KR20240056582A - 피리미딘 헤테로사이클릭 화합물의 결정형 및 이의 제조 방법 - Google Patents

피리미딘 헤테로사이클릭 화합물의 결정형 및 이의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20240056582A
KR20240056582A KR1020247011544A KR20247011544A KR20240056582A KR 20240056582 A KR20240056582 A KR 20240056582A KR 1020247011544 A KR1020247011544 A KR 1020247011544A KR 20247011544 A KR20247011544 A KR 20247011544A KR 20240056582 A KR20240056582 A KR 20240056582A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compound
added
crystalline form
compounds
assay
Prior art date
Application number
KR1020247011544A
Other languages
English (en)
Inventor
양양 수
지쿠이 선
웬타오 우
양 장
슈후이 첸
Original Assignee
디3 바이오 (우씨) 컴퍼니, 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 디3 바이오 (우씨) 컴퍼니, 리미티드 filed Critical 디3 바이오 (우씨) 컴퍼니, 리미티드
Publication of KR20240056582A publication Critical patent/KR20240056582A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/04—Ortho-condensed systems
    • C07D491/044—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring
    • C07D491/052—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring the oxygen-containing ring being six-membered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D419/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen, oxygen, and sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D419/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen, oxygen, and sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D419/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen, oxygen, and sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/13—Crystalline forms, e.g. polymorphs

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Abstract

본 발명은 피리미딘 헤테로사이클릭 화합물의 결정형 및 그에 대한 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로 화학식(II)의 화합물 및 이의 결정형에 대한 제조 방법 및 이의 적용이 개시되어 있다:

Description

피리미딘 헤테로사이클릭 화합물의 결정형 및 이의 제조 방법
본 출원은 2021년 9월 10일자 출원된 제CN202111062619.1호; 및 2022년 8월 26일자 출원된 제CN202211034826.0호의 우선권을 주장한다.
본 발명은 피리미도헤테로사이클릭 화합물 계열의 결정형 및 이의 제조 방법, 구체적으로 화학식(II)로 나타내는 화합물 및 이의 결정형의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
RAS 종양유전자 돌연변이는 인간 종양의 30%에서 발생하는, 인간 암에서 가장 통상적인 활성화 돌연변이이다. RAS 유전자 패밀리는 3개의 하위유형(KRAS, HRAS, 및 NRAS)을 포함하며, 이 중에서 RAS-유도 암의 85%는 KRAS 하위유형에서의 돌연변이에 의해 야기된다. KRAS 돌연변이는 폐 선암종, 췌장 관 암종, 및 결장직장암 등과 같은 고형 종양(solid tumor)에서 통상적으로 발견된다. KRAS 돌연변이화 종양에서, 종양유전자 돌연변이의 80%는 코돈 12에서 발생하며, 가장 통상적인 돌연변이는 p.G12D(41%), p.G12V(28%), 및 p.G12C(14%)를 포함한다.
KRAS 유전자의 전체 명칭은 커스틴(Kirsten) 래트 육종 바이러스종양유전자 상동체이다. KRAS는 세포 성장의 신호전달 조절에서 중추적 역할을 한다. EGFR(ErbB1), HER2(ErbB2), ErbB3, 및 ErbB4와 같은 업스트림 세포 표면 수용체는 외부 신호를 수신한 후에 RAS 단백질을 통해 다운스트림으로 신호를 전달할 것이다. KRAS 단백질이 활성화되지 않는 경우, 그것은 GDP(구아노신 디포스페이트)에 강하게 결합한다. SOS1과 같은 구아노신 교환 인자에 의해 활성화된 후에, KRAS 단백질은 GTP(구아노신 트리포스페이트)에 결합하고 키나제 활성 상태가 된다. 유전자 돌연변이 후에, KRAS는 성장 및 증식을 위한 신호를 업스트림 성장 인자 수용체 신호에 독립적으로 다운스트림 경로에 독립적으로 전달할 수 있으며, 이는 제어되지 않는 세포 성장 및 종양 진행을 야기한다. 한편, KRAS 유전자가 돌연변이를 갖는지 여부는 또한 종양 예후의 중요한 지표이다.
KRAS는 최초로 발견된 종양유전자이지만, 그것은 오랫동안 약물 치료가 불가능한 표적으로 간주되어 왔다. 2019년까지, Amgen 및 Mirati Therapeutics는 그들의 소분자 KRAS 저해제 AMG510 및 MRTX849의 임상 연구 결과를 연이어 공개했으며, 이는 종양의 임상적 치료에 있어서 KRAS 저해제의 임상적 유효성을 최초로 확인했다. AMG 510 및 MRTX849 둘 모두는 KRAS G12C 돌연변이체 단백질의 시스테인 잔기와 비가역적 공유 결합을 형성함으로써 KRAS 활성을 저해하는 비가역적 소분자 저해제이다.
KRAS는 세포 성장의 신호전달 조절에서 중추적 역할을 한다. EGFR(ErbB1), HER2(ErbB2), ErbB3, 및 ErbB4와 같은 업스트림 세포 표면 수용체는 외부 신호를 수신한 후에 RAS 단백질을 통해 다운스트림으로 신호를 전달할 것이다. KRAS 단백질이 활성화되지 않는 경우, 그것은 GDP(구아노신 디포스페이트)에 강하게 결합한다. SOS1과 같은 구아노신 교환 인자에 의해 활성화된 후에, KRAS 단백질은 GTP(구아노신 트리포스페이트)에 결합하고 키나제 활성 상태가 된다. KRAS는 RAS 단백질의 중요한 구성원이다. 유전자 돌연변이 후에, KRAS는 성장 및 증식을 위한 신호를 업스트림 성장 인자 수용체 신호에 독립적으로 다운스트림 경로에 독립적으로 전달할 수 있으며, 이는 제어되지 않는 세포 성장 및 종양 진행을 야기한다. 한편, KRAS 유전자가 돌연변이를 갖는지 여부는 또한 종양 예후의 중요한 지표이다.
통계적 결과는 폐 선암종의 12-36%가 KRAS 돌연변이에 의해 유도되고; 결장암의 27-56%가 KRAS에 의해 유도되고; 췌장암의 90%, 자궁내막암의 21%, 및 폐 선암종의 12-36%가 KRAS에 의해 유도됨을 나타내며, 이는 환자 집단이 막대함을 나타낸다. KRAS 유전자 돌연변이에서, 돌연변이의 97%는 위치 12 또는 13에서의 아미노산 잔기에서 발생하며, 여기에서 G12D, G12V, 및 G13D 돌연변이는 약물치료 가능성이 불량하고, 위치 12에서 글리신이 시스테인에 의해 대체된 KRAS(G12C) 돌연변이는 공유 결합 저해제의 개발을 위한 양호한 방향을 제공한다.
본 발명은 화학식(II)의 화합물을 제공한다:
상기 식에서, n은 0 내지 3 중에서 선택된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, n은 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 및 3.0 중에서 선택된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, n은 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 및 3 중에서 선택된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, n은 2이다.
본 발명은 또한 화학식(II)의 화합물을 제공한다:
상기 식에서, n은 0 내지 2 중에서 선택된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, n은 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 및 2 중에서 선택된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, n은 0.5, 1, 1.5, 및 2 중에서 선택된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, n은 2이다.
본 발명은 또한, 화학식(II)의 화합물의 결정형 A(crystal form A)를 제공하며, 이는 8.514±0.200°, 14.689±0.200° 및 18.122±0.200°의 2θ 각에서 특징적인 회절 피크(characteristic diffraction peak)를 나타내는 X-선 분말 회절 패턴을 특징으로 한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 결정형 A는 6.218±0.200°, 8.514±0.200°, 12.299±0.200°, 14.689±0.200°, 16.903±0.200°, 18.122±0.200°, 18.927±0.200° 및 25.580±0.200°의 2θ 각에서 특징적인 회절 피크를 나타내는 X-선 분말 회절 패턴을 가진다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 결정형 A는 6.218±0.200°, 8.514±0.200°, 11.663±0.200°, 12.299±0.200°, 14.689±0.200°, 16.903±0.200°, 18.122±0.200°, 18.927±0.200°, 19.364±0.200°, 20.386±0.200°, 21.914±0.200° 및 25.580±0.200°의 2θ 각에서 특징적인 회절 피크를 나타내는 X-선 분말 회절 패턴을 가진다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 결정형 A는 6.218±0.200°, 8.514±0.200°, 11.663±0.200°, 12.299±0.200°, 14.689±0.200°, 16.903±0.200°, 18.122±0.200°, 18.927±0.200°, 19.364±0.200°, 20.386±0.200°, 21.914±0.200°, 22.640±0.200°, 25.580±0.200°, 25.988±0.200°, 27.147±0.200° 및 27.715±0.200°의 2θ 각에서 특징적인 회절 피크를 나타내는 X-선 분말 회절 패턴을 가진다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 결정형 A는 6.218°, 8.514°, 11.663°, 12.299°, 14.689°, 16.903°, 18.122°, 18.554°, 18.927°, 19.364°, 20.386°, 21.914°, 22.640°, 23.867°, 24.553°, 24.806°, 25.580°, 25.988°, 27.147°, 27.715°, 29.135° 및 31.799°의 2θ 각에서 특징적인 회절 피크를 나타내는 X-선 분말 회절 패턴을 가진다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 결정형 A는 8.514±0.200° 및 14.689±0.200°의 2θ 각에서, 및 또한 임의로 6.218±0.200°, 및/또는 11.663±0.200°, 및/또는 12.299±0.200°, 및/또는 16.903±0.200°, 및/또는 18.122±0.200°, 및/또는 18.554±0.200°, 및/또는 18.927±0.200°, 및/또는 19.364±0.200° 및/또는 20.386±0.200°, 및/또는 21.914±0.200°, 및/또는 22.64±0.200°, 및/또는 23.867±0.200°, 및/또는 24.553±0.200° 및/또는 24.806±0.200°, 및/또는 25.58±0.200°, 및/또는 25.988±0.200°, 및/또는 27.147±0.200° 및/또는 27.715±0.200°, 및/또는 29.135±0.200°, 및/또는 31.799±0.200°의 2θ 각에서 특징적인 회절 피크를 나타내는 X-선 분말 회절 패턴을 가진다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 결정형 A가 개시되며, 이는 도 1에 나타낸 바와 같은 XRPD 패턴을 가진다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 결정형 A의 XRPD 패턴 해상도 데이터를 표 1에 나타내었다:
[표 1]
본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 결정형 A의 시차 주사 열량법 곡선은 115.37 ℃±3 ℃에서 흡열 피크의 피크 값을 가진다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 결정형 A의 DSC 곡선은 도 2에 나타내었다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 결정형 A의 열중량 분석 곡선(thermogravimetric analysis curve)은 150.0±3 ℃에서 5.379% 이하의 중량 손실(weight loss)을 가진다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 결정형 A의 TGA 곡선을 도 3에 나타내었다.
본 발명은 또한
(a) 화학식(I)의 화합물을 에탄올에 첨가하고, 맑아질 때까지 혼합물을 교반하는 단계;
(b) 교반하면서 시스템에 물을 서서히 첨가하고, 20 내지 30 ℃에서 시드 결정을 첨가하는 단계;
(c) 15 시간 동안 20 내지 30 ℃에서 교반하는 단계;
(d) 20 내지 30 ℃에서 반응 시스템 내로 물을 서서히 적가하고, 추가로 1 내지 3 시간 동안 교반하는 단계;
(e) 여과하고, 고체를 수집하는 단계를 포함하는, 화학식(II)의 화합물의 결정형 A를 제조하는 방법을 제공한다:
본 발명은 또한, 고형 종양의 치료를 위한 의약(medicament)의 제조에 있어서의, 상기 화합물 및 이의 결정형 A의 용도를 제공한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 고형 종양은 폐암(lung cancer) 및 직장암(rectal cancer)이다.
[발명의 효과]
본 발명의 화합물은 KRASG12C-돌연변이화 MIA-PA-CA-2 세포주 및 NCI-H358 세포에 대해 양호한 세포 증식 저해 활성을 갖는다. 본 발명의 화합물은 간 마이크로좀, 간세포, 혈장 및 전혈에서 양호한 안정성을 가질 뿐아니라, 양호한 PK 특성 및 유의한 항-종양 효과를 가진다. 결정형 A는 안정하고, 광 및 열에 의해 영향을 덜 받으며, 양호한 PK 특성을 가진다.
달리 특정되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 하기 용어 및 구문은 하기 의미를 갖고자 한다. 특별한 정의의 부재 하에 구체적인 구문 또는 용어는 불확정 또는 불명확한 것으로 간주되어서는 안되고 관용적인 의미로 이해되어야 한다. 본 명세서에 상표명이 나타나는 경우, 이는 이의 상응하는 상품 또는 이의 활성 성분을 지칭하고자 한다.
본 발명의 중간체 화합물은 하기 열거된 구체적인 실시양태, 하기 열거된 구체적인 실시양태와 다른 화학적 합성법을 조합하여 형성된 실시양태, 및 당업자에게 주지된 균등한 대안적 방법을 포함하는, 당업자에게 주지된 다양한 합성법에 의해 제조될 수 있다. 대안적 실시양태는 본 발명의 실시예를 포함하지만 이로 제한되지는 않는다.
본 발명의 구체적인 실시양태에서 화학 반응은 적합한 용매 중에서 완료되며, 이는 본 발명의 화학적 변화 및 필요한 시약 및 재료에 적합하여야 한다. 본 발명의 화합물을 얻기 위하여, 당업자는 때때로 기존의 실시양태를 기초로 하여 합성 단계 또는 반응식을 변형하거나 선택할 필요가 있다.
본 발명은 실시예를 통하여 하기에서 구체적으로 기재될 것이나, 이는 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하고자 하지 않는다.
본 발명에 사용된 모든 용매는 구매가능하며 추가의 정제 없이 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 화합물의 구조는 당업자에게 주지된 관용적인 방법에 의해 확인될 수 있다. 본 발명이 화합물의 절대 입체배치에 관한 것이면, 절대 입체배치는 당업계에 관용적인 기술, 예컨대 단결정 X-선 회절(SXRD)에 의해 확인될 수 있다. 단결정 X-선 회절(SXRD)에서, 육성된(cultivated) 단결정의 회절 강도 데이터는 φ/ω 스캔의 스캔 모드로 CuKα 방사선의 광원을 사용하는 Bruker D8 벤처 회절계를 사용하여 수집하며; 관련 데이터를 수집한 후, 절대 입체배치를 확인하기 위한 직접적 방법(Shelxs97)에 의해 결정 구조를 추가로 분석한다.
화합물은 ChemDraw® 소프트웨어에 의해 당업계의 일반적 명명 원칙에 따라 명명되며, 구매가능한 화합물은 이들의 판매자 디렉토리 명칭으로 명명된다.
본 발명에서 사용된 X-선 분말 회절(XRPD) 방법
기기 모델: Bruker D2 Phaser X-선 회절계
시험 방법: 약 10 내지 20 mg의 샘플을 XRPD 검출에 사용하였다.
구체적인 XRPD 파라미터는 다음과 같다:
광 튜브: Cu, kα(λ=1.54184 Å)
광 튜브 전압: 30 kV, 광 튜브 전류: 10 mA
발산 슬릿: 0.60 mm
검출기 슬릿: 5.827 mm
안티-스캐터 슬릿: 0 mm
스캔 범위: 3-40 deg
단계 크기: 0.02 deg
단계 길이: 0.2 초
본 발명에서 사용된 시차 주사 열량법(DSC)
기기 모델: NETZSCH DSC 214 DSC21400A-0958-L
시험 방법: 시험을 위해 샘플(약 4.02 mg)을 DSC 알루미늄 포트 내에 놓았다. 50 mL/min의 N2 조건 하에, 10 ℃/min의 가열 속도로 샘플을 30 ℃(실온)에서 400 ℃로 가열하였다.
본 발명에서 사용된 열중량 분석(TGA) 방법
기기 모델: TA Discovery TGA 5500 열중량 분석기
시험 방법: 시험을 위해 샘플(2 내지 5 mg)을 TGA 백금 포트 내에 놓았다. 25 mL/min의 N2 조건 하에, 10 ℃/min의 가열 속도로 샘플을 실온에서 350 ℃로 또는 20%의 중량 손실이 될 때까지 가열하였다.
본 발명에서 사용된 단결정 X-선 회절 방법
기기 모델: 헬리오스 mx 다중층 단색기를 갖는 Bruker D8 VENTURE CMOS Photon II 회절계.
시험 방법: 0.0133 g의 화학식(II)의 화합물의 결정형 A를 실온에서 2 mL의 아세토니트릴에 용해시켰다. 샘플 용액을 4 mL의 반-밀봉된 샘플 바이알에 첨가하고 실온에서 서서히 증발시켰다. 10 일 후에 무색의 거대 결정을 얻었다. 회절 실험의 온도는 T=173(2) K였다.
기기 파라미터:
헬리오스 mx 다중층 단색기를 갖는 Bruker D8 VENTURE CMOS Photon II 회절계.
극저온 시스템: 옥스포드 크리오스트림 800
Cu:λ=1.54184 Å, 2.5 kW,
결정으로부터 검출기까지의 거리: d = 45 mm
튜브 전압: 50 kV
튜브 전류: 50 mA
도 1은 Cu-Kα 방사선을 사용한 화학식(II)의 화합물의 결정형 A의 XRPD 패턴이고;
도 2는 화학식(II)의 화합물의 결정형 A의 DSC 곡선이며;
도 3은 화학식(II)의 화합물의 결정형 A의 TGA 곡선이고;
도 4는 화학식(I)의 화합물의 상이한 투여량에서 종양 부피의 경시 변화를 보여주며;
도 5는 화학식(I)의 화합물의 상이한 투여량에서 동물 체중의 경시 변화를 보여주고;
도 6은 화학식(III)의 화합물의 단결정 X-선 회절의 3-차원 구조의 타원체 다이어그램이다.
본 발명의 내용을 더욱 잘 이해하기 위하여, 구체적인 실시예와 관련하여 본 발명을 하기에 추가로 예시하지만, 구체적인 실시예가 본 발명의 내용을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 화학식(I)의 화합물의 제조
단계 1: 화합물 1-2의 합성
5-리터 3-구 플라스크를 준비하고, 여기에서 화합물 1-1(250 g, 2.00 mol, 1 eq), 무수 포타슘 카르보네이트(690.26 g, 4.99 mol, 2.5 eq), 및 포타슘 요오다이드(331.62 g, 2.00 mol, 1 eq)를 N-메틸피롤리돈(2.5 L)에 첨가하였다. 이어서, p-메톡시벤질 클로라이드(641.36 g, 4.10 mol, 557.71 mL, 2.05 eq)를 적가하면, 반응액은 황색이고 혼탁하였다. 생성된 혼합물을 120 ℃에서 5 시간 동안 오일조에서 질소 하에 교반하고 반응시켰다. 6 회분의 반응액(250×6)을 합하여 20 리터의 물에 첨가하였다. 이어서, 10 리터의 메틸 tert-부틸 에테르를 첨가하고, 혼합물을 교반하였다. 액체 분리 후, 유기상을 수집하고, 수성상을 메틸 tert-부틸 에테르(5 L×1)로 추출하였다. 유기상을 합하여 포화 염수(10 L × 2)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켜 화합물 1-2의 비정제 생성물을 얻었다. 3 리터의 석유 에테르를 비정제 생성물에 첨가하고, 혼합물을 밤새 슬러리화하였다. 슬러리 시스템은 유백색이고 혼탁하였으며, 부흐너 깔때기를 통해 여과하였다. 필터 케이크를 석유 에테르(500 mL × 3)로 세척하여 필터 케이크로부터 화합물 1-2를 얻었다. 1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ = 7.23-7.18(m, 4H), 6.91-6.87(m, 1H), 6.82-6.76(m, 4H), 6.65 -6.59(m, 2H), 4.20(s, 4H), 3.79(s, 6H), 2.19(s, 3H). LCMS: MS m/z = 366.1 [M+H]+.
단계 2: 화합물 1-3의 합성
2,2,6,6-테트라메틸피페리딘(2.44 kg, 17.29 mol, 2.94 L, 4 eq)을 무수 테트라하이드로푸란(15 L)에 첨가하고, 혼합물을 -5 내지 0 ℃로 냉각시켰다. 시스템을 질소로 3회 퍼징하고, n-부틸리튬(2.5 M, 6.92 L, 4 eq)을 질소 하에 적가하였다. 혼합물을 -5 내지 0 ℃에서 15 분간 반응시키고, -60 ℃로 냉각시켰다. 테트라하이드로푸란(1.5 L) 중의 화합물 1-2의 용액(1.58 kg, 4.32 mol, 1 eq)을 적가하였다. 적가가 완료된 후, 혼합물을 -65 내지 -60 ℃에서 0.5 시간 동안 반응시켰다. 이어서, N,N-디메틸포름아미드(3.16 kg, 43.24 mol, 3.33 L, 10 eq)를 신속히 첨가하고, 혼합물을 -60 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 20 L의 포화 암모늄 클로라이드를 반응액에 첨가하고, 혼합물을 5 L의 메틸 tert-부틸 에테르로 추출하였다. 층을 분리하였다. 유기상을 20 L의 포화 암모늄 클로라이드로 세척하였다. 이어서, 수성상을 10 L의 메틸 tert-부틸 에테르로 추출하였다. 층을 분리하였다. 유기상을 합하여 포화 염수(12 L × 2)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 이어서, 비정제 생성물을 석유 에테르 및 메틸 tert-부틸 에테르(3/1, 3L)를 사용하여 5 시간 동안 슬러리화한 다음 여과하였다. 필터 케이크를 수집하여 화합물 1-3을 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ = 10.43 - 10.35(m, 1H), 7.21-7.18(m, 5H), 6.92 - 6.81(m, 5H), 4.25(s, 4H), 3.80(s, 6H), 2.23(s, 3H). LCMS:MS m/z = 394.2[M+H]+.
단계 3: 화합물 1-4의 합성
화합물 1-3(1.17 kg, 2.83 mol, 95% 순도, 1 eq)을 N,N-디메틸포름아미드(5.7 L)에 첨가하고, 브로모석신이미드(603.35 g, 3.39 mol, 1.2 eq)를 5 ℃에서 회분식으로 첨가하였다. 혼합물을 5 내지 15 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 5.7 L의 물을 반응액에 서서히 첨가하고, 고체를 침전시켰다. 20 분간 교반한 후, 11.4 L의 물을 서서히 첨가하였다. 혼합물을 40 min 동안 추가로 교반하고 여과하였다. 필터 케이크를 물(2 L × 2)로 세척하였다. 비정제 생성물을 7.7 L의 석유 에테르 및 메틸 tert-부틸 에테르의 혼합 용매(10:1)로 12 시간 동안 슬러리화한 다음 여과하였다. 필터 케이크를 500 mL의 석유 에테르 및 메틸 tert-부틸 에테르의 혼합 용매(10:1)로 세척하였다. 진공 농축 후, 생성물을 12 시간 동안 질소로 블로잉하여 화합물 1-4를 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ = 10.39(s, 1H), 7.17(d, J = 8.8 Hz, 4H), 6.89(d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.85-6.82(m, 4H), 4.22(s, 4H), 3.79(s, 6H), 2.28(s, 3H). LCMS:MS m/z = 472.1[M+H]+, 474.1[M+H]+.
단계 4: 화합물 1-6의 합성
화합물 1-4(130 g, 275.22 mmol, 1 eq), 케톤 요오다이드(104.83g, 550.44 mmol, 2 eq) 및 화합물 1-5(264.37 g, 1.38 mol, 175.08 mL, 5 eq)를 DMF(1.3 L)에 용해시켰다. 혼합물을 100 ℃에서 질소 하에 4 시간 동안 교반하였다. 반응 시스템을 냉각시키고, 여과하고, 물(1.3 L)에 부어 반응을 켄칭하였다. 혼합물을 메틸 tert-부틸 에테르(400 mL × 2)로 추출하고, 포화 염수(300 mL)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하였다. 모액을 수집하고 농축시켜 비정제 생성물을 얻었다. 비정제 생성물을 석유 에테르 및 메틸 tert-부틸 에테르(8/1, 300 mL)로 슬러리화하여 화합물 1-6을 얻었다. 모액을 수집하고, 농축시키고, 칼럼 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 100/1 내지 5/1)로 정제하여 비정제 생성물을 얻었다. 비정제 생성물을 석유 에테르 및 메틸 tert-부틸 에테르(8/1,100 mL)로 슬러리화하여 화합물 1-6을 얻었다. 2 회분의 고체를 혼합하고, 석유 에테르로 슬러리화하고, 여과하였다. 고체를 수집하여 화합물 1-6을 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ = 10.37(q, J = 4.0 Hz, 1H), 7.18 - 7.11(m, 4H), 6.89 - 6.82(m, 4H), 6.73(d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.36(s, 4H), 3.81(s, 6H), 2.37 - 2.29(m, 3H). LCMS: MS m/z =484.0[M+Na]+.
단계 5: 화합물 1-8의 합성
소듐 수소(70.21 g, 1.76 mol, 60% 순도, 1.8 eq)를 무수 테트라하이드로푸란(4.5 L)에 첨가하고 -5 ℃로 냉각시켰다. 혼합물을 3회 질소로 퍼징하고, 화합물 1-7(203.82 g, 1.76 mol, 188.72 mL, 1.8 eq)을 질소 하에 적가하였다. 혼합물을 -5 내지 0 ℃에서 10 분간 반응시킨 다음, n-부틸리튬(2.5 M, 702.14 mL, 1.8 eq)을 적가하였다. 혼합물을 질소 하에 -5 내지 0 ℃에서 또 다른 10 분간 반응시키고 -10 ℃로 냉각시켰다. 테트라하이드로푸란(450 mL) 중의 화합물 1-6(450 g, 975.19 mmol, 1 eq) 용액을 적가하고, 혼합물을 -10 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 추출을 위해 반응액을 5 L의 포화 암모늄 클로라이드에 서서히 첨가하였다. 층을 분리하였다. 유기상을 4 L의 포화 염수로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 900 mL × 4의 석유 에테르를 농축된 비정제 생성물에 첨가하여 진탕하면서 세척하였다. 석유 에테르 상등액을 따라내고, 비정제 생성물을 진공하에 농축시켜 화합물 1-8을 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ = 7.18-7.15(m, 4H), 6.90 - 6.78(m, 4H), 6.61(d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.72 - 5.57(m, 1H), 4.31(m, 4H), 3.81(s, 6H), 3.76(s, 3H), 3.56(s, 2H), 3.50 - 3.38(m, 1H), 2.98 - 2.93(m, 1H), 2.38 - 2.26(m, 3H). LCMS: MS m/z =578.1[M+H]+.
단계 6: 화합물 1-9의 합성
화합물 1-8(1.15 kg, 1.77 mol, 89% 순도, 1 eq)을 디클로로메탄(5.7 L)에 첨가하고, N,N-디메틸포름아미드 디메틸 아세탈(337.86 g, 2.84 mol, 376.66 mL, 1.6 eq)을 첨가하였다. 혼합물을 25 ℃에서 1 시간 동안 반응시키고 0 ℃로 냉각시켰다. 보론 트리플루오라이드-디에틸 에테르(377.27 g, 2.66 mol, 328.06 mL, 1.5 eq)를 0 내지 5 ℃에서 적가하고, 혼합물을 10 분간 반응시켰다. LCMS에 의해 확인된 바, 출발 물질들이 사라지고 생성물의 Ms 시그널이 보였다. 추출을 위해 반응액을 10 L의 반-포화된 소듐 비카르보네이트 용액에 서서히 첨가하였다. 층을 분리하였다. 유기상을 5 L의 포화 염수로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 비정제 생성물을 고르게 6개 부분으로 나누고, 각 부분에 0.83 L의 메틸 tert-부틸 에테르를 첨가하였다. 혼합물을 20 분간 교반하고 고체를 침전시켰다. 0.5 L의 석유 에테르 및 메틸 tert-부틸 에테르의 혼합 용매(1:1)를 첨가하고, 혼합물을 밤새 16 시간 동안 슬러리화하였다. 6개 부분을 함께 여과하였다. 필터 케이크를 석유 에테르 및 메틸 tert-부틸 에테르의 혼합 용매(1:1, 800 mL × 2)로 헹구고 회전 증발시켜 건조시켰다. 모액을 칼럼 크로마토그래피(석유 에테르:에틸 아세테이트 = 100:0-0:1)로 정제하여 화합물 1-9를 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ =8.43(d, J = 0.8 Hz, 1H), 7.21 - 7.10(m, 4H), 6.91 - 6.81(m, 4H), 6.70(d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.93(dd, J = 3.2, 14.8 Hz, 1H), 4.35(s, 4H), 3.8(s, 3H), 3.81(s, 6H), 3.38-3.29(m, 1H), 2.68(dd, J = 3.6, 16.8 Hz, 1H), 2.39 - 2.24(m, 3H). LCMS: MS m/z =588.2[M+H]+.
단계 7: 화합물 1-10의 합성
화합물 1-9(775 g, 1.32 mol, 1 eq)를 테트라하이드로푸란(4 L)에 첨가하였다. 혼합물을 -60 ℃로 냉각시키고 질소로 3 회 퍼징하였다. 이어서, 트리-sec-부틸보로하이드리드(1 M, 1.45 L, 1.1 eq)를 질소 하에 적가하였다. 혼합물을 -60 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 반응액을 3.5 L의 1 M 염산 용액에 서서히 첨가하고, 추출을 위해 2 L의 물을 첨가하였다. 층을 분리하였다. 추가로 수성상을 2 L의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기상을 합하고, 1 L의 에틸 아세테이트를 첨가하였다. 혼합물을 5 L의 포화 염수로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 비정제 생성물을 4 부분으로 나누고, 각 부분에서 200 mL의 메틸 tert-부틸 에테르를 각각 첨가하였다. 혼합물을 10 min 동안 교반하고, 200 mL의 석유 에테르를 서서히 첨가하였다. 0.5 내지 1 시간 동안 교반한 후, 고체를 침전시켰다. 1.6 L의 석유 에테르를 회분식으로 추가로 첨가하고, 혼합물을 12 시간 동안 슬러리화하였다. 슬러리를 여과하고, 필터 케이크를 300 mL의 석유 에테르 및 메틸 tert-부틸 에테르의 혼합 용매(10:1)로 3 회 세척하였다. 고체를 수집하여 화합물 1-10(1.15 kg)을 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ = 7.167-7.14(m, 4H), 6.87-6.83(m, 4H), 6.63(d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.05-5.00(m, 1H), 4.61-4.58(m, 1H), 4.42 - 4.24(m, 5H), 3.85-3.73(m, 10H), 3.13-3.05(m, 1H), 2.47 - 2.38(m, 1H), 2.35-2.31(m, 3H). LCMS: MS m/z = 590.3.[M+H]+.
단계 8: 화합물 1-11의 합성
화합물 1-10(310 g, 525.80 mmol, 1 eq)을 에탄올(1.55 L)에 첨가하였다. 이어서, S-메틸이소티오우레아 설페이트(439.11 g, 1.58 mol, 3 eq) 및 소듐 카르보네이트(111.46 g, 1.05 mol, 2 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 질소 하에 16 시간 동안 45 내지 50 ℃(내부 온도)에서 반응시켰다. 대부분의 에탄올을 농축에 의해 제거하였다. 500 ml의 물 및 400 ml의 에틸 아세테이트를 비정제 생성물에 첨가하였다. 혼합물을 교반하고, 500 ml의 1 M 염산을 사용하여 pH 3 내지 4로 조정하였다. 미색 고체를 침전시켰다. 600 ml의 석유 에테르를 추가로 첨가하였다. 교반하면서 다량의 미색 고체를 시스템 내에 침전시켰다. 부흐너 깔때기를 통해 시스템을 여과하고, 필터 케이크를 에틸 아세테이트(200 mL × 2)로 세척하여 생성물로 필터 케이크를 얻었다. 필터 케이크를 2 L의 디클로로메탄에 용해시켰다. 액체 분리 후, 유기상을 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 농축시켜 화합물 1-11를 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ = 7.22 - 7.14(m, 4H), 6.91 - 6.82(m, 4H), 6.65(dd, J = 8.4 Hz 1H), 5.12-5.08(m, 1H), 4.97-4.91(m, 1H), 4.67 - 4.57(m, 1H), 4.45 - 4.22(m, 4H), 3.88 - 3.74(m, 6H), 3.43-3.35(m, 1H), 2.77-2.72(m, 1H), 2.59(m, 3H), 2.40-2.31(m, 3H). LCMS:MS m/z =630.2[M+H]+.
단계 9: 화합물 1-12B의 합성
화합물 1-11을 SFC(칼럼: DAICEL CHIRALPAK AD(250 mm*50 mm, 10 ㎛); 이동상: [0.1% NH3. H2O EtOH]; EtOH%: 45%-45%, 6.3 min)에 의해 분리하여 화합물 1-12B(피크 시간: 1.665 min) 및 화합물 1-12A(피크 시간: 2.446 min)를 얻었다.
단계 10: 화합물 1-13의 합성
화합물 1-12B(2 g, 3.18 mmol, 1 eq)를 디클로로메탄(20 mL)에 용해시키고, N,N-디이소프로필에틸아민(1.23 g, 9.53 mmol, 1.66 mL, 3 eq)을 첨가하였다. 혼합물을 0 내지 10 ℃로 냉각시키고, 트리플루오로메탄설폰산 무수물(1.34 g, 4.76 mmol, 786.11 ㎕, 1.5 eq)을 시스템 내로 서서히 첨가하였다. 동 온도에서 15 분간 혼합물을 반응시켰다. 포화 암모늄 클로라이드 수용액(15 mL)을 첨가하였다. 액체 분리 후. 수성상을 디클로로메탄(15 mL × 2)으로 추출하였다. 유기상을 합하여 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 비정제 생성물을 얻었다. 비정제 생성물을 칼럼 크로마토그래피(석유 에테르/에틸 아세테이트 = 100/1 내지 0/1)로 분리하여 화합물 1-13을 얻었다. LCMS m/z =762.2[M+H]+. 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ = 7.21 - 7.11(m, 4H), 6.90 - 6.80(m, 4H), 6.66(d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.19-5.15(m, 1H), 5.04 - 4.93(m, 1H), 4.77-4.72(m, 1H), 4.41 - 4.19(m, 4H), 3.80(s, 6H), 3.62-3.54(m, 1H), 3.11 - 2.97(m, 1H), 2.56(s, 3H), 2.42 - 2.31(m, 3H). LCMS:MS m/z =762.2[M+H]+.
단계 11: 화합물 1-15의 합성
화합물 1-13(147 g, 186.74 mmol, 96.767% 순도, 1 eq)을 N,N-디메틸포름아미드(1.5 L)에 용해시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민(72.40 g, 560.23 mmol, 97.58 mL, 3 eq)을 첨가한 다음, 화합물 1-14(42.54 g, 214.76 mmol, 1.15 eq, 2HCl)도 첨가하였다. 혼합물을 50 ℃로 가열하고 0.5 시간 동안 교반하여 N,N-디메틸포름아미드 중의 화합물 1-15의 용액을 얻었다. 반응액을 직접 다음 단계에 사용하였다.
단계 12: 화합물 1-16의 합성
N,N-디메틸포름아미드(1.5 L) 중의 화합물 1-15(137.8 g, 187.02 mmol, 1 eq) 용액을 교반기에 첨가하고, 트리에틸아민(18.92 g, 187.02 mmol, 26.03 mL, 1 eq)을 첨가하였다. 이어서, 디-tert-부틸 디카르보네이트(48.98 g, 224.42 mmol, 51.56 mL, 1.2 eq)를 반응액에 첨가하고, 혼합물을 18 ℃에서 10 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물(1.5 L)에 붓고, 이어서 에틸 아세테이트(400 mL × 3) 및 포화 암모늄 클로라이드 수용액(400 mL × 4)을 첨가하였다. 유기상을 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 화합물 1-16을 얻었다. 1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ = 7.16(d, J = 8.4 Hz, 4H), 6.85(d, J = 8.6 Hz, 4H), 6.64(d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.22( d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.90 - 4.68(m, 2H), 4.61(s, 1H), 4.41 - 4.21(m, 4H), 4.04(s, 1H), 3.80(s, 6H), 3.71(s, 1H), 3.50(d, J = 11.0 Hz, 2H), 3.30(s, 1H), 3.24 - 3.02(m, 2H), 2.90(d, J = 2.0 Hz, 1H), 2.78 - 2.58(m, 2H), 2.55(s, 3H), 2.34(d, J = 4.0 Hz, 3H), 1.51(s, 9H). LCMS m/z =837.2[M+H]+.
단계 13: 화합물 1-17의 합성
화합물 1-16(245 g, 278.10 mmol, 95% 순도, 1 eq)을 무수 디클로로메탄(2500 mL)에 용해시키고, 0 내지 10 ℃로 냉각시켰다. 이어서, m-클로로퍼옥시벤조산(56.46 g, 278.10 mmol, 85% 순도, 1 eq)을 회분식으로 첨가하고, 혼합물을 10 ℃에서 0.5 시간 동안 교반하였다. 부가적인 m-클로로퍼옥시벤조산(8.47 g, 41.71 mmol, 85% 순도, 0.15 eq)을 첨가하고, 혼합물을 10 ℃에서 또 다른 0.5 시간 동안 교반하였다. 본 반응을 1 회분의 10 g의 화합물 1-16과 함께 진행시켰다. 반응액을 포화 소듐 비카르보네이트(1500 mL), 5%의 소듐 티오설페이트(1500 mL)(습윤 전분 포타슘 요오다이드 시험 페이퍼를 사용한 시험을 통과한 후), 및 반-포화 염수(1500 mL)로 세척하였다. 유기상을 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트:석유 에테르 = 10%-15%-20%-30%)로 정제하여 화합물 1-17을 얻었다. 1HNMR(400 MHz,CDCl3) δ ppm 7.15(d, J=8.00 Hz, 4 H), 6.85(d, J=8.80 Hz, 4 H), 6.65(d, J=8.80 Hz, 1 H), 5.27(m, 1 H), 4.78 - 4.91(m, 2 H), 4.61( s, 1 H), 4.24 - 4.38(m, 4 H), 3.90 - 4.18(m, 2 H), 3.78 - 3.82(m, 6 H), 3.42 - 3.70(m, 3 H), 3.33(br s, 1 H), 3.06 - 3.28(m, 2 H), 2.90(s, 3 H), 2.66(m, 2 H), 2.29 - 2.41(s, 3 H), 1.51(s, 9 H). LCMS m/z =853.2[M+H]+.
단계 14: 화합물 1-19의 합성
화합물 1-18(18.24 g, 114.59 mmol, 1.2 eq)을 무수 테트라하이드로푸란(900 mL)에 용해시키고, 혼합물을 -20 ℃로 냉각시켰다. 이어서, 소듐 tert-부톡사이드(11.01 g, 114.59 mmol, 1.2 eq)를 첨가하고, 혼합물을 15 분간 교반하였다. 이어서, 무수 테트라하이드로푸란(180 mL) 중의 화합물 1-17(90.5 g, 95.49 mmol, 90% 순도, 1 eq) 용액을 첨가하고, 혼합물을 추가로 0.5 h 동안 교반하였다. 본 반응을 1 회분의 50 g의 화합물 1-18과 함께 진행시켰다. 1000 mL의 포화 암모늄 클로라이드를 반응액에 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 액체 분리 후, 수성상을 에틸 아세테이트(1000 mL)로 추출하였다. 층을 분리하였다. 유기상을 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트:석유 에테르 = 20%-50%-100%)로 정제하여 백색 고체로서 화합물 1-19를 얻었다. LCMS m/z =948.4[M+H]+.
단계 15: 화합물 1-20의 합성
화합물 1-19(97.00 g, 97.20 mmol, 95% 순도, 1 eq)를 2-메틸테트라하이드로푸란(500 mL)에 용해시키고, 혼합물을 0 ℃로 냉각시켰다. 이어서, 염산(8 M, 614.80 mL, 50.6 eq)을 반응액에 적가하고, 혼합물을 25 ℃로 가열하고 2 시간 동안 교반하였다. 이어서, n-헵탄(200 mL)을 첨가하고, 층을 분리하였다. 수성상을 수집하고, 2-메틸테트라하이드로푸란(300 mL)을 첨가하였다. 소듐 카르보네이트를 사용하여 혼합물의 pH를 8 내지 9로 조정하고, 맑아질 때까지 혼합물을 교반하였다. 액체 분리 후, 유기상을 수집하고, 수성상을 2-메틸테트라하이드로푸란(300 mL × 2)으로 추출하였다. 유기상을 수집하고, 포화 염수(200 mL)로 세척하고, 무수 마그네슘 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하였다. 유기상을 수집하고 농축시켜 비정제 생성물을 얻었다. 비정제 생성물을 디클로로메탄(1000 mL)에 용해시키고, 트리플루오로아세트산(283.73 g, 2.49 mol, 184.24 mL, 25.6 eq)을 디클로로메탄에 서서히 첨가하는 한편, 온도를 10 ℃ 미만으로 유지하였다. 혼합물을 25 ℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응액을 500 mL의 얼음물에 붓고, 맑아질 때까지 혼합물을 교반하였다. 액체 분리 후, 유기상을 물(300 mL × 3)로 추출하였다. 2개 회분의 수성상을 합한 다음 디클로로메탄(500 mL × 4)으로 추출하였다. 유기상을 버렸다. 수성상을 10 ℃로 냉각시키고, 여기에 500 mL의 2-메틸테트라하이드로푸란을 첨가하였다(열 발생 유발). 이어서, 혼합물의 pH를 소듐 카르보네이트를 사용하여 9로 조정하고, 추출을 위해 2-메틸테트라하이드로푸란(400 mL × 2)을 첨가하였다. 유기상을 합하여 각각 물(300 mL × 4) 및 포화 염수(300 mL)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 회색 고체로서 화합물 1-20을 얻었다. LCMS m/z =608.27[M+H]+.
단계 16: 화학식(I)의 화합물의 합성
화합물 1-20(58 g, 84.00 mmol, 88% 순도, 1 eq), N,N-디이소프로필에틸아민(21.71 g, 168.00 mmol, 29.26 mL, 2 eq), 및 2-(7-아자벤조트리아졸)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(38.33 g, 100.80 mmol, 1.2 eq)를 DMF(600 mL)에 용해시킨 다음, 혼합물을 0 ℃로 냉각시켰다. 2-플루오로아크릴산(6.81 g, 75.60 mmol, 0.9 eq)을 회분식으로 첨가하고, 혼합물을 0 ℃에서 10 min 동안 교반하였다. 반응액을 900 mL의 물에 붓고, 이어서 에틸 아세테이트(200 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 합하여 포화 암모늄 클로라이드(200 mL × 3), 포화 소듐 카르보네이트(200 mL × 3), 및 포화 염수(200 mL)로 각각 세척한 다음, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 이어서 혼합물을 16 시간 동안 아세토니트릴 및 물(100 mL: 150 mL)로 슬러리화하였다. 슬러리를 여과하여 화학식(I)의 화합물을 얻었다. SFC 분석 방법(칼럼: Chiralcel OD-3, 50 × 4.6 mm I.D., 3 ㎛; 이동상: A(CO2) 및 B(메탄올, 0.05% 디이소프로필아민 함유); 구배: B%=5에서 50%, 3 min; 유속: 3.4 mL/min; 파장: 220 nm; 압력: 1800 psi, 광학 순도: 99.21%, 피크 시간: 1.840 min). 1H NMR(400 MHz, CD3OD) δ = 6.80 - 6.68(m, 1H), 5.73 - 5.51(m, 1H), 5.46 - 5.19(m, 3H), 5.05 - 4.90(m, 3H), 4.74 - 4.58(m, 2H), 4.37 - 4.26(m, 1H), 4.20 - 4.06(m, 2H), 4.05 - 3.84(m, 3H), 3.79 - 3.59(m, 2H), 3.54 - 3.43(m, 1H), 3.42 - 3.35(m, 1H), 3.31 - 3.24(m, 1H), 3.13 - 2.89(m, 3H), 2.82 - 2.52(m, 2H), 2.50 - 2.42(m, 1H), 2.41 - 2.30(m, 5H), 2.29 - 2.18(m, 1H).
실시예 2: 화학식(III)의 화합물의 단결정 X-선 회절 분석
0.0133 g의 화학식(II)의 화합물의 결정형 A를 실온에서 2 mL의 아세토니트릴에 용해시켰다. 샘플 용액을 4 mL의 반-밀봉된 샘플 바이알에 첨가하고, 실온에서 서서히 증발시켰다. 10 일 후에 무색의 거대 결정을 얻었다. 결정을 수집하고, 단결정 X-선 회절계(D8-VENTURE)를 사용하여 회절 강도 데이터를 수집하였다. 화학식(III)의 화합물의 결정 구조 데이터를 표 2에 나타내고, 화학식(III)의 화합물의 3-차원 구조의 타원체 다이어그램을 도 6에 나타내었다.
[표 2]
화학식(III)의 화합물의 결정 데이터
실시예 3: 화학식(II)의 화합물의 결정형 A의 제조
방법 1: 화학식(I)의 화합물(0.2 g)을 에탄올(2.4 mL)에 첨가하고, 혼합물을 50 ℃로 가열하였다. 용해시킨 후, 물(0.48 mL)을 반응액에 서서히 첨가하고, 혼합물을 50 ℃에서 72 시간 동안 교반하였다. 여과 후, 고체를 수집하여 화학식(II)의 화합물의 결정형 A를 얻었다.
방법 2: 화학식(I)의 화합물(5.0 g)을 에탄올(4 V)에 첨가하고 혼합물을 맑아질 때까지 교반하였다. 물(1 V)을 시스템에 서서히 첨가하고, 시드 결정(0.5 g)을 20 내지 30 ℃에서 첨가하였다. 동 온도에서 15 시간 동안 혼합물을 교반하였다. 이어서, 물(3 V)을 서서히 적가하고, 혼합물을 추가로 1 내지 3 시간 동안 교반하였다. 여과 후, 필터 케이크를 수집하여 화학식(II)의 화합물의 결정형 A를 얻었다.
실시예 4: 화학식(II)의 화합물의 결정형 A의 고체 안정성 검정
"원료 및 제제의 안정성 시험에 대한 처리 원칙"(Chinese Pharmacopoeia 2015 Edition, Part Four, General Principles, Chapter 9001)에 따라, 화학식(II)의 화합물의 결정형 A의 결정 안정성을 고온(60 ℃, 밀봉되지 않음), 고습(실온/상대습도 92.5%, 밀봉되지 않음) 및 강한 광(5000 lx, 밀봉되지 않음), 및 장기 실험(25±2 ℃/60±5% RH) 및 가속 실험(40±2 ℃/75±5% RH)의 조건 하에 조사하였다.
약 20 mg의 화학식(II)의 화합물의 결정형 A를 칭량하고 유리 샘플 바이알의 바닥에 놓았다. 샘플을 얇은 층으로 펼쳤다. 고온 및 고습 조건 하에 놓인 샘플의 경우, 바이알 입구를 알루미늄 호일로 밀봉하고 알루미늄 호일에 몇개의 작은 구멍을 펀칭하여 샘플이 주변 공기와 완전히 접촉하고 있음을 보장하였다. 강한 광의 조건 하에 놓인 샘플의 경우, 바이알 입구를 알루미늄 호일로 밀봉하고, 알루미늄 호일에 몇개의 작은 구멍을 펀칭하였다. 상이한 조건 하에 놓인 샘플들을 각각 제5일 및 제10일에 샘플링하고 시험(XRPD)하였다. 검정 결과를 제0일의 초기 검정 결과와 비교하였다. 검정 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
화학식(II)의 화합물의 결정형 A를 의료용 이중-층 저-밀도 폴리에틸렌 백으로 투입하였다. 각각의 의료용 저-밀도 폴리에틸렌 백을 끈으로 단단히 묶은 다음, 단일-층 알루미늄 호일 백 내에 놓았다. 이어서 단일-층 알루미늄 호일 백을 가열-밀봉하였다. 최종적으로, 샘플을 플라스틱 버킷에 보관하고 일정한 온도 및 습도의 챔버 내에 보관하였다. 안정성 검정에서 사용된 포장은 재료 보관 포장을 모의하였다. 적색 광 하에 안정성 샘플로서 재료를 1.5 g/포장으로 분리하였다. 각 샘플을 동일한 방식으로 포장하고 안정성 샘플 라벨로 표지하였다. 상이한 조건 하에 놓인 샘플들을 제3개월 및 제6개월에 샘플링하고 시험하였다(XRPD). 검정 결과를 제0일의 초기 검정 결과와 비교하였다. 검정 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
[표 3]
화학식(II)의 화합물의 결정형 A의 고체 안정성 검정 결과
광 대조군*1: 광 대조군 샘플이 동시에 놓일 필요가 있다. 광 대조군 샘플을 나사 마개로 밀봉한 다음 은박지로 완전히 감쌌다.
결론: 화학식(II)의 화합물의 결정형 A는 고온, 고습, 강한 광, 및 장기 실험 및 가속 실험의 조건 하에 양호한 안정성을 가진다.
생물학적 검정 데이터:
검정 실시예 1: KRAS G12C -돌연변이화 MIA-PA-CA-2 세포의 증식에 대한 화합물의 저해 효과의 검정
1.1 검정 목적
KRASG12C-돌연변이화 MIA-PA-CA-2 세포의 증식의 저해의 IC50에 대해 화합물을 검정하였다.
1.2 시약
본 검정에 사용된 주요 시약은 CellTiter-Glo(Promega, 카탈로그 번호 G7573)를 포함하였다.
1.3 기기
본 검정에 사용된 주요 기기는 PerkinElmer EnVision 다기능 마이크로플레이트 판독기였다.
1.4 검정 방법
1) 부착 세포를 트립신으로 소화시켜 세포 현탁액을 형성하고, 이후의 사용을 위해 세포 현탁액을 계수하였다.
2) 적절한 양의 세포를 원심분리 튜브에 첨가하고, 세포 배양 배지를 첨가하여 필요한 부피를 보충한 후; 2000 세포/웰의 최종 밀도, 100 ㎕의 배양 배지로 96-웰 플레이트에 세포를 플레이팅하였다.
3) 24 hr 동안 인큐베이션한 후에, DMSO로 화합물을 10 mM로 제형화하고, DPBS(둘베코 포스페이트 완충 식염수)로 9개의 지점까지 3-배 연속 희석하고; 각각의 웰에 이중실험으로 10 ㎕를 첨가하였다. 검정 대조군 웰(Con)에는 웰당 10 ㎕의 DPBS를 첨가하였다.
4) 동일한 날에, 화합물이 없는 다른 세포 배양 플레이트에 50 ㎕의 CellTiter Glo를 첨가하고, EnVision에 의해 형광 값을 판독하였다. 값은 제0일 값으로서 표시되었다.
5) 화합물로 처리된 세포의 72 h 인큐베이션 후에, 플레이트를 제거하고, 50 ㎕의 CellTiter Glo를 세포 플레이트에 첨가하였다. EnVision에 의해 형광 값을 판독하였다.
6) 데이터 분석: 각각의 웰에서의 세포의 저해율을 하기 방정식에 따라 계산하였다:
* FDay0은 화합물 처리가 없는 원래의 세포 수 검정 웰의 판독 값이었다;
FCon은 72 hr의 인큐베이션 후에 Con 군의 형광 판독 값이었다.
FCpd는 72 hr의 인큐베이션 후에 각각의 화합물 웰의 형광 판독 값이었다.
7) Log(작용제) 대 반응 -- 화합물의 저해율 데이터(저해율 %)에 대한 가변 슬로프 비선형 적합 분석을 수행하여 GraphPad Prism 소프트웨어에 의해 하기 방정식을 사용하여 화합물의 IC50 값을 얻었다:
Y=하단 + (상단-하단)/(1+10^((LogIC50-X)*힐슬로프))
1.5 검정 결과
[표 4]
KRAS G12C -돌연변이화 MIA-PA-CA-2 세포의 증식의 억제에 대한 본 발명의 화합물의 검정 결과
검정 결과는 화학식(I)의 화합물이 KRASG12C-돌연변이화 MIA-PA-CA-2 세포주의 세포 증식에 대한 양호한 저해 활성을 가졌음을 나타냈다.
검정 실시예 2: KRAS G12C 돌연변이화 H358 세포의 증식에 대한 화합물의 저해 효과의 검정
2.1 검정 목적
KRASG12C-돌연변이화 H358 세포의 증식의 저해의 IC50에 대해 화합물을 검정하였다.
2.2 시약
본 검정에 사용된 주요 시약은 Vicente로부터 구매한 RPMI-1640 배지, 페니실린/스트렙토마이신 항생제, Biosera로부터 구매한 소 태아 혈청, Promega로부터 구매한 CellTiter-Glo(세포 생존율 화학발광 검출 시약), 및 중국 과학원의 세포 은행으로부터 구매한 NCI-H358 세포주를 포함하였다.
2.3 기기
본 검정에 사용된 주요 기기는 Nivo 다중-표지 분석기(PerkinElmer)였다.
2.4 검정 방법:
1) NCI-H358 세포를 백색 96-웰 플레이트에 접종하였으며, 각각의 웰은 80 ㎕의 세포 현탁액 및 4000개의 NCI-H358 세포를 함유하였다. 세포 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다.
2) 검정하고자 하는 화합물을 다중-채널 피펫으로 5-배 연속 희석하여 9개의 농도를 얻었다(즉, 2 mM 내지 5.12 nM). 검정은 이중실험으로 실행되었다. 78 ㎕의 배지를 중간 플레이트에 첨가한 후, 2 ㎕의 연속 희석된 화합물을 상응하는 위치에 따라 중간 플레이트의 각각의 웰에 이전하였다. 잘 혼합한 후에, 웰당 20 ㎕를 세포 플레이트에 이전하였다. 세포 플레이트에 이전된 화합물의 농도는 10 μM 내지 0.0256 nM의 범위였다. 세포 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터에서 5 일 동안 인큐베이션하였다. 다른 세포 플레이트를 준비하고, 화합물 첨가일에 세포 플레이트의 신호 값을 데이터 분석에 참여하기 위한 최대값(하기 방정식에서 Max 값)으로서 판독하였다. 25 ㎕의 세포 생존율 화학발광 검출 시약을 세포 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하여 발광 신호를 안정화시켰다. 플레이트를 판독하기 위해 다중-표지 분석기를 사용하였다.
3) 25 ㎕의 세포 생존율 화학발광 검출 시약을 세포 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하여 발광 신호를 안정화시켰다. 플레이트를 판독하기 위해 다중-표지 분석기를 사용하였다.
데이터 분석:
방정식 (샘플-Min)/(Max-Min)*100%를 사용하여 원시 데이터를 저해율로 전환하였으며, IC50 값은 4개의 파라미터를 이용하는 곡선 적합(GraphPad Prism 내의 "log(저해제) 대 반응 -- 가변 슬로프" 모드)에 의해 얻어질 수 있다. NCI-H358 세포 증식에 대한 본 발명의 화합물의 저해 활성은 표 5에 제공되었다.
[표 5]
KRAS G12C -돌연변이화 H358 세포의 증식의 저해에 대한 본 발명의 화합물의 검정 결과
결론: 화학식(I)의 화합물은 NCI-H358 세포의 증식에 대한 양호한 저해 활성을 나타낸다.
검정 실시예 3: 간세포의 대사 안정성
검정 목적: CD-1 마우스, SD 래트, 비글 개, 사이노몰구스 원숭이, 및 인간의 간세포에서 검정 화합물의 대사 안정성을 각각 검정하였다.
검정 절차: 몇 개의 96-웰 샘플 침전 플레이트를 준비하고, 각각 T0, T15, T30, T60, T90, T120, T0-MC, T120-MC, 및 블랭크 기질로 명명하였다. 회수 배지 및 인큐베이션 배지를 미리 취하여 예열을 위해 37 ℃ 수조에 넣었다. 냉동보존 간세포를 액체 질소 탱크로부터 제거하고 즉시 37 ℃ 수조에 침지시켰다(대략 90 초). 냉동보존 간세포가 해동되고 이완된 후에, 40 mL의 회수 배지를 함유하는 원심분리 튜브에 그들을 붓고, 튜브를 부드럽게 역위시켜 세포가 회수 배지에 재현탁되도록 하였다. 세포를 실온에서 5 min 동안 100×g로 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 적절한 부피의 인큐베이션 배지에 간세포를 재현탁시키고, 트리판 블루 염색 방법에 의해 세포 생존율을 계산하였다. 예열된 인큐베이션 플레이트에 198 ㎕의 간세포 현탁액(0.51×106 세포/mL)을 첨가하였다. 배양 배지 대조군의 경우, 198 ㎕의 간세포-무함유 인큐베이션 배지를 T0-MC 및 T120-MC 인큐베이션 플레이트에 첨가하였다. 모든 인큐베이션 플레이트를 37 ℃ 인큐베이터에서 10 분 동안 예비-인큐베이션하였다. 이어서, 검정 샘플 및 대조 화합물의 작업 용액 2 ㎕를 각각 첨가하고, 혼합물을 잘 혼합하였다. 인큐베이션 플레이트를 즉시 인큐베이터 내의 진탕기에 넣고, 타이머를 시작하면서 반응을 개시하였다. 각각의 화합물의 각각의 시점에 대해, 2개의 이중실험 샘플을 준비하였다. 인큐베이션 조건은 37 ℃, 포화 습도, 및 5% CO2였다. 검정 시스템에서, 검정 샘플의 최종 농도는 1 μM이었고, 대조 샘플의 최종 농도는 3 μM이었고, 간세포의 최종 농도는 0.5×106 세포/mL이었고, 총 유기 용매의 최종 농도는 0.96%였으며, 이 중에서 DMSO의 최종 농도는 0.1%였다. 상응하는 시점에 대한 인큐베이션의 종료점에서, 인큐베이션 플레이트를 꺼내고, 125 ㎕의 중단 용액(아세토니트릴 중의 200 ng/mL 톨부타미드 및 라베탈롤)을 함유하는 샘플 플레이트에 화합물 및 대조 화합물과 세포의 혼합물 25 ㎕를 첨가하였다. 블랭크 샘플 플레이트의 경우, 25 ㎕의 간세포-무함유 인큐베이션 배지를 직접 첨가하였다. 밀봉 후에, 모든 샘플 플레이트를 진탕기 상에서 600 rpm으로 10 분 동안 진탕한 후, 3220×g로 20 분 동안 원심분리하였다. 검정 샘플 및 대조 샘플의 상등액을 초순수로 1:3의 비로 희석하였다. 모든 샘플을 잘 혼합하고 LC/MS/MS에 의해 분석하였다.
검정 결과: 검정 결과를 표 6에 나타내었다.
[표 6]
CD-1 마우스, SD 래트, 비글 개, 사이노몰구스 원숭이, 및 인간의 간세포에서의 검정 화합물의 대사 안정성
결론: 다양한 종의 간세포에서의 대사 검정은 화학식(I)의 화합물이 양호한 대사 안정성을 가졌음을 나타냈다.
검정 실시예 4: 간 마이크로좀에서의 시험관내 안정성 검정
검정 목적: CD-1 마우스, SD 래트, 비글 개, 사이노몰구스 원숭이, 및 인간의 간 마이크로좀에서 검정 화합물의 대사 안정성을 각각 검정하였다.
검정 절차: 2개의 96-웰 인큐베이션 플레이트를 준비하고, 각각 T60 인큐베이션 플레이트 및 NCF60 인큐베이션 플레이트로 명명하였다. 445 ㎕의 마이크로좀 작업 용액(0.56 mg/mL의 간 마이크로좀 단백질 농도)을 각각 T60 인큐베이션 플레이트 및 NCF60 인큐베이션 플레이트에 첨가한 후, 상기 인큐베이션 플레이트를 37 ℃ 수조에서 약 10 분 동안 예비-인큐베이션하였다.
예비-인큐베이션 후에, 검정 샘플 또는 대조 화합물의 작업 용액 5 ㎕를 각각 T60 인큐베이션 플레이트 및 NCF60 인큐베이션 플레이트에 첨가하고, 혼합물을 잘 혼합하였다. 50 ㎕의 포타슘 포스페이트 완충액을 NCF60 인큐베이션 플레이트의 각각의 웰에 첨가하여 반응을 개시하였다. 180 ㎕의 중단 용액(아세토니트릴 중의 200 ng/mL 톨부타미드 및 200 ng/mL 라베탈롤) 및 6 ㎕의 NADPH 재생 시스템 작업 용액을 T0 중단 플레이트에 첨가하고, 54 ㎕의 샘플을 T60 인큐베이션 플레이트로부터 T0 중단 플레이트로 이전하였다(T0 샘플의 생성). T60 인큐베이션 플레이트의 각각의 웰에 44 ㎕의 NADPH 재생 시스템 작업 용액을 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 블랭크 플레이트에는 54 ㎕의 마이크로좀 작업 용액, 6 ㎕의 NADPH 재생 시스템 작업 용액, 및 180 ㎕의 중단 용액만을 첨가하였다. 그러므로, 검정 화합물 또는 대조 화합물의 샘플에서, 화합물, 테스토스테론, 디클로페낙, 및 프로파페논의 최종 반응 농도는 1 μM이었고, 간 마이크로좀의 농도는 0.5 mg/mL였고, 반응 시스템 내의 DMSO 및 아세토니트릴의 최종 반응 농도는 각각 0.01%(v/v) 및 0.99%(v/v)였다. 적절한 시간(예를 들어, 5, 15, 30, 45, 및 60 분)의 인큐베이션 후에, 180 ㎕의 중단 용액(아세토니트릴 중의 200 ng/mL 톨부타미드 및 200 ng/mL 라베탈롤)을 각각의 중단 플레이트의 샘플 웰에 각각 첨가하였다. 60 ㎕의 샘플을 T60 인큐베이션 플레이트로부터 제거하여 반응을 중단시켰다. 모든 샘플 플레이트를 잘 진탕한 후에 3220×g로 20 분 동안 원심분리하였다. 이어서, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 분석을 위해 80 ㎕의 상등액을 각각의 웰로부터 취하여 240 ㎕의 순수에 희석하였다. 모든 샘플을 주입하고 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법에 의해 분석하였다.
검정 결과: 검정 결과를 표 7에 나타내었다.
[표 7]
CD-1 마우스, SD 래트, 비글 개, 사이노몰구스 원숭이, 및 인간의 간 마이크로좀에서의 검정 화합물의 대사 안정성
결론: 간 마이크로좀에서의 대사 안정성의 검정은 화학식(I)의 화합물이 양호한 대사 안정성을 갖는다는 것을 나타냈다.
검정 실시예 5: 혈장에서의 안정성 검정
검정 목적: CD-1 마우스 및 인간의 혈장에서의 검정 화합물의 안정성을 각각 검정하였다.
검정 절차: 냉동보존 혈장을 10 내지 20 min 동안 해동시켰다. 혈장이 완전히 해동된 후에, 그것을 원심분리기에 넣고 3220×g로 5 min 동안 원심분리하여 혈장 내의 임의의 현탁된 물질 및 침전물을 제거하였다. 96-웰 인큐베이션 플레이트를 준비하고 각각 T0, T10, T30, T60, T120으로 명명하였다. 마우스, 래트, 개, 원숭이, 및 인간의 블랭크 혈장 98 ㎕를 상응하는 인큐베이션 플레이트에 첨가한 후, 화합물 또는 대조 화합물의 작업 용액 2 ㎕를 상응하는 플레이트에 이중실험으로 첨가하였다. 모든 샘플을 37 ℃ 수조에서 인큐베이션하였다. 화합물 및 대조 화합물 비사코딜, 에날라프릴 말레에이트, 프로카인, 및 프로반틴의 최종 인큐베이션 농도는 2 μM이었고, 및 최종 유기상 함량은 2.0%였다. 각각의 시점에 대한 인큐베이션의 종료점에서, 상응하는 인큐베이션 플레이트를 제거하고 아세토니트릴 중의 200 ng/mL 톨부타미드 및 라베탈롤 용액 400 ㎕를 각각의 상응하는 샘플 웰에 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 모든 샘플 플레이트를 밀봉하고 잘 진탕한 후, 3220×g로 20 분 동안 원심분리하였다. 50 ㎕의 상등액을 취하여 100 ㎕의 초순수에 희석하였다. 모든 샘플을 잘 혼합한 후에 LC/MS/MS에 의해 분석하였다.
검정 결과: 검정 결과를 표 8에 나타내었다.
[표 8]
CD-1 마우스 및 인간의 혈장에서의 검정 화합물의 안정성
결론: 화학식(I)의 화합물은 인간 및 마우스의 혈장에서 양호한 안정성을 갖는다.
검정 실시예 6: 전혈에서의 안정성 검정
검정 목적: CD-1 마우스, SD 래트, 비글 개, 및 사이노몰구스 원숭이의 전혈에서의 검정 화합물의 안정성을 각각 검정하였다.
검정 절차: 검정 당일 또는 검정 전일에, 항응고제 EDTA-K2를 사용하여 CD-1 마우스, SD 래트, 비글 개, 및 사이노몰구스 원숭이로부터 신선한 전혈을 수집하였다. 검정의 시작 전에, 전혈을 PBS와 1:1(v:v)로 혼합하고 혼합물을 37 ℃ 수조에서 10 내지 20 분 동안 예열하였다. 96-웰 인큐베이션 플레이트를 준비하고 각각 T0, T30, T60, T240으로 명명하였다. T0, T30, T60, 및 T240 인큐베이션 플레이트를 포함하는 상응하는 인큐베이션 플레이트에서, 화합물 또는 대조 화합물의 작업 용액 2 ㎕를 마우스, 래트, 개, 원숭이, 및 인간의 블랭크 전혈 98 ㎕와 이중실험으로 혼합하였다. 모든 샘플을 37 ℃ 수조에서 인큐베이션하였다. 화합물의 최종 인큐베이션 농도는 5 μM이었고 대조 화합물의 최종 인큐베이션 농도는 2 μM이었다. 각각의 시점에 대한 인큐베이션의 종료점에서, 상응하는 인큐베이션 플레이트를 제거하고, 상응하는 샘플 웰에 100 ㎕의 초순수를 즉시 첨가하고, 잘 혼합하였다. 아세토니트릴 중의 200 ng/mL 톨부타미드 및 라베탈롤 용액 800 ㎕를 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 샘플 플레이트를 밀봉하고 잘 진탕한 후, 3220×g로 20 분 동안 원심분리하였다. 150 ㎕의 상등액을 취하여 LC/MS/MS에 의해 분석하였다.
검정 결과: 검정 결과를 표 9에 나타내었다.
[표 9]
CD-1 마우스, SD 래트, 비글 개, 및 사이노몰구스 원숭이의 전혈에서의 검정 화합물의 안정성
결론: 다양한 종의 전혈에서의 안정성 검정은 화학식(I)의 화합물이 전혈에서 양호한 안정성을 갖는다는 것을 나타냈다.
검정 실시예 7: 단백질 결합 비율의 검정
검정 목적: CD-1 마우스, SD 래트, 비글 개, 사이노몰구스 원숭이, 및 인간의 혈장에서의 검정 화합물의 단백질 결합 비율을 평형 투석에 의해 결정하였다.
검정 절차: 상기 5개의 종의 혈장을 사용하여 2 μM의 화합물 농도를 갖는 혈장 샘플을 준비하고, 96-웰 평형 투석 장치에 넣고, 포스페이트 완충 용액으로 37±1 ℃에서 4 시간 동안 투석하였다. 본 검정에서는 와파린을 대조 화합물로서 사용하였다. 혈장 및 투석 완충액 중의 검정 화합물의 농도를 LC-MS/MS 방법에 의해 결정하였다.
검정 결과: 검정 결과를 표 10에 나타내었다.
[표 10]
CD-1 마우스, SD 래트, 비글 개, 사이노몰구스 원숭이, 및 인간에서의 검정 화합물의 단백질 결합 비율
결론: 다양한 종의 혈장 결합 비율에 대한 검정은 화학식(I)의 화합물이 혈장에서 높은 비결합 단백질 비율을 갖는다는 것을 나타냈다.
검정 실시예 8: 생체내 약동학에 대한 검정
1) SD 래트에서의 경구 투여 및 정맥 주사에 의한 검정 화합물의 약동학에 대한 검정
검정 화합물을 5% 디메틸 설폭사이드/95%(10% 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린) 용액과 혼합하였다. 혼합물을 와동시키고 초음파처리하여 1 mg/mL의 맑은 용액을 준비하였으며, 이후의 사용을 위해 미세다공성 막을 통해 이를 여과하였다. 주령 7 내지 10 주의 웅성 SD 래트를 선택하고, 후보 화합물 용액을 정맥내 또는 경구 투여하였다. 소정 기간 동안 전혈을 수집하고, 혈장을 얻기 위해 준비하였다. LC-MS/MS 방법에 의해 약물 농도를 분석하고, Phoenix WinNonlin 소프트웨어(Pharsight, USA)에 의해 약동학적 파라미터를 계산하였다. 검정 결과를 표 11에 나타내었다:
[표 11]
검정 화합물의 약동학적 결과
비고: Vdss,u는 비결합 혈장 단백질 하의 겉보기 분포 용적이고(Vdss,u=Vdss/PPB(비결합%)); Cmax, u, 및 AUC0-last, u는 비결합 혈장 단백질 하의 상응하는 값이다(Cmax,u= Cmax × PPB(비결합%); AUC0-last, u = AUC0-last × PPB(비결합%))
결론: PK 검정은 화학식(I)의 화합물이 래트에서 높은 비결합 혈장 노출 및 양호한 경구 생체이용률을 갖는다는 것을 나타냈다.
2) SD 래트에서의 경구 투여에 의한 화학식(II)의 화합물의 결정형 A의 약동학에 대한 검정
109.72 mg의 검정 화합물을 정확하게 칭량하여 유리 바이알에 첨가하였다. 774 ㎕의 0.5% 메틸셀룰로스(400 점도) 수용액을 첨가하고, 혼합물을 5 분 동안 교반하였다. 10 mL의 0.5% 메틸셀룰로스(400 점도) 수용액을 첨가하고, 혼합물을 5 분 동안 교반하여 균일하고 불투명한 현탁액을 얻었다. 주령 7 내지 10 주의 웅성 SD 래트를 선택하고, 후보 화합물 용액을 경구 투여하였다. 소정 기간 동안 전혈을 수집하고, 혈장을 얻기 위해 준비하였다. LC-MS/MS 방법에 의해 약물 농도를 분석하고, Phoenix WinNonlin 소프트웨어(Pharsight, USA)에 의해 약동학적 파라미터를 계산하였다. 검정 결과를 표 12에 나타내었다:
[표 12]
검정 화합물의 약동학적 결과
결론: PK 검정은 화학식(II)의 화합물의 결정형 A가 래트에서 높은 노출을 갖는다는 것을 나타냈다.
3) CD 마우스에서의 경구 투여 및 정맥 주사에 의한 검정 화합물의 약동학에 대한 검정
검정 화합물을 5% 디메틸 설폭사이드/95%(10% 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린) 용액과 혼합하였다. 혼합물을 와동시키고 초음파처리하여 1 mg/mL의 맑은 용액을 준비하였으며, 이후의 사용을 위해 미세다공성 막을 통해 이를 여과하였다. 주령 7 내지 10 주의 웅성 CD 마우스를 선택하고, 후보 화합물 용액을 정맥내 또는 경구 투여하였다. 소정 기간 동안 전혈을 수집하고, 혈장을 얻기 위해 준비하였다. LC-MS/MS 방법에 의해 약물 농도를 분석하고, Phoenix WinNonlin 소프트웨어(Pharsight, USA)에 의해 약동학적 파라미터를 계산하였다. 검정 결과를 표 13에 나타내었다:
[표 13]
검정 화합물의 약동학적 결과
비고: Vdss,u는 비결합 혈장 단백질 하의 겉보기 분포 용적이고(Vdss,u=Vdss/PPB(비결합%)); Cmax, u, 및 AUC0-last, u는 비결합 혈장 단백질 하의 상응하는 값이다(Cmax,u= Cmax × PPB(비결합%); AUC0-last, u = AUC0-last × PPB(비결합%))
결론: PK 검정은 화학식(I)의 화합물이 마우스에서 높은 비결합 혈장 노출 및 양호한 경구 생체이용률을 갖는다는 것을 나타냈다.
4) 비글 개에서의 경구 투여에 의한 검정 화합물의 약동학에 대한 검정
680.397 mg의 검정 화합물 분말을 정확하게 칭량하고, 50 mL의 0.5% 메틸셀룰로스(400 점도) 수용액을 첨가하였다. 혼합물을 10 분 동안 교반하고, 10 분 동안 초음파처리하였다. 50 mL의 0.5% 메틸셀룰로스(400 점도) 수용액을 첨가하고, 균질화기를 사용하여 10 분 동안 균질화하였다. 11 mL의 0.5% 메틸셀룰로스(400 점도) 수용액을 첨가하였다. 혼합물을 5 분 동안 초음파처리하고 10 분 동안 교반하였다. 358 ㎕의 0.5% 메틸셀룰로스(400 점도) 수용액을 첨가하고 2 분 동안 교반하였다. 월령 6 개월 초과의 웅성 비글 개를 선택하고, 후보 화합물 용액을 경구 투여하였다. 소정 기간 동안 전혈을 수집하고, 혈장을 얻기 위해 준비하였다. LC-MS/MS 방법에 의해 약물 농도를 분석하고, Phoenix WinNonlin 소프트웨어(Pharsight, USA)에 의해 약동학적 파라미터를 계산하였다. 검정 결과를 표 14에 나타내었다: 소정 기간 동안 전혈을 수집하고, 혈장을 얻기 위해 준비하였다. LC-MS/MS 방법에 의해 약물 농도를 분석하고, Phoenix WinNonlin 소프트웨어(Pharsight, USA)에 의해 약동학적 파라미터를 계산하였다. 검정 결과를 표 14에 나타내었다:
[표 14]
검정 화합물의 약동학적 결과
결론: PK 검정은 화학식(II)의 화합물의 결정형 A가 개에서 높은 노출을 갖는다는 것을 나타냈다.
검정 실시예 9: 생체내 약력학에 대한 검정
Balb/c 누드 마우스에서 인간 췌장암 Mia PaCa-2 세포의 피하 이식 종양 모델에서의 생체내 약력학에 대한 검정
1. 세포 배양 및 종양 조직 제조
세포 배양: 인간 췌장암 Mia PaCa-2 세포(ATCC-CRL-1420)를 단층으로 시험관내에서 10% 송아지 태아 혈청 및 2.5% 말 혈청을 갖는 DMEM 배지 중에 37 ℃, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하였다. 트립신-EDTA를 이용한 일상적인 소화에 의해 세포를 주 2회 계대하였다. 세포 포화도가 80%-90%에 도달하고 세포 수가 요건을 충족시켰을 때, 세포를 수확하고, 계수하고, 적절한 양의 PBS에 재현탁시켰다. Matrigel을 1:1의 비로 첨가하여 25×106 세포/mL의 세포 밀도를 갖는 세포 현탁액을 얻었다.
세포 접종: 0.2 mL(5×106 세포/마우스)의 Mia PaCa-2 세포(+ Matrigel, 1:1(부피비))를 각각의 마우스의 우측 등에 피하 접종하였다. 평균 종양 부피가 190 mm3에 도달했을 때, 종양 부피에 기초하는 그룹으로 마우스를 무작위배정하고, 표 15의 프로토콜에 따라 투여를 개시하였다.
[표 15]
검정 동물 그룹화 및 투여 프로토콜
비고: PO는 경구 투여를 나타내고; QD는 1일 1회를 나타낸다.
2. 종양 측정 및 검정 지표
종양 직경을 버니어 캘리퍼로 주 2회 측정하였다. 종양 부피의 계산식은 V = 0.5a × b2이었으며, 여기에서 a 및 b는 각각 종양의 장직경 및 단직경을 나타낸다.
화합물의 항-종양 효능을 TGI(%) 또는 상대 종양 증식률 T/C(%)에 의해 평가하였다. 상대 종양 증식률 T/C(%) = TRTV / CRTV × 100 %(TRTV: 치료군에서의 RTV; CRTV: 음성 대조군에서의 RTV). 상대 종양 부피(RTV)는 종양 측정의 결과에 따라 계산되었고, 계산식은 RTV = Vt / V0이었으며, 여기에서 V0은 그룹에 의한 투여 시점(즉, D0)에서 측정된 평균 종양 부피였고, Vt는 소정 측정 시점에서의 평균 종양 부피였다. TRTV 및 CRTV의 경우, 동일한 날의 데이터가 사용되었다.
TGI(%)는 종양 성장 저해율을 반영하였다. TGI(%) = [(1-(치료군의 투여 종료점에서의 평균 종양 부피 - 치료군의 투여 시작점에서의 평균 종양 부피)) /(비히클 대조군의 치료 종료점에서의 평균 종양 부피 - 비히클 대조군의 치료 시작점에서의 평균 종양 부피)] × 100%.
3. 검정 결과
검정 결과를 도 4 및 도 5에 나타낸다.
투여의 제22일에서의 결과를 표 16에 나타내었다.
[표 16]
투여의 제22일에서의 T/C 및 TGI
결론: 화학식(I)의 화합물은 유의한 종양-억제 효과를 갖는다. 또한, 각각의 용량군에서 마우스의 체중이 안정적이었고, 명백한 불내성은 없다.

Claims (14)

  1. 화학식(II)의 화합물,

    상기 식에서, n은 0 내지 3 중에서 선택된다.
  2. 제1항에 있어서,
    n이 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 및 3 중에서 선택되는 화합물.
  3. 제2항에 있어서,
    n이 2인 화합물.
  4. 8.514±0.200°, 14.689±0.200° 및 18.122±0.200°의 2θ 각에서 특징적인 회절 피크(characteristic diffraction peak)를 나타내는 X-선 분말 회절 패턴을 특징으로 하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화학식(II)의 화합물의 결정형 A(crystal form A):
    .
  5. 제4항에 있어서,
    6.218±0.200°, 8.514±0.200°, 12.299±0.200°, 14.689±0.200°, 16.903±0.200°, 18.122±0.200°, 18.927±0.200° 및 25.580±0.200°의 2θ 각에서 특징적인 회절 피크를 나타내는 X-선 분말 회절 패턴을 특징으로 하는 결정형 A.
  6. 제5항에 있어서,
    6.218±0.200°, 8.514±0.200°, 11.663±0.200°, 12.299±0.200°, 14.689±0.200°, 16.903±0.200°, 18.122±0.200°, 18.927±0.200°, 19.364±0.200°, 20.386±0.200°, 21.914±0.200° 및 25.580±0.200°의 2θ 각에서 특징적인 회절 피크를 나타내는 X-선 분말 회절 패턴을 특징으로 하는 결정형 A.
  7. 제6항에 있어서,
    6.218°, 8.514°, 11.663°, 12.299°, 14.689°, 16.903°, 18.122°, 18.554°, 18.927°, 19.364°, 20.386°, 21.914°, 22.640°, 23.867°, 24.553°, 24.806°, 25.580°, 25.988°, 27.147°, 27.715°, 29.135° 및 31.799°의 2θ 각에서 특징적인 회절 피크를 나타내는 X-선 분말 회절 패턴을 특징으로 하는 결정형 A.
  8. 제7항에 있어서,
    도 1에 나타낸 바와 같은 XRPD 패턴을 갖는 결정형 A.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    115.37 ℃±3 ℃에서 흡열 피크의 피크 값을 갖는 시차 주사 열량법 곡선을 갖는 결정형 A.
  10. 제9항에 있어서,
    도 2에 나타낸 바와 같은 DSC 곡선을 갖는 결정형 A.
  11. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    150.0 ℃±3 ℃에서 5.379% 이하의 중량 손실(weight loss)을 나타내는 열중량 분석 곡선(thermogravimetric analysis curve)을 갖는 결정형 A.
  12. 제11항에 있어서,
    도 3에 나타낸 바와 같은 TGA 곡선을 갖는 결정형 A.
  13. 고형 종양(solid tumor)의 치료를 위한 의약(medicament)의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 결정형 A의 용도.
  14. 제13항에 있어서,
    고형 종양이 폐암(lung cancer) 및 직장암(rectal cancer)인 용도.
KR1020247011544A 2021-09-10 2022-09-09 피리미딘 헤테로사이클릭 화합물의 결정형 및 이의 제조 방법 KR20240056582A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111062619 2021-09-10
CN202111062619.1 2021-09-10
CN202211034826 2022-08-26
CN202211034826.0 2022-08-26
PCT/CN2022/118023 WO2023036282A1 (zh) 2021-09-10 2022-09-09 嘧啶并杂环类化合物的晶型及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240056582A true KR20240056582A (ko) 2024-04-30

Family

ID=85507187

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020247011544A KR20240056582A (ko) 2021-09-10 2022-09-09 피리미딘 헤테로사이클릭 화합물의 결정형 및 이의 제조 방법

Country Status (7)

Country Link
KR (1) KR20240056582A (ko)
CN (1) CN117957220A (ko)
AU (1) AU2022342220A1 (ko)
CA (1) CA3231329A1 (ko)
IL (1) IL311340A (ko)
TW (1) TWI820901B (ko)
WO (1) WO2023036282A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023240263A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Revolution Medicines, Inc. Macrocyclic ras inhibitors

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2021001706A (es) * 2018-08-16 2021-04-19 Hoffmann La Roche Compuestos de anillo fusionado.
CN112390788A (zh) * 2019-08-13 2021-02-23 苏州闻天医药科技有限公司 一种用于抑制krasg12c突变蛋白的化合物及其制备方法和用途
CN112979664B (zh) * 2019-12-02 2024-03-01 上海璎黎药业有限公司 一种含氧杂环化合物、其制备方法及应用
IL296357A (en) * 2020-03-12 2022-11-01 D3 Bio Wuxi Co Ltd Heterocyclic pyrimido compounds and their uses
TWI811656B (zh) * 2020-04-22 2023-08-11 大陸商德昇濟醫藥（無錫）有限公司 嘧啶并雜環類化合物及其應用
WO2022081655A1 (en) * 2020-10-14 2022-04-21 Accutar Biotechnology, Inc. Substituted dihydropyranopyrimidine compounds as kras inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
TW202313627A (zh) 2023-04-01
AU2022342220A1 (en) 2024-03-28
CN117957220A (zh) 2024-04-30
WO2023036282A1 (zh) 2023-03-16
CA3231329A1 (en) 2023-03-16
IL311340A (en) 2024-05-01
TWI820901B (zh) 2023-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021233058B2 (en) Pyrimidoheterocyclic compounds and application thereof
CN109381469B (zh) 喹唑啉衍生物类酪氨酸激酶抑制剂的新用途
ES2884398T3 (es) Formas cristalinas de 2-[(2s)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2-il]-6-(3-metil-1H-pirazol-4-il)tieno[3,2-d]pirimidin-4(3H)-ona hemihidrato
EP2504331B1 (en) Compound, certain novel forms thereof, pharmaceutical compositions thereof and methods for preparation and use
KR20240056582A (ko) 피리미딘 헤테로사이클릭 화합물의 결정형 및 이의 제조 방법
CN114728957B (zh) 一种atr抑制剂的晶型及其应用
BR112013010009A2 (pt) compostos úteis para inibição de chk1
WO2022048545A1 (zh) 一种吡啶并嘧啶化合物的晶型
CN112574208B (zh) 取代的稠合三环衍生物及其组合物及用途
AU2020248834B2 (en) BRD4 inhibitor compound in solid form and preparation method therefor and application thereof
JP2023511675A (ja) アリールアミノプリン誘導体の塩、その調製方法ならびその用途
US11919898B2 (en) Crystal form of azaindole derivative and use thereof
WO2020224585A1 (zh) 一种mTORC1/2双激酶活性抑制剂的盐型、晶型及其制备方法
CN114258394B (zh) 一种致癌性融合激酶抑制剂的晶型及其应用
US20220220120A1 (en) Crystal form of wee1 inhibitor compound and use thereof
JP5701884B2 (ja) 三環性ピラゾロピリミジン誘導体の結晶
TW202313604A (zh) 吡唑並雜芳基類衍生物的可藥用鹽及其結晶形式
CN115368355A (zh) 一种吡唑并杂芳基类衍生物的结晶形式
BR112019009448A2 (pt) cristal de um composto, seu uso e composição farmacêutica
EA035560B1 (ru) Кристаллические формы гемигидрата 2-[(2s)-1-азабицикло[2.2.2]окт-2-ил]-6-(3-метил-1h-пиразол-4-ил)тиено[3,2- d]пиримидин-4(3h)-она

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination