KR101663570B1

KR101663570B1 - 평위산 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제 및 이를 이용한 기능성 사료

Info

Publication number: KR101663570B1
Application number: KR1020140084585A
Authority: KR
Inventors: 최상훈; 황요셉; 이찬흔; 허용주
Original assignee: 군산대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-07
Filing date: 2014-07-07
Publication date: 2016-10-07
Also published as: KR20160007877A

Abstract

본 발명은 한방소화제로 알려진 평위산 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제 및 이를 이용한 기능성 사료에 관한 것이다. 본 발명의 여러 구현예에 따르면, 평위산 부산물 추출물, 상기 평위산 부산물 추출물에 상기 프로바이오틱스를 첨가하는 경우, 어류의 각종 세균성 질병의 예방은 물론 항병력을 증가시키고 병원성 세균감염의 치료가 가능하므로 어류용 사료 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 밀집사육으로 인한 질병발생에 대한 면역력 강화로 저항성을 높이며, 천연 항생제 개념을 도입하여 항생제 잔류나 부작용을 예방하고, 전염병에 대한 저항성을 증진시킬 수 있다.

Description

평위산 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제 및 이를 이용한 기능성 사료{Feed additive containing Pyeong wee-San sludge extract and functional feed using thereof}

본 발명은 한방소화제로 알려진 평위산 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제 및 이를 이용한 기능성 사료에 관한 것이다.

현재 우리나라 해산 어류 양식은 1970년대부터 각종 어류에 대한 양식기술이 개발되면서 어종별 양식 생산량은 지금까지 약 250%의 증가를 보이고 있으며, 2003년 기준으로 어류양식 생산량은 72,393톤에 달하며 국민의 단백질 식량산업으로 자리를 굳히고 있다(National fisheries research & development institute, 2000). 일본 중국 등과 함께 최근에는 미국을 비롯한 유럽 등지의 선진국에서도 성인병의 예방방지를 위한 식생활 개선을 위하여 육상동물보다 어류단백질의 우수성이 인정되는 어류양식 생산량이 급증하고 있어 국제사회의 경쟁이 날로 심각해지고 있다. 또한 우리나라 국민의 식생활 패턴과 삼면이 바다인 우리나라의 입지적 여건으로 보아 수산물 생산에 있어 수요가 공급을 초과하고 있는 실정이다. 그러나 생산량을 높이기 위한 양식장의 밀식과 열약한 사육수 등은 양식어류의 항병력을 약화시켜 어류질병이 빈번히 나타나며 치료나 예방이 힘든 실정이기 때문에 이에 따른 경제적 손실이 높아지고 있다(Ministry for food agriculture forestry and fisheries, 2003).

현재 양식장에서 발생하는 질병에 대한 예방 및 치료방법에는 항생제요법이 가장 많이 이루어지고 있으나, 항생제의 오남용으로 인한 내성균의 출현(Smith et al., 1994)과 체내잔류(Karunasagar et al., 1994) 및 주변의 수질 오염 등의 문제로 인해서 항생제의 사용은 한계에 이르고 있다. 항생물질의 계속적인 사용은 내성을 갖는 미생물의 증가를 초래하게 되고 이러한 내성균은 사람에게 전염될 수 있고 양식어 자체의 장내 세균총의 파괴와 함께 항생물질의 축적으로 생육에 지장을 초래할 뿐만 아니라 식용시 악영향을 미칠 수 있다. 특히 장내서식 유익 세균총은 대사과정에서 중요한 역할을 할 뿐 아니라 면역강화 및 동물의 성장과 건강유지를 위해 필수적이며 비타민의 생성 등 유익한 역할을 하나 항생물질 등의 투여로 장내세균총의 생물학적 균형이 깨지면 감염 방어기작에 이상이 생겨 병원 미생물의 침입이 용이하게 된다(Mitsuoka, 1982). 생균제(probiotics, 이하 PB라 함)는 여러 종류의 정상 장내 세균총에서 병원성세균에 대해 증식을 억제하는 항균력이 있는 것으로 알려져 있으므로 정상 장내 세균총의 균형을 유지하고 병원성 세균의 증식을 억제하는데 중요한 역할을 담당한다(Shahani and Ayebo, 1982; Fuller, 1980).

또한 양식 산업에서 사료비는 양식 경영비의 절반 이상을 차지하는 요소로 사료비의 절감은 양식의 성패를 좌우할 수 있는 중요한 요건으로 작용하고 있다. 양식어가에서는 어떤 형태의 사료를 사용하더라도 거의 대부분은 사료의 이용률을 높이기 위해 별도의 첨가제를 사용하고 있는 실정이다. 또한, 최근에는 청정 농수산물에 대한 인식이 높아짐에 따라 항생제 사용에 많은 부담을 갖게 되었다. 이러한 문제점을 개선하고자 최근에는 사료 내 유용식물자원 및 PB 첨가에 관한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 연구된 내용에 의하면 해조류, 키토산 및 성장호르몬을 이용하여 어류의 생리적인 기능의 향상을 이룰 수 있는 것으로 알려져 있다(Nakagawa et al., 1981; Yone et al., 1986; Nematipour et al., 1987; Kim and Choi, 1996). 또한 PB군에는 광합성세균을 중심으로 유산균, 효모균, 고초균, 방선균, 국균 등 주로 통기혐기성 또는 미 호기성인 미생물을 포함하고 있으며 PB는 장내 해로운 균의 번식을 억제하고(Perdigon et al., 1990; Jun et al., 1999), 장내 미생물 형성에 영향을 미쳐(Shahani and Ayebo, 1980) 장내 독소 제거에 의해 장 질환을 억제할 뿐만 아니라 비특이적 면역기능 강화(Jun et al., 1999; Shida et al., 1980), 혈중 콜레스테롤 저하(Rhim et al., 1993), 간 기능 항진작용(Beak, 1993), 항암작용(Kato et al., 1994; Kim and Han, 1995) 및 항산화작용(Kim and Ham, 2003; Kaizu et al., 1993)등의 다양한 효과가 있다. 이러한 점에서 최근 PB의 활용은 사육 대상 어류의 직접적인 건강증진은 물론 환경 즉 수질 개선의 측면에서 유용할 것으로 여겨지고 있다.

한편으로 현재까지 한약재를 이용한 많은 연구들에 의하면 한약재는 면역력, 생존율, 성장 및 사료효율을 향상시킨다고 알려져 있다(Tanimoto et al., 1993; Kim et al., 1996; Kwon et al., 1998; Hwang et al., 1999). 그러나 한약조제 과정에서 나오는 한약재 부산물(medicinal herb extracts, MHE)은 작물재배의 밑거름으로 사용하는 것 이외에는 대부분이 폐기처분되고 있다.

한편, 평위산은 오적산 소청룡탕 삼소음에 이어 4번째로 처방되는 다빈도 처방으로 현재 소화기질환에서 가장 다용되는 처방중의 하나로서, 위액분비감소와 위점막 손상 보호, 위와 소장 운동 증가 등의 효과가 있어 다양한 소화기질환에 응용되고 있는 한방제제이다(Korean J. Oriental Physiology & Pathology 24(1):22-25, 2010).

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 병원성세균, 박테리아에 대한 항균효과, 어류의 성장 촉진 및 면역증강 기능 효과를 통하여 질병 예방 및 생산성 향상 등의 기능을 수행할 수 있는 평위산 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하는 어류 양식용 사료첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 대표적인 일 측면에 따르면, 병원성세균, 박테리아에 대한 항균효과, 어류의 성장 촉진 및 면역증강 기능 효과를 통하여 질병 예방 및 생산성 향상 등의 기능을 수행할 수 있는 평위산 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하는 어류 양식용 사료첨가제를 제공한다.

본 발명의 여러 구현예에 따르면, 평위산 부산물 추출물, 또는 상기 평위산 부산물 추출물에 상기 프로바이오틱스를 첨가하여 발효시킨 발효물을 포함하는 경우, 어류의 각종 세균성 질병의 예방은 물론 항병력을 증가시키고 병원성 세균감염의 치료가 가능하므로 어류용 사료 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 밀집사육으로 인한 질병발생에 대한 면역력 강화로 저항성을 높이며, 천연 항생제 개념을 도입하여 항생제 잔류나 부작용을 예방하고, 전염병에 대한 저항성을 증진시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 평위산 추출물(MHE)의 농도에 따른 E. tarda(2×10⁸ CFU/㎖)에 대한 항균 활성 효과를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 평위산 추출물의 E. tarda , E. coli , L. garvieae, P. damsela 및 S. iniae에 대한 항박테리아 효과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 평위산 추출물의 (3A) Bacillus spp(B. licheniformis 및 B. subtilis), (3B) Lactobacillus spp(L. plantarum 및 L. paracasei) 및 (3C) Yeast spp(S. cerevisiae 및 P. anomala) 발효 효과를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 평위산 추출물 및 프로바이오틱스 혼합물의 E. tarda에 대한 항박테리아 효과를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 무처리군(C), 평위산 추출물(MHE), 프로바이오틱스(PB) 및 평위산 추출물 및 프로바이오틱스 혼합물(MHE+PB)을 첨가한 사료를 28일간 공급한 그룹의 ROI 활성 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 C, MHE, PB 및 MHE+PB의 4개의 그룹에 각각 28일간 사료를 공급한 후 측정된 Phagocytic activity(도 6A)와 phagocytic index (도 6B)의 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 C, MHE, PB 및 MHE+PB를 첨가한 사료를 28일간 공급 후에 측정한 lysozyme 활성 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 C, MHE, PB 및 MHE+PB의 4개의 그룹에 각각 28일간 사료를 공급한 후 측정된 SOD 활성 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 C, MHE, PB 및 MHE+PB를 첨가한 사료를 28일간 공급 후에 측정한 ACH₅₀ 활성 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따른 C, MHE, PB 및 MHE+PB의 4개의 그룹에 각각 28일간 사료를 공급한 후 7, 14, 21 및 28일째에 각각 혈청을 분리하여 SDS-PAGE를 이용하여 혈청 내 단백질의 변화를 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 구현예에 따른 C, MHE, PB 및 MHE+PB를 30일 동안 공급한 후 E. tarda에 대한 in vivo 항균효과 실험 결과를 나타내는 도면이다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

본 명세서에서 용어 프로바이틱스(생균제 : Probiotics)란 항생제에 상대적인 개념의 용어로써, 여러 종류의 정상 장내 세균총에서 병원성균에 대해 증식을 억제하는 항균력이 있는 물질로, 정상 장내 세균총의 균형을 유지하고 병원성 세균의 증식을 억제하는데 중요한 역할을 담당하는 물질을 의미한다.

또한, 본 명세서에서 '혼합발효물'은 평위산 부산물 추출물에 프로바이오틱스를 첨가한 후, 발효시킨 최종산물을 의미한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 평위산 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하는 어류 양식용 사료첨가제가 개시된다.

상기 평위산은 감초, 진피, 후박 및 창출로 이루어지는 것을 특징으로 하고, 상기 평위산은 건생강 및 대추를 더 포함할 수 있으며, 상기 평위산은 감초 10-15 중량%, 진피 20-30 중량%, 후박 15-25 중량% 및 창출 35-45 중량%를 포함하는 것을 특징으로 한다.

한편, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 평위산 부산물은 평위산을 물 또는 C₁-C₆ 알코올로 1차 추출한 후의 평위산 추출박인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 평위산 부산물 추출물은 평위산 추출박을 물 또는 C₁-C₆ 알코올로 1 내지 5회 재추출한 것을 사용할 수 있는데, 이때 물 또는 C₁-C₆ 알코올로 추출 시, 100-150 ℃의 온도에서 24시간 이상 추출하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 평위산 부산물 추출물에 프로바이오틱스를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

한편, 상기 평위산 부산물 추출물에 프로바이오틱스를 더 포함하는 경우, 발효 시키는 공정을 수행하는 것을 특징으로 한다.

상기 프로바이오틱스는 Bacillus licheniformis, Bacillus subtillis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Saccharomyces cerevisiae, pichia anomala 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 어류는 넙치, 우럭, 참돔, 민어, 숭어, 능성어 등의 해산어류 및 뱀장어, 송어, 쏘가리 등의 육상어류로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징한다.

바람직하게는, 넙치, 우럭, 참돔, 뱀장어 및 송어로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 평위산 부산물 추출물에 상기 프로바이오틱스를 첨가하는 경우, 바람직하게는 평위산 부산물 추출물에 상기 프로바이틱스를 첨가한 후, 발효시키는 공정을 수행하게 되면 어류의 각종 세균성 질병의 예방은 물론 항병력을 증가시키고 병원성 세균감염의 치료가 가능하므로 어류 또는 어패류 등의 해양 생물에 적용되어 어류 또는 어패류 등의 폐사율을 낮추고 생산성을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라, 해양 생물을 섭취하는 타 동물의 2차 감염을 예방할 수 있다.

상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배성 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하고, 구체적으로는 극피동물, 갑각류, 연체동물, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 성게류 또는 해삼류와 같은 극피동물, 절지동물에 속하는 게, 새우, 대하 등의 갑각류, 두족류, 복족류 또는 이매패류 등의 연체동물, 참돔, 도미, 대구, 가자미, 넙치 등의 어류, 꿩 또는 닭 등의 가금류를 포함하는 조류 또는 인간, 돼지, 소 염소 등의 포유류일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 평위산 부산물 추출물을 유효성분으로 포함하는 사료첨가제를 사료 전체 중량을 기준으로, 0.05-10 중량%의 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 어류 양식용 사료가 개시된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 사료는 평위산 부산물 추출물에 프로바이오틱스를 더 포함할 수 있고, 상기 평위산 부산물 추출물에 프로바이오틱스를 더 포함하는 경우, 발효 시키는 공정을 수행하여 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합발효물로 제조하여 사용하는 것을 특징으로 한다.

한편, 상기 어류 양식용 사료는 본 발명의 평위산 부산물 추출물, 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합물, 또는 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합발효물 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서의 평위산 부산물 추출물, 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합물, 또는 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합발효물을 포함하는 사료에는 식물성으로는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등이 있으며, 동물성으로는 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질, 동물성플랑크톤류, 어분 등이 있으며 이에 한정된 것은 아니다.

나아가, 본 발명에서의 평위산 부산물 추출물, 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합물, 또는 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합발효물을 포함하는 사료첨가제에는 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 향미제, 비단백질태질소화합물, 규산염제, 완충제, 추출제, 올리고당 등이 있다. 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며 이에 한정된 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 어류의 양식장에서, 평위산 부산물 추출물, 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합물, 또는 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합발효물을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류의 식방법이 개시된다.

본 발명에서 배양배지란, 동물세포, 식물세포, 또는 세균 등을 기르는데 필요한 영양소가 들어있는 배지를 의미하고, 배양액이란, 액체 배지에 균주를 접종하여 배양한 것을 의미한다. 상기 배양액은 균주를 포함한 것, 또는 균주를 접종하여 배양한 후 제균 즉 균주를 제거한 배양 여액일 수 있다. 상기 배양액의 농축액이란 상기 배양액을 농축한 것을 말하고, 상기 배양액의 건조물이란 상기 배양액의 물기를 없앤 것을 의미한다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 평위산 부산물 추출물, 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합물, 또는 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합발효물을 어류에 급이하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류의 비브리오 속 미생물(Vibrio sp .) 또는 에드워드시엘라 속 미생물(Edwardsiella sp.) 감염성 질병을 예방하는 방법이 개시된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 비브리오 앵길라움(Vibrio anguillarum)이고, 에드워드시엘라 속 미생물은 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda )인 것을 특징으로 한다.

상기 에드워드시엘라 균은 장내세균과의 세균인 그람 음성균으로 주로 어류에서 소화관의 장애를 일으키는 원인균이며, 특히 에드워드시엘라 타르다 균은 에드워드 병의 원인균이다.

상기 에드워드 병은 고수온기에 2년어 이상의 대형어류에 발생하며, 외관증상으로는 두부의 궤양, 복부의 팽만 또는 발적, 안구의 백탁 또는 돌출 등이 있고, 내부증상으로는 복수가 차있거나 생식소 특히 난소의 발적과 경화가 특징 등이 있으며, 이병에 의한 누적폐사율은 20 내지 30 % 에 달한다.

이러한 에드워드시엘라 타르다 균에 대한 항균효과가 본 발명에 따른 바실러스 서브틸러스 및 파지 혼합물에 의해서 확인되었고, 비 특이적 면역반응 활성이 우수한 것으로 확인되었다. 특히, 펩티도글리칸(peptidoglycan)이라는 서균의 세포벽 성분을 분해하는 작용을 하는 리소자임(lysozyme) 활성을 측정한 결과, 평위산 부산물 추출물에 대한 리소자임 활성보다 매우 우수한 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 평위산 부산물 추출물, 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합물, 또는 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합발효물을 유효성분으로 함유하는 사료를 어류에 급여하는 단계를 포함하는 어류의 장내 유해 미생물 억제 및 면역 증진 방법이 개시된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 사료는 어류 체중의 2 중량% 이하의 양으로 투여하는 것을 특징으로 한다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

1. 유용 미생물( PB ) 분리 및 동정

PB의 분리를 위하여 배추김치, 열무김치, 파김치, 파인애플 박, 분뇨 등의 다양한 샘플을 수집 하였다. 샘플 속의 PB를 분리하기 위해 1차적으로 선택 배지를 사용하여 배양하였다. 사용 된 선택배지는 Bacillus 동정용인 Luria Bertani broth(LB, Difco), 유산균 동정용인 Lactobacilli MRS broth(MRS, Difco), 효모 동정용인 YM broth & Potato dextrose broth(PDB, Difco)를 사용하였다. 수집된 샘플은 PBS를 이용하여 10배수씩 단계 희석한 후 100 ㎕씩 각 배지에 도말하였다. 또한 고형물들은 강하게 교반한 후 위와 같은 방법으로 각 배지에 도말하였으며 37 ℃에서 24시간 또는 48시간을 배양 한 후 일차적으로 Bacillus, Lactobacillus 및 Yeast 등의 형태학적 특성에 근거하여 분리하고 단일집락 형태가 서로 다른 균주들을 선택하여 순수 분리하였다. 또한 PB를 평판배지에 계대배양을 실시하고 정확한 동정을 위하여 단일집락 형태에 따라 Bacillus spp. 2종, Lactobacillus spp. 2종, Yeast spp. 2종을 선정하여 16S-rRNA sequencing & 18S rRNA ITS region sequencing을 하였다. DNA sequencing에 사용된 PB의 16S rRNA gene과 18S rRNA gene 대한 universal primer는 표 1에 나타내었다.

Universal primers for probiotics 16S rRNA

Primer Name	Objects	Primer Sequence 5' to 3'
27F	16S rRNA sequence amplification	AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R	16S rRNA sequence amplification	GGTTACCTTGTTACGACTT
ITS1	18S rRNA sequence amplification	TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS4	18S rRNA sequence amplification	TCCTCCGCTTATTGATATGC

PB의 동정결과는 표 3에 나타내었다. 배추김치 ,열무김치, 파김치, 파인애플 박, 분뇨 등에서 분리된 균주를 16S rRNA universal primer를 이용 한 염기 서열 분석 결과 Bacillus spp. 2종은 Genbank에 등록된 accession number KC757129.1와 AB743877.1로 B. subtilis와 B.licheniformis 로 16S ribosomal RNA gene과 100% 상동성을 나타내었고, Lactobacillus spp. 2종은 Genbank에 등록된 accession number JX426117.1와 JF965377.1로 L. plantarum과 L. paracasei로 16S ribosomal RNA gene과 100% 상동성을 나타내었고, Yeast spp. 2종은 Genbank에 등록된 accession number JN887919.1와 FJ865436.1로 S. cerevisiae와 P. anomala로 18S ribosomal RNA gene과 99%와 100% 상동성을 나타내었다.

Output of BLAST for probiotics supplemented in fish diets

Strains	Accession	Description	Score (bits)	Identities(%)	E value
B1	KC757129.1	Bacillus subtilis strain GRSW1_B1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence	2575	100	0
B-5	AB743877.1	Bacillus licheniformis gene for 16S rRNA, partial sequence, strain: BCJ	2556	100	0
L-1	JX426117.1	Lactobacillus plantarum strain CTBRBL22 16S ribosomal RNA gene, partial sequence	2582	100	0
L-2	JF965377.1	Lactobacillus paracasei strain BIM B-552D 16S ribosomal RNA gene, partial sequence	2623	100	0
Y-1	JN887919.1	Saccharomyces cerevisiae strain Wu-Y2 18S ribosomal RNA gene, partial sequence	1353	99	0
Y-2	FJ865436.1	Pichia anomala isolate M10 18S ribosomal RNA gene, partial sequence;	1029	100	0

2. 사용한 한약재 부산물( MHE )과 병원성 균주

1) MHE

MHE는 ㈜한풍제약에서 소화제 약제로 사용되고 남은 부산물을 100-120 ℃에서 24시간 정도 물을 이용하여 5:1의 비율로 중탕하여 얻은 추출액을 사용하였다. 소화제 약제의 원료 성분과 효능은 표 3에 나타내었다.

Kinds of medicinal herbs in extract and their efficacies

종류	속명	효능
감초(甘草)	Glycyrrhiza uralensis Fischer	해독작용, 간염, 두드러기, 피부염, 습진등에 효과, 소화성궤양 억제
건강(乾薑)	Zingiber officinale Roscoe	위액분비촉진, 연동작용 활성화, 진통작용, 항염, 억균작용.
진피(陳皮)	Citrus unshiu Markovich	비장기능강화, 복부창만, 구토, 메스꺼움, 소화불량에 효능
후박(厚朴)	Magnolia officinalis Rehder et. Wilson	소화촉진, 담제거
창출(蒼朮)	Atractylodes chinensis Koidzumi	소화장애나 위장기능 허약증상 치료

2) 병원성 균주

본 연구에서 사용된 E. tarda (KCTC 12267)는 Korean Collection for Type Culture(KCTC)로부터 분양받았다. 분양받은 균주는 brain heart infusion(BHI) broth 와 Salmonella shigella(SS) agar를 이용하여 2차 계대 배양 한 후 사용하였다.

3. 실험어

군산대학교 부속양식장으로부터 평균체중이 약 100±20 g의 나일 틸라피아(Oreochromis niloticus) 200마리를 분양받았다. 분양받은 틸라피아를 1 ton의 원형수조에 수온 23-25 ℃에서 1주일간 순치시킨 후 실험에 사용하였다.

4. In vitro 항균효과 및 발효효과 실험

1) MHE의 농도별 항균효과

In vitro 1차 실험은 50 ㎖ tube에 MHE를 원액, 2배, 5배 및 10배로 각각 희석하여 10 ㎖씩 분주한 뒤 E. tarda를(2×10⁸ CFU/㎖) 100 ㎕를 접종하였다. 모든 sample은 30 ℃에서 배양하였고 배양 후 0, 6, 12, 24, 36시간 및 48시간째에 각각의 sample을 SS 배지를 이용하여 평판도말법으로 E. tarda의 생균수를 측정하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, MHE를 원액, 2배, 5배 및 10배로 희석하여 E. tarda에 대한 in vitro 항균효과를 조사한 실험 결과, 6시간째에 원액과 2배 희석된 MHE의 샘플에서 E. tarda의 생균수가 감소하기 시작되었다. 반면 5배와 10배로 희석된 MHE의 샘플에서는 E. tarda의 생균수가 감소하지 않고 조금 증가하는 것으로 나타났다. 원액의 MHE 샘플은 24시간째에 E. tarda의 생균수가 완전히 소멸되어 24시간, 36시간 및 48시간에서 E. tarda의 생균수는 나타나지 않았다. 2배로 희석된 MHE 샘플은 6시간째에 조금 감소하였지만 12시간째에서는 거의 감소하지 않고 24, 36 및 48시간째 모두 아주 미미한 E. tarda의 생균수의 감소를 보여주었다. 5배로 희석된 MHE 샘플에서는 12시간째에 E. tarda의 생균수가 조금 감소하였지만 24, 36 및 48시간째에는 E. tarda의 생균수의 변화가 거의 없었다. 10배로 희석된 MHE 샘플은 12시간째보다 24시간째에 E. tarda의 생균수가 조금 감소하였지만 36시간과 48시간째에 E. tarda의 생균수의 변화가 나타나지 않았다.

2) 병원성 bacteria에 대한 MHE의 항균효과

In vitro 2차 실험은 50 ㎖ tube에 MHE 원액을 10 ㎖씩 분주한 뒤 병원성 bacteria 5종(Lactococcus garvieae, Streptococcus iniae, Photobacterium demsella, Edwardsiella tarda, Escherichia coli)을 각각(2×10⁸ CFU/㎖) 100 ㎕씩 접종하였다. 모든 sample은 30 ℃에서 배양하였고 배양 후 0, 6, 12, 24, 36시간 및 48시간째에 각각의 sample을 BHI 와 SS 배지를 이용하여 병원성 박테리아의 생균수를 평판도말법으로 측정하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 병원성 bacteria 5종(L. garvieae, S. iniae, P.demsella, E. tarda, E. coli)에 대한 MHE의 in vitro 항균효과를 조사한 실험 결과는 도 2에 나타내었다. MHE는 모든 샘플에서 원액을 사용하여 실험한 결과 병원성 bacteria 5종 모두 유사한 패턴을 보여주었다. L. garvieae, S. iniae, P. demsella, E. tarda, E. coli 5종 모두 6시간째부터 각 균주 생균수의 감소를 보여주었으며 24시간째에는 급격히 감소하여 각 균주의 생균수가 완전히 소멸되어 24시간, 36시간, 48째까지 각 균주의 생균수는 검출되지 않았다.

3) PB에 대한 MHE의 발효효과

In vitro 3차 실험은 50 ㎖ tube에 MHE 원액을 10 ㎖씩 분주한 뒤 PB 6종(Bacillus licheniformis, Bacillus sebtillis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Saccharomyces cerevisiae, pichia anomala)을 각각(2×10⁸ CFU/㎖) 100 ㎕를 접종하였다. 모든 sample은 30 ℃에서 배양하였고 배양 후 0, 6, 12, 24, 36시간 및 48시간째에 각각의 sample을 LB, MRS 및 YM & PDB 배지를 이용하여 평판도말법으로 PB의 생균수를 측정하였다.

도 3A, 3B 및 3C는 PB 6종(B. licheniformis, B. sebtillis, L. plantarum, L. paracasei, S. cerevisiae, p. anomala)을 각각 MHE 원액에 접종하여 각각 생균수의 변화를 관찰한 결과이다. PB 6종은 모두 유사한 패턴으로 나타났다. Bacillus 2종(도 3A)의 결과는 24시간째까지 생균수가 조금씩 감소하는 경향을 보이다가 36시간째에서부터 생균수가 증가하는 것으로 나타났다. Lactobacillus 2종(도 3B)중 L. paracasei는 24시간까지 대체적으로 생균수가 감소하였으나 36시간째에는 생균수가 0시간째의 생균수보다 더 많이 증가하는 것으로 나타났다. L. plantarum은 12시간까지 생균수가 감소하다가 L. paracasei 조금 더 빠르게 24시간째부터 생균수가 증가하기 시작하여 48시에는 많은 수의 생균수가 관찰되었다. Yeast 2종(도 3C) 모두 유사하게 24 시간까지 생균수가 감소하였으나 36 시간째부터 생균수가 급격히 증가하는 것으로 나타났다.

4) MHE와 PB의 항균효과

In vitro 4차 실험은 6개의 sample로 나누어 실험을 수행하였다. 첫 번째 sample은 MHE 10 ㎖에 PB 3종(B. sebtillis, L. paracasei, S. cerevisiae)을 각각(2×10⁸ CFU/㎖) 100 ㎕를 접종한 뒤, 3일 동안 발효(fermentation, FER)시킨 후에 E. tarda를(2×10⁸ CFU/㎖) 100㎕ 접종(MHE+PB/FER)하였고, 두 번째 sample은 MHE 10 ㎖에 PB 3종(B. subtillis, L. paracasei, S. cerevisiae)을 각각(2×10⁸ CFU/㎖) 100 ㎕씩 접종하고 E. tarda를 각각(2×10⁸ CFU/㎖) 100 ㎕ 접종(MHE+PB)하였다. 세 번째 sample은 BHI broth 10 ㎖에 PB 3종(B. sebtillis, L. paracasei, S. cerevisiae)을 각각(2×10⁸ CFU/㎖) 100 ㎕ 접종하고 E. tarda를(2×10⁸ CFU/㎖) 100 ㎕ 접종(BHI+PB)하였고, 네 번째 sample은 MHE 10㎖에 E. tarda를(2×10⁸ CFU/㎖) 100 ㎕ 접종(MHE)하였고, 다섯 번째 sample은 양성대조군으로써 BHI broth 10 ㎖에 E. tarda를(2×10⁸ CFU/㎖) 100 ㎕ 접종(positive control)하였고, 마지막으로 여섯 번째 sample은 음성대조군으로써 BHI broth 10㎖에 E. tarda를(2×10⁸ CFU/㎖) 100 ㎕ 접종한 뒤 autoclave를 이용하여 고압멸균(negative control)시켜주었다. 6개의 모든 sample은 35 ℃에서 배양하였고 배양 후 0, 6, 12, 18, 24, 36시간 및 48시간째에 각각의 sample에서 SS 배지에 평판도말법을 이용하여 E. tarda의 생균수를 측정하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, E. tarda에 대한 MHE, PB, MHE+PE 및 MHE+PB/FER sample의 in vitro 항균효과를 조사한 실험 결과, negative control에서는 생균수가 0시간째부터 48시간째까지 관찰되지 않았고 positive control은 6시간째부터 48시간째까지 계속적으로 증가 하였다. 한편 MHE와 MHE+PB는 6시간째부터 18시간째까지 유사하게 감소하다가 24시간째부터 36시간과 48시간에서 E. tarda의 생균수가 검출되지 않았다. BHI+PB는 18시간째까지 E. tarda의 생균수가 계속 증가하다가 24시간째부터 조금씩 감소하는 것으로 나타났다. MHE+PB/FER는 6시간째까지 E. tarda의 생균수가 검출되었으나 12시간째에 E. tarda의 생균수가 급격히 감소하여 12, 18, 24, 36 및 48시간째에 E. tarda의 생균수가 완전히 소멸된 것이 확인되었다.

5. 실험 사료 및 실험설계

1) 실험 사료

본 연구에서는 기초사료로 ㈜천하제일사료에서 양어사료를 구입하여 사용하였다. 실험에 사용된 사료는 4가지로 제조하여 사용하였다. 첫 번째 사료는 MHE 40%를 기초사료에 첨가하여 호기성 조건으로 37 ℃ incubator에서 3일간 발효시킨 후 건조(MHE)하여 사용하였다. 두 번째 사료는 PB 6종(B. licheniformis, B. sebtillis, L. plantarum, L. paracasei, S. cerevisiae, p. anomala)을 각각(2×10⁸ CFU/g)을 첨가하여 호기성 조건으로 37 ℃ incubator에서 3일간 발효시킨 후 건조(PB)하여 사용하였다. 세 번째 사료는 MHE에 PB 6종(B. licheniformis, B. sebtillis, L. plantarum, L. paracasei, S. cerevisiae, p. anomala)을 각각(2×10⁸ CFU/g)을 배양 한 후에 기초사료에 첨가하여 호기성 조건으로 37 ℃ incubator에서 3일간 발효시킨 후 건조(MHE+PB)하여 사용하였다. 네 번째 사료는 아무것도 첨가하지 않은 기초사료(C)를 사용하였다. 사료공급 전까지 4 ℃에서 보관한 후 실험에 사용하였다.

2) 실험 설계

MHE와 PB가 나일 틸라피아의 성장률과 선천성 면역반응 및 항균효과에 미치는 영향을 알아보기 위해 실험을 수행하였다. 선천성 면역반응 실험은 MHE와 PB가 혼합된 첨가사료(MHE+PB)를 급이 하는 그룹, PB만 급이 하는 그룹, MHE만 급이 하는 그룹 및 기초사료(C)만 급이 하는 대조군 그룹의 4개 그룹으로 나누어 80 ℓ 수조에 그룹당 각각 24마리씩 수용하였다. 각각 제조된 사료는 28일간 공급 하였으며 sample 수집은 사료공급 후 7, 14, 21 및 28일째에 수집하였다. 성장률 실험은 선천성 면역반응 실험과 동일하게 사료를 급이 하고 7, 14, 21 및 28일째에 각 그룹의 무게를 측정하였다. 항균효과 실험은 성장률과 선천성 면역반응 실험과 동일하게 사료를 제조하여 30일간 사료를 공급 후에 공격접종 후 0, 7, 14 및 21일째에 샘플을 수집하였고 공격접종 후에도 계속적으로 사료를 공급해주었다.

6. 성장률

MHE와 PB가 나일 틸라피아의 성장률에 미치는 영향을 조사하기 위해 실험을 수행하였다. 총 4그룹(C, MHE, PB, MHE+PB)을 각각 6마리씩 한 그룹당 3그룹으로 나누어 사료를 공급하기 전 최초 무게를 측정하였으며 7, 14, 21 및 28일간 사료를 공급한 후 최종 무게를 측정하여 각각의 총 증체량을 사육수조수로 나누어 1미 당 최종무게로 산출하였다. 최종무게를 측정 후 아래와 같은 공식을 이용하여 증체량(Weight gain), 증체율(Percent weight gain, PWG), 일일 성장률(Specific growth rate, SGR) 및 사료계수(Feed conversion ratio, FCR)를 산출하였다.

	DAYS	Treatments
	DAYS	Control	MHE	PB	MHE+PB
Initial weight(g)	0	116.67±1.67^a	116.67±1.67^a	116.67±1.67^a	116.67±1.67^a
Final weight(g)	7	120.83±0.01^a	122.22±2.41^a	123.61±2.41^ab	126.39±2.41^b
	14	127.78±2.41^a	129.17±4.17^a	131.93±2.41^ab	136.11±2.41^b
	21	132.5±4.33^a	137.5±4.17^a	140.28±2.41^a	148.61±4.81^b
	28	138.89±4.81^a	143.06±4.81^a	145.83±4.17^a	156.94±4.81^b
weight gain(g)	7	4.17±0.01^a	5.56±2.41^ab	6.94±2.41^ab	9.72±2.41^b
	14	11.11±2.41^a	12.5±4.17^a	15.28±2.41^ab	19.44±2.41^b
	21	15.83±4.33^a	16.67±4.17^a	19.44±6.36^ab	26.39±4.81^b
	28	22.22±4.81^a	26.39±4.81^a	29.17±4.17^a	40.28±4.81^b
PWG(%)	7	3.57±0.01^a	4.76±2.06^ab	5.95±2.06^ab	8.33±2.06^b
	14	9.52±2.06^a	10.71±3.57^a	13.10±2.06^ab	16.67±2.06^b
	21	13.57±3.71^a	17.86±3.57^a	20.24±2.06^ab	27.38±4.12^b
	28	19.05±4.12^a	22.62±4.12^a	25.00±3.57^a	34.52±4.12^b
SGR(%)	7	0.5±0.01^a	0.66±0.28^ab	0.82±0.28^ab	1.14±0.27^b
	14	0.65±0.14^a	0.72±0.23^a	0.88±0.13^ab	1.10±0.13^b
	21	0.60±0.15^a	0.78±0.14^ab	0.88±0.08^b	1.15±0.15^c
	28	0.62±0.13^a	0.73±0.12^a	0.80±0.1^a	1.06±0.11^b
FCR	7	1.68±0.01^a	1.4±0.48^ab	1.12±0.48^ab	0.75±0.16^b
	14	1.31±0.32^a	1.21±0.43^ab	0.93±0.16^ab	0.73±0.1^b
	21	1.39±0.33^a	1.32±0.34^a	1.18±0.44^a	0.82±0.17^a
	28	1.31±0.32^a	1.09±0.22^ab	0.97±0.14^ab	0.70±0.08^b

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, MHE를 첨가하여 발효시킨 사료(MHE), PB 6종을 첨가하여 발효시킨 사료(PB), MHE에 PB 6종을 첨가하여 발효시킨 사료(MHE+PB) 및 아무것도 첨가하지 않은 기초사료(C)를 7, 14, 21 및 28일간 공급하여 나타난 성장률 실험의 결과, MHE, PB, MHE+PB 및 C를 공급하여 28일 동안 나일 틸라피아를 사육한 결과 4그룹 모두 100% 생존하였다. 최초무게는 4그룹 모두 비슷했지만 최종무게, 증체량, 증체율, 일일성장률(SGR) 및 사료계수(FCR) 모두 유사하게 7, 14, 21 및 28일째 모두 MHE+PB를 처리한 그룹이 유의적으로 가장 높게 나타났으며, MHE와 PB를 처리한 그룹은 대조군에 비해 평균적으로는 높게 나타났지만 유의적인 차이는 없었다.

7. Sample 수집

1) 혈청 수집

혈청 수집을 위해 틸라피아의 미병부에서 혈액을 채취하였다. 혈액은 4 ℃에서 24시간 동안 응고시킨 후 1200 × g에서 5분간 원심분리 하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청은 lysozyme 활성, superoxide dismutase(SOD) 활성 및 alternative complement pathway(ACH₅₀) 활성 분석에 사용하였다.

2) 백혈구 분리

백혈구의 수집방법은 Santarem et al .,(1997)의 방법을 조금 수정하여 사용하였다. 백혈구 수집을 위해 틸라피아를 해부하여 신장을 적출하였다. 적출한 신장은 mesh에 통과시켜 잘게 쪼갠 후 Histopaque-1077(Sigma)을 이용하여 2500 × g에서 30분간 원심분리 한 후 buffy-coat층에서 백혈구를 수집하였으며 Dulbecco's modified Eagle' medium(DMEM)으로 30 × g에서 5분간 2회 세척하였다. 분리된 세포는 혈구계산판(FORTUNA, GERMANY)을 이용하여 세포수(10⁶cell/㎖)를 확인하였으며 세포를 이용한 모든 실험에 사용되었다.

8. 선천성 면역반응 실험

1) Reactive oxygen intermediates(ROI) 활성

비 특이적 면역반응의 일종으로 백혈구의 식세포 작용에 의해서 생기는 중간대사 산물인 활성산소의 생성 유무와 수준을 측정하기 위해 nitroblue tetrazolium(NBT)의 환원 능력을 조사하였다(Secombes et al., 1988). 신장에서 분리한 백혈구 200 ㎕를 96 well plate에 넣고 30 × g에서 5분간 원심분리 하였다. PBS로 2회 세척한 후 phorbol myristate acetate(PMA, 1㎍/㎖)를 첨가한 NBT(1㎍/㎖)를 각각 100 ㎕씩 첨가하여 25 ℃의 암실에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 30 × g에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거한 후 PBS를 첨가하여 2회 세척하였다. 세척 된 백혈구에 70% methanol로 고정하고 PBS로 2번 세척 후 120 ㎕ KOH와 140 ㎕ dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma)를 첨가 후 Micro plate reader(Sunrise, TECAN)로 620 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, C, MHE, PB 및 MHE+PB를 첨가한 사료를 28일간 공급한 그룹의 ROI 활성 결과를 나타내었다. MHE+PB를 첨가한 그룹이 C, MHE 및 PB를 첨가한 그룹에 비해 7, 14, 21 및 28일째 모두 ROI 활성이 유의성 있게 증가되었다. MHE와 PB를 첨가한 그룹은 MHP+PB를 첨가한 그룹보다 낮은 수치를 나타내었으나, 대조군 그룹보다는 7, 14, 21 및 28일째 모두 유의적으로 더 높은 결과를 나타내었다.

2) Phagocytosis 활성

백혈구의 phagocytic activity(PA)는 Pulsford et al.,(2012)의 방법을 참고하여 측정하였다. Chamber slide(Thermo scientific, Nunc)에 분리한 백혈구를 200 ㎕씩 분주한 후 25 ℃의 암실에서 12시간 동안 배양하였다. 배양 후에 zymosan(1×10⁶cell/㎖, Sigma)을 well당 10 ㎕씩 분주한 후 25 ℃의 암실에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후에 30 × g에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거한 후 PBS를 첨가하여 2회 세척하였다. 세척 된 백혈구를 70% methanol로 고정하고 30 × g에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다. Camber slide의 덮개와 well을 분리하여 상온에서 건조시킨 후 고무를 제거하여 다시 건조 시켜주었다. 건조 후에 wright giemsa stain염색 용액을 첨가하여 2분간 염색하고, wright giemsa stain염색액이 있는 상태에서 완충액을 같은 양을 첨가하여 4분간 처리하였다. 물로 충분히 세척하여 여분의 염색액을 완전히 제거한 후 건조 시켜주었다. 건조 후에 광학현미경(Olympus)으로 검경하였다. 무작위로 100마리의 백혈구 숫자를 센 후 zymosan을 잡아먹은 백혈구의 수를 세어 아래와 같은 공식을 이용하여 PA를 구하였고 식세포작용을 한 백혈구의 숫자를 zymosan의 수로 나누어 phagocytosis index(PI)를 구하였다.

도 6A 및 6B에 나타낸 바와 같이, C, MHE, PB 및 MHE+PB의 4개의 그룹에 각각 28일간 사료를 공급한 후 측정된 PA와 PI의 결과, PA는 MHE+PB를 첨가한 그룹이 대조군에 비해 7, 14, 21 및 28일째 모두 높은 유의적인 차이를 보여주었다. 반면 MHE와 PB를 첨가한 그룹과는 7, 14, 21 및 28일째에 평균적인 차이는 나타났지만 유의적인 차이는 나타나지 않았다. MHE와 PB를 첨가한 그룹은 대조군 그룹과 평균적인 차이가 나타났지만 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. PI는 C, MHE, PB 및 MHE+PB의 4개 그룹이 7, 14, 21 및 28일째 모두 유의적인 차이가 없었다.

3) Lysozyme 활성

채취한 혈청을 이용하여 Sheikhzadeh et al.,(2012)의 방법을 응용하여 분석하였다. 96 well plate에 0.2M citrate phosphate buffer(pH 5.8)에 2 mg/㎖의 Micrococcus lysodeikticus(Sigma)를 부여시킨 용액을 well당 70 ㎕와 혈청 30 ㎕를 분주한 후 30초부터 10분 30초까지 반응시켜 감소하는 흡광도의 양을 Micro plate reader(Sunrise, TECAN) 405 nm에서 측정하였다. 이때 1 unit은 분당 0.001의 흡광도가 감소하는 양으로 표현하였다.

도 7에 나타낸 바와 같이, C, MHE, PB 및 MHE+PB를 첨가한 사료를 28일간 공급 후에 측정한 lysozyme 활성 결과, MHE+PB를 첨가한 그룹은 시간이 지날수록 점점 lysozyme 활성도가 높아졌으며 C, MHE 및 PB를 첨가한 그룹보다 7, 14, 21 및 28일째 모두 유의적으로 높은 수치를 나타내었다. 반면, MHE와 PB를 첨가한 그룹은 MHE+PB를 첨가한 그룹보다 낮은 lysozyme 활성을 나타내었지만 대조군과 비교했을 때 7, 14, 21 및 28일째 모두 유의적으로 높은 수치를 나타내었다.

4) Superoxide dismutase(SOD) 활성

SOD의 활성 분석에 사용한 샘플은 상품화된 SOD assay kit(Biovision co, korea) 의 방법에 따라 샘플을 수집하였다. SOD 분석에 있어 과산화물음이온은 수용성 formazan 염료를 생성하는 xanthine(Sigma) 및 NBT(Sigma)를 이용하였다. 과산화물 음이온의 생성은 xanthine과 xanthine oxidase(XOD, 1unit/㎖)의 활동에 의해 생성되어 이것은 SOD에 의해 억제된다. 96 well plate에 SOD assay kit(Biovision co, korea)의 시약을 첨가하여 37 ℃에서 20분간 반응시킨 후에 Micro plate reader(Sunrise, TECAN)로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 후에 하기 수학식 7를 이용하여 SOD activity를 구하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이, C, MHE, PB 및 MHE+PB의 4개의 그룹에 각각 28일간 사료를 공급한 후 측정된 SOD 활성 결과, MHE+PB를 첨가한 그룹이 C를 공급한 그룹에 비해 7, 14, 21 및 28일째 모두 높은 유의적인 차이를 보여주었지만 MHE와 PB를 첨가한 그룹과는 7, 14, 21 및 28일째 모두 평균적인 차이는 나타났지만 유의적인 차이는 나타나지 않았다. MHE와 PB를 첨가한 그룹은 대조군과 평균적인 차이가 나타났지만 유의적인 차이는 관찰되지 않았다.

5) Alternative complement pathway(ACH₅₀) 활성

ACH₅₀ 활성은 Yano,(1992c)의 방법을 이용하여 분석하였다. 토끼의 혈액을 귀의 정맥혈관에서 채취하여 Histopaque-1077을 이용하여 적혈구만을 분리하였다. 분리된 토끼의 적혈구를 PBS로 2회 washing한 후 0.01 M EGTA-Mg-Gelatin veronal buffer(EGTA-Mg-GVB)로 희석하여 1×10⁸ cell/㎖의 농도로 조절하여 사용하였다. 틸라피아의 혈청을 EGTA-Mg-GVB로 1:15의 농도로 희석한 후 96well plate에 well당 200, 150, 125, 100, 75 ㎕씩 분주하고 EGTA-Mg-GVB로 각각의 well의 총량이 200 ㎕가 되도록 맞춰주었다. 그 다음 분리된 토끼 적혈구(1×10⁸ cell/㎖)를 각각의 well에 100 ㎕씩 분주하여 25 ℃ incubator에서 1시간 동안 반응시킨 후 30 × g 에서 4 ℃에서 5분간 원심분리 한 다음 각각의 well에서 상청액 100 ㎕를 채취하여 Micro plate reader(Sunrise, TECAN)를 이용하여 405 ㎚에서 측정하였다. 용혈된 적혈구(Y)는 Y/(1-Y) 공식을 이용하여 50%의 haemolysis(ACH₅₀)을 계산한 뒤 unit/ml를 산출하였다.

도 9에 나타낸 바와 같이, C, MHE, PB 및 MHE+PB를 첨가한 사료를 28일간 공급 후에 측정한 ACH₅₀ 활성 결과, C, MHE, PB 및 MHE+PB의 4그룹 모두 7일째에 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 하지만 14일째에는 MHE+PB를 첨가한 그룹이 C를 공급한 그룹에 비해 14, 21 및 28일째에 유의적으로 높은 수치의 ACH₅₀ 활성을 나타내었다. 하지만 MHE와 PB를 첨가한 그룹이 대조군과 비교했을 때 14, 21 및 28일째 모두 평균적으로는 높게 나타났지만 유의적인 차이는 없었다.

9. SDS - PAGE

Sodium dodecyl sulphate polyacrlamide gel elecrophoresis(SDS-PAGE) 는 reducing 상태로 Mini-Protean elecrophoresis system(BioRad^ㄾ, USA)을 이용하여 Laemmli,(1970)의 방법을 참고하여 진행하였다. 틸라피아의 혈청을 SDS를 이용하여 음전하로 치환하고 2×sample buffer(0.5 M Tris, 10% SDS, 20% glycerol, 2-mercaptoethanol, 1% bromophenol blue)와 1:1로 섞었다. 이를 100 ℃에서 5분간 처리함으로서 단백질들의 이황화결합을 끊어 순수하게 단백질 크기로만 분리되도록 하였다. 샘플을 넣어주고 12% acrylamide gel에 200 V, 100 mA로 약 90분간 전기영동 하였다. 이때 사용한 running buffer(0.3% trizma base, 1.44% glycine, 10% SDS)는 일주일 단위로 신선한 것으로 교체하여 사용하였다. 이렇게 해서 얻어진 gel을 1% coomassie brilliant Gduatordordmfh dir 1시간 정도 염색하고 detaining buffer(10% acetic acid, 50% methanol)을 이용하여 약 1시간 30분 정도 탈색하였다. 그리고 gel은 gel dry-film에 부착시켜 24시간 정도 자연 건조하여 취급과 보관이 쉽도록 하였다.

도 10에 나타낸 바와 같이, C, MHE, PB 및 MHE+PB의 4개의 그룹에 각각 28일간 사료를 공급한 후 7, 14, 21 및 28일째에 각각 혈청을 분리하여 SDS-PAGE를 이용하여 혈청 내 단백질의 변화를 관찰한 결과, 7일째의 단백질 수준은 C, MHE, PB 및 MHE+PB의 4그룹 모두 큰 차이를 나타내지 않았다. MHE+PB그룹이 C그룹에 비해 14일째에 약 100-120 kDa 사이에서 소량의 단백질 증가를 보였으나 큰 차이를 나타내지 않았다. 21일째에는 MHE+PB 그룹이 C, MHE 및 PB의 3그룹에 비해 약 196 kDa와 120 kDa에서 확연한 단백질의 증가를 나타내었다. 28일째에는 MHE+PB그룹과 PB그룹이 120 kDa에서 C와 MHE그룹에 비해 높은 단백질의 증가를 나타내었다.

10. In vivo 항균효과 실험

나일 틸라피아의 E. tarda 인위적 감염 시 MHE와 PB가 생체 내에서 미치는 항균효과를 알아보기 위해 실험을 수행하였다. 4개의 그룹으로 나누어 80 ℓ 수조에 각각 24마리씩 수용하였다. MHE, PB, MHE+PB 및 C를 각각의 그룹에 30일간 공급한 후 1일간 절식시켜 E. tarda(1×10⁸ CFU/㎖)를 틸라피아의 복강에 주사하였다. 주사 이후 21일 동안 각각의 사료를 공급하였다. 주사 후 0, 7, 14 및 21일째에 각각 group에서 6마리씩 모든 장기를 적출하였다. 적출된 장기에 멸균된 PBS 10 ㎖을 혼합하여 균질화한 후 거즈를 이용해서 1000 × g 로 원심분리하여 착즙하였다. 그 후 착즙부유액을 멸균된 PBS로 1:10으로 단계 희석하여 SS 배지에 평판도말법으로 E. tarda의 생균수를 측정하였다.

도 11에 나타낸 바와 같이, C, MHE, PB 및 MHE+PB를 30일 동안 공급한 후 E. tarda에 대한 in vivo 항균효과 실험 결과, MHE+PB를 공급한 그룹은 공격접종 이후 7, 14 및 21일째 모두 C와 MHE를 공급한 그룹에 비해 유의성 있는 E. tarda의 생균수 감소를 나타내었다. MHE+PB를 공급한 그룹과 PB를 공급한 그룹은 공격접종 이후 7, 14 및 21일째 모두 평균적인 생균수의 감소를 보여주었지만 유의적인 차이는 나타나지 않았다. MHE를 공급한 그룹은 C를 공급한 그룹에 비해 공격접종 이후 7, 14 및 21일째 모두 평균적으로 높은 생균수의 감소를 보여주었지만 유의적인 차이는 없었다.

한편, 실험데이터로 따로 제시하지는 않았지만, 감초, 건강, 진피, 후박 및 창출 각각을 E. tarda에 대한 in vivo 항균효과 실험 결과, 본 발명에 따른 MHE 및 MHE+PB를 공급한 그룹보다 생균수 감소율이 약 1000배 낮은 것으로 확인됨에 따라 어류의 각종 세균성 질병의 예방은 물론 항병력을 증가시키고 병원성 세균감염의 치료가 가능하므로 어류용 사료 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 밀집사육으로 인한 질병발생에 대한 면역력 강화로 저항성을 높이며, 천연 항생제 개념을 도입하여 항생제 잔류나 부작용을 예방하고, 전염병에 대한 저항성을 증진시킬 수 있다.

11. 통계 처리

데이터를 평균과 표준편차(MeanㅁS.D.)로 표현하였으며 SPSS12.0 통계분석프로그램의 one-way ANOVA를 실시 후 Duncan's multiple range test를 이용하여 유의성 검정을 실시하였다. 각 그룹간의 유의성의 판단 기준은 P < 0.05일 경우 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

Claims

평위산 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하고,
상기 평위산은 감초 10-15 중량%, 진피 20-30 중량%, 후박 15-25 중량% 및 창출 35-45 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류 양식용 사료첨가제.
삭제
제1항에 있어서,
상기 평위산은 건생강 및 대추를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
삭제
제1항에 있어서,
상기 평위산 부산물은 평위산을 물 또는 C₁-C₆ 알코올로 1차 추출한 후의 평위산 추출박인 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제1항에 있어서,
상기 평위산 부산물 추출물은 평위산 추출박을 물 또는 C₁-C₆ 알코올로 1 내지 5회 재추출한 것임을 특징으로 하는 사료첨가제.
제1항에 있어서,
상기 평위산 부산물 추출물에 프로바이오틱스를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제7항에 있어서,
상기 평위산 부산물 추출물에 프로바이오틱스를 더 포함하는 경우, 발효 시키는 공정을 수행하는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제7항에 있어서,
프로바이오틱스는 Bacillus licheniformis, Bacillus subtillis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Saccharomyces cerevisiae, pichia anomala 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제1항에 있어서,
상기 어류는 넙치, 우럭, 참돔, 민어, 숭어, 능성어 등의 해산어류 및 틸라피아, 뱀장어, 송어, 쏘가리 등의 육상어류로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
평위산 부산물 추출물을 유효성분으로 포함하는 사료첨가제를 사료 전체 중량을 기준으로, 0.05-10 중량%의 비율로 혼합하고,
상기 평위산은 감초 10-15 중량%, 진피 20-30 중량%, 후박 15-25 중량% 및 창출 35-45 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류 양식용 사료.
제11항에 있어서,
상기 사료는 평위산 부산물 추출물에 프로바이오틱스를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 사료.
제12항에 있어서,
상기 평위산 부산물 추출물에 프로바이오틱스를 더 포함하는 경우, 발효 시키는 공정을 수행하는 것을 특징으로 하는 사료.
제12항에 있어서,
상기 프로바이오틱스는 Bacillus licheniformis, Bacillus subtillis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Saccharomyces cerevisiae, pichia anomala 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 사료.
어류의 양식장에서, 평위산 부산물 추출물, 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합물, 또는 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합발효물을 처리하는 단계를 포함하고,
상기 평위산은 감초 10-15 중량%, 진피 20-30 중량%, 후박 15-25 중량% 및 창출 35-45 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류의 양식방법.
평위산 부산물 추출물, 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합물, 또는 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합발효물을 어류에 급이하는 단계를 포함하고,
상기 평위산은 감초 10-15 중량%, 진피 20-30 중량%, 후박 15-25 중량% 및 창출 35-45 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류의 비브리오 속 미생물 또는 에드워드시엘라 속 미생물 감염성 질병을 예방하는 방법.
제16항에 있어서,
상기 비브리오 속 미생물은 비브리오 앵길라움이고, 에드워드시엘라 속 미생물은 에드워드시엘라 타르다인 것을 특징으로 하는 감염성 질병을 예방하는 방법.
평위산 부산물 추출물, 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합물, 또는 평위산 부산물 추출물 및 프로바이오틱스 혼합발효물을 유효성분으로 함유하는 사료를 어류에 급여하는 단계를 포함하고,
상기 평위산은 감초 10-15 중량%, 진피 20-30 중량%, 후박 15-25 중량% 및 창출 35-45 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류의 장내 유해 미생물 억제 및 면역 증진 방법.
제18항에 있어서,
상기 사료는 어류 체중의 2 중량% 이하의 양으로 투여하는 것을 특징으로 하는 장내 유해 미생물 억제 및 면역 증진 방법.