KR20240050158A - Screening of Target Material List for Regulation of Peritoneal Fibrosis - Google Patents
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
본 발명은 복막 섬유증 예측용 조성물, 키트 및 복막 섬유증 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 기술이다. 본 발명은 생화학 마커를 기반으로 하는 진단법을 제공함에 따라 빠르고 정확도 높은 진단이 가능한 장점이 있다. 특히, 복막 섬유화와 같이 직접적으로 확인하기 어려운 섬유화 수준에 대해 바이오마커의 수준을 확인하여 복막 섬유증을 보다 효과적으로 예측할 수 있도록 한다.The present invention relates to a composition for predicting peritoneal fibrosis, a kit, and a method of providing information for diagnosing peritoneal fibrosis. The present invention has the advantage of enabling rapid and highly accurate diagnosis by providing a diagnostic method based on biochemical markers. In particular, it is possible to more effectively predict peritoneal fibrosis by checking the level of biomarkers for fibrosis levels that are difficult to directly confirm, such as peritoneal fibrosis.
Description
본 발명은 복막 섬유증 예측용 조성물, 키트 및 복막 섬유증 예측을 위한 정보제공 방법에 관한 기술이다.The present invention relates to a composition for predicting peritoneal fibrosis, a kit, and a method of providing information for predicting peritoneal fibrosis.
상피-중간엽 전환(Epithelial-Mesenchymal Transition; EMT)은 한 종류의 세포가 다른 종류의 세포로 분화하는 세포 형성성의 한 가지 형태로, 상피세포가 이동성이 높은 중간엽 세포 표현으로 전환되는 과정을 말한다. EMT가 일어나면 상피세포가 극성을 잃고 세포 모양이 정방형에서 섬유아세포형으로 바뀌며, 상피세포 표지자는 감소하고 중간엽 세포 표지자가 증가한다. 이 과정이 비가역적으로 진행될 경우, 심장, 간, 신장 및 혈관 기능 부전 뿐만 아니라 악성 종양의 전환을 초래할 수도 있다. 즉, EMT는 태생기에는 배아 형성 및 장기 발달, 성인기에는 상처 치유와 조직 재생 등 정상적인 생리과정에 관여하지만, 병적으로는 조직의 섬유화와 암의 진행, 전이 및 약제 내성을 유발한다.Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) is a form of cell formation in which one type of cell differentiates into another type of cell, and refers to the process by which epithelial cells are converted into a highly mobile representation of mesenchymal cells. . When EMT occurs, epithelial cells lose polarity and the cell shape changes from square to fibroblast-like, and epithelial cell markers decrease and mesenchymal cell markers increase. If this process progresses irreversibly, it can lead to heart, liver, kidney and vascular dysfunction as well as malignant transformation. In other words, EMT is involved in normal physiological processes such as embryo formation and organ development in the prenatal period and wound healing and tissue regeneration in adulthood, but pathologically it causes tissue fibrosis, cancer progression, metastasis, and drug resistance.
한편, 복막 섬유증(PF, Peritoneal fibrosis)은 지속적인 외래 복막 투석(CAPD, Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis) 환자의 복막 구조 변화 및 한외 여과(ultrafiltration) 장애의 주요 원인이 되고 있다. 복막 섬유화의 극단적인 형태인 피막 형성 복막 경화증 (encapsulating peritoneal sclerosis, ESP)은 복막 투석을 지속하기 어렵게 하는 대표적인 원인이며, 현재까지는 뚜렷한 예방법이 없고, 섬유화-경화증의 특성상 정상 기능으로 복귀가 불가능하며, 이러한 이유로 한번 진단되면 매우 치명적인 경과를 보인다.Meanwhile, peritoneal fibrosis (PF) is a major cause of peritoneal structural changes and ultrafiltration failure in patients undergoing continuous ambulatory peritoneal dialysis (CAPD). Encapsulating peritoneal sclerosis (ESP), an extreme form of peritoneal fibrosis, is a representative cause of difficulty in continuing peritoneal dialysis. To date, there is no clear prevention method, and due to the nature of fibro-sclerosis, return to normal function is impossible. For this reason, once diagnosed, it has a very fatal course.
현재까지는 복막 중피 세포(PMC, Peritoneal Mesothelial Cell)의 상피-중간엽 전이 (EMT, Epithelial-mesenchymal transition) 및 세포외 기질 (ECM, ExtraCellular Matrix) 단백질의 복막 축적이 복막 섬유증의 주요한 특징이며, 형질전환 성장 인자(TGF, Transforming Growth Factor)-β1이 복막 섬유증 발달에서 핵심 역할을 하는 것으로 알려져 있다.To date, epithelial-mesenchymal transition (EMT) of peritoneal mesothelial cells (PMC) and peritoneal accumulation of extracellular matrix (ECM) proteins are the main characteristics of peritoneal fibrosis. Transforming Growth Factor (TGF)-β1 is known to play a key role in the development of peritoneal fibrosis.
그러나, 위와 같은 인자들 이외에 실제 이러한 질환들을 예측하기 위한 충분한 기술 개발은 없는 실정이다. 이에 본 발명자들은 복막 섬유증의 유전자들의 발현 변화를 측정함으로써 복막 섬유증 관련 질환을 예측하는 바이오마커들을 발굴함으로써 본 발명을 완성시켰다.However, other than the above factors, there has not been sufficient technology development to actually predict these diseases. Accordingly, the present inventors completed the present invention by discovering biomarkers that predict peritoneal fibrosis-related diseases by measuring changes in the expression of peritoneal fibrosis genes.
본 발명의 목적은 LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC 및 MSX2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 복막 섬유증 예측용 조성물을 제공하는 것이다. The purpose of the present invention is to provide a composition for predicting peritoneal fibrosis, including an agent for measuring the expression level of one or more proteins or nucleic acids selected from the group consisting of LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC, and MSX2.
본 발명의 또 다른 목적은 LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC 및 MSX2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 포함하는 복막 섬유증 예측용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for predicting peritoneal fibrosis comprising a composition containing an agent for measuring the expression level of any one or more proteins or nucleic acids selected from the group consisting of LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC, and MSX2. will be.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 복막 섬유증이 의심되는 피검체의 시료로부터 LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC 및 MSX로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 단백질 또는 핵산의 발현수준을 측정한 결과, 상응하는 정상 대조군의 LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC 및 MSX2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 비교하여 발현이 증대되는 경우, 복막 섬유증이 발생한 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 복막 섬유증을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is (a) measuring the expression level of one or more proteins or nucleic acids selected from the group consisting of LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC and MSX from a sample of a subject suspected of having peritoneal fibrosis; and (b) as a result of measuring the expression level of the protein or nucleic acid, if the expression is increased compared to any one or more selected from the group consisting of LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC, and MSX2 of the corresponding normal control group, peritoneal fibrosis To provide a method of providing information for predicting peritoneal fibrosis, including the step of determining that this has occurred.
하기에서는 중복되는 내용의 혼잡을 방지하기 위하여, 중복되는 내용의 기재를 생략하고자 한다. 즉, 하기의 내용만으로 발명의 내용이 한정되는 것은 아니고, 전체적인 발명의 내용에 따라 발명의 내용이 해석되어야 할 것이다.In the following, in order to prevent confusion with overlapping content, description of overlapping content will be omitted. In other words, the content of the invention is not limited only to the following content, and the content of the invention should be interpreted according to the overall content of the invention.
본 발명은 복막 섬유증 예측용 조성물, 키트 및 복막 섬유증 예측을 위한 정보제공 방법에 관한 기술을 제공하고자 한다.The present invention seeks to provide technology regarding a composition for predicting peritoneal fibrosis, a kit, and a method of providing information for predicting peritoneal fibrosis.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC 및 MSX2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 복막 섬유증 예측용 조성물을 제공한다.In one aspect for achieving the above object, a composition for predicting peritoneal fibrosis is provided, comprising an agent for measuring the expression level of any one or more proteins or nucleic acids selected from the group consisting of LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC, and MSX2. do.
본 발명의 용어 “복막 섬유증”은 복막이 섬유화된 상태를 의미하는 것으로서 복막에 비정상적으로 섬유세포가 형성되는 질환을 말하며, 투석에 의해서 발생할 수 있다.The term “peritoneal fibrosis” of the present invention refers to a condition in which the peritoneum is fibrosed and refers to a disease in which fibrous cells are abnormally formed in the peritoneum, and can be caused by dialysis.
본 발명의 용어 “LOXL2”(lysyl oxidase like 2, Gene ID: 4017)는 라이실 옥시다제(lysyl oxidase)의 하나로, 콜라겐과 엘라스틴의 공유 가교 결합을 개시하는 구리 의존성 아민 옥시다제로 알려져 있다. The term “LOXL2” (lysyl oxidase like 2, Gene ID: 4017) of the present invention is one of lysyl oxidase and is known as a copper-dependent amine oxidase that initiates covalent cross-linking of collagen and elastin.
본 발명의 용어 “SFRP1” (secreted frizzled related protein 1, Gene ID: 6422)는 Wnt 신호전달에 대해 길항제 역할을 하는 종양 억제제로 알려져 있다.The term “SFRP1” (secreted frizzled related protein 1, Gene ID: 6422) of the present invention is known as a tumor suppressor that acts as an antagonist for Wnt signaling.
본 발명의 용어 “TMEM100”(transmembrane protein 100, Gene ID: 55273)는 세포내 막횡단 단백질을 코딩하는 유전자로, 배아 내피 분화 및 혈관 형태 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다.The term “TMEM100” (transmembrane protein 100, Gene ID: 55273) of the present invention is a gene encoding an intracellular transmembrane protein and is known to be involved in embryonic endothelial differentiation and vascular morphogenesis.
본 발명의 용어 “GSC”(goosecoid homeobox, Gene ID: 145258)는 위장형성, 신경 능선 발달에 중요한 역할을 하는 호메오박스 유전자이다.The term “GSC” (goosecoid homeobox, Gene ID: 145258) of the present invention is a homeobox gene that plays an important role in gastrointestinal formation and neural crest development.
본 발명의 용어 “MSX2”(msh homeobox 2, Gene ID: 4488)는 인간의 5번 염색체에 국한된 호메오박스 유전자로, E-cadherin의 발현을 하향 조절하고 N-cadherin과 vimentin의 발현을 상향 조절하여 EMT를 유도하는 역할을 한다.The term “MSX2” (msh homeobox 2, Gene ID: 4488) of the present invention is a homeobox gene localized to human chromosome 5, which downregulates the expression of E-cadherin and upregulates the expression of N-cadherin and vimentin. Thus, it plays a role in inducing EMT.
본 발명의 일실시양태에 따르면, LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC 및/또는 MSX2의 단백질 또는 핵산의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명에서 규명된 상술한 기전을 이용하여 복막 섬유증을 진단하는 것이 가능하다.According to one embodiment of the present invention, it was confirmed that the expression of proteins or nucleic acids of LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC and/or MSX2 was increased. Accordingly, it is possible to diagnose peritoneal fibrosis using the above-described mechanism identified in the present invention.
본 발명에서 용어 “진단”이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 복막 섬유증이 진행되기 전, 진행 중 또는 진행 후, 또는 예후 예측을 위하여 복막 섬유증에 의한 손상 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.In the present invention, the term “diagnosis” means confirming the presence or characteristics of a pathological condition. For the purpose of the present invention, the above diagnosis can be interpreted as confirming whether damage is caused by peritoneal fibrosis before, during, or after peritoneal fibrosis progresses, or to predict prognosis.
본 발명의 단백질 및 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제는, 복막 섬유증 상태와 정상군에서 생물학적 시료의 검체에서 발현 수준을 측정할 수 있는 인자를 의미한다. 구체적으로, 감소되거나 증가하는 마커에 대한 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다.The agent for measuring the expression level of proteins and nucleic acids of the present invention refers to a factor that can measure the expression level in biological samples from peritoneal fibrosis and normal groups. Specifically, it refers to a molecule that can be used for detection of a marker that is decreased or increased.
생물학적 시료에서 단백질 및 핵산을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 할 수 있으며, 상기 단백질 및 핵산의 발현 수준은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 측정될 수 있다.The process of separating proteins and nucleic acids from biological samples can be done using known processes, and the expression levels of the proteins and nucleic acids can be measured by various methods known to those skilled in the art.
구체적으로 상기 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정하는 것일 수 있다.Specifically, the agent may be measured using an antibody that specifically binds to the protein.
상기 “항체”는 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미하며, 본 발명의 목적상 항체는 본 발명의 LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC 및/또는 MSX2 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 모두 포함할 수 있다. 뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함될 수 있다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태를 비롯하여, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab”), F(ab”) 2 및 Fv 등이 될 수 있다. 상기 항체는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 제조된 것이라면 모두 사용할 수 있다.The “antibody” refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site, and for the purposes of the present invention, an antibody is capable of specifically binding to the LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC and/or MSX2 protein of the present invention. It refers to antibodies that exist and can include antibodies such as polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies. In addition, special antibodies such as humanized antibodies may also be included. The antibody may include functional fragments of the antibody molecule, including intact forms with two full-length light chains and two full-length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment that possesses at least an antigen-binding function and may be Fab, F(ab”), F(ab”) 2, and Fv. The above antibodies can be used by anyone skilled in the art as long as they are manufactured using known techniques.
이를 이용하여, 면역분석(immunoassay, 예컨대, 방사능 면역분석 방법, 방사능 면역-침전 방법, 효소-결합 면역흡착 방법 (ELISA), 도트 블롯 분석, 웨스턴 블롯, 억제 또는 경쟁 분석 및 샌드위치 분석)를 통하여 정량적으로 또는 정성적으로 실시될 수 있다.Using this, quantitative immunoassays (e.g., radioimmunoassay method, radioimmunoprecipitation method, enzyme-linked immunosorbent method (ELISA), dot blot analysis, Western blot, inhibition or competition assay, and sandwich assay) are performed. It can be conducted visually or qualitatively.
본 발명에서 상기 제제는 상기 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것일 수 있다.In the present invention, the agent may contain a primer or probe that specifically binds to the nucleic acid.
즉, 핵산의 검출은 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화 되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 프라이머를 이용한 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.That is, detection of nucleic acid can be performed by an amplification reaction using one or more oligonucleotide primers that hybridize to the nucleic acid molecule or the complement of the nucleic acid molecule. For example, detection of nucleic acid using primers can be performed by amplifying the gene sequence using an amplification method such as PCR and then confirming whether the gene has been amplified using a method known in the art.
프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 갖는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다. 본 발명에서는 상기 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 스트레스 여부를 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.A primer is a short nucleic acid sequence with a free 3' hydroxyl group that can form a base pair with a complementary template and serves as a starting point for copying the template strand. means. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and a reagent for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer solution and temperature. In the present invention, stress can be diagnosed by confirming the expression level by performing PCR amplification using sense and antisense primers that specifically bind to one or more nucleic acids. PCR conditions and lengths of sense and antisense primers can be modified based on those known in the art.
프로브는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수십 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 핵산과 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 복막 섬유증 여부를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.A probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA that is as short as a few bases or as long as several tens of bases and is labeled. Probes may be manufactured in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, etc. In the present invention, peritoneal fibrosis can be diagnosed by confirming the expression level by performing hybridization using a probe complementary to the nucleic acid. Selection of appropriate probes and hybridization conditions can be modified based on those known in the art.
이러한 프라이머 또는 프로브는 공지된 서열을 바탕으로 당업자가 적절히 디자인할 수 있다.Such primers or probes can be appropriately designed by those skilled in the art based on known sequences.
예컨대, 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.For example, primers or probes can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. These nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution of a native nucleotide with one or more homologs, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages (e.g., methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamises). dates, carbamates, etc.) or charged linkages (e.g. phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
위와 같이, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC 및 MSX2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 포함하는 복막 섬유증 예측용 키트를 제공한다.As above, the present invention is an aspect for achieving the above object, and is a composition comprising an agent for measuring the expression level of any one or more proteins or nucleic acids selected from the group consisting of LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC, and MSX2. Provided is a kit for predicting peritoneal fibrosis, including:
바람직하게는, 본 발명의 키트는, 담체, 세정버퍼, 시료 희석액, 효소 기질, 반응 정지액 및 사용법을 교시하는 설명서 중 하나 이상을 추가로 더 포함하는 것일 수 있다. 상기한 재료 이 외 복막 섬유증 진단 키트로 사용되기에 적합하도록 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 더 포함될 수 있다.Preferably, the kit of the present invention may further include one or more of a carrier, a washing buffer, a sample diluent, an enzyme substrate, a reaction stop solution, and instructions teaching how to use the kit. In addition to the materials described above, tools and reagents commonly used in the art that are suitable for use as a peritoneal fibrosis diagnostic kit may be further included.
상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당해 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.Examples of the tools or reagents include, but are not limited to, suitable carriers, labeling substances capable of generating detectable signals, chromophores, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, etc. If the labeling substance is an enzyme, it may include a substrate that can measure enzyme activity and a reaction stopper. Carriers include soluble carriers and insoluble carriers. Examples of soluble carriers include physiologically acceptable buffers known in the art, such as PBS, and examples of insoluble carriers include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, and polyester. It may be acrylonitrile, fluororesin, cross-linked dextran, polysaccharide, polymers such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof.
키트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 디바이스, 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR) 디바이스, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등의 형태를 가질 수 있으며, 바람직하게는 마이크로어레이로 구성되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 항체가 다수의 단백질이 고정될 수 있는 단백질 칩에 제공되는 경우에는, 2개 이상의 항체에 대한 항원-항체 복합체 형성을 관측할 수 있다.The kit includes a reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) device, a real-time PCR device, an ELISA plate, a dip-stick device, an immunochromatography test strip, and a radial fractionation immunoassay device, and a flow-through device. It may have a form such as a flow-through device, and is preferably configured as a microarray, but is not limited thereto. Additionally, when antibodies are provided on a protein chip on which multiple proteins can be immobilized, the formation of antigen-antibody complexes for two or more antibodies can be observed.
바람직하게는, 대상은 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상은 인간일 수 있다. 또한 복막 섬유증이 유발된 것으로 의심되는 인간일 수 있다.Preferably, the subject may be a mammal. In some embodiments, the subject can be a human. It may also be a human suspected of having peritoneal fibrosis.
본 발명의 키트는 상술한 조성물을 구성으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the kit of the present invention includes the above-described composition, duplicate content is omitted to avoid excessive complexity of the specification.
위와 같이, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서,As above, the present invention is an aspect for achieving the above object,
(a) 복막 섬유증이 의심되는 피검체의 시료로부터 LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC 및 MSX로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 단백질 또는 핵산의 발현수준을 측정한 결과, 상응하는 정상 대조군의 LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC 및 MSX2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 비교하여 발현이 증대되는 경우, 복막 섬유증이 발생한 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 복막 섬유증을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. (a) measuring the expression level of one or more proteins or nucleic acids selected from the group consisting of LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC, and MSX from a sample of a subject suspected of having peritoneal fibrosis; and (b) as a result of measuring the expression level of the protein or nucleic acid, if the expression is increased compared to any one or more selected from the group consisting of LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC, and MSX2 of the corresponding normal control group, peritoneal fibrosis It provides a method of providing information for predicting peritoneal fibrosis, including the step of determining that this has occurred.
상기 “상응하는 정상 대조군 시료의 단백질 또는 핵산 발현 수준과 비교” 한다는 것은 진단의 대상인 개체의 특정 단백질 또는 핵산과 동일한 종류의 대조군 단백질 또는 핵산의 발현 정도를 비교한다는 것이다.The above-mentioned “comparison with the protein or nucleic acid expression level of a corresponding normal control sample” means comparing the expression level of a specific protein or nucleic acid of the subject of diagnosis with the same type of control protein or nucleic acid.
본 명세서에서 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 언급하면서 사용되는 용어 "증대(고발현)"는 바이오 마커가 비정상 프로세스, 질환 혹은 개체 내 기타 병태를 나타내거나 이의 징후인 경우, 건강하거나 정상인 개체 또는 비교 대상인 개체로부터 획득된 생물학적 시료에서 검출되는 바이오 마커의 값 혹은 수준 범위 보다 높은 생물학적 시료 내의 바이오 마커의 값 혹은 수준을 지칭한다.The term "enhanced (high expression)" used herein when referring to the expression level of the protein or nucleic acid means that the biomarker indicates or is a sign of an abnormal process, disease, or other condition in an individual, or in a healthy or normal individual or comparison. It refers to the value or level of a biomarker in a biological sample that is higher than the value or level range of the biomarker detected in the biological sample obtained from the subject.
본 명세서에서 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 언급하면서 사용되는 용어 "저감(저발현)"은 바이오 마커가 비정상 프로세스, 질환 혹은 개체 내 기타 병태를 나타내거나 이의 징후인 경우, 건강하거나 정상인 개체 또는 비교 대상인 개체로부터 획득된 생물학적 시료에서 검출되는 바이오 마커의 값 혹은 수준 범위 보다 낮은 생물학적 시료 내의 바이오 마커의 값 혹은 수준을 지칭한다.The term "low expression" used herein when referring to the expression level of the protein or nucleic acid refers to the term "low expression" when the biomarker indicates or is a symptom of an abnormal process, disease, or other condition in an individual, or in a healthy or normal individual or comparison. It refers to the value or level of a biomarker in a biological sample that is lower than the value or level range of the biomarker detected in the biological sample obtained from the subject.
본 명세서에서 사용되는 용어 "시료"란 본 발명의 단백질 또는 핵산 발현이 검출될 수 있는 개체로부터 얻어지는 모든 시료를 의미한다.As used herein, the term “sample” refers to any sample obtained from an individual in which expression of a protein or nucleic acid of the present invention can be detected.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 시료는 혈액, 타액(saliva), 생검(biopsy), 피부 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 특별히 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 혈액, 소변 또는 타액이며, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the sample is any one selected from the group consisting of blood, saliva, biopsy, skin tissue, liquid culture, feces and urine, but is not particularly limited thereto. is blood, urine or saliva, and can be prepared by processing by a method commonly used in the technical field of the present invention.
상기 정상 대조군은 복막 섬유증이 발생하지 않은 정상의 피검체로부터 회수한 생물학적 시료 또는 생체 외에서 손상되지 않은 세포를 의미할 수 있다.The normal control group may refer to a biological sample recovered from a normal subject that did not develop peritoneal fibrosis or undamaged cells in vitro.
상기 “단백질 수준을 측정하기 위한 방법”은, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 이러한 방식은 공지된 것으로써 그 기재를 생략한다.The “method for measuring protein levels” includes Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion, Ouchteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, and FACS. And it may be any one selected from the group consisting of protein chips. Since this method is known, its description is omitted.
또한, 상기에서 단백질의 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다. 상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, the method of measuring the protein level described above may be performed including a known process of isolating a protein from a biological sample using a known technique. The protein level can be measured using antibodies. In this case, the marker protein in the sample and the antibody specific to it form a complex, that is, an antigen-antibody complex, and the amount of the antigen-antibody complex formed is measured by a detection label (detection label). It can be measured quantitatively through the size of the signal of the label. These detection labels may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent substances, ligands, luminescent substances, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but are not limited thereto.
또한, 상기 “핵산 수준을 측정하기 위한 방법”은, 서던 블랏, PCR, RT-PCR 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 역시도 이러한 방식은 공지된 것으로써 그 기재를 생략한다.Additionally, the “method for measuring nucleic acid level” may be any one selected from the group consisting of Southern blot, PCR, RT-PCR, and DNA chip, but is not limited thereto. Again, since this method is known, its description is omitted.
상기 방법에 관한 사항은 키트 및 조성물에 대해서도 적용 가능하다. The above method is also applicable to kits and compositions.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군의 단백질 또는 핵산의 양과 복막 섬유증이 진행된 경우의 단백질 또는 핵산의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 정상 대조군과 비교함으로써 복막 섬유증을 예측할 수 있다.Therefore, through the above detection methods, the present invention can confirm the amount of protein or nucleic acid in the normal control group and the amount of protein or nucleic acid in the case of advanced peritoneal fibrosis, and compare the level of expression with the normal control to determine peritoneal fibrosis. It's predictable.
본 발명은 생화학 마커를 기반으로 하는 진단법을 제공함에 따라 빠르고 정확도 높은 진단이 가능한 장점이 있다. 특히, 복막 섬유화와 같이 직접적으로 확인하기 어려운 섬유화 수준에 대해 바이오마커의 수준을 확인하여 복막 섬유증을 보다 효과적으로 예측할 수 있도록 한다.The present invention has the advantage of enabling rapid and highly accurate diagnosis by providing a diagnostic method based on biochemical markers. In particular, it is possible to more effectively predict peritoneal fibrosis by checking the level of biomarkers for fibrosis levels that are difficult to directly confirm, such as peritoneal fibrosis.
도 1은 투석을 시작한 환자를 대상으로 초기 투석 시작 시 얻어진 배액과 투석 3개월 후 얻어진 배액에서 복막 중피 세포를 분리하여 세포 모양을 관찰한 것이다.
도 2는 RNA-seq.에서 발굴한 상피-중간엽 전이 유전자 그룹 중, 복막 기능 유지군에 비해 복막 기능 악화군에서 발현이 증가한 유전자들을 발현 변화량 순으로 정리한 것이다. 각 군에서의 유전자 발현량과 유지군 대비 악화군의 증가를 보여주는 표이다.Figure 1 shows the cell shape observed by separating peritoneal mesothelial cells from the drainage obtained at the beginning of dialysis and the drainage obtained 3 months after dialysis in a patient who started dialysis.
Figure 2 shows the genes whose expression increased in the group with worsening peritoneal function compared to the group with maintained peritoneal function, among the epithelial-mesenchymal transition gene group discovered by RNA-seq., arranged in order of expression change. This table shows the gene expression level in each group and the increase in the worsening group compared to the maintenance group.
본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Examples are presented to aid understanding of the present invention. The following examples are provided to make the present invention easier to understand, and the content of the present invention is not limited by the examples.
<실시예 1> 정상군과 대조군의 시료 확보<Example 1> Obtaining samples from normal and control groups
13명의 복막 투석을 시작한 환자를 대상으로 초기 투석 시작할 때와 투석 후 3개월 경과 시, 복막기능검사(PET)를 실시하였다. 각 군에서 투석 후 얻어진 배액에서 복막 중피 세포를 분리하여 세포 모양을 관찰하였다. 그 결과로부터 대조군(복막 기능 유지군)과 실험군(복막 기능 악화군)으로 분류하였다(도 1 참조).Peritoneal function tests (PET) were performed on 13 patients who started peritoneal dialysis at the time of initial dialysis and 3 months after dialysis. In each group, peritoneal mesothelial cells were isolated from the drainage fluid obtained after dialysis, and the cell shape was observed. From the results, they were classified into the control group (peritoneal function maintenance group) and the experimental group (peritoneal function deterioration group) (see Figure 1).
이후, 얻어진 각 군의 복막 중피 세포에서 리보핵산(RNA)를 추출하여 리보핵산 염기서열 분석(RNA-seq.) 시행하였다.Afterwards, ribonucleic acid (RNA) was extracted from the peritoneal mesothelial cells of each group and subjected to ribonucleic acid sequencing (RNA-seq.).
<실시예 2> RNA seq.<Example 2> RNA seq.
RNA seq.을 통해 복막 기능 악화군에서 복막 기능 유지군에 비해 발현 레벨이 변화한 유전자를 조사하였다. 여러가지 유전자 기능 카테고리 (https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/) 중, 상피-중간엽 전이 역할로 알려진 유전자(EMT genes)를 분류하였고, 복막 기능 악화군에서 발현 레벨이 증가하여, 복막섬유증을 예측할 수 있는 마커로 활용 가능한 유전자들을 발굴하였다.Genes whose expression levels changed in the group with worsening peritoneal function compared to the group with maintained peritoneal function were investigated through RNA seq. Among various gene function categories (https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/), genes known to play a role in epithelial-mesenchymal transition (EMT genes) were classified, and their expression level increased in the group with worsening peritoneal function, Genes that could be used as markers to predict peritoneal fibrosis were discovered.
그 결과, 중요 마커로 LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC 및/또는 MSX2의 상향 조절이 확인되었다(도 2 참조).As a result, upregulation of LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC, and/or MSX2 was confirmed as important markers (see Figure 2).
Claims (8)
(b) 상기 단백질 또는 핵산의 발현수준을 측정한 결과, 상응하는 정상 대조군의 LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC 및 MSX2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 비교하여 발현이 증대되는 경우, 복막 섬유증이 발생한 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 복막 섬유증을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.(a) measuring the expression level of one or more proteins or nucleic acids selected from the group consisting of LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC, and MSX from a sample of a subject suspected of having peritoneal fibrosis; and
(b) As a result of measuring the expression level of the protein or nucleic acid, if the expression is increased compared to any one or more selected from the group consisting of LOXL2, SFRP1, TMEM100, GSC, and MSX2 of the corresponding normal control group, peritoneal fibrosis A method of providing information for predicting peritoneal fibrosis, comprising the step of determining that peritoneal fibrosis has occurred.
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