KR860002193B1

KR860002193B1 - A-21978c 사이클릭 펩타이드 유도체의 제조방법

Info

Publication number: KR860002193B1
Application number: KR1019830002223A
Authority: KR
Inventors: 데보노 마누엘
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니; 아더알. 웨일
Priority date: 1982-05-21
Filing date: 1983-05-19
Publication date: 1986-12-30
Also published as: GR78850B; US4396543A; HU193528B; PT76702B; KR840005077A; CA1216580A; RO86723B; DD210258A5; PL242097A1; DK221283D0; PT76702A; FI831747A0; ES522559A0; ATA178483A; PH23417A; DK221283A; ES8407011A1; RO86723A; AT381104B; FI831747L

Abstract

내용 없음.

Description

A-21978C 사이클릭 펩타이드 유도체의 제조방법

본 발명은 신규한 항생제인 다음 일반식(1)의 A-21978C 사이클릭 펩타이드 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 반합성적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기식에서,

R은 수소, 특정한 아미노아실 또는 N-알카노일아미노아실그룹, 8-메틸데카노일, 10-메틸운데카노일, 10-메틸도데카노일, A-21978C인자 C₀의 특정한 C₁₀-알카노일 그룹 또는 A-21978C인자 C₄및 C₅의 특정한 C₁₂-알카노일그룹 또는 아미노-보호그룹이고 ; R¹은 수소, 특정한 아미노아실 또는 N-알카노일아미노 아실그룹 또는 아미노-보호그룹이며 ; 단 R이 아미노아실 또는 N-알카노일아미노아실이 아닌 경우에는 R¹은 아미노아실 또는 N-알카노일아미노아실이어야 하고, R¹이 아미노-보호그룹인 경우에는, R은 아미노아실 또는 N-알카노일아미노아실 이어야 한다.

상기 일반식(1)의 A-21978C 사이클릭 펩타이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 그 자체로 유용한 반합성 항생제이거나, 그의 중간체로서 유용하다.

병원성 미생물의 항생제-특이 내성 균주가 발생할 수 있는 가능성이 높아지며, 이러한 위협이 계속되고 있으므로 신규 항생제의 개발이 절실히 요구되고 있다. 특히, 그람 양성균인 스타필로코커스(Staphylococcus) 및 스트렙토코커스(Streptococcus) 속에 속하는 균은 페니실린 및 에리트로마이신과 같이 통상적으로 사용되는 항생제에 내성을 보이는 경우가 종종 있다[참조 : W. O. Faye, Principles of Medicinal Chemistry, pp 694-686(1974)].

본 발명에 따라서, A-21978C 사이클릭 펩타이드 신규 유도체 및 그의 약학적으로 허용되는 염은 효과적인 항생제인 것으로 밝혀졌다.

이러한 신규 유도체는 적절히 차단된 A-21978C 복합체 또는 그의 적절히 차단된 개별적 인자인 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄또는 C₅를 탈아실화시켜 제조한 A-21978C 핵을 또는 그의 보호된 유도체를 목적하는 아실화제 또는 그의 활성화 유도체와 반응시켜 제조할 수 있다.

본 발명에서는 다음의 약어가 사용되는데, 이들중 대부분은 이 분야에 통상적으로 알려져 있다.

Ala : 알라닌

Asn : 아스파라긴

Asp : 아스파르트산

Gly : 글리신

Kyn : 키누레닌

Orn : 오르니틴

Ser : 세린

Thr : 트레오닌

Trp : 트립토판

t-BOC : 3급-부톡시카보닐

Cbz : 벤질옥시카보닐

DMF : 디메틸포름아미드

THF : 테트라하이드로푸란

HPLC : 고속액체크로마토그래피

NMR :¹H핵자기공명

TLC : 박층 크로마토그래피

UV : 자외선

A-21978C 항생제는 밀접하게 연관된 산성 펩타이드 항생제로서, 미합중국 특허 제4,208,403호에 기술되어 있다. 상기 특허에 기술된 바와같이, A-21978C 항생제의 복합체는 주성분으로서, 그 자체가 밀접하게 관련된 인자의 복합체인 인자 C를 함유한다. A-21978C 복합체로 불리우는 A-21978인자 C는 개별적 인자인 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅를 함유하는데, 인자 C₁, C₂및 C₃가 주인자이며, 인자 C₀, C₄및 C₅는 부인자이다. A-21978C 인자의 구조는 다음 일반식(2)와 같다.

상기식에서, 3MG는 L-트레오-3-메틸글루탐산을 나타내고, R^N은 특정한 지방산 잔기를 나타낸다.

각 인자의 특정한 R^N그룹은 다음과 같다 :

* 아직 확인되지 않은 상태이다.

펩타이드 항생제의 탈아실화 문제에 접하게 될때, 이를 위해 사용할 수 있는 효소를 찾아내는 문제는 극히 어렵다. 특히, 기질인 항생제가 사이클릭 펩타이드 핵을 함유하는 경우에는 그런 효소를 발견하는 것이 더욱 어려워진다. 효소는 고도의 특이성을 가지므로 기질의 펩타이드 부위 및 측쇄의 차이는 탈아실화의 결과에 영향을 미치게 된다. 또한 많은 종류의 미생물이 펩타이드 부분의 다른 부위에 작용하는 여러가지 펩티다제를 생산한다. 이로 인해 생성물이 취급하기 힘든 혼합물 상태로 수득되는 경우가 있다.

A-21978C항생제(일반식 2) 각각에서, 지방산 측쇄(R^N)는 트립토판 부위의 α-아미노그룹에 결합된다. 본 출원인의 계류중인 특허원(Docket No. X-5279)에는, 분자의 다른 부분에는 영향을 미치지않고 지방산 측쇄를 효소로 분해할 수 있다고 기술하고 있다.

탈아실화 반응을 수행하는데 사용하는 효소는 악티노플라나세 과(Actinoplanaceae)미생물, 바람직하게는 악티노플레인스 유타엔시스 NRRL 12052(Actinoplanes Utahensis NRRL 12052, 기탁번호 : KFCC-10054, 기탁기관 : 한국 종균협회, 기탁일 : 1983.8.17) 또는 그의 변종에 의해 생산된다. 탈아실화를 위해서, A-21978C 복합체, A-21978C 인자 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅, 차단된 A-21978C 복합체, 및 차단된 A-21978C 인자 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅중에서 선택한 항생제를 미생물의 배양물에 가한다. 탈아실화가 거의 완결될때까지 배양물을 가질과 함께 배양하고, 수득된 상응하는 A-21978C 사이클릭 펩타이드를 이 분야에 공지된 방법으로 발효육즙으로 부터 분리한다.

이러한 효소적 탈아실화에 의해 수득된 사이클릭 펩타이드 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 일반식(3)과 같다.

상기식에서, R⁰및 R'는 독립적으로 수소 또는 아미노-보호그룹이다.

A-21978C 복합체 또는 A-21978C 개별적인자 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅로 부터 아실기를 제거하면 R⁰및 R'가 각각 수소를 나타내는 일반식(3)의 화합물이 생성되는데, 이는 항생제 A-21978C 인자에 존재하는 통상적 사이클릭 펩타이드이며, 편의상 이 화합물을 A-21978C 핵이라고 부르기로 한다. 이 화합물은 구조식(4)로 나타낼 수 있다 :

상기식에서, 3MG는 L-트레오-3-메틸 글루탐산을 나타낸다.

R⁰또는 R'가 수소가 아닌 일반식(3)의 화합물은 적절히 차단된 항생물질 A-21978C 인자 C₀, C₁, C₂, C₃, C₄및 C₅를 탈아실화하여 제조한다. 편의상, 이들 화합물을 차단된 A-21978C 핵이라 한다. 이러한 차단된 화합물은 일반식(1)의 펩타이드, 예를들어, R¹이 아미노-보호그룹인 화합물을 제조하기 위한 중간체로서 유용하다.

이 분야의 전문가에게 잘 알려져 있듯이, A-21978C핵 및 차단된 A-21978C 핵은 유리아민 또는 산부가염형태로 수득될 수 있다. 어떠한 산부가염이라도 사용할 수 있지만, 약학적으로 허용되는 염이 바람직하다.

바람직한 탈아실화 효소인 악티노플레인스 유타엔시스 NRRL 12052 (기탁번호 : KFCC-10054)는 다음 기관으로부터 아용할 수 있다[기탁기관 : Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, U. S. Department of Agriculture, 1815 North University St., Peoria, Illinois 61604, U. S. A., 기탁번호 : NRRL 12052]. 제조실시예 1은 A-21978C 복합체를 기질로 사용하고, 악티노플레인스 우타엔시스 NRRL 12052(기탁번호 : KFCC 10054)를 미생물로 사용하여 발효시켜 A-21978C핵을 제조하는 방법을 설명하고 있다.

일반식(3)의 A-21978C 핵을 제조하는데 사용할 수 있는 다른 악티노플라나세 배양물은 다음의 기탁번호로써 상기한 기탁기관(NRRL)으로부터 이용할 수 있다 : 악티노플레인스 미조리엔시스 (Actinoplanes missouriensis)NRRL 12053(기탁번호 : KFCC-10056, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17), 악티노플레인스종(Actinoplanes sp.)NRRL 8122(기탁번호 : KFCC-10052, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17), 악티노플레인스종(Actinoplanes sp.)NRRL 12065(기탁번호 : KFCC-10053, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17), 스트렙토스포란기움 로제움 변종 홀란덴시스 (Streptosporangium roseum Var. hollandensis)NRRL 12064(기탁번호 : KFCC-10055, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1983.8.17).

악티노플라나세 과에 속하는 어떤 균주의 탈아실화 수행능력은 다음 과정으로 측정한다. 적절한 생육배지에 미생물을 접종하여, 약 28℃로 2 또는 3일간 회전진탕기 상에서 배양한 후, 기질 항생제중의 한 가지를 배양기(培養基)에 가한다. 발효배지의 pH는 약 6.5로 유지시킨다. 배양의 활성은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)검정법을 이용하여 모니터한다. 항생제 활성의 소실은 미생물이 탈아실화에 필요한 효소를 생산했다는 것을 나타내며, 이는 다음 방법중의 하나로 입증될 수 있다 :

1) 완전한 핵의 존재여부에 대한 HPLC 분석 ; 또는

2) 적절한 측쇄(예 : 라우로일. n-데카노일 또는 n-도데카노일)에 의한 재-아실화에 의한 활성회복.

본 발명은 전술한 바와같이 A-21978C핵(일반식(3)의 화합물)을 아실화시켜 유도한 신규 화합물인 일반식(1)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 제조방법에 관한 것이다.

상기식에서,

R은 수소, 8-메틸데카노일, 10-메틸도데카노일, 10-메틸운데카노일, A-21978C₀의 특정한 C₁₀-알카노일그룹 또는 A-21978C인자 C₄및 C₅의 특정한 C₁₂-알카노일그룹, 아미노-보호그룹, 일반식

의 아미노아실그룹(여기서, Q는 C₁-C₁₆알킬렌이다), 또는 일반식

의 N-알카노일 아미노아실 그룹[상기식에서 W는 (a) 일반식

의 이가 아미노아실라디칼(여기서, A는 C₁-C₁₀알킬렌 또는 C₅-C₆사이클로알킬렌이다) ;

(b) 일반식

의 이가 아미노아실라디칼(여기서, R³는 하이드록시메틸, 하이드록시에틸, 머캅토메틸, 머캅토에틸, 메틸티오에틸, 2-티에닐, 3-인돌-메틸, 페닐, 벤질, 또는 치환된 페닐 또는 치환된 벤질(이들의 벤젠환은 클로로, 브로모, 요오도,니트로, C₁-C₃알킬, 하이드록시, C₁-C₃알콕시, C₁-C₃알킬티오, 카바밀, 또는 C₁-C₃알킬카바밀로 치환된다)이다) ;

(c) 일반식

의 이가 아미노아실 라디칼(여기서, X는 수소, 클로로, 브로모, 요오도, 아미노, 니트로, C₁-C₃알킬, 하이드록시, C₁-C₃알콕시, 머캅토, C₁-C₃알킬티오, 카바밀 또는 C₁-C₃알킬카바밀이다) ;

(d)일반식

또는

의 이가 아미노아실 라디칼(여기서, X¹는 클로로, 브로모, 요오도, 아미노, 하이드록시, C₁-C₃알킬 또는 C₁-C₃알콕시이다) ;

(e) 구조식

또는

의 이가 아미노아실 라디칼 ; 또는

(f) 일반식

의 이가 아미노아실 라디칼(여기서, B는 이가 라디칼로 -(CH₂)_n-(n은 1, 2 또는 3이다), -CH=CH-, -CH=CH-CH₂-, 또는

이고 ;

R²는 C₁-C₁₇알킬 또는 C₂-C₁₇알케닐이다]이고 ;

R¹은 수소, 아미노-보호그룹, 상기한 바와같은 일반식

의 아미노아실그룹 또는 상기한 바와같은 일반식

의 N-알카노일아미노아실 그룹이며 ; 단, R이 아미노아실 또는 N-알카노일아미노아실이 아닌 경우에, R¹은 아미노아실 또는 N-알카노일 아미노아실 이어야 하며 ; R¹이 아미노-보호그룹인 경우, R은 아미노아실 또는 N-알카노일 아미노아실이어야 한다.

본 명세서에서 사용된 "알킬렌", "알킬", "알콕시", "알킬티오" 및 "알케닐"은 직쇄 및 측쇄 탄화수소 쇄를 모두 포함한다. "알킬"은 일가의 포화탄화수소 라디칼을 의미한다. "알케닐"은 각각 시스 또는 트랜스 배위로 배향된 이중 결합을 1, 2 또는 3개 함유하는 일가의 불포화 탄화수소 라디칼을 의미하며, "알킬렌"은 이가의 포화탄화수소 라디칼을 의미하고, 사이클로알킬렌은 이가의 사이클릭 포화탄화수소 라디칼을 의미한다.

본 발명의 목적에 바람직한 C₁-C₁₀또는 C₁-C₁₆알킬렌 라디칼로는 -CH₂-;

(여기서, R⁵는 C₁-C₄알킬(예 ; 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 3급-부틸, 이소부틸, 또는 1-메틸프로필)이다; -(CH₂)_m-(여기서, m은 2 내지 10의 정수이다); 및

-(여기서, p는 1 내지 8의 정수이고, q는 0 내지 7의 정수이며, 단 p+q는 8이하여야 한다)를 들수 있다.

본 발명의 목적에 바람직한 C₁-C₁₇알킬그룹의 예로는 다음을 들 수 있다 :

(a) CH₃-;

(b) -(CH₂)_nCH)₃(여기서, n은 1내지 16의 정수이다) ;

(c)

(여기서, r 및 s는 독립적으로 0 내지 14의 정수이며, 단 r+s는 4이하이다).

(a)-(CH₂)_t-CH=CH-(CH₂)_u-CH₃(여기서, t 및 u는 독립적으로 0 내지 14의 정수이며, 단t+u는 14이하이다);

(b) -(CH₂)_v-CH=CH-(CH₂)_y-CH=CH-(CH₂)_z-CH₃(여기에서, v 및 z는 독립적으로 0 내지 11의 정수이고, y는 1 내지 12의 정수이며, 단 v+y+z는 11이하이다).

특히 다음의 C₁-C₁₇알킬그룹이 바람직하다 :

이 분야 전문가라면

작용기 및 -NH-작용기가 벤젠환 상에서 서로에 대해 오르보, 메타, 또는 파라배위로 배향될 수 있음을 이해할 것이다. X로 표시된 치환체는 벤젠환의 어느 위치에서나 치환될 수 있다. X가 수소이고,

및 -NH-작용기가 파라배위로 배향된 경우가 바람직하다.

일반식(1)에서 R³로서 정의된 "치환된 페닐" 및 "치환된 벤질"은 벤젠환의 가능한 어느 위치에서나 치환된 경우를 나타낸다. 즉 치환체는 오르토, 메타 또는 파라배위를 취할 수 있다. 일반식(1)에서 R³또는 X로서 정의된 "C₁-C₃알킬"에는 메틸, 에틸, n-프로필, 또는 이소프로필 그룹이 포함된다.

R 및/또는 R¹으로서의 아미노아실 및 N-알카노일아미노아실 그룹은 실시예에 설명되어 있으며, 그 외의 그룹으로는 다음과 같은 예를 들수 있다 :

4-[N(n-옥타노일)아미노]사이클로헥산-1-카보닐,

7-[N-(n-펩타노일)아미노]-n-옥타노일, α-하이드록시메틸-α-[N-(n-펩타데카노일)아미노]-아세틸, α-(m-메톡시페닐)-α-[N-(n-헵타노일)아미노]-아세틸, m-클로로-p-[N-(n-노나노일)아미노]벤조일, 2, 4-디하이드록시-5-[N-(n-데카노일)아미노]벤조일, 4-[N-(0-메틸부타노일)아미노]니코티노일, 4-[N-(n-헵타데카노일)아미노]페닐프로피오닐 및 p-[N-(n-헥사데카노일)아미노]히푸릴.

일반식(1)의 화합물은 염을 형성할 수 있는데 이러한 염 또한 본 발명의 일부이다. 이러한 염은, 예를들어, 화합물의 분리 및 정제에 유용하다. 약학적으로 허용되는 알칼리-금속염, 알칼리-토금속염, 아민염 및 산부가염이 특히 유용하다. "약학적으로 허용되는"염은 은혈등들의 화학 요법에서 유용한 염이다.

예를들어, 일반식(1)의 화합물은 염을 형성할 수 있는 4개의 유리카복실 그룹을 갖고 있으며, 이들 카복실 그룹의 부분, 혼합 및 완전염 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 염을 제조할때, pH는 반드시 10이하여야 하는데, pH10을 초과하는 경우에는 화합물이 불안정하기 때문이다.

일반식(1)의 화합물의 대표적인 적절한 알카리 금속염 및 알카리-토금속염에는 나트륨, 칼륨, 리튬, 세슘, 루비듐, 바륨, 칼슘 및 마그네슘 염이 포함된다.

일반식(1)의 화합물의 적절한 아민염에는 암모늄 및 1급, 2급 및 3급 C₁-C₄-알킬암모늄 및 하이드록시-C₂-C₄-알킬암모늄의 염이 포함된다. 아민염에는 일반식(1)의 화합물과 수산화암모늄, 메틸아민, 2급-부틸아민, 이소프로필아민, 디에틸아민, 디-이소프로필아민, 사이클로헥실아민, 에탄올아민, 트리에틸아민 또는 3-아미노-1-프로판올과 반응으로 생성된 염이 포함된다.

일반식(1) 화합물의 알카리금속 및 알카리토금속 양이온성 염은 양이온성 염의 제조에 통상적으로 사용되는 방법에 따라 제조한다. 예를들어, 유리산 형태의 일반식(1)의 화합물을 가온한 메탄올 또는 에탄올같은 적절한 용매에 용해시키고 ; 화학량론적 양의 목적하는 무기 염기를 함유하는 수성메탄올 용액을 가한다.

이와같이 생성된 염은 여과 또는 용매의 증발같은 통상적 방법에 의해 분리할 수 있다.

유기 아민과의 염도 비슷한 방법으로 제조할 수 있다. 예를들어, 일반식(1)의 화합물을 에탄올과 같은 적절한 용매에 용해시킨 용액에 가스상 또는 액상아민을 가하고 ; 용매 및 과량의 아민을 증발시켜 제거할 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 유리아미노 그룹을 가지고 있으므로 산부가염을 형성할 수 있는데, 이러한 염도 본 발명의 일부이다. 일반식(1)의 화합물의 대표적인 적절한 산부가염에는 염산, 황산, 인산, 아세트산, 숙신산, 시트르산, 락트산, 말레산, 푸마르산, 팔미트산, 콜산, 파모산, 뮤스산, D-글루탐산, d-캄포르산, 글루타르산, 글리콜산, 프탈산, 타르타르산, 라우르산, 스테아르산, 살리실산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 소르브산, 피크르산, 벤조산 및 신남산과 같은 유기 및 무기산과의 표준반응에 의해 생성된 염이 포함된다.

본 발명은 A-21978C 사리클릭 펩타이드 인자인 일반식(3)의 A-21978C핵 또는 그의 유도체를 일반식(5)의 아실화제 또는 그의 활성화 유도체로 아실화하여 일반식(1)의 A-21978C 사이클릭 펩타이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기식에서,

W 및 R²는 상기 정의한 바와 같다.

다시 말해서, 일반식(1)의 화합물은 아미도 결합 형성분야에서 통상적인 방법을 사용하여 일반식(3)화합물의 트립토판 α-아미노그룹을 적절한 N-알카노일 아미노아실 또는 N-알케노일아미노아실 측쇄로 아실화하여 제조한다. 아실화 반응은 일반적으로 일반식(3)의 화합물을 목적하는 아실측쇄 그룹에 상응하는 일반식(5)의 산활성화 유도체와 반응시켜 수행한다.

상기에서, 일반식(3)의 A-21978C핵 또는 그의 "유도체"라 함은 그의 적절히 보호된 유도체 및 약학적으로 허용되는 염을 포함하며, "활성화 유도체"란 아실화제의 카복실 작용기가 1급아미노 그룹과의 커플링에 반응성을 나타내어 아실 측쇄를 핵에 연결하는 아미드 결합을 형성하는 유도체를 의미한다. 적절한 활성화 유도체, 그의 제조방법 및 1급아민에 대한 아실화제로서의 그 사용법은 이 분야의 전문가에게 자명하다.

바람직한 활성화 유도체는 다음과 같다 ; (a)산 할라이드(예 : 산 클로라이드), (b)산 무수물(예 : 알콕시포름산 무수물 또는 아릴옥시포름산 무수물) 또는 (c) 활성화 에스테르(예 : 2, 4, 5-트리클로로페닐 에스테르, N-하이드록시-벤즈트리아졸 에스테르, 또는 N-하이드록시 숙신이미드 에스테르). 카복실작용기를 활성화하는 다른 방법에는 카복실산과 카보닐디이미드(예 : N, N'-디사이클로헥실카보디이미드 또는 N, N'-디이소프로필카보디이미드)의 반응이 포함되는데, 그 결과로 반응성 중간체가 생성되며, 생성된 중간체는 불안정하므로 분리하지는 않는다. 이러한 경우 1급 아민과의 반응은 동일 반응계내에서 수행한다.

이 분야 전문가라면 아미노-보호그룹을 이용하여 선택적 아실화 공정에 의해 일반식(1)의 화합물을 제조한다는 것을 이해할 것이다. 예를들어, R⁰및 R'가 수소인 일반식(3)의 화합물을 출발물질로 하는 경우, 트립토판의 α-아미노그룹 및 오르니틴의 δ-아미노그룹 모두에서 아실화가 일어나 N_TrP, N_Orn-디아실 유도체가 생성된다. 따라서, 트립토판의 α-아미노그룹만이 아실화된 유도체를 수득다음 위해서는, 오르니틴의 δ-아미노그룹(R⁰위치)을 아미노-보호그룹에 의해 차단한 일반식(3)의 화합물을 아실화시키는 것이 바람직하다.

그런 출발물질은 바람직하게는 A-21978C인자를 탈아실화다음 전에 그 위치를 차단시켜 수득한다.

키누레닌의 방향족 아미노그룹(R' 위치)은 A-21978C 핵에 존재하는 세개의 유리아미노그룹 중에서 가장 반응성이 낮은 그룹이다. R 또는 R¹위치의 아실화에서는 통상적으로 이 아미노그룹을 차단할 필요가 없다.

반응도식 I은 일반식(1)의 화합물을 제조하는 전반적 공정을 요약하고 있다. 여기에서는 다음과 같은 표시가 사용된다 :

[*]=A-21978C의 나머지부분, N_T=트립토판의 α-아미노그룹, N_O=오르니틴의 δ-아미노그룹, N_K=키누레닌의 방향족 아미노그룹, R, R¹=상기한 바와같은 치환체, R_N=천연인자의 아실그룹, B=아미노-보호그룹, Acyl=아실화단계, Deacyl=탈아실화단계, Block=아미노-보호그룹에 의한 차단, Deblock=아미노-보호그룹의 제거.

도식 I에서 A-21978C의 N_TrP-모노아실유도체는 일반식(3)으로 나타내며 A-21978C의 N_TrP, N_Orn-디아실 유도체는 일반식(4)로 나타낸다. N_TrP-아실그룹이 천연 A-21978C 인자의 아실그룹과 동일한 N_TrP, N_Orn-디아실 유도체는 일반식(8)로 표시한다.

도식 I : N_TrP-모노아실 및 N_TrP, N_Orn-디아실-A21978C의 제조

일반식(1)의 화합물의 바람직한 제조방법은 R'가 H이고 R⁰가 t-BOC인 일반식(3)의 화합물, 즉 N_Orn-t-BOC핵 또는 "tBOC핵"을 이용한 활성 에스테르법이다. 목적하는 N-알카노일아미노산 또는 N-알케노일아미노산(일반식 5)의 2, 4, 5-트리클로로페닐 에스테르를 아실화제로 사용하는 것이 가장 바람직하다. 이 방법에서, 과량의 활성에스테르를 DMF, THF, 디에틸에테르 또는 다클로로메탄과 같은 비-반응성 유기용매중 실온에서 t-BOC핵과 반응시킨다. 반응시간은 중요하지 않으나, 약 15 내지 약 18시간이 바람직하다. 반응의 종결시에 용매를 제거하고, 잔사를 정제한다. 특히 유용한 정제법은, 고정상으로서 실리카겔을, 용매계로서 에틸아세테이트 : 메탄올(3:3, v/v)을 사용한 칼럼 크로마토그래피이다. t-BOC 그룹은 트리플루오로아세트산/아니솔/트리에틸실란, 또는 바람직하게는 트리플루오로아세트산/1, 2-에탄디티올로 약 3 내지 약 5분간 실온에서 처리하여 제거한다. 용매를 제거한 후, 잔사를 역상 HP-LC로 정제한다.

N-알카노일아미노산 또는 N-알케노일아미노산의 2, 4, 5-트리클로로페닐에스테르는 목적하는 아미노산(일반식(5))을 N, N'-디사이클로헥실카보디이미드와 같은 커플링제의 존재하에 2, 4, 5-트리클로로페놀로 처리하여 편리하게 제조할 수 있다. 아미노산 에스테르를 제조하는 적절한 다른 방법은 이 분야 전문가에게 잘 알려져 있다.

N-알카노일아미노산 또는 N-알케노일아미노산은 공지된 화합물이거나, 적절한 아미노산을 목적하는 알카노일, 또는 알케노일 그룹으로 통상적 방법에 따라 아실화시켜 제조할 수 있다. N-알카노일아미노산 의 바람직한 제조방법은 적절한 아미노산을 피리딘 중의 알카노산클로라이드로 처리하는 것이다. 본 발명의 생성물의 제조에 사용되는 알카노산, 또는 알케노산, 그의 활성화 유도체 및 아미노산은 공지 화합물이거나, 이 분야 전문가에게 알려진 공지방법 또는 그 변형방법에 의해 제조할 수 있다.

특정한 아미노산이 아미노그룹 이외의 아실화 가능한 작용성 그룹을 함유하는 경우, 알카노일 또는 알케노일 그룹을 결합시키기 위해 사용하는 시약과 아미노산을 반응시키기 이전에 이러한 그룹을 먼저 보호시켜야 한다. 보호그룹으로는 펩타이드합성 분야에서 측쇄작용성 그룹의 보호에 유용한 것으로 공지된 그룹이면 적절하다. 이러한 그룹은 잘 알려져있으며, 특정 보호그룹의 선택 및 그 사용방법은 이 분야 전문가라면 쉽게 이해할 것이다[참조 : "Protective Groups in Organic Chemistry" M. McOmic, Editor, Plenum Press, N. Y. 1973].

본 발명의 생성물의 합성에 상요되는 일부 아미노산은 광학적 활성형태로 존재할 수 있으며, 천연에 존재하는 배위(L-배위)또는 D-배위 모두를 출발물질로 사용하여 본 발명의 생성물을 수득할 수 있다.

본 발명의 A-21978C 사이클릭 펩타이드를 항균제로 사용할때, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 이 분야의 전문가에게 자명한 바와같이, A-21978C 화합물은 동상적으로 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 투여한다. A-21978C 화합물의 투여용량은 여러가지 조건, 예를들어, 치료를 요하는 감염종의 종류 및 정도에 좌우된다. 투여시의 적절한 용량범위 및/또는 용량단위는 본 명세서의 MIC 및 ED₅₀값 및 특성데이타와 약물 역학적 특징, 환자 또는 호스트의 특성 및 감염미생물과 같은 인자를 함께 고려하여 결정한다.

다음의 비-제한적 실시예 및 제조실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명다음 위한 것이다.

[제조실시예 1]

A-21978C핵의 제조

A. 악티노플레인스 유타엔시스의 발효

악티노플레인스 유타엔시스 NRRL 12052(기탁번호 : KFCC-10054)의 저장 배양물을 사면 한천배지상에서 제조하여 유지시킨다.

사면 배양물을 제조하는데 사용되는 배지는 다음중에서 선택한다.

배지 A

고압 멸균전의 pH는 약 5.9이며 ; NaOH를 가하여 pH7.2로 조정하고 ; 고압 멸균후의 pH는 약 6.7이다.

* 쟈펙 무기물 원액의 조성은 다음과 같다 :

배지 B

* N·Z·Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, NJ.

사면 배지에 악티노플레인스 유타엔시스 NRRL 12052(기탁번호 : KFCC-10054)를 접종하고, 접종한 사면배지를 30℃에서 약 8 내지 10일간 배양한다. 사면 증식물의 약 반을 다음 조성의 영양배지 50ml에 접종한다 :

NaOH를 사용하여 pH7.4로 조정하고 : 고압 멸균후의 pH는 약 6.8이다.

* National Distillers Products Co., 99 Park Ave., New York, NY.

접종한 영양배지를 250ml들이 광구 에믈렌메이어 플라스크중, 250RPM에서 직경 2인치의 호를 그리는 회전 진탕기 상에서 30℃로 약 72시간동안 배양한다.

배양한 상기의 영양배지는 제2단계 영양배지 접종에 직접 사용하거나 추후의 사용을 위해 액체질소의 증기상중에 배양물을 유지시켜 저장할 수도 있는데, 후자의 경우가 바람직하다. 그와같은 저장을 위해서는 배양물을 작은 바이알 단위로 제조한다 :

각 바이알에는 배양시킨 영양배지 2ml 및 2ml의 글리세롤-락토스 용액을 함유시킨다[참조 : W. A. Dailey and C. E. Higgens, "Preservation and Storage of Microorganisms in the Gas Phase of Liquid Nitrogen, Cryobiol 10 364-367(1973)].

제조한 현탁액은 액체 질소의 증기상중에 저장한다.

이와같이 제조된 저장현탁액(1ml)을 사용하여 전술한 바와같은 조성의 제1단계 영양배지 50ml에 접종하고, 접종한 제1단계 영양배지를 전술한 바와같이 배양한다.

다량의 접종물을 수득다음 위하여, 배양한 제1단계 영양배지 10ml를 사용하여 제1단계 영양배지와 동일한 조성의 제2단계 영양배지 400ml에 접종하고, 2ℓ들이 광구 에믈렌메이어 플라스크중, 250RPM에서 직경 2인치 호를 그리는 회전진탕기 상에서 30℃로 약 48시간동안 배양한다.

상기한 바와같이 제조한 제2단계의 영양배지 배양물(80ml)을 사용하여 다음에서 선택한 멸균 생산배지 10ℓ에 접종한다.

배지 I

121℃로 45분간 약 16 내지 18psi로 고압 멸균시킨 후의 배지의 pH는 약 6.9이다.

배지 II

HCl을 사용하여 pH7.0으로 조정한다 : 고압 멸균후의 pH는 약 7.0이다.

배지 III

* 따로 멸균하여 무균적으로 가한다. 최종 pH는 약 6.6이다.

접종한 생산배지를 14ℓ들이 발효기로 옮겨 약 30℃에서 약 66시간동안 발효시킨다. 발효배지를 통상적인 교반기로 약 600RPM으로 교반하고, 멸균 공기를 통해 주어 대기압에서 용존산소수준이 공기포화도의 30%를 초과하도록 한다.

B. A-21978C의 탈아실화

악티노플레인스 유타엔시스의 발효는 사면배지 A 및 생산배지 I을 사용하여 생산배지를 약 67시간동안 배양시켜 A항에서 기술된 바와같이 수행한다. 미합중국 특허 제4,208,403호에 기술된 바와같이 제조한 A-21978C복합체(100g)를 발효 배지에 가한다.

A-21978C 복합체의 탈아실화는 마이크로코커스 루테우스에 의한 검정에 의해 모니터한다. 마이크로코커스 루테우스에 대한 활성의 소실로 탈아실화를 확인할때까지 발효시키는데, 이때 소요시간은 약 24시간이다.

C. A-21978C핵의 분리

B항에 기술된 바에따라 수득한 전 발효육즙(20ℓ)을 필터에이드(Hyflo Super-Cel, Johns Manville Corp.)를 통해 여과하고, 균사체 케이크는 버린다. 수득한 여액을 HP-20수지(DIAION High Porous Polymer HP series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan)1.5ℓ를 함유한 칼럼내로 통과시키고, 수득한 용출액을 버린다. 칼럼을 탈이온수 10ℓ로 세척하여 잔류하는 여과육즙을 제거한다. 이 세척수를 버린다. 칼럼을 물 : 아세토니트릴 혼합물(10ℓ, 각각 95:5, 9:1 및 4:1)로 용출시켜 1ℓ 분획을 수집한다.

실리카겔/C₁₈및 용매계로서 0.1%암모늄 아세테이트를 함유하는 물 : 메탄올(3:1)을 사용하고, 254nm에서 UV 모니터로 핵을 검출하는 분석적 HPLC에 의해 용출을 모니터한다. 핵을 함유하는 분핵을 합하고, 진공하에 농축시켜 아세트니트릴을 제거한 다, 동결 건조시켜 반-정제된 A-21978C핵 40.6g을 수득한다.

D. A-21978C핵의 정제

C항에서 기술된 바와같이 수득한 반-정제된 A-21978C핵 15g을 0.2%아세트산 및 0.8% 피리딘을 함유하는 75ml의 물 : 메탄올 : 아세토니트릴(82:10:8)에 용해시키고, 이 용액을 3.33ℓ의 실리카겔(Quantum LP-1)/C₁₈을 함유하는 4.7×192cm 칼럼상에 적용한다. 칼럼을 동일 용매계로 용출시키고, 350ml 용적으로 획분을 모은다.

280nm에서 UV 모니터로 분리과정을 추적한다. 핵을 함유하는 분획을 합하고, 진공하에 농축시켜 용매를 제거한 다음, 동결 건조시켜 5.2g의 정제된 A-21978C핵을 수득한다.

E. A-21978C 핵의 특성

A-21978C 핵은 다음과 같은 특성을 갖는다 :

a) 형태 : 단파 UV하에서 형광을 발하는 백색의 무정형고체

b) 실험식 : C₆₂H₈₃N₁₇O₂₅

c) 분자량 : 1465

d) 용해도 : 수용성

e) 적외선 흡수스펙트럼(KBr)분석결과, 다음 주파수(cm^-1)에서 흡수 극대가 나타난다 :

3300(브로드), 3042(약), 2909(약), 1665(강), 1530(강), 1451(약), 1399(중간), 1222(중간), 1165(약), 1063(약) 및 758(중간 내지 약)

f) 메탄올중 UV 흡수 스펙트럼은 223nm(ε41,482) 및 260nm(ε8,687)에서 극대를 보인다.

g) 66% 수성 디메틸포름아미드 중에서 전기적 적정한 결과 pKa값이 각각 약 5.2, 6.7, 8.5 및 11.1인 적정 가능한 4개의 그룹이 확인된다(초기 pH6.12).

[제조실시예 2]

A-21978C핵의 다른 제조방법

B항의 일부를 변화시키는 것을 제외하고는 제조실시예 1의 방법에 따라 A-21978C핵을 제조한다. 악티노플레인스 유타엔시스 배양물을 처음에 약 48시간동안 배양하고 ; 기질(반-정제된 A-21978C 복합체 50g)을 가한 후, 약 16시간동안 배양한다. 여액을 3.1ℓ의 HP-20수지를 함유하는 칼럼내로 통과시키고, 칼럼을 10배량의 물로 세척한다음 물 : 아세토니트릴(95:5)로 용출시킨다. 제조실시예 1에서와 같이 용출을 모니터한다. 24ℓ를 모은 후, 용출용매를 물 : 아세토니트릴(9:1)로 바꾼다. 핵을 함유하는 분획은 이 용매로 용출시킨다. 이들 분획을 합하고, 진공하에 농축시켜 아세토니트릴을 제거한 다음, 동결 건조시켜 24.3g의 반-정제된 A-21978C 핵을 수득한다.

수득된 반-정제된 A-21978C핵(24.3g)을 물(400ml)에 용해시킨다. 이 용액을 0.2%아세트산 및 0.8%피리딘을 함유하는, 물 : 메탄올 : 아세토니트릴(8:1:1)중에서 3.33ℓ의 실리카겔(Quantum LP-1)/C₁₈을 함유한 4.7×192cm 강철칼럼 상에 적용한다. 칼럼을 약 2000psi에서 동일 용매로 용출시켜 350ml 분획을 수집한다. 280nm에서 UV로 용출을 모니터한다. 핵을 함유한 분획을 합하여 진공하에 농축시켜 용매를 제거한 다음, 동결 건조시켜 14g의 매우 순수한 A-21978C핵을 수득한다.

[제조실시예 3]

N_Orn-t-BOC A-21978C인자 C₂및 C₃의 제조

미합중국 특허 제4,208,403호에 기술된 방법에 따라 제조한 A-21978C인자 C₂및 C₃의 혼합물 10g을 물 50ml에 음파처리하여 용해시킨다(200mg/ml). 5N NaOH 3.6ml를 가하여 용액의 pH를 4.05로부터 9.5로 조정하고, 디-3급-부틸디카보네이트 3.0ml를 가하여 반응혼합물을 실온에서 2시간동안 교반한다. 반응물의 pH는 5N NaOH를 가하여 9.5로 유지시킨다(2시간동안 6.5ml를 가함).

CH₃CN : H₂O (7:3 및 8:2)용매계를 사용하는 실리카겔상의 TLC 및 UV검출에 의해 반응을 주기적으로 모니터한다.

약 10분후에 반응용액이 급격히 혼탁해지며, 염기의 소모가 증가된다. 30분후에 혼탁도의 증가속도와 염기 소모속도는 감소되며, 이는 반응이 완결되었음을 나타낸다. 그러나, 반응을 90분간 더 지속시켜 완결을 확실히 한다. 2시간에 걸친 반응의 종기에 반응물질을 급속히 동결 건조시켜 12.7g의 N_Orn-t-BOC-A-21978인자 C₂및 C₃를 수득한다.

유사한 방법으로 반응물 10g을 사용하여 2회, 반응물 30g을 사용하여 1회, 반응을 실시한다. 각각의 경우 반응시간은 불과 40분이다. 10g을 사용한 2회의 실험에서 각각 11.9g 및 12.1g의 생성물을 수득한다. 30g을 사용한 반응결과, 35.4g의 생성물을 수득한다.

[제조실시예 4]

A-21978C N_Orn-t-BOC핵의 제조

A. 악티노플레인스 유타엔시스의 발효

악티노플레인스 유타엔시스의 발효는 사면배지 A와 생산배지 I을 사용하고, 생산배지를 약 66시간동안 배양시켜 제조실시예 1의 A항에 기술된 바와같이 수행한다.

B. N_Orn-t-BOC 복합체의 탈아실화

A-21978C N_Orn-t-BOC 복합체(약 176g의 A-21978C 복합체를 함유한 1185g의 조기질)를 발효 배지에 가하고, 제조실시예 1, B항에 기술된 바와같이 탈아실화시킨다. 약24시간후에 탈아실화의 완결이 HPLC로 확인된다.

C. A-21978C N_Orn-t-BOC핵의 분리

B항에 기술된 바와같이 수득한 발효육즙 100ℓ를 필터 에이드(Hyflo Super-Cel)로 여과한다. 7.5ℓ의 HP-20수지(DIAION)를 함유한 칼럼으로 여액을 통과시키고, 칼럼을 물(38ℓ)로 세척한다.

실리카겔/C₁₈HPLC 및 254nm에서의 UV검출로 용출을 모니터한다. 일부의 핵이 세척시 용출된다. 다음과 같은 물 : 아세토니트릴 혼합물로 핵을 계속 용출시킨다 : (95:5)-40ℓ : (9:1)-40ℓ : 및 (85:15)-100ℓ, 핵을 함유한 분획을 합하고, 진공하에 농축시켜 용매를 제거한 다음, 동결 건조시켜 298.5g의 반-정제된 A-21978C N_Orn-t-BOC핵을 수득한다.

D. A-21978C N_Orn-t-BOC핵의 정제

C항에서 기술한 바와같이 수득한 반-정제된 A-21978C N_Orn-t-BOC핵 30g을 0.2%아세트산 및 0.8%피리딘을 함유하는 물 : 아세토니트릴(9:1)75ml에 용해시키고, 동일 용매계 중에서 평형을 이룬 실리카겔(Quantum LP-1)/C₁₈3.33ℓ를 함유하는 4.7×192cm 강철 칼럼에 적용한다. 칼럼을 0.2% 아세트산 및 0.8% 피리딘을 함유한, 물 : 아세토니트릴 : 메탄올(80:15:5)로 가압하에 용출시키고, 350ml씩의 분획을 수집하여, 280nm에서 UV로 생성물을 검출한다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 진공하에 농축시켜 용매를 제거한 다음, 동결 건조시켜 18.4g의 순수한 A-21978C N_Orn-t-BOC핵을 수득한다.

A-21978C N_Orn-t-BOC핵의 특성은 다음과 같다 :

a) 형태 : 단파 UV 하에서 형광을 발하는 백색 무정형 고체.

b) 실험식 : C₆₇H₉₁N₁₇O₂₇

c) 분자량 : 1565

d) 용해성 : 수용성

e) 적외선 흡수 스펙트럼(KBr)분석결과 다음 주파수(cm^-1)^.에서 흡수 극대를 보인다 :

3345(브로드), 3065(약), 2975(약), 2936(약), ∼1710(Shoulder), 1660(강), 1530(강), 1452(약), 1395(중간), 1368(약), 1341(약), 1250(중간), 1228(중간), 1166(중간 내지 약) 및 1063(약).

f) 90% 에탄올중 UV 흡수 스펙트럼은 220nm(ε42,000) 및 260nm(ε10,600)에서 극대를 보인다.

g) HPLC 체류시간 : 4.6×300mm 실리카겔 C₁₈칼럼상에서 0.2% NH₄Ac를 함유한, H₂O/CH₃CN/CH₃OH(80:15:5) 용매를 사용하여, 2ml/분의 유속으로 용출시키고, UV로 검출하는 경우, 체류시간은 6분이다.

[제조 실시예 5]

A-21978C N_Orn-t-BOC핵의 다른 정제방법

제조실시예 4의 C항에 기술된 바와 같이 수득한 반-정제된 A-21978C N_Orn-t-BOC핵 10.8g을 물에 용해시켜, 80ml의 앰버라이트 IRA-68(아세테이트 사이클)을 함유한 칼럼에 적용한다. 칼럼을 물로 세척하고, 5ml/분의 유속으로 0.05N 아세트산(1080ml), 0.1N 아세트산(840ml) 및 0.2N 아세트산(3120ml)으로 연속 용출시켜, 120ml씩의 분획을 모은다. 실리카겔/C₁₈상에서, 0.2% 암모늄 아세테이트를 함유한, 물 : 아세토니트릴 : 메탄올(80:15:5) 혼랍물을 사용하여 분석적 HPLC를 실시하고, 254nm UV로 생성물을 검출한다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 피리딘을 사용하여 용액의 pH를 5.8로 조정한 다음, 이 용액을 진공하에 약 200ml 용적으로 농축시킨다. 농축물에 물을 가하고, 생성된 용액을 재농축시켜 피리딘을 제거한다. 이 농축물을 동결 건조시켜 순수한 A-21978 N_orn-t-BOC 핵 3.46g을 수득한다.

[제조실시예 6 내지 14]

여러가지의 유용한 N-알카노일아미노산의 제조방법이 미합중국 특허 제4,293,483호(표 I, 칼럼 9 내지 16)에 기술되어 있다. 이러한 화합물의 일반적 제조공정은 다음과 같다 :

적절한 알카노산 클로라이드를 피리딘에 용해시킨 적절한 아미노산에 적가한다(이들의 몰비는 1:1이다). 사용된 피리딘의 양은 반응물의 농도를 0.1 내지 0.2M로 하기에 충분해야 한다. 이 용액을 실온에서 약 3 내지 6시간 동안 교반한 다음, 다량의 물에 붓는다. 용액으로부터 침전되는 생성물을 여과하여 모으고, 메탄올로부터 결정화시킨다.

이 방법에 의해 제조되는 다른 N-알카노인 아미노산은 다음 표 I에 요약되어 있다.

[표 I]

N-알카노일 아미노산의 제조

제조실시예 15 내지 24

미합중국 특허 제4,293,483호에 기술된 N-알카노일아미노산의 2, 4, 5-트리클로로페닐 에스테르 역시 그 특허(표 2, 칼럼17-20)에 기술되어 있다. 이러한 화합물의 일반적 제조공정은 다음과 같다 :

N-알카노일아미노산(1몰), 2, 4, 5-트리클로로페놀(1.1몰) 및 DCC(1몰)을 디클로로메단, 디에틸 에테르 또는 THF에 용해시키고, 이 용액을 실온에서 약 16 내지 20시간 동안 교반한 후 여과한다. 여액을 건조시키고, 생성물을 아세토니트릴-물 또는 디메틸 에테르-석유 에테르로부터 결정화시킨다.

이 방법에 의해 제조되는 다른 N-알카노인아미노산의 2, 4, 5-트리클로로페닐 에스테르가 다음 표 Ⅱ에 요약되어 있다.

[표 Ⅱ]

2, 4, 5-트리클로로페닐 에스테르의 게조

[실시예 1내지 33]

활성화-에스테르법을 이용한 핵의 아실화를 포함하는 다음의 일반적 공정에 따라 일반식(1)의 A-21978C의 N-알카노인아미노산 유도체를 제조한다 :

No_rn-t-BOC-차단된-A-21978C 핵(t-BOC핵)을 DMF에 용해시킨 용액을 상응하는 N-알카노일아미노산의 2, 4, 5-트리클로로페닐 에스테르("환성에스테르")로 처리한다. 반응혼합물을 질소대기하에 약 18 내지 24시간 동안 실온에서 교반하고, 감압하에 증발건고시켜 잔사를 수득한다. 소량의 메탄올을 잔사에 가하고, 메탄올에 용해되지 않는 고체(N, N'-디사이클로헥실우레아)를 여과하여 제거하고 페기한다. 여액을 진공하에 증발시켜 조질의 No_rn-c-BOC-N_TrD-아실-A-21978C 동족제인 고체를 수득한다. 고정상으로 프레프팩-500/C₁₈칼럼(PrepPak-500/C₁₈column, Waters Associates, Inc.)을 장치한 "프레프 LC/시스템 500"단위("Prep LC/system 500"unit, Waters Assoclates, Inc., Milford. MA)를 사용하여 수득된 고체를 정제한다. 칼럼은 0.1% 피리디늄아세테이트를 함유한, 물 : 메탄올 : 아세토니트릴(2 : 1 : 2) 용매계를 사용하여 250ml 분획/분의 속도로 용출시키고, 대략 40개의 분획을 수집한다. 적용하는 샘플량은 약 1g 내지 약 5g의 범위이며, 미반응 출발물질을 함유하는 초기의 분획은 버린다. 초기 분획이후의 분획에서는 모두 목적생성물이 주피크(UV 검출기 이용)을 나타낸다. 개별적인 분획에 대해 TLC[역상 실리카겔(C₁₈), 물 : 메탄올 : 아세토니트릴(3 : 3 : 4)용매체, 검출 : Van Urk 분무액]및 바이오오토그래피[실리카겔 TLC판(Merck), 아세토니트릴 : 아세톤 : 물(2 : 2 : 1)용매계, 검정 미생물 : 마이크로코커스 루테우스] 분석을 실시한다.

이 방법에 의해 단일 성분으로서 수득된 No_rn-t-BOC-N_TrD-아신-A-21978C 동족제를 동걸 건조시키고, 2%아니솔을 함유한 무수 트리플루오로아세트산으로 0℃에서 처리한다.(0.3 내지 0.5g의 동족제당 10ml의 무수산을 사용한다). 약 5분후, 반응 혼합물을 감압하에 증발 건고시킨다. 수득한 잔사를 소량의 에테르로 연마하고, 고형 침전물을 모아 공기-건조시킨다. 이 물질을 물에 용해시키고, 피리딘을 가하여 용액의 pH를 약 6 내지 7로 조정한 다음, 용액을 동결건조시킨다. 단일성분으로 수득된 생성물을 크로마토그래픽 및 아미노산 분석에 의해 확성화한다.

이 공정에 의해 제조되는 No_rn-알카노일-아미노신-A-21978C 유도체가 표 Ⅲ에 요약되어 있다.

[표 Ⅲ]

A-21978C 사이클릭펩타이드의 N_Trp-알카노일아미노산유도체

[표 Ⅲ(계속)]

^aR'=H₄ ^bNorn-t-BOC-N_TrD-아실-핵

^c실리카겔(Merck)상 박층 크로마토그래피, 물 : CH₃CN : 아세톤(11 : 2 : 2) 용매제클 사용

^dNo_rn-t-BOC-핵

^eA21978C핵

이와 유사한 방법으로 제조되는 일반식(1)의 다른 알카노일아미노산 유도체가 표 Ⅳ에 요약되어 있다.

[표 Ⅳ]

일반식(1)의 A-21978C 사이클릭펩타이드

일반적 공정에 따르되, 단 출발물질로서 A-21978C 인자를 사용하여 제조되는 A-21978C 유도체가 표 Ⅴ에 요약되어 있다.

[표 Ⅴ]

A-21978C의 디아실유도체

^a실리카겔(Merck)상 TLC, 물 : CH₃CN : 아세톤(1 : 2 : 2) 용매제 사용

일반적 공정에 따라 제조되는 A-21978C의 다른 N_TRP-N_Orn-디아실 유도체가 표Ⅵ에 나열되어 있다.

[표 Ⅵ]

A-21978C의 디아실 유도체

[실시예 34]

N_Trp[-N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐]-A21978C핵(실시예 19의 화합물)의 제조

이 실시예는 활성-에스테르법에 의한 화합물의 대규모 제조법을 설명한다.

A. N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐-2, 4, 5-트리클로로페놀레이드의 제조

N-(n-데카노일-L-페닐알라닌(31.9g. 0.1몰) 및 2, 4, 5-트리클로로페놀(19.7g. 0.1몰)을 1l의 무수 에테르에 용해시킨 용액을 N, N'-디사이클로헥실카보디이미드(20.6g, 0.1몰)로 처리한다. 반응혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 침전된 N, N'-디사이클로헥실우레아를 여과하여 제거하고 버린다. 여액을 진공하에 농축건고시킨다. 수득된 잔사물 에테르로 연마하고, 고체(잔여의 사이클로헥실우레아)물 여과하여 제거한다. 여액을 감압하에 증발건고시키고, 잔사를 아세토니트릴로부터 결정화시켜 36.9g의 결정성 N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐 2, 4, 5-트리클로로페놀레이트를 수득한다(융점 : 122 내지 124℃).

B. N_Trp-[N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐]-No_rn-t-BOC-A-21978C핵의 제조

N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐 2, 4, 5-트리클로로페놀레이트(10g, 0.02몰), No_rn-t-BOC-A-21978C핵(10g, 0.006몰)을 무수 DMF(1l)에 용해시킨 용액을 질소대기하에 실온에서 96시간동안 교반하고, 감압하에 용매를 증발시켜 제거한다. 잔류물질을 디에틸에테르(800ml)와 클로로포름(200ml)의 혼합물과 함께 2시간동안 교반한다. 생성물을 여과분리하여 담갈색 분말(10.3g)을 수득한다. 이 물질(9.9g)을 메탄올(200ml)에 용매시키고, 고정상으로서 프레프팩-500/C₁₈칼럼을 장치한 "프레프 LC/시스템 500"단위를 이용한 제조용 HPLC를 실시하여 정제한다. 물 : 메턴올 : 아세토니트릴(2 : 1 : 2) 용매계를 사용하여 칼럼을 용출시키고, 분당 250ml 분획 1개를 수집한다. 목적화합물은 분획 9 내지 22에서 용출된다.

분획에 대해 TLC[역상 실리카겔/C₁₈, 전개용매 : 물 : 메탄올 : 아세토니트릴(3 : 3 : 4), Van Urk분무액으로 검출]를 실시하고, 해당 분획을 합해 바이오오토그래피[실리카겔 TLC, 아세토니트릴 : 아세톤 : 물(2 : 2 : 1)용매계, 검출미생물 : 마이크로코커스루테우스]에 의해 시험하여, 단일한 생물학적 활성성분으로 이루어짐을 확인한다. 이 과정에서 6.02g의 N_TrP-[N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐]-N_Orn-t-BOC-A-21978C핵[일반식(1) 화합물 : R=N-(n-데카노일-L-페닐알라닐) : R¹=t-BOC]을 수득한다.

C. N_TrP-[N-(n--데카노일)-L-페닐알라닐]-A-21978핵의 제조

100㎖들이 플라스크를 빙욕에서 5℃로 냉각시킨다. B항에서와 같이 제조한 N_TrP-[N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐]-N_Orn-t-BOC-A-21978C핵(6.02g. 0.008몰), 이어서 2%아니솔을 함유하는 무수트리플루오로아세타산(50㎖)을 플라스크에 가한다. 혼합물(대략 2분후에 용해된다)을 질소대기하에 10분 동안 교반하고, 40℃이하 감압하에 증발 건고조시켜 고무상 고체를 수득한 다음, 이를 각각 100㎖의 디에틸에테르 : 디클로로메탄(4 :1)용액으로 2회 연마한다. 고체를 여과하여 모으고, 디에틸 에테르로 세척하여 TFA염을 수득한다. 이를 물(50㎖)에 용해시키고 피리딘을 가하여 용액의 pH를 5.4로 조정한다. 용액을 동결건조시켜 6.1g의 회백색 동결 건조물을 수득한다.

수득한 동결 건조물을 메탄올(35㎖)에 용해시키고, 역상 C₁₈실리카겔 칼럼(Waters Associates, Perd 500)을 사용하여, 0.1% 피리디늄 아세테이트를 함유하는, H₂O : CH₃CN : CH₃CN 용매계로 단계적 구매(3 : 1 : 2. 2 : 1 : 2 및 1 : 2 : 2)에 의해 용출시켜 250㎡씩의 분획을 수집한다. 무걱하는 생성물은 2 : 1 : 2비율로 용매계로 용출시킬 때 용출된다. 생성물을 함유한 분획을 동결 건조시켜 2.23g의 크림색 N_TrP-[N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐]-N_Orn-21978C핵(일반식(1) 화합물 : R=N-(n-데카노일)-L-페닐알라닐 ; R¹=H)을 수득한다.

생성물을 분석적 HPLC[역상 C₁₈실리카겔 칼럼, MeOH : CH₃CN : H₂O : PyOAc(15 : 35 : 49 : 1)용매계, 및 230nm UV검출], TLC[역상 C₁₈실리카겔판(Whatman). H₂O : CH₃OH : CH₃CN(3 : 3 : 4)용매제, Van UrK분무액 및 단파 UV에 의해 검출] 및 바이오오토그래피[실리카겔 TLC (Merck), H₂O : CH₃CN : 아세톤(1 : 2 : 2)용매계, 검출 미생물 : 마이크로코커스 루테우스]로 분석한다. 이들 방법에 의한 분석결과, 생성물이 균질함이 입증된다. 트립토판 N-말단 위치의 치환이 360MHz PMR에 의해 확인된다. 아미노산 분석에 의해 L-페닐알라닌 1당량이 생성물중에 혼입되어 있음을 확인한다.

[실시예 34]

일반식(1)의 화합물의 항균화성은 표준안천 희석시험법을 이용하여 시험관내에서 입증될 수 있다. 일반식(1)의 대표적 화합물의 항균시험전과는 표 VII에 기재되어 있다. 표 VII에서 환성은 최소억제농도(MIC). 즉 미생물의 생육을 억제하는 시험화합물의 최저 농도로 나타낸다.

[표 VII]

A-21978C 사이클릭 펩타이드의 항생제 활성

a MIC, mcg/ml b 화합물번호=표 III-VI의 실시예번호 c 페니실린-내성균주

d 메티실린-내성균주 e 5회 실험치의 중앙값 f 2회 실험 g 3회 실험치의 중앙값

일반식(1)의 A-21978C 사이클릭 펩타이드는 실험실적 세균감염에 대해 생체내 항미생물 활성을 보인다. 2배 용량의 시험화합물을 감염된 마우스에 피하 또는 경구 투여하여, 그 활성을 ED₅₀값[시험 동물의 50%를 보호하는 유효용량(mg/kg); 참조 : Warren Wick, etal., t18 233-235(1961)으로 나타낸다. A-21978C 화합물의 ED₅₀값은 표 VIII 및 IX에 나타나 있다.

[표 VIII]

A-21978C 사이클릭 펩타이드의 생체내 활성

^aR¹=H,^bmg/kg 2,^c2회 실험.

[표 IX]

A-21978C 사이클릭 펩타이드의 생체내 활성

^amg/kg×2^c2회 실험

일부의 A-21978C 사이클릭 펩타이드에 대한 독성 시험 결과는 표 X와 같다.

[표 X]

A-21978C 사이클릭펩타이드의 독성

a 정맥내 투여 b 현탁액 상태

Claims

A-21978C 사이클릭 펩타이드 인자인 일반식(3)의 A-21978C 핵 또는 그의 유도체를 일반식(5)의 아실화제 또는 그의 활성화 유도체로 아실화시킴을 특징으로 하여 일반식(1)의 A-21978C 사이클릭 펩타이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제조하는 방법.

상기식에서, R은 수소, 8-메틸데카노일, 10-메틸도데카노일, 10-메틸운데카노일, A-21978C₀의 특정한 C₁₀-알카노일 그룹 또는 A-21978C 인자 C₄및 C₅의 특정한 C₁₂-알카노일 그룹, 아미노-보호그룹, 일반식
(여기서, Q는 C₁-C₁₆알킬렌이11다)의 아미노아실 그룹, 또는 일반식
N-알카노일 아미노아실 그룹 [상기식에서, W는 (a) 일반식
의 이가 아미노아실라디칼(여기서, A는 C₁-C₁₀알킬렌 또는 C₅-C₆사이클로알킬렌이다); (b) 일반식

의 이가 아미노아실 라디칼(여기서, R³는 하이드록시메틸, 하이드록시에틸, 머캅토메틸, 머캅토에틸, 메틸티오에틸, 2-티에닐, 3-인돌-메틸, 페닐, 벤질, 또는 치환된 페닐 또는 치환된 벤질(이들의 벤젠환은 클로로, 브로모, 요오도, 니트로, C₁-C₃알킬, 하이드록시, C₁-C₃알콕시, C₁-C₃알킬티오, 카바밀 또는 C₁-C₃알킬카바밀로 치환된다) 이다; (c) 일반식
의 이가 아미노아실라디칼(여기서, X는 수소, 클로로, 브로모, 요오도, 아미노, 니트로, C₁-C₃알킬, 하이드록시, C₁-C₃알콕시머캅토, C₁-C₃알킬티오, 카바밀 또는 C₁-C₃알킬카바밀이다); (d) 일반식
또는
의 이가 아미노아실라디칼(여기서, X¹은 클로로, 브로모, 요오도, 아미노, 하이드록시, C₁-C₃알킬 또는 C₁-C₃알콕시이다); (e) 구조식
또는
의 이가 아미노아실 라디칼; 또는 (f) 일반식
의 이가 아미노아실라디칼(여기서, B는 이가 라디칼 -(CH₂)_n-(n은 1, 2 또는 3이다), -CH=CH-,-CH=CH-CH₂-, 또는
이고, R²는 C₁-C₁₇알킬 또는 C₂-C₁₇알케닐이다]이고; R¹은 수소, 아미노-보호그룹, 상기한 바와 같은 일반식
의 아미노아실 그룹, 또는 상기한 바와 같은 일반식
의 N-알카노일아미노아실 그룹이며; 단, R이 아미노아실 또는 N-알카노일아미노아실이 아닌 경우에, R¹은 아미노아실 또는 N-알카노일 아미노아실이어야하고, R¹이 아미노-보호그룹인 경우. R은 아미노아실 또는 N-알카노일아미노 아실이어야하며; R' 및 R⁰는 독립적으로 수소 또는 아미노 보호그룹이고; Z는 -Q-NH₂,

(여기서, Q, A, R², R³, X, X¹및 B는 상기한 바와 같다).
제1항에 있어서, R이
이고, A는 C₁-C₁₀알킬렌이며, R²는 C₁-C₁₇직쇄 알킬인 방법.
제1항에 있어서, R이
이고, X는 수소이며, R²는 C₁-C₁₇직쇄 알킬인 방법.
제1항에 있어서, R이
또는
이고, X1은 클로로, 브로모, 요오도, 아미노, C₁-C₃알킬, 하이드록시 또는 C₁-C₃알콕시이며, R²는 C₁-C₁₇직쇄알킬인 방법.
제1항에 있어서, R이
이고, R²는 C₁-C₁₇알킬이며, R³는 페닐, 벤질 또는 3-인돌-메틸인 방법.