BR112013010009A2

BR112013010009A2 - compostos úteis para inibição de chk1

Info

Publication number: BR112013010009A2
Application number: BR112013010009-5A
Authority: BR
Inventors: Sajan Joseph; Susanta Samajdar
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 2010-11-08
Filing date: 2011-11-01
Publication date: 2020-09-29
Also published as: HRP20150530T1; CA2816944A1; PL2638033T3; SI2638033T1; KR101533166B1; AR083575A1; BR112013010009B1; ME02119B; CN103180311A; AU2011326230B2; AU2011326230A1; PT2638033E; US20130190262A1; JO3145B1; CN103180311B; TWI501956B; EP2638033A1; DK2638033T3; EA201390499A1; JP5792316B2

Abstract

COMPOSTOS ÚTEIS PARA INIBIÇÃO DE CHK1. A presente invenção refere-se a um composto de aminopirazol ou um sal farmaceuticamente aceitável, que inibe Chk1 e é útil no tratamento de câncer.

Description

ecpp———— —.—,.—«c2«àÀ2xcan.p.8S..—————— ss————— es er ———£Aadiiissss———— 2/30 " proporcionam a inibição de Chk2, o que pode ser benéfico para o tratamento | de câncer.

Além disso, os compostos da presente invenção inibem a prolife- Í ração celular de células cancerosas através de um mecanismo dependente da inibição de Chk1. Esses novos compostos suprir a necessidade de trata- mentos seguros e eficazes de câncer.

A presente invenção proporciona um composto que é (R)-[5-(2- metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]- amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Formas de realização preferidas são (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-i1)-[6- ' 10 (piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il)-amina, sal do ácido metano sulfônico de (R)-[5- (2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il)-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-

o amina, sal hemioxalato de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3- il]--[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il-amina e sal hemissuccinato de (R)-[5-(2- | metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperiídin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]- 1 amina. i Como uma forma de realização particular, a presente invenção | proporciona o composto que é (R)-[5-(2-metóxi-B6-metil-piridin-3-il)-2H- | pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il)-amina.

I A presente invenção proporciona o ácido metano sulfônico, áci- do acético, sais hemioxalato e hemissuccinato de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil- piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il-amina.

Outra forma de realização é um hidrato de (R)-[5-(2-metóxi-6- metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-i1]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-i])-amina.

A presente invenção proporciona hidrato de (R)-[5-(2-metóxi-6- metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il)-amina em forma cristalina.

A presente invenção também proporciona hidrato de (R)-[5-(2- metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il)-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]- amina em forma cristalina caracterizada por um padrão de difração de pó de raio-X com picos de 28 + 0,2 a 5,17, em combinação com um ou mais dos picos selecionados a partir do grupo que consiste em 15,73; 17,71 e 20,12. A presente invenção proporciona uma composição farmacêutica

] que compreende (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6- (piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il)-amina, ou um seu sal farmaceuticamente acei- tável, e um veículo, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A presente invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-i1]-[6- (piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il-amina, ou um seu sal farmaceuticamente acei- tável, juntamente com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável e opcionalmente outros ingredientes terapêuticos.

A presente invenção proporciona um método de tratamento de : 10 câncer, compreendendo a administração a um paciente em sua necessidade de uma quantidade eficaz de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol- . 3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina, ou um seu sal farmaceuticamen- te aceitável. Além disso, a presente invenção também fornece um método de tratamento de câncer, que compreende a administração a um paciente em sua necessidade de uma quantidade eficaz de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil- piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-i])-amina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e radiação por ionização. Além disso, a presente invenção proporciona um método de tratamento de câncer, com- preendendo a administração a um paciente em sua necessidade de uma quantidade eficaz de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-i1]-[6- (piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina, ou um seu sal farmaceuticamente acei- tável, e um ou mais agentes de quimioterapia.

A presente invenção proporciona a utilização de (R)-[5-(2- metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]- amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para a fabricação de um medicamento para o tratamento do câncer. Além disso, a presente invenção também proporciona a utilização de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H- pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il--amina, ou um seu sal farmaceu- ticamente aceitável, para a fabricação de um medicamento para o tratamen- tode câncer, em que o referido tratamento compreende a terapia de combi- nação com radiação por ionização. Além disso, a presente invenção propor- ciona a utilização de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-

om aãÃ: SÔ “ON | 4/30 ' (piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il])-amina, ou um seu sal farmaceuticamente acei- tável, para a fabricação de um medicamento para o tratamento do câncer por terapia de combinação, em que o referido tratamento de terapia de com- binação compreende a administração do referido medicamento e administra- çãodeumourmais agentes de quimioterapia ao mesmo paciente.

A presente invenção proporciona (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin- 3-i1)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização em terapia. Além disso, a pre- sente invenção proporciona também (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H- . 10 pirazol-3-ill-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il)--amina, ou um seu sal farmaceu- ' ticamente aceitável, e radiação por ionização para utilização em terapia. A- * lém disso, a presente invenção proporciona (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3- iN)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina, ou um seu sal far- maceuticamente aceitável, e um ou mais agentes de quimioterapia para utili- zaçãoemterapia.

A presente invenção proporciona (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin- 3-i1)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]- amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento de câncer. Além disso, a presente invenção proporciona também (R)-[5-(2-metóxi-6-metil- piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il)-amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e radiação por ionização para utilização no tratamento de câncer. Além disso, a presente invenção proporciona (R)-[5- (2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il)-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]- amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e um ou mais agentes de quimioterapia para o uso no tratamento do câncer.

A presente invenção proporciona a utilização de (R)-[5-(2- metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il)-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-i]- amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o medicamento deve ser administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente com a radiação por ionização.

A presente invenção proporciona a utilização de (R)-[5-(2-

pD——————————————————————————>—————————————————. | | 5/30 | ' metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]- amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o medicamento também | compreende um ou mais agentes de quimioterapia ou deve ser administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente com um ou mais a- gentes de quimioterapia.

A presente invenção proporciona (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin- 3-i1)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-i])-amina, ou um seu sal | farmaceuticamente aceitável, para utilização em combinação simultânea, . 10 separada ou sequencial com radiação de ionização para o tratamento de ' câncer.

-.. A presente invenção proporciona (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin- 3-iI)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il)-amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes de quimioterapia no trata- mento de câncer.

Além disso, a presente invenção proporciona formas de realiza- ção preferidas dos métodos e utilizações como aqui descritos, em que o um ou mais agentes de quimioterapia é selecionado a partir do grupo que con- siste em 5-fluorouracila, hidroxiureia, gemcitabina, metotrexato, pemetrexed, doxorrubicina, etoposídeo, cisplatina, e taxol. Além disso, a presente inven- ção proporciona formas de realização preferidas dos métodos e utilizações como aqui descrito, em que dois agentes quimioterapêuticos são seleciona- dos a partir do grupo que consiste em 5-fluorouracila, hidroxiureia, gemcita- bina, metotrexato, pemetrexed, doxorrubicina, etoposídeo, cisplatina e taxol. Além disso, a presente invenção proporciona formas de realização ainda mais preferidas dos métodos e utilizações como aqui descrito, em que o a- gente de quimioterapia é selecionado a partir do grupo que consiste em 5- fluorouracila, hidroxiureia, gemcitabina, metotrexato, pemetrexed, doxorrubi- cina, etoposídeo, cisplatina, e taxol. Formas de realização preferidas dos métodos e utilizações aqui descritos são cânceres selecionados a partir do grupo que consiste em câncer de bexiga, câncer de cólon, câncer gástrico,

' câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer da mama, melanoma, câncer de ovário, câncer de pâncreas, mesotelioma, câncer renal e câncer de útero.

Tal como utilizado acima, e ao longo da descrição da invenção, os termos a seguir, a menos que indicado em contrário, devem ser entendi- doscomo tendo os seguintes significados: "Sal farmaceuticamente aceitável" ou "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se aos sais inorgânicos e orgânicos relativamente não- tóxicos de compostos da presente invenção.

Os compostos da presente invenção são capazes de reação, por : 10 exemplo, com um número de ácidos inorgânicos e orgânicos para formar sais farmaceuticamente aceitáveis. Tais sais farmaceuticamente aceitáveis e To metodologia comum para seu preparo são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, P. Stahl, et al, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, (VCHA / Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al. "Pharma- ceutical Salts", Joumal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, Janeiro de 1977.

Os compostos da presente invenção são preferencialmente for- mulados como composições farmacêuticas utilizando um ou mais veículos, diluentes, ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis e administrados a- través de uma variedade de vias. De preferência, tais composições são para administração oral, subcutânea ou intravenosa. Tais composições farmacêu- ticas e processos para seu preparo são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Genna- ro, et al, eds., 21º ed, Mack Publishing Co., 2005).

Os termos "tratamento", "tratar", "tratando", e similares, devem incluir retardar ou reverter a progressão de uma doença. Estes termos tam- bém incluem aliviar, melhorar, atenuar, eliminar ou reduzir um ou mais sin- tomas de um distúrbio ou condição, mesmo se a doença ou condição não for efetivamente eliminada e mesmo se a progressão do distúrbio ou condição nãoé,emsi, retardada ou revertida.

"Quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" significa a quantidade do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável,

" da presente invenção ou uma composição farmacêutica contendo um com- posto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, da presente invenção que irá provocar a resposta biológica ou médica ou efeito terapêutico desejado em um tecido, sistema, animal, mamífero ou ser humano que está sendo solici- tado pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico.

A quantidade de composto da presente invenção efetivamente administrada será determinada por um médico sob as circunstâncias rele- vantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, o composto real da presente invenção administrado, a idade, peso e respos- . 10 tado paciente individual, e a gravidade dos sintomas do paciente. As dosa- gens por dia normalmente caem dentro da faixa de cerca de 0,1 a cerca de "o. 10 mg / kg de peso corporal. Em alguns casos, níveis de dosagem abaixo do limite inferior da faixa acima mencionada podem ser mais do que adequa- dos, enquanto em outros casos doses ainda maiores podem ser emprega- das.

Os compostos da presente invenção podem ser preparados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, bem como os des- critos em Preparos e Exemplos abaixo. As etapas sintéticas específicas para cada uma das vias descritas podem ser combinadas de diferentes formas para preparar os compostos da presente invenção.

Os reagentes e os materiais de partida são em geral prontamen- te disponíveis para alguém de habilidade comum na técnica. Outros podem ser preparados por técnicas padrão de química orgânica e heterocíclica, téc- nicas que são análogas às sínteses de compostos conhecidos estrutural- .

mente semelhantes, e os procedimentos descritos em Preparos e Exemplos que se seguem, incluindo quaisquer novos procedimentos. Os seguintes Preparos e Exemplos são fornecidos para ilustrar a invenção em maiores detalhes e representam sínteses típicas dos compostos. Os nomes dos compostos da presente invenção são geralmente fornecidos por ISIS Draw

2.5SP2 com Autonom incluído.

Como usado aqui, os termos a seguir têm os significados indica- dos: "BCA" refere-se a ácido bicinconínico; "BSA" refere-se à albumina do

' soro bovino; "DMSO" refere-se a dimetilsulfóxido; "DPBS" refere-se a solu- ção salina tamponada tamponada com fosfato dibásico; "DTT" refere-se a ditiotreitol; "EtOAc" refere-se a acetato de etila; "FBS" refere-se a soro bovi- no fetal; "HEPES" referese a ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2- etanossulfónico; "MEM" refere-se a meio essencial mínimo; “MeOH" refere- se a metanol; "PBS" refere-se a solução salina tamponada com fosfato; "PI" refere-se a iodeto de propídio; "RNAase" refere-se a ribonuclease A; "RPMI" refere-se a Roswell Park Memorial Institue; "TBST" refere-se a solução sali- na com Tween-20 tamponada com tris; "THF" refere-se a tetrahidrofurano; ' 10 "TR-FRET" refere-se a tempo de transferência de energia fluorescente re- solvida; "Tris" refere-se a tris(hidroximetil)aminometano; "Triton-X" refere-se ss. a 4 (1,1,3,3-tetrametilbutifenil-polietileno —glicol polietileno-glicol £& octilfenoxipolietoxietanol polietileno glicol terc-octilfenil éter e "Tween-20" refere-se o polissorbato 20.

Preparo 1 (R)-3-(6-cloropirazin-2-il)oxipiperidina-1-carboxilato de terc-butila fSX cr “NO Qu.

Y Hidreto de sódio (225,6 g; 5,64 mol) é disperso em THF (3 L)ea temperatura é reduzida a O - 5ºC. Uma solução de (R)-3-hidróxi-1-boc pipe- ridina (891,6 g; 4,43 mol) em THF (3 L) é adicionada ao longo de 1 h en- quantose mantém a temperatura entre 0 - 5ºC. A reação é agitada durante 1 h. 2,6-Dicloropirazina (600 g; 4,03 mol) como uma solução em THF (3 L) é adicionada gota a gota ao longo de 1,5 h mantendo a mesma temperatura. À reação é agitada durante 2 horas a 25 - 30ºC, e em seguida vertida em gelo. A mistura é diluída com água e extraída com acetato de etila. Os extratos são secos sobre sulfato de sódio anidro, filtrados e concentrados. O óleo residual é triturado com diclorometano a 5% em hexano para dar o produto como um sólido branco. O sólido é recolhido por filtração e seco para dar

' 1,538 g de material bruto. O produto bruto é retriturado com diclorometano a 5% em hexanos para dar um sólido branco em rendimento quantitativo. ES/MS m/z 314,1 [M + HJ”. Preparo 2 Éster metílico do ácido 2-metóxi-6-metil-nicotínico

LS

O A uma solução agitada de éster metílico do ácido 2-cloro-6-metil- To nicotínico de (10,4 g; 56,52 mmol) em MeOH sob nitrogênio, é adicionada uma solução de sódio (2,58 g; 113,04 mmol) em metanol (80,0 mL) (sódio Ss metálico é dissolvido em metanol sob uma atmosfera de nitrogênio) à tempe- ratura ambiente. A mistura da reação é submetida a refluxo durante a noite. A reação é arrefecida à temperatura ambiente e o pH é ajustado a pH = 7 com ácido acético. A mistura da reação é diluída com acetato de etila (100 mL) e água (30 mL). A camada orgânica é separada e a camada aquosa é extraída com acetato de etila (2 x 75 mL). Os extratos orgânicos combinados são secos sobre Na7zSO;, filtrados e concentrados para dar o produto bruto. Rendimento: 7,25 g (71%). *H RMN (400 MHz, CDCI3); 5 8,066 - 8,047 (d, J =7,6 Hz, 1H); 6,782 - 6,764 (d, J= 7,2 Hz; 1H); 4,029 (s, 3H); 3,879 (s, 3H); 2,483 (s, 3H); ES/MS m/z 182,2 [M + HJ. Preparo 3 5-(2-Metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-ilamina

FS

NZ 1 7O N Â-NH,

H n-BuLi (1,2 M; 96,0 mL; 115,6 mmol) é adicionado a uma solu- ção de acetonitrila (6,08 mL; 115,4 mmol) em THF (300 mL) a - 78ºC e dei- xada agitar durante 30 min a - 78ºC. Éster metílico do ácido 2-metóxi-6- metil-nicotínico (20 g; 105,1 mmol) em THF (200 mL) é adicionado e agitado a-78ºC durante mais 30 min. A mistura da reação é arrefecida a -78ºC com

AA“ 2222“ mm e o E AAA“A“CMe ja DA 10/30 | | ' água (500 mL) e lavada com EtOAc (2 x 250 mL). A camada aquosa é sepa- Í rada e evaporada. Esta é co-destilada duas vezes com tolueno para se obter 3-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-3-oxo-propionitrila. Rendimento = 21,4 g (bru- to). ES/MS m/z 191,1 [IM + HI”. Uma solução — de 3-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-3-0x0- propionitrila (21 g; 110,4 mmol) em etanol (200 ml) é colocada em um tubo vedado. Hidrato de hidrazina (32,1 mL; 662,4 mmol) e ácido acético (21,0 mL) são adicionados e a reação aquecida a 100ºC durante 2 h. O solvente é separado por evaporação e a mistura da reação é diluída com EtOAc (500 mL)e solução saturada de bicarbonato de sódio (100 mL). A camada orgâ- nica é separada e a camada aquosa é extraída com EtOAc (2 x 250 mL). Os -. extratos orgânicos combinados são secos sobre Na>zSO;, filtrados e concen- trados para dar o produto bruto, o qual é levado para a etapa seguinte sem qualquer purificação adicional. Rendimento = 16,5 g (73%). '*H RMN (400 MHz, DMSO-d;s) 5 11,50 (bs, 1H); 7,90 (d; y = 7,6 Hz; 1H); 6,86 (d; J =7,6 | Hz; 1H); 5,88 (s, 1H); 4,64 (s, 2H); 3,91 (s, 3H); 2,38 (s, 3H). | Preparo 4 | Éster terc-butílico do ácido 5-amino-3-(2-metóxi-6-metil-piridin-3- | i)-pirazol-1-carboxílico

PD

NS 1 7O N "NH, 2 Uma solução de 5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il- amina (16,0 g; 78,3 mmol) em THF (200 mL) é adicionada lentamente a uma suspensão agitada de NaH (60% em óleo mineral; 3,4 g; 85,0 mmol) em THF (200 mL) a 0ºC. Após 15 min a 0ºC, di-terc-butildicarbonato (19,8 mL; 86 mmol) é adicionado lentamente à mistura da reação e agitado a 0ºC du- rante 30 min. A mistura da reação é arrefecida com água gelada (aproxima- damente 250 mL) e o produto é extraído em acetato de etila (2 x 500 mL). As porções orgânicas combinadas são lavadas com água e solução saturada de

————————————— ss. MOOSC.—2 D”5“2«p—pCÇÂADr>A5ARnDODPCCNA.Ç9.APÔpM aeee o AAA A A A A a ra amo 11/30 . NaCi (200 mL), secas sobre Na;SO, anidro, filtradas e concentradas sob vácuo para produzir material bruto. Este material é triturado com hexano du- as vezes para se obter 18,5 g (78%) do composto do título. *H RMN (400 MHz, DMSO-d;s) 5 8,05 (d; J = 7,6 Hz; 1H); 6,90 (d; J = 7,2 Hz; 1H); 6,28 (s, 2H);5,85(s,1H);3,90(s, 3H); 2,40 (s, 3H); 1,56 (s, 9H). Preparo 5 Éster ferc-butílico do ácido (R)-3-(6-[2-ferc-butoxicarbonil-5-(2- metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-ilamino]-pirazin-2-ilóxi)-piperidina-1- carboxílico

PARANDO i oo Á À MK. SeY o Uma mistura de éster terc-butílico do ácido 5-amino-3-(2-metóxi- 6-metil-piridin-3-il)-pirazol-1-carboxílico (50,0 g; 164,5 mmol), (R)-3-(6- cloropirazin-2-il)oxipiperidina-1-carboxilato de ferc-butila (56,6 g; 180,9 mmol), 4,5-bis-difenilfosfanil-9,9-dimetil-9H-xanteno (14,2 g; 24,6 mmol) e Cs2C0O; (85,5 g; 263 mmol) em 1,4-dioxano (1,4 L) é igualmente dividido em doisfrascos de fundo redondo lado a lado e ambos são purgados com argô- nio durante 2 h. Pd(OAc)>? (5,4 g; 24,6 mmol) é adicionado (metade a cada vaso) e a purga continua durante 1 h. As reações são, em seguida, aqueci- das a 90 - 95ºC durante 1 h. As misturas da reação são arrefecidas à tempe- ratura ambiente, combinadas e diluídas com acetato de etila (1 L). A mistura é então filtrada através de terra diatomácea, lavada com acetato de etila e o filtrado é concentrado. O produto bruto é purificado em sílica gel com EtOAc a 15% / hexano como eluente para proporcionar 55 g (57% de rendimento) de um pó branco. Esses 55 g do produto purificado são combinados com 15 g de material preparado de forma similar e purificado (obtido a partir de 20 g | de éster ferc-butíilico do ácido 5-amino-3-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)- | pirazol-1-carboxílico). Os 70 g combinados de material são dissolvidos em uma mistura 4:1 de THF e metanol (1,4 L) e tratados com QuadraSilº AP

———— A A ———J—/]/]/"" 12/30 . (140 g) durante 2 h. A mistura da reação é filtrada através de terra diatomá- cea e lavada com acetato de etila (4 x 100 mL). O filtrado é novamente agi- tada com QuadraSilº AP (140 g) durante 2 horas e filtrado como anterior- mente. O solvente é evaporado para dar o composto do título como um sóli- —dobranco. Rendimento = 70 g (47%). ES/MS m/z 582,5 [M + HJ”. Exemplo 1 (R)-[5-(2-Metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin- 3-ilóxi)-pirazin-2-il)-amina

Í DS

NS AN o o LA

P N N N &, A uma solução agitada de éster terc-butílico do ácido (R)-3-(6-[2- terc-butoxicarbonil-5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)- 2H-pirazol-3-ilamino]- pirazin-2-ilóxi)-piperidina-1-carboxílico (13,0 g; 22,3 mmol) em diclorometano (150 mL), é adicionada uma solução de ácido trifluoroacético (12,4 mL; 167 | mmol) em diclorometano (20 mL) ao longo de um período de 5 min a 0ºC. A reação é deixada a aquecer até a temperatura ambiente e agitada durante 3 | h.A reação é diluída com diclorometano (1000 mL), seguido pela adição de solução saturada de bicarbonato de sódio (250 mL) e em seguida agitada durante 4 h. A porção orgânica é separada e seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e evaporada. O material resultante é cristalizado a partir de isopropanol para se obter o produto desejado. Rendimento = 7,2 g (85%). *H —RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 12,40 (s, 1H); 9,71 (s, 1H); 8,02 (d, J = 7,6 Hz; 1H); 7,97 (s, 1H); 7,46 (s, 1H); 6,93 (d, J = 7,6 Hz; 1H); 6,91 (s, 1H); 4,94 - 4,86 (m, 1H); 3,97 (s, 3H); 3,20 - 3,13 (m, 1H); 2,83 - 2,75 (m, 1H); 2,57 (dd; J = 12,0; 84 Hz; 1H); 2,53 - 2,45 (m obscuro, 1H); 2,42 (s, 3H); 2,15 - 2,05 (m, 1H); 1,71 - 1,63 (m, 1H); 1,60 - 1,49 (m, 1H); 1,49 - 1,40 (m, 1H); ES/MS mz382,5[M+H]. Exemplo 2 Sal do ácido metano sulfônico (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-

EE MACS TA TR RR SS RR SR RAS coa SERRA isto . 13/30 SJ iI)-2H-pirazol-3-i1]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina (S

NZ AN To LA Ó N N N & - CH;SOH | NH Ácido metano-sulfônico (0,247 g; 2,57 mmol) é adicionado a uma solução agitada de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-i1]-[6- (piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il)-amina (0,982 g; 2,57 mmol) em diclorometano (25mL)a0C.A reação é deixada a aquecer até a temperatura ambiente e agitada durante 45 min. O solvente é evaporado, e o sal resultante é lavado ' com éter (10 ml) e pentano (10 mL) sequencialmente para se obter o produto desejado. Rendimento = 1,139 g (92,6%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-ds), 5 12,5 (bs, 1H); 9,81 (s, 1H); 8,73 (bs, 1H); 8,54 (bs, 1H); 8,07 (s, 1H); 7,96 (d; J=7,6Hz;1H);7,56 (s, 1H); 6,95 (d; J = 7,6 Hz; 1H); 6,81 (s, 1H); 5,31 - 5,24 (m, 1H); 3,97 (s, 3H); 3,48 - 3,39 (m, 1H); 3,39 - 3,30 (m, 1H); 3,18 - 3,10 (m, 1H); 3,10 - 3,01 (m, 1H); 2,43 (s, 3H); 2,32 (s, 3H); 2,03 - 1,85 (m, 3H); 1,73 - 1,65 (m, 1H); ES/MS m/z 382,4 [M + HI*. Exemplo 3 Sal do ácido acético (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H- pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina (Ss - NON ON HH « CH,COH Ê& A uma solução de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol- | 3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il])-amina (0,100 g; 0,26 mmol) em dicloro- | metano (10 mL), adiciona-se ácido acético (0,015 mL; 0,26 mmol) dissolvido em diclorometano (1 mL) a 0ºC. A mistura da reação é agitada durante 60 minutos à temperatura ambiente e em seguida o solvente é evaporado para se obter um resíduo. O resíduo é triturado com dietil éter (20 mL), seguido ii cc0ttlcmimmcoslôsaiôsôiôtmilScnôisôitciôiôsiilinC DÓ TSTOQRÇUÇ”ÔÇEÔUI TE OO OCA ÂRÔseccc ee) UU ai llieêêiiEoiSÇEÇ TEA SilSiSiSiSôsiOOcnS CR ÕO qQOCOUCÔÉicLCÔSôSitl cSScôSSAULcôôSôtit dC SôôFcSÔSSÔSSS SRA ôSiôtOiSôSôSôSôSSttalAiOcSSsSsoicc ciciiilÚi SESI» NI» NiOEêNoci0A 14/30 ' de n-pentano (20 mL). O material é seco sob alto vácuo durante 4 h para se Í obter o produto desejado.

Rendimento = 0,060 g (51,8%). '*H RMN (400 | MHz, DMSO-ds) 5 12,40 (bs, 1H); 9,70 (s, 1H); 8,02 (d; J = 7,6 Hz; 1H); 7,98 | (s, 1H); 7,46 (s, 1H); 6,94 (d; J = 7,6 Hz; 1H); 6,90 (s, 1H); 4,97 - 4,38 (m, Í 1H); 3,98(s, 3H); 3,20-3,13(m, 1H); 2,83 - 2,74 (m , 1H); 2,66 - 2,56 (m, 1H); 2,42 (s, 3H); 2,14 - 2,03 (m, 1H); 1,89 (s, 3H); 1,74 - 1,62 (m, 1H); 1,61 - Í 1,51 (m, 1H); 1,50 - 1,40 (m, 1H); 1,30 - 1,20 (m, 1H); ES/MS m/z 382,5 [M + HT. | Exemplo 4 | . 10 Sal hemioxalato de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H- Í pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il)-amina | a os | N | NO Ô os mo À OoH NH o A uma solução de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol- 3-iI]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina (0,100 g; 0,26 mmol) em dicloro- metano (10 mL), adiciona-se ácido oxálico (0,012 mg; 0,13 mmol) dissolvido em MeOH(0,1 mL) a 0ºC.

A mistura da reação é agitada durante 60 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, o solvente evaporado para se obter um resíduo.

O resíduo é triturado com dietil éter (20 mL), seguido de n- pentano (20 mL). O material é seco sob alto vácuo durante 4 h para se obter o composto do título.

Rendimento = 0,095 g (77%). 'H RMN (400 MHz, DM- SO-ds;) 59,77 (s, 1H); 8,07 (s, 1H); 7,95 (d; J = 7,6 Hz; 1H); 7,55 (s, 1H); 6,95 (d; J = 7,6 Hz; 1H); 6,79 (s, 1H); 5,33 - 5,24 (m, 1H); 3,97 (s, 3H); 3,45 - 3,30 (m, 2H); 3,18 - 3,09 (m, 1H); 3,08 - 2,98 (m, 1H); 2,42 (s, 3H); 2,05 - 1,85 (m, 2H); 1,74 - 1,63 (m, 1H); 1,48 - 1,410 (m, 1H); ES/MS m/z 382,4 [M + HJ*. Exemplo 5 Sal hemissuccinato de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-i1)-2H- pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-i])-amina

: OS QD. sm pon [Qt o A uma solução de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol- 3-i1]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il)-amina (0,1 g; 0,26 mmol) em diclorome- tano (10 mL), adiciona-se ácido succínico (0,015 g; 0,13 mmol) dissolvido em etanol (1 mL, dissolvido a 50ºC) à temperatura ambiente. A mistura da : 5 reação é agitada durante 2 h à temperatura ambiente. O solvente é evapo- rado e o resíduo obtido é triturado com dietil éter (20 mL), seguido de n- -. pentano (20 mL). O material é seco sob alto vácuo durante 8 horas para se obter o composto do título. Rendimento = 0,102 g (78%). *'H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 12,4 (bs, 1H); 9,72 (s, 1H); 8,05 - 7,96 (m, 2H); 7,48 (s, 1H); Í 6,93(d;J=7,6Hz; 1H); 6,86 (s, 1H); 5,06 - 4,97 (m, 1H); 3,97 (s, 3H); 2,90 - | | 2,81 (m, 1H); 2,74 - 2,62 (m, 1H); 2,42 (s, 3H); 2,30 (s, 2H); 2,09 - 2,01 (m, 1H); 1,80 - 1,60 (m, 2H); 1,57 - 1,46 (m, 1H); 1,44 - 1,40 (m, 1H); 1,410 - 1,00 (m, 1H); ES/MS m/z 382,4 [M + HI*. Exemplo 6 Hidrato de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6- (piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il)-amina Suspender (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6- (piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il)-amina (52,1 mg; ES/MS m/z 382,2 [M + HJ) em mistura de água-etanol a 5:95 (10 mL) e pasta fluida à temperatura ambiente durante 48 horas. Um sólido branco cristalino foi recuperado por filtração a Vácuo.

Padrões de difração de pó de raio X (XRD) de sólidos cristalinos são obtidos em um difratômetro de pó de raio X Bruker D4 Endeavor, equi- pado com uma fonte de CuKa (A = 1,54060 À) e um detector Vantec, ope- randoa35kVe50maA.A amostra é varrida entre 4 e 40º em 26, com um tamanho de etapa de 0,009º em 28. O pó seco é embalado em um suporte de amostras de quartzo e uma superfície lisa é obtida utilizando uma lâmina

—J—s—ssss—ssos—s——ssss ss qc cqopspspstptpóRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR A —"— [ 16/30 ' de vidro. No presente caso, uma variabilidade de posição de pico de + 0,2 em 28 leva em conta as variações potenciais sem impedir a identificação inequívoca da forma de cristal indicada. A confirmação de uma forma de cristal pode ser feita com base em qualquer combinação única de picos dis- tintivos (em unidades de *º 26), tipicamente os picos mais proeminentes. Os padrões de difração de forma de cristal, coletados à temperatura ambiente e umidade relativa, foram ajustados com base em picos de padrão NIST 675 a 8,85 e 26,77 graus 2-teta. Assim, uma forma cristalina de amostra do composto é caracte- : 10 rizada por um padrão de XRD, utilizando radiação CuKa como tendo picos i de difração (valores de dois-teta) como descrito na Tabela 1 abaixo. Especi- -. ficamente, o padrão contém um pico a 5,17 em combinação com um ou mais dos picos selecionados a partir do grupo que consiste em 15,73; 17,71 e 20,12, com uma tolerância para os ângulos de difração de 0,2 graus. Tabela 1: picos de difração de pó de raio-X do Exemplo 6 [| Bieo Ângulo (* 2-Teta) Intensidade (%) LILI e Bu Bea voga Ba | Lo 5 13,21 O 15,78 16,17 poa | 8 17,71 FE 18,00 20,12 2331 O

2.52 32,95 Ensaio Bioquímico da Chk1 O efeito dos compostos sobre a atividade bioquímica da Chk1 pode ser determinado utilizando um ensaio de ligação de filtro de peptídeo CHK1/substrato. Neste ensaio, um peptídeo sintético com base nos resíduos da sequência de aminoácidos 206-225 de Cdc25 é utilizado como um subs- trato aceitador de fosfato para proteína quinase recombinante Chk1. Usando

[.."2[CJà——s...——.———PZFPÁZÚ7ÍD5“SP4“““ rq< A «p«—“—232—““C2“JPPD“<-——————»—»—»s.ps=sÚ oo ess————pppooos—————= RA ooo — 17/30 . y-*P-ATP como substrato doador de fosfato, Chk1 transfere o grupo y- **fosfato radioativo para o peptídeo sintético.

À reação é medida através da captura do substrato peptídico em uma placa de filtro de papel de troca iôni- ca e contagem de cintilação de partículas beta emitidas.

As reações de quinase (40 ul de volumes da reação) são reali- zadas em placas de poliestireno de fundo em V de 96 poços.

As reações são iniciadas com a adição da enzima Chk1. As condições finais da reação são 67 mM HEPES sal de sódio de pH 7,4; 0,007% (v / v) de TRITONTY X-100; 2,7 MM de DTT; 2,7 mM de MgCl,, 12 uM de substrato peptídico, 60 uM ATP sal dissódico; 0,75 pCiy-""P-ATP; 0,75 nM da enzima Chk1 ativa, 4% (v / v) de DMSO e diluição em série do composto (diluição em série de 1:3, a partir “ de 20 uM, 10 pontos). Seguindo a adição da enzima Chk1, as reações são incubadas à temperatura ambiente durante 90 min, e depois terminadas com a adição de 140 ul de ácido fosfórico.

A mistura da reação é transferida para os poços correspondentes de uma placa de filtro opaca de papel de troca catiônica de fosfocelulose para assentar durante 30 min.

A placa de filtro é lavada em um coletor de vácuo com cinco lavagens de 200 uL de ácido fosfórico a 0,5% (v 1 v). A placa de filtro é seca durante a noite antes da adição de 40 ul de Mi- croscintº -20 a cada poço da placa.

Depois de assentar durante 4 h à tempe- | ratura ambiente, a radioatividade na placa é medida utilizando um contador de cintilação de microplaca MicroBeta Trilux (Perkin Elmer). | Para determinação do ICs5,, a percentagem de inibição para cada | concentração é calculada utilizando a razão de contagem de cintilação a par- tirde controles executados em cada placa.

Os dados de concentração de | composto de 10 pontos são posteriormente ajustados a uma equação logís- | tica de quatro parâmetros, utilizando ActivityBase 4.0. Valores de ICs5 abso- Í lutos são calculados a partir da curva resultante.

Os compostos da invenção são testados neste ensaio executado substancialmente como descrito aci- | ma.

Por exemplo, o composto do Exemplo 1 é testado e verifica-se que tem | um ICs5,9 de < 0,001 uM (n = 6). Além disso, o composto do Exemplo 2 é tes- tado e verifica-se que tem um ICs55 de < 0,001 uM (n = 3). Estes resultados

3222 2.2 q«Os“2€2 Oq5«.S2“j€CC-A.2 CAM ON OO AA A O O o Ee eee a | 18/30 ' indicam que os compostos dentro do âmbito da presente invenção são po- tentes inibidores de Chk1. Ensaio Bioquímico de Chk2 O efeito dos compostos sobre a atividade bioquímica de Chk2 — pode ser determinada utilizando um ensaio de ligação de filtro de peptídeo CHK2/substrato.

Neste ensaio, um peptídeo sintético com base nos resíduos da sequência de aminoácidos 206-225 de Cdc25C é utilizado como um substrato aceitador de fosfato para proteina quinase Chk2 recombinante.

Usando y-**P-ATP como o substrato doador de fosfato, Chk2 transfere o : 10 grupo y-**P radioativo para o peptídeo sintético.

A reação é medida através ] da captura do substrato peptídico em uma placa de filtro de papel de troca - catiônica e contagem de cintilação de partículas beta emitidas.

As reações de quinase (40 ul de volumes de reação) são reali- zadas em placas de poliestireno de fundo em V de 96 poços.

As reações são iniciadas com a adição de enzima Chk2. As condições de reação finais são 67 mM de HEPES sal de sódio pH 7,4; 0,007% (v / v) de TRITONS X-100; 2,7 MM de DTT; 2,7 mM de MgCl2; 12 UM de substrato peptídico, 60 uM de ATP sal dissódico; 0,75 pCiy-**P-ATP; 1,4 NM de enzima Chk2 ativa; 4% (v / v) de DMSO e diluição em série do composto (diluição em série de 1:3, a partirde20 uM, 10 pontos). Após adição da enzima Chk2, as reações são incubadas à tem- peratura ambiente durante 90 min, e depois terminadas com a adição de 140 uL de ácido fosfórico.

A mistura da reação é transferida para os poços cor- respondentes de uma placa de filtro opaca de papel de troca catiônica de fosfocelulose para assentar durante 30 min.

A placa de filtro é lavada em um coletor de vácuo com cinco lavagens de 200 uL de ácido fosfórico a 0,5% (v Iv). A placa de filtro é seca durante a noite antes da adição de 40 ul de Mi- croscint?-20 a cada poço da placa.

Depois de assentar durante 4 h à tempe- ratura ambiente, a radioatividade na placa é medida utilizando um contador de cintilaçãode microplaca MicroBeta Trilux (Perkin Elmer). Para a determinação do ICs,., a percentagem de inibição para cada concentração é calculada utilizando a razão TR-FRET de controles e-

——————,, ——— ——-..— —..—.——.————Ú| ss aos e—Ç pe sep— 19/30 ' xecutados em cada placa.

Os dados de concentração de compostos de 10 pontos são posteriormente ajustados a uma equação logística de quatro pa- râmetros, utilizando ActivityBase 4.0. Valores de ICso absolutos são calcula- dos a partir da curva resultante.

Os compostos da invenção são testados neste ensaio executado substancialmente como descrito acima.

Por exem- plo, o composto do Exemplo 1 é testado e verifica-se que tem um ICs9 de 0,011 uM (SE = 0,002; n = 6). Além disso, o composto do Exemplo 2 é tes- tado e verifica-se que tem um ICs9 de 0,012 uM (SE = 0,008; n = 3). Estes resultados indicam que os compostos dentro do âmbito da presente inven- . 10 çãosão potentes inibidores de Chk2. ' Ensaio à Base de Célula de Autofosforilação de Chk1 - Um inibidor de Chk1 irá impedir a atividade da proteína quinase de substratos de fosforilação em células nas quais a resposta a dano de DNA foi ativada.

Um substrato facilmente detectável para Chk1 é um sítio de —autofosforilação na própria Chk1, serina 296. O ensaio de imunoblot a seguir pode ser usado para medir a quantidade de fosforilação da serina 296 em Chk1 e indiretamente o nível de atividade da proteína quinase Chk1. Células HeLa são cultivadas em solução salina equilibrada de Earle MEM w / com L- glutamina suplementada com 10% (v / v) de soro bovino fetal inativado por calor, 1xMEM aminoácidos não-essenciais, 1x piruvato de sódio e 1 x 10º células plaqueadas em 600 ul de meio de cultura MEM por poço de uma placa de cultura de células de 24 poços.

As células são incubadas durante 24 horas a 37ºC, 5% de CO, e 95% a 100% de umidade.

Dezesseis ul. de uma estoque a 4 uM de doxorubicina em meio de cultura são adicionados a cada poço apropriado para fazer uma concentração final de 100 nM de do- xorrubicina.

As placas são devolvidas à incubadora durante 24 horas adicio- nais antes da adição do composto inibidor de Chk1. Os compostos são solu- bilizados a 10 mM em DMSO a 100%, em seguida diluídos a 2 mM em DM- SO a 40% (v / v) e em seguida diluídos a 100 UM com meio de cultura mais DMSO a4% (v/v). Subsequentemente, diluições em série dos compostos (1:3) são preparadas ao longo de um intervalo de 100 uM a 0,005 uM.

Ses- senta e seis ul. de estoque de composto são adicionados aos poços apro-

RR... cos sos eos o osPs—.ecsss > Pe oq—————ssssesoºoosss———— spp 20/30 ' priados na placa para produzir uma concentração final de DMSO de 0,4% (v / v) e um intervalo de concentração de composto final entre 1 UM e 0,0005 UM.

As placas são devolvidas à incubadora durante mais 2 h e, em seguida, removidas para lise das células e processamento.

O meio é então removido da placa,cada poço lavado uma vez com 0,5 mL de Solução Salina Tampo- nada com Fosfato gelada da Dulbecco (DPBS), todo o líquido é retirado, e a placa é colocada em gelo para o restante do procedimento.

A cada poço, são adicionados 75 ul de tampão de lise gelado, que consiste em Tampão de Extração Celular contendo coquetel inibidor de fosfatase (Sigma, catit . 10 POO44 + P5725)e comprimidos do coquetel inibidor de protease (Roche Di- agnostics, cat 11836153001). Depois de 10 min, cada poço é raspado e o “o lisado transferido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de polipropileno em gelo.

Cada lisado é sonicado durante 45 segundos com um sonicador de copo de chifre de placa (Misonix) enquanto suspenso em um banho de água /gelo.

Cinquenta ul de cada amostra são transferidos para um tubo de mi- crocentrífuga de polipropileno de 0,5 ml contendo 25 ul. de 4x Tampão de Amostra Laemmli, aquecidos a 95ºC durante 5 min e armazenados congela- dos a -80ºC.

O lisado restante é usado para a determinação da concentra- ção de proteína (kit de ensaio de proteínas BCA, Thermo Scientific). Cinco ugdecadalisadode células em tampão de amostra são aplicados a um gel de 96 poços E-Page e submetidos à eletroforese.

As proteínas são eletro- transferidas do gel para membrana Immobilon-P PVDF (0,45 um) de acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica (Towbin et a/., PNAS (1979) 76(9), 43504). A membrana é lavada brevemente com 10 mM de Tris / HCl pH38,0,150mM de NaCl e 0,05% (v/v) de Tween 20 (TBST) e embebida durante uma hora a 25ºC em TBST / 5% (v / v) de leite instantâneo Carnati- onº reconstituído.

A membrana é lavada quatro vezes com TBST durante 5 minutos, em seguida embebida a 4ºC durante 24 h em TBST / 5% (w / v) de albumina de soro bovino com uma diluição adequada de anti-fosfo-Chk1 (se- rina296)de coelho.

A membrana é lavada 4 x com TBST durante 5 minutos a 25ºC e, em seguida, embebida a 25ºC durante 2 h em TBST / leite a 5% contendo uma diluição adequada de IgG anticoelho de burro conjugado a

2222—3D———————....PP".——————————————.———»—«—«..—.—.——.—€€€——. q ARg«5gR<ARRAAA A O AO O AAA 21/30 ' peroxidase de rábano silvestre (GE Healthcare, cat ?t! NA9340 ) para detectar a proteina Chk1 autofosforilada. A membrana é lavada novamente 4 x com TBST durante 5 minutos a 25ºC. Conjugados Antígeno-anticorpo-repórter imobilizados na membrana são detectados com o reagente de detecção de HRP Super Signal Western Femto utilizando um sistema de formação de imagens FUJI LAS-4000. Intensidades de banda Fosfo-Chk1 (ser296) são calculadas usando software "Total Lab" (Nonlinear Dynamics). A percenta- gem de inibição da autofosforilação de Chk1 induzida por doxorrubicina é calculada usando a seguinte fórmula: % de inibição = (amostra-intensidade . 10 de banda fosfo-Chk1 - nenhum controle negativo de doxorrubicina - intensi- ' dade de banda fosfo-Chk1) / (controle positivo de doxorrubicina-intensidade .., de banda fosfo-Chk1-nenhum controle negativo de doxorrubicina-intensidade de banda fosfo-Chk1) x 100. Os compostos da invenção são testados neste ensaio executado substancialmente como descrito acima. O composto do Exemplo 1 é testado neste ensaio e verificou-se que tem um valor de ECso de < 0,001 uM (n = 1). O composto do Exemplo 3 é testado neste ensaio e verificou-se que tem um valor de EC5o de <0,001 uM (n = 1). Estes resulta- dos indicam que compostos dentro do âmbito da presente invenção são po- tentes inibidores da Chk1.

Ensaio Acume à Base de Células HeLa de Anulação do Ponto de Verificação G2M Induzido por Doxorrubicina Um inibidor de Chk1 irá desativar o ponto de verificação de da- nos no ADN G2M em células tumorais p53-minus tratadas com o inibidor da topoisomerase Il, doxorrubicina. Uma medição da anulação do ponto de veri- ficação G2M é a fosforilação da histona H3 em serina 10 que ocorre depois que as células atravessam o ponto de verificação G2M e entram em mitose. O ensaio de formação de imagens de alto conteúdo seguinte pode ser usado para medir a fosforilação da histona H3 em células. Células HeLa são culti- vadas em Meios MEM suplementados com 10% (v / v) de FBS e plaqueadas —a2000 células por poço em placas pretas de fundo claro revestidas com poli D-lisina, 100 ul de volume por poço. As placas são então incubadas em um incubador de cultura de células durante 18-24 h (37ºC, 5% de CO, e 95% de

F.3.—e..———s———»»5pA.CPDP vue 22/30 ' umidade relativa). Após a incubação inicial, 20 ul de Meios MEM mais FBS a 10% contendo 625 nM de doxorrubicina são adicionados aos poços ade- quados da placa resultante em uma concentração final de 125 nM.

As placas são devolvidas à incubadora durante 24 horas, suficiente para prender as —célulasno ponto de verificação G2M.

No dia seguinte, as células são trata- das com compostos.

Os compostos são solubilizados a 10 mM em DMSO a 100% e depois diluídos a um estoque 10x a partir de 50 UM em MEM mais 4% (v / v) de DMSO.

Subsequentemente, diluições em série dos compostos (1:2) são preparadas ao longo de um intervalo de 50 uM a 0,39 uM.

Treze ul ' 10 de estoque de composto são adicionados aos poços apropriados na placa : para produzir uma concentração final de DMSO de 0,4% e um intervalo de o concentração de composto final entre 5 uM e 0,039 UM.

As placas são de- volvidas à incubadora durante mais 7 h e, em seguida, removidas para fixa- ção.

O líquido é cuidadosamente removido de cada poço e 100 uL de fixador PREFERº são adicionados.

As placas são mantidas à temperatura ambiente durante 20 min, o fixador removido e as células são então permeabilizados pela adição de 100 uL / poço de 0,1% (v / v) de Tritonº X 100 em DPBS du- rante 10 minutos.

A solução é removida e a placa lavada duas vezes com 100 ul. de DPBS por poço, seguido pela adição de 100 ul de DPBS conten- do50 ug/mL de Ribonuclease A (RNAase, do pâncreas bovino) durante uma hora à temperatura ambiente.

A solução de RNAase é removida e as células tingidas quanto à presença de histona H3 fosforilada em serina 10 (phh3), adicionando-se a cada poço 50 ul. de solução de RNAase contendo uma diluição de 1:500 de anti-phh3 de coelho (ser10) mais 1% (w / v) de BSA.

As —placassão seladas e mantidas a 4 ºC durante a noite.

O anticorpo primário é removido por lavagem de cada placa duas vezes com 100 ul de DPBS por poço e substituído com 50 ul de uma diluição a 1:750 de IgG anticoelho de cabra Alexa Fluor& 488 (H + L) (2 mg / ml) em DPBS mais 1% (w / v) de BSA.

As placas são mantidas durante uma hora à temperatura ambiente co- — bertas com folha de alumínio para proteger da luz.

As placas são novamente lavadas duas vezes com 100 uL por poço de DPBS e substituídas com 100 ul de 15 nM de iodeto de propídio (diluição a 1:100 com PBS a partir da so-

2222.“ O2. OOgsNs€*€*NCÇÇÇÇA AO OO A AA O o A A A a AO 23/30 ' lução original). As placas são seladas com um selo preto para proteger as placas da luz. As placas são incubadas durante 30 minutos para tingir os núcleos. As placas são varridas com citômetros de microplacas de fluores- cência de varredura a Laser ACUMEN EXPLORER, usando excitação a 488nm(TTPLABTECH LTC) para medir o conteúdo de pHH3 e ADN inclu- indo 2N e 4N. As células positivas phh3 são identificadas pela intensidade média a 519 nm de Alexa 488. A intensidade total a 655-705 nm a partir de iodeto de propídio / ADN é utilizada para identificar células individuais e sub- populações em ciclo celular (células 2N, 4N células). A leitura final para cada . 10 população é determinada através da normalização para o percentual do total ' de células com uma produção de ensaio final de %pHH3, %2N e %4N. SO 100% de atividade é então determinado por tratamento das células com a concentração máxima de um composto de controle inibidor a 100 nM para determinar o percentual de atividade final de cada composto. 0% de ativida- de baseia-se na ausência de tratamento com composto. O ECrs, relativo é determinado usando ACTIVITY BASE”, ajuste excel, ajuste de curva utili zando um ajuste logístico de quatro parâmetros, equação 205, para determi- nar o percentual de pHH3 em relação ao controle máximo a 100%. Os com- postos da invenção são testados neste ensaio executado substancialmente como descrito acima. O composto do Exemplo 1 é testado e verificou-se que tem um ECs, de 0,029 uM (n = 1). Os compostos do Exemplo 2 e Exemplo 3 são testados e verificou-se que têm resultados de ECs9 de 0,033 uM (n = 1) e 0,019 UM (n = 1), respectivamente. Estes resultados indicam que os com- postos dentro do âmbito da presente invenção irão desativar o ponto de veri- ficaçãodedanosdo DNA G2M.

Ensaio de ECrxs, (Duas Vezes Sensibilização) Um inibidor de Chk1 pode potenciar a atividade antiproliferativa de gemcitabina (ou outros agentes citotóxicos) através de anulação do ponto de verificação de fase intra-S, o que resulta em danos ao ADN prolongados e aumentados. A capacidade para a proliferação contínua de células tumo- rais após o dano ao DNA pode ser analisada através da determinação da capacidade das células de replicar o seu ADN. Este ensaio avalia a capaci-

2.2". «s««jj“jOonCCCANOANOO A A A A O A AAA eo A 24/30 | ' dade das células de replicar seu DNA, depois que as células tiveram uma oportunidade para reparar danos ao ADN.

Neste ensaio, as células são tra- tadas com uma série de diluição de gemcitabina e em seguida, 22 h mais tarde, com o composto do Exemplo 3. Após um adicional de 44 h, o número relativo de células é avaliado por um ensaio de redução de corante de MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-i1)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H- tetrazólio). O parâmetro EC é uma medida da concentração de um inibidor de Chk1 necessário para reduzir à metade a concentração de GI90 de gem- citabina, medida neste ensaio na ausência de inibição de Chk1. As células . 10 HT-29 (obtidas de ATCC) são cultivadas em RPMI 1640 mais 10% (v / v) de FBS inativado pelo calor.

As células são plaqueadas a 2,5 x 10º por poço, - em um volume de 100 yL em placas de cultura de tecidos de 96 poços e in- cubadas durante 24 h.

Diluições de gemcitabina são preparadas a concen- trações de 6x em meio 5A de McCoy (modificado) (1x) e adicionadas aos poços a20 uL por poço.

Diluições de Gemcitabina foram criadas com a mai- or concentração final de gemcitabina sendo 1,0 uM e diluições feitas por e- tapas de três vezes a 0,5 nM.

Inibidor de Chk1 é preparado por diluições em DMSO a uma concentração final de 4000x e, em seguida, diluído 666 vezes em meio de McCoy para gerar estoques a 6x.

Diluições de inibidor de Chk1 continuam por etapas de 2,5 vezes a partir de 25 nM até 0,3 nM.

Vinte e duas horas após a adição de gemcitabina, inibidor de Chk1 é adicionado em um volume de 24 yuL à poços contendo 120 ul de meio mais gemcitabina.

Cada diluição de gemcitabina recebe uma única diluição de inibidor de Chk1. Os poços de controle receberam apenas DMSO, gemcitabina ou inibidor de Chk1. Qua- renta e quatro horas após a adição do inibidor de Chk1, 30 ul de reagente de ensaio AQueocus CeliTiter 96º são adicionados a cada poço e mantidos à temperatura ambiente durante 1 hora e 45 minutos.

A absorbância é lida em um espectrofotômetro SpectraMax 250 (Molecular Devices) a 490 nm.

Os dados do espectrofotômetro SpectraMax são analisados com GraphPad Prism 4.0. Em primeiro lugar, uma média de absorbância de controle sem células é subtraída de todos os outros valores na matriz de dados de cada

———PA—— ———.——p—— ——————————.— ————————————..—————————r—-— 25/30 | ' placa. Em seguida, calcula-se uma média dos pontos de dados duplicados. Os dados são normalizados para cada concentração de inibidor de Chk1, com número de células a 0% definido como Ausso = O corrigido, e o número de células a 100% definido como o valor médio de gemcitabina a O nM. Es- tes resultados são, então, transformados. Concentrações de gemcitabina são convertidas para concentrações log e valores do número de células | normalizados são convertidos em percentual de inibição (inibição percentual | = 100 - valor normalizado). Os dados transformados são colocados em gráfi- co, e uma regressão não-linear é executada para estimar um valor de ICso . 10 de gemcitabina em cada concentração de inibidor de Chk1. A regressão ' não-linear é calculada permitindo a variação da curva, e sem restrições para * a parte superior ou inferior das curvas dose-resposta. O valor de EC; é cal- culado como segue: valores de Gls5 para gemcitabina para cada concentra- ção de inibidor de Chk1 são determinados, colocados em gráfico e a concen- 15 tração de inibidor de Chk1 necessária para diminuir apenas o Gls5º da gemci- tabina em duas vezes é determinada por interpolação. Os compostos dentro do âmbito da invenção são testados neste ensaio executado substancialmente como descrito acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 3 é testado e verificou-se que tem um valor de EC 20 de10nM(SE=0,1;n=3). Além disso, 25 nM do composto diminuem o ECrso de gemcitabina 7 vezes de 22 nM e 3 nM em células HT-29 de câncer de cólon. Sozinhos, 25 nM do composto do Exemplo 3 têm pouco efeito so- bre a proliferação de células HT-29. Estes resultados indicam que os com- postos dentro do âmbito da presente invenção efetivamente potenciam a 25 atividade antiproliferativa de gemcitabina em baixas concentrações. Valores de IC5oº de Gemcitabina obtidos com o tratamento de vá- rias concentrações do Exemplo 3

E o 22 0,256 23 0,64 19 1,60 14 4,0 10 4 3

' Ensaio de Inibição de Alvo in vivo de Chk1 Células Calu-6 são cultivadas em meio de crescimento (MEM com Solução Salina Equilibrada de Earle com L-glutamina suplementada com 10% (v / v) de FBS inativado pelo calor, 1x aminoácidos não-essenciais MEM, 1x piruvatode sódio) e expandidas.

As células são colhidas e lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato e 1 x 10º células em meio de crescimento (sem soro) são misturadas com um volume igual de matriz BD Matrigelº, então injetadas subcutaneamente no flanco de camun- dongos nus pré-irradiados (4,5 Gy) (nu atímico). No dia 15 após o implante . 10 (tamanho do tumor = 150 - 200 mm?), gemcitabina formulada fresca em so- À lução salina diariamente é administrada aos animais por via intraperitoneal " na dose de 150 mg / kg.

Seis horas depois, os animais são administrados oralmente com o composto Chki formulado em Tween-80 a 0,2% / metilce- lulose a 0.5% pH ajustado a 6,8 por adição de NaOH diluído.

Os animais são sacrificados 2 horas após a dose de inibidor de Chk1, tumores colhidos e processados imediatamente em tampão de Extração de Células gelado con- tendo coquetel inibidor de fosfatase (Sigma, cat % POO44 + P5725) e com- primidos do coquetel inibidor da protease (Roche Diagnostics, cat É 11836153001). Os tumores são processados em 1,5 - 2,0 mL de tampão de lisee um tubo cônico de polipropileno de 15 mL congelado usando um ho- mogeneizador de tecido motorizado ajustado em modo intenso durante 15 seg.

Com a amostra mantida em gelo, o lisado é puxado quatro vezes atra- vés de uma seringa de 1 mL com uma agulha de calibre 25. 0,35 mL de lisa- do de tumor é transferido para um tubo de microcentrífuga de polipropileno de1,5mlcontendo 0,15 mL de tampão de amostra de Laemm!li 4x.

A amos- tra é, em seguida, misturada e aquecida durante 5 min a 95 ºC e sonicada durante 1 min, utilizando alta potência em um sonicador de chifre de placa Misonix 3000. As amostras são então armazenadas em gelo, ou armazena- das a -BO ºC para a avaliação da inibição alvo por western blot.

Cinco ug de cada lisadode tumor em tampão de amostra são aplicados a géis de 96 po- ços E-Page e submetidos à eletroforese.

As proteínas são transferidas para membrana de nitrocelulose BA83 Protran (Whatman, Cat. ft 10402405) de

' acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica (Towbin et al., PNAS (1979) 76 (9), 43504). A membrana é então processada para medir a prote- ina Chk1 autofosforilada em serina 296. A membrana é lavada brevemente com água, depois 10 mM de Tris / HCl, pH 8,0, 150 mM de NaCl e 0,05% (v / vwv) de Tween20 (TBST)e embebida durante uma hora a 25 ºC em TBST / 5% (p / v ) de leite instantâneo Carnation reconstituído. A membrana é então lavada quatro vezes com TBST durante 5 min. A membrana é embebida a 4ºC durante 16 h em TBST / 5% (p / v) de BSA em uma diluição apropriada de anti-fosfo-Chk1 de coelho-fosfo-Chk1 (serina 296). Em seguida, a mem- . 10 branaé lavada quatro vezes com TBST durante 5 min a 25ºC e, em seguida, embebida a 25ºC durante 2 h em TBST / 5% de leite contendo uma diluição a apropriada de IgG anticoelho de burro conjugado com peroxidase de rábano silvestre para detectar fosfo-Chk1 ( Ser 296). A membrana é lavada nova- mente quatro vezes com TBST durante 5 min a 25ºC. Conjugados antígeno- anticorpo-repórter imobilizados sobre a membrana são detectados com o reagente de detecção de HRP Super Signal Western Femto.

Os sinais são detectados e capturados usando o sistema de formação de imagens FUJI LAS-4000. Intensidades de banda fosfo-Chk1 (ser296) são calculados usando o software "Total Lab" (Nonlinear Dyna- mics). O percentual de inibição da autofosforilação de Chk1 induzida por gemcitabina é calculado utilizando a seguinte fórmula: % inibição = (amos- tra-intensidade de banda de Fosfo-Chk1 - intensidade de banda de fosfo- Chk1 de controle positivo de gemcitabina (Max) média) / (intensidade de banda de Fosfo-Chk1 (Min) de controle negativo média - intensidade de banda de fosfo-Chk1i de controle positivo de gemcitabina (Max) média) x

100.

Os compostos dentro do âmbito da invenção são testados neste ensaio executado substancialmente como descrito acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 3 é testado e verifica-se que tem uma Dose Eficaz Modulatória Alvo 50 (TMED;so) para autofosforilação de Chk1 de 1,3 mg / kg (n = 1). Este resultado indica que os compostos dentro do âmbito da presen- te invenção inibem potentemente a ativação da proteina quinase Chk1 in

.2.“.sss—s———.—*—ss0—2—25FDJZ13—»—»—»—»s socos spp 28/30 Í vivo.

Modelos de Xenoenxerto Tumoral Humanos A capacidade dos inibidores de Chk1 de potenciar a morte de tumores por agentes prejudiciais ao ADN pode ser determinada in vivo u- sando os modelos de eficácia de xenoenxerto tumoral do cólon HT-29 e pulmão Calu-6. Células de câncer pulmão Calu-6 são cultivadas em meio de crescimento (MEM com Solução Salina Equilibrada de Earle com L- glutamina suplementada com 10% (v / v) de FBS inativado pelo calor, 1x aminoácidos não-essenciais MEM, 1x piruvato de sódio) e células de câncer : 10 do cólonHT-29 As (ATCC) são cultivadas em meios de crescimento, (meio i 5A de McCoy suplementado com 10% de FBS) e expandidas. ., As células são colhidas e lavadas duas vezes com solução sali- na tamponada com fosfato e 5 x 10º células (HT-29) ou 1 x 10º células (Ca- lu-6) em meio de crescimento (sem soro) são misturadas com um volume igual de matriz BD Matrigelº, então injetadas subcutaneamente no flanco de camundongos nus CD-1 (nu / nu). | Administração Subcutânea de Inibidor de Chk1 | A cerca de 16 dias após o implante (150 - 200 mm?), gemcitabi- | na é formulada fresca em solução salina diariamente e administrada aos a- nimais por via intraperitoneal à dose de 60 mg / kg.

Vinte e quatro horas mais tarde, os animais são administrados com o composto do Exemplo 3, em 0,2% de Tween-80 / 0,5% de metilcelulose subcutaneamente BID.

Após dois dias de descanso, a dosagem é repetida por três ciclos adicionais (Q4Dx4 com o composto do Exemplo 3 deslocamento + 24 horas P.25, L22).A inibição do crescimento tumoral (TGI) é calculada como o percentu- al de redução no tamanho médio do tumor de um grupo tratado com com- posto do tamanho médio do tumor do grupo de controle tratado com veículo.

Os compostos dentro do âmbito da invenção são testados neste ensaio exe- cutado substancialmente como descrito acima.

Por exemplo, verifica-se o — composto do Exemplo 3 administrado em combinação com gemcitabina de- monstra uma excelente atividade antitumoral dependente da dose em mode- los de xenoenxerto tumoral HT-29 e Calu-6, com um aumento de até seis

' vezes na inibição do crescimento tumoral em relação à gemcitabina sozinha. Este resultado indica que os compostos dentro do âmbito da presente inven- ção administrados por via subcutânea aumentam significativamente a ativi- dade antitumoral da gemcitabina em modelos de xenoenxerto tumoral hu- manos.

HT29 Subcutânea [vo TOR TOO cemetabnasomr [mo o [memessome | o [Cemestome [ss [os [eme ami [ss [oo ns = não significante estatisticamente Calu 6 Subcutânea [vao TOR TOR [semen [OR TA [Bamessme | [so Gemexs sm | a | oe [eme tome [o [os [cemexs om | sor ns = não significante estatisticamente Administração Oral de Inibidor de Chk1 A cerca de 16 dias após o implante (150 - 200 mm?), gemcitabi- na é formulada fresca em solução salina diariamente e administrada aos a- nimais por via intraperitoneal à dose de 40 mg / kg. Vinte e quatro horas mais tarde, os animais são administrados com composto Chk1, em 0,2% de Tween-80 /0,5% de metilcelulose por via oral BID. Após três dias de des-

Petas ee ——— A Is ————————— pp ——.s...slls oia 30/30 ' canso, a dosagem foi repetida por três ciclos adicionais (QSDx4, com o | composto do Exemplo 3 deslocamento + 24 horas). A inibição do crescimen- | to tumoral (TGI) é calculada como descrito no parágrafo anterior.

Os com- | postos dentro do âmbito da invenção são testados neste ensaio executado | — substancialmente como descrito acima.

Por exemplo, o composto do Exem- plo 3 é administrado em combinação com gemcitabina e verifica-se que de- monstra uma excelente atividade antitumoral dependente da dose em mode- los de xenoenxerto tumoral HT-29 e Calu-6, com um aumento de até 2,9 ve- zes na inibição do crescimento tumoral em relação à gemcitabina sozinha. : 10 Este resultado indica que os compostos dentro do âmbito da presente inven- ] ção administrados por via oral aumentam significativamente a atividade anti- “.. tumoral da gemcitabina em modelos de xenoenxerto tumoral humanos.

Claims

' REIVINDICAÇÕES

1. Composto que é (R)[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-i1)-2H- pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il--amina ou um seu sal farmaceuti- camente aceitável.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, que é (R)-[5-(2- metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]- amina.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, que é sal do áci- do metano sulfônico (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-i1]-[6- (piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il)-amina.

i : 4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, que é sal do áci- . 7. do acético (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3- ilóxi)-pirazin-2-il)-amina.

' 5. Composto, de acordo com a reivindicação 1, que é sal hemio- xalato de (R)[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3- ilóxi)-pirazin-2-il)-amina.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 1, que é sal hemis- succinato de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin- 3-ilóxi)-pirazin-2-il)-amina.

7. Composição farmacêutica que compreende o composto ou sal conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 - 6, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

8. Composto ou sal, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 - 6, para uso em terapia.

9. Composto ou sal, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 - 6, para uso no tratamento de câncer.

10. Composto ou sal, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 - 6, para uso em combinação simultânea, separada ou sequencial com radiação por ionização no tratamento de câncer.

11. Composto ou sal, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 - 6, para uso em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes de quimioterapia no tratamento de câncer.

SS SO NS ee 2/2 , 12. Composto ou sal para uso, de acordo com a reivindicação 11, em que o um ou mais agentes de quimioterapia é selecionado a partir do grupo que consistindo em 5-fluorouracila, hidroxiureia, gemcitabina, metotre- xato, pemetrexed, doxorrubicina, etoposídeo, cisplatina e taxol.

13. Composto ou sal para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 - 12, em que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de bexiga, câncer de cólon, câncer gástrico, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de mama, melanoma, câncer de ovário, câncer pancreático, mesotelioma, câncer renal e câncer uterino. . Ps |