KR910003119B1 - 액체 크로마토 그래피용 충전재 및 컬럼 - Google Patents

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미쓰이 도오아쯔 가가쿠 가부시기가이샤
사와무라 하루오
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Abstract

내용 없음.

Description

액체 크로마토 그래피용 충전재 및 컬럼
제1도 및 제3도는 각기 제조예1 및 제조예 2에서 얻어진 본 발명의 COAp의 X선 회절도.
제2도 및 제4는 각기 제조예 1 및 제조예 2에서 얻어진 COAp의 적외흡수 스펙트럼을 나타낸 도면.
제5도는 비교제조예 1에서 얻어진 HAp의 적외흡수 스펙트럼을 나타낸 도면.
제6도 및 제7도는 각기 실시예 1 및 실시예 2에서 행한 HPLC용 컬럼에 의한 우혈청 알부민을 전개하여 얻어진 크로마토 그래프이다.
제8도 및 제9도는 각기 실시예 3 및 실시예 4에서 행한 LC용 컬럼에 의한 우혈청 알부민을 전개하여 얻어진 크로마토그램이다.
제10도는 실시예 11에서 행한 HPLC용 컬럼에 의한 핵산을 전개하여 얻어진 크로마토그램.
제11도는 비교예 1에서 행한 LC용 유리 컬럼에 의한 우혈청 알부민을 전개하여 얻어진 크로마토그램이다.
제12도는 비교예 2에서 행한 HPLC용 컬럼에 의한 우혈성 알부민을 전개하여 얻어진 크로마토그램.
본 발명은 탄산근을 함유한 히드록시 아파타이트로 이루어진 액체 크로마토그래피용 충전재, 및 이것을 충전하여 이루어진 액체 크로마토그래피용 컬럼에 관한 것이다.
아파타이트란 넓은 뜻으로는 하기(1)식의 조성식으로 표시되는 화합물을 말하며, 이 식에서 M은 Ca, Pb, Ba, Sr, Mg, Ni, Na, K, Fe, Al그 밖의 금속원자를, ZO4는 PO4, AsO4, VO4, SO4, SiO4, CO3그밖의 산근을, Y는 F, OH, Cl, Br, O, CO3그 밖의 음이온성원자(단)을 나타내는 광범위한 화합물군의 총칭이다.
Figure kpo00001
(n+m=10, n=0 및 m=0일 경우도 포함함)
본 발명에 있어서는 상기(1)식에 있어서 M이 실질적으로(즉 불순물 레벨의 다른 원자, 원자단이 들어 있어도 좋은)Ca이며, ZO4가 실질적으로 PO4이고 Y가 실질적으로 OH인 화합물을 히드록시 아파타이트라고 부른다. 그리고, 여기서 ZO4및/또는 Y의 일부가 CO3로 치환된 것을 탄산함유 히드록시 아파타이트라고 부른다.
히드록시 아파타이트(이하 HAp라고 약기함)는 천연치나 천연뼈와 똑같은 화학조성을 갖는 무기화합물이므로, 생채 물질과의 친화성에 뛰어나다고하는 특성을 가지며, 단백질, 핵산, 산소등의 생체고분자물질의 분리·정체를 목적으로한 액체크로마토그래피(이하, LC라고 약기함)용 컬럼의 충전재로서 적절하게 사용되고 있다. 또한 근래 고속액체 크로마토그래피(이하 HPLC라고 약기함)의 보급에 의해 소량의 시료를 단시간으로 처리하는 것(미량분석), 또는 대량의 시료를 한번에 처리하는것(대량분취)이 가능해져서, HAp의 이 분야에의 응용은 금후 더욱더 확대될 것이 예상된다. 따라서, HPLC를 포함하는 LC용의 컬럼 충전재로서, 더욱 고성능이며 또한 사용하기 쉬운 HAp의 개발이 요망되고 있다.
종래의 LC용의 컬럼 충전재에 사용되는 HAp는 A. Tiselius, et.al., 에 의해 발표된 수용성의 칼슘염과 수용성의 인산염을 반응시키는 습식 합성법(Arch. Biochem. Biophys., 65, 132(1956))을 근거로 적절히 개량을 가한 방법으로 제조된 것이 일반적이었다. 이들 방법으로 얻어진 HAp는 현재로서는 LC용 컬럼 충전재로서의 성능이 뛰어나다고 말하여지고 있는 것으로서 다음과 같은 물성을 나타내는 것이 통상이다.
Ca/p 비 1.4-1.55
X선회절 회절피크가 약하다.
CO3함유량 0.1중량%미만
그러나 HAp를 제조하는 상기 종래의 방법은 원료의 조정, pH관리, 교반상태, 온도관리등의 반응 및 그후의 처리등에 매우 번잡한 조작을 필요로한다.
더구나 이 방법에서는 품질적으로 재현성 좋게 HAp를 제조하기는 매우 곤란하다. 또한 이 방법을 공업적으로 스케일업하면, 소형 스케일과 비교하여 그 재현성이 현저하게 부족되어 공업적 실시에는 좋지 않은 방법이다. 게다가 얻어진 상기 물성의 HAp는 인산나트륨 완충액중에서 냉소 보존하지 않으면, 그 물성을 유지할 수 없다고 하는 문제도 있다.
이상 기술한 바와 같이 LC용 컬럼 충전재로서 생체고분자의 분리·정제에 뛰어난 성능을 발휘하는 HAp를 종래 공지의 방법으로 재현성 좋게 제조하는 것이 곤란하며, 이점에서 HAp는 고가의 것으로 되어 있다. 그래서 HAp는 생체고분자의 분리·정제를 위한 LC용 컬럼 충전재로서 다른 충전재와 비교하여 사용 빈도가 극도로 적으며, 한정된 분야에서 사용되고 있는 실정이다.
또, 종래 사용되고 있었던 HAp는 내압성 및 내구성에 있어서, 반드시 충분하지는 않으며 특히 HPLC로서의 장기에 걸친 반복 사용이 제한되고 있었다.
본 발명은 상술한 종래 기술에 있어서의 문제를 해결하기위해 이루어진 것이다.
본 발명의 목적은 품질적으로 안정된 제조가 가능하며, 제조 원가의 저감화가 가능한 HAp를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 HPLC를 포함한 LC용의 컬럼 충전재로서, 특히 생체물질의 분리능이 향상된 HAp를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 내압 및 내구성에 뛰어난 HAp로 이루어진 HPLC를 포함한 LC용의 컬럼 충전재를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 내구성 및 생체물질의 분리능에 뛰어난 HAp를 포함하는 LC용에 적절한 컬럼을 제공하는 데 있다.
이들의 목적은 탄산근을 포함하는 HAp(탄산 함유 히드록시 아파타이트, 이후, COAp라고 약기함)의 CO3함유량으로서 측정되는 탄산근 함유량을 0.5-5.0중량%로한 COAp에 의해 달성할 수 있다.
본 발명의 LC용 컬럼의 충전재는 탄산근을 CO3로서 0.5-5.0중량% 함유한 COAp로 이루어진다. 이 충전재를 컬럼에 충전함으로써, 본 발명의 LC용 컬럼을 얻을 수 있다.
그리고, 본 발명의 충전재 및 컬럼의 용도로소의 "LC"는 "HPLC"를 포함한다.
종래의 HAp로 이루어진 충전재를 사용한 LC용 또는 HPLC용 컬럼은 앞서 기술한 바와 같이 분리능에 약간 문제가 있는 동시에 내압·내구성에 뒤진다고 하는 문제가 있었다. 또, HAp가 품질적으로 재현성 좋게 제조할 수 없다고 하는 중대한 문제도 있었다. 또한 종래의 HAp는 내압성 및 내구성이 뒤지므로, HPLC로의 반복 사용에서의 양호한 내구성이 얻어지지 않았었다.
이것에 대해, 본 발명의 COAp로 이루어진 충전재는 품질적으로 재현성 좋게 제조할 수 있으며, 더구나 생체물질의 분리능에 높다. 또한 COAp결정의 물리적 강도가 높으므로, 본 발명의 충전재는 내압성 및 내구성에 뛰어나다.
그 결과, 본 발명의 충전재를 컬럼에 충전할 때의 충전압으로서 최소한 500㎏/㎠까지의 고압을 채용할 수 있다.
또한 본 발명의 충전재를 충전한 컬럼은 HPLC에 있어서의 반복사용에서의 내구성에 뛰어나다. 또, 종래의 HAp는 평판형상의 결정형상을 하고 있기 때문에 결정을 배향시키면서 HPLC용 컬럼에 충전한다고 하는 번잡한 조작을 필요로 하였지만, 본 발명에서 사용하는 COAp의 경우는 그와 같은 배려는 특별히 필요하지 않으므로 간단히 컬럼 충전을 할 수 있다고하는 이점이 있다. 또한 압력의 조정에 의해 유속제어를 할 수 있으므로 전개액도 종래품에 비해 소량으로된다고 하는 이점도 있다. 또한 본 발명의 컬럼은 분석을 목적으로한 HPLC용 컬럼 이외에 분취를 목적으로한 분취용 HPLC용 컬럼으로서도 적절하게 이용할 수 있고, 필요한 시료를 단시간내에 순도좋게 분리·정제할 수 있는 것이다.
또한, HAp를 충전한 종래의 컬럼을 사용하여 분취를 할 경우, 분취한 샘플의 용리액으로서 통산 인산염의 액이 사용되는 관계상, 용리후의 처리로서 탈염을 필요로할 경우도 때때로 있지만, 이 경우 분리조작 자체는 단시간이라도, 후처리를 포함하면 결코 단시간이라고는 할 수 없었다. 그러나, 본 발명의 COAp로 이루어진 충전재에 대해서는 용리액으로서 지금까지 적합하지 못한 것으로 생각되었던 휘발성의 탄산염계 용리액이 사용가능하므로 처리후의 시간을 대폭 단축할 수 있다고하는 이점도 가지고 있다. 이점은 특히 핵산을 분리정제할 때 위력을 발휘한다.
즉 핵산류로서 예를들면 프라스미드 DNA를 분리·정제할 경우는 분리후 최종적으로는 분취액에 에탄올을 가하여 핵산을 침전시켜 회수 보존된다. 그러나 이 조작은 인산염을 포함하는 액에서는 인산염도 함께 석출침전하므로 전처리로서 인산염의 탈염이 필요했었다. 그러나 여기서 휘발성염을 사용하면 직접 에탄올 첨가에 의한 침전석출이 실시가능하며, 합계의 처리시간이 대폭 경감된다.
여기서 탈염처리란 투석을 가리키며, 용리액에 인산을 사용했을 경우, 이처리에는 통상 15-24시간을 필요로하고 있었지만 본 발명에서는 탄산염계 용리액이 사용 가능하므로, 이 탈염처리 시간은 1시간 이내로 대폭 단시간으로 완료할 수 있다. 이 탄산염게 용리액의 사용은 COAp와 같은 탄산근을 함유하는 아파타이트를 사용하는 것으로 보다 효과적으로 된다.
또한 본 발명의 탄산근 함유 아파타이트로 이루어진 LC용 충전재 및 이것을 충전한 LC용 컬럼의 이점으로서, 종래 안되는 것으로 되어 있었던 탄산근을 포함하는 용리액을 사용할 수 있다는 점도 들 수 있다. 즉, 지금까지의 HAp, 를 충전한 LC용 컬럼에 탄산근을 포함하는 용리액을 통액하면 컬럼이 패색되어 통액이 곤라해진다. 이것은 탄산근이 아파타이트와 반응을 일으키기위한 것으로 생각된다. 한편 본 발명의 탄산근 함유 아파타이트의 경우는 미리 탄산근을 함유하고 있기 때문에 탄산근을 포함하는 용리액을 통액하여도 문제가 생기지 않는 것으로 생각된다.
이상 여러가지 열거한 바와 같이, LC용 및 HPLC용 컬럼의 충전재에 COAp를 사용함으로써 여러가지 효과가 있으며, 본 발명의 효과는 경제적으로 매우 큰 것이 있다.
본 발명의 LC용 충전재는 탄산근을 CO3로서 0.5-5.0중량%함유한 COAp로 이루어진다.
본 발명에 있어서의 탄산근 함유량이란, 일본 화상비료협회 기술전문위원회(Technical Comittee Japan phasphate ＆ Compound, Fertilizers Manufacturer's Association)이 정하는 인광석분석법에 준해서 측정한 무수탄산(CO2)의 측정치를 CO3함유량으로 환산한 것이다.
본 발명에서 사용되는 COAp의 제조 방법에는 특별한 제한은 없으며, 종래 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를들면 제 2인산칼슘과 탄산칼슘을 암모니아수 중에서 반응시키는 방법이나 제 2인산칼슘 2수염과 탄산칼슘을 수중에서 반응시키는 방법, 유기 용매를 포함하는 반응 매체중에서 인산 및/또는 그 칼슘염과 탄산칼슘을 반응시키는 방법등, 어떤 방법으로도 얻을 수 있다.
그러나, 본 발명에 사용되는 COAp중에는 탄산근이 CO3로서 0.5-5.0중량%의 범위로 함유하고 있는 것이 바람직하다. 아파타이트의 제조 기술면에서는 CO3함유량으로서 7.0%까지 조절 가능하지만, 5.0%를 넘을 경우는 크로마토그래피의 충전재로서의 분리성능이 저하되어 바람직하지 못하다.
따라서, 본 발명에 있어서는 COAp는 인산 및/또는 그 칼슘염과 탄산칼슘을, 암모니아수, 물, 유기용매의 어느 하나의 반응용매체 중에서 하기와 같은 몰비로 반응시켜서 얻을 수 있다.
즉 반응조에 암모니아수, 물, 유기용매의 어느 하나를 반응용매체로서 사입하고, 이것에 인산 및/또는 그 칼슘염과 탄산칼슘을 가하여 통상 대기압하에서 반응용매체를 가열하고, 증발한 반응용매체는 환류시키는 방법으로 반응시킨다. 그리고, 이때의 인산 및/또는 그 칼슘염과 탄산칼슘의 비율은 칼슘과 인의 원자비가 Ca/p로서 1.30-1.90바람직하게는 1.45-1.75의 범위이며, 또 탄산근과 인의 비율은 CO3/PO4로서 0.015-1.90의 범위에서 실시된다. 반응 시간은 매체가 암모니아수 또는 물의 경우는 대략 5-8시간 필요하며, 반응용 매체가 유기용매를 함유할 경우는 약 2시간 있으면 충분하다.
가열 종류후는 생성한 COAp가 석출되어 슬러리모양으로 되어 있으므로, 이것을 통상 공지의 방법으로 여별·분류하여 건조하면된다.
COAp의 원자비(Ca/p)는 이론적으로는 5/3이므로 칼슘과 인과의 반응시에 있어서의 원자비도 5/3≒1.67이 가장 적합할 것이지만 실제의 반응시에는 원자비가 상기 범위내에 있으면 적절하게 COAp를 합성할 수 있다.
상기 반응의 원료로서 사용하는 인산 및/또는 그 칼슘염으로서는 H3PO4, H4P2O7, HPO3, P2O5, Ca(H2PO4)2·H2O, Ca(PO3)2, CaHPO4, CaHPO4·2H2O, Ca2P2O7, Ca3(PO4)2, Ca8H2(PO4)6·5H2O등이 사용가능하다. 그러나, 이들 화합물은 본 발명에 있어서 사용 가능한 원료의 일부이며, 이들에 한정할 필요는 없다. 또 이들 화합물은 특별히 고순도의 것을 사용할 필요는 없으며, 통상, 시판의 공업용의 것으로 충분하다. 지금 하나의 원료인 탄산칼슘도 역시 공업용의 것으로 충분하다.
칼슘원으로서, 상기와 같은 인산의 칼슘염외에 CaO, Ca(OH)2, CaCl, Ca(NO3)2, (CH3COO)2Ca등의 칼슘의 산화물, 수산화물 및 무기산과 유기산의 칼슘염을 사용할 수도 있다.
또 탄산원으로서, 본 발명에서는 칼슘원자의 보급으로도 되므로, 탄산칼슘을 사용하지만 K2CO3, KHCO3, Na2CO3, NaHCO3(NH4)2CO3, NH4HCO3등의 탄산염이나 탄산가스를 사용해도 지장은 없다.
본 발명에 있어서는 탄산칼슘과 상기와 같은 인산 및/또는 그 칼슘염의 1종류 이상을 적절히 선택하여, 칼슘과 인의 원자비 Ca/P가 1.30-1.90, 바람직하게는 1.45-1.75로 되도록 반응조에 투입하면 된다. 또, 상기 탄산칼슘의 투입량을 변화시킴으로써, 생성하는 COAp중에 함유하는 탄산근의 함유량을 조정할 수 있으며 이 방법에 의해 탄산근을 CO3로서 7.0중량%이하의 범위에서 조절할 수 있다.
본 발명에 있어서, 반응용매체의 사용량은 그 종류, 반응시의 교반상태등에 의해 각기 적성치가 다르지만, 어느 조건에 있어서도 슬러리 농도로서 5-60중량%로 되는 양이 바람직하다.
본 발명에 있어서, COAp의 제조시에 반응용매체로서 암모니아수를 사용할 경우는, 농도가 5-28중량%의 것을 사용한다. 또 반응 용매체로서 사용할 수 있는 유기용매로서는 예를들어 벤젠, 톨루엔, 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 데칸, 각종 석유나 프사나 공업용 가솔린 등의 방향족 및 지방족 탄화수소류; iso-부틸알코올, n-아밀알코올등의 알코올류; 트리에틸아민, 트리부틸아민, 에탄올아민등의 아민류; 에틸에테르, 에틸부틸에테르나 각종 세르솔브, 카르비톨등의 에테르류; 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤등의 케톤류를 들 수 있다. 그러나 이들은 본 발명에 있어서는 사용 가능한 유기용매의 일례에 지나지 않는다.
이렇게 해서 얻어진 COAp는 액체 크로마토 그래피용, 특히 고속액체 크로마토 그래피용 충전으로서 사용했을 경우, 생체 고분자물질의 분리·정제에, 종래의 HAp를 사용했을 경우보다도 더욱 뛰어난 성능을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 COAp의 입경에 대해서는 0.5㎛에서 50㎛의 범위의 것을 사용하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 2㎛에서 15㎛의 것이 선택된다.
본 발명에 있어서는 이 COAp를 컬럼으로 충전하여 액체 크로마토 그래피용 컬럼으로 하지만, COAp를 컬럼으로 충전하는 방법으로서는 종래 공지인 습식충전법(슬러리법)등을 사용할 수 있다.
즉, 습식충전법에는 평형밀도법, 비평형밀도법, 고점도법 등이 있지만, 이들중에서 충전재인 COAp의 입경 및/또는 물리적 강도를 고려하여, 적절히 바람직한 충전법을 선택하면된다.
COAp를 컬럼에 충전하는 데는 패커라고 불리우는 충전 용기와 고압펌프가 필요하다. 또, 충전에는 충전용 용매를 사용하며, COAp는 이 용매의 1-20중량%의 슬러리로하여 상기 패커에 부어넣어, 70-350㎏/㎠의 일정압력으로 충전하는 것이 바람직하다.
상기 충전용 용매로서는 테트라브로모에탄, 테트라클로로, 에틸렌, 4염화탄소, 메틸알코올, 에틸알코올, n-프로필알코올, 이소프로필알코올, 물, 아세톤, 디옥산, 클로로포름, 테트라히드로 푸란, 시클로헥산올, 에틸렌글리콜 등을 들 수 있다. 그리고 이들 용매의 1종 또는 2종 이상을 조합하면 된다.
본 발명의 충전재를 충전하는 컬럼의 재질, 형상, 크기는 그 용도에 따라 선택할 수 있다.
즉, 컬럼의 크기에 대해서는 내경 1㎜정도의 소형분석용부터 내경 100㎜이상의 분취용 사이즈의 컬럼에 적용할 수 있다. 예를들면 HPLC용 컬럼의 경우에서는 내경 3㎜ 유효길이를 3㎝정도의 분리용 컬럼, 내경 7.6㎜, 유효길이 10㎝정도의 분석 및 미크로분취용 컬럼 내경 50㎝ 유효길이 50㎝의 대형분취용 컬럼등이 예로서 들 수 있다. 이들 분취용 소형컬럼에서 분취용의 대형컬럼까지 그 분리특성의 컬럼에 대한 의존성이 매우 적다.
또 컬럼의 재질에 대해서는 통상 액체 크로마토그래피용 컬럼으로 사용되는 재질 예를들어 스테인레스 스틸, 유리, 수지등의 일반적인 재질을 사용할 수 있다.
특히 본 발명의 충전재는 분석용의 소형(내경 1㎜정도)에서 공업용의 대형(내경 100㎜이상)까지 적용할 수 있으며, 그 분리 특성의 컬럼의 스케일에 대한 의존성이 매우 적다.
그리고, 본 발명의 충전재를 HPLC용의 컬럼에 충전할 경우에는 충전밀도를 0.5g/㎤이상으로 하면, 분리성능이 더욱 향상되므로 바람직하다. 또 지나치게 충전밀도를 올리면 컬럼의 통액저항이 커져서 바람직하지 못하므로 충전밀도의 상한은 1.1g/㎤정도이다.
[실시예]
다음에, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 그리고 다음에 있어서 %는 중량%를 나타낸다.
[제조예 1]
증류수 2ℓ, Ca(OH)2분말 74g 및 CaCO3분말 68g을 교반기 및 환류냉각기를 구비한 유효용적 3ℓ의 세퍼러블프라스크에 사입하고, 교반하면서 다시 농도 40%의 H3PO4수용액 200㎖을 15분간으로 첨가한 다음, 가열하여 비등온도(약 98℃)로 5시간 반응시켰다.
반응 종료후는 생성물을 냉각후, 가압 여과기로 여과·수세하고 이어서 130℃로 16시간 건조하여 백색의 분말을 83g얻었다.
이 분말의 X-선 회절도를 제1도에 나타낸다.
제1도에서 명백한 바와 같이 X선 회절도는 회절각도 2θ=31.7, 32.2, 32.8에 주피크를 가지며, ASTM카드 9-432에 기재한 COAp의 특성회절피크와 일치하였다. 또 적외흡수스펙트럼을 제2도에 나타낸다. 제2도에서 명백한 바와 같이 1450㎝-1, 870㎝-1부근에 C-O의 흡수피크가 관찰되었다. CaO함유량은 EDTA킬레이트 적정법에 의해 측정하였으며, P2O5함유량은 비색정량법에 의해 측정하였다. 또 이 COAp의 물성 분석결과를 제1표에 나타낸다.
[제조예 2]
Ca(NO3)2분말 83.6g을 용해한 수용액 1에 농도 28%의 암모니아수를 가하여 pH 10으로 조정한 다음, 이것을 제조예 1에서 사용한 세퍼러블플라스크에 사입하고 잘 휘저어 섞었다.
이어서, 이 수용액에 (NH4)2HPO4분말 39.6g과 NH4HCO3분말 11.9g을 용해시킨 혼합수용액 1을 5-10㎖/min의 속도로 서서히 첨가하였다. 그런 다음에 이것을 교반하면서 가열하여, 비등온도(약 98℃)로 5시간 반응시켰다.
반응 종료후는 제조예 1과 같이 하여, 생성물을 여과·건조하여 백색의 분말을 38g얻었다. 이 분말의 X선 회절도를 제3도에 나타낸다.
제3도에서 명백한 바와 같이 X선 회절도의 회절각도는 제1도와 같은 주피크를 가지며, COAp로 특정된다. 또 적외흡수 스펙트럼을 제4도에 나타낸다. 제4도에서 명백한 바와 같이 제2도와 같은 C-O의 흡수피크가 관찰되었다. 또 이 COAp의 물성분석 결과를 제1표에 나타낸다.
[제조예 3]
Ca(H2PO4)2·H2O 75.6g, CaCO370.0g, 물 100g 및 n-헥산 350g을 교반기 및 환류냉각기를 구비한 유효용적 1ℓ의 세퍼러블프라스크에 사입하고, 교반하면서 승온시켜 환류온도(63℃)이하에서 약 2시간 가열하여 반응시킨 다음, 세퍼러블 프라스크내의 수분과 n-헥산을 증발시켜, 유출한 n-헥산과 물에 해당하는 용량의 n-헥산을 계내에 가하면서 가열을 하였다. 조작이 진행됨에 따라 세퍼러블프라스크내의 온도가 상승하여, 내온이 68℃를 넘은 시점에서 가열을 중지하여, 생성물과 제조예 1과 같이 여과·건조시켜 백색의 분말을 얻었다.
이 분말에 대해, 제조예 1과 같이 X선 회절 및 적외선 흡수 스펙트럼에 의해 COAp임을 확인하였다.
[제조예 4]
CaHPO481.6g, CaCO340.0g, 물 200g 및 농도 28%의 암모니아수 10g을, 제조예 3에서 사용한 세퍼러블프라스크에 사입하고 잘 교반하였다. 그런후에 이것을 교반하면서 승온시켜 80-100℃의 온도로 5시간 반응시켰다.
반응 종료후는 제조예 1과 같이하여, 생성물을 여과·건조시켜 백색분말상의 COAp를 110g 얻었다. 이 COAp의 물성 분석결과를 제1표에 나타낸다.
[제조예 5-8]
Ca(H2PO4)2·H2O, CaHPO4·2H2O, CaHPO4, CaCO3의 각 분말, 물 및 유기용매를 제2표에 표시한 조건으로 세퍼러블프라스크에 사입하고, 제2표에 표시한 이외의 조건에 대해서는 실시예 1과 같은 조작에 의해 백색 분말상의 COAp를 제2표에 나타낸 양을 얻었다. 이 COAp의 물성분석 결과를 제1표에 나타낸다.
[제조예 9]
제조예 2를 50배로 스케일 업하여 그 재현성을 확인하였다. 즉 Ca(NO3)2분말 4.18㎏을 용해한 수용액 50ℓ에 농도 28%의 암모니아수를 더하여 pH 10으로 조정한 후, 이것을 교반기 및 환류 냉각기를 갖춘 유효용적 50ℓ의 스텐레스제 반응조에 넣어 잘 교반하였다.
이어서, 이 수용액에 (NH4)2HPO4분말 1.98㎏과 NH4HCO3분말 595g을 용해시킨 혼합수용액 50ℓ을 250-500㎖/min의 속도로 서서히 첨가하였다. 이하, 제조예 2와 동일의 조작을 행하여, 백색 분말형의 COAp를 제2표에 표시한 양을 얻었다. 이 COAp의 물성을 제1표에 표시한다.
[비교제조예 1]
종래법에 의한 방법(A·Tiselius등의 방법 Arch·Biochem·Biophys, 65, 132(1956)에 따라서 HAp를 이하와 같이하여 합성하였다.
유효용적 3ℓ의 프라스크에 농도 0.5Mol/1의 CaCl2수용액 1ℓ와 농도 0.5㏖/1의 Na2HPO4수용액 1ℓ을 매분 120적의 율로 동시로 적하하고, 교반기로 천천히 교반하면서 반응을 행하였다. 적하종료후, 웃물을 테칸테이션에 의하여 제거하고, 잔류한 침전물을 4회, 각각 2ℓ의 증류수로 세척하였다. 다음에 이 침전물에 2ℓ의 증류수를 더하여, 그위에 농도 40%의 NaOH 수용액을 50㎖보탠후 1시간 비등하였다.
반응액을 다시 데칸테이션에 의하여, 웃불을 제거하고, 재차 2ℓ의 증류수로 4회 세척하였다. 다음에 pH 6.8로서 농도 0.01㏖/1의 인산나트륨 완충액을 2ℓ보태어 비등 직전까지 가열하였다. 이 조작을 2회 되풀이하나, 비등시간은 각각 5분과 15분으로 하였다. 다음에 pH 6.8로서 농도 0.01㏖/1의 인산 나트륨 완충액을 2ℓ 보태어 2회 비등(각 15분간)시켜서 제1표에 표시하는 양의 HAp 36g을 얻었다.
이와 같이 하여 얻어진 HAp는 pH 6.8로서 농도 0.001㏖/1의 인산나트륨 완충액에 넣어, 냉장고에서 보존하였다.
그 결과를 제1표에 표시하고 HAp를 얻었다. 또 이 HAp의 적외흡수 스펙트럼을 제5도로 도시하나, 제5도에서도 명백하듯 탄산근(C-O)의 흡수스펙트럼(1450㎝-1, 870㎝-1부근)은 보이지 않았다.
[제1표]
Figure kpo00002
[제2표]
Figure kpo00003
[실시예 1-2]
내경 7.6㎜, 길이 100㎜의 HPLC용 금속 칼럼에, 제조예 1 및 2에서 얻어진 COAp를 통상의 방법에 의하여 10㎏/㎠-G의 압력으로 각각 충전하여, 2종의 칼럼을 만들었다. 충전 종료후 각 컬럼을 HPLC장치에 칼럼을 장착하였다. 양 칼럼 공히 충전 밀도는 0.52g/㎤였다.
각 칼럼의 분리능의 평가를 행하기 위하여 트립토판(0.16%), 우혈청 알브민(4.6%), 리조튬(2.0%), 및 티트로클롬(1.0%)를 함유하는 혼합용액을 표준시료로서 사용하여 전개를 행하였다. 전개는 인산 완충액 10mM (pH 6.8)과 350mM (pH 6.8)에 의한 직선 농도 구배법에 의하여 행하고, 상기 표준시료를 10.0ul주입하였다. 또, 유속은 1㎖/min이 되도록 7.5㎏/㎠의 전개압으로 하였다.
단백질의 검출은 280㎚의 흡광도를 측정하였다. 제조예 1로서 얻은 COAp를 갖는 칼럼으로 얻어진 크로메트그램을 제6도에, 제조예 2에서 얻은 COAp를 갖는 칼럼으로 얻어진 크로메트그램을 제7도에 표시한다. 제6도 및 제7도에서도 명백하듯이, 주된 피크가 4개처에서 나타나 있으며, 표준시료인 4성분이 깨끗이 분리되어 있음을 알았다. 각 피크는 좌측으로부터 트립토판, 우혈민, 알부민, 리조튬, 티토클롬C에 대응하는 피크인 것을 확인하였다. 그리고 티토클롬C에는, 2종의 이성체가 있고, 피크가 2개로 분리되고 있다.
[실시예 3-4]
제조예 2 및 9에서 얻어진 COAp를 써서, 이하에 표시하는 칼럼크로메트의 조작순서에 따라 우혈청 알부민의 정제를 행하였다. 즉, COAp 각 10g을 500㎖의 비커에 의하여, 이온 교환수(이단지 물로 약기한다)를 조용히 보태어, 천천히 교반하였다. 10분간 정치후 데칸테이션 하였다. 이 조작을 윗물이 맑아질때까지 다시 되풀이 하였다. 그후, 직경 10㎜의 크로매트그라피용(LC용)의 유리칼럼에 현탁한 COAp를 중층하였다(충전 높이 100-120㎜). 그후 COAp가 충전된 유리칼럼의 세척을 물로 행하여, 동시에 유속의 측정을 행하였다(약 10㎖/h가 되도록 충전하였다). 다음에 1% 우혈청 알부민 수용액 1㎖를 칼럼에 옮겨, 칼럼내의 COAp 우혈청 알부민을 흡착시켰다. 이때의 조작은 모두 실온에서 행하였다. 다음에 흡착시킨 우혈청 알부민 칼럼으로부터 용출하기 위하여, 인산 나트륨 완충액(pH 6.8)으로서 전개를 행하였다. 용출액은 중량 분획형의 프랙션 크렉터로 수집하였다(1시험관당 2.5g의 용출액). 얻어진 용출액의 흡광도는, 자외부 280㎚로서 측정하였다. 제조예 3에서 얻어진 COAp를 갖는 칼럼에서 결과를 제8도에, 제조예 9에서 얻어진 COAp를 갖는 칼럼에서의 결과를 제9도에 표시한다. 제8도, 제9도에서 본 발명의 COAp는 비교 제조예의 아파타이트를 쓴 경우의 제11도에 비교하여 샤프한 크로매토패턴이 얻어져 있으며 뛰어난 분해능을 보이고, 흡탈착에 뛰어난 것을 안다.
[실시예 5]
내경 7.5㎜, 길이 100㎜의 HPLC용 칼럼에, 10㎏/㎠-G의 압력으로 제조 예3에 의하여 얻어진 COAp를, 실시예1 및 2와 동일의 방법으로 충전하고, 그 이후의 조작은, 실시예1 및 2와 동일하게 하여 HPLC용 칼럼의 조작을 행하였다. 충전 밀도는 5.2g/㎤였다. 각 피크의 유지시간 및 반 값폭에 의하여 그 결과를 제3표에 표시한다. 제3표에서 아는 바와 같이 실시예1 및 2에서 얻어진 크로매트그라피와 같은 결과를 표시하였다.
[실시예 6]
내경 7.6㎜, 길이 100㎜의 HPLC용 칼럼에, 80㎏/㎠의 압력으로 제조 예6에 의하여 얻어진 COAp를 충전하고, 그 이후의 조작은, 실시예1 및 2와 동일하게 하여 HPLC용 칼럼 조작을 행하였다. 충전 밀도는 0.06g/㎤였다. 그 결과를 실시예 5와 동일하게 제3표에 표시한다. 제3표에서도 알 수 있듯이, 실시예1 및 2에서 얻어진 크로마트그라피와 같은 결과를 나타내었다.
[실시예 7]
실시예 6에서 사용한 칼럼에 대하여, 표준시료의 분리를 300회 행하였다. 300회째에 얻어진 크로매토그램의 결과를 실시예 5와 동일하게 제3표에 표시한다. 제3표에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 칼럼은 300회의 되풀이 사용에 대하여도 좋은 분리능을 나타내고, 뛰어난 내구성을 갖고 있는 것을 알 수 있다.
[실시예 8]
내경 7.6㎜, 길이 100㎜의 HPLC용 칼럼에, 500㎏/㎠의 압력으로 제조예 7에 의하여 얻어진 COAp를 밀도 1.03g/㎤로 충전하고, 그 이후의 조작은 실시예1 및 2와 동일한 조작으로 HPLC용 칼럼의 조작을 실시하였다. 그 결과를 실시예 5와 동일하게 제3표에 표시한다.
제3표에서, 높은압력으로 COAp를 칼럼에 충전하고 있는데도 불구하고 실시예5 및 6에서 얻은 크로매토그램과 동일한 결과를 나타내고, 내압성이 우수함을 알 수 있다.
[실시예 9]
내경 21㎜, 길이 250㎜의 분취용 칼럼에 80㎏/㎠-G의 압력으로 제조예5에 따라 얻은 COAp를 밀도 0.62g/㎤으로 충전하고, 조작법은 실시예1 및 실시예2와 동일한 방법으로 HPLC용 칼럼의 조작을 실시했다. 단, 표준시료는 70㎕ 주입했다. 이것으로 얻은 크로매트그램의 결과를 실시예5와 동일하게 제3표에 표시한다. 제3표의 결과에서 본 발명의 칼럼에 의하면 통상의 HPLC와 동일한 결과가 얻어지고, 분취용으로서도 충분히 사용할 수 있음이 판명되었다.
[실시예 10]
내경 7.6㎜, 길이 100㎜의 HPLC용 칼럼에 80㎏/㎠-G 압력으로 제조예7에 따라 얻은 COAp를 밀도 0.58g/㎤으로 충전하여 그 이하의 조작은 실시예1 및 실시예2와 동일하게 실시했다. 단, 전개중의 유속이 3.4㎖/min가 되도록 압력을 50㎏/㎠-G로 조정했다. 이것으로 얻은 크로매토그램의 결과를 실시예5와 동일하게 제3표에 표시한다. 제3표와 같이 분리를 단 시간으로 했는데도 불구하고 각각의 4개의 피크가 깨끗이 분리되고 있음을 알 수 잇다.
[제3표]
Figure kpo00004
(주) 1. 상기 표중에서 BSA는 소혈청 알부민을 표시.
2. 괄호내의 수치는 피크반치폭을 표시.
[실시예 11]
실시예 5에서 사용한 HPLC 칼럼을 사용하여 핵산에 대한 분리능의 평가를 탄산염을 전개액으로 하여 실시했다.
핵산의 샘플에는 미국 시그머사제의 송아지 흉선 디옥시리보핵산(DNA)을 사용하여 전개는 증류수와 탄산수소 암모늄 수용액 2M(pH 7.8)에 의한 직선 농도 구배법으로 실시하고, 상기 샘플을 10.0㎕ 칼럼에 주입했다. 또 유속은 1㎖/min이 되도록 7.5㎏/㎠-G의 전개압으로 했다.
핵산의 검출은 260㎚의 흡광도를 측정했다. 이 칼럼에 의하여 얻은 크로매토그램을 제10도에 도시한다. 제10도와 같이 주된 피크가 2개소 나타나고, 일부 열처리를 실시하여 한줄쇄가 된 핵산이 2줄쇄의 그것과 깨끗이 분리되고 있음을 알 수 있다. 또 각각의 피크분취액에 에탄올을 첨가하여 핵산을 실형상의 침전물로 직접 회수했다.
[실시예 12]
표준시료에 의한 분리능 평가를 끝낸 실시예 6에서 사용한 칼럼에 대하여 실시예11의 조작을 50회 실시했다. 본 조작 종료후, 재차 표준시료에 의한 분리능 평가를 실시한 결과 칼럼의 열화는 전혀 없었다.
[비교예 1]
비교 제조예 1에 따라 얻은 HAP를 사용하여 이하 실시예3 및 실시예 4와 동일한 방법으로 소혈청 알부민의 분리를 실시했다. 얻은 결과를 제11도에 도시한다.
실시예3 및 실시예 4에서는 우수한 분리능을 나타내고, 흡탈착이 우수한 것에 대하여 비교 제조예 1에 따라 얻은 탄산근을 함유하고 있지 아니한 HAp는 제11도에서 회수량이 저하되는 것을 알 수 있다.
[비교예 2]
비교 제조예 1에 따라 얻은 HAp를 내경 7.6㎜, 길이 100㎜의 칼럼에 충전하고, 그후의 조작은 실시예 4와 동일한 조작으로 표준시료의 분리를 실시했다. 또 이때의 충전 밀도는 0.28g/㎤이었다. 또 유속을 1㎖/min으로 하기 위하여 1㎏/㎠-G의 압력이 되도록 조정을 했으나 HPLC로서는 저압이 되기 때문에 조작이 곤란하였다.
이것으로 얻은 크로매토그램을 제12도에 도시한다. 제12도와 제6도 및 제7도의 비교에서도 알 수 있듯이 종래법에 따라 얻은 HAp를 충전한 것은 전체적으로 넓은 피크를 나타냈다.
[비교예 3]
비교 제조예 1에 따라 얻은 HAP를, 내경 7.6㎜, 길이 100㎜의 칼럼에 충전 압력 15㎏/㎠-G로 충전했다. 그러나 내부에서 결정이 파괴되어 막혀서 전개를 실시할 수가 없었다.
[비교예 4]
비교 제조예 1에 따라 얻은 HAP를 내경 7.6㎜, 길이 100㎜의 칼럼에 충전하여 실시예12와 동일한 조작을 실시했으나 5회째에서 칼럼 압력이 상승하여 전개가 불가능했다.

Claims (3)

  1. 탄산근을 CO3로서 0.5-15.0중량% 함유한 히드록시 아파타이트로 구성되는 액체크로마토그래피용 충전재.
  2. 제1항의 충전재를 충전한 액체 크로마토그래피용 칼럼.
  3. 제2항에 있어서, 충전재의 충전 밀도가 0.5g/㎠이상인 액체 크로마토그래피용 칼럼.
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