KR810000048B1 - Process for preparing cephalexin by immobilized enzyme - Google Patents

Abstract

Cephalexin (III) was highly yielded using immobilized whole cell or crude enzyme prepd. from the culture soln. of Xantomonas citri IFO 3835 or Acetobacter turbidans. Thus, 7-aminodeacetoxy cephalosporanic acid (I) was reacted to phenylglycine methyl ester (II) with the Weight ratio 1 to 2.5-5.0, pH = 5-7, temp. 25-45≰C to give (III).

Description

고정화 효소를 이용한 세팔랙신 제조방법Method for producing cephalaccin using immobilized enzyme

제1도는 7-ADCA와 PGM의 상대적 중량비를 바꾸었을때의 반응시간에 따른 세팔랙신의 전환율을 나타낸 도면이다.FIG. 1 is a diagram showing the conversion rate of cefalaccin according to the reaction time when the relative weight ratio of 7-ADCA and PGM is changed.

본 발명은 고정화 효소를 이용한 세팔랙신 제조방법에 관한 것으로서 크산토모나스 시트리(Xantomonas citri, IF03835), 아세토박터 터비단스(Acetobacter turbidans) 등을 배양하여 얻은 균체 또는 이를 정제하여 얻은 효소를 고정화(immobilization)시킨 고정화 효소를 사용하여 단일 단계로 두개의 원료인 7-아미노데아세톡시 세팔로 스포란산(7-Aminodeacetoxy Cephalosporanic acid, 7-ADCA)과 페닐글라이 신 메칠에스 터(Phenyl glycinemethyl ester,PGM)의 중량비를 1 : 2.5-5.0, 반응온도 25-45℃ PH 5-7에서 반응시켜 세팔랙신을 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing cephalacsin using an immobilized enzyme, and immobilization of a cell obtained by culturing Xantomonas citri (Xantomonas citri, IF03835), acetobacter turbidans, or an enzyme obtained by purification thereof. Two raw materials, 7-Aminodeacetoxy Cephalosporanic acid (7-ADCA) and Phenyl glycinemethyl ester (PGM) in a single step using immobilized enzyme It relates to a method for producing cephalacsin by reacting the weight ratio of 1: 2.5-5.0 at a reaction temperature of 25-45 ° C. PH 5-7.

종래에는 미생물 균체를 직접 사용하므로서 온도에 대한 안전성이 나빠 매우 낮은 은도 5-15℃에서 반응을 해야 하므로 결과적으로 반응슥도가 낮아지게 되고 7-ADCA와 PGM의 중량비를 1 : 1로 사용하므로서 수율이 40-50%이었으며 또 균체를 직접사용할 경우 생성된 세팔랙신이 균체내에 있는 다른 효소(예를들면, β-lactamase) 등에 의해 다시 분해 되는등 부반응이 일어나 수율이 낮게 되는 등의 결점이 있었다.Conventionally, the microbial cells are used directly, and thus the temperature stability is poor, and thus, the silver has to be reacted at a low temperature of 5-15 ° C. As a result, the reaction degree is lowered. 40-50% of the cells were used, and when the cells were used directly, the generated cephalaccin was decomposed by other enzymes (eg, β-lactamase) in the cells, resulting in side reactions such as lower yields.

본 발명은 이와 같은 종래의 결점을 해결하기 위하여 미생물균체 및 균체로부터 얻어진 세팔랙신 합성 능력을 가진 효소를 분리, 정제하여 고정화시킨 고정화 효소를 사용하여 7-ADCA와 PGM의 중량비 1 : 2.5-5.0, 반응 온도 25-45℃, PH-5-7에서 반응시키므로서 수율를 80-90%까지 높이고 균체를 10번 이상 재사용하여도 효소의 활성도가 저하하지 않는 것을 특징으로 한것이다.The present invention is to solve the above-mentioned drawbacks of the microorganism and the enzyme having the ability to synthesize the Sepalaxine synthesized from the cells, using the immobilized enzyme immobilized by separation, purification and immobilization ratio of 7-ADCA and PGM 1: 2.5-5.0, By increasing the yield to 80-90% by reacting at the reaction temperature of 25-45 ℃, PH-5-7 and reusing the cells more than 10 times, the activity of the enzyme is not reduced.

본 발명에서는 고정화 효소를 사용하여 세팔랙신을 제조하였는바 본 발명을 상세히 설명하면다음과 같다. 미생물균주(크산토 모나스 시트리, IFO(3835), 아세토 박터 터비단스등)를 배양하여 균체를 얻은후 이 균체를 처리하여 직접 고정화 시키거나 균체로부터 효소를 분리 정제한후 고정시킨 고정화 효소를 사용하여 단일 단계로 다음 반응식에서와 같이 두개의 원료 즉, 7-아미노데아세톡시 세팔로스포란산(Ⅰ) 과 페닐글라이신 메칠에스터(Ⅱ) 또는 이와유사한 유도체를 상온에서 반응시켜 세팔랙신(Ⅲ)을 얻게 된다.In the present invention, the cephalaccin was prepared using the immobilized enzyme. The present invention will be described in detail as follows. Cultivate microbial strains (Xantho Monas citri, IFO (3835), acetobacter turbidans, etc.) to obtain the cells, and then directly fix them by treating the cells, or use an immobilized enzyme that is immobilized after separating and purifying enzymes from the cells. In a single step, two raw materials, 7-aminodeacetoxy cephalosporranic acid (I) and phenylglycine methyl ester (II) or similar derivatives, are reacted at room temperature in a single step, as shown in the following scheme. You get

[반응식][Scheme]

즉, 두개의 원료인 7-아미노데아세톡시 세팔로스포탄산과 페닐글라이신 메칠에스터를 녹인액에 미생물 균주를 최적의 배지에 배양하여 얻은 균체 또는 분리 정제한 효소를 고정화 시킨 고정화 효소(immobilized whole cellor enzymes)를 가한후, 반응온도 25-45℃, 반응시 PH 5-7, 두개 원료물질의 중량비 즉 7-아미노데아세톡시 세팔로스포란산에 대한 페닐글라이신 메칠에스터의 비율을 2.5-5.0, 반응시간 30-90분에서 반응시킨다. 기질로서 사용되는 페닐글라이신 메칠에스터는 D체, L체 또는 DL체를 모두 사용할 수 있으며 이와유사한 유도체(예 : 페닐글라이신 메칠에스터등)도 기질로 사용될 수 있다.In other words, immobilized whole cellor immobilized cells or separated enzymes obtained by culturing microorganism strains in an optimal medium in a solution of two raw materials, 7-aminodeacetoxy cephalospotanic acid and phenylglycine methyl ester. After the addition of the enzymes, the reaction temperature is 25-45 ° C., pH 5-7 at the reaction, and the ratio of the weight ratio of the two raw materials, namely, the ratio of phenylglycine methyl ester to 7-aminodeacetoxy cephalosporranic acid is 2.5-5.0, The reaction time is 30-90 minutes. The phenylglycine methyl ester used as the substrate may be either D, L or DL, and similar derivatives such as phenylglycine methyl ester may be used as the substrate.

직접 미생물 균체효소(whol-cell enzyme)를 사용하는대신 이를 고정화 시켜 고정화 균체효소(immobilized whole cell enzyme)로 만든 후 반응시킬 수 있을 뿐 아니라 미생물 균체효소로부터 조효소(crude enzyme)를 분리한후 이를 고정화시켜 사용할 수 있으므로 산업적으로 이용하기가 매우 용이한 점이 있을 뿐 아니라, 또한 상기한 바와 같은 반응조건과 구성요건을 최적조건으로 잘조정하여 세팔랙신의 수율을 획기적으로 높일 수 있으며 균체를 10번이상 재사용할 수 있다.Instead of directly using micro-cell enzymes, immobilized whole cell enzymes can be immobilized and reacted. The crude enzymes are isolated from microbial cell enzymes and then immobilized. In addition, it is very easy to use industrially because it can be used in addition to the above, it is also possible to dramatically increase the yield of cephalaccin by finely adjusting the reaction conditions and composition requirements as described above to the optimum conditions and to reuse the cells more than 10 times. can do.

더욱 상세한 실험 결과를 예를들어 설명하면, 제1도에 표시된바와 같이, 두가지 원료 물질 즉 7-ADCA과 PGM의 상대적 중량비를 바꾸면서 다른 반응조건을 상술한 바와같이 최적조건으로 조정을 해주면 세팔랙신의 수율이 40-50%에서 80-90%로 향상되어 공정 경제성으로보아 산업화가 가능하게 된다.For example, as shown in FIG. 1, by adjusting the relative weight ratio of the two raw materials, namely, 7-ADCA and PGM, and adjusting the other reaction conditions to the optimum conditions as described above, The yield is improved from 40-50% to 80-90%, which makes industrialization possible in view of process economics.

이상에서 얻은 반응 생성물이 세팔랙신 인지를 확인하기 위해 여지크로마토 그라피와 박층 크로마토 그라피로 실험한 결과 모두 표준품과 동일한 것임을 확인하였으며, 이때의 사용 용매와 Rf치는 다음과 같다.In order to confirm that the reaction product obtained above was cephalaccin, it was confirmed that the results of experiments with exciter chromatography and thin layer chromatography were all the same as the standard product, and the solvent and Rf values used were as follows.

본 발명방법의 고정화 효소를 사용하는 세팔랙신 제조 방법은 종래의 방법에 비해 다음과 같은 장점을 가지고 있다.The method for producing cephalaccin using the immobilized enzyme of the present invention has the following advantages over the conventional method.

(1) 미생물 균체에 의한 반응은 균체에 포함되어 있는 다른 효소에 의해 부반응(Side reaction)이 일어나 수율이 낮으나 균체로부터 반응에 특이성을 갖는 효소를 분리 정재하여 고정화 시키므로 부반응을 극소화 시킬 수 있다.(1) The reaction by microbial cells can minimize side reactions because the side reactions are caused by other enzymes contained in the cells, and the yield is low, but the enzymes having specificity for the reaction are isolated and immobilized from the cells.

(2) 고정화 효소 공정은 미생물 균체에 의한 방법에 비해 열이나 산, 염기에 매우 안정하므로 장시간 조업이 가능하다.(2) The immobilized enzyme process is more stable to heat, acid and base than the microbial cell method, and thus can be operated for a long time.

(3) 종래의 방법은 최종수율이 40-50%에 불과하였으나 본 발명 밥업에 의한 최종수율은 80-90%에 달하고 따라서 분리 및 정제 공정이 용이하게 되며 또한 균체를 10번이상 재사용할 수 있다.(3) In the conventional method, the final yield is only 40-50%, but the final yield by the present invention is 80-90%, thus facilitating the separation and purification process, and the cells can be reused more than 10 times. .

이상에서와 같이 본 발명에 의한 고정화 효소 공정은 조업시간을 크게 단축시킬수 있으며 또한 수율을 80-90%로 높임으로서 생산경비를 크게 절감시킬 수 있어 경제적 및 공업적으로 매우 유용한 것이라 할 수 있다. 본 발명의 실시예를 들면 다음과 같다.As described above, the immobilized enzyme process according to the present invention can greatly shorten the operating time and can greatly reduce the production cost by increasing the yield to 80-90%, which is very economically and industrially useful. Examples of the present invention are as follows.

[실시예 1]Example 1

표 1의 조성으로 50㎖배지를 만들어 500㎖ 진탕용 삼각 플라스크에 놓고 멸균하여 냉각시킨후 크산토모나스시트티(Xantmonas citri IFO 3855) 바이알을 깨어 놓는다.50 ml of the composition of Table 1 was made in a 500 ml shake Erlenmeyer flask, sterilized and cooled, and the vials of Xantmonas citri IFO 3855 were awakened.

이것을 28℃에서 300rpm으로 30-36시간 진탕 배양한 후에 500㎖진탕용 삼각 플라스크에 전과 동일한 조성의 배지를 40㎖씩 놓고 멸균한 것에 2.5㎖씩 식균한다.After shaking for 30-36 hours at 300 ° C at 28 ° C for 30-36 hours, 40 ml of the same composition was put in a 500 ml shaking Erlenmeyer flask and 2.5 ml of each was sterilized.

처음의 종배지(inoculum)를 배양하는 방법과 동일한 조건에서 20-24시간 배양한후 원심 분리한 다음 상등액을 버리고 증류수 500㎖로 수세하여 다시 원심 분리 시켜 균체를 얻는다. 이 균체 즉 미생물효소(whole cell enzyme)를 7-아미노데아세톡시 세팔로스포란산 2.5g과 D-페닐글라이신 메칠에스터 5g을 250㎖의 증류수에 녹이고 2N NaOH로 PH6.0으로 조절한 액에 가하여 계속 PH 6.0으로 조절해 주면서 37℃에서 90분간 반응시킨다.After incubation for 20-24 hours under the same conditions as the method of culturing the initial species (inoculum), centrifuged, discarded the supernatant, washed with distilled water 500ml and centrifuged again to obtain cells. This cell, or microbial enzyme (whole cell enzyme), was dissolved in 2.5 g of 7-aminodeacetoxy cephalosporranic acid and 5 g of D-phenylglycine methyl ester in 250 ml of distilled water and adjusted to PH6.0 with 2N NaOH. The reaction is continued for 90 minutes at 37 ℃ while adjusting to pH 6.0.

이 반응액을 원심 분리한 다음 상등액을 동결 건조(freeze drying)시켜 결과 3.6g의 세팔랙신을 얻었으며 이때의 수율은 약 90%이었다.The reaction solution was centrifuged and the supernatant was freeze dried to yield 3.6 g of cefalaccin, the yield being about 90%.

[표 1. 배지조성]Table 1. Medium Composition

[실시예 2]Example 2

실시예 1과 동일한 방법으로 500㎖의 배지를 배양한후 원심 분리, 증류수로 세척하고 다시 원심 분리하여 균체를 얻는다. 7-아미노데아세톡시 세팔로스란산 0.5g, D-페닐글라이신 메칠에스터 1g을 50㎖증류수에 녹이고 4N NaOH로 PH 6.0으로 조절한 후 균체를 가하고 35℃에서 45분간 방응시킨다. 반응액을 원심 분리하여 상등액을 동결건조시켜 0.70g의 세팔랙신을 얻었다. 한번 사용한 균체를 위와 동일한 방법으로 실험 하였을때의 수율은 거의 변화가 없었으며 10번 사용한 균체를 위화 동일한 방법으로 실험하였을때는 0.62g의 세팔랙신을 얻었다.After incubating the medium of 500ml in the same manner as in Example 1, centrifuged, washed with distilled water and centrifuged again to obtain cells. 0.5 g of 7-aminodeacetoxy cephaloslanic acid and 1 g of D-phenylglycine methyl ester are dissolved in 50 ml distilled water, adjusted to PH 6.0 with 4N NaOH, and cells are added and allowed to react at 35 ° C. for 45 minutes. The reaction solution was centrifuged and the supernatant was lyophilized to obtain 0.70 g of cephalaccin. Yields were almost unchanged when the cells were used in the same way as above, and 0.62 g of cephalaccin was obtained when the cells were used in the same way.

[실시예 3]Example 3

아크릴 아미이드 겔(Acrylamide gel)에 의한 고정화 균체 효소이용방법.Immobilized Cell Enzyme Use Method by Acrylamide Gel.

표 2의 배지 조성으로 실시예 1과 동일한 방법으로 크산토모나스 시트리 균체효소 700㎎(건조중량)을 0.05M, PH 6.0인산염 완충용액으로 세척한후 0.1M, PH 6.0 인산염 완충액을 가하여 10㎖로 만들어 0-4℃로 냉각한다. 이 용액을 아크릴아마이드 2.39g과 N,N'-메칠렌비스 아크릴 아마이드(N,N' methylenebis-acrylamide) 0.15g을 9.2㎖의 0.1M, PH 6.0 인산염 용액에 녹인 용액과 합한 후 즉시 교반시킨다. (용액 A) N,N,N',N'-테트라 메칠렌디아민(N,N,N',N'-tetra-methylene diamine) 0.04g을 물 0.4㎖에 녹이고 암모니움 퍼설페이트(ammonium persulfate) 0.02g을 0.4㎖물에 녹인다.700 mg (dry weight) of xanthomonas citri mycolytic enzyme was washed with 0.05 M, PH 6.0 phosphate buffer solution in the same manner as in Example 1, and then 0.1 M, PH 6.0 phosphate buffer was added thereto. Made and cooled to 0-4 ℃. 2.39 g of acrylamide and 0.15 g of N, N'-methylenebis-acrylamide were combined with a solution of 9.2 ml of 0.1 M, PH 6.0 phosphate solution, followed by stirring immediately. (Solution A) Dissolve 0.04 g of N, N, N ', N'-tetra-methylenediamine in 0.4 ml of water and ammonium persulfate Dissolve 0.02 g in 0.4 ml water.

이두 용액을 용액 A에 가하고 0℃로 냉각시키면서 교반한후 일정시간 방치한다.Add these solutions to Solution A, stir while cooling to 0 ° C, and leave for a while.

완전히 겔이 굳어진 후 30메시(mesh) 크기의 펠랫(pellet)을 만든후 0.9%식염수로 세척하고 상온에서 표 2의 배지에 하루동안 활성화 시킨다.After the gel is completely hardened, a pellet of 30 mesh size is made, washed with 0.9% saline, and activated in the medium of Table 2 at room temperature for one day.

상기 방법으로 제조된 고정화 균체 효소를 관형반응기(2×30㎝)에 충진시킨후 5℃에서 7-아미노데아세톡시세팔로스포란산 50㎎/㎖과 페닐글라이신 메칠에스터 12㎎/㎖을 함유하는 기질 용액(PH7.0)을 유향 1㎖/hr로 통과 시켰을때 7㎎/㎖ 세팔랙신이 생성되었으며 표 2의 배지로 활성화 하여 10번 재사용한 결과 15일 동안의 조업에도 효소역가의 변화가 거의 없었다.The immobilized cell enzyme prepared by the above method was charged in a tubular reactor (2 × 30 cm) and then contained 50 mg / ml of 7-aminodeacetoxy cephalosporranic acid and 12 mg / ml of phenylglycine methyl ester at 5 ° C. When passing through the substrate solution (PH7.0) at 1 ml / hr of frankincense, 7 mg / ml cephalaccin was produced, and the enzyme titer was changed even after 15 days of operation after activating with the medium of Table 2 and reusing 10 times. There was little.

[표 2. 배지조성][Table 2. Medium composition]

[실시예 4]Example 4

폴리아크릴로일-N,N-비스(2,2-데메톡시에칠)아민에 조효소를 고정화시켜 이용하는 방법.A method of immobilizing coenzyme in polyacryloyl-N, N-bis (2,2-demethoxyethyl) amine.

아크릴로일 클로라이드(acryloyl chloride) 4.52g을 100에테르에 녹인것을 N,N-비스(2,2-디메톡시에칠)아민(N,N-bis(2,2-dimethoxy ethylamine) 19.3g을 녹인 100㎖의 에테르에 가하고 5℃ 이하에서 30분간 교반시킨다.4.52 g of acryloyl chloride was dissolved in 100 ethers, and 19.3 g of N, N-bis (2,2-dimethoxy ethylamine) was dissolved. It is added to 100 ml of ether and stirred at 5 DEG C or lower for 30 minutes.

생성된 아크릴로일-N,N-비스(2,2-디메톡시에칠)아민을 50㎖의 에테르로 세척한 다음 실온에서 에테르를 증발시켜 순수한 아크릴로일-N,N-비스(2,2-디메톡시에칠)아민 11.9g(97%)을 얻는다. 이중 4.9g을 취하여 N,N'-메칠렌디 아크릴 아미드(N,N'-methylene diacryl amde)0.38g과 함께 80%(v/v) 에칠알콜용액 13㎖에 녹인다 (용액 A)암모니움 퍼설페이트를 80%에칠알콜에 녹여 0.5%(w/v)용액으로 하고 그중 2㎖를 취해 용액 A에 가하여 급속히 겔화 시킨후 방치한다.The resulting acryloyl-N, N-bis (2,2-dimethoxyethyl) amine was washed with 50 ml of ether and then the ether was evaporated at room temperature to give pure acryloyl-N, N-bis (2, 11.9 g (97%) of 2-dimethoxyethyl) amine are obtained. Take 4.9 g of this and dissolve in 13 ml of 80% (v / v) ethyl alcohol solution with 0.38 g of N, N'-methylene diacryl amde (Solution A) Ammonium persulfate. Dissolve in 80% ethyl alcohol to make 0.5% (w / v) solution. Take 2 ml of this solution and add it to Solution A. After rapidly gelling, let stand.

굳어진겔을 일정한 크기로 만든후 80% 에칠알콜 용액에서 저장한다. 이렇게 하여 제조된 폴리아크릴로일-N,N-비스(2,2-디메톡시에칠) 아민의 무개는 약 2.5g(수율 40%)이었다. 이 중합체를 1M 염산에 녹인 5%(w/v)주석산 디히드 라지드(tartaric acid drazide)에 넣고 실온에서 18시간 방치한후 증류수로 세척한 후 2M 염산을 가하여 방치한 다음 원심 분리한다. 이렇게 하여 얻어진 겔을 인산염 완충용액(0.05M)으로 여러번 세척한다.The gel is made to a certain size and stored in 80% ethyl alcohol solution. The weight of the polyacryloyl-N, N-bis (2,2-dimethoxyethyl) amine thus prepared was about 2.5 g (40% yield). The polymer is placed in 5% (w / v) tartaric acid drazide dissolved in 1M hydrochloric acid, left at room temperature for 18 hours, washed with distilled water, left to add 2M hydrochloric acid, and then centrifuged. The gel thus obtained is washed several times with phosphate buffer (0.05 M).

균체효소 500㎎(건조중량)을 PH6.0 인산완충용액(0.05M) 30㎖에 현탁시키고 그중 10㎖을 취해 겔에 가한 다음 0-4℃에서 교반시키면서 반응을 시킨후 생성 물질을 원심 분리기로 분리한 후 인산 완충용액과 1M 식염수에 설탕을 녹인 1mM 용액으로 교대하여 수차 세척시킨다.Suspension 500 mg (dry weight) of the cell enzyme was suspended in 30 ml of PH6.0 phosphate buffer solution (0.05 M), 10 ml of which was added to the gel, and reacted with stirring at 0-4 ° C. After separation, the phosphate buffer was washed several times by alternating with 1mM solution in which sugar was dissolved in 1M saline solution.

이렇게 하여 얻은 고정화 효소를 실시예 4와 같은 방법으로 반응시켰을때 70-80%(mole 기준으로)의 수율로 세팔랙신을 합성시킬수 있었다.When the immobilized enzyme thus obtained was reacted in the same manner as in Example 4, cefalaccin was synthesized in a yield of 70-80% (based on mole).

[실시예 5]Example 5

조효소(crude enzyme)제조방법.Crude enzyme production method.

실시예 1과 같은 방법으로 얻어진 균체 효소를 0.9%식염수로 세척하고 PH 6.0 인산 완충용액(0.1M)에 현탁시켜 균체를 소니케이션(Sonication)시킨 다음 원심 분리기에 의하여 분리시킨다. 상등액을 취해 황산암모늄(ammoniumsulfate)을 가한 후 생성되는 첨전물을 분리시킨 다음 동결 건조하여 조효소로 사용한다.The cell enzymes obtained in the same manner as in Example 1 were washed with 0.9% saline solution and suspended in PH 6.0 phosphate buffer (0.1 M) to sonicate the cells and separated by centrifugation. Take the supernatant, add ammonium sulfate, separate the resulting additive, and freeze-dry it to use as a coenzyme.

[실시예 6]Example 6

담체를 이용한 고정화 조효소 이용 방법.Method of using immobilized coenzyme using a carrier.

세파로스 4B(Sepharose 4B, 파마시아 회사제품, 스웨덴)를 2M 인산카리 완충용액(PH 12.1)으로 세척하고 여과한 다음 냉각된 5M 인산카리 완충용액으로(PH 12.1)을 10g의 세파로스 4㎖겔에 가하고 증류수와 시이노겐 브로마이드(CNBr)소량을 가한다.Sepharose 4B (available from Pharmacia, Sweden) was washed with 2M phosphate buffer (PH 12.1), filtered, and cooled with 5M phosphate buffer (PH 12.1) on 10 g of Sepharose 4 ml gel. Distilled water and a small amount of cyinogen bromide (CNBr) are added.

실시예 5에서 얻은 조효소 100㎎을 PH6.0 인산완충용액(0.3M) 4㎖에 녹여 상기방법으로 제조된 겔에 가한다. 5℃에서 천천히 교반시켜준 후 결합(Coupling)반응이 끝나면 물 0.1M 인산완충용액, 0.3M, 식염수 등으로 세척한다. 이렇게 하여 얻어진 고정화 조효소를 관형 반응기(2×20㎝)에 놓고 7-아미노데아세톡시세팔로스 포란산 5㎎/㎖와 페닐글라이신 에칠에스터 10㎎/㎖의 기질용액(PH7.0)을 넣어 반응시킨 결과 70㎎/㎖의 세팔랙신 합성수율을 얻을 수 있었으며 일주일동안 거의 일정한 효소 활성도를 유지하였다.100 mg of the coenzyme obtained in Example 5 was dissolved in 4 ml of PH6.0 phosphate buffer solution (0.3 M) and added to the gel prepared by the above method. After slowly stirring at 5 ° C, the coupling reaction is completed and washed with water 0.1M phosphate buffer solution, 0.3M, saline, and the like. The immobilized coenzyme thus obtained was placed in a tubular reactor (2 × 20 cm), and 5 mg / ml of 7-aminodeacetoxy cephalosulfonic acid and 10 mg / ml of phenylglycine ethyl ester (PH7.0) were added thereto. The reaction yielded a yield of 70 mg / ml cephalaccin synthesis and maintained nearly constant enzyme activity for one week.

[실시예 1]Example 1

실시예 5에서 얻어진 조효소를 5㎖(단백질 함량 40㎎)을 취하여, 0.05M 인산 완충액(PH7.5)으로 평형화된 EDAE-셀루로스 크로마토 그라피관을 통과시킨 다음 0.05M인산 완충용액(PH7.4)을 15㎖/hr의 유속으로 용리시킨다. 효소활성을 갖고 있는 부분을 취하여(단백질 함량 1.9㎎) 0.05M 인산 완충용액(PH6.2)으로 평형화 된 세파로즈(Sepharose 4B)크로마토 그라피 관을 통과시킨후 같은 완충용액을 사용하여 15㎖/hr의 유속으로 용리시킨다. 상기 정제 방법에 의해 효소의 비활성(Specific activity)이 59.8units/㎎ Protein이었으며 약 30배 정제된다.5 ml (protein content 40 mg) of the coenzyme obtained in Example 5 was passed through an EDAE-cellulose chromatography tube equilibrated with 0.05 M phosphate buffer (PH7.5), followed by 0.05 M phosphate buffer (PH7.4). ) Is eluted at a flow rate of 15 ml / hr. Take the part with enzymatic activity (protein content 1.9mg) and pass through Sepharose 4B chromatographic tube equilibrated with 0.05M phosphate buffer (PH6.2), and then use 15ml / hr using the same buffer. Elute at a flow rate of. The specific activity of the enzyme was 59.8 units / mg Protein and purified about 30 times by the above purification method.

[실시예 8]Example 8

흡착에 의한 고정화 효소 제조법.Method for preparing immobilized enzyme by adsorption.

벤토나이트(Al₂O₃4SiO₂H₂O)와 카올린(H₂Al₂Si₂O₈H₂O) 100㎎을 각각 취하여 1mMEDTA로 20℃에서 1시간 동안 처리한 후 300rpm에서 5분간 원심 분리시킨다. 여과된 흡착제를 인산 완충용액(0.05M)에 현탁시킨다음 실시예 7에서 얻은 정제 효소를 가하여(8㎎ 단백질) 20℃에서 1시간 동안 교반시킨후 역시 3000rpm에서 5분간 원심 분리시킨다. 이때의 효소 활성도는 벤토나이트의 경우 390units/g matrix, 카올린의 경우 506 units/g matrix로 회수율은 각각 71%, 92%이었다.100 mg of bentonite (Al ₂ O ₃ 4SiO ₂ H ₂ O) and kaolin (H ₂ Al ₂ Si ₂ O ₈ H ₂ O) were taken, respectively, treated with 1mMEDTA for 1 hour at 20 ° C, and centrifuged at 300 rpm for 5 minutes. . The filtered adsorbent was suspended in phosphate buffer (0.05 M), and the purified enzyme obtained in Example 7 was added (8 mg protein), stirred at 20 ° C. for 1 hour, and then centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes. At this time, the enzyme activity was 390 units / g matrix for bentonite and 506 units / g matrix for kaolin, with 71% and 92% recovery, respectively.

[실시예 9]Example 9

실시예 8에서 얻어진 고정화 효소를 실시예 3에서와 같이 관형 반응기에 충진시켜 조업한 결과 75-85%의 7-ADCA가 셀팔랙신으로 전환 되었으며 20일 동안 거의 일정한 효소활성도를 유지하였다.The immobilized enzyme obtained in Example 8 was charged into a tubular reactor as in Example 3, and as a result, 75-85% of 7-ADCA was converted to cell falacin and maintained almost constant enzyme activity for 20 days.

Claims (1)

본문에서 상술한 바와 같이(미생물(크산토모나스 시트리 IFO 3855, 아세토박터 터비단스등)을 배양하여 얻은 미생물 균체로부터 제조된 고정화 효소(immobilized whole cellor crude enzyme)를 사용하여 7-아미노데아세톡시세팔로스포라닌산과 페닐글라이신 메칠에스터의 중량비 1대 2.5-5.0, 반응온도 25-45℃, PH5-7에서 반응시킴을 특정으로 하는 고정화 효소에 의한 세팔랙신 제조방법.As described above in the text (7-aminodeacetoc using immobilized whole cellor crude enzyme prepared from microbial cells obtained by culturing microorganisms (Xanthomas citri IFO 3855, Acetobacter turbidans, etc.). A method for producing cephalacsin by immobilizing enzyme, characterized in that the reaction is carried out at a weight ratio of 2.5-5.0, a reaction temperature of 25-45 ° C, and PH5-7 of cycephalosporanic acid and phenylglycine methyl ester.

Images