JPH04330297A - Production of l-threo-3-(3,4-dihydroxyphenyl)serine derivative - Google Patents
Production of l-threo-3-(3,4-dihydroxyphenyl)serine derivativeInfo
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-
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- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
【０００１】0001
【産業上の利用分野】本発明は、パーキンソン病治療薬
及び家族性アミロイドポリニューロパシーなどの治療薬
として有用なことが知られているＬ−スレオ−３−（３
，４−ジヒドロキシフェニル）セリン及びその誘導体（
以下、Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳ誘導体と略す）の製造方法
に関する。Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳ誘導体は医薬品として
有用なＬ−スレオ−ＤＯＰＳ合成の重要な中間体である
。[Field of Industrial Application] The present invention relates to L-threo-3-(3
,4-dihydroxyphenyl)serine and its derivatives (
The present invention relates to a method for producing L-threo-DOPS derivatives (hereinafter abbreviated as L-threo-DOPS derivatives). L-threo-DOPS derivatives are important intermediates in the synthesis of L-threo-DOPS, which is useful as a pharmaceutical.
【０００２】0002
【従来の技術】従来、Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳ誘導体の合
成は、以下の方法により行なわれていた。即ち、カテコ
ール部分を保護したプロトカテキュアルデヒド誘導体と
、グリシンとを強アルカリ下で縮合させ、ラセミ−スレ
オ／エリスロ−ＤＯＰＳ誘導体を得、次にこうして得ら
れた生成物をスレオ／エリスロ体の相互分離処理を行な
い、次にラセミ−スレオ−ＤＯＰＳ誘導体を光学分割す
るために、カテコール部分の保護基を除去後、アミノ基
部分に置換基を導入した後、キニン、ブルシン等の光学
分割剤を用いて光学分割を行った後、最後にアミノ基部
分の置換基を除去するというものである（特開昭５８−
２１６１４６号）。BACKGROUND OF THE INVENTION Conventionally, L-threo-DOPS derivatives have been synthesized by the following method. That is, a protocatechualdehyde derivative with a protected catechol moiety and glycine are condensed in a strong alkali to obtain a racemic-threo/erythro-DOPS derivative, and then the product thus obtained is condensed with the mutual reaction of the threo/erythro forms. After performing separation treatment, in order to optically resolve the racemic-threo-DOPS derivative, after removing the protective group of the catechol moiety and introducing a substituent to the amino group moiety, an optical resolution agent such as quinine or brucine is used. After optical resolution is carried out, the substituents on the amino group are finally removed (Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 1983-1999).
No. 216146).
【０００３】0003
【発明が解決しようとする問題点】Ｌ−スレオ−ＤＯＰ
Ｓ誘導体の合成にあたっては、各種の特定の保護基を導
入したり、除去することが必要であるのに加えて、この
合成において複数の立体異性体が産生され、それら立体
異性体相互の分離が、大きな課題となっている。このよ
うに、その合成工程において２種以上の立体異性体が生
じることから、それら異性体の分離には少なくとも複数
の工程が必須であり、さらに各種保護基の導入除去工程
もそれに伴って必要であることから、工業的製造の上で
大きな問題となっていた。[Problem to be solved by the invention] L-Threo-DOP
In the synthesis of S derivatives, it is necessary to introduce or remove various specific protecting groups, and in addition, multiple stereoisomers are produced in this synthesis, and separation of these stereoisomers from each other is difficult. , has become a major issue. Since two or more stereoisomers are generated in the synthesis process, at least multiple steps are essential to separate these isomers, and steps for introducing and removing various protecting groups are also necessary. For this reason, it has become a major problem in industrial manufacturing.
【０００４】このうち特に、光学分割法は、工程が複雑
で収率が悪いばかりでなく、それに使用する光学分割剤
も高価であり、工業的製造法としては問題があった。さ
らに従来の光学分割法では、ラセミ体分離前に必ず、ス
レオ／エリスロ体間の分離処理も必要としており、さら
にこれらの方法の結果得られる不要の生成物、すなわち
、ＤＬ−エリスロ誘導体及びＤ−スレオ誘導体は、再度
それを利用するために別途ラセミ化したり、分解したり
する必要があり、ますます製造設備などが複雑となるこ
とになっていた。Among these methods, the optical resolution method in particular has problems as an industrial production method because not only the process is complicated and the yield is poor, but also the optical resolution agent used therein is expensive. Furthermore, conventional optical resolution methods always require separation treatment between threo/erythro forms before racemic separation, and furthermore, unnecessary products obtained as a result of these methods, namely DL-erythro derivatives and D- In order to use the threo derivative again, it is necessary to separately racemize or decompose it, making the manufacturing equipment increasingly complex.
【０００５】[0005]
【問題点を解決するための手段】本発明者らは、Ｌ−ス
レオ−ＤＯＰＳ合成にあたり重要な中間体であるＬ−ス
レオＤＯＰＳ誘導体のみを得ることのできる手法を鋭意
検討した結果、ラセミ−スレオ／エリスロ−ＤＯＰＳ誘
導体に、特定の基質特異性を有する酵素を作用させるこ
とにより、特異的にＬ−スレオ−ＤＯＰＳ誘導体のみが
得られることを見出し、本発明を完成したものである。
本発明は、一般式[Means for Solving the Problems] The present inventors have intensively investigated a method that can obtain only L-threo-DOPS derivatives, which are important intermediates in the synthesis of L-threo-DOPS. The present invention was completed based on the discovery that only L-threo-DOPS derivatives can be specifically obtained by allowing enzymes having specific substrate specificity to act on /erythro-DOPS derivatives. The present invention is based on the general formula
【０００６】[0006]
【化２】
（式中、Ｒ１ 、Ｒ２ は同一又は相異なり、水素、低
級アルキル又はアラルキル基を示し、Ｒ１ 、Ｒ２ 共
にアルキレン基で置換されて環を形成していてもよい）
で表わされるラセミ−スレオ／エリスロ−３−（３，４
−ジヒドロキシフェニル）セリン誘導体に、Ｄ−スレオ
／エリスロ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セ
リン誘導体と、Ｌ−エリスロ−３−（３，４−ジヒドロ
キシフェニル）セリン誘導体とを特異的にグリシンと対
応するプロトカテキュアルデヒド誘導体に分解する能力
を有する酵素、同酵素を産生する微生物菌体あるいは菌
体処理物を作用させることを特徴とするＬ−スレオ−３
−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セリン誘導体の製
造法に関する。特には、本発明は、一般式[Formula 2] (In the formula, R1 and R2 are the same or different and represent hydrogen, lower alkyl or aralkyl group, and both R1 and R2 may be substituted with an alkylene group to form a ring)
Racemic threo/erythro-3-(3,4
D-threo/erythro-3-(3,4-dihydroxyphenyl)serine derivative and L-erythro-3-(3,4-dihydroxyphenyl)serine derivative are specifically added to glycine L-Threo-3, characterized in that it is treated with an enzyme capable of decomposing it into the corresponding protocatechualdehyde derivative, a microbial cell that produces the same enzyme, or a processed product of the cell.
- It relates to a method for producing a (3,4-dihydroxyphenyl)serine derivative. In particular, the invention relates to the general formula
【０００７】[0007]
【化３】
（式中、Ｒ１ 、Ｒ２ は同一又は相異なり、水素、低
級アルキル又はアラルキル基を示し、Ｒ１ 、Ｒ２ 共
にアルキレン基で置換されて環を形成していてもよい）
で表わされるラセミ−スレオ／エリスロ−３−（３，４
−ジヒドロキシフェニル）セリン誘導体に、Ｄ−スレオ
／エリスロ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セ
リン誘導体を特異的にグリシンと対応するプロトカテキ
ュアルデヒド誘導体に分解する能力を有する酵素、同酵
素を産生する微生物菌体あるいは菌体処理物と、Ｌ−エ
リスロ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セリン
誘導体を特異的にグリシンと対応するプロトカテキュア
ルデヒド誘導体に分解する能力を有する酵素、同酵素を
産生する微生物菌体あるいは菌体処理物を作用させるこ
とを特徴とするＬ−スレオ−３−（３，４−ジヒドロキ
シフェニル）セリン誘導体の製造法に関する。[Formula 3] (In the formula, R1 and R2 are the same or different and represent hydrogen, lower alkyl or aralkyl group, and both R1 and R2 may be substituted with an alkylene group to form a ring)
Racemic threo/erythro-3-(3,4
-dihydroxyphenyl)serine derivative, an enzyme capable of specifically decomposing D-threo/erythro-3-(3,4-dihydroxyphenyl)serine derivative into glycine and the corresponding protocatechualdehyde derivative; Produced microbial cells or bacterial cell-treated products, and an enzyme having the ability to specifically decompose L-erythro-3-(3,4-dihydroxyphenyl)serine derivatives into glycine and the corresponding protocatechualdehyde derivatives; The present invention relates to a method for producing L-threo-3-(3,4-dihydroxyphenyl)serine derivatives, which is characterized by reacting enzyme-producing microbial cells or bacterial cell-treated products.
【０００８】本発明で用いられる原料ラセミ−スレオ／
エリスロ−ＤＯＰＳ誘導体としては、上記式（Ｉ）を有
する化合物があげられるが、それら化合物は、その保護
基のＲ１ 及びＲ２ が同一又は相異なるところの化合
物の混合物であってもよい。上記式（Ｉ）で示される化
合物の代表的なものとしては、ラセミ−スレオ／エリス
ロ−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）セリン
、ラセミ−スレオ／エリスロ−３−（３，４−ジベンジ
ルオキシフェニル）セリン、ラセミ−スレオ／エリスロ
−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セリン、ラセ
ミ−スレオ／エリスロ−３−（３，４−ジメトキシフェ
ニル）セリンあるいはそれらの混合物があげられる。Raw material racemic threo/
Erythro-DOPS derivatives include compounds having the above formula (I), but these compounds may be a mixture of compounds in which R1 and R2 of the protecting groups are the same or different. Representative examples of the compound represented by the above formula (I) include racemic-threo/erythro-3-(3,4-methylenedioxyphenyl)serine, racemic-threo/erythro-3-(3,4- dibenzyloxyphenyl)serine, racemic threo/erythro-3-(3,4-dihydroxyphenyl)serine, racemic threo/erythro-3-(3,4-dimethoxyphenyl)serine, or a mixture thereof.
【０００９】本発明においては、Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳ
誘導体以外の異性体、すなわち、Ｄ−スレオ−ＤＯＰＳ
誘導体並びにＤＬ−エリスロ−ＤＯＰＳ誘導体を特異的
に分解するのみでなく、それらの異性体をグリシンと対
応するプロトカテキュアルデヒド誘導体とに分解するこ
とから、こうして得られたグリシンと対応するプロトカ
テキュアルデヒド誘導体はそれを再度合成に使用できる
。In the present invention, L-threo-DOPS
Isomers other than derivatives, i.e. D-threo-DOPS
It not only specifically decomposes the derivatives and DL-erythro-DOPS derivatives, but also decomposes their isomers into glycine and the corresponding protocatechualdehyde derivatives. The aldehyde derivative can be used again for synthesis.
【００１０】本発明で使用されるＤ−スレオ及びエリス
ロ−ＤＯＰＳ誘導体及びＬ−エリスロ−ＤＯＰＳ誘導体
を特異的にグリシンと対応するプロトカテキュアルデヒ
ド誘導体に分解する能力を有する酵素としては、Ｄ−ス
レオニンアルドラーゼとＬ−アロスレオニンアルドラー
ゼとを組み合わせたものがあげられる他、その酵素と実
質的に同一な活性を有するもの、例えば、それら酵素を
産生する微生物そのもの、あるいは菌体の処理物などが
あげられる。The enzyme used in the present invention that has the ability to specifically decompose D-threo and erythro-DOPS derivatives and L-erythro-DOPS derivatives into glycine and the corresponding protocatechualdehyde derivatives includes D-threonine. In addition to those that combine aldolase and L-allothreonine aldolase, examples include those that have substantially the same activity as the enzymes, such as microorganisms that produce these enzymes themselves or processed products of bacterial cells. .
【００１１】本発明においては、上記酵素又はその同等
物は、同時に反応せしめられてもよいし、あるいは順次
反応せしめられてもよい。本発明においては、前記した
ように、Ｄ−スレオ／エリスロ−ＤＯＰＳ誘導体を分解
する酵素を用いることがあげられるが、このような酵素
としては、Ｄ−スレオ／エリスロ−ＤＯＰＳ誘導体を特
異的に分解するものであれば、いずれも使用できる。こ
のような酵素として特に好ましいものとしては、Ｄ−ス
レオ／エリスロ−ＤＯＰＳ誘導体を特異的にグリシンと
対応するプロトカテキュアルデヒド誘導体に分解する能
力を有するものがあげられる。また特に好ましいものと
しては、ＤＬ−立体構造の違いを特異的に認識するが、
スレオ・エリスロの構造上の差異には影響を受けないも
のがあげられる。さらにまた（ジヒドロキシフェニル）
セリンに導入された各種保護基などの存在にかかわらず
、特異的な活性を有するものがあげられる。In the present invention, the above enzymes or their equivalents may be reacted simultaneously or sequentially. In the present invention, as described above, an enzyme that decomposes D-threo/erythro-DOPS derivatives can be used, but such an enzyme can specifically decompose D-threo/erythro-DOPS derivatives. You can use any of them as long as you do. Particularly preferred such enzymes include those having the ability to specifically decompose D-threo/erythro-DOPS derivatives into glycine and the corresponding protocatechualdehyde derivatives. Particularly preferred are those that specifically recognize differences in DL-3D structure;
There are some things that are not affected by the structural differences between Threo and Erythro. Furthermore (dihydroxyphenyl)
Some of them have specific activity regardless of the presence of various protective groups introduced into serine.
【００１２】このような酵素として特に好ましいものは
、Ｄ−スレオニンアルドラーゼがあげられる。このよう
な、Ｄ−スレオニンアルドラーゼとしては、特公昭６４
−１２７９号に記載されたものの他、その遺伝子を操作
して得られたもの（例えば、特願平１−２７６１２６号
）などをあげることができる。本発明で用いられるＤ−
スレオニンアルドラーゼは、Ｄ−スレオニンアルドラー
ゼ産生菌あるいは、その変異株又は変種株などから得る
ことができる。A particularly preferred example of such an enzyme is D-threonine aldolase. As such D-threonine aldolase,
In addition to those described in No. 1279, examples include those obtained by manipulating the gene (for example, Japanese Patent Application No. 1-276126). D- used in the present invention
Threonine aldolase can be obtained from a D-threonine aldolase-producing bacterium or a mutant or variant strain thereof.
【００１３】Ｄ−スレオニンアルドラーゼ産生菌として
は、例えば、アルカリゲネス フェカリス（Ａｌｃａ
ｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＩＦＯ １
２６６９）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
）ＤＫ−２ （微工研菌寄６２００号）、アスロバクタ
ー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＤＫ−１９ （微工研
菌寄６２０１号）、キサントモナス オリゼー（Ｘａ
ｕｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ）（ＩＡＭ１６５
７）などが知られているが、これらのものに限定される
ことなく使用することもできる。Examples of D-threonine aldolase-producing bacteria include Alcaligenes faecalis (Alca
ligenes faecalis) (IFO 1
2669), Pseudomonas
) DK-2 (Feikoku Kenkyori No. 6200), Arthrobacter DK-19 (Feikin Kyoiku No. 6201), Xanthomonas oryzae (Xa
uthomonas oryzae) (IAM165
7) and the like are known, but it can also be used without being limited to these.
【００１４】また、Ｄ−スレオニンアルドラーゼの合成
に関与する遺伝子を担うＤＮＡを遺伝子組換えなどの手
法を用いて導入して作成された組換え体も、好適に使用
することができる。このような遺伝子を導入して利用し
うる微生物としては、例えばエシェリヒア属（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ）細菌、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
）細菌、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属
細菌、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属細
菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌
、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属
細菌、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属細
菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、アルカ
リゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属細菌、クレブシ
エラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属細菌、サルモネラ（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔ
ｉａ）属細菌などの原核微生物や酵母などの下等真核生
物などを用いることができる。[0014] Furthermore, a recombinant prepared by introducing DNA carrying a gene involved in the synthesis of D-threonine aldolase using techniques such as genetic recombination can also be suitably used. Examples of microorganisms into which such genes can be introduced and utilized include the genus Escherichia (Esch
erichia) bacteria, Bacillus spp.
) Bacteria, Xanthomonas genus bacteria, Acetobacter genus bacteria, Pseudomonas genus bacteria, Gluconobacter genus bacteria, Azotobacter genus bacteria, Rhizobium genus bacteria um) bacteria, Alcaligenes ( Bacteria of the genus Alcaligenes, bacteria of the genus Klebsiella, Salmonella (S
Bacteria of the genus almonella, Serratia
Prokaryotic microorganisms such as bacteria of the genus ia) and lower eukaryotes such as yeast can be used.
【００１５】このような組換え体のうち、特にＤ−スレ
オニンアルドラーゼを高度に産生する能力を有している
組換え体の例としては、キサントモナス属細菌に属する
ものがあげられる。微工研菌寄１０９７９号として寄託
のされているキサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏ
ｎａｓ ｃｉｔｒｉ）ＩＦＯ３３１１ （ｐＤＴ６４
８）は、Ｄ−スレオニンアルドラーゼを高度に産生する
能力を有しており（特願平１−２７６１２６号）、特に
好適なものである。[0015] Among such recombinants, examples of recombinants having a particularly high ability to produce D-threonine aldolase include those belonging to bacteria of the genus Xanthomonas. Xanthomonas citri (Xanthomonas citri), which has been deposited as Microtechnical Research Institute No. 10979.
nas citri) IFO3311 (pDT64
8) has the ability to highly produce D-threonine aldolase (Japanese Patent Application No. 1-276126) and is particularly suitable.
【００１６】特に、このキサントモナス シトリ
ＩＦＯ３３１１ （ｐＤＴ６４８）は、Ｄ−スレオニン
アルドラーゼのみを特異的に大量に産生することから、
簡単な処理で、高い活性を有するＤ−スレオニンアルド
ラーゼを得ることができ、それを用いた場合、単位反応
時間が短縮できるとか、収量を増加させるとか、装置を
簡素化できるとかという、予想外の優れた効果を得るこ
とができる。In particular, this Xanthomonas citri
Since IFO3311 (pDT648) specifically produces only D-threonine aldolase in large quantities,
D-threonine aldolase with high activity can be obtained by simple processing, and when used, unexpected results such as shortening unit reaction time, increasing yield, and simplifying equipment are possible. Excellent effects can be obtained.
【００１７】これらＤ−スレオニンアルドラーゼは、予
想外にもＤ−型の立体配位には非常に高い特異性を有す
るにも拘らず、エリスロ／スレオといった立体配位に対
しては、許容されうる寛容性を有するのみでなく、（ジ
ヒドロキシフェニル）セリンのみでなくその誘導体にも
作用することができ、さらにグリシンと対応するプロト
カテキュアルデヒドとを生成せしめるという優れた特性
を有している。Although these D-threonine aldolases unexpectedly have very high specificity for the D-configuration, they are tolerable for the erythro/threo configuration. Not only is it tolerant, it can act not only on (dihydroxyphenyl)serine but also its derivatives, and has the excellent property of producing glycine and the corresponding protocatechualdehyde.
【００１８】本発明においては、前記したようにＬ−エ
リスロ−ＤＯＰＳ誘導体を分解する酵素を用いることが
あげられるが、このような酵素としては、Ｌ−エリスロ
−ＤＯＰＳ誘導体を特異的に分解するものであれば、い
ずれも使用できる。このような酵素として特に好ましい
ものとしては、Ｌ−エリスロ−ＤＯＰＳ誘導体を特異的
にグリシンと対応するプロトカテキュアルデヒドとに分
解する能力を有するものがあげられる。また特に好まし
いものとしては、ＤＬ−立体構造の違いを特異的に認識
するばかりでなく、エリスロ／スレオの立体構造の違い
も特異的に認識するけれども、（ジヒドロキシフェニル
）セリン骨格のみでなく、それに導入された各種保護基
などの存在に拘らず、特異的な活性を有するものがあげ
られる。[0018] In the present invention, an enzyme that decomposes L-erythro-DOPS derivatives may be used as described above, but such enzymes include enzymes that specifically decompose L-erythro-DOPS derivatives. If so, you can use either one. Particularly preferred such enzymes include those having the ability to specifically decompose L-erythro-DOPS derivatives into glycine and the corresponding protocatechualdehyde. Particularly preferred is one that not only specifically recognizes the difference in the DL-stereostructure but also specifically recognizes the difference in the erythro/threo stereostructure, but not only the (dihydroxyphenyl)serine skeleton but also the Examples include those that have specific activity regardless of the presence of various protective groups introduced.
【００１９】このような酵素として特に好ましいものは
、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼがあげられる。この
ようなＬ−アロスレオニンアルドラーゼとしては、例え
ば、特公昭６３−５４３５９号に記載された微生物から
得られるもののみでなく、その遺伝子を操作して得られ
たものなどをあげることができる。このＬ−アロスレオ
ニンアルドラーゼは、（ジヒドロキシフェニル）セリン
のみでなく、その誘導体にも作用しうるものであり、グ
リシンと対応するプロトカテキュアルデヒド誘導体とを
生成せしめるという特性を持ちながら、ＤＰＯＳ誘導体
のＬ−エリスロ体にのみ作用するという立体特異性を有
するものである。A particularly preferred example of such an enzyme is L-allothreonine aldolase. Such L-allothreonine aldolases include, for example, not only those obtained from the microorganisms described in Japanese Patent Publication No. 54359/1982, but also those obtained by manipulating their genes. This L-allothreonine aldolase can act not only on (dihydroxyphenyl)serine but also its derivatives, and while it has the property of producing glycine and the corresponding protocatechualdehyde derivative, it also acts on DPOS derivatives. It has stereospecificity in that it acts only on L-erythro form.
【００２０】本発明で用いられるＬ−アロスレオニンア
ルドラーゼは、Ｌ−スレオニンアルドラーゼ産生菌ある
いは、その変異株又は変種株などから得ることができる
。Ｌ−スレオニンアルドラーゼ産生菌としては、例えば
、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＤＫ−３９ （微工研
菌寄６２０２号）、アルカリゲネス フェカリス（Ａ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＩＦＯ
１２６６９）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ）ＤＫ−２ （微工研菌寄６２００号）、アース
ロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＤＫ−１９
（微工研菌寄６２０１号）、キサントモナス オリゼ
ー（Ｘａｕｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ）（ＩＡ
Ｍ１６５７）が知られているが、これらのものに限定す
ることなく使用することもできる。[0020] L-allothreonine aldolase used in the present invention can be obtained from L-threonine aldolase-producing bacteria or mutant or variant strains thereof. Examples of L-threonine aldolase-producing bacteria include Bacillus DK-39 (Feikoken Bacteria 6202), Alcaligenes faecalis (A
lcaligenes faecalis) (IFO
12669), Pseudomonas
nas) DK-2 (Fiber Engineering Laboratory No. 6200), Arthrobacter DK-19
(Fiber Engineering Laboratory No. 6201), Xauthomonas oryzae (IA
M1657) are known, but it can also be used without being limited to these.
【００２１】また、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼに
ついてもＤ−スレオニンアルドラーゼの場合と同様にし
て、それの合成に関与する遺伝子を担うＤＮＡを遺伝子
組換え等の処理操作により、微生物等に導入し、そうし
て得られた微生物を利用することもできる。このような
ことに用いられる微生物としては前記Ｄ−スレオニンア
ルドラーゼのところであげたものがあげられる。[0021] Regarding L-allothreonine aldolase, in the same manner as D-threonine aldolase, the DNA carrying the gene involved in its synthesis is introduced into microorganisms etc. by genetic recombination or other processing operations. The microorganisms obtained can also be used. Examples of microorganisms that can be used for this purpose include those listed above for D-threonine aldolase.
【００２２】また、Ｄ−スレオニンアルドラーゼとＬ−
アロスレオニンアルドラーゼは、同一の菌株由来のもの
であっても、それぞれ異なる菌株由来のものであっても
、同様に用いることができるし、さらに前記したように
遺伝子操作を行なって、一方のみを特異的に産生せしめ
るようにしたものから得られたものも、あるいはその両
者を効率よく産生せしめるようにしたものも使用できる
。[0022] Furthermore, D-threonine aldolase and L-
Allothreonine aldolase can be used in the same way whether it is derived from the same bacterial strain or from different strains, and furthermore, it can be genetically manipulated as described above to make only one strain unique. It is also possible to use those obtained from those that are made to produce both, or those that are made to produce both efficiently.
【００２３】本発明に用いる微生物は常法に従って培養
することが出来る。培養に用いられる培地は微生物の生
育に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む通常の培
地である。ここで用いられる炭素源としては、グルコー
ス、リボース、ガラクトース、可溶性デンプンなどがあ
げられ、窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、ペプトン、肉エキス、イー
ストエキス、コーンスティプリカー、大豆粉、綿実カス
などがあげられる。また、塩化ナトリウム、カリウム塩
、カルシウム塩、アンモニウム塩、燐酸塩などの他、亜
鉛、マグネシウム、鉄、マンガンなどの無機物も使用で
きる。更に、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を
添加すると望ましい結果が得られる場合が多い。培養は
、好気的条件下でｐＨ４から１０、温度２０から６０℃
の任意の範囲に制御して１〜１０日間培養を行えばよい
。組換え体を用いる場合、使用する菌株に応じて、アン
ピシリン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培養液
に添加してもよい。[0023] The microorganisms used in the present invention can be cultured according to conventional methods. The medium used for culture is a normal medium containing carbon sources, nitrogen sources, inorganic substances, etc. necessary for the growth of microorganisms. Carbon sources used here include glucose, ribose, galactose, soluble starch, etc., and nitrogen sources include ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, soy flour, and cotton. Examples include fruit scraps. In addition to sodium chloride, potassium salts, calcium salts, ammonium salts, phosphates, and the like, inorganic substances such as zinc, magnesium, iron, and manganese can also be used. Additionally, the addition of organic micronutrients such as vitamins, amino acids, etc. often provides desirable results. Cultivation is carried out under aerobic conditions at pH 4 to 10 and temperature 20 to 60°C.
The culture may be carried out for 1 to 10 days while controlling the amount within an arbitrary range. When using a recombinant, antibiotics such as ampicillin and chloramphenicol may be added to the culture solution depending on the strain used.
【００２４】酵素反応にあたっては、菌体の培養液、培
養液から分離した菌体、凍結乾燥などによる乾燥菌体、
菌体破砕液、粗酵素抽出液、精製酵素、さらには、上記
の処理物および固定化物、その他何れも使用できる。酵
素反応を実施する方法は、水性媒体中にて基質であるラ
セミ−スレオ／エリスローＤＯＰＳ誘導体を、上に記し
た微生物の培養液、菌体、菌体処理物、酵素、あるいは
これらを通常の方法で固定化したものと接触させれば良
い。かかる反応時の水性媒体としては、例えば、水、緩
衝液、含水有機溶媒等が使用できる。[0024] In the enzymatic reaction, bacterial culture solution, bacterial cells isolated from the culture solution, dried bacterial cells by freeze-drying, etc.
A bacterial cell disruption solution, a crude enzyme extract, a purified enzyme, the above-mentioned processed products and immobilized products, and any others can be used. The enzymatic reaction can be carried out by adding the racemic threo/erythro DOPS derivative as a substrate in an aqueous medium to the above-mentioned microorganism culture solution, bacterial cells, treated bacterial cells, enzymes, or using these in a conventional manner. All you have to do is bring it into contact with something that has been immobilized. As the aqueous medium for such a reaction, for example, water, a buffer solution, a water-containing organic solvent, etc. can be used.
【００２５】反応における酵素、微生物菌体あるいは菌
体処理物等の濃度は、Ｄ−スレオ／エリスローＤＯＰＳ
誘導体とＬ−エリスロ−ＤＯＰＳ誘導体を完全に分解で
きるならば特に制限はないが、Ｄ−スレオニンアルドラ
ーゼ活性（１ＵはＤ−スレオニンから１分間に１μｍｏ
ｌｅのグリシンを生成するのに必要な酵素量を表わす）
とＬ−アロスレオニンアルドラーゼ活性（１ＵはＬ−ア
ロスレオニンから１分間に１μｍｏｌｅのグリシンを生
成するのに必要な酵素量を表わす）が、ともに０．０１
Ｕ／ｍｌ以上であることが望ましい。特に、ともに０．
１Ｕ／ｍｌ以上であれば反応を速やかに終了させること
が出来る。[0025] The concentration of the enzyme, microbial cells, or treated product of the microorganisms in the reaction is determined by D-threo/erythro DOPS
There is no particular restriction as long as the derivative and L-erythro-DOPS derivative can be completely decomposed, but D-threonine aldolase activity (1U is 1μmol per minute from D-threonine)
Represents the amount of enzyme necessary to produce glycine le)
and L-allothreonine aldolase activity (1U represents the amount of enzyme required to generate 1 μmole of glycine per minute from L-allothreonine) are both 0.01.
It is desirable that it is at least U/ml. In particular, both are 0.
If the concentration is 1 U/ml or more, the reaction can be terminated quickly.
【００２６】反応は、２種類の酵素を同時に作用させて
も順次作用させても行うことが可能であり、順次作用さ
せる場合、その順序は問わない。基質であるラセミ−ス
レオ／スリスロ−ＤＯＰＳ誘導体の濃度は、反応を著し
く阻害しない程度であれば良く１ｍｍｏｌｅ／リットル
から１００ｍｍｏｌｅ／リットルが好ましく、基質の供
給は、一括、連続、分割のいずれの手段でも実施出来る
。[0026] The reaction can be carried out by allowing two types of enzymes to act simultaneously or sequentially, and when they are made to act sequentially, the order does not matter. The concentration of the racemic-threo/threo-DOPS derivative that is the substrate may be at a level that does not significantly inhibit the reaction, and is preferably from 1 mmole/liter to 100 mmole/liter, and the substrate may be supplied in bulk, continuously, or divided. It can be implemented.
【００２７】反応温度は、１０から５５℃が良く、２０
から４０℃がより好適である。反応時のｐＨは５から１
０、好ましくは６から８である。Ｄ−スレオニンアルド
ラーゼとＬ−アロスレオニンアルドラーゼは、ピリドキ
サール−５′−リン酸を補酵素として要求するため、反
応系に１０ｎｍｏｌｅ／リットル〜１０ｍｍｏｌｅ／リ
ットル、好ましくは１μｍｏｌｅ／リットル〜１００μ
ｍｏｌｅ／リットルの濃度で添加することにより反応が
促進される。[0027] The reaction temperature is preferably 10 to 55°C, and 20 to 55°C.
to 40°C is more suitable. pH during reaction is 5 to 1
0, preferably 6 to 8. D-threonine aldolase and L-allothreonine aldolase require pyridoxal-5'-phosphate as a coenzyme, so the reaction system contains 10 nmole/liter to 10 mmole/liter, preferably 1 μmole/liter to 100 μm.
The reaction is accelerated by adding at a concentration of mole/liter.
【００２８】また、Ｄ−スレオニンアルドラーゼは２価
金属イオンを補欠因子として要求するため、Ｍｇ２＋、
Ｍｎ２＋、ＣＯ２＋、Ｆｅ２＋等を塩の形で１００μｍ
ｏｌｅ／リットル〜１００ｍｍｏｌｅ／リットル、好ま
しくは１ｍｍｏｌｅ／リットル〜１０ｍｍｏｌｅ／リッ
トルの濃度で添加することにより反応が促進される。Furthermore, since D-threonine aldolase requires divalent metal ions as complementary factors, Mg2+,
Mn2+, CO2+, Fe2+, etc. in the form of salt at 100μm
The reaction is accelerated by adding at a concentration of ole/liter to 100 mmole/liter, preferably 1 mmole/liter to 10 mmole/liter.
【００２９】反応形式はバッチ方式、連続方式のいずれ
でも良いが、かくして、反応は０．５から５０時間程度
で終了する。反応終了後、反応液は遠心分離や限外ろ過
等により除菌・除タンパクし、まず有機溶媒抽出により
生成プロトカテキュアルデヒド誘導体を分離する。抽出
には、プロトカテキュアルデヒド誘導体の溶解性が高く
、Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳ誘導体及びグリシンがほとんど
不溶である溶媒であればいずれも使用することが出来る
が、エーテルを使用すると良好な結果が得られる。[0029] The reaction type may be either a batch type or a continuous type, but the reaction is thus completed in about 0.5 to 50 hours. After the reaction is completed, the reaction solution is sterilized and protein removed by centrifugation, ultrafiltration, etc., and the produced protocatechualdehyde derivative is first separated by organic solvent extraction. For extraction, any solvent can be used as long as the protocatechualdehyde derivative is highly soluble and the L-threo-DOPS derivative and glycine are almost insoluble, but good results are obtained when ether is used. It will be done.
【００３０】溶媒相からは減圧濃縮することによりプロ
トカテキュアルデヒド誘導体を回収する。水相からのＬ
−スレオ−ＤＯＰＳ誘導体とグリシンの単離回収は、通
常のイオン交換樹脂を用いたクロマト分離によって行う
ことが出来る。すなわち、水相を陽イオン交換樹脂を充
填したカラムに通液、水洗後、希アンモニア水等により
溶出を行う。The protocatechualdehyde derivative is recovered from the solvent phase by concentration under reduced pressure. L from aqueous phase
The -threo-DOPS derivative and glycine can be isolated and recovered by chromatographic separation using a conventional ion exchange resin. That is, the aqueous phase is passed through a column packed with a cation exchange resin, washed with water, and then eluted with dilute ammonia water or the like.
【００３１】純度が低い場合には、さらに晶析・水再結
晶を行うことにより精製度を高めることが出来る。上記
反応生成物の単離精製法は、一つの代表的な方法を例示
したものであり、好ましい方法であるが、本発明におい
てはそれに限定されることなく各種の分離精製法が適用
できる。このような方法の例としては、メタノール、エ
タノール等のアルコール系溶媒、ベンゼン、トルエン等
の芳香族炭化水素系溶媒、酢酸エチル等のエステル系溶
媒、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン溶媒、ジ
メチルスルホキシド等のスルホキシド類溶媒、Ｎ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド等のアミド溶媒、アセトニトリル
などのニトリル系溶媒、エチルエーテル、ジオキサン、
テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒、メチレンクロ
ライド等のハロゲン化炭化水素溶媒及びそれらの混合溶
媒あるいはそれらの水性溶媒などを用いた溶媒抽出など
の分離法、カラムクロマトグラフィー、逆相クロマトグ
ラフィー、高速液体クロマトグラフィー、再結晶化法な
どの方法をあげることができる。[0031] If the purity is low, the degree of purification can be increased by further performing crystallization and water recrystallization. The method for isolating and purifying the reaction product described above is one representative method and is a preferred method, but the present invention is not limited thereto and various separation and purification methods can be applied. Examples of such methods include alcohol solvents such as methanol and ethanol, aromatic hydrocarbon solvents such as benzene and toluene, ester solvents such as ethyl acetate, ketone solvents such as acetone and methyl ethyl ketone, and dimethyl sulfoxide. Sulfoxide solvent, N,N-
Amide solvents such as dimethylformamide, nitrile solvents such as acetonitrile, ethyl ether, dioxane,
Separation methods such as solvent extraction using ether solvents such as tetrahydrofuran, halogenated hydrocarbon solvents such as methylene chloride, mixed solvents thereof, or aqueous solvents thereof, column chromatography, reversed phase chromatography, high performance liquid chromatography , recrystallization method, and the like.
【００３２】本発明の方法によると、
（１）スレオ体とエリスロ体の分離工程を省略できる。
（２）光学分割のための置換基の導入及び除去が不要で
あり、さらに高価な光学分割剤を用いる必要もなく、収
率も高い。
（３）非常に装置工程を単純化できるので、装置のため
の設備費を大巾に節約することができる。
（４）Ｄ−スレオ／エリスロ−ＤＯＰＳ誘導体とＬ−エ
リスロ−ＤＯＰＳ誘導体は共に合成原料であるグリシン
とプロトカテキュアルデヒド誘導体に分解されるため、
それらは再度反応液から回収してラセミ−スレオ／エリ
スロ−ＤＯＰＳ誘導体合成にリサイクル使用することが
でき、生産コストを大きく低減させることができる。特
に、カテコール部分を保護した誘導体を基質として用い
て本発明の処理を行なった場合においても、本発明の処
理は良好に行なうことができ、更に回収されたプロトカ
テキュアルデヒド誘導体には、保護基がそのまま残って
いるので再度保護基の導入操作を行なうことなく、それ
をそのまま合成原料に用いることができる。
（５）原料からの目的物の収率を大巾に高めることがで
きると共に、高純度の目的物を簡単に取得できる。According to the method of the present invention: (1) The step of separating the threo and erythro bodies can be omitted. (2) There is no need to introduce or remove substituents for optical resolution, there is no need to use an expensive optical resolution agent, and the yield is high. (3) Since the device process can be greatly simplified, equipment costs for the device can be greatly reduced. (4) Both D-threo/erythro-DOPS derivatives and L-erythro-DOPS derivatives are decomposed into glycine and protocatechualdehyde derivatives, which are raw materials for synthesis.
They can be recovered from the reaction solution and recycled for synthesis of racemic-threo/erythro-DOPS derivatives, thereby greatly reducing production costs. In particular, even when the treatment of the present invention is performed using a derivative with a protected catechol moiety as a substrate, the treatment of the present invention can be carried out satisfactorily, and the recovered protocatechualdehyde derivative has a protective group. remains as it is, so it can be used as a raw material for synthesis without performing the step of introducing a protecting group again. (5) The yield of the target product from raw materials can be greatly increased, and the target product of high purity can be easily obtained.
【００３３】[0033]
【実施例】次に、実施例により本発明の方法を更に詳し
く説明するが、本発明は実施例により限定されるもので
はない。例中％は重量％を示す。EXAMPLES Next, the method of the present invention will be explained in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited by the Examples. In the examples, % indicates weight %.
【００３４】酵素製造例１
ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．５％、塩化ナト
リウム０．５％からなるｐＨ７．５の培地を調製し、５
リットルの培養槽にその３リットルを添加し、１２０℃
で１５分間加熱殺菌した。その培地にＡｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ＤＫ−１９（微工研菌寄６２０１号）を接
種し、ｐＨ７．５に保ちながら３０℃で２０時間通気及
び撹拌をしつつ培養した。培養終了後、培養液から菌体
を遠心分離で集菌、水洗後、０．０１ｍＭピリドキサー
ル−５′−リン酸、及び１．０ｍＭ塩化マグネシウムを
含むｐＨ７．５の０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−Ｈ
ｙｄｒｏｘｅｙｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−
２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝
液１００ｍｌに懸濁し、菌体懸濁液を得た。この菌体懸
濁液を２０ｋＨｚ、３分間の超音波破砕処理を４回行な
い、破砕液の懸濁物質を遠心分離で除去して、粗酵素液
を調整した。次に、この粗酵素液を６０℃で３０分間処
理した後、遠心分離して得られた上清を熱処理酵素液と
した。
得られた菌体懸濁液、粗酵素液及び熱処理酵素液のＤ−
スレオニンアルドラーゼ活性（１ＵはＤ−スレオニンか
ら１分間に１μｍｏｌｅのグリシンを生成するのに必要
な酵素量を表わす）とＬ−アロスレオニンアルドラーゼ
活性（１ＵはＬ−アロスレオニンから１分間に１μｍｏ
ｌｅのグリシンを生成するのに必要な酵素量を表わす）
を測定した。Enzyme Production Example 1 A pH 7.5 medium containing 0.5% polypeptone, 0.5% yeast extract, and 0.5% sodium chloride was prepared.
Add 3 liters of it to a liter culture tank and heat it to 120°C.
It was heat sterilized for 15 minutes. Arthroba in the medium
cter DK-19 (Feikoken Bokuyori No. 6201) was inoculated and cultured at 30° C. for 20 hours with aeration and stirring while maintaining the pH at 7.5. After culturing, the cells were collected from the culture solution by centrifugation, washed with water, and added to 0.2M HEPES (N-2), pH 7.5, containing 0.01mM pyridoxal-5'-phosphate and 1.0mM magnesium chloride. -H
ydroxeythylpiperazine-N'-
2-ethanesulfonic acid) buffer to obtain a bacterial cell suspension. This cell suspension was subjected to ultrasonic disruption treatment at 20 kHz for 3 minutes four times, and suspended matter from the disruption solution was removed by centrifugation to prepare a crude enzyme solution. Next, this crude enzyme solution was treated at 60° C. for 30 minutes and then centrifuged, and the resulting supernatant was used as a heat-treated enzyme solution. D- of the obtained bacterial cell suspension, crude enzyme solution and heat-treated enzyme solution
Threonine aldolase activity (1U represents the amount of enzyme required to generate 1 μmole of glycine per minute from D-threonine) and L-allothreonine aldolase activity (1U represents the amount of enzyme required to generate 1 μmole of glycine per minute from L-allothreonine).
Represents the amount of enzyme necessary to produce glycine le)
was measured.
【００３５】[0035]
【表１】[Table 1]
【００３６】酵素製造例２
酵素製造例１と同様の方法で、Ｐｅｓｕｄｏｍｏｎａｓ
ＤＫ−２（微工研菌寄６２００号）、Ａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（ＩＦＯ１２６６９）
（ｐＤＴ６４８）及びＢａｃｉｌｌｕｓ ＤＫ−３９
（微工研菌寄６２０２号）の菌体懸濁液、粗酵素液及び
熱処理酵素液を調製した。得られた菌体懸濁液、粗酵素
液及び熱処理酵素液のＤ−スレオニンアルドラーゼ活性
及びＬ−アロスレオニンアルドラーゼ活性を測定した。Enzyme Production Example 2 In the same manner as in Enzyme Production Example 1, Pesdomonas
DK-2 (Feikoken Bokuyori No. 6200), Alcali
genes faecalis (IFO12669)
(pDT648) and Bacillus DK-39
A bacterial cell suspension, a crude enzyme solution, and a heat-treated enzyme solution were prepared. The D-threonine aldolase activity and L-allothreonine aldolase activity of the obtained bacterial cell suspension, crude enzyme solution, and heat-treated enzyme solution were measured.
【００３７】[0037]
【表２】[Table 2]
【００３８】[0038]
【表３】[Table 3]
【００３９】[0039]
【表４】[Table 4]
【００４０】合成例１
ラセミ−スレオ／エリスロ−３−（３，４−メチレンジ
オキシフェニル）セリンの合成
水酸化カリウム４８．８ｇ、グリシン２６．４ｇをメタ
ノール８４４ｍｌに溶解し、３０℃以下でピペロナール
１１６ｇを加え６５℃で３０分間攪拌後、減圧濃縮を行
った。残渣をメタノール１０８ｍｌに溶解し、３０℃以
下で酢酸６４．８ｇを加え、４５℃で１時間攪拌した。
トルエン１０００ｍｌと水１０８ｍｌを加え、４５℃で
３０分間攪拌、さらに５℃で２時間攪拌後、析出した結
晶を濾取し、乾燥したところ、８６．９ｇの結晶Ａが得
られた。この結晶Ａ８５ｇを水１０００ｍｌから再結晶
を行い、得られた結晶を乾燥させ４８．７ｇのラセミ−
スレオ／エリスロ−３−（３，４−メチレンジオキシフ
ェニル）セリンを得た。
ｍｐ：１９１℃（分解）
ＩＲ（Ｎｕｊｏｌ）ν（ｃｍ−１）：３４００，３２０
０，１６００，１３００，１２４０，１０２０，９１０
また、ｏ−フタルアルデヒドとＮ−アセチル−Ｌ−シス
テインによる誘導体化後、ＯＤＳカラムを用い、ＨＰＬ
Ｃによる異性体分析によって、各異性体の比率を調べた
。
Ｌ−スレオ体：Ｄ−スレオ体：Ｌ−エリスロ体：Ｄ−エ
リスロ体＝３９：３８：１２：１１Synthesis Example 1 Synthesis of racemic threo/erythro-3-(3,4-methylenedioxyphenyl)serine 48.8 g of potassium hydroxide and 26.4 g of glycine were dissolved in 844 ml of methanol, and piperonal was dissolved at 30° C. or below. After adding 116 g of the mixture and stirring at 65° C. for 30 minutes, it was concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in 108 ml of methanol, 64.8 g of acetic acid was added at 30°C or lower, and the mixture was stirred at 45°C for 1 hour. After adding 1000 ml of toluene and 108 ml of water and stirring at 45° C. for 30 minutes and further stirring at 5° C. for 2 hours, the precipitated crystals were collected by filtration and dried to obtain 86.9 g of Crystal A. 85 g of this crystal A was recrystallized from 1000 ml of water, and the obtained crystals were dried to give 48.7 g of racemic
Threo/erythro-3-(3,4-methylenedioxyphenyl)serine was obtained. mp: 191°C (decomposition) IR (Nujol) ν (cm-1): 3400, 320
0,1600,1300,1240,1020,910
In addition, after derivatization with o-phthalaldehyde and N-acetyl-L-cysteine, HPL was performed using an ODS column.
The ratio of each isomer was determined by isomer analysis using C. L-threo body: D-threo body: L-erythro body: D-erythro body = 39:38:12:11
【００４１】合成例２
ラセミ−スレオ／エリスロ−ＤＯＰＳの合成合成例１で
得られたラセミ−スレオ／エリスロ−３−（３，４−メ
チレンジオキシフェニル）セリン２ｇとジクロロメタン
２０ｍｌ、エチルメルカプタン２ｍｌを混合し、無水臭
化アルミニウム１０ｇを氷冷下で攪拌しながら加え、氷
冷下で３時間、さらに室温で１５時間攪拌した。この反
応液に１Ｎ塩酸２００ｍｌを加え混合後分液し、水層の
ｐＨを水酸化ナトリウムで約５とし、析出した結晶を濾
取した。この結晶を０．０５％のＬ−アスコルビン酸を
含む水４０ｍｌから再結晶を行い、得られた結晶を乾燥
させ、１．８ｇのラセミ−スレオ／エリスロ−ＤＯＰＳ
を得た。
元素分析：Ｃ９ Ｈ１１Ｏ５ Ｎに対し、計算値：Ｃ５
０．７１，Ｈ５．２０，Ｎ６．５７％実測値：Ｃ５０．
９９，Ｈ５．１５，Ｎ６．４４％ＩＲ（Ｎｕｊｏｌ）ν
（ｃｍ−１）：３６００，３５００，３２００，１６２
０，１６００，１５００，１４００，１３５０，１２８
０，１０４０
また、ｏ−フタルアルデヒドとＮ−アセチル−Ｌ−シス
テインによる誘導体化後、ＯＤＳカラムを用い、ＨＰＬ
Ｃによる異性体分析によって、各異性体の比率を調べた
。
Ｌ−スレオ体：Ｄ−スレオ体：Ｌ−エリスロ体：Ｄ−エ
リスロ体＝４１：３９：１０：１０Synthesis Example 2 Synthesis of Racemic Threo/Erythro-DOPS 2 g of racemic threo/erythro-3-(3,4-methylenedioxyphenyl)serine obtained in Synthesis Example 1, 20 ml of dichloromethane, and 2 ml of ethyl mercaptan were added. After mixing, 10 g of anhydrous aluminum bromide was added while stirring under ice cooling, and the mixture was stirred under ice cooling for 3 hours and then at room temperature for 15 hours. 200 ml of 1N hydrochloric acid was added to this reaction solution, mixed and separated, the pH of the aqueous layer was adjusted to about 5 with sodium hydroxide, and the precipitated crystals were collected by filtration. The crystals were recrystallized from 40 ml of water containing 0.05% L-ascorbic acid, the obtained crystals were dried, and 1.8 g of racemic threo/erythro-DOPS was added.
I got it. Elemental analysis: C9 H11O5 N, calculated value: C5
0.71, H5.20, N6.57% Actual value: C50.
99, H5.15, N6.44%IR (Nujol) ν
(cm-1): 3600, 3500, 3200, 162
0,1600,1500,1400,1350,128
0,1040 In addition, after derivatization with o-phthalaldehyde and N-acetyl-L-cysteine, HPL was performed using an ODS column.
The ratio of each isomer was determined by isomer analysis using C. L-threo body: D-threo body: L-erythro body: D-erythro body = 41:39:10:10
【００４２】実施例１
酵素製造例１で得た粗酵素液１００ｍｌに合成例２で得
たＤ，Ｌ−スレオ／エリスロ−ＤＯＰＳ１００ｍｇを加
え、３０℃で３０時間反応させた。反応終了後、１Ｎ塩
酸を１０ｍｌ加えた後、遠心分離で不溶物を除去した。
ＨＰＬＣ（島津アミノ酸分析システム）で残存基質と生
成グリシンを定量したところ、基質は添加時の３９．２
％残存、グリシンは基質の減少と等しいモル濃度で生成
していた。また、プロトカテキュアルデヒドは、２，４
−ジニトロフェニルヒドラジンと反応させ、ＯＤＳカラ
ムを用いてＨＰＬＣ分析を行ったところ、基質の減少と
等しいモル濃度で生成していた。上記遠心上清に２００
ｍｌのエチルエーテルを加え、攪拌・静置し、エーテル
相を分離、減圧乾固を行い、３６ｍｇのプロトカテキュ
アルデヒドを得た。水相を、強酸性陽イオン交換樹脂Ｄ
ＯＷＥＸ ５０Ｗ×８を充填したカラム（１０ｍｍφ
×１００ｍｍ）に通液、脱イオン水による十分な洗浄後
、０．５Ｎのアンモニア水で吸着物質を溶出させ、ＤＯ
ＰＳ画分とグリシン画分に分けて採取した。両画分それ
ぞれ減圧乾固を行ったところ、それぞれ３３ｍｇ、２５
ｍｇの結晶を得た。ＤＯＰＳ画分より得られた結晶は、
以下の分析によりＬ−スレオ−ＤＯＰＳであることが確
認できた。
ｍｐ：２０８℃
元素分析：Ｃ３ Ｈ１１Ｏ５ Ｎに対し計算値：Ｃ５０
．７１，Ｈ５．２０，Ｎ６．５７％実測値：Ｃ５０．８
３，Ｈ５．１８，Ｎ６．４９％異性体分析（ｏ−フタル
アルデヒドとＮ−アセチル−Ｌ−システインによる誘導
体化後、ＯＤＳカラムでＨＰＬＣ分析）：ピークはＬ−
スレオ体の位置にのみ見られた。
比旋光度：〔α〕２８Ｄ ＝−３９．７°（Ｃ＝０．５
，０．１Ｎ・ＨＣｌ）Example 1 100 mg of D,L-threo/erythro-DOPS obtained in Synthesis Example 2 was added to 100 ml of the crude enzyme solution obtained in Enzyme Production Example 1, and the mixture was reacted at 30° C. for 30 hours. After the reaction was completed, 10 ml of 1N hydrochloric acid was added, and insoluble matter was removed by centrifugation. When the remaining substrate and produced glycine were quantified by HPLC (Shimadzu Amino Acid Analysis System), the substrate was 39.2% at the time of addition.
% remaining, glycine was produced at a molar concentration equal to the reduction in substrate. In addition, protocatechualdehyde is 2,4
- Reaction with dinitrophenylhydrazine and HPLC analysis using an ODS column revealed that the product was produced at a molar concentration equivalent to the decrease in the substrate. Add 200% to the above centrifuged supernatant.
ml of ethyl ether was added, stirred and allowed to stand, and the ether phase was separated and dried under reduced pressure to obtain 36 mg of protocatechualdehyde. The aqueous phase was replaced with strongly acidic cation exchange resin D.
Column packed with OWEX 50W x 8 (10mmφ
After thorough washing with deionized water, the adsorbed substances were eluted with 0.5N ammonia water, and the DO
The PS fraction and glycine fraction were collected separately. When both fractions were dried under reduced pressure, the amounts were 33 mg and 25 mg, respectively.
mg of crystals were obtained. The crystals obtained from the DOPS fraction are
The following analysis confirmed that it was L-threo-DOPS. mp: 208℃ Elemental analysis: Calculated value for C3 H11O5 N: C50
．． 71, H5.20, N6.57% Actual value: C50.8
3, H5.18, N6.49% Isomer analysis (after derivatization with o-phthalaldehyde and N-acetyl-L-cysteine, HPLC analysis using an ODS column): The peak is L-
It was seen only in the threo position. Specific optical rotation: [α]28D = -39.7° (C = 0.5
,0.1N HCl)
【００４３】実施例２
酵素製造例１及び２で得た粗酵素液（Ａ）と熱処理酵素
液（Ｂ）（２種類の酵素液を用いる場合は５０ｍｌずつ
）を用い、実施例１と同様に反応を行い、反応液中の残
存基質を定量した結果を示す。Example 2 The crude enzyme solution (A) and heat-treated enzyme solution (B) obtained in Enzyme Production Examples 1 and 2 (50 ml each when using two types of enzyme solutions) were used in the same manner as in Example 1. The results of performing the reaction and quantifying the remaining substrate in the reaction solution are shown.
【００４４】[0044]
【表５】[Table 5]
【００４５】反応終了後、反応液を実施例１と同様に処
理し、比旋光度を測定したところ、得られたＤＯＰＳは
いずれもＬ−スレオ体であることが確認された。After the reaction was completed, the reaction solution was treated in the same manner as in Example 1, and the specific optical rotation was measured, and it was confirmed that all of the obtained DOPS were L-threo forms.
【００４６】実施例３
酵素製造例１及び２で得た菌体懸濁液（２種類の菌体懸
濁液を用いる場合は５０ｍｌずつ）を用い、実施例１と
同様に反応を行い、反応液中の残存基質量を定量した結
果を示す。Example 3 Using the bacterial cell suspensions obtained in Enzyme Production Examples 1 and 2 (50 ml each when using two types of bacterial cell suspensions), a reaction was carried out in the same manner as in Example 1. The results of quantifying the amount of substrate remaining in the solution are shown.
【００４７】[0047]
【表６】[Table 6]
【００４８】反応終了後、反応液を実施例１と同様に処
理し、比旋光度を測定したところ、得られたＤＯＰＳは
いずれもＬ−スレオ体であることが確認された。After the reaction was completed, the reaction solution was treated in the same manner as in Example 1, and the specific optical rotation was measured, and it was confirmed that all of the obtained DOPS were L-threo forms.
【００４９】実施例４
一般式（Ｉ）におけるＲ１ 、Ｒ２ がともに水素・メ
チル基、ベンジル基である誘導体及びＲ１ 、Ｒ２ が
メチレン基で置換されて五員環を形成している誘導体の
４種の異性体の等量混合物を基質に用い、酵素製造例１
及び２で得た粗酵素液を、実施例１と同様の方法で反応
させ、反応液中の残存基質を定量した結果を示す。Example 4 Four types of derivatives in which R1 and R2 in general formula (I) are both hydrogen, methyl group, or benzyl group, and derivatives in which R1 and R2 are substituted with methylene groups to form a five-membered ring Enzyme production example 1 using an equal mixture of isomers of as a substrate
The crude enzyme solutions obtained in 2 and 2 were reacted in the same manner as in Example 1, and the remaining substrate in the reaction solution was quantified. The results are shown below.
【００５０】[0050]
【表７】[Table 7]
【００５１】反応終了後、反応液を実施例１と同様に処
理し、比旋光度を測定したところ、得られたＤＯＰＳ誘
導体は、いずれもＬ−スレオ体であることが確認された
。After the reaction was completed, the reaction solution was treated in the same manner as in Example 1, and the specific optical rotation was measured, and it was confirmed that all of the obtained DOPS derivatives were L-threo derivatives.
【００５２】[0052]
【発明の効果】Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳを得るための従来
の光学分割法は、置換基の導入や除去が必要であるため
工程が複雑で収率も悪く、分割剤も高価であり、また残
りの光学異性体をラセミ化させる必要がある等、工業的
製造法としては問題があった。本発明によれば、光学分
割のための置換基の導入や除去が不要であり、高価な光
学分割剤を用いる必要もなく、生成するグリシンとプロ
トカテキュアルデヒド誘導体を原料合成にリサイクル使
用することが可能で、複雑なラセミ化を行う必要がない
ため、従来の方法に比べて極めて有利な方法である。Effects of the Invention: Conventional optical resolution methods for obtaining L-threo-DOPS require introduction and removal of substituents, resulting in complicated steps and poor yields, expensive resolving agents, and There were problems as an industrial production method, such as the need to racemize the optical isomers. According to the present invention, there is no need to introduce or remove substituents for optical resolution, there is no need to use an expensive optical resolution agent, and the generated glycine and protocatechualdehyde derivatives can be recycled and used in raw material synthesis. This method is extremely advantageous compared to conventional methods because it does not require complex racemization.
Claims (6)
級アルキル又はアラルキル基を示すが、Ｒ１ 、Ｒ２
共にアルキレン基で置換されて環を形成していてもよい
）で表わされるラセミ−スレオ／エリスロ−３−（３，
４−ジヒドロキシフェニル）セリン誘導体に、Ｄ−スレ
オ／エリスロ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）
セリン誘導体と、Ｌ−エリスロ−３−（３，４−ジヒド
ロキシフェニル）セリン誘導体とを特異的にグリシンと
対応するプロトカテキュアルデヒド誘導体に分解する能
力を有する酵素、同酵素を産生する微生物菌体あるいは
菌体処理物を作用させることを特徴とするＬ−スレオ−
３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セリン誘導体の
製造法。Claim 1: General formula [Formula 1] (wherein R1 and R2 are the same or different and represent hydrogen, lower alkyl or aralkyl group,
racemic threo/erythro-3-(3,
4-dihydroxyphenyl) serine derivative, D-threo/erythro-3-(3,4-dihydroxyphenyl)
An enzyme that has the ability to specifically decompose serine derivatives and L-erythro-3-(3,4-dihydroxyphenyl)serine derivatives into glycine and the corresponding protocatechualdehyde derivatives, and microbial cells that produce the same enzymes. Alternatively, L-threo-
A method for producing a 3-(3,4-dihydroxyphenyl)serine derivative.
４−ジヒドロキシフェニル）セリン誘導体と、Ｌ−エリ
スロ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セリン誘
導体とを特異的にグリシンと対応するプロトカテキュア
ルデヒド誘導体に分解する能力を有する酵素、同酵素を
産生する微生物菌体あるいは菌体処理物が、Ｄ−スレオ
／エリスロ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セ
リン誘導体を特異的にグリシンと対応するプロトカテキ
ュアルデヒド誘導体に分解する酵素とＬ−エリスロ−３
−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セリン誘導体を特
異的にグリシンと対応するプロトカテキュアルデヒド誘
導体に分解する能力を有する酵素、同酵素を産生する微
生物菌体あるいは菌体処理物とからなるものである請求
項１記載の方法。Claim 2: The D-threo/erythro-3-(3,
An enzyme having the ability to specifically decompose 4-dihydroxyphenyl) serine derivatives and L-erythro-3-(3,4-dihydroxyphenyl) serine derivatives into glycine and the corresponding protocatechualdehyde derivatives; The produced microbial cells or the processed product of the microorganisms contain an enzyme that specifically decomposes D-threo/erythro-3-(3,4-dihydroxyphenyl)serine derivatives into glycine and the corresponding protocatechualdehyde derivatives, and L- Erythro-3
- An enzyme that has the ability to specifically decompose a (3,4-dihydroxyphenyl)serine derivative into glycine and the corresponding protocatechualdehyde derivative, and a microbial cell that produces the enzyme or a processed product of the cell. 2. The method of claim 1.
−ジヒドロキシフェニル）セリン誘導体を特異的にグリ
シンと対応するプロトカテキュアルデヒド誘導体に分解
する酵素が、Ｄ−スレオニンアルドラーゼである請求項
２記載の方法。[Claim 3] D-threo/erythro-3-(3,4
3. The method according to claim 2, wherein the enzyme that specifically decomposes the -dihydroxyphenyl)serine derivative into glycine and the corresponding protocatechualdehyde derivative is D-threonine aldolase.
ロキシフェニル）セリン誘導体を特異的にグリシンと対
応するプロトカテキュアルデヒド誘導体に分解する酵素
がＬ−アロスレオニンアルドラーゼである請求項２記載
の方法。4. The enzyme according to claim 2, wherein the enzyme that specifically decomposes L-erythro-3-(3,4-dihydroxyphenyl)serine derivatives into glycine and the corresponding protocatechualdehyde derivatives is L-allothreonine aldolase. the method of.
−ジヒドロキシフェニル）セリン誘導体を特異的にグリ
シンと対応するプロトカテキュアルデヒド誘導体に分解
する酵素を産生する微生物が、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔ
ｅｒ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属に属する微生物より
なる群より選ばれた少なくとも１種の微生物よりなる請
求項１記載の方法。[Claim 5] D-threo/erythro-3-(3,4
A microorganism that produces an enzyme that specifically decomposes a -dihydroxyphenyl)serine derivative into glycine and the corresponding protocatechualdehyde derivative is Alcaligenes.
Genus, Pseudomonas, Arthrobact
The method according to claim 1, comprising at least one type of microorganism selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genus Er and Xanthomonas.
ロキシフェニル）セリン誘導体を特異的にグリシンと対
応するプロトカテキュアルデヒド誘導体に分解する酵素
を産生する微生物が、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物よりなる群から選
ばれた少なくとも１種の微生物よりなる請求項１記載の
方法。6. A microorganism that produces an enzyme that specifically decomposes L-erythro-3-(3,4-dihydroxyphenyl)serine derivatives into glycine and the corresponding protocatechualdehyde derivatives is a microorganism of the genus Alcaligenes, Ps.
Eudomonas genus, Arthrobacter genus,
Xanthomonas sp., Bacillus sp., Es
The method according to claim 1, comprising at least one microorganism selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genus Cherichia.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03124586A JP3078597B2 (en) | 1991-04-30 | 1991-04-30 | Method for producing L-threo-3- (3,4-dihydroxyphenyl) serine derivative |
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|---|---|---|---|
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| JPH04330297A true JPH04330297A (en) | 1992-11-18 |
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| JP03124586A Expired - Fee Related JP3078597B2 (en) | 1991-04-30 | 1991-04-30 | Method for producing L-threo-3- (3,4-dihydroxyphenyl) serine derivative |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106748854A (en) * | 2016-12-01 | 2017-05-31 | 暨明医药科技（苏州）有限公司 | A kind of preparation method of Droxidopa |
| JP2019511512A (en) * | 2016-03-30 | 2019-04-25 | ピラマル エンタープライジーズ リミテッド | Improved process for producing droxidopa and intermediates thereof |
-
1991
- 1991-04-30 JP JP03124586A patent/JP3078597B2/en not_active Expired - Fee Related
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