히 발생하는 약물 강도문제가 일어나지 않는다. 실제로, 본 발명은 종양부위에 존재하는 활성 약물분자의 수를 증폭하는데 이것은 결합체의 항체-결합효소가 여러가지 기질 대사를 수행하여 전구약물을 활성 약물로 반복 전환시킬 수 있기 때문이다. 게다가, 본 발명의 방법은 다른 조직에서 방출시키는 것과 반대로 종양부위에서 특이적으로 활성약물을 방출시킬 수 있다. 이것은 항체-효소결합체로 종양세포를 코팅하는 것에 기인하여 종양부위에서의 효소농도가 다른 조직에서의 효소농도보다 높기 때문이다.

본 발명의 면역결합체의 항체성분은 종양-관련 항원에 특이적으로 결합하는 어떠한 항체든지 포함한다. 이러한 항체의 예로는 암종, 흑색 세포종, 임파종 및 뼈 및 연조직육종, 기타 종양에서 발견되는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 들수 있으나 이들로 한정하는 것은 아니다.

더 연장된 기간동안 세포표면에 결합된 채 남아있거나 매우 서서히 내면화되는 항체들이 바람직하다. 이 항체들은 폴리클로날 일 수 있고, 바람직하게는 모노클로날 일 수 있으며 본래의 항체분자 또는 항체의 활성 결합영역, 예컨대 Fab 또는 F(ab')₂를 함유하는 단편일 수 있으며, 이 분양의 기술에 잘 알려진 기술을 이용하여 생산할 수 있다.[예컨대, 알.에이.드웨거외 공동연구자. "클로람부실-항체 복합체에 의한 쥐의 임파종 및 흑색 세포종 세포의 제거" Immunological Rev., 62, pp.29-45(1982)(결합체로서 제조 사용되는 종양-특이 폴리클로날 항체) ; 엠.예외 공동연구자, "흑색 세포종 항체에 의해 확인되는 인체 흑색 세포종의 세포 표면 항원", Proc. Natl. Acad. Sci., 76, p.2927(1979) ; 제이.피.브라운외 공동연구자의 " 모노클로날 항체에 의한 인체 흑색세포종-관련 항원 p97의 구조적 특성화" J.Immunol., 127(No2), pp.539-546(1981)(종양-특이 모노클로날 항체가 생산) ; 및 Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy(알.더블유.볼드윈외 편집, pp.53-64 아카데미 출판 1985)중의 제이.피.매취외 공동연구자의 "Improvement of Colon Carcinoma Imaging ; From Polyclonal Anti-CEA Antibodies And Static Photoscanning To Monoclonal Fab Fragments And ECT" (종양세포로 국소화시키기 위해 생산, 이용되는 항체 단편) 참고]. 덧붙여, 만약 모노클로날 항체가 사용되면 항체는 쥐 또는 인간유래 또는 키메릭 항체일 수 있다. [예컨대, 브이.티.오이. "키메릭 항체", Biotechniques, 4(No.3), pp.214-221(1986) 참고].

본 발명의 면역 결합체의 효소 성분은 전구약물을 보다 활성적인 세포독성 형태로 전환시키는 방식으로 전구약물에 작용할 수 있는 효소이면 어느것이든 포함한다. 본 출원에서 사용되는 "전구약물"이라는 용어는 모 약물에 비해 종양세포에 대해 세포독성이 약하며 효소적으로 활성화시킬수 있거나 보다 활성적인 모형태로 전환시킬 수 있는 약리적으로 활성인 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 가리킨다. [예컨대, 디.이.브이.윌만의 "암화학 요법에 있어서의 전구약물", Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382(615차 회의, 벨파스트 1986) 및 브이.제이.스텔라외 공동연구자의 "전구약물 : 표적 약물 전달에 대한 화학적 접근" Directed Drug Delivery, 알 보커르트외 공동연구자편, pp.247-267(휴마나 출판 1985)참고].

본 발명의 방법에 유용한 효소들로는 포스페이트-함유 전구약물을 유리약물로 전환시키는데 유용한 알칼리 포스파타제, 설페이트-함유 전구약물을 유리약물로 전환시키는데 유용한 아릴설파타제, 비독성 5-플루오로시토신을 항암약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제, 세라티아 프로테아제, 써모리신, 서브티리신, 카르복시펩티다제류 및 카댑신류(카댑신 B 및 L과 같은)와 같이 펩티드-함유전구약물을 유리약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제류, D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물로 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제류, 글리코실화된 전구약물을 유리약물로 전환시키는데 유용한 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제와 같은 탄수화물 분해 효소, β-락탐으로 유도된 약물을 유리약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제 및 그의 아민 질소에서 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기로 유도된 약물을 각각 유리약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제와 같은 페니실린 아미다제류 등을 들 수 있으나 이들로 한정시키는 것은 아니다.

다른 방법으로는, 이 기술분야에서 앱자임(abzyme)으로도 알려져 있는 효소활성이 있는 항체를 사용하여 본 발명의 전구약물을 유리활성약물로 전환시킬 수도 있다. [예컨대 알.제이.매씨, Nature, 328, pp.457-458(1987)참고]. 항체-앱자임 결합체는 앱자임을 종양세포군으로 전달하기 위해 여기 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 이와 유사하게, 본 발명의 전구약물로는 예컨대 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스 페이트-함유 전구약물, 설페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산 변형 약물, 글리코실화된 전구약물, β-락탐-함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 5-플루오로유리딘 전구약물등과 같이 결합체의 효소에 의해 더욱 활성적인, 세포독성 유리약물로 전환될수 있는 기타의 상술한 전구약물을 들 수 있으나 이들로 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 사용되기 위해 전구약물형태로 유도될 수 있는 세포독성 약물로는 에토포시드, 테니포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 블레오마이신류, 에스페라미신류 [미국특허 제4,675,187호] 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 관련된 질소 겨자류를 들 수 있다.

본 발명의 효소들은 이질이작용기 교차결합시약 SPDP(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프리피오네이트) 또는 SMCC(숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트를 사용하는 것과 같은 본 관련분야에 잘 알려진 기술을 사용하여 본 발명의 항체에 공유적으로 결합시킬 수 있다. [예컨대, 피.이.토로프외 공동연구자의 "항체-독소 결합체의 제조 및 세포독성특성", Immunological Rev. 62, pp.119-58(1982) : 제이.엠.램버트외 공동연구자의 상기문헌 p.12038 : 지.에프.롤랜드외 공동연구자의 상기 문헌, pp. 183-84 및 제이.갈레고외 공동연구자의 상기문헌, pp.737-38 참고] 다른 한편, 적어도, 본 발명의 효소의 관능적으로 활성인 부위에 결합하는 본 발명의 항원결합 부위로 최소한 구성되는 응합 단백질은 관련분야에 잘 알려진 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다. [예컨대, 엠.에스.노이버지외 공동연구자, Nature, 312, pp. 604-608(1984) 참고]. 이 융합 단백질들은 기본적으로는 여기에 기재된 항체-효소 결합체와 같은 방식으로 작용한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 인체 암 항원에 특이적인 항체를 효소 알칼린 포스파타제와 결합시키고, 본 발명의 방법에 따라 사용함으로써 에피포도필로톡신 배당체의 4'-포스페이트 유도체를 활성적인 항암약물로 전환시킨다. 이러한 유도체에는 에토포시드-4'-포스페이트, 에토포시드-4'-티오포스페이트 및 테니포시드-4'-포스페이트를 들 수 있다(제3도에서 이유도체들의 구조 참고 : 테니포시드 유도체는 도시된 구조의 당부분상의 메틸기 대신 2-티에닐기를 갖는다).

본 발명의 다른 구체예에는 포스페이트 부분이 배당체상의 다른 히드록실 기에 위치한 이 배당체들의 포스페이트 유도체를 함유할 수 있다. 그러나 보다 바람직한 실시예에서는 본 발명에서 전구약물로 사용된 포스페이트 유도체가 에토포시드-4'-포스페이트, 또는 에토포시드-4'-티오포스페이트이다.

본 발명에 따라, 알칼린 포스파타제 (AP)를 인체 폐 암종 세포상에서 당단백질 항원에 결합하는 IgG2a항원인 L6 모노클로날 항체에 공유 결합시켰다[아이. 헬스트롬외 공동연구자, "대부분의 인체 암종과 반응하는 IgG2a항체인 L6의 항종양 효과 "Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 83, pp. 7059-63(1986) 참고]. 얻어진 면역 결합체는 결합되지 않은 효소에 비교했을 때 효소 활성이 전혀 감소되지 않았다. 덧붙여, L6항체의 결합 활성은 면역결합체에서 유지되었다.

생체의 세포독성 분성을 이용하여 본 발명자들은 인체 암종세포주로부터의 세포를 L6-AP 면역결합체로 처리하고 이어서 세포를 에토포시드 포스페이트 전구약물을 노출시키고자 암세포에 에토포시드만을 단독으로 사용한 것과 필적할만한 세포독성을 나타냈음을 입증하였다. 이와 대조적으로, 에토포시드 포스페이트를 단독으로 사용하면 세포독성을 거의 나타내지 않았다.

게다가 본 발명자들의 제모한 쥐에 대한 생체내 연구는 L6-AP 면역결합체가 L6-양성종양 크세노그라프트로 국소화함을 입증하였다. 이종양들을 조직학적으로 평가한 결과 표적 AP효소가 종양 덩어리 전체에 분포함을 나타냈다.

덧붙여, L6-AP 면역결합체는 피하에 L6-양성종양을 갖는 제모한 새앙쥐에 결합체를 투여하고 이어서 에토포시드 포스페이트 전구약물로 처리하는 치료실험시 강력한 생체내 항종양 활성을 갖는 것으로 입증되었다. 이 처리의 항종양 효과는 몇몇 종양의 완전한 억제를 포함하며 전구약물이나 모약물 단독으로 처리한 경우의 효과보다 우수했다.

본 발명의 또다른 바람직한 구체예에 따라, L6-AP 면역결합체를 신규의 미토마이신 포스페이트 전구약물을 활성 미토마이신 약물로 전환하는데 사용하였다. 에토포시드 포스페이트 전구약물의 경우처럼, 결합체의 AP 효소는 전구약물로부터 포스페이트기를 제거하여 활성 항종양 물질을 방출시킨다. 본 실시예의 미토마이신 포스페이트 전구약물은 포르피로마이신 또는 미토마이신 C의 N⁷-C_1-8알킬 포스페이트 유도체, 또는 약리적으로 허용되는 그의 염일 수 있다. N⁷은 모약물의 미토산 핵의 제7-위치에 결합한 질소원자를 가리킨다. 보다 바람직한 실시예에서는 유도체로 7-(2'-아미노에틸포스페이트) 미토마이신("MOP")을 사용한다(제12도에서 미토마이신 C의 구조 및 디나트륨염 형태인 MOP의 구조 참고 ; MOP에 상응하는 포르피로마이신 유도체는 미토마이신 C의 아지리딘 질소상에 메틸기를 갖는다). 다른 한편, MOP 화합물은, 9a-메톡시-7-[[(포스포노옥시)에틸]아미노]미토산 디나트륨염으로도 불린다. 본 발명의 다른 구체예에서는 전구약물로서 N⁷-알킬 미토마이신 포스포로티오에이트류를 사용할 수도 있다.

생체의 연구결과, 인체 폐 종양주로부터 유래한 세포를 L6-AP 면역결합체로 처리하고 이어서 세포를 MOP에 노출시키자 종양세포에 항종양제인 미토마이신을 단독 사용하였을때와 필적할만한 세포독성이 나타났다. 종양세포에 미토마이신 포스페이트 전구약물을 단독 사용하면 세포독성이 거의 나타나지 않았다. 이와 유사하게 L6-AP 면역결합체는 인체 폐종양이 있는 제모한 생앙쥐에게 결합체를 투여하고 이어서 미토마이신 포스페이트 전구약물로 처리하는 생체내 치료 실험시 분명한 항종양효과를 나타내었다. 이 항종양 효과는 전구약물 단독, 모약물 단독, 또는 비결합 상태-AP 결합체로 주어진 전구약물을 사용했을 때보다 훨씬 컸다.

본 발명의 또다른 실시예에서는, 페니실린 아미다제 효소를 L6 모노클로날 항체에 공유 결합시키며 결과적인 면역결합체를 사용하여 신규의 아드리아마이신 전구약물을 활성 항종양 약물인 아드리아마이신으로 전환시켰다. 사용된 특징 아미다제는 페녹시아세틸 아미드 결합을 가수분해시키는 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)으로부터 분리한 페니실린 V 아미다제("PVA")였다. 특정 전구약물로는 N-(p-히드록시페녹시아세틸) 아드리아마이신("APO")을 사용하였으며, 이것은 아미다제에 의해 가수분해되어 강력한 항종양 물질인 아드리아마이신을 방출시킨다. L6-PVA 면역결합체는 비결합효소에 비했을 때 효소활성을 전혀 상실하지 않았으며 L6 항체의 대부분의 결합 활성은 결합체에서 보존되었다.

본 발명자들의 생체외 연구에서 인체 폐 종양 세포를 L6-PVA 결합체로 처리한 후 세포를 APO 전구약물에 노출시키자 아드리아마이신으로 세포를 단독 처리했을 때에 견줄만한 세포독성을 나타내었다. 중요하게도, APO 전구약물 단독으로는 종양세포에 훨씬 낮은 세포독성을 나타냄이 입증되었다.

이와 유사한 생체외 연구가 1F5-PVA 결합체를 사용하여 수행되었는데, 1F5-PVA 중의 PVA 효소는 임파종 세포에서 발견된 항원과 반응성인 모노클로날 항체인 1F5에 결합되어 있다. 다우디 임파종 세포를 1F5-PVA 결합체로 처리하고 이어서 세포를 APO에 노출시키자 세포를 아드리아마이신 단독으로 처리했을 때와 필적할 만한 세포독성을 나타냈으며, 반면 세포를 APO로 단독 처리하자 매우 낮은 세포독성이 결과되었다.

비록 신규의 아드리아마이신 전구약물인 N-(p-히드록시페녹시아세틸) 아드리아마이신을 합성 및 사용하는 것을 본 명세서에 기재하였으나, 본 발명이 실제로 같은 방식으로 유도될 수 있는 그밖의 관련된 아드리아마이신 전구약물의 합성 및 사용도 포함하고 있음을 이해하여야만 한다. 예컨대, 전구약물인 N-(페녹시아세틸) 아드리아마이신 또한 이 전구약물이 여기에 기재된 프로토콜에 따라 합성될 수 있으며 반응물인 p-히드록시페녹시아세트산을 페녹시아세트산으로 대치한 점에서 본 발명의 범주에 든다고 볼 수 있다(다음의 실시예4참고). 게다가, 본 발명의 아드리아마이신 전구약물에는 여기에 기재된 히드록실기가 아닌 페닐고리상의 치환제를 함유하는 N-페녹시아세틸 유도체 뿐만 아니라 페닐고리의 다른 위치에서 치환된 아드리아마이신의 다른 N-히드록시페녹시아세틸 유도체도 포함함을 이해하여야 한다.

더우기, 본 실시예는 특정 아미다제가 전구약물을 활성적인 항종양 형태로 가수분해시킬 수 있는 것과 같이 상응하게 유도된 기타의 전구약물 뿐 아니라 면역결합체의 효소 성분으로서, 페니실린 G 아미다제와 같은 기타 아미다제류를 사용하는 것도 포함한다. 예컨대, 효소로 페니실린 G 아미다제를 사용할 경우 전구약물에는 페닐아세틸아미드기(APO의 페녹시아세틸아미드에 상반되는)가 함유되어야 하는데 이것은 페니실린 G 아미다제가 이 형태의 아미드 결합을 분해하기 때문이다. [예컨대 에이.엘, 마골린외 공동연구자 Biochim.Biophys.Acta, 616, pp.283-89(1980) 참고]. 그러므로, 본 발명의 기타 전구약물들에는 N-(p-히드록시페닐아세틸) 아드리아마이신, N-(페닐아세틸) 아드리아마이신 및 아드리아마이신의 기타 임의로 치환된 N-(페닐아세틸) 유도체들이 있다.

본 발명이 모약물의 아민기를 페녹시아세트산, 페닐아세트산 또는 기타 관련산의 카르복실기와 반응시킴으로써 유도되는 모든 전구약물을 포함함을 이해하여야 한다. 그러므로, 본 명세서에 기재된 아드리아마이신 전구약물과 실제로 동일한 방식으로 유도되고 작용할 수 있는 아드리아마이신외의 안트라시클린류의 전구약물들도 본 발명의 범주에 속한다고 할 수 있다.

예컨대, 본 발명에 따라 제조 및 사용될 수 있는 기타 전구약물로는 다우노마인신 및 카르미노마이신과 같은 안트라시클린류의 히드록시페녹시아세틸아미드 유도체, 히드록시 페닐아세틸아미드 유도체, 페녹시아세틸아미드 유도체 및 페닐아셀틸아미느 유도체를 들 수 있다. 멜팔란, 미토마이신, 아마노프테린, 블레오마이신 및 닥티노마이신과 같은 아민-함유 약물들도 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형시켜 본 발명의 전구약물을 생산할 수 있다.

그러므로 본 발명이 다음의 일반식(Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 화합물을 포괄함은 분명한 사실이다.

상기 일반식중, R¹은 H, R³은 OH 또는 OCH₃이거나, R¹은 OH이고 R³은 OCH₃이며, R²는 H 또는 OH이고

상기 일반식중, R¹은 H, R³은 OH 또는 OCH₃이거나, R¹은 OH이고 R³은 OCH₃이며, R²는 H 또는 OH이다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시예는 효소 시토신 데아미나제("CD")를 L6 모노클로날 항체에 결합시키는 것을 포함한다. 데아미나제 효소는 항종양 활성이 결여된 5-플루오로시토신("5-FC")을 강력한 항종양 약물인 5-플루오로우라실("5-FU")로 전환시키는 것을 촉진한다(제24도 참고). 이리하여 본 발명의 L6-CD 면역결합체를 전구약물 5-FC를 5-FU로 전환시키는데 사용하여 생체외에서 종양세포에 커다란 세포독성 효과를 미쳤다.

명세서에 기록된 본 발명의 면역결합체의 경우에서처럼 L6-CD결합체는 결합에 기인한 효소적 또는 결합 활성에 있어서 심각한 손실을 나타내지 않았다. 더우기 본 발명자들의 생체외 연구결과 인체 폐 종양 세포를 L6-CD 결합체로 처리한 다음 이어서 세포를 전구약물 5-FC에 노출시키자 세포를 강력한 항종양제인 5-FU 단독으로 처리했을 때 나타난 것과 동일한 세포독성 효과를 나타냄이 입증되었다.

이러한 종양세포를 전구약물 단독으로 처리하면 세포독성 효과가 보잘것 없었다.

본 명세서의 포괄적인 자료로부터 본 발명의 면역결합체/전구약물 배합물이 세포독성 활성이 감소된 전구약물을 투여하고 이 전구약물을 항체-표적 효소의 존재에 의해 종양세포부위에서 세포독성이 높아진 상태로 전환시키는 종양세포를 사멸시키기 위한 선택적인 메카니즘을 제공한다는 것은 분명한 사실이다. 더우기, 이 방법에 의해 획득된 세포독성은 종래의 항체-표적 기술보다 향상된 것으로 그 이유는 종양부위에서 방출된 활성 약물이 상술한 바와 같이, 항체-약물 결합체 전달 시스템에 수반되는 물리적 제약에 의해 방해받지 않기 때문이다. 그러므로, 본 발명의 방법이 암과 기타 종양의 치료시 종양세포와 관련하여 선택적인 세포독성을 향상시키는 방법을 제공한다는 것은 분명한 사실이다.

본 발명의 방법의 또다른 실시예는 여러가지 전구약물과 오직 하나의 항체-효소 결합체를 사용하는 배합물 화학 치료요법의 방법을 제공한다. 이 실시예에 따라 면역결합체의 동일한 효소에 대해 모두 기질이 되는 몇가지 전구약물을 사용한다. 이렇게 하여, 특정한 항체-효소결합체는 몇가지 전구약물을 세포독성 형태로 전환시켜, 종양부위에서 증가된 항종양 활성을 나타낸다. 예컨대 인간의 폐 종양을 갖는 제모한 새앙쥐에게 본 발명의 L6-AP 면역결합체를 투여하고, 이어서 신규의 전구약물, 즉 에토포시트 포스페이트 전구약물 및 미토마이신 포스페이트 전구약물의 배합물로 처리하는 생체내 연구에서 분명한 항종양 효과를 얻었다. 유사하게, 항종양 항체-AP 결합체로 처리한 후 에토포시드 포스페이트, 아드리아마이신 포스페이트[미국특허 제4,185,111호 참고] 및 5-플루오로유리딘 모노포스페이트[예컨대 Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol., 54, pp.57-119 씨. 하이델버거외 공동연구자 "불화 피리미딘 및 그들의 뉴클레오시드류" 참고]를 투여하자 종양부위에서 예컨대 에토포시드, 아드리아마이신 및 5-플루오로유리딘과 같이 강력한 항종양 약물의 배합물이 생성되었다.

또 다른 실시예에 따라서, 결합체의 효소성분을 변화시키는 여러가지 상이한 면역결합체를 사용한다. 각 면역 결합체는 그의 상응하는 전구약물 또는 전구약물들을 종양부위에서 세포독성 형태로 전환시키는데 이용될 수 있다. 예컨대, 항종양 항체는 AP와 결합하여 하나의 결합체를 형성할 수 있으며 시토신 데아미나제와 결합하여 다른 결합체를 형성할 수 있다. 다음 두개의 면역결합체 모두를 종양이 있는 숙주에게 투여하면 종양부위에서 항체특이성을 통해 종양 항원에 결합하게 된다. 전구약물 에토포시드 포스페이트 및 5-플루오로시토신을 투여하면 종양부위에서, 모두 강력한 항종양제인 에토포시드와 5-플루오로우라실을 생성시킨다.

본 발명의 또다른 실시예는 목적하는 종양상의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 갖는 각각의 면역결합체를 여러개 사용함으로써 결합체의 항체성분의 특이성이 변하는 면역결합체를 여러개 사용하는 것을 포함한다. 이 면역결합체의 효소성분은 같을 수도 변할 수도 있다. 이 실시예는 특히 종양 표면상의 다양한 항원의 양이 알려져 있지 않은 상태에서 연구자가 충분히 효소가 종양부위에 표적되는 것을 확실히 하길 원하는 경우에 특히 유용하다. 종양에 대해 상이한 항원 특이성을 갖는 결합체를 여러개 사용하면 종양부위에서 전구약물 또는 일련의 전구약물들을 전환시키기 위해 충분한 효소를 얻을 수 있는 가망성이 증가된다. 덧붙여, 이 실시예는 종양에 대해 고도의 특이성을 획득하는데 있어 중요한데 그 이우는 정상적인 조직이 동일한 종양 관련 항원을 모두 가질 가능성은 적기 때문이다.[아이.헬스트롬외 공동연구자 "Monoclonal Antibodies To Two Determinants of Melanoma-Antigen p97 Act Synergistically In Complement-Dependent Cytotoxicity" J.Immunol., 127(No.1), pp.157-160(1981) 참고].

본 발명은 또한 임 및 기타 종양의 치료를 위한 약리적 조성물, 배합물 및 방법을 포함한다. 더욱 구체적으로 말하면, 본 발명은 포유류 숙주를 약리적 유효량의 항체-효소 결합체 또는 결합체들 및 약리적 유효량의 전구약물 또는 전구약물들로 약리적으로 함유하는 배합물들을 포함한다. 본 발명의 배합물 및 방법은 인간, 개, 고양이 및 말을 포함한 모든 포유류를 치료하는데 유용하다.

바람직한 실시예에 따라, 항체-효소 결합체는 숙주내로 전구약물을 도입하기에 앞서서 투여한다. 결합체의 항체를 표적화하고 효소를 종양부위에 위치시키기 위해서는 결합체 투여와 전구약물 투여사이에 충분한 시간 간격을 두어야 한다. 이러한 충분한 시간은 사용하는 결합체에 따라 12시간에서 1주일이다.

본 발명의 결합체와 전구약물은 정맥내, 복강내, 경구, 임파내로 투여할 수 있으며 또는 종양에 직접 투여할 수 있으나 결코 이에 한정되는 것은 아니다. 정맥내 투여가 바람직하다.

본 발명의 조성물-면역결합체 또는 전구약물을 함유하는 액상 용액 또는 현탁액, 정제, 알약, 분말제, 좌약, 폴리머 마이크로 캡슐제 또는 마이크로베지클, 리포좀 및 주사가능하거나 주입 가능한 용액과 같이 다양한 투여 형태를 취할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 바람직한 형태는 투여 방식 및 치료 적용에 따라 다르다. 예컨대, 결합체 단백질은 경구적으로, 예컨대 정제형태로 투여될 경우 위에서 분해되기 쉬우므로 항체-효소 결합체를 경구투여하는 것은 바람직스럽지 못하다.

결합체 또는 전구약물의 조성물도 인체 혈청 알부민, 이온 교환제, 알루미나, 레시틴, 포스페이트와 같은 완충기질, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트 및 프로타민 셀페이트와 같은 염 같은 전해질과 같이 기술분야에 알려져 있는 보조제 및 종래의 약리적으로 허용되는 담체를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물을 위한 가장 효과적인 투여형태 및 복용 섭생은 병의 위증도 및 경과, 환자의 건강 및 치료에 대한 반응 및 치료하는 의사의 판단에 의존한다. 따라서, 면역결합체 및 전구약물의 복용량은 환자 개개인에 따라 적절히 고려되어야 한다.

그러나 대체로 본 발명의 항체-효소 결합체의 유효 투여량은 약 1.0-약 100mg/m²범위라고 할 수 있다.

본 발명의 전구약물의 유효 투여량은 사용한 특정 전구약물과 그것을 유도한 모약물에 의존한다. 전구약물은 모약물보다 세포독성이 약하기 때문에 전구약물은 모약물이 기술분야에서 인식되는 양을 초과하여 사용한다. 예컨대, 에토포시드 전구약물의 유효 투여량은 약 75-500㎎/m²정도이다. 미토마이신 포스페이트 전구약물의 유효투여량은 약 50-1000mg/m²정도이다. 아드리아마이신 전구약물의 유효투여량은 약 15-150㎎/m²이다. 그리고, 5-플루오로시토신 및 기타 5-플루오로유리딘 유도체의 유효투여량은 약 600-2000mg/m²이라 할 수 있다.

본 명세서에 기재된 본 발명을 좀 더 잘 이해시키기 위해 실시예들을 다음에 기재하였다. 이 실시예들은 설명 목적만을 위한 것으로써 본 발명의 범주를 어떤 형식으로든 제한시키고자 함이 아님을 이해하여만 한다.

[실시예 1]

다음의 실시예는 항체-결합 알칼린 포스파타제를 사용하여 에토포시드 포스페이트 전구약물을 에토포시드로 전환시켜 본 발명의 방법에 의해 입증된 종양세포에 대한 생체의 세포독성 및 생체내 항 종양효과를 일으키기 위한 면역 결합체의 용도 및 본 발명의 방법을 나타낸다.

[본 발명의 항체-알칼린 포스파타제 결합체의 제조]

본 실시예에서는 효소 알칼린 포스파타제(AP)에 결합된 모노클로날 항체 L6, 96.5 또는 1F5로 이루어진 3가지 면역결합체를 제조 및 연구한다. L6은 인체 폐 암종 세포상의 당단백질 항원에 특이적으로 결합하는 IgG2a 부류의 모노클로날 항체이다. [아이.헬스트롬의 공동연구자, (1986) 상기문헌 참고] 96.5는 p97, 흑색세포종-관련 항원에 특이적인 모노클로날 IgG2a 항체이다. [제이.피.브라운의 공동연구자 "모노클로날 항체를 이용한 인체 흑색세포종-관련 항원 p97의 구조적 특성화" J.Immunol., 127(No.2), pp.539-46(1981) 참고]. 1F5는 정상 및 종양 B 세포상의 CD-20항원에 특이적인 모노클로날 IgG2a 항체이다[이.에이.클라크외 공동 연구자 "인체 B-세포 활성화에 있어서 B_P35 세포 표면 폴리펩티드의 역할" Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82, pp.1766-70(1985) 참고]. L6 모노클로날 항체를 생산하는 L6 하이브리도마는 1987년 1월 14일자 공개된 유럽특허출원 제207963호와 관련하여 기탁번호 제HB8677호로 Americal Type Culture Collection (ATCC)에 기탁되었다. 1F5 모노클로날 항체를 생산하는 1F5 하이브리도마는 1988년 2월 12일 ATCC 제HB9645호로 ATCC에 기탁되었다. 96.5 모노클로날 항체는 시판하고 있다.

항체-효소 결합체는 제이.엠.램버트외 공동연구자의 "인체 임파양세포와 반응성인 정제면역독소"[J.Biol.Chem., 260(No.22), pp.12035-12041(1985)]에 기재된 것과 유사한 방법에 의해 티오에테르 결합을 통해 AP를 모노클로날 항체 L6, 96.5 또는 1F5와 공유적으로 결합시켜 제조하였다. 한가지 실험 프로토콜에 따라, 결합체인 L6-AP 및 96.5-AP를 다음과 같이 제조하였다. 2-이미노티올란의 최종농도가 1.3mM이 되도록 2-이미노티올란(pH8.0 10mM EDTA와 함께 0.5M 트리에탄올아민 히드로클로라이드중 50mM )을 L6 또는 96.5 항체 8.0㎎/㎖ 용액에 첨가하였다. 0℃에서 90분후 용리액으로서 pH7.2에서 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 사용하여 세파덱스 G-25상에서 겔여과시켜 반응을 정지시켰다. 항체와 2-이미노티올란의 반응은 설피드릴기를 도입하였으며, 그 숫자는 엘만시약을 사용하여 1.9-3.5로 결정하였다[피.더블유.리들즈의 공동연구자., "엘만시약 : 5.5'-디티오비스(2-니트로벤조산)-재시험" Analytical Biochemistry, 94, pp.75-81(1979) 참고].

pH 7.0에서 100mM 포스페이스 완충액중의 알칼린포스파타제(송아지 내장, 뵈링거 만하임, 10㎎/㎖)를 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(설포-SMCC)(피어스 화학사, 디메틸 포름아미드(DMF)중 20mM)로 처리하여 설포-SMCC의 최종농도가 2.4mM가 되게 하여있다. 30분후 30℃에서, 변형 효소를 G-25 세파덱스상에서 겔여시켜 정제하고 PBS로 용출시켰다.

다음 변형된 AP를 2 : 1몰비율로 티올화시킨 항체에 첨가하였다. AP를 설포-SMCC와 반응시키면 효소에 말레이미도기가 도입되는데 이 말레이미도기는 각각의 변형된 항체상에서 설피드릴기와 반응시키면 항체와 AP 사이에 티오에테르 결합 형성시키게 된다. 미반응 티올이 조금이라도 남는것을 막기위해 반응시간 1시간후에 요오드아세트아미드(최종 농도 1mM )를 단백질 용액에 첨가하고, 용출액으로서 PBS를 사용하여 세파크릴 S-300 컬럼상에서 결합체를 정제시켰다. 280㎜에서 분획을 모니터하고 각 분획(6,4000배로 희석)의 AP 활성은 기질로서 p-니트로페닐포스페이트를 사용하여 pH9.5에서 분석하였다[P.Tijssen, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, pp. 366-67, (Elsevier Press 1985)참고]. AP-항체 비율이 적절한 결합체를 함유하는 분획들을 5-12.5% 구배 겔 상에서 SDS-PAGE로 결정하고(제2도 참고) 수집하였다. 항체 0.1% 용액과 AP의 흡광도가 각각 1.4 및 0.76D'S인 280㎜에서 단백질 농도를 결정하였다. 겔에 대해 변성조건을 취하자 자연상태에서는 분자량 140kd이고 호모-다이머로 존재하던 AP가 70kd의 싱글 밴드로 이동하였다. 이 70kd 단백질 밴드는 고분자 결합체 밴드도 포함하는 컬럼의 겔에서 관찰되었는데 그 이유는 효소의 서브유니트중 하나가 공유적으로 결합된 항체-효소 결합체로부터 분해되기 때문이다(제2도 레인 A 및 레인 B 참고). S-300 세파크릴 컬럼상에서의 겔 여과는 결합체 제제에 유리효소가 존재하지 않음을 가리켰다.

본 발명자들은 또한 본 발명의 L6-AP 및 1F5-AP 결합체를 제조하기 위해 두번째의 유사한 실험 프로토콜을 사용하였는데 여기서는 항체를 이미노티올란(0.5mM)으로 변형시켜 단일의 유리 티올기를 도입하고 SMCC의 최종 농도가 1.0mM이 되도록 AP를 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)(피어스화학사, Rockford, Illinois) 변형시켰다. 다음 변형 단백질을 결합시키고 얻어진 결합체를 S-300 세파크릴 상에서 겔 여과에 의해 정제시켰다. 이어서 SDS-PAGE 분석을 하자 이 결합체 제제들에는 비결합 단백질과 응집체가 없는 것으로 나타났다. 상술한 바와 같이, 제제의 단백질 농도는 280㎜(이 파장에서 항체용액(분자량 : 160kd) 1㎎/㎖과 AP(분자량: 140 kd)의 흡광도는 각각 1.4 및 0.76임)에서의 흡광도에 의해 측정하였다.

[전구약물인 에토포시드 전구약물 및 에토포시드 티오포스페이트의 제조]

본 발명의 다음 공정에 따라, 항체-효소 결합체를 신규의 에토포시드 포스페이트 또는 에토포시드 티오포스페이트 전구약물과 반응시켰다. 더욱 구체적으로는, 제3도에 도시된 구조식을 갖는 에토포시드의 4'-디나트륨 포스페이트 에스테르 및 에토포시드의 4'-디나트륨 티오포스페이트 에스테르를 각각 전구약물로 사용하였다.

에토포시드 포스페이트와 에토포시드 티오포스페이트는 에토포시드를 각각 옥시염화인 또는 염화 티오포스포릴과 반응시켜 디클로로포스페이트 또는 디클로로티오포스페이트 중간체를 생산시켜 합성하였다. 포스포릴화 반응은 예컨대 아세토니트릴과 같은 적합한 무수 유기 용매중에서, 바람직하게는 3차아민염기, 예컨대 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재하에서 수행하였다. 반응의 경과는 박충크로마토그래피(TLC)로 모니터 하였는데 TLC에 의해 최적 반응시간을 생성물의 출현 또는 출발 물질의 소실에 의해 판정하였다. 본 발명자들의 경험상, 반응은 사용한 인시약의 품질에 따라 약 4시간에서 약 72시간까지 걸리는 것으로 나타났다. 디클로포스페이트 또는 디클로로티오포스페이트 중간체를 각각 디나트륨 포스페이트 또는 티오포스페이트 전구약물로 가수분해시키는 반응은 물증의 중탄산나트륨 용액(20-50배 초과)을 반응 혼합물에 직접 첨가한 다음 혼합물을 실온에서 각각 1.5시간 또는 3시간동안 교반시킴으로써 수행하였다. 에틸아세테이트와 물로 분배시킨 다음 물-메탄올을 이용하여 수층을 역상 크로마토그래피 처리하자 진공상태에서 수성매질을 동결건조 또는 증발시킨 후 목적하는 전구약물이 생상되었다.

본 발명의 방법에서 전구약물의 하나로 사용된 에토포시드의 4'-디나트륨 포스페이트 유도체의 보다 구체적인 제조방법은 다음과 같다 :

자력 교반시킨 건조 아세토니트릴(210㎖) 중의 에토포시드(브리스톨-마이어즈사, 2.30g, 3.91m㏖)현탁액을 거의 완전한 용액이 될때까지 데우고, 실온으로 냉각시킨 다음 N,N-디이소프로필에틸아민(2.36㎖, 13.5m㏖)으로 처리하였다. 다음 이 혼합물을 0℃까지 냉각시키고 시린지를 통해 염화포스포릴 POCl₃(666㎎, 4.34m㏖)로 30초간 처리하였다. 혼합물을 2-3시간에 걸쳐 서서히 실온에 이르게 하고 실온에서 63시간동안 교반하였다.

이 기간에 말기에, 반응 혼합물을 탈이온화시킨 H₂O(110㎖) 중에서 중탄산나트륨(6.0g, 71.4m㏖)용액으로 처리하고, 혼합물을 실온에서 80분간 교반시킨 다음, 중탄산나트륨 포화수용액(20㎖), 탈이온화시킨 H₂O(125㎖) 및 에틸 아세테이트(350㎖)로 분배하였다. 유기층은 탈이온화시킨 H₂O(1×50㎖)로 더 추출하고 결합수층은 에틸아세테이트(250㎖)로 세척한 다음 실온에서 1시간동안 0.5㎜진공 처리하여 용해된 용매를 제거하였다. 다음 수성부분을 메탕올중에 충진시킨 실리카겔에 접착된 옥타데실실란(C-18) 15㎝를 함유하는 직경 4㎝ 관에 적용시킨 다음 H₂O로 평형시켰다. 수성부분을 모두 적용한 뒤, 관을 H₂O(175㎖)로 용출시켜 무기염을 제거한 다음 생성물을 물중의 20% 메탄올로 용출시켰다. 0.5토르에서 용매를 농축시켜 순수한 에토포시드 포스페이트 화합물 744㎎(36%)을 무색의 고체로써 얻었다. 다른 한편, 동결건조시키면 순수한 화합물이 복슬복슬한 저밀도 고체로 얻어진다.

다른 실시예에 따라 본 발명의 에토포시드 포스페이트 전구약물을 다음과 같이 제조하였다 :

자력 교반시킨 건조 아세토니트릴(450㎖) 중의 에토포시드(10.50g, 17.84m㏖, 80℃/0.5 토르에서 P₂O₅로 건조) 현탁액을 디이소프로필에틸아민(4.20㎖, 24.1m㏖)으로 처리하였다. 다음 디페닐 클로로포스페이트(2.00㎖, 9.65m㏖)시린지를 통해 첨가하였다. 혼합물을 N₂하에서 50℃로 2시간동안 교반시키자 이 온도에서 에토포시드가 모두 용해되었다. 디페닐 클로로포스페이트(1.80㎖, 8.68m㏖)를 부가적으로 첨가하고 반응 혼합물을 45℃에서 72시간동안 정치시켰다. 아민 염기(0.75㎖)와 디페닐 클로로포스페이트(0.80㎖, 3,86m㏖)를 좀 더 첨가하고, 혼합물을 40-45℃에서 27시간 동안 교반시키고, 디페닐 클로로포스페이트(0.4㎖)로 더 처리한 다음 40-45℃에서 22시간동안 유지시켰다. 다음 이소프로판을 (20㎖)을 첨가하고, 용매를 진공으로 다음 교체 잔사를 CH₂Cl₂(500㎖)로 용해시키고, H₂O(400㎖)로 분배하였다. 수송은 CH₂Cl₂(100㎖)로 더 추출하고 결합 유기추출물을 소금물(250㎖)로 세척한 다음(Na₂SO₄/MgSO₄)로 건조시켰다. 회전증발시킨 다음 CH₂Cl₂중의 2-3% CH₃OH를 사용하여 실리카겔 상에서 플래쉬 크로마토스래피 처리하여 에토포시드-4'-디페닐 포스페이트 12.50g(85%)를 무색의 고체로 얻었다.

다음, 새로 마개를 딴 병(알드리치화학사)으로부터의 산화 백금(0.198g, 0.87m㏖)을 순수 에탄올 95㎖중의 에토포시드-4'-디페닐 포스페이트(0.79g, 0.962m㏖)용액에 첨가하였다. 용액을 40-50 프시하에서 실온에서 4시간동안 Parr 장치로 수소첨가시켰다. 반응 혼합물을 용리액으로 에탄올을 사용하여 셀라이트 패드를 통해 여과시켰다. 진공농축시키고 P₂O₅로 진공에서 14시간동안 건조시켜 에토포시드-4'-포스페이트를 백색의 고체(0.627, 94%)로써 얻었다.

FAB MS m/e 669(M+H)⁺

IR(KBr) 3440,2930,1778,1604,1498 ㎝^-1

¹H NMR(DMSO-d₆) σ6.93(s, 1H), 6.46(s, 1H), 6.12(2, 2H), 5.94(m, 2H), 5.17(bs, 1H), 4.86(d,J=3,93㎐, 1H), 4.64(q,J=7.5, 5.8㎐, 1H), 4.51-4.42(m, 2H), 4.20(d,J=10.7㎐, 1H), 4.01(dd,J=12.1, 5.3㎐, 1H), 3.51(s, 6H), 3.51-2.75(m, 7H), 2.83(m, 1H), 2.83(m, 1H), 1.16(d,J=5.1㎐, 3H).

¹³C NMR(DMSO-d₆) σ174.5, 151.2, 151.1, 147.7, 146.2, 126.1, 132.3, 128.8, 109.8, 109.7, 107.9, 101.5, 101.2, 98.5, 80.0, 74.3, 72.7, 71.7, 67.6, 67.2, 65.7, 55.8, 43.0, 37.1, 20.2, 18.5.

분석. C₂₉H₃₃O₁₆P 계산치. 0.85%H₂O : C,50.95 ; H,5.11. 실측치 : C,51.42 ; H,4.97.

다음 탈이온화시킨 H₂O(50㎖)와 고체 중탄산나트륨(3.00g, 3.57m㏖)을 에토포시드-4'-포스페이트 생성물에 첨가시킴으로써 에토포시드-4'-포스페이트를 그의 디나트륨염으로 전환시켰다. 혼합물을 실온에서 0.5시간동안 교반시키면서 CO₂발생을 중지시켰다. 다음 혼합물을 전술한 실시예에 기재된 바와 같이 C-18관에 직접 적용시켰다. 우선 탈이온화시킨 H₂O 300㎖로 관을 용출하여 과량의 염을 제거한 다음 4 : 1 H₂O/CH₃OH로 추출하여 동결건조시켜 순수한 에토포시드-4'-디나트륨 염 1.90g(61%)을 백색의 복슬복슬한 고체로 얻었다.

에토포시드-4'-디나트륨 포스페이트 또는 티오포스페이트 유도체는 세포독성활성이 감소된 에토포시드의 고수용성 전구약물을 나타낸다. 그러나. 이 화합물들을 알칼린 포스파타제와 반응시키자 각각 포스페이트 또는 티오포스페이트 부분이 제거되고 강력한 항암약물인 에토포시드가 방출되었다(제3도 참고).

에토포시드-4'-포스페이트와 에토포시드-4'-티오포스페이트를 각각 알칼린 포스파타제와 반응시키는 실험으로부터 두 전구약물이 모두 이 효소의 기질임이 드러났다. 제5도에 나타난 바와 같이, 에토포시드 포스페이트는 에토포시드 티오포스페이트 전구약물보다 효소에 의해 더 빨리 가수분해된다. 그러나 어떤 조건에서는 에토포시드 티오포스페이트가 가수분해에 대한 그의 증가된 안정성 때문에 특정한 용도를 가질수도 있다.

[항체-알칼린포스파타제 결합체와 에토포시드 포스페이트 전구약물과의 반응]

결합체와 유리 효소가 기질인 p-니트로페닐 포스페이트[P.Tijssen, 상기 문헌 참고] 또는 에토포시드 포스페이트에 대해 동일한 활성을 보이는 사실로 입증된 바와 같이 본 발명의 결합체는 효소와 항체의 결합하였다 해서 어떠한 효소활성의 분명한 손실도 나타내지 않았다.

예컨대, AP 단독이나, 또는 상술한 바와 같이 제조한 항체-효소 결합체인 L6-AP(최종 AP 농도 5㎍/㎖)를 pH 7.0에서 MgCl₂(1mM)과 ZnCl₂(0.1mM)을 함유하는 트리스완충액(100㎖)중의 에토포시드-4'-포스페이트(0.1mM)용액에 첨가하였다. IBM-C-18관 (3μ, 4.5×100㎜) 및 용출액으로 50% 수성메탄올을 사용하여 HPLC로 반응을 모니터하였다. (0.5㎖/분, 254㎜에서 모니터) 반응 개시 5분이내에 유리효소 형태 또는 L6항체-효소 결합체 형태의 AP가 적어도 58%의 에토포시드-4'-포스페이트를 에토포시드로 가수분해시킨 것이 발견되었다(제4c 및 d도 참고). 도면에 나타난 바와 같이 AP 효소가 결합체내에서 항체에 결합되었다고 해서 그 활성이 손실되지는 않았다. 효소 부재하에서는 포스페이트가 전혀 가수분해되지 않았다(제4a 참고). 에토포시드 포스페이트 또는 에토포시드 티오포스페이트의 수용액은 실온에서는 적어도 8시간, 4℃에서는 며칠간 안정하였다.

[항체-알칼린 포스파타제 결하체의 H3347 종양세포로의 결합]

제6도는 전이적 인체결장 암종 세포주인 H3347(온코겐의 쥬디 엔더슨이 공급)로부터의 종양세포에 대한 유리 L6 및 96.5 항체의 결합뿐 아니라 L6-AP 결합체의 결합능력을 시험해보기 위해 수행한 결합체 결합 분석 결과를 나타낸 것이다.

결합분석은 다음과 같이 수행하였다 : 면역 결합체 또는 유리항체를 불완전 변형 들베코(Delbecco) 배지(IMDM, Gibco)중에 연쇄적으로 희석시키고 100㎕ 분취량을 4℃에서 10⁶세포와 함께 30분동안 배양시켰다. 세포를 세척하고 4℃에서 추가로 30분동안 FITC-염소 항-새앙쥐항체(Tago, 1 : 12.5 희석) 50㎕과 같이 배양하였다. 세포를 세척하고 Coulter Epics-C 형광 세포 분석기로 분석하였다. 죽은 세포는 버리고 각 샘플의 평균 로그 녹색 형광 강도를 얻었다. 이 숫자를 리니어 스케일로 전환시키고 음성대조군(세포＋FITC-염소 항-새앙쥐 항체)과 모든 시험 샘플사이의 비율을 계산하였다.

제6도는 항체의 결합 활성의 대부분이 결합체내에서 보존되었음을 나타내는 것으로, 즉 결합체가 항체의 결합능력에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 더우기, 제 6도는 96.5 유리항체와 96.5-AP 결합체 모두가 L6 항체 및 L6-AP 결합체보다 종양세포에 훨씬 약하게 결합됨을 나타내듯이 항체의 결합 특이성을 나타낸다. 이러한 결과는 H3347 종양세포가 인체 암종으로부터 유래된 것이고 L6 항체는 암종항원에 특이적인 반면 96.5 항체는 흑색세포종 항원에 특이적이라는 것을 고려하면 예측할 수 있는 것이다.

L6, L6-AP, 1F5 및 1F5-AP를 이용한 유사한 결합 시험 역시 1F5 또는 1F5-AP는 H3347 암종 세포주(10㎍/㎖ 항체에 포화)에 거의 결합하지 않거나 검색할 수 있지 않을만큼 결합하는 반면 L6및 L6-AP는 상기 세포주에 결합함을 보여준다(제7도 참조). 이 결과는 L6-AP 결합체는 L6-양성 종양세포주에 결합하고, B 임파종 세포에 특이성이 있는 1F5-AP 결합체는 아무런 결합을 하지 않는것과 같이 결합체들의 결합 특이성을 입증해 주었다.

[본 발명의 결합체/전구약물 배합물의 생체외 세포독성]

다음, 본 발명의 결합체/ 전구약물 배합물의 세포독성 효과를 클로노제닉(clonogenic)세포독성 분석법 또는³H-티미딘 흡수 분석법을 사용하여 생체외에서 측정하였다.

본 발명자들이 사용한 세포독성 분석법은 In Vitro Methods In Cell-Mediated Immunity, 블룸 및 글레이드(편집) pp.409-14(1971) 중의 아이. 헬스트롬외 공동 연구자의 "집락 억제 및 세포독성 분석"에 기재된 집락 억제분석법이다. 세포독성을 검색하는데 사용한 세포는 전술한 H3347 종양세포였다. L6-AP 및 96.5-AP 결합체 모두 전구약물을 유리약물로 전환시키는 그들의 능력에 대해 시험하였다.

간단히, H3347 세포(10⁶/㎖)를 IMDM 생육배지(항체 농도에 기초하여 각 면역결합체 10㎍/㎖)함유에 현탁시키고 37℃에서 30분간 배양시켰다. 세포를 2회 세척하고, IMDM 중에 재현탁시키고, 매질중의 약물 또는 전구약물을 첨가하였다. 37℃에서 15시간동안 계속 배양하였다. 2회 세척한 후, 세포를 플레이트 아웃시키고 7-10일 후 집락(＞8세포/집락)수를 세었다.

분석결과는 제8도에 나타내었다(저해 백분율은 6개 샘플의 평균치임). 도면에 나타난 바와 같이, 에토포시드(IC₅₀=0.20μM) 에토포시드 (IC₅₀=0.20μM)는 에토포시드-4'-포스페이트(EP)(IC₅₀=5.8μM) 보다 세포독성이 훨씬 컸다. 전구약물 단독으로는 세포독성 활성이 거의 나타나지 않았다. H3347 세포를 L6-AP 결합체로 처리하고, 이어서 에포토시드 포스페이트에 노출시키자, 전구약물 단독처리시 나타난 세포독성 활성보다 훨씬 크고 에포토시드 단독처리시 나타난 세포독성 활성에 필적할만한 매우 커다란 세포독성활성의 증가가 초래되었다. 세포를 96.5-AP 결합체와 에토포시드 포스페이트로 처리하자 전구약물 단독으로 처리한 경우보다 세포독성 활성이 아주 미미하게 상승됐을 뿐이었다. 이 결과는 상술한 바와 같이 H3347 세포에 결합하는 96.4-AP 결합체가 소량이기 때문일 것이다(제6도 참조). 세포를 결합체만으로 처리하면 세포를 전혀 사멸시키지 않으므로 결합체 자체는 세포독성이 아니다.

본 발명의 결합체의 세포독성 효과는³H-티미딘 흡수분석에 의해서도 연구하였다. 이 분석에 따라, 10% 송아지 태아 혈청과 함께 IMDM 0.1㎖ 중의 H3347 종양세포 10⁶개의 현탁액을 결합체 5㎍/㎖의 존재하에서 4℃에서 1시간동안 배양시켰다. 세포를 10% 송아지 태아 혈청이 함유된 매질로 2회 세척하고, 재현탁(1㎖중)하고 96-웰 마이크로타이터 평판에 넣었다(10,000세포/웰). 다음 IMDM 중의 약물이나 전구약물을 첨가하고 37℃에서 6시간동안 배양하였다. 세포를 2회세척하고 부가로 12시간동안 계속 배양시킨 다음³H-티미딘(1.0μci/ 웰)으로 6시간 펄스(pulse) 시켰다. 평판을 -20℃에서 냉각시켜 세포를 분리시키고 세포를 유리섬유 디스크상으로 수확하였다. 여과물을 벡크만 3801 섬광 계수기상에서 세었다.

이 분석법을 사용하여, 본 발명자들은 전구약물의 DNA로의³H-티미딘 인코포레이션의 억제를 측정하고, 이로부터 L6-AP 또는 1F5-AP 결합체의 부재 또는 존재하에서 세포에 미치는 에토포시드 또는 전구약물인 EP의 세포독성 영향을 측정하였다. 제9도에 나타난 바와 같이, 에포토시드(IC₅₀=1μM)는 EP(100μM에서 35% 저해)보다 100배이상 독성이었다. 세포를 EP에 노출시키기에 앞서 1F5-AP로 예비처리하자 세포독성은 향상되지 않았다. 그러나, 세포를 L6-AP에 먼저 노출시키고 그다음 EP에 노출시키자 세포독성 활성이 놀랄만하게 증가하였다. 그러므로, 생체외 세포독성을 측정하는데 있어서, 본 발명의 결합체/전구약물 배합물의 세포독성 효과는 에토포시드 단독의 경우와 필적하였고, EP 세포독성이 H3347 세포를 대조 결합체인 96.5-AP 및 1F5-AP로 각각 처리함에 의해 유사하게 향상되지 않은 사실로부터 가리켜진 바와 같이 이 효과는 항원-특이적이었다.

[새앙쥐의 종양 크세노그래프에 있어서 결합체의 국소화]

본 발명의 결합체가 얼마나 신속히 그리고 어느정도까지 종양내에 축적되는가를 알아본 다음 생체내 국소화 연구를 진행하였다. 이 정보는 본 발명자들의 종양치료요법 연구에 있어서 항체-효소 결합체와 전구약물의 투여시 적절한 시간 간격을 결정하는데 유용한 것으로 밝혀졌다.

우선, Balb/C nu/nu 암컷 새앙쥐(생후 4-6주 된것)(플로리다, 세인트 피더스버그, 라이프 사이언스사제공)의 좌우 후부 옆구리에 10⁷개의 H3347 종양세포를 피하(s.c)주사하였다. 트립신(0.5g/1) 및 EDTA(0.2g/1)로 2분간 처리함으로써 현탁시킨 생체외 배양불로부터 종양세포를 얻었다. 새포를 IMDM으로 2회세척하고 10% 송아지 태아 혈청과 함께 IMDM 중에서 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 세포를 세척하고, PBS로 현탁시키고, 주사하기전 4℃로 유지하였다. 본 명세서에 기재된 치료용법 연구 및 국소화 모두 종양의 평균 크기가 225㎣에 도달했을 때 시작하였다.

본 발명자들은 국소화 연구를 위해, 요도겐(iodogen)방법을 이용하여 L6 및 L6-AP는¹²⁵I로 표지하고 1F5 및 1F5-AP는¹³³I로 표지하였다. (피.제이.프레이커외 공동연구자, Biochem.Biophy.Res.Commun., 80, pp.849-857(1978) 참고]국소화 실험을 하기 2일전에, 동물들에게 0.5%(V/V)루골(Lugol's)요오드 용액을 끼얹었다.

각 새앙쥐에게 다음 용액들중 어느 하나를 100㎍(각 모노클로날 항체에 기초하여)복강내 주사하였다 : pH7.2의 PBS 0.2㎖중의 L6-AP(5μCi) 및 1F5-AP(2.5μCi) 또는 PBS 0.2㎖ 중의 L6 (5μCi) 및 1F5(2.5μCi)의 배합물, 주기적으로 새앙쥐를 마취시키고 궤도 플렉시스(orbital plexis)를 통해 채혈한 뒤 사살하였다. 조직을 칭량한 다음 감마계수기로 세었다. 국소화는¹²⁵I-L6 국소화를¹³¹I-1F5의 국소화와 비교함으로써, 즉 여러조직의 카운트의 특이적(¹²⁵I)대 비특이적(¹³¹I) 흡수 비율을 결정함으로써 측정하였다. 종양 및 간에 흡수 결과를 다음의 표 1에 요약하였다.

[표 1]

투여된 단백질의 조직 중량 g당 주사된 투여량 백분율

괄호 안의 숫자는 L6/1F5 또는 L6-AP/1F5-AP의 비율을 나타냄.

상기표 1에 나타난 바와 같이, 비결합 L6은 24시간 이내에 종양에 효과적으로 국소화되어 적어도 48시간동안 남아 있었다. 이 기간동안 종양중이 L6/1F5의 비율은 8-12이범위였고 간에서의 비율은 상당히 낮았다.(1.3-1.4) L6-AP에 대한 종양내의 특이적 흡수 최대치는 약 24시간경에 일어났고 이때 L6-AP/1F5-AP의 비율은 10.0이었다. 이러한 결과는 L6-AP 결합체가 1F5-AP 보다는 훨씬 잘 종양으로 국소화되지만 변형되지 않은 L6만큼은 잘 국소화되지 않음을 나타내는 것이다.

다음 본 발명자들은 종양중의 자연적인 포스파타제 활성의 양과 본 발명의 결합체를 사용하여 종양에 AP를 표적시킴으로써 이 활성이 증가될 수 있는 정도를 측정하였다. 24시간동안 L6-AP 100㎍(L6에 기초)로 처리한 새앙쥐로부터 종양을 제거하고, 포스파타제 총활성을 기질로써 p-니트로페닐 포스페이트를 사용하여 다음과 같이 측정하였다 : 떼어낸 종양을 세척한 다음 NaCl(100mM)과, MgCl₂(5mM)을 함유하는 pH9.5 트리스(100mM)중의 p-니트로페닐 포스페이트(1㎎/㎖)와 함께 23℃에서 가볍게 회전시켰다. 반응 경과는 410㎚에서 방출된 p-니트로페놀을 측정함으로써 모니터하였고 결과는 종양중량에 대해 정정하였다. L6-AP 결합체로 처리한 새앙쥐로부터의 종양의 포스파타제 활성 수준이 처리하지 않은 새앙쥐로부터의 종양에서 관찰된 포스파타제 활성 수준보다 10배나 더 큰 것으로 나타났다(제10a 참고).

종양의 포스파타제 활성의 보다 자세한 조직학적 분석을 처리되지 않거나 L6-AP 또는 1F5-AP 300㎍(항체에 기초)으로 24시간 미리 예비 처리시킨 새앙쥐로부터 얻은 종양의 단면에 대해 실시하였다. 효소 활성 부위에 어두운 침전물을 남기는 포스파타제 기질을 사용하여 면역조직학에 의해 포스파타제 활성을 다음과 같이 측정하였다 : 떼어낸 종양을 -28℃까지 신속히 냉각시키고 8㎛ 연속적인 횡단면을 라이헤르트-융마이크로톰을 사용하여 제조하였다. 포스파타제 활성을 벡터연구소(Burlingame, CA)로부터의 AP 기질키트로 측정하고 그 결과를 헤마톡실린 및 에오신(H 및 E. 제10b도 참고)으로 염색한 부분과 비교하였다.

제10b도에서 나타나듯이 1F5-AP로 처리되거나 처리되지 않은 새앙쥐로부터의 종양에서는 효소활성이 거의 검색되지 않았다. 그러나 L6-AP처리된 새앙쥐에서는 포스파타제 활성이 높게 평가되었으며 종양전체에 걸쳐 분vh하는 것으로 나타났다. 미시적 평가결과 L6-AP로 처리한 새앙쥐내의 종양 세포 대부분은 포스파타제 활성에 대해 매우 높게 양성적으로 염색된 것으로 나타났다.

[본 발명의 결합체/에토포시드 포스페이트 전구약물 배합물의 생체내 항종양 효과]

부피가 약 225㎣인 피하종양을 갖는 제모한 새앙쥐에 대해 치료요법 실험을 실시하였다. EP를 투여하기 18-24시간 전에 결합체, L6-AP 및 1F5-AP를 투여(복강내) 하였다. 처리하지 않은 새앙쥐와 에토포시드 또는 EP 단독으로 최대 한계치까지 처리한 새앙쥐에 있어서의 종양 생육을 비교하였다.

더욱 구체적으로는 H3347 종양을 대칭적으로 갖는 8마리의 제모한 새앙쥐군을 에토포시드(2 : 3 DMSO : H₂O 중에 에포포시드 1.2㎎을 함유하는 0.2㎖)또는 EP(H₂O중에 EP 2㎎을 함유하는 0.2㎖)단독 또는 L6-AP(PBS중에 항체 300㎍을 함유하는 0.1㎖)또는 1F5-AP(PBS중에 항체 300㎍을 함유하는 0.1㎖)로 처리하고 이어서 EP 처리하였다. 각 실험시 아무 처리도 하지 않은 새앙쥐를 대조군으로 사용하였다. 종양의 부피는 다양한 날짜에 다음의 공식 : ([수직넓이 2/2)]×최장길이를 사용하여 종양 내이식후 평가하였다.

이 실험의 결과를 제11도에 나타내었다. 에토포시드는 사용된 투여량에서는 종양 생육에 거의 영향을 미치지 않았으며 더 많은 투여량은 잘 인내되지 못하였다. 전구약물인 EP는 동물에게 독성이 덜하였으며, 따라서 투여량을 높이자 에토포시드 자체가 보였던 것보다 더 큰 항종양 효과를 나타냈다. EP를 처리하기에 앞서 대조 결합체 F-AP를 처리한 새앙쥐에서는 항종양 활성 정도가 유사한 것으로 관찰되었다. 그러나 새앙쥐를 L6-AP, 이어서 EP로 처리하자 훨씬 강력한 항종양 효과가 관찰되었다. L6-AP 단독으로 종양 생장에 아무런 영향을 미치지 않았다(데이타 나타나지 않음).

치료요법에 대한 각 개체 종양의 반응을 다음의 표 2에 요약하였다. L6-AP 및 EP로 처리한 새앙쥐 8마리중의 종양 16개중, 6개의 종양이 완전한 퇴행을 보였으며 다른 2개는 처음 치료할 때마다 크기가 줄어들었다. 다른 처리 프로토콜에서는 완전하거나 부분적인 반응이 전혀 관찰되지 않았다.

[표 2]

종양 생장에 대한 여러 처리의 효과

반응^*

상기 데이타는 종양을 내이식한지 23일째에 각 군에서의 종양 16개의 반응을 나타낸 것이다.

*반응 : 진행-종양 생장 계속됨 ; 안정-추가적인 종양 생육은 없음 ; 부분-크기가 줄어듬 ; 완전-분명한 종양이 없을 정도로 종양이 퇴화됨.

실시예 1은 효소에 의해 비교적 비독성인 형태로부터 강력한, 세포독성 형태로 전환될 수 있는 전구약물과 종양-특이 항체 -효소 결합체를 사용하여 종양세포로 세포독성 항종양 약물을 전달하는데 본 발명의 방법이 적용될 수 있음을 분명히 입증한다.

[실시예 2]

실시예 2는 비교적 비독성인 미토마이신 포스페이트 전구약물을 활성 미토마이신 약물로 전환시켜 종양세포에 대해 생체외 세포독성을 나타내게 하는, 본 발명의 방법 및 면역 결합체의 용도를 입증한다. 더우기, 상술한 실시예 1에서 나타난 바와 같이, 다음의 실시예는 세포독성 항종양 약물을 생체내 종양세포로 전달하는데 본 발명의 면역 결합체, 전구약물 및 방법의 적용성을 입증해준다.

실시예 2는 전술한 실시예 1에서 기재된 바와 같이 제조한 L6-AP 또는 1F5-AP 면역결합체를 이용한다. 본 발명의 이 구체예에 따라, 이 항체-효소 결합체를 신규의 미토마이신 포스페이트 전구약물과 반응시켰다. 더욱 구체적으로는, 전구약물로서 미토마이신 C의 N⁷-C_1-8알킬포스페이트의 디나트륨염을 사용하였다. 이 반응의 결과로서 방출된 항종양제는 미토마이신 알코올 유도체였다. 본 발명의 L6-AP/미토마이신 포스페이트 전구약물 배합물은 생체외 종양세포에 대해 세포독성을 나타내었으며 새앙쥐에 있어서 분명한 생체내 항종양 효과를 나타냈다.

[신규의 미토마이신 포스페이트 전구약물의 제조]

신규의 미토마이신 포스페이트 전구약물 7-(2'-아미노에틸 포스페이트)미토마이신(이하 "MOP"라 칭함)은 미토마이신 C의 2-아미노에틸 포스페이트 유도체이며 다음과 같이 제조한다 :

트리에틸아민(0.3㎖, 2m㏖)과 물(0.35㎖)중의 2-아미노에틸 디히드로겐 포스페이트(56㎎, 0.4m㏖)용액을 메탄올(6㎖)중의 미토마이신 A(이하 "MMA"라 칭함)(140mg, 0.4m㏖)에 첨가하고 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 다음 중탄산나트륨 포화 수용액 1.4㎖를 첨가하고 물과 염화메틸렌 사이에서 용액을 분배하였다. 수층을 농축시켜 건조시키고 메탄올의 몇부분을 첨가하고 증발시켰다. 잔사를 메탄올 흡수 시키고 여과하여 2×10㎝ C-18(역상) 실리카관에 적용시켰다. 생성물을 물로 용출시키고 휘발성인 물질은 모두 증발시켰다. 메탄올을 첨가하고 전처럼 증발시키고 잔사는 고압하에서 오산화인으로 데시케이터내에서 24시간동안 건조시켰다. 미토마이신 포스페이트 유도체 MOP를 미세한 청색 분말상(190㎎, 97%)으로 얻었다.

360 MHz 'H-NMR(D₂O) σ1.92(s, 3H, CH₃), 2.9-3.1(m, 4H), 3.20(s, OCH₃), 3.28(s, 1H), 3.36(s, 1H), 3.5-3.65(m, 4H), 4.1-4.25(m, 2H), 4.50-4.57(dd, 1H, 10-H).

이리하여 MOP는 MMA의 7-메톡시기를 2-아미노에틸 인산으로 대치시켜 제조하였다(제12도 참고). 생성물은 중탄산 나트륨으로 처리하여 수용성 디나트륨염으로 전환시켰다.

상응하는 공지의 미토마이신 알코올 유도체인 7-[(2-히드록시에틸)아미노]-9a-메톡시미토산(이하, "MOH"라 칭함)은 비.에스.옌가외 공동연구자의 방법 ["미토마이신 C 및 제7위치에 치환 에틸아민이 있는 포르피로마이신 동족체", J.Med. Chem., 26, pp.16-20(1983)]에 따라 MMA(100㎎, 0.28m㏖)를 에탄올아민826㎎, 0.429m㏖)과 반응시켜 제조하였다. 생성물은 미세한 청색 분말로 얻었다(58㎎, 54%).

[미토마이신 포스페이트 전구약물의 반응성 및 안정성]

다음 MOP 전구약물의 반응성을 AP로 시험하였다. 실온에서 pH7.2의 100mM 트리스 완충액중의 MOP(1mM)용액에 송아지 내장, 또는 인체 태반 AP(최종농도 1㎍/㎖)를 첨가하였다. 반응결과를 다음 조건으로 C-18관(4.6×150㎜)을 사용하여 HPLC로 모니터하였다 : 280㎜에서 검색 ; 아세테이트 완충액(100mM, pH5.2)중의 30-95% 8분간, 15분후 재평형 ; 0.8㎖/분 유속, 이러한 조건하에서 MMC는 7분경, MOH는 8.5분경 그리고 MOP는 4.0분경에 용리되었다. 제13도에 나타난 바와 같이, MOP 전구약물 상의 포스페이트기는 AP에 의해 신속히 분해되었다. HPLC는 상응하는 알코올 MOH가 생성되었음을 확인시켰다. 사용된 반응조건하에서, MOP의 가수분해 반감기는 약 10분이었고 반응은 40분 이내에 종결되었다.

전구약물의 소실속도와 MOH 및 에토포시드의 생성속도를 모두 측정함으로써 HPLC에 의해 인체 혈청중의 MOP 및 EP의 안정성을 결정하였다. 이리하여, 예컨대, MOP용액(100mM 트리스중의 1mM , pH 7.2)을 신선한 인체 혈청에 첨가하여 약물 최종농도가 0.1mM 이 되도록 하였다. 분취액(0.25㎖)은 메탄올(0.25㎖)과 EDTA(100mM 에서 50㎕)로 희석하여 혈청 단백질을 침전시키고 반응 정지시켰다. 샘플을 원심분리시키고 상술한 대로 즉시 HPLC로 분석하였다. EP의 50%가 약 1시간후에 가수분해된 것으로 나타났으나, MOP는 4시간 후에도 겨우 25%만이 가수분해 되었다. 혈청에 AP를 첨가하면 가수분해가 신속히 완결될 수 있었다.

[항체-알칼린 포스파타제 결합체와 H2981 종양세포와의 결합]

본 발명의 L6-AP 및 1F5-AP 항체-효소 결합체가 H2981 종양세포에 결합하는 능력을 측정하였다. H2981 세포주는 폐의 원시 인체 선암으로부터 주화시켰다. [아이.헬스트롬외 공동연구자, "Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma"Cancer Res., 46(No.8), pp.3917-23(1986)참고] L6 항체는 H2981 세포(10㎍/㎖로 포화)에 강하게 결합하는 반면 1F5는 이 세포에 거의 결합하지 않는 것으로 알려져 있다.

실시예 1에 기재된 대로 결합 분석을 행하였다. FACS 분석결과 L6 및 L6-AP는 세포에 아주 강하게 결합하나, 1F5 및 1F5-AP는 훨씬 약하게 결합하는 것으로 나타났다(제14도 참고).

[2981 종양세포에 대한 본 발명의 결합체/전구약물 배합물의 생체외 세포독성]

본 발명의 결합체/전구약물 배합물의 세포독성 효과를 실시예 1에 기재된³H-티미딘 흡수 분석을 통해 생체외 적으로 입증하였다 ; 이 경우 생체외 세포독성을 시험하기 위해 H2981 종양세포를 사용하고 대조군으로 CEM 세포를 사용하였다. ATCC로부터 T 세포 ALL 세포주인 CEM을 얻었으며 이것은 L6 또는 1F5 모노클로날 항체에 결합하지 않는다. L6-AP 또는 1F5-AP 면역결합체의 종양세포의 대한 세포독성효과를 분석하였다. 이 배합물의 세포독성 효과를 각각의 모약물 단독의 세포독성 효과와도 비교하였다.

간단히, 10% 송아지 태아 혈청을 함유하는 IMDM 0.1㎖ 중의 10⁶개의 H2981 도는 CEM세포 현탁액을 결합체 10㎍/㎖의 존재하에 4℃에서 1시간동안 배양하였다. 세포를 10% 송아지 태아 혈청을 함유하는 매질로 2회 세척하고, pH7.2의 포스페이트 완충된 식염수(PBS) 1㎖에 재현탁시키고, 96-웰 마이크로타이터 평판에 얹었다(10,000세포/웰). 다음 PBS 중의 전구약물을 첨가하고 37℃에서 1시간(MOP의 경우)또는 5시간(EP의 경우)동안 배양시켰다. 다음 세포를 2회 세척하고 총 24시간동안 계속 배양시켰다(³H-티미딘으로 펄스시킨것 포함, 1.0μci/웰). 평판을 -70℃로 냉각시켜세포를 분리하고, 해동시킨 후 세포를 유리섬유 디스크상에 수확하였다. 필터를 벡크만 3801 섬광계수기상에서 세고 결합체/전구약물 배합물의 세포독성 효과를 세포를 전구약물 또는 모약물 단독으로 처리했을 때 나타난 세포독성 효과와 비교해 보았다. 결과를 제15도-17도에 나타냈다.

제15도에 나타난 바와 같이, 에토포시드(IC₅₀=2μM)는 H2981 세포에 대해 EP(30μM에서 20% 사멸시킴)보다 훨신 독성이 강했다. 세포를 전구약물에 노출시키기에 앞서서 1F5-AP로 미리처리하자 세포독성의 증가는 매우 미약하였다. 그러나, 세포를 먼저 L6-AP에 노출시키고 그다음 EP에 노출시키자 극적이라고 할만큼 세포독성이 증가된 것이 관찰되었다. 이 세포독성 효과는 에토포시드 단독의 세포독성 효과와 비견할 만한 것이었다.

미토마이신 유도체를 사용하였을 때도 비슷한 결과가 관찰되었다. 제16도에 나타난 바와 같이, MMC와 MOH는 H2981세포에 대해 동일하게 세포독성적이었으며 IC₅₀은 약 1μM이었다. 포스페이트 전구약물 MOP는 훨씬 낮았는데(10μM에서 5% 세포 사멸시킴), 아마도 세포내로 침투하는 능력이 없기 때문일 것이다. 그러나, MOP의 활성은 종양세포를 L6-AP 결합체에 미리 노출시킨 경우엔 MOH와 MMC에 필적할만 하였다.

비결합 결합체인 1F5-AP는 전구약물의 세포독성 활성에 크게 영향을 미치지 않으므로 이러한 향상은 항원 특이적인 것이었다. L6-AP 및 1F5-AP 모두가 CEM 세포에 대해 MOP의 세포독성효과를 크게 증가시키지 않은 것은, 결합체가 이 세포주에 결합하지 않은 사실과 일치한다(제17도 참고). 이 결과들은 각 시험 전구약물의 포스페이트기가 약물을 불활성화시키며, 항체-효소결합체가 종양세포 표면에 결합함으로써, 전구약물 EP 또는 MOP의 포스페이트기를 가수분해시켜 활성적인 약물을 생산해냄을 가리키는 것이다.

[본 발명의 결합체/미토마이신 전구약물 배합물의 생체내 항종양 효과]

본 발명의 L6-AP 결합체와 함께 MOP의 생체내 항종양 활성을 조사하기에 앞서, Balb C nu/nu 새앙쥐에 있어서 전구약물의 상대적인 독성과 그의 방출된 활성약물인 MOH의 상대독성을 측정하였다. 4일간격을 두고 동일한 두 복용량을 투여한(i.p.)결과 MOH와 MOP의 경우 각각 LD₅₀값이 45 및 90㎎약물/㎏ 체중으로 얻어졌다. 또한 오랜기간동안 투여량을 좀 더 적게함으로써 약물을 꽤많이 투여할 수 있도록 밝혀졌다. 25일동안 4회 동일 복용량으로 투여할 경우 MOH 40㎎/㎏과 MOP 100㎎/㎏까지는 인내될 수 있었다. 이 연구결과는 미토마이신 전구약물의 감소된 독성 때문에 상당히 많은 양까지 투여될 수 있음을 나타내는 것이다.

다음 라이트 사이언스(St. Petersburg, Fla.)로 부터 얻은 제모한 Balb C nu/nu 암컷 새앙쥐(1처리군 당 6마리)(생후 4-6주됨, 생체내 원(源)으로부터 얻은 H2981 종양을 내이식(피하로. 오른쪽 후두 옆구리)시킴)에 대해 치료요법 연구를 실시하였다. 종양의 부피가 약 100㎣에 달했을 때 실험을 시작하였다. L6-AP 및 1F5-AP 결합체(PBS중에 항체 250㎍을 함유하는 0.1㎖)를 MOP(H₂O중의 0.6㎎ MOP를 함유하는 0.2㎖)로 처리하기 약 18-24시간전에 투여(복강내)하였다. 종양 생장을 처리하지 않은 새앙쥐와 MOP(H₂O중에 0.6㎎ MOP를 함유하는 0.2㎖)또는 MOH(H₂O중에 0.2㎎ MOH 함유하는 0.2㎖) 단독으로 처리했을 때와 비교하였다.

제18도에 나타난 바와 같이 MOH와 MOP는 생체내 에서 커다란 항종양 활성을 갖는다. 평균 종양 부피가 750㎣ 되는데 필요한 시간은 MOH 처리한 쥐에서는 45일, MOP 전구약물 처리한 쥐에서는 63일 그리고 대조군에서 27일이었다. 상술한 바와 같이, MOP 전구약물은 동물에 대해 독성이 덜하므로 따라서 투여될 수 있는 한 더 많은 투여량은 MOH 유도체에서 나타난 것 보다 항종양 효과가 더 컸다. 비록 비결합 결합체 1F5-AP가 MOP의 활성을 어느정도 증가시키지만, MOP 처리에 앞서 L6-AP를 처리한 군에서 관찰된 활성은 훨씬 분명하였다. 도면에 나타난듯이 70일째에는 L6-AP 결합체로 예비 처리된(이어서 MOP로 처리) 종양은 1F5-AP 결합체로 예비처리한 종양의 1/3크기였다.

더우기, 표 3에서 나타난 바와 같이, 내이식시킨 후 63일째되는 날에는 L6-AP＋MOP로 처리한 쥐의 종양 6개중 3개가 완전히 퇴화하였으며 나머지 3개는 치료중엔 크기가 증가하지 않았다. 이와는 대조적으로 1F5-AP＋MOP로 처리한 군의 종양 5개중 3개는 실제로 그 크기가 커졌으며 종양 5개중 2개는 안정상태였고, 부분적으로나 완전히 퇴화한 종양은 하나도 없었다.

[표 3]

항체-AP 결합체와 미토마이신 유도체로 처리한 종양의 반응(63일까지)

이 실험은 생체내에서 본 발명의 표적 효소/MOP 배합물의 증가된 항종양 효과와 특이성을 분명히 입증해준다.

[실시예 3]

실시예 3은 여러개의 상이한 약물을 종양세포에 전달하기 위한 본 발명의 면역결합체, 전구약물 및 방법의 적용 가능성을 입증해준다. 전구약물 EP 및 MOP와 함께 항체-알칼린 포스파타제인 L6-AP를 사용하자 생체내 항종양 활성이 증가되었음이 입증되었다. 그러므로, 본 발명은 종양에 대한 배합물 화학요법을 위한 전구약물의 패널(Panel)과 함께 단일 항체-표적 효소의 용도를 제공한다.

전구약물 EP 및 MOP는 각각 실시예 1 및 2에 기재된 것과 같이 제조하였다. 실시예 1에는 L6-AP 및 1F5-AP 면역결합체의 제조에 대해 기재되어 있다. 제모한 새앙쥐에 대해 행한 생체내 연구는 실시예 1및 2에 기재된 것과 마찬가지로 수행하였다. 따라서, H2981 종양을 내이식시킨 제모한 새앙쥐를 MOP/EP(H₂O 중에 EP 1㎎과 MOP 0.3㎎는 함유하는 0.2㎖)배합물로 처리하기에 앞서 18-24시간 전에 L6-AP 또는 1F5-AP 결합체에 예비 노출시켰다. 종양생장을 처리하지 않은 쥐와 MOP/EP 배합물만으로 처리한 쥐에서의 종양생장과 비교하였다.

제19도에 나타난 바와 같이, MOP/EP 배합물 단독, 그리고 MOP/EP 배합물에 1F5-AP 처리를 더한 경우에서의 항종양 활성은 거의 동일하였다. 그리고, 다음의 표 4가 나타내듯이 처리하지 않은 대조군의 종양에서 뿐만 아니라 이들 2군에서의 종양 모두는 그 크기가 커졌다. 종양이 있는 새앙쥐를 L6-AP결합체로 예비 처리하고 이어서 MOP/EP 배합물로 처리하였으나 항종양 반응이 명백하였다. 제19도에서 나타난 바와 같이 70일째 되던 날, L6-AP로 예비 처리한(이어서 MOP/EP 배합물로 처리) 종양의 크기는 1F5-AP배합물 만으로 예비처리한 종양의 크기의 약 1/3이었다. 더우기, 표 4는 내이식후 63일째까지는, L6-AP예비처리한 새앙쥐군의 종양 6개중 하나는 완전히 퇴화하였고 6개중 3개는 생육이 정지되었으며 6개중 오직 2개만이 크기가 커졌음을 나타낸다.

[표 4]

항체-AP 결합체 배합물 및 미토마이신/에토포시드 배합물로 처리한 종양의 반응(63일까지)

이리하여, 이 생체내 연구는 종양에 대한 배합물 치료요법을 위한 본 발명의 결합체, 전구약물 및 방법의 적용 가능성을 나탄낸다.

다른 한편 L6-AP와 같은 본 발명의 결합체는, EP, 아드리아마이신-14-포스페이트 및 5-플루오로유리딘 모노포스페이트와 같이 전구약물의 기타 배합물과 함께 몇개의 상이한 세포독성 물질을 종양세포로 옮기는데 사용될 수 있다.

항체-효소 결합체인 L6-AP 및 전구약물인 에토포시드-4'-포스페이트의 제조는 실시예 1에서와 같이 수행하였다. 1980년 1월 22일자 제이.비.듀셉의 미국특허 제4,185,111호에는 아드리아마이신-14-포스페이트의 제조에 대해 기재되어 있다. 5-플루오로유리딘 모노포스페이트는 엠.제이.로빈스외 공동연구자의 Can.J.Chem., 53. 1302-1306(1975)에 기재된대로 제조하였다.

L6-AP를 상술한 3가지 전구약물과 다음과 같이 반응시켰다 ; AP 단독 또는 L6-AP결합체(최종 AP 농도 5㎍/㎖)를 pH7.0에서 MgCl(1mM)과 ZnCl₂(0.1mM)를 함유하는 트리스완충액(100mM)중의 아드리아마이신-14-포스페이트 또는 에토포시드-4'-포스페이트에 첨가하였다. 5-플루오로유리딘 전구약물의 경우, 반응조건은 pH8.0 포스페이트 완충액(100mM)중의 5-플루오로유리딘(3μM)의 용액을 필요로 하였다. L6-AP와 에토포시드 포스페이트 또는 5-플루오로유리딘 전구약물과의 반응을 실시예 1에 기재된 것과 같이 모니터하였다. L6-AP와 아드리아마이신-14-포스페이트와의 반응을 IBM C-18관(3μ, 4.5×100MM) 및 용리액으로서 3% 암모늄 아세테이트를 함유하는 물중의 65% 메탄올을 사용하여 HPLC에 의해 모니터하였다(0.5㎖/분, 495㎜에서 모니터).

항체-AP 결합체와 각 전구약물과의 반응에 의해 포스페이트 부분이 가수분해되어 유리약물이 방출되었다. [알.비.맥콤외 공동연구자, Alkaline Phosphatase, Plenum Press(뉴욕 1979) 참고]

본 발명의 L6-AP 결합체의 존재하에서 세가지 전구약물 각각의 종양세포에 대한 세포독성은 실시예 1에서 기재된 바와 같이 집락 억제 분석법을 사용하여 입증할 수 있다. 결합체에 의해 전구약물 각각으로부터 포스페이트 부분을 제거하면 에토포시드, 아드리아마이신 및 5-플루오로유리딘이 방출된다. 이 약물 각각은 강력한 항종양 물질인 것으로 나타났다. [예컨대, 피.제이.오드와이어외 공동연구자, "에토포시드 : 활성 항암제의 현황 "New England Journal of Medicine, 312, pp. 692-700(1985) : 엠.제이.엠블레톤외 공동연구자, "Antibody Targeting of Anti-Cancer Agents "Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, 알. 더블유 볼드윈 및 브이.에스.바이어(편집) pp.321-22(아카데미 출판 1985) ; 미국특허 제4,185,111호, 상기문헌 ; 에스.티.크록 및 에스.디.라이히(편집) 안트라시클린류 : 그 현황과 새로운 발전, 아카데미 출판(뉴욕 1980) ; 및 씨, 하이델버거외 공동연구자 "불화 피리미딘 및 그들의 뉴클레오시드류 "Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol. 54, pp. 57-119(1983)].

그러므로 에토포시드, 아드리아마이신 및 5-플루오로유리딘의 전구약물들은 본 발명의 항체-알칼린 포시파타제 결합체에 의해 종양부위에서 상응하는 공지의 항종양제의 방출을 위해 함께 또는 연속적으로 사용될 수 있다. 예컨대, 상호관련하여 투여된 항종양제가 상승적으로 작용할 수 있음이 입증되었다. [예컨대 에스.몬파르디니외 공동연구자., 암화학 치료 메뉴얼, UICC기술보고서 시리즈, 56(1981) 참고] 본 발명의 이 실시예는 따라서 종양에 대해 결합 화학요법에 대한 방법을 제공한다.

[실시예 4]

실시예 4는 종양세포에 대해 비교적 비독성인 전구약물을 생체외 세포독성을 나타내는 활성항종양제로 전환시키기 위한 본 발명의 전구약물 및 기타 면역결합체의 용도를 입증한다. 실시예 4에 따라, 아드리아마이신의 N-페녹시아세틸 유도체를 공지의 항종양제 아드리아마이신으로 전환시키는데 L6-페니실린 V 아미다제(이하 "PVA"라 칭함)를 사용한다.

[본 발명의 항체-페니실린 V 이미다제 결합체의 제조]

실시예 4에서는 L6-PVA 면역결합체 및 1F5-PVA 결합체를 제조하였다. 항체 L6 및 전구약물F5와 그들의 근원은 앞서 밝힌 바 있다. 사용한 아미다제효소는 디.에이.로웨외 공동연구자의 "Fusarium Oxysporum에 의한 페니실린 V에서 6-아미노페니실란산으로의 효소적 가수분해, Biotechnology Letters ((3), pp, 151-56(1986) 참고]에 따라 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)의 곰팡이 배양액으로부터 분리한 페니실린 V 아미다제였다. 이 효소를 생산하는 푸사리움 옥시포룸은 ATCC에 기탁되어 있다. 그러므로 PVA는 페니실린-V를 페니실란산으로 전환시키는 간단히 구입할 수 있는 효소이다. 더욱 구체적으로는 PVA는 페니실린-V의 페녹시아세틸아미드 결합을 가수분해시켜 페니실란산을 생산한다. 페녹시아세트아미드류와 반응하는 이 효소는 페녹시아세트산이나 p-히드록시페녹시아세트산으로 유도된 공지의 세포독성물질의 전구약물을 분해 하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 이 구체예의 항체-PVA 결합체는 실시예 1의 AP 결합체 제조 경우와 실제로 동일하게 제조되었다. 항체인 L6 및 1F-5는 기재된대로 이미노티올란과 반응시켰으며 항체 각각에 도입된 설피드릴기의 수는 1-2로 결정하였다.

다음 PVA 효소를 PBS중에 9㎎/㎖로 용해시키고 SMCC(피어스 화학사, DMF중 100mM)로 처리하여 최종 농도를 5mM로 만들었다. SMCC로 처리하자 효소로 말레이미도기가 도입되었다. 30℃에서 30분후, 변형된 효소를 G25 PD-10 세파덱스(Pharmacia, Upsalla, Sweden) 상에서 겔 여과시켜 정제하고 PBS로 용출시켰다. 다음 변형된 PVA를 각 티올화된 항체용액에 3 : 1의 몰비율로 첨가하였다. 각각의 반응 혼합물을 질소로 포화시키고 실온에서 3시간 방치한 다음 4℃에서 18시간동안 정치시켰다. 이때, 2-아미노에탄티올(최종농도 1mM)을 각 용액에 첨가하여 반응치 않은 말레이미드류가 더 생기는 것을 방지하였다.

용리액으로서 50mM NaCl, pH7.2의 20mM 트리스를 사용하여 겔 여과 관(G-25)을 통해 각 반응혼합물을 통과시켰다. 얻어진 혼합물을 DEAE 세파덱스관(2.5×10㎝)으로 정제하였다. 분획을 280㎚에서 모니터하였다.

각 혼합물의 미반응 항체는 관에 결합하지 않았고 결합체와 미반응 PVA는 200mM 트리스, pH7.2, 0.5mM NaCl로 용출시켰다. 다음 PVA와 결합체를 함유하는 분획을 아미콘 YM-30 한외 여과 필터를 사용하여 농축시키고 용리액으로서 PBS를 사용하여 세파크릴 S-300관(2.5×95㎝)상에서 정제시켰다. 분획을 280㎚에서 모니터하고, SDS-PAGE(4-12% 구배겔)에 의해 결정된 것처럼 순수한 배합물을 함유하는 분획을 수집하였다.

[신규의 아드리아마이신 전구약물의 조제]

상기 제조한 각 항체-PVA 결합체를 신규의 아드리아마이신 전구약물과 반응시켰다. 더욱 구체적으로는, 전구약물로 N-(p-히드록시페녹시아세틸) 아드리아마이신(이하 "APO"라 칭함)(아드리아마이신이 제20도에 도시된 것과 같이 아미노-당 위치에서 p-히드록시-페녹시아세트산으로 아실화되어 있음).

이 아드리아마이신 전구약물은 다음과 같이 제조하였다 : 테트라히드로퓨탄 10㎖에 p-히드록시-페녹시아세트산 84㎎(0.5mmole), N-히드록시숙신이미드 57㎎(0.5mmole), 및 디시클로헥실카르보디이미드100㎎(0.49mmole)을 넣었다. 이 혼합물을 2시간 동안 교반시키고 이때 용액을 여과시키며 여과물을 아드리아마이신 히드로클로라이드 200㎎(0.35mmole)에 첨가하였다. 반응 혼합물에 트리에틸아민 0.1㎖를 첨가하고 4시간 동안 교반하였다. 다음 반응 혼합물을 글래스울을 통해 여과시키고 고압하에서 중발시켜 잔사를 남겼다. 이렇게 얻은 혼합물을 95 : 5 디클로로메탄 : 메탄올로 용출시켜 실리카겔 60관 (2.5×20㎝)상에서 정제하였다. 같은 종류의 관에서 수집한 분획을 다시 정제하여 순수한 N-(p-히드록시페녹시아세틸)아드리아마이신 70㎎(0.1mmole, 30% 수율)을 얻었다.

FAB MS m/e 694.2125(M+H)^÷, 계산된 C₃₅H₃₆NO₁₄, 694.2136. 360 MHz¹H NMR(CDCL₃)σ 1.06(d, 3H 당 CH₃), 1.5-2.2(m, 6H 당 H), 3.0(q, 2H) 4.0(s, 3H, OCH₃)σ 1.06(d, 3H 당 CH₃), 1.5-2.2(m, 6H, 당 H), 3.0(q, 2H) 4.0(s, 3H, OCH₃), 4.35(s, 2H, COCH₂O), 4.8-5.0(m, 3H), 5.2 및 5.4(s, 1H), 6.6-6.8(dd, 4H, 페녹시 ArH) 7.4-7.9(m, 3H, 2,3,4-H), 9.0(s, 1H, Ar'OH), 11.61 및 12.39(s, 1H, ArOH).

아드리아마이신의 그밖의 페녹시아세틸 아미드 유도체들도 상술한 것과 동일한 공정에 의해 합성될 수 있음을 이해하여야 한다. 예컨대, p-히드록시페녹시아세트산이 페녹시아세트산 0.5mmole(76㎎)으로 대치된 N-(페녹시아세틸) 아드리아마이신도 여기 기재된 것과 같이 합성할 수 있다. 이와 유사하게, 멜팔란 100㎎ 또는 다우노마이신 200㎎(0.35mmole)을 사용하는 이 합성 프로토콜에 의해 N-(p-히드록시페녹시아세틸) 멜팔란이나 다우노마이신 전구약물 또는 N-(페녹시아세틸) 멜팔란이나 다우노마이신 전구약물을 합성할 수 있다.

[항체-페니실린 V 아미다제 결합체와 아드리아마이신 전구약물과의 반응]

신규의 전구약물인 APO를 아드리아마이신으로 전환시킬 수 있는 항체-PVA 결합체인 L6-PVA의 능력을 다음과 같이 측정하였다 : (a) PVA 단독(최종농도 : 50㎍/㎖)를 PBS중의 APO(0.1mM) 용액에 첨가하였다. 각 반응을 페노미넥스 C-18관 (3μM, 4.5×100㎜)과 0.1% HPO와 함께 물중에서 20-60%테트라히드로퓨란 구배 추출을 이용하여 HPLC로 모니터하였다. (1.0㎖/분, 495㎚에서 모니터)이 조건하에서 아드리아마이신은 8.9분에서 용출하고 APO는 12.2분에서 용출하였다.

결과를 제21도에 나타냈다.

제21도에서 나타나듯이, APO의 아미드기는 실제로 아드리아마이신 생성이 가리키듯이 PVA에 의해 가수분해되었다. 사용된 조건하에서, PVA에 의한 APO 가수분해의 반감기는 약 20분이었다. 더우기, 반응개시로부터 40분이내에 효소단독 또는 항체-PVA결합체가 APO의 적어도 80%를 아드리아마이신으로 가수분해시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 10㎍/㎖(2.5㎍/㎖ PVA)결합체가 이 정도로 가수분해시키는데는 120분이 소요되었다. 결국, 이 연구로부터 효소가 항체에 결합했다고 해서 본 발명의 항체-PVA 결합체의 효소 활성이 손실되지 않았음이 자명하며 이것은 결합체와 유리 효소가 APO를 아드리아마이신으로 가수분해시키는데 있어 유사한 능력을 나타내는 사실로부터 분명히 입증된다.

[본 발명의 신규의 아드리아마이신 전구약물의 혈청 안정성]

HPLC를 사용하여 APO의 소실속도와 아드리아마이신의 생성속도를 측정하여 인체 혈청에 있어서 APO의 안정성을 측정하였다. 이러기 위해, APO 용액(디메틸포름아미드중에 10mM)의 최종농도가 0.1mM이 되도록 신선한 인체 혈청에 첨가하였다. 분취액(50㎕)을 메탄올(50㎕)로 희석시켜 혈청 단백질을 침전시켰다. 다음 이 샘플을 원심분리시키고 상술한 바와 같이 HPLC로 분석하였다. 2시간 이내에는 APO가 아드리아마이신으로 가수분해되지 않았다.

[항체-PVA 결합체와 H2981 종양세포와의 결합]

H2981 종양세포에 대한 본 발명의 L6-AP 또는 1F5-AP 결합체의 결합능력을 실시예 1및 2에 기재된 바와 같이 측정하였다. 결합분석 결과를 제22도에 도시하였다.

FACS 분석결과 L6 및 L6-PVA 결합체는 모두 종양세포에 강하게 결합한 반면 1F5-PVA 결합체는 결합량이 미약한 것으로 나타났다. 이 결합분석은 우선 효소에 대한 결합이 본 발명의 면역 결합체의 항체 성분의 결합능력에 실제로 영향을 미치지 않았음을 가리키는 것이다. 두번째로, 이 분석은 결합체의 반응 특이성을 다시한번 입증한다 : 즉 L6-PVA 결합체는 L6-양성 H2981 종양세포에 결합하지만, 1F5항체는 종양세포에 대해 특이성이 없기 때문에 1F5-PVA 결합체는 실제로 결합하지 않는다.

H2981 종양세포에 대한 본 발명의 항체-PVA 결합체/아드리아마이신 전구약물 배합물의 생체외 세포독성

H2981 종양세포에 대한 본 발명의 항체-PVA/아드리아마이신 전구약물 배합물의 생체외 세포독성효과를 실시예 1 및 2에 기재된³H-티미딘 흡수분석을 사용하여 측정하였다. 간단히, H2981 종양세포를 IMDM(10,000세포/웰)중의 96-웰 마이크로타이터 평판에 옮겨놓고 37℃에서 18시간 동안 접착시켰다. 다음 항체-PVA 결합체인 L6-PVA 또는 1F5-PVA를 10㎍/㎖ 항체의 농도로 첨가하고 평판을 4℃에서 30분간 정치시켰다. 다음 웰을 다시 세척하고, IMDM으로 4회 세척하고 IMDM 중에서 APO를 여러농도로 하여 첨가하였다. 2시간 후, 웰을 다시 세척하고, IMDM을 첨가하고 세포를 37℃에서 18시간 동안 놓아두었다. 이때³H-티미딘을 첨가(웰당 1μCi)하고 6시간후, 평판을 -70℃에서 냉각시켜 세포를 분리하였다. 해동시킨 후, 세포를 유리섬유 필터 상에 수확하였다. 벡크만 3801 섬광계수기로³H-티미딘으로 인코포레이션을 측정하고 APO 또는 아드리아마이신(ADM) 단독으로 처리한 세포와 비교하였다.

이 분석법을 사용하여 종양세포의 DNA로의³H-티미딘의 인코포레이션의 저해를 측정하여, L6-PVA 또는 1F5-PVA 결합체로 처리되거나 처리되지 않은 세포에 대한 전구약물 APO의 세포독성 효과를 측정하였다. 이 배합물의 세포독성 효과를 모약물인 아드리아마이신 단독으로 처리한 세포의 경우와 비교하였다. 제23도에 나타난 바와 같이, 어떠한 결합체로도 처리하지 않은 종양세포에 대해 아드리아마이신(IC₅₀=38nM)은 APO(IC₅₀=2μM)보다 독성이 훨씬 강하였다. 이것은 아드리아마이신 아미드류가 아드리아마이신보다 독성이 약함을 보여준 앞서의 보고에 기초하여 예상된 바였다. [예컨대, 와이.레빈 및 비.에시.셀라. FEBS Letters, 98,p.119(1979) 및 알.바우라인외 공동연구자., J.Med.Chem., 23, p. 1171(1980)참고]세포를 L6-PVA로 예비처리하면 APO의 세포독성이 20배 증가되어 아드리아마이신 단독으로 처리한 수준에 필적할만한해졌다. 세로를 1F5-PVA로 예비처리하면 APO의 세포독성에 아무 영향을 미치지 않았다. 이 결과들은 L6-PVA 결합체가 비교적 비독성인 전구약물 APO를 가수분해시켜 아드리아마이신을 단독 사용했을 때와 비교할만한 정도로 세포를 사멸시킬 수 있으며, 이 특정 세포주와는 잘 결합하지 않는 1F5-PVA결합체는 이러한 독성을 보이지 않는다는 사실이 가리키듯이 이 세포독성이 항원 특이적 임을 나타내고 있다.

[디우디 임파종 세포에 대한 항체-PVA 결합체의 결합]

공지의 다우디 세포주에 대한 본 발명의 L6-PVA 및 1F5-PVA 결합체의 결합능력도 측정하였다. 이 세포주의 ATCC(ATCC # CCL 213)에 기탁된 비킷 임파종 세포주이며 1F5 항체가 결합하는 CD-20항원을 발현시킨다. 결합분석은 세포로서 다우디세포를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 것과 같이 수행하였으며 결과는 제24도에 도시하였다.

이 경우, 1F5 모노클로날 항체와 1F5-PVA 결합체는 모두 임파종 세포에 강하게 결합하였다. 그러므로, 이 연구는 결합체의 결합능력이 결합공정에 크게 영향받지 않음을 다시 한번 나타내고 있다.

더우기, 도면에서 나타난 바와 같이, L6 항체와 L6-PVA 결합체는 다우디 세포에 대해 별다른 결합을 보이지 않았다. 이것은 다우디 세포가 L6항체가 반응하는 항원을 갖고 있지 않기 때문에 예상할 수 있었다. 그러므로, 전술한 결합연구와 관련하여 이 연구는 본 발명의 결합체의 결합특이성을 명확히 입증해준다. 즉, L6-함유 결합체는 L6-양성 종양세포에 특이적으로 결합하고 1F5-함유 결합체는 CD-20 양성종양세포에 특이적으로 결합한다.

[다우디세포에 대한 항체-PVA 결합체/아드리아마이신 전구약물 배합물의 생체외 세포독성]

다음 본 발명자들은 APO 전구약물과 함께 다우디세포에 대한 L6-PVA 또는 1F5-PVA 결합체의 생체외 세포독성효과를 시험하였다.

H-티미딘 분석은 기본적으로 상술한 실시예에 기재된 바와 같이 수행하였으나 다두디세포가 비착생적(non-adherent)이기 때문에 약간의 변형을 가하였다. IMDM 중의 약 250,000 다우디세포를 96-웰 마이크로타이터 평판의 각 웰에 옮기고 항체-효소 결합체를 첨가하였다. 반응 혼합물은 30분간 4℃에서 배양시켰다. 비결합 항체-효소 결합체는 500×g로 5분간 원심분리시켜 제거하고 상등액을 제거하였다. 세포를 IMDM 중에 재현탁시키고 세척 공정을 3회 반복하여 비결합 결합체를 모두 제거하였다. 다음 IMDM 중의 APO를 2시간 동안 첨가하고 상술한 바와같이 1회 세척하였다. 분석하고 남은 잔사는 상술한 실시예에서와 같이 수행하였다.

이 분석을 사용하여, 본 발명자들은 다우디세포의DNA로의³H-티미딘의 인코포레이션의 저해를 측정하고 L6-PVA 또는 1F5-PVA 결합체로 처리하거나 처리하지 않은 세포에 대한 APO 전구약물의 세포독성 효과를 측정하였다. 이 배합물의 세포독성 효과를 아드리아마이신 단독으로 처리한 세포의 경우와 비교하였다. 제25도에 도시된 바와 같이 어떠한 결합체로도 처리하지 않은 다우디세포에 대한 아드리아마이신의 독성효과는 APO보다 훨씬 강했다. 1F5-PVA 결합체로 세포를 예비처리하자 APO 전구약물의 세포독성은 아드리아마이신으로 단독처리한 수준에 필적할만큼 증가되었으며 L6-PVA 결합체로 예비처리한 것은 세포독성이 증가되지 않았다.

L6-PVA에 APO를 더한 배합물이 세포독성이 증가를 보인 반면 1F5-PVA에 APO를 더한 배합물은 세포독성을 증가시키지 않았던 H2981 종양세포에 대해 실시한 앞서의 실시예와는 반대의 결과가 이 결합 및 세포독성 연구에서 얻어졌음을 명심해야 한다. 이것은 결합체의 L6 및 1F5항체의 상이한 특이성을 감안하여 예상된 바였으며 본 발명의 결합체/전구약물 배합물로 얻어진 세포독성 효과의 특이성을 분명히 입증해주는 것이다.

더우기, 이 연구는 종양세포에 대해 생체외 세포독성 효과를 나타내는데 있어 APO와 함께 1F5-PVA결합체의 유효성을 나타낸다. 그러므로 이 실시예의 생체외 세포독성연구는 항체와 반응하는 종양을 치료하기 위해 종양-관련 항원과 반응성인 항체를 함유하는 모든 결합체에 본 발명의 작용성을 입증해준다.

[실시예 5]

실시예 5는 항체-격합 시토신 데아미나제(CD) 효소에 의해 전구약물인 5-플루오로시토신(이하 "5-FC"라 칭함)을 항종양젱니 5-플루오로우라실(이하 "5-FU"라 칭함)로 전환시키는 본 발명의 면역결합체 및 방법에 관한 것이다(제26도 참고). 본 구체예의 항체-CD 결합체/5-FC 전구약물 배합물은 종양세포에 대한 커다란 생체외 세포독성 효과를 나타낸다.

[본 발명의 항체-시토신 데아미나제 결합체의 제조]

L6-CD 및 1F5-CD 면역결합체를 앞선 실시예에서 언급한 L6 및 1F5 모노클로날 항체와 시토신 데아미나제 효소를 사용하여 제조하였다. 비록 CD효소는 여러가지 미생물로부터 검색 및 분리되지만 [예컨대 웨스트외 공동연구자., Biochem. Biophys.Acta., 719, pp. 251-58(1982) 참고] 본 실시예에서는 피.엘.이파타외 공동연구자의 "Baker's Yeast Cytosine Deaminase, Some Enzymatic Properties And Allosteric Inhibition By Nucleosides And Nucleotides," Biochemistry, 10, pp. 4270-76(1971)에 보고된 것과 유사한 방법으로 압축 베이커 효모로부터 정제한 특수 CD를 사용하였다.

간단히, 효모세포(맥주효모군, Saccharomyces cerevisiae)(2.0㎏)를 에틸 아세테이트로 원형질 분리시키고 암모늄설페이트 침전을 2회 수행하여 조질의 효소 침전물을 얻었다. 설페이트 펠렛을 10mM 트리스-Cl 완충액(pH8.0)에 대해 투석시키고, Q-세파로스 음이온 교환 컬럼(Pharmacia)에 적용시켜 KCl 구배(0-0.3M)로 용출시켰다.

티. 니시야마외 공동연구자의 "Antineoplastic Effects In Rats Of 5-Fluorocytosine In Combination With Cytosine Deaminase Capsules" Cancer Research, 45, pp. 1753-61(1985)의 공정에 따라 27℃에서 기질로서 3mM 시토신(또는 5-FC)을 사용하여 PBS중에서 CD 활성에 대해 분획을 분석하였다. 이리하여, 본 공정에 따라, 효소 제제소량을 기질인 시토신(또는 5-FC)에 첨가하고, 0.1N HCl로 pH를 조절한 분취액에 대해 우라실(또는 5-FU)의 생성에 대해 UV 분광광도계를 반응경과를 모니터하였다.

우라실 또는 5-FU의 생성량을 측정하는데 250/280(시토신의 경우) 및 255/290(5-FC경우) 비율을 사용하였다. CD활성을 측정하는 이 공정을 다음에 기재한 본 발명의 CD-함유결합체의 정제시뿐만 아니라 CD 효과를 정제하는 각 단계에도 이용하였다.

이리하여, KCl구배로부터 활성 분획을 수집·농축하고 G-75 세파덱스 컬럼상에서 정제하였다. 이 단계에서 SDS-PAGE(14%, 비-환원)는 CD 활성이 있는 분획은 분자량 18kd의 주요단백질과 분자량 20kd 및 30kd의 소량의 단백질로 구성됨을 나타냈다. 이 분획의 CD활성은 10U/㎎ 단백질(기질로 시토신 사용)이었다. 기타 제제는 활성이 17U/㎎ 단백질인 물질을 생산하였다. 모든 단백질 분석은 피어스사(Rockford, IL)로부터 구입가능한 BCA단백질 분석시약을 사용하여 행하였다.

다음 정제 CD를 실시예 1의 AP 결합체의 경우에 기재된 것과 같은 방식으로 L6 및 1F5 모노클로날 항체에 결합시켰다. 용리액으로서 PBS를 사용하여 S-200 셀파로스 상에서 겔여과시켜 조질의 결합체(요오드아세트아미도로 처리하지 않음)을 정제하였다. 분획을 280㎚에서 모니터하고 각 분획의 CD 활성을 전술한 바와같이 분석하였다. CD-항체의 비율이 적당한 결합체를 함유하는 분획을 수집하고 SDS-PAGE로 4-12% 비-환원 구배겔에 의해 분석하여 L6-CD 및 1F5-CD결합체 제제를 생산하였다.

[항체-시토신 데아미나제 결합체와 전구약물인 5-플루오로시토신과의 반응]

전구약물인 5-FC를 5FU로 또는 기질 시토신을 우라실로 전환시키는 본 발명이 L6-CD 및 1F5-CD 결합체의 능력을 다음과 같이 측정하였다 : 유리 CD(최종농도 : 5㎍/㎖), L6-CD 결합체(CD 최종농도 : 5㎍/㎖) 또는 1F5-CD 결합체(CD 최종농도 : 5㎍/㎖)FMF 27℃에서 PBS 중의 (a) 시토신 또는 (b) 5-FC의 3mM 용액에 첨가하고 시간에 따른 생성물의 양을 상술한 실시예에 기재된 바와같이 분광광도계를 측정하였다. 결과는 제27도에 나타내었다.

제27도에 나타난 바와같이, 5-FU는 유리효소와 본 발명의 항체-CD 결합체 모두에 의해 전구약물 5-FC로부터 생성됨을 나타낸다. 이 도면은 또한 결합체가 CD 단독의 활성과 동일한 활성은 보인데서 입증된 바와 같이 효소가 어느 결합체의 항체에 결합했다고 해서 CD 효소의 활성이 크게 손실되지는 않았음을 보여준다. 결합체와 유리효소의 특히 활성은 약 4U-㎎ 효소였다.

비교를 위해, 기질로서 시토신을 사용하여 결합체의 반응성을 시험해 보았다. 도면에 나타난 바와같이 기질로 시토신을 사용한 경우, 결합체는 CD 유리효소 단독의 경우와 실제로 동일한 CD 활성을 나타내었다. 결합체의 특이활성-10U/㎎ 효소-은 CD의 본래의 효소활성이 결합체에서 유지되었음을 추가로 나타내주고 있다. 결합체를 PBS 중에서 4℃에서 보관했을 때에는 활성 수준이 수주일간 유지되었다.

[H2981 종양세포에 대한 항체-CD 결합체의 결합]

H2981 종양세포에 대한 본 발명의 L6-CD 및 1F5-CD 결합체의 결합능력을 실시예1 및 2에 기재된 바와같이 측정하였다.

결합분석 결과를 제28도에 도시하였다.

FACS 분석은 L6 및 L6-CD가 모두 종양세포에 강하게 결합하는 반면 1F5-CD 결합체는 세포에 결합하지 않음을 나타내었다. 지금까지의 결합연구와 마찬가지로 이 분석도 결합체의 결합 특이성뿐만아니라, 항체가 효소에 결합했음에도 불구하고 이 결합체가 결합 능력을 보유하고 있음을 나타낸다.

H2981 종양세포에 대한 본 발명의 항체-CD/5-FC 전구약물 배합물의 생체외 세포독성을 실시예 1 및 2에 기재된³H-티미딘 흡수 분석법과 유사한³H-류신 흡수 분석법을 사용하여 측정하였다.

이 분석에 따라, 10%(v/v)송아지 태아 혈청과 함께 IMDM 0.1㎖ 중에 10⁴h2981 세포의 현탁액을 96-웰 마아크로타이퍼 평판에 옮기고 37℃에서 하룻밤 접착시켰다. 다음 평판을 세척하고 0.1㎖ IMDM 중의 L6-CD 및 1F5-CD 결합체(10U/㎎ 결합효소 CD 활성을 함유하는 10㎍ 총단백질/㎖, 기질로 시토신 사용)를 첨가하였다. 4℃에서 30분후, 평판을 4회 세척하고, 여러가지 농도의 약물 5-FC 5-FU를 함유하는 류신을 함유하지 않는 RPMI 배지 15㎖를 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 18시간동안 배양한 다음 류신을 함유하지 않는 RPMI 0.05㎖ 중의³H-F류신(1μ Ci/웰)으로 6시간동안 펄스시켰다. 다음 평판을³H-티미딘 흡수에 대한 실시예 1 및 2에 기재된 공정에 따라 반응시켰다.

이 분석법을 사용하여, 본 발명자들은 종양세포의 단백질로의 H-류신의 인코포레이션의 저해를 측정하고, L6-CD 또는 1F5-CD결합체로 예비 처리하거나 처리하지 않은 세포에 대한 전구약물 5FC의 세포독성효과를 측정하였다. 이 결합체들의 세포독성 효과를 모약물 5-FU 단독으로 처리한 세포의 경우에 관찰된 세포독성 효과와 비교하였다. 제29도에 나타난 바와 같이, 어떠한 결합체로도 처리하지 않은 종양세포에 대하여 5-FC는 매우 약한 세포독성 활성을 보인 반면, 5-FU 는 IC₅₀=20μM로 세포의 생장을 억제하였다. 그러나, 세포를 L6-CD 결합체로 예비처리하자 5-FU로 단독 처리한 것과 같은 수준으로 5-FU의 세포독성이 증가하였다. 이 결과는 항원-결합 L6-CD가 비독성 전구약물인 5-FC 를ㄹ 5-FU로 전환시킬수 있다는 사실과도 일치한다. 비결합 결합체인 1F5-CD는 이러한 세포독성의 증가를 보이지 않았으며 이것은 증가된 세포독성이 항원 특이적 성격임을 가리키는 것이다.

본 발명인들은 지금까지 본 발명의 몇가지 실시예를 제시하였으나 본 발명의 기본 구조를 변형시켜 본 발명의 방법, 면역결합체 및 전구약물을 이용하는 기타의 실시예를 제공할 수 있음은 분명하다. 그러므로, 본 발명의 범위는 지금까지 실시예에 의해 제시된 특정 구체예에 의해서라기보다는 첨부된 특허청구의 범위에 의해 한정됨을 이해하여야 할 것이다.

Claims (15)

1. 다음의 항체-효소 결합체와 동시에 투여되거나 이후에 투여되는 모약물에 비해 세포독성이 약한 하나 이상의 전구약물을 보다 세포독성이 강한 모약물로 전환시킬 수 있는 효소에 종양세포의 표면 항원과 반응하는 항체가 결합되어 이루어지는 항원-효소 결합체를 하나 이상 함유하는, 종양세포에 세포독성 물질을 전달하기 위한 약제.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 폴리클론, 모노클론 또는 키메릭 항체인 것을 특징으로 하는 약제.
3. 제1항에 있어서, 상기 항체가 L6 또는 96.5인 것을 특징으로 하는 약제.
4. 제1항에 있어서, 상기 효소가 알칼린 포스파타제, 페니실린 아미다제, 아릴설파타제, 시토신 데아미나제, 프로테아제, D-알라닐 카르복시펩티다제, 탄수화물 분해 효소 및 β-락타마제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제.
5. 제1항에 있어서, 상기 모약물이 에토포시드, 테니포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 시스-플라티늄 및 시스-플라티늄 유사체, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드류로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제.
6. 제1항에 있어서, 상기 전구약물이 포스페이트 함유 전구약물, 설페이트 함유 전구약물, 펩티드 함유 전구약물, 글리코실화된 전구약물, β-락탐 함유 전구약물, D-아미노산 변형 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드 함유 전구약물 및 임의로 치환된 페닐아세트아미드 함유 전구약물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제.
7. 제1항에 있어서, 상기 전구약물이 에토포시드 포스페이트, 에토포시드 티오포스페이트, 에토포시드설페이트, 테니포시드 포스페이트, 테니포시드 티오포스페이트, 테니포시드 설페이트, 아드리아마이신 포스페이트, 아드리아마이신 설페이트 N⁷-C_1-8알킬 미토마이신 포스페이트 및 N⁷-C_1-8알킬 미토마이신설페이트 로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 의약품.
8. 제1항에 있어서, 상기 전구약물이 에토포시드-4'-포스페이트 또는 약리학적으로 허용되는 그것의 염, 7-(2'-아미노에틸 포스페이트) 미토마이신 또는 약리학적으로 허용되는 그것의 염. N-(p-히드록시페녹시아세틸) 아드리아마이신, N-(p-페녹시아세틸) 아드리아마이신, N-(p-히드록시페닐아세틸) 아드리아마이신, N-(p-페닐아세틸) 아드리아마이신, 5-플루오로우리딘 모노포스페이트 및 5-플루오로시토신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제.
9. 제1항에 있어서 상기 항체-효소 결합체가 L6-알칼린 포스파타제, 96.5-알칼린 포스파타제, L6-페니실린 V 아미다제, 96.5-페니실린 V 아미다제, L6-시토신 데아미나제 또는 96.5-시토신 데아미나제인 것을 특징으로 하는 약제.
10. 제1항에 있어서, 상기 항체-효소 결합체가 L6-알칼린 포스파타제이고 상기 전구약물이 에토포시드-4'-포스페이트, N₇-C_1-8알킬 미토마이신 또는 약리학적으로 허용되는 그것의 염이거나, 상기 항체-효소 결합체가 L6-페니실린 V 아미다제이고 상기 전구약물이 N-(p-히드록시페녹시아세틸) 아드리아마이신 또는 N-(페녹시아세틸) 아드리아마이신이거나, 상기 항체-효소 결합체가 L6-시토신 데아미나제이고 상기 전구약물이 5-플루오로시토신인 것을 특징으로 하는 약제.
11. 제1항에 있어서, 상기 전구약물이 상기 항체-효소 결합체에 의해 활성화될 수 있으며 제6항의 전구약물로부터 선택되는 하나 이상의 전구약물의 조합인 것을 특징으로 하는 약제.
12. 제11항에 있어서, 상기 전구약물의 조합이 에토포시드-4'-포스페이트와 N₇-C_1-8알킬 미토마이신 포스페이트 또는 약리학적으로 허용되는 그것의 염으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약제.
13. 제1항에 있어서, 상기 항체-효소 결합체가 하나 이상의 항체-효소 결합체의 조합인 것을 특징으로 하는 약제.
14. 다음의 일반식을 갖는 화합물.

    

    상기 일반식중, R¹은 H이고 R³은 OH 또는 OCH₃이거나, R¹은 OH이고 R³은 OCH₃이며 R²는 H 또는 OH임.
15. 다음의 일반식을 갖는 화합물

    

    상기 일반식중, R¹은 H이고 R³은 OH 또는 OCH₃이거나, R¹은 OH이고 R³은 OCH₃이며 R²는 H 또는 OH임.

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