KR20240092547A - 락토코쿠스 락티스를 포함하는 동애등에 추출물 내 비타민 또는 이의 유도체 생성용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 명세서는 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis)를 포함하는, 동애등에 용매 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체 생성용 조성물, 이에 의해 발효된 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
Description
본 명세서는 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis)를 포함하는, 동애등에 용매 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체 생성용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
비타민은 정상적인 성장과 영양에 필수적이며, 인간의 신체에서 합성되지 않아 식이 섭취를 통해 공급한다. 주로 미생물과 식물에서 생산되며 모든 살아있는 유기체의 신진 대사에 필수적 물질이다. 비타민의 영양 공급 부족은 신체에 다양한 문제를 발생시키며 인간뿐 아니라 축산 산업 동물, 반려 동물과 어류 양식에도 영향을 준다. 최근의 건강에 대한 관심이 고조되면서 인간과 반려동물에게 비타민은 단순 건강 보조제에서 필수 건강 보조 식품으로 인식되고 있다.
반려견의 품종과 나이에 따라 비타민 요구량은 상이하나 사람보다 더 많은 양을 필요로 하며, 특히 비타민 B1의 경우 사람보다 1.3배, 비타민 B2의 경우 2.3배, 비타민 B5 1.0배, 비타민 B6는 0.7배, 비타민 B12는 10배가 요구되고 있다. 수용성 비타민의 경우 소변으로 배출되어 지속적 공급이 필요한 영양소이다.
비타민 생산은 고가의 장비와 용매를 이용한 화학반응에 의해 유기화학합성을 통해 생산되었으나 최근에 자연적으로 비타민을 생산하는 유기체의 탐색, 배양 조건의 최적화를 통한 생물학적 공정을 통한 비타민 생산 기술이 개발되고 있다. 비타민 생산량에 있어 화학 합성과 경쟁할 수 없지만 최근의 환경 친화적인 비타민 생산을 위해 미생물을 활용하고 있다. 미생물의 비타민 생산은 단시간 성장에 의한 생산과 시설확충의 용이성에 있어 그 유효성이 인정되고 있다. 비타민은 지용성 비타민 4종 (A, D, E, K)과 수용성 비타민 9종 (B군 및 C) 등 13종이 있다.
비타민 B 복합체 또는 비타민 B군은 세포 대사, 면역력 향상, 피로 회복, 에너지 생성에 도움을 준다. 또 다른 수용성 비타민 C와 달리 B1 (Tiamin; 티아민), B2 (Riboflavin, 리보플라빈), B3 (Niacin, 니아신), B5 (Pantothenic acid; 판테톤산), B6 (Pyridoxin; 피리독신), B7 (Biotin; 비오틴; Vitamin H), B9 (Folic acid; 엽산), B12 (Cobalamin, 코발라민) 8종류가 있다.
비타민B1 (Tiamin; 티아민)은 비타민 B군 중 가장 핵심적인 역할로 탄수화물·지방·단백질의 에너지 전환을 돕고, 신경전달물질을 활성화시키며, 비타민B1이 부족하면 에너지원이 부족해지는 꼴이 되기 때문에 쉽게 피로해지고 근육통 등이 나타난다.
비타민 B2 (Riboflavin, 리보플라빈)은 세포의 성장과 재생을 돕는 역할과 체내 활성산소를 없애는 데 관여한다. 비타민 B2가 부족시, 눈이 쉽게 피로해지고 구내염이 생기기 쉽다. 세균, 균류, 식물은 리보플라빈을 생성할 수 있지만, 사람과 반려동물 같은 진핵생물들은 리보플라빈을 만드는 능력을 상실하여 음식을 통해 섭취해야 한다.
리보플라빈은 아데노신 이인산 (Adenosine diphosphate, ADP)와 결합하여 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드 (Flavin Adenine Dinucleotide, FAD)를 형성하거나, 인산화된 리보플라빈 형태은 플라빈 모노뉴클레오타이드 (Flavin Mononucleotide, FMN)로 존재하나 세포와 조직에서는 리보플라빈이 주된 형태로 발견된다.
비타민 B3 (Niacin, 니아신)은 탄수화물과 단백질, 지방 대사를 돕고, 알코올을 분해, 혈액순환 촉진, 및 중성지방 감소 효과가 있다. 비타민B3가 결핍되면 심한 숙취가 생기고 집중력 저하와 근육통증, 소화불량 등의 증상이 나타난다.
비타민 B5 (Pantothenic acid; 판테톤산)은 지방과 탄수화물을 에너지로 전환시키는 보조 효소로 작용하며, 혈액 세포와 적혈구 생성, 호르몬 정상화, 항스트레스 역할을 하는 부신 호르몬 합성과 여성 호르몬 생성에 도움을 준다. 부족시 만성피로와 스트레스를 느끼게 되고 불면증과 우울증이 생기기 쉽다.
비타민 B6 (Pyridoxin; 피리독신)은 단백질과 아미노산의 대사를 촉진하고 신경전달물질 합성에 보조 효소, 적혈구에서 산소를 운반하는 헤모글로빈 합성에도 필요하다. 비타민B6가 부족하면 피부염과 구내염, 우울증, 빈혈 같은 증상이 나타날 수 있다.
비타민 B7 (Biotin; 비오틴; Vitamin H)은 황을 함유하고 있는 비타민으로, 지방과 탄수화물 대사에 필요하다. 또한, 간과 근육에 저장되어 있는 글리코겐을 합성해서 에너지원으로 사용한다. 비타민 B7은 머리카락과 손톱 등에 중요한 비타민으로 알려져 있어서 비타민H로 불리기도 한다. 부족하면 탈모와 손발톱 깨짐, 피부 트러블 등이 나타난다.
비타민 B9 (Folic acid; 엽산)은 DNA 합성 과정과 아미노산 대사, 혈관 벽을 손상시키는 호모시스테인을 제거한다. 비타민B9이 부족하면 정상적인 세포 분열이 이뤄지지 않는다. 그래서 엽산은 임신 초기 필수적으로 챙겨 먹어야 한다. 비타민 B9이 부족하면 태아의 신경세포 형성에 이상이 생길 수 있다. 또 허약감, 피로, 불안정, 가슴 두근거림, 위장장애를 유발하기도 한다.
비타민 B12 (Cobalamin, 코발라민)은 모든 세포를 구성하는 핵심 물질인 핵산 합성과 조혈 작용과 세로토닌·도파민 등 신경전달물질이 원활하게 만들어지도록 돕는다. 비타민B12가 부족하면 면역력 저하가 나타나기 쉽고, 우울증 등이 오기 쉽다.
곤충은 생산효율이 매우 높아서 1kg 생산하는데 단지 약 2kg의 사료가 필요하다. 이는 돼지, 소, 닭 등의 가축에 비해 월등히 우수할 뿐만 아니라, 온실가스나 암모니아 배출도 매우 낮은 수준이다. 또한 사육에 필요한 물의 양도 적고, 곤충이 매개하는 질병의 위험도 또한 낮다. 곤충은 영양적 가치가 뛰어나 양질의 단백질, 지방, 섬유질 및 미네랄과 비타민이 풍부하게 함유되어 있다. 또한, 그 기능에 따라 식용, 약용, 환경정화, 천적 자원 등으로 구분하여 곤충의 생리와 생태적 특성에 적합한 사육환경을 구축하고 있다. 이러한 점에서 곤충산업의 활성화는 영양적 측면이나 환경적인 측면 모두 바람직하다.
현재 식품의약품안전처가 인정한 국내 식용곤충에는 메뚜기, 누에번데기, 백강잠누에, 갈색거저리 유충 (고소애), 흰점박이 꽃무지 유충 (꽃벵이), 장수풍뎅이유충 (장수애), 귀뚜라미 (쌍별이), 아메리카 왕거저리 유충, 수벌 번데기, 풀무치로 총 10종의 곤충이 식품으로 인정받았다 (2021.09). 식용곤충은 단백질, 불포화지방산, 탄수화물 외에도 비타민과 미네랄이 풍부한 우수한 식품과 사료원료이며, 사료원료로서 주목받는 동애등에 역시 기본 영양성분과 비타민과 미네랄이 풍부하다.
사료로 사용되는 주요 곤충류에는 일반 집파리 유충, 누에, 갈색거저리, 메뚜기, 또는 흰개미가 있다. 일반집파리 유충은 육계 생산에 어분 대체로 사용한 예가 있으나 축산사료에 질병 전염과 기타 세균 번식의 우려가 있는 것으로 보고되었다. 흰개미의 경우 물고기나 새의 먹이로 사용된 사례가 있으나, 사육이 쉽지 않고 메탄올 배출이 있어 안전성 문제가 야기되었다. 누에의 경우 사료섭취량, 증체량, 사료효율 또는 단백질 효율 면에서 일반사료에 비해 영향이 없다고 보고되었다. 최근 상한 음식이나 분과 같은 유기성 물질을 분해할 수 있는 동애등에는 단백질 40%, 지방 30%로 어분과 대두분을 대체할 수 있는 단백질원이다. 동애등에 유충은 지용성 비타민 A, D, E 가 풍부하며 비타민 B1 (83 μg/100g), B2 (960 μg/100g), B3 (8.8 mg/100g), B5 (1.5 mg/100g), B7 (145 μg/100g)이 풍부하다.
일반사료 등에 곤충을 활용하기 위해서는 곤충의 중금속 함량, 독성 평가를 통한 안전성 확보, 세균, 바이러스 등의 미생물에 의한 오염 및 부패를 대비하고 안전하게 장기간 저장 유통, 보관 방법과 사료계수, 성장, 면역강화에 대한 연구가 필요하다. 한편, 미생물을 이용한 발효 공법의 경우, 원료가 가진 기존의 효능과는 다른 새로운 효능이 부여될 수 있으며, 다수의 유해한 성분들이 안전한 성분으로 변화될 수 있다. 또한, 분해효소의 작용에 의해 영양 성분들을 저분자화 함으로써 흡수성을 증가시키거나, 자극성을 낮추고 알러지 성분을 감소시킬 수 있다.
유산균을 이용한 바이오컨버젼 (bioconversion)기술로 천연 항균물질을 생산하고 이를 식용곤충에 응용하여 항균제, 항산화기능 향상, 보관, 저장, 유통에 있어 방부제 기능이 향상된 식용곤충 추출물의 발효물을 제조하고, 유산균 자체의 분해효소로 아미노산, 펩타이드, 지방, 탄수화물 등을 분해하여 체내 흡수율과 기능성을 높인 식용곤충 추출물의 발효물에 관해서는 아직까지 알려진 바가 없어, 이에 대한 연구의 필요성이 높다. 또한 장내의 유익한 미생물의 발효에 의해 아세트산, 프로피온산, 부티르산과 같은 단쇄지방산을 생성하여 장내미생물과 인체의 주요 에너지 공급원이 된다. 장내의 단쇄지방산 (Short Chain Fatty Acids; SCFA)은 장내 미생물 균총의 생균수와 비율, pH, 세포증식 유전자발현, 장 상피세포의 영양소로 작용한다 (Cook 1998). 단쇄지방산은 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환 개선, 심혈관질환, 비만억제 기능을 가진다 (Kumar 2012).
식품과 반려동물 사료는 천연 제품, 유기농, 무첨가 제품 등이 점차 증가하고 있다. 특히, 반려동물 기능성 사료는 일반적인 사료 (가축용 먹이)가 아닌 식품 (사람 섭취 음식물)의 수준에서 안전성과 기능성을 요구하고 있다. 반려동물은 물, 단백질, 탄수화물, 지방과 함께 비타민과 미네랄의 6대 필수 영양소 섭취가 요구되고 있다.
반려동물의 사료로 사용되는 단백질과 불포화지방산이 풍부한 동애등에 내 비타민 함량을 높이기 위해 유산균으로 발효하는 연구는 아직 미진한 상황이다.
상기와 같은 배경 하에서, 본 발명자들은 동애등에 추출물에 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis)로 발효 시 추출물 내 비타민 B2, FAD, FMN 및 비타민 B9 함량이 증가한 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 명세서는 유산균을 포함하는 동애등에 추출물 내 비타민 및/또는 비타민 유도체 생성용 조성물을 제공한다.
본 명세서는 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis)를 포함하는, 동애등에 용매 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체 생성용 조성물을 제공한다.
본 명세서는 상기 동애등에 용매 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체 생성용 조성물에 의해 발효되는, 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물을 제공한다.
본 명세서는 상기 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 식품 조성물, 약학적 조성물 및/또는 사료 조성물을 제공한다.
본 명세서는 상기 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 항균용 조성물을 제공한다.
본 명세서는 상기 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물을 동애등에 용매 추출물에 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 동애등에 용매 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체의 생성방법을 제공한다.
본 명세서는
동애등에 용매 추출물에 락토코쿠스 락티스를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는, 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물의 제조방법을 제공한다.
본 명세서는 상기 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물을 유해균 저해, 억제 및/또는 제거를 필요로 하는 대상에게 투여 및/또는 급여하는 단계를 포함하는, 유해균 저해, 억제 및/또는 제거방법을 제공한다.
본 명세서는 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis)를 포함하는, 동애등에 용매 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체 생성용 조성물을 제공한다.
상기 락토코쿠스 락티스는 KCCM13066P의 기탁번호를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서는 상기 동애등에 용매 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체 생성용 조성물에 의해 발효되고,
유산균에 의해 발효되지 않은 동애등에 용매 추출물보다 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체 함량이 더 증가한, 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물을 제공한다.
본 명세서는 상기 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 식품 조성물, 약학적 조성물 및/또는 사료 조성물을 제공한다.
본 명세서는 상기 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 항균용 조성물을 제공한다.
본 명세서는 상기 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물을 동애등에 용매 추출물에 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 동애등에 용매 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체의 생성방법을 제공한다.
본 명세서는 상기 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물을 유해균 저해, 억제 및/또는 제거를 필요로 하는 대상에게 투여 및/또는 급여하는 단계를 포함하는, 유해균 저해, 억제 및/또는 제거방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 자세히 설명한다.
본 명세서에서, "동애등에"는 절지동물 곤충강 파리목 동애등에과의 곤충으로. 더러운 물, 거름더미 따위에서 살고, 한국, 일본 등지에 분포하는 것을 특징으로 하며, 유충은 탁월한 유기물 분해능력이 있어 음식물쓰레기의 처리에 적용되어 산업화되어 있다. 상기 "동애등에"는 동애등에 (Hermetia illucens)의 알, 유충, 번데기, 및 성충으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상인 것을 의미할 수 있고, 일 예에서, 동애등에는 동애등에의 유충 및/또는 번데기일 수 있으며, 또 다른 일 예에서, 동애등에 유충일 수 있다.
본 명세서는 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis)를 포함하는, 동애등에 용매 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체 생성용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 "비타민"은 비타민 B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8 및 B9로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "비타민 유도체"는 비타민에 작용기의 도입, 산화, 환원, 원자의 치환 등 모체의 구조와 성질을 대폭 변화시키지 않는 한도 내에서 변화된 화합물을 의미하고, 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드 (flavin adenine dinucleotide; FAD) 및 플라빈 모노뉴클레오타이드 (flavin mononucleotide; FMN)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서는 상기 동애등에 용매 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체 생성용 조성물에 의해 발효되고,
유산균에 의해 발효되지 않은 동애등에 용매 추출물보다 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체 함량이 더 증가한, 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물을 제공한다.
본 명세서에서 "유산균"은 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 제공되는 발효물의 원료가 되는 동애등에는 동결건조하여 분말 형태로 이용될 수 있으며, 필요에 따라 동결건조 단계 이전에 세척 및 절식 단계를 추가로 거칠 수 있다. 상기 절식 단계는 동애등에의 내장을 비우기 위한 단계로서, 해당 목적 범위 내에서 동애등에의 사료 공급을 중단하는 방법 또는 찹쌀 가루를 급이하는 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 분말화 과정은 필요에 따라 분쇄와 휴지 시간을 적절히 이용하여 수행될 수 있으며, 휴지 시간을 가짐으로써 분쇄기에서 발생하는 열에 의한 동애등에 유충 시료의 손상을 최소화할 수 있는 장점을 가진다. 일 실시예에서, 1분간 분쇄 후 3분간 휴지하는 분쇄 주기를 5회 반복하여 동애등에 유충 분말 (Hermetia illucens; Hi)을 제조하였다.
상기 동애등에 용매 추출물은, 동애등에, 동애등에의 건조물, 및/또는 동애등에의 동결건조물을 이용하여 제조될 수 있으며, 필요에 따라 동애등에, 동애등에의 건조물, 및/또는 동애등에의 동결건조물을 분말화하여 이용할 수 있다.
상기 동애등에 용매 추출물을 동애등에의 동결건조물을 분말화하여 이용하는 경우, 상기 동애등에 용매 추출물 전체 부피를 기준으로 동애등에 분말은 1 내지 10 (w/v)%, 1 내지 8 (w/v)%, 1 내지 6 (w/v)%, 1 내지 5 (w/v)%, 3 내지 10 (w/v)%, 3 내지 8 (w/v)%, 3 내지 6 (w/v)%, 3 내지 5 (w/v)%, 4 내지 10 (w/v)%, 4 내지 8 (w/v)%, 4 내지 6 (w/v)%, 4 내지 5 (w/v)%, 5 내지 10 (w/v)%, 5 내지 8 (w/v)% 또는 5 내지 6 (w/v)%, 예컨대, 5 (w/v)%의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 동애등에 용매 추출물은 필요에 따라 적절한 추출 용매를 선택하여 사용할 수 있으며, 상기 추출용매는 탄소수 1 (C1) 내지 4 (C4)의 알코올 및 물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 물, 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지쇄 알코올, 및 이들의 혼합물일 수 있으며, 더욱 자세하게는 에탄올 (EtOH) 또는 에탄올 농도 10 내지 99 v/v%, 20 내지 99 v/v%, 25 내지 99 v/v%, 30 내지 99 v/v%, 10 내지 90 v/v%, 20 내지 90 v/v%, 25 내지 90 v/v%, 30 내지 90 v/v%, 10 내지 70 v/v%, 20 내지 70 v/v%, 25 내지 70 v/v%, 또는 30 내지 70 v/v%의 에탄올 수용액일 수 있다. 상기 추출물 제조를 위한 추출방법은 통상의 추출법을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 추출 용매에 의한 추출, 초임계 유체 추출, 초음파 추출, 열수 추출 등의 방법을 사용할 수 있고, 바람직하게는 열수 추출방법을 사용할 수 있다. 상기 용매추출 시간은 1분 내지 1시간, 1분 내지 40분, 1분 내지 30분, 1분 내지 20분, 1분 내지 15분, 5분 내지 1시간, 5분 내지 40분, 5분 내지 30분, 5분 내지 20분, 5분 내지 15분, 10분 내지 1시간, 10분 내지 40분, 10분 내지 30분, 10분 내지 20분, 10분 내지 15분, 14분 내지 1시간, 14분 내지 40분, 14분 내지 30분, 14분 내지 20분 또는 14분 내지 15분일 수 있고, 예컨대 15분일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용매 추출시의 추출온도는 50 내지 200℃, 50 내지 160℃, 50 내지 150℃, 50 내지 140℃, 50 내지 130℃, 50 내지 125℃, 50 내지 121℃, 80 내지 200℃, 80 내지 160℃, 80 내지 150℃, 80 내지 140℃, 80 내지 130℃, 80 내지 125℃, 80 내지 121℃, 100 내지 200℃, 100 내지 160℃, 100 내지 150℃, 100 내지 140℃, 100 내지 130℃, 100 내지 125℃, 100 내지 121℃, 110 내지 200℃, 110 내지 160℃, 110 내지 150℃, 110 내지 140℃, 110 내지 130℃, 110 내지 125℃, 110 내지 121℃, 120 내지 200℃, 120 내지 160℃, 120 내지 150℃, 120 내지 140℃, 120 내지 130℃, 120 내지 125℃, 또는 120 내지 121℃일 수 있고, 예컨대 121℃일 수 있고, 상기 용매는 물일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 “추출물”은 열수 추출물, 용매 추출물, 증류 추출물, 초음파 추출물, 압착 추출물, 초임계 추출물, 및/또는 초고압 추출물일 수 있고, 열수 추출, 용매 추출, 증류 추출 (Distillation Extraction), 초음파 추출 (Ultrasonic Extraction), 압착 추출 (Press Extraxtion), 초임계 추출 (supercritical Extraction), 및/또는 초고압 추출 (Ultra-high pressure Extraction)의 방법으로 추출되는 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물은, 동애등에 용매 추출물을 그대로 발효를 위한 원료로 사용하거나, 원심 분리 또는 여과 등 후처리 공정 단계를 거쳐 발효 원료로 사용할 수 있다. 동애등에의 유효물질을 활용하기 위해 양적인 손실을 줄이고자 상기 동애등에 용매 추출물 전체를 사용할 수도 있고, 동애등에 용매 추출물의 상청액만을 사용할 수 있다.
상기 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물은 20 내지 40℃, 20 내지 37℃, 20 내지 35℃, 20 내지 30℃, 20 내지 25℃, 25 내지 40℃, 25 내지 37℃, 25 내지 35℃, 25 내지 30℃, 30 내지 40℃, 30 내지 37℃, 30 내지 35℃, 35 내지 40℃, 35 내지 37℃ 또는 37 내지 40℃, 예컨대, 25℃, 30℃, 35℃ 또는 37℃의 온도에서 발효되어 얻어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물은 1시간 내지 7일, 1시간 내지 5일, 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 48시간, 1시간 내지 24시간, 1시간 내지 12시간, 1시간 내지 2시간, 2시간 내지 7일, 2시간 내지 5일, 2시간 내지 72시간, 2시간 내지 48시간, 2시간 내지 24시간, 2시간 내지 12시간, 12시간 내지 7일, 12시간 내지 5일, 12시간 내지 72시간, 12시간 내지 48시간, 12시간 내지 24시간, 24시간 내지 7일, 24시간 내지 5일, 24시간 내지 72시간, 24시간 내지 48시간, 48시간 내지 7일, 48시간 내지 5일, 48시간 내지 72시간, 72시간 내지 7일, 72시간 내지 5일 또는 5일 내지 7일, 예컨대, 2시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 또는 7일동안 발효되어 얻어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서가 제공하는 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물은, 상기 동애등에 추출물에 덱스트로스, 갈락토스, 만노스, 수크로스 (설탕, 자당), 글루코스 (포도당), 스타치, 과당, 락토스 (젖당, 유당), 말토스 (엿당, 맥아당) 셀룰로스, 락툴로스, 트레할로스, 셀로비오스, 키토비오스, 코지비오스, 니게로스, 아이소말토스, 소포로스, 라미나리비오스, 겐티오비오스, 투라노스, 말툴로스, 아이소말툴로스, 겐티오비울로스, 만노비오스, 멜리비오스, 베리비울로스, 루티노스, 루티눌로스, 자일로비오스, 및 람노스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 탄소원을 첨가하고 유산균을 배양하여 얻어진 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 탄소원은 상기 추출물 부피 기준으로 0.1 내지 10 (w/v)%, 0.1 내지 7 (w/v)%, 0.1 내지 4 (w/v)%, 0.1 내지 3 (w/v)%, 0.1 내지 2.3 (w/v)%, 0.1 내지 2 (w/v)%, 0.5 내지 10 (w/v)%, 0.5 내지 7 (w/v)%, 0.5 내지 4 (w/v)%, 0.5 내지 3 (w/v)%, 0.5 내지 2.3 (w/v)%, 0.5 내지 2 (w/v)%, 1 내지 10 (w/v)%, 1 내지 7 (w/v)%, 1 내지 4 (w/v)%, 1 내지 3 (w/v)%, 1 내지 2.3 (w/v)%, 1 내지 2 (w/v)%, 1.5 내지 10 (w/v)%, 1.5 내지 7 (w/v)%, 1.5 내지 4 (w/v)%, 1.5 내지 3 (w/v)%, 1.5 내지 2.3 (w/v)%, 1.5 내지 2 (w/v)%, 1.7 내지 10 (w/v)%, 1.7 내지 7 (w/v)%, 1.7 내지 4 (w/v)%, 1.7 내지 3 (w/v)%, 1.7 내지 2.3 (w/v)%, 1.7 내지 2 (w/v)%, 2 내지 10 (w/v)%, 2 내지 7 (w/v)%, 2 내지 4 (w/v)%, 2 내지 3 (w/v)%, 또는 2 내지 2.3 (w/v)%로 첨가되는 것일 수 있고, 예컨대, 2 (w/v)%로 첨가되는 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서가 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물은, 상기 동애등에 추출물에 효모, 우유 카제인, 펩톤 (Peptone), 소이펩톤 (Soy peptone), 카제인펩톤 (Casein peptone), 미트펩톤 (Meat peptone), 폴리펩톤 (Polypeptone), 트립톤 (Tryptone), 소이톤 (Soytone) 및 소고기 추출물 (Beef extract)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 질소원을 첨가하고 유산균을 배양하여 얻어진 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니고, 상기 효모는 효모 추출물일 수 있고, 구체적으로, 분말형태일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 질소원은 상기 추출물 부피 기준으로 0.1 내지 10 (w/v)%, 0.1 내지 5 (w/v)%, 0.1 내지 2 (w/v)%, 0.1 내지 1 (w/v)%, 0.1 내지 0.7 (w/v)%, 0.1 내지 0.5 (w/v)%, 0.3 내지 10 (w/v)%, 0.3 내지 5 (w/v)%, 0.3 내지 2 (w/v)%, 0.3 내지 1 (w/v)%, 0.3 내지 0.7 (w/v)%, 0.3 내지 0.5 (w/v)%, 0.4 내지 10 (w/v)%, 0.4 내지 5 (w/v)%, 0.4 내지 2 (w/v)%, 0.4 내지 1 (w/v)%, 0.4 내지 0.7 (w/v)%, 0.4 내지 0.5 (w/v)%, 0.5 내지 10 (w/v)%, 0.5 내지 5 (w/v)%, 0.5 내지 2 (w/v)%, 0.5 내지 1 (w/v)%, 또는 0.5 내지 0.7 (w/v)%로 첨가되는 것일 수 있고, 예컨대, 0.5 (w/v)%로 첨가되는 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 제공하는 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물은 배양 (발효) 후 배양액 파쇄하고 원심분리 하여 상청액을 수집한 후 이를 이용하여 HPLC 및 EILSA를 수행하여, 발효물 내 비타민 B2, FMN, FAD 및/또는 비타민 B9의 생성양 및/또는 생성능을 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 제공하는 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물 내 비타민 B2 함량은 유산균에 의해 발효가 되지 않은 동애등에 용매 추출물 내 비타민 B2 함량의 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상 또는 1.5배 이상일 수 있고, 100배 이하 또는 10배 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 제공하는 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물 내 FMN 함량은 유산균에 의해 발효가 되지 않은 동애등에 용매 추출물 내 FMN 함량의 1.1배 이상, 1.2배 이상 또는 1.3배 이상일 수 있고, 100배 이하 또는 10배 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 제공하는 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물 내 FAD 함량은 유산균에 의해 발효가 되지 않은 동애등에 용매 추출물 내 FAD 함량의 1.1배 이상, 1.5배 이상, 2배 이상, 2.2배 이상, 2.4배 이상 또는 2.5배 이상일 수 있고, 100배 이하 또는 10배 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 제공하는 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물 내 비타민 B9 함량은 유산균에 의해 발효가 되지 않은 동애등에 용매 추출물 내 비타민 B9 함량의 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 4.2배 이상, 4.5배 이상 또는 4.6배 이상일 수 있고, 100배 이하 또는 10배 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 제공하는 조성물은 식품 조성물, 약학적 조성물, 사료 조성물, 화장품 조성물 및/또는 헤어 케어용 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서는 상기 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 식품 조성물, 약학적 조성물, 사료 조성물, 화장품 조성물 및/또는 헤어 케어용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, "발효물" 및/또는 "조성물"은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트, 토끼 등의 설치류, 이외의 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말, 염소 등을 포함하는 포유류, 닭, 오리, 거위 등을 포함하는 조류, 뱀, 도마뱀, 거북, 악어 등을 포함하는 파충류, 양서류, 어류, 새우류 등에서 선택된 대상에 다양한 경로로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 약학적 조성물의 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구 투여, 또는 정맥투여, 근육투여, 피하투여, 복막내 투여, 병변 부위 (예컨대, 염증 예방, 치료 또는 개선, 항균이 필요한 부분 등) 국소 투여 또는 복강 주사 같은 비경구 투여의 경로로 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 약학 조성물의 1회 또는 1일 투여량은 유효성분 (식물 착즙액)의 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 10000㎎/kg, 구체적으로, 0.01 내지 10000㎎/kg, 0.01 내지 5000㎎/kg, 0.01 내지 3000㎎/kg, 0.01 내지 2500㎎/kg, 0.01 내지 2000㎎/kg, 0.01 내지 1800㎎/kg, 0.1 내지 10000㎎/kg, 0.1 내지 5000㎎/kg, 0.1 내지 3000㎎/kg, 0.1 내지 2500㎎/kg, 0.1 내지 2000㎎/kg, 0.1 내지 1800㎎/kg, 1 내지 10000㎎/kg, 1 내지 5000㎎/kg, 1 내지 3000㎎/kg, 1 내지 2500㎎/kg, 1 내지 2000㎎/kg, 1 내지 1800㎎/kg, 10 내지 10000㎎/kg, 10 내지 5000㎎/kg, 10 내지 3000㎎/kg, 10 내지 2500㎎/kg, 10 내지 2000㎎/kg, 10 내지 1800㎎/kg, 100 내지 10000㎎/kg, 100 내지 5000㎎/kg, 100 내지 3000㎎/kg, 100 내지 2500㎎/kg, 100 내지 2000㎎/kg, 또는 100 내지 1800㎎/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1회 또는 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다.
상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 앞서 설명한 유효성분 이외에도, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행 (Standard pharmaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 및/또는 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 및 희석제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조제와 혼합되어 투여될 수 있다. 예컨대, 상기 약제학적 및/또는 생리학적으로 허용되는 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 약제학 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 담체일 수 있다.
상기 약제학적 및/또는 생리학적으로 허용되는 희석제 및/또는 부형제는 약학 조성물의 적절한 제제화에 통상적으로 사용되는 모든 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 윤할제, 계면활성제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
예컨대, 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제 등의 경구투여를 위한 고형 제제의 경우, 상기 부형제는 이러한 고형 제제의 제제화를 위한 적어도 1종 이상의 물질, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose), 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이외에도, 마그네슘 스티레이트 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 또한, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등의 경구투여를 위한 액상제제의 제제화의 경우, 통상적으로 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있고, 이외에, 통상적으로 사용되는 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 및/또는 보존제 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예컨대, 상기 약학적 조성물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 적절한 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강내 또는 혀밑 투여될 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제 (예를 들면, 메틸셀룰로오즈, 위텝솔 (Witepsol)과 같은 반합성 글리세라이드 또는 행인유 (Apricot kernel oil)와 PEG-6 에스테르의 혼합물 또는 PEG-8과 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 혼합물과 같은 글리세라이드 혼합물)와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 제형화 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 제공되는 식품 조성물에서, 용어 "식품"은 영양소를 한 가지 이상 함유하고 있는 식용의 천연물 또는 가공품을 의미하며, 통상적인 의미로서, 각종 일반 식품, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제, 및 음료 첨가제 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 의미하기 위하여 사용될 수 있다. 용어 "식품 조성물"은 상기 식품을 제조하기 위한 재료의 조합을 의미할 수 있다.
상기 식품 조성물 내의 상기 생약 성분의 함량은 식품사용 형태, 목적 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 예컨대, 고형분 중량 기준으로 0.00001 내지 99.9 중량%, 0.0001 내지 99.9 중량%, 0.001 내지 99.9 중량%, 또는 0.001 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 건강기능식품은 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료 (이하, '기능성 원료')를 사용하여 제조한 식품으로, 건강을 유지하거나 소정의 질병 또는 증상을 예방 및/또는 개선(완화)하는데 도움을 주는 모든 식품을 의미하며, 최종 제품 형태에는 특별한 제한이 없다. 예컨대, 상기 건강기능식품은 통상의 각종 식품, 식품 보조제, 음료, 식품 첨가제 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 건강기능식품은 고형, 반고형, 또는 액체 형태일 수 있으며, 구체적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등으로 제형화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 또는 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 또는 그의 염, 알긴산 또는 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 전체 건강 기능성 식품 100 중량부 당 0.001 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "사료"는 가축 (동물 등)에게 주는 먹을 거리를 총칭하는 의미일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 사료는 어류, 갑각류, 및/또는 동물에 사용하기 위한 사료일 수 있고, 상기 어류는 산천어, 문치가자미, 돌가자미, 넙치, 조피볼락, 무지개송어, 방어, 뱀장어, 잉어, 관상어, 메기, 청어, 농어, 대구, 아귀, 복어, 쏨뱅이, 전갱이, 홍어, 은어 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있고, 상기 갑각류는 새우류 등일 수 있으며, 상기 동물은 파충류, 양서류, 닭 (예, 육계, 산란계 등), 돼지, 소, 염소, 양, 말, 개, 고양이, 오리, 거위 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 사료는 어류 및/또는 새우류에 적용하거나, 및/또는 개 (반려견) 또는 고양이 (반려묘) 등의 반려동물에 적용하기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "항균"은 세균이나 진균 등의 미생물의 생장 및 증식을 억제 또는 제어하는 작용을 의미하는 것으로, 여드름 원인균 및/또는 피부 상재균의 생장 및 증식을 억제 또는 제어하는 작용을 의미할 수 있다.
본 명세서는 상기 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 항균용 조성물을 제공한다.
본 명세서는 상기 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물을 유해균 저해, 억제 및/또는 제거를 필요로 하는 대상에게 투여 및/또는 급여하는 단계를 포함하는, 유해균 저해, 억제 및/또는 제거방법을 제공한다.
상기 항균용 조성물의 항균 대상 균주 및/또는 상기 유해균은 대장균 (Escherichia coli, E. coli), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus, S. aureus), 리스테리아 (Listeria monocytogenes, L. monocytogenes), 살모넬라 (Salmonella sp), 바실러스 (Bacillus cereus), 비브리오 (Vibrio sp), 비듬균 (Malassezia furfur), 충치균 (Streptococcus mutans) 및 치주균 (Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항균용 조성물은 장 내 균주에 대한 항균용 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유해균은 장 내 균주의 유해균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서는
본 명세서에서 제공하는 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물을 동애등에 용매 추출물에 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 동애등에 용매 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체의 생성방법을 제공한다.
본 명세서는
동애등에 용매 추출물에 락토코쿠스 락티스를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는, 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물의 제조방법을 제공한다.
상기 배양하는 단계는 20 내지 40℃, 20 내지 37℃, 20 내지 35℃, 20 내지 30℃, 20 내지 25℃, 25 내지 40℃, 25 내지 37℃, 25 내지 35℃, 25 내지 30℃, 30 내지 40℃, 30 내지 37℃, 30 내지 35℃, 35 내지 40℃, 35 내지 37℃ 또는 37 내지 40℃, 예컨대, 25℃, 30℃, 35℃ 또는 37℃의 온도에서 진행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배양하는 단계는 1시간 내지 7일, 1시간 내지 5일, 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 48시간, 1시간 내지 24시간, 1시간 내지 12시간, 1시간 내지 2시간, 2시간 내지 7일, 2시간 내지 5일, 2시간 내지 72시간, 2시간 내지 48시간, 2시간 내지 24시간, 2시간 내지 12시간, 12시간 내지 7일, 12시간 내지 5일, 12시간 내지 72시간, 12시간 내지 48시간, 12시간 내지 24시간, 24시간 내지 7일, 24시간 내지 5일, 24시간 내지 72시간, 24시간 내지 48시간, 48시간 내지 7일, 48시간 내지 5일, 48시간 내지 72시간, 72시간 내지 7일, 72시간 내지 5일 또는 5일 내지 7일, 예컨대, 2시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 또는 7일동안 진행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서는 상기 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물을 유해균 저해, 억제 및/또는 제거를 필요로 하는 대상에게 투여 및/또는 급여하는 단계를 포함하는, 유해균 저해, 억제 및/또는 제거방법을 제공한다.
상기 "투여"는 경구 투여, 또는 정맥투여, 근육투여, 피하투여, 복막내 투여, 병변 부위 (예컨대, 염증 예방, 치료 또는 개선, 항균이 필요한 부분 등) 국소 투여 또는 복강 주사 같은 비경구 투여일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 투여 및/또는 급여 대상은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트, 토끼 등의 설치류, 이외의 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말, 염소 등을 포함하는 포유류, 닭, 오리, 거위 등을 포함하는 조류, 뱀, 도마뱀, 거북, 악어 등을 포함하는 파충류, 양서류, 및 어류 등의 척추동물에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis)를 포함하는, 동애등에 용매 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체 생성용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 동애등에 추출물 내 비타민 및/또는 비타민 유도체 생성효과 및/또는 항균 효과를 가진다.
도 1은 동애등에 추출물의 락토코쿠스 락티스 발효 여부에 따른 비타민 B2, FMN, FAD 및 비타민 B9의 생성량을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 동애등에 추출물의 락토코쿠스 락티스 발효 여부 및 온도에 따른 비타민 B2의 생성량을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 동애등에 추출물의 락토코쿠스 락티스 발효 여부 및 온도에 따른 비타민 B9의 생성량을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 동애등에 추출물 및 동애등에 추출물의 락토코쿠스 락티스 발효물의 장내 세포 독성을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 동애등에 추출물의 락토코쿠스 락티스 발효물의 장 내 세포와의 부착능을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 동애등에 추출물의 락토코쿠스 락티스 발효물의 장 내에서 비타민 B2, FMN, FAD 및 비타민 B9의 생성량을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 락토코쿠스 락티스의 황색포도상구균에 대한 항균 효과를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 락토코쿠스 락티스의 리스테리아에 대한 항균 효과를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 동애등에 추출물의 락토코쿠스 락티스 발효 여부 및 온도에 따른 비타민 B2의 생성량을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 동애등에 추출물의 락토코쿠스 락티스 발효 여부 및 온도에 따른 비타민 B9의 생성량을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 동애등에 추출물 및 동애등에 추출물의 락토코쿠스 락티스 발효물의 장내 세포 독성을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 동애등에 추출물의 락토코쿠스 락티스 발효물의 장 내 세포와의 부착능을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 동애등에 추출물의 락토코쿠스 락티스 발효물의 장 내에서 비타민 B2, FMN, FAD 및 비타민 B9의 생성량을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 락토코쿠스 락티스의 황색포도상구균에 대한 항균 효과를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 락토코쿠스 락티스의 리스테리아에 대한 항균 효과를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위를 제한하지 않는다.
실시예 1. 동애등에 추출물의 제조
실시예 1-1. 동애등에 분말 제조
동애등에 유충을 15 ~ 18시간 온도 27℃, 습도 60%에서 키우고 3일동안 절식시켜 동애등에 유충의 내장을 깨끗하게 하였다. 다음으로 동애등에 유충을 흐르는 물에 세척한 후, 마이크로웨이브로 건조하여 살충 처리하였다.
상기 건조시킨 동애등에 유충을 분쇄기를 사용해 분말로 제조하였다. 구체적으로, 분쇄기 사용에 의한 열 발생을 방지하기 위해 1분간 분쇄 후 3분간 휴지하는 분쇄 Cycle을 5회 반복하여, 동애등에 유충 분말 (Hermetia illucens; Hi)을 제조하였다.
실시예 1-2. 동애등에 열수 추출물 제조
상기 실시예 1-1에서 제조한 동애등에 유충 분말 (Hi) 50g과 물 1L (5 %, w/v)를 혼합하고, 초음파로 750 watt, 10kHz 조건에서 10초 간격으로 5분간 조사하여 혼합하였다 (Sonics Vibra-Cell, USA). 그 후, 상기 혼합물을 121℃ 고온고압기 (Autoclave; steam sterilizer)에서 5 ~ 20분간 처리하여 동애등에 유충의 열수 추출물 (Hotwater Extract of Hermetia illucens, HiHe)을 제조하였다. 상기 열수 추출물은 -70℃에서 보관 후 동결건조하거나 제조 직후 동결건조하여 분말화하거나 추출물 액상을 취하여 하기 실험에 이용하였다.
실시예 2. 발효물 제조를 위한 유산균의 분리 및 동정
실시예 2-1. 유산균의 분리
양어 사료용 유효 균주를 이용한 발효물 제조를 위해, 항균활성과 효소활성 등의 기능을 가지는 유산균 균주인 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis; KCCM13066P)를 해수에서 분리 및 동정하여 이용하였다. 상기 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis; KCCM13066P)는 2018년 6월 경북수산자원연구원의 양식장 해수의 해양심층수로부터 분리하였다.
상기 분리한 해양심층수로부터 분리한 균주를 0.1% (v/v) bromocresol purple (BCP)이 첨가된 DE MAN, ROGOSA and SHARPE (MRS) agar 배지에 도말하여 37℃에서 1일간 배양하였다. 이후 BCP와의 반응에 의해 형성된 노란색 콜로니의 선별을 반복하여 단일 종을 분리하였다.
상기 분리된 균주는 MRS 액체 배지에서 배양하여 50% (v/v) 글리세롤을 혼합하여 최종 글리세롤 농도가 25%가 되도록 한 후, -70℃에서 보관하였다.
실시예 2-2. 유산균의 동정
상기 실시예 2-1에서 분리된 균주는 16S rRNA의 염기서열 분석을 이용하여 동정되었다. 균주를 동정하기 위해, 우선 mini genomic DNA extraction kit (Promega)를 이용하여 각 균주의 유전체 DNA (genomic DNA)를 분리하였다.
상기 분리된 유전체 DNA를 주형으로, 하기의 27F (서열번호 1) 및 1492R 프라이머 (서열번호 2) 세트 및 AccPower PCR premix kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 TaKaRa PCR Thermal Cycler (Japan)으로 상기 균주의 16S rRNA 유전자 부위를 증폭하였고, 상기 프라이머 세트의 정보를 하기 표 1에 나타내었다.
| 프라이머 | 염기서열 (5’ → 3’) | 서열번호 |
| 27F primer | AGAGTTTGATCMTGGCTCAG | 1 |
| 1492R primer | GGTTACCTTGTTACGACTT | 2 |
상기 PCR 산물은 PCR clean-up Gel extraction (Macherey Nagel, USA)으로 정제하여 ABI3730 DNA analyzer (Applied Bioxyxtems, USA)로 유전자 서열을 분석하였다. 상기 실시예 2-1에서 분리한 락토코쿠스 락티스 균주의 16S rDNA 서열은 서열번호 3에 나타내었고, 그 정보를 하기 표 2에 나타내었다.
| 균주 | 염기서열 (5’ → 3’) | 서열번호 |
| Lactococcus lactis MIRE_P1 | TGCCAGGGGGCGGCATGCTATACATGCAAGTTGAGCGCTGAAGGTTGGTACTTGTACCGACTGGATGAGCAGCGAACGGGTGAGTAACGCGTGGGGAATCTGCCTTTGAGCGGGGGACAACATTTGGAAACGAATGCTAATACCGCATAAAAACTTTAAACACAAGTTTTAAGTTTGAAAGATGCAATTGCATCACTCAAAGATGATCCCGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGATGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGGTAGAGAAGAACGTTGGTGAGAGTGGAAAGCTCATCAAGTGACGGTAACTACCCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGTGGTTTATTAAGTCTGGTGTAAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTATGCATTGGAAACTGGTAGACTTGAGTGCAGGAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGCCTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGATGTAGGGAGCTATAAGTTCTCTGTATCGCAGCTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCGTGCTATTCCTAGAGATAGGAAGTTCCTTCGGGACACGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAACGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAGACAGTGATGTTTAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTTGGGAGTACCCGAAGTAGGTTGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTCCTAAGGTAGACCGCGTGGA | 3 |
| Lactococcus lactis GQ337880.1 | TGGGACTGGGCGGCGTGCTATACATGCAAGTTGAGCGCTGAAGGTTGGTACTTGTACCGACTGGATGAGCAGCGAACGGGTGAGTAACGCGTGGGGAATCTGCCTTTGAGCGGGGGACAACATTTGGAAACGAATGCTAATACCGCATAAAAACTTTAAACACAAGTTTTAAGTTTGAAAGATGCAATTGCATCACTCAAAGATGATCCCGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGATGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGGTAGAGAAGAACGTTGGTGAGAGTGGAAAGCTCATCAAGTGACGGTAACTACCCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGTGGTTTATTAAGTCTGGTGTAAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTATGCATTGGAAACTGGTAGACTTGAGTGCAGGAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGCCTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGATGTAGGGAGCTATAAGTTCTCTGTATCGCAGCTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCGTGCTATTCCTAGAGATAGGAAGTTCCTTCGGGACACGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAACGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAGACAGTGATGTTTAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTTGGGAGTACCCGAAGTAGGTTGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTTCCTAAGGTAAGACCGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGAGCGGCAAG | 4 |
상기 분리된 균주의 16S rRNA 서열정보를 이용하여 16S rRNA 서열 유사도 분석을 수행하였고, 그 결과를 하기 표 3에, 사용된 근접종 16S rRNA 정보를 상기 표 2에 나타내었다.
| 유산균 유래 | 분리 균주 | 근접종 16S rRNA | sequence identity | 수탁번호 |
| 해수 | Lactococcus lactis MIRE_P1 (서열번호 3의 16s rRNA) |
Lactococcus lactis GQ337880.1 (서열번호 4) |
99.7% | KCCM13066P |
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 2-1에서 해수로부터 분리된 유산균 락토코쿠스 락티스는 16S rRNA 분석 결과 락토코쿠스 락티스 균주 (Accession No. GenBank accession no. GQ337880.1)와 99.7%의 서열 유사도를 보였다.
상기 해수에서 분리된 균주들은 한국미생물보존센터 (KCCM)에 2021년 10월 27일자로 기탁되었으며 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis MIRE_P1)는 KCCM13066P의 기탁번호를 받았다.
실시예 3. 동애등에 추출물 유산균 발효물 제조의 최적 조건 확인
동애등에 유충 추출물의 유산균 발효물을 제조하는 데 있어, 유산균 발효를 효과적으로 일어나게 할 수 있는 최적조건으로서 탄소원 첨가 필요 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1-2에서 제조한 동애등에 유충의 열수 추출물 (HiHe) 1L에 상기 추출물 부피 기준으로 첨가 탄소원으로서 갈락토스 (Galactose Sigma, USA) 20g (2 %; w/v), 질소원으로 효모 분말 (기산바이오, 한국) 5 g (0.5 %; w/v)를 첨가한 배지 (시험배지 1)를 준비하였다. 또한, 대조군으로 일반적으로 사용되는 유산균 배지인 DE MAN, ROGOSA and SHARPE (MRS) 배지 (대조배지), HiHe 1L만 있는 배지 (시험배지 2)를 준비하였다.
상기 준비한 3종의 배지 (시험배지 1, 시험배지 2 및 대조배지)에 각각 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis; Ll; KCCM13066P)를 1x108 cfu/ml 농도로 10 mL (1 %; v/v) 접종하였고, 상기 배지에 접종된 유산균을 25℃, 30℃, 35℃ 또는 37℃에서 24시간동안 배양하였다.
배양 24시간 후의 LAB (Lactic Acid Bacteria) Counts (log cfu/ml)를 측정하여 최적 발효물 배양 조건을 확인하였으며, 구체적으로 각 액체 배지에 아가로스 (BD Difco, USA)를 첨가하여 제작한 고체 배지에 발효물을 1 (v/v)%로 희석하여 1ml을 LAB 플레이트에 도말 후 30℃에서 24시간 배양하여 형성된 콜로니의 수를 측정하여 수행하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타냈다.
| 반응온도 | 배지 종류 | 형성된 콜로니 수 |
| 25℃ | MRS | 3.E+11 |
| HiHe | 3.E+08 | |
| HiHe+2% Gal+0.5% yeast | 2.E+11 | |
| 30℃ | MRS | 3.E+11 |
| HiHe | 3.E+08 | |
| HiHe+2% Gal+0.5% yeast | 2.E+11 | |
| 35℃ | MRS | 3.E+11 |
| HiHe | 3.E+08 | |
| HiHe+2% Gal+0.5% yeast | 2.E+11 | |
| 37℃ | MRS | 3.E+11 |
| HiHe | 3.E+08 | |
| HiHe+2% Gal+0.5% yeast | 3.E+09 |
형성된 콜로니의 수를 측정한 결과, 동애등에 유충의 열수 추출물을 포함하는 시험배지 2 및 여기에 0.5% 효모와 2% 갈락토스를 첨가한 배지 (시험배지 1)는 모두 대조배지보다 락토코쿠스 락티스 유산균의 생장을 증가시켰다.
실시예 4. 동애등에 추출물 발효물의 비타민 B2, FMN, FAD 생산량 측정
상기 실시예 3의 시험배지 1에 상기 실시예 2의 락토코쿠스 락티스 (MIRE_P1; KCCM 13066P)를 1x108 cfu/ml 농도로 10 mL (1 (v/v)%) 접종한 후 배양한 용액을 시험용액 (GY_HiHe_Ll)으로 준비하였고, 대조군으로 상기 실시예 3의 시험배지 1에 미생물 접종 없이 배양한 대조용액으로 준비하였다 (GY_HiHe). 구체적으로, 30℃에서 호기 상태로 24시간 배양을 진행하였다.
상기 준비한 GY_HiHe_Ll 및 GY_HiHe를 초음파파쇄기 (Sonics, USA)를 이용하여 750 watt, 20 kHz (amplitude, 20%)로 pulse on 2초, pulse off 10초 조건 하에 3회 반복하여 파쇄하였으며, 8,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상청액을 수집하였다. 수집된 상청액을 0.45 μm 시린지 필터 (ADVANTEC, Japan)를 이용하여 필터링한 후 HPLC 시험 용액으로 이용하였다.
HPLC 수행 시 표준물질로 비타민 B2 (Riboflavin; R4500; Sigma USA)와 FMN (Flavin mononucleotide; F2253, Sigma USA), FAD (Flavin Adenine dinucleotide; F8384, Sigma USA) 각각 5 μg/mL (0.05%; w/v)을 이용하였다. HPLC용 컬럼은 CapcellPAK UG120 C18 (4.6 x 250 mm, 5 um; OSAKA SODA, Japan)를 사용하였고 이동상 용액은 메탄올 (methanol)과 10 mM NaH2PO4용액 (pH5.5)을 25:75의 부피비 (v:v)로 혼합하여 사용하였고, 컬럼의 온도는 40℃로 유지시켰으며 유속은 0.8 ml/min으로 하였다.
형광검출기 (여기파장: 445nm, 측정파장: 530nm)를 이용하여 검출하였고, 상기 HPLC 시험용액과 상기 표준물질을 각 10 μl씩 주입 후 이동상용액은 유속 0.8 ml/mim 조건으로 실험을 진행하였고, 그 결과를 하기 표 5 및 도 1에 나타내었다.
| 시험용액 종류 | 비타민 B2 함량 (μg/g) | FMN 함량 (μg/g) | FAD 함량 (μg/g) |
| GY_HiHe | 7.98 | 2.66 | 10.64 |
| GY_HiHe_Ll | 12.24 | 3.58 | 27.58 |
비타민 B2, FMN, FAD 생산량을 확인한 결과, 동애등에 추출물에 락토코쿠스 락티스를 접종한 결과 전체적으로 생산량이 증가한 것을 확인하였다.
실시예 5. 동애등에 추출물 발효물 내 비타민 B9의 정량분석
상기 실시예 4와 실질적으로 동일한 방법으로 GY_HiHe_Ll 및 GY_HiHe를 준비하고, 30℃에서 24, 48 또는 72시간 배양한 후, 파쇄 및 원심분리하여 얻은 상청액을 준비하였다.
상기 상청액을 0.45 μm 시린지 필터 (ADVANTEC, Japan)를 이용하여 필터링한 후 ELISA 시료로 이용하여, 비타민 B9 ELISA kit (Mybiosource, USA)로 ELISA를 수행하였다.
구체적으로, 비타민 B9 (Mybiosource, USA)이 코팅 된 96-well microplate에 상기 준비된 ELISA 시료 각각 100 μL와 표준물질 (비타민 B9)을 분주하여 25℃에서 1시간동안 정치하고, washing buffer로 각 well을 3번씩 세척하였다.
Assay buffer (1X)를 100 μL씩 분주하여 1시간 동안 블로킹 (blocking)하고 washing buffer로 세척하였다. 2시간 뒤에 비타민 B9인 folic acid 검출 항체 (detection antibody)와 HRP enzyme이 conjugation된 Avidin을 100 μL를 분주 한 후에 상온에서 1시간동안 반응시키고, 다시 washing buffer로 7번 세척한 다음, TMB (Tetramethylbenzidine) substrate 용액을 100 μL 처리하였다.
상온에서 10분동안 암반응 시킨 후, 비타민 B9 ELISA kit 내의 stop solution (Mybiosource, USA)을 50 μL씩 분주하여 반응을 종결시켰고, ELISA reader (BioTek Instruments Inc.USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 6 및 도 1에 나타내었다.
| 시험용액 종류 | 비타민 B9 함량 (ng/mL) |
| GY_HiHe | 0.65 |
| GY_HiHe_Ll | 3.05 |
비타민 B9 생산량을 확인한 결과, 동애등에 추출물에 락토코쿠스 락티스를 접종한 결과 생산량이 증가한 것을 확인하였다.
실시예 6. 동애등에 추출물 발효물의 발효온도에 따른 비타민 B2의 정량분석
상기 실시예 4의 GY_HiHe_Ll 및 GY_HiHe를 준비하고, 추가적으로 증류수에 첨가 탄소원으로서 갈락토스 (Galactose Sigma, USA) 2 (w/v)%, 질소원으로 효모 분말 (기산바이오, 한국) 0.5 (w/v)%를 첨가한 배지를 배양한 용액 (GY_DW), 상기 실시예 3의 시험배지 2를 준비하여 배양을 진행한 비교용액 (NO_HiHe)을 준비하였다.
구체적으로, 상기 GY_HiHe_Ll 및 GY_HiHe에 대해 25℃, 30℃, 35℃ 또는 37℃에서 호기 상태로 24시간 배양하고, 상기 GY_DW 및 NO_HiHe에 대해 25℃에서 호기상태로 24시간 배양하고, 파쇄 및 원심분리한 상청액을 준비하였다.
상기 상청액을 각각 상기 실시예 4와 실질적으로 동일한 방법으로 HPLC를 수행하였고, 그 결과를 표 7 및 도 2에 나타내었다.
| 종류 | 배양온도 | 비타민 B2 함량 (μg/g) |
| GY_DW | 25℃ | 5.9 |
| NO_HiHe | 25℃ | 8.2 |
| GY_HiHe | 25℃ | 6.6 |
| 30℃ | 6.6 | |
| 35℃ | 6.6 | |
| 37℃ | 6.6 | |
| GY_HiHe_Ll | 25℃ | 15.27 |
| 30℃ | 15.41 | |
| 35℃ | 13.59 | |
| 37℃ | 14.37 |
상기 HPLC 수행을 통해 비타민 B2 함량을 확인한 결과, 동애등에 추출물에 락토코쿠스 락티스를 추가로 접종하는 경우, 균주를 접종하지 않은 동애등에 추출물보다 비타민 B2 함량이 높은 것을 확인하여, 락토코쿠스 락티스를 접종을 통해 비타민 B2의 생산량이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 7. 동애등에 추출물 발효물의 온도에 따른 비타민 B9의 정량분석
상기 실시예 6과 실질적으로 동일한 방법으로 GY_HiHe_Ll, GY_HiHe, GY_DW 및 NO_HiHe를 배양, 파쇄 및 원심분리하여 얻은 상청액을 준비하였다.
상기 준비한 상청액을 상기 실시예 5와 실질적으로 동일한 방법으로 ELISA를 수행하였고, 그 결과를 표 8 및 도 3에 나타내었다.
| 종류 | 배양온도 | 비타민 B9 함량 (ng/mL) |
| GY_DW | 25℃ | 1.29 |
| NO_HiHe | 25℃ | 2.11 |
| GY_HiHe | 25℃ | 1.91 |
| 30℃ | 1.91 | |
| 35℃ | 1.91 | |
| 37℃ | 1.91 | |
| GY_HiHe_Ll | 25℃ | 3.01 |
| 30℃ | 2.92 | |
| 35℃ | 2.98 | |
| 37℃ | 1.33 |
상기 ELISA 수행을 통해 비타민 B9 함량을 확인한 결과, 동애등에 추출물에 락토코쿠스 락티스를 추가로 접종하는 경우, 균주를 접종하지 않은 동애등에 추출물보다 비타민 B9 함량이 높은 것을 확인하여, 락토코쿠스 락티스를 접종을 통해 비타민 B9의 생산량이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 8. 동애등에 추출물 발효물의 인간 장 내 세포 생존율 분석
Caco-2 세포 (한국세포주은행; http://cellbank.snu.ac.kr)를 1x105 단층으로 10% FBS (Gibco, USA)를 포함하는 DMEM (Gibco, USA)내에 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 세포 생존율은 Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies Inc., Japan) 분석법을 이용하였고, Caco-2 세포를 96-well plate에 1×105 cell/well 분주하여 24시간 배양하고 0.5% FBS가 함유된 MEM 배지로 교체하여 12시간 방치하였다.
상기 실시예 4에서 파쇄, 원심분리 과정을 거쳐 수집한 GY_HiHe_Ll 및 GY_HiHe 각각의 상청액을 각각 10, 100 또는 1,000 μg/mL의 농도로 상기 배지에 희석하여 처리한 Caco-2 세포는 24, 48, 72시간 또는 7일동안 배양한 후 CCK-8 시약을 well당 10 μL 첨가하여 2시간동안 5% CO2, 37℃ 배양기에서 배양하고, ELISA reader (BioTek Instruments Inc., USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 상기 희석한 상청액을 첨가하지 않은 대조군 (CON) 대비 상대 백분율로 측정하였고, 그 결과를 하기 표 9 및 도 4에 나타내었다.
| 농도 (μg/mL) | 배양시간 | Caco-2 세포 생존율 (%) | |
| CON | - | 24시간 | 100 |
| 48시간 | 100 | ||
| 72시간 | 100 | ||
| 7일 | 100 | ||
| GY_HiHe | 10 | 24시간 | 97.50 |
| 48시간 | 106.00 | ||
| 72시간 | 124.66 | ||
| 7일 | 108.39 | ||
| 100 | 24시간 | 95.80 | |
| 48시간 | 106.68 | ||
| 72시간 | 138.93 | ||
| 7일 | 108.43 | ||
| 1000 | 24시간 | 105.29 | |
| 48시간 | 102.79 | ||
| 72시간 | 137.54 | ||
| 7일 | 112.99 | ||
| GY_HiHe_Ll | 10 | 24시간 | 108.50 |
| 48시간 | 104.08 | ||
| 72시간 | 131.57 | ||
| 7일 | 110.92 | ||
| 100 | 24시간 | 121.90 | |
| 48시간 | 112.88 | ||
| 72시간 | 156.37 | ||
| 7일 | 113.49 | ||
| 1000 | 24시간 | 121.97 | |
| 48시간 | 126.84 | ||
| 72시간 | 145.73 | ||
| 7일 | 131.83 |
Caco-2 세포 생존율을 분석한 결과, 동애등에 추출물의 락토코쿠스 락티스 첨가 발효물에서 아무것도 첨가하지 않은 대조군 대비 모두 세포 생존율이 높게 측정되는 바, 상기 발효물을 첨가하더라도 세포 생존율이 줄어들지 않은 것을 확인하여, 독성이 없는 것을 확인하였다.
실시예 9. 동애등에 추출물 발효물의 인간 장 내 세포와의 부착능 분석
Caco-2 세포 (한국세포주은행; http://cellbank.snu.ac.kr)를 10% FBS (Gibco, USA)를 포함하는 DMEM (Gibco, USA) 배지에 1x105 단층으로 접종하여, 37℃, CO2 배양기에서 락토코쿠스 락티스를 첨가하여 배양하였다. Caco-2세포는 사람의 대장암 세포 (Colorectal carcinoma에서 유래한 세포로 배양하면 사람의 소장상피세포로 분화하여 장내 흡수, 투과 등의 실험에 유효하다.
구체적으로 Caco-2세포에 락토코쿠스 락티스를 1:1,000 (Caco-2 세포 : 락토코쿠스 락티스; 1x105 cells/well: 1x108 cfu/well)의 비율로 상기 실시예 3의 시험배지 1에 접종하고 (GY_HiHe_Ll_Ca), 24시간, 48시간, 72시간 또는 7일 동안 37℃의 온도에서 CO2 배양을 진행하였고, 배지 내 균을 제거하고 세포에 붙은 유산균 수만으로 계수하였다. 대조군으로 상기 시험배지 1 배지 대신 상기 실시예 3의 MRS 배지에 Caco-2세포 및 락토코쿠스 락티스를 접종하여 (MRS_Ll_Ca) 계수하였다.
각 유산균의 부착 기능은 MRS_Ll_Ca와 GY_HiHe_Ll_Ca 각각의 Caco-2 세포수에 대한 유산균 생균수의 비율로 표시하였고, 그 결과를 하기 표 10 및 도 5에 나타내었다.
| 배양시간 | Caco-2 세포수에 대한 유산균 생균수의 비율 (log cfu / mL) | |
| MRS_Ll_Ca | 2시간 | 7.E+01 |
| 12시간 | 6.E+04 | |
| 24시간 | 2.E+05 | |
| 48시간 | 4.E+06 | |
| 72시간 | 5.E+05 | |
| GY_HiHe_Ll_Ca | 2시간 | 2.E+01 |
| 12시간 | 4.E+06 | |
| 24시간 | 2.E+07 | |
| 48시간 | 4.E+07 | |
| 72시간 | 2.E+07 |
Caco-2 세포수에 대한 유산균 생균수의 비율을 측정한 결과, GY_HiHe_Ll_Ca의 경우 유산균 생균수 비율이 높은 것을 확인하였고, 이를 통해, 동애등에 추출물이 첨가되는 경우 인간 장 내 세포와의 부착능이 더 우수한 것을 확인하였다.
실시예 10. 동애등에 추출물 발효물의 인간 장 내 세포 내에서의 비타민 B2, FMN, FAD 및 비타민 B9의 생산능 분석
상기 실시예 9와 실질적으로 동일한 방법으로 Caco-2 세포에 동애등에 배지의 락토코쿠스 락티스 발효물 (30℃, 24시간)을 첨가하여 12시간, 24시간, 48시간 또는 72시간 배양하였고 (GY_HiHe_Ll_Ca), 각 시간별의 Caco-2세포와 배지를 모아 초음파파쇄기 (Sonics, USA)를 이용하여 750watt, 20kHz (amplitude, 20%)로 pulse on 2초, pulse off 10초 조건 하에 3회 반복하여 파쇄하였으며, 8,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상청액을 수집하였다. 대조군으로 락토코쿠스 락티스를 첨가하지 않고, Caco-2 세포만을 배양하여 상청액을 수집하였다 (NO_Ca).
수집된 상청액을 0.45um 시린지 필터 (ADVANTEC, Japan)를 이용하여 필터링한 후 HPLC 시험 용액으로 이용하여, 상기 실시예 4와 실질적으로 동일한 방법으로 HPLC를 수행하였고, 그 결과를 하기 표 11 및 도 6에 나타내었다.
또한, 상기 수집된 상청액을 0.45 μm 시린지 필터 (ADVANTEC, Japan)를 이용하여 필터링한 후 비타민 B9 ELISA 시료로 이용하여, 상기 실시예 5와 실질적으로 동일한 방법으로 ELISA를 수행하였고, 그 결과를 하기 표 11 및 도 6에 나타내었다.
| 배양시간 | 비타민 B2 (μg/g) | FMN (μg/g) | FAD (μg/g) | 비타민 B9 (ng/mL) | |
| NO_Ca | 12시간 | 0.112 | 0 | 0 | 6.306 |
| 24시간 | 0.108 | 0 | 0 | 6.341 | |
| 48시간 | 0.112 | 0 | 0 | 6.476 | |
| 72시간 | 0.115 | 0 | 0 | 6.820 | |
| GY_HiHe_Ll_Ca | 12시간 | 0.108 | 0.010 | 0.081 | 7.625 |
| 24시간 | 0.101 | 0.009 | 0.066 | 7.992 | |
| 48시간 | 0.108 | 0.009 | 0.061 | 7.227 | |
| 72시간 | 0.156 | 0.009 | 0.052 | 7.094 |
비타민 B2, FMN, FAD 및 비타민 B9의 생산량을 확인한 결과, GY_HiHe_Ll_Ca의 비타민 B2, FMN, FAD 및 비타민 B9의 생산량이 더 높은 것을 확인하였고, 특히 NO_Ca의 경우 FMN 및 FAD가 생성되지 않았지만, GY_HiHe_Ll_Ca의 경우 FMN 및 FAD 생성을 확인하여, 동애등에 추출물의 락토코쿠스 락티스 발효물이 우수한 비타민 B2, FMN, FAD 및 비타민 B9 생선능을 가지는 것을 확인하였다.
실시예 11. 동애등에 추출물에 의해 발효된 유산균의 인간 장 내 세포내의 유해균 부착 억제능 분석
동애등에 추출물에서 발효된 유산균 락토코쿠스 락티스의 Caco2 세포내의 유해균 2종 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus, S. aureus, ATCC 12600) 및 리스테리아 (Listeria monocytogenes, L. monocytogenes, ATCC 15313)에 대한 억제능을 분석하였다.
구체적으로, 상기 황색포도상구균 (ATCC 12600)과 리스테리아 (Listeria monocytogenes, L. monocytogenes, ATCC 15313) 2종의 유해균 (OD600=0.5; 1x106 cfu/well) 각각과 상기 실시예 3에서 시험배지 1에서 30℃ 온도조건으로 배양을 진행한 락토코쿠스 락티스 (OD600=0.5; 1x106 cfu/well)를 Caco-2 세포 (1x105 cells/well)에 2:1의 cfu 비율로 공접종하였다 (실험군). 대조군으로 락토코쿠스 락티스 접종 없이 상기 2종의 유해균 황색포도상구균 (ATCC 12600) (OD600=0.5; 1x106 cfu/well)과 리스테리아 (Listeria monocytogenes, L. monocytogenes, ATCC 15313) (OD600=0.5; 1x106 cfu/well) 각각을 상기 실험군과 동일한 양으로 Caco-2 세포 (1x105 cells/well)에 접종하여 준비하였다.
상기 각 균주 접종 후, 0시간, 2시간 또는 6시간 배양된 세포의 세포배양액을 버리고 1x PBS로 2번 세척 후, 0.25% trypsin 용액 (sigma, USA)을 30초 처리하여 Caco-2 세포만을 수거하여 Promega Wizard DNA Extraction kit (Promega, USA) 로 분리한 genomic DNA 50ng을 real-time PCR의 시료 DNA로 사용하였다.
상기 Real-time PCR은 PowerChekTM Staphylococcus aureus Real-time PCR premix (R0103C; KOGENEBIOTECH, KOREA)에 상기 분리한 각 genomic DNA 50ng을 처리하고, 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 50℃ 2분, 95℃ 10분 처리 후, 95℃ 15초, 60℃ 1분 조건의 35 사이클로 qRT-PCR을 수행하였고, 실험군 및 대조군 각각에 대해 공배양을 수행하지 않은 경우 (0시간) 대비 Ct (Threshold cycle)값을 측정하여 유전자 copy수의 상관관계를 확인하였고, 그 결과를 도 7, 8, 표 12 및 13에 나타내었다.
| 균주 종류 | 2시간 (Fold Change to 0h) | 6시간 (Fold Change to 0h) |
| S. aureus | 1.159 | 1.007 |
| S. aureus + 락토코쿠스 락티스 | 0.293 | 0.080 |
| 균주 종류 | 6시간 (Fold Change to 0h) |
| L. monocytogenes | 1.108 |
| L. monocytogenes + 락토코쿠스 락티스 | 0.033 |
유전자 copy 수의 상관관계를 확인한 결과, 락토코쿠스 락티스와 함께 첨가되는 경우 황색포도상구균 및 리스테리아의 수가 줄어드는 것을 확인하였고, 이를 통해, 락토코쿠스 락티스의 상기 유해균 2종에 대한 억제능을 확인하였다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (16)
- 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis)를 포함하는, 동애등에 용매 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체 생성용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 비타민은 비타민 B2 및 B9으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상; 또는
상기 비타민 유도체는 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드 (flavin adenine dinucleotide; FAD) 및 플라빈 모노뉴클레오타이드 (flavin mononucleotide; FMN)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 동애등에 용매 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체 생성용 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 락토코쿠스 락티스는 KCCM13066P의 기탁번호를 갖는 것인, 동애등에 용매 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체 생성용 조성물.
- 제1항의 조성물에 의해 발효되고,
유산균에 의해 발효되지 않은 동애등에 용매 추출물보다 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체 함량이 더 증가한, 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물. - 제4항에 있어서, 상기 동애등에 용매 추출물은 동애등에를 물, 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지쇄 알코올, 또는 이들의 혼합물로 추출한 용매 추출물인, 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물.
- 제4항에 있어서, 상기 동애등에 용매 추출물은 동애등에 유충의 용매 추출물인, 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물.
- 제4항에 있어서, 상기 유산균 발효물은 20 내지 40℃의 온도에서 발효되어 얻어진 것인, 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물.
- 제4항에 있어서, 상기 유산균 발효물은 1시간 내지 7일동안 발효되어 얻어진 것인, 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물.
- 제4항에 있어서, 상기 유산균 발효물은 동애등에 용매 추출물에, 덱스트로스, 갈락토스, 만노스, 수크로스, 글루코스, 스타치, 과당, 락토스, 말토스, 셀룰로스, 락툴로스, 트레할로스, 셀로비오스, 키토비오스, 코지비오스, 니게로스, 아이소말토스, 소포로스, 라미나리비오스, 겐티오비오스, 투라노스, 말툴로스, 아이소말툴로스, 겐티오비울로스, 만노비오스, 멜리비오스, 베리비울로스, 루티노스, 루티눌로스, 자일로비오스, 및 람노스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 탄소원을 첨가하고 유산균을 배양하여 얻어진 것인, 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물.
- 제4항에 있어서, 상기 유산균 발효물은 동애등에 용매 추출물에, 효모, 우유 카제인, 펩톤 (Peptone), 소이펩톤 (Soy peptone), 카제인펩톤 (Casein peptone), 미트펩톤 (Meat peptone), 폴리펩톤 (Polypeptone), 트립톤 (Tryptone), 소이톤 (Soytone) 및 소고기 추출물 (Beef extract)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 질소원을 첨가하여 유산균을 배양하여 얻어진 것인, 동애등에 용매 추출물의 유산균 발효물.
- 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항의 유산균 발효물을 포함하는, 사료 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 사료는 어류, 새우류, 닭, 오리, 거위, 개, 고양이, 소, 말 및 돼지로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 사용하기 위한 것인, 사료 조성물.
- 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항의 유산균 발효물을 포함하는, 항균용 조성물.
- 제13항에 있어서, 항균 대상 균주는 황색포도상구균 (S. aureus) 및 리스테리아 (L. monocytogenes)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 항균용 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 동애등에 용매 추출물에 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 동애등에 용매 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체의 생성방법.
- 제15항에 있어서,
상기 비타민은 비타민 B2 및 B9으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상; 또는
상기 비타민 유도체는 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드 (flavin adenine dinucleotide; FAD) 및 플라빈 모노뉴클레오타이드 (flavin mononucleotide; FMN)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 동애등에 용매 추출물 내 비타민 또는 비타민 유도체의 생성방법.
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|---|---|---|---|
| KR20220165005 | 2022-11-30 | ||
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| KR1020230105167A KR20240092547A (ko) | 2022-11-30 | 2023-08-10 | 락토코쿠스 락티스를 포함하는 동애등에 추출물 내 비타민 또는 이의 유도체 생성용 조성물 및 이의 용도 |
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-
2023
- 2023-08-10 KR KR1020230105167A patent/KR20240092547A/ko unknown
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