KR20230134925A

KR20230134925A - Composition for diagnosis of avascular osteonecrosis, kit and method for provision of information of diagnosis thereof

Info

Publication number: KR20230134925A
Application number: KR1020220032340A
Authority: KR
Inventors: 서민수; 강경구; 성수은; 최주희; 이시준; 성민경; 김길수; 이근우; 김영인
Original assignee: 주식회사 셀렉소바이오
Priority date: 2022-03-15
Filing date: 2022-03-15
Publication date: 2023-09-22

Abstract

본 발명은 무혈성 골괴사증 진단용 조성물, 키트 및 무혈성 골괴사증 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 기술이다. 본 발명의 조성물을 이용한 무혈성 골괴사증의 진단은, 기존 X선 촬영(X-ray), 컴퓨터단층촬영(computed tomography; CT) 등이 주를 이루는 진단법이 아닌 생화학 마커를 기반으로 하는 진단법을 제공함에 따라 빠르고 정확도 높은 진단이 가능한 장점이 있다.The present invention relates to a composition for diagnosing avascular osteonecrosis, a kit, and a method for providing information for diagnosing avascular osteonecrosis. Diagnosis of avascular osteonecrosis using the composition of the present invention provides a diagnostic method based on biochemical markers rather than a diagnostic method mainly based on existing X-ray imaging (X-ray) and computed tomography (CT). It has the advantage of enabling quick and highly accurate diagnosis.

Description

무혈성 골괴사증 진단용 조성물, 키트 및 이의 진단 정보제공 방법 {Composition for diagnosis of avascular osteonecrosis, kit and method for provision of information of diagnosis thereof}Composition for diagnosis of avascular osteonecrosis, kit and method for provision of information of diagnosis thereof}

본 발명은 무혈성 골괴사증 진단용 조성물, 키트 및 무혈성 골괴사증 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 기술이다.The present invention relates to a composition for diagnosing avascular osteonecrosis, a kit, and a method for providing information for diagnosing avascular osteonecrosis.

골괴사는 뼈에 혈액 공급이 일시적 또는 영구적으로 줄어들면서 뼈조직이 사멸하는 질환으로, 골괴사를 무혈성 괴사(avascular necrosis), 무균 괴사(aseptic necrosis) 및 허혈 괴사(ischemic necrosis)로 나누기도 한다. 골괴사는 몸의 어느 곳에서도 일어날 수 있으나 골반과 인접한 대퇴골의(femur)의 상단부에 해당하는 대퇴골두에서 주로 발병하며, 그 다음으로는 팔 위쪽 부위, 어깨, 무릎 등에서도 발병하는 것으로 알려졌다.Osteonecrosis is a disease in which bone tissue dies as blood supply to the bone is temporarily or permanently reduced. Osteonecrosis is also divided into avascular necrosis, aseptic necrosis, and ischemic necrosis. Osteonecrosis can occur anywhere in the body, but it mainly occurs in the femoral head, which is the upper part of the femur adjacent to the pelvis, and is also known to occur in the upper arms, shoulders, and knees.

골괴사는 사멸되는 조직의 속도가 재생되는 조직의 속도보다 빠를 경우, 적절한 치료가 이뤄지지 않아 질환이 진행되면서 통증과 관절염(arthritis)을 일으킬 뿐만 아니라 뼈가 쉽게 부러지는 질병이다. 골괴사는 뼈조직에 혈액 공급이 적절히 이뤄지지 않으면서 발병하는데, 면역억제제인 코르티코스테로이드(corticosteroid)의 과다복용, 알콜 남용 및 부상 등이 주요한 원인으로 알려져 있으나, 뚜렷한 원인이나 건강상태에 이상이 없는 경우에도 발병한다. 연구에 다르면 코르티코스테로이드 계통의 약을 구강이나 정맥주사를 통해 장기간 복용할 경우 비외상성 골괴사 (nontraumatic osteonecrosis)의 원인이 되는 것으로 밝혀졌다. 스테로이드 계통의 약이 지방물질의 체내 분해 능력을 방해하여 혈관에 지질물질이 쌓이게 되면서 동맥경화를 유발하고, 이로 인해 혈액 흐름을 방해함으로써 뼈 조직으로 혈액 공급이 감소되면서 골괴사를 유발하는 것으로 보고되고 있다.Osteonecrosis is a disease that occurs when the rate of death of tissue is faster than the rate of regeneration of tissue, and as the disease progresses without proper treatment, it not only causes pain and arthritis, but also causes bones to break easily. Osteonecrosis occurs when blood supply to bone tissue is inadequate. Overuse of corticosteroids, which are immunosuppressants, alcohol abuse, and injuries are known to be major causes. However, even in cases where there is no obvious cause or health condition, It occurs. Studies have shown that long-term use of corticosteroid drugs by mouth or intravenous injection can cause nontraumatic osteonecrosis. It has been reported that steroid-based drugs interfere with the body's ability to decompose fatty substances, causing lipid substances to accumulate in the blood vessels, causing arteriosclerosis. This interferes with blood flow and reduces blood supply to bone tissue, causing osteonecrosis. .

또한, 지나친 음주는 지방물질의 생성을 촉진하고 이로 인해 동맥경화가 진행되면서 뼈조직으로 혈액 공급이 감소하면서 골괴사를 유발할 수 있다. 또한, 혈관에 손상을 줄 수 있는 골절(fracture), 전위(dislocation), 그 외의 관절 부상은 혈액의 순환을 방해하고 골괴사를 유발할 수 있다. 이 외 뼈 안의 압력도 또 다른 원인이 될 수 있는데, 뼈 안에 내압이 올라가게 되면 혈관이 좁아짐에 따라 뼈조직으로의 혈액공급이 감소하여 골괴사를 유발할 수 있다. 그 이외 원인으로, 방사선치료, 항암약물치료(chemothreapy), 신장이식수술과 장기이식수술(organ transplantation), 암, 전신홍반성낭창(Lupus), 혈액질환, 에이즈 환자, 골관절염(osteoarthritis), 골다공증 (osteoporosis), 고셰병(Gaucher disease), 잠수병(Caisson disease) 등이 있다.Additionally, excessive drinking promotes the production of fatty substances, which can lead to arteriosclerosis and a decrease in blood supply to bone tissue, causing osteonecrosis. Additionally, fractures, dislocations, and other joint injuries that can damage blood vessels can disrupt blood circulation and cause osteonecrosis. In addition, pressure inside the bone can be another cause. When the internal pressure inside the bone increases, blood vessels narrow and blood supply to bone tissue decreases, which can cause osteonecrosis. Other causes include radiation therapy, chemotherapy, kidney transplantation and organ transplantation, cancer, systemic lupus erythematosus, blood disease, AIDS patients, osteoarthritis, and osteoporosis. ), Gaucher disease, Caisson disease, etc.

골괴사의 증상으로는, 초기에는 증상을 거의 인지하지 못하나 질환이 진행되면서 관절의 통증(joint pain)이 점차 심해지게 된다. 상태가 악화되어 관절주변 뼈의 손상이 커질 경우에는 활동의 제한으로 이어진다. 일반적으로 처음 통증을 인지하고 관절기능을 상실할 때까지 수 개월에서 2년 정도 걸리는 것으로 알려졌다.Symptoms of osteonecrosis are almost unrecognizable in the beginning, but as the disease progresses, joint pain gradually becomes worse. If the condition worsens and damage to the bones around the joint increases, it leads to limitations in activity. It is known that it generally takes several months to two years from first noticing pain to loss of joint function.

이렇듯, 골괴사의 예방 또는 치료를 위해서는 빠른 진단이 요구되는데, 현재는 X-ray, CT 등을 통해 진단이 이뤄지고 있으며, 임상적 소견에 따라 질환의 발병을 뒤늦게 확인하는 것이 일반적이다. 본 질환의 경우 미국에서만 매년 대략 15,000 내지 30,000건의 발병이 보고되고 있는 상태인데 이에 대한 평가 기준이 오직 뼈 스캔 및 MRI를 기반으로만 진행된다는 점에서 골괴사에 대한 예방 및 사전적 치료를 위한 빠른 진단이 요구되는 실정이다.As such, rapid diagnosis is required to prevent or treat osteonecrosis. Currently, diagnosis is made through X-ray, CT, etc., and it is common to late confirm the onset of the disease based on clinical findings. In the case of this disease, approximately 15,000 to 30,000 cases are reported each year in the United States alone, and since the evaluation criteria for this disease are based only on bone scans and MRIs, rapid diagnosis for prevention and proactive treatment of osteonecrosis is necessary. It is being demanded.

Screening of Serum Protein Markers for Avascular Osteonecrosis of Femoral Head Differentially Expressed after Treatment with Yuanshi Shengmai Chenggu Tablets (Biomed Res Int. 2018 Mar 20;2018)Screening of Serum Protein Markers for Avascular Osteonecrosis of Femoral Head Differentially Expressed after Treatment with Yuanshi Shengmai Chenggu Tablets (Biomed Res Int. 2018 Mar 20;2018) Microarray-_based screening of differentially expressed genes in glucocorticoid-induced avascular necrosis (MOLECULAR MEDICINE REPORTS 15: 3583-3590, 2017)Microarray-_based screening of differentially expressed genes in glucocorticoid-induced avascular necrosis (MOLECULAR MEDICINE REPORTS 15: 3583-3590, 2017)

본 발명의 목적은 IGHV3-23, FN1, VWF, FGB, PRG4, FCGBP 및 ZSWIM9으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 무혈성 골괴사증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.The object of the present invention is to provide a composition for diagnosing avascular osteonecrosis comprising an agent for measuring the expression level of one or more proteins or nucleic acids selected from the group consisting of IGHV3-23, FN1, VWF, FGB, PRG4, FCGBP and ZSWIM9. will be.

본 발명의 또 다른 목적은 IGHV3-23, FN1, VWF, FGB, PRG4, FCGBP 및 ZSWIM9으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 포함하는 무혈성 골괴사증 진단용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is an avascular bone comprising a composition comprising an agent for measuring the expression level of any one or more proteins or nucleic acids selected from the group consisting of IGHV3-23, FN1, VWF, FGB, PRG4, FCGBP and ZSWIM9. The goal is to provide a kit for diagnosing necrosis.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 무혈성 골괴사증이 의심되는 피검체의 시료로부터 IGHV3-23, FN1, VWF, FGB 및 PRG4으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정한 결과 상응하는 정상 대조군의 IGHV3-23, FN1, VWF, FGB 및 PRG4 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 비교하여 발현이 증대되는 경우 무혈성 골괴사증이 발생한 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 무혈성 골괴사증을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is (a) to measure the expression level of any one or more proteins or nucleic acids selected from the group consisting of IGHV3-23, FN1, VWF, FGB and PRG4 from a sample of a subject suspected of having avascular osteonecrosis. step; and (b) when the expression level of the protein or nucleic acid is measured and the expression is increased compared to any one or more selected from the group consisting of IGHV3-23, FN1, VWF, FGB and PRG4 of the corresponding normal control group, avascular bone To provide a method of providing information for diagnosing avascular osteonecrosis, including the step of determining that necrosis has occurred.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 무혈성 골괴사증이 의심되는 피검체의 시료로부터 FCGBP, ZSWIM9 또는 이들 모두의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정한 결과 상응하는 정상 대조군의 FCGBP, ZSWIM9 또는 이들 모두와 비교하여 발현이 저감되는 경우 무혈성 골괴사증이 발생한 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 무혈성 골괴사증을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is (a) measuring the expression level of FCGBP, ZSWIM9, or both proteins or nucleic acids from a sample of a subject suspected of having avascular osteonecrosis; and (b) measuring the expression level of the protein or nucleic acid and determining that avascular osteonecrosis has occurred if the expression is reduced compared to FCGBP, ZSWIM9, or both of the corresponding normal control group. It provides a method of providing information for diagnosis.

하기에서는 중복되는 내용의 혼잡을 방지하기 위하여, 중복되는 내용의 기재를 생략하고자 한다. 즉, 하기의 내용만으로 발명의 내용이 한정되는 것은 아니고, 전체적인 발명의 내용에 따라 발명의 내용이 해석되어야 할 것이다.In the following, in order to prevent confusion with overlapping content, description of overlapping content will be omitted. In other words, the content of the invention is not limited to the following content, and the content of the invention should be interpreted according to the overall content of the invention.

본 발명은 무혈성 골괴사증 진단용 조성물, 키트 및 무혈성 골괴사증 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 기술을 제공하고자 한다.The present invention seeks to provide technology regarding a composition for diagnosing avascular osteonecrosis, a kit, and a method for providing information for diagnosing avascular osteonecrosis.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, IGHV3-23, FN1, VWF, FGB, PRG4, FCGBP 및 ZSWIM9으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 무혈성 골괴사증 진단용 조성물을 제공한다.In one embodiment for achieving the above object, an avascular agent comprising an agent for measuring the expression level of any one or more proteins or nucleic acids selected from the group consisting of IGHV3-23, FN1, VWF, FGB, PRG4, FCGBP, and ZSWIM9. A composition for diagnosing osteonecrosis is provided.

본 발명의 용어 "무혈성 골괴사증"은 여러 요인에 의해 혈액 공급이 중단되어 골의 괴사가 진행되는 병으로, 괴사란 일종의 썩는 현상이지만 고름이 나는 등의 일반적인 피부 또는 근육 괴사와는 달리 뼈 부위가 힘없이 무너지는 현상을 말한다. The term "avascular osteonecrosis" of the present invention is a disease in which bone necrosis progresses due to interruption of blood supply due to various factors. Necrosis is a type of rotting phenomenon, but unlike general skin or muscle necrosis such as pus, the bone area is It refers to the phenomenon of collapsing without strength.

무혈성 골괴사증은 몸의 어느 곳에서도 일어날 수 있으나 골반과 인접한 대퇴골의(femur)의 상단부에 해당하는 대퇴골두에서 주로 발병하며, 그 다음으로는 팔 위쪽 부위, 어깨, 무릎 등에서도 발병하는 것으로 알려졌다.Avascular osteonecrosis can occur anywhere in the body, but it mainly occurs in the femoral head, which is the upper part of the femur adjacent to the pelvis, and is also known to occur in the upper arms, shoulders, and knees.

본 발명에 있어, 무혈성 골괴사증은 바람직하게는 대퇴골두 무혈성 골괴사, 상완골두 무혈성 골괴사, 척추체 무혈성 골괴사, 슬관절 무혈성 골괴사 및 족부 무혈성 골괴사로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.In the present invention, avascular osteonecrosis may preferably be any one selected from the group consisting of avascular osteonecrosis of the femoral head, avascular osteonecrosis of the humeral head, avascular osteonecrosis of the vertebral body, avascular osteonecrosis of the knee joint, and avascular osteonecrosis of the foot.

본 발명의 용어 "IGHV3-23(Immunoglobulin heavy variable 3-23)"은, 14번 염색체의 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 있는 약 40개의 기능적 가변 유전자 클러스터에 속하는 유전자로, 항원 인식에 참여한다. 가변 도메인은 V-(D)-J 재배열이라고 하는 과정에 의해 조립되고 항원에 대한 노출 및 선택 후 특정 항원에 대한 친화도 성숙을 허용하는 체세포 과돌연변이를 일으킬 수 있다.　The term "IGHV3-23 (Immunoglobulin heavy variable 3-23)" of the present invention is a gene belonging to a cluster of about 40 functional variable genes located in the immunoglobulin heavy chain locus on chromosome 14, and participates in antigen recognition. The variable domains are assembled by a process called V-(D)-J rearrangement and can undergo somatic hypermutation, allowing affinity maturation for specific antigens following exposure and selection to the antigen.

본 발명의 용어 "FN1(Fibronectin 1)"은, 배아 발생, 상처 치유, 혈액 응고, 숙주 방어 및 전이를 포함한 세포 접착 및 이동 과정에 관여하는 유전자이다.The term “FN1 (Fibronectin 1)” in the present invention is a gene involved in cell adhesion and migration processes, including embryonic development, wound healing, blood coagulation, host defense, and metastasis.

본 발명의 용어 "VWF(Von Willebrand factor)"는, 지혈에 관여하는 당단백질을 암호화하는 유전자로, VWF의 돌연변이는 유전성 출혈 장애인 폰 빌레브란트병 (von Willebrand disease)을 유발한다.The term "Von Willebrand factor (VWF)" of the present invention is a gene encoding a glycoprotein involved in hemostasis, and mutations in VWF cause von Willebrand disease, a hereditary bleeding disorder.

본 발명의 용어 "FGB(Fibrinogen beta chain)"는, 피브리노겐은 지혈 및 항균성 숙주 방어에 중요한 역할을 하는 유전자로, FGB의 돌연변이는 아피브리노겐혈증(afibrinogenemia), 섬유소원이상혈증(dysfibrinogenemia), 섬유소원저혈증(hypodysfibrinogenemia) 및 혈정 경향(thrombotic tendency)을 비롯한 여러 장애를 유발한다.The term "FGB (Fibrinogen beta chain)" of the present invention refers to fibrinogen, which is a gene that plays an important role in hemostasis and antibacterial host defense, and mutations in FGB cause afibrinogenemia, dysfibrinogenemia, and hypofibrinogenemia. It causes several disorders, including hypodysfibrinogenemia and thrombotic tendency.

본 발명의 용어 "FCGBP(Fc gamma binding protein)"는, IgGFc-결합 단백질을 암호화하는 유전자로, 점막 구조의 유지에 관여할 수 있다. The term "FCGBP (Fc gamma binding protein)" of the present invention is a gene encoding an IgGFc-binding protein and may be involved in maintaining mucosal structure.

본 발명의 용어 "ZSWIM9(Zinc finger SWIM-type containing 9)"는, 징크핑거 코딩 유전자로,　ZSWIM9와 관련된 질병으로는 무지문증(Adermatoglyphia)이 있다.　ZSWIM9의 중요한 이원체는　SIAH1이다.The term "ZSWIM9 (Zinc finger SWIM-type containing 9)" of the present invention refers to a zinc finger coding gene, and diseases related to ZSWIM9 include Adermatoglyphia. The important binary of ZSWIM9 is SIAH1.

본 발명에 따른 진단용 조성물은 상기 언급된 임의의 1 이상의 마커를 기초로 하여 추가로 상기 언급된 임의의 마커를 더 포함하는 형태로 구성될 수도 있다. 즉, 상기 마커의 경우, 2 이상의 조합으로도 활용 가능하다. The diagnostic composition according to the present invention may be based on any one of the above-mentioned markers and may further include any of the above-mentioned markers. In other words, the above markers can be used in combination of two or more.

본 발명에서 상기 단백질은 엑소좀 유래인 것일 수 있다.In the present invention, the protein may be derived from exosomes.

"엑소좀(exosome)"은 대부분의 세포에서 분비되는 작은 형태의 소포체(membrane vesicle)이다. 이 엑소좀 안에는 그 세포에서 유래된 다양한 종류의 단백질, 유전물질(DNA, mRNA, miRNA), 지질 등이 포함되어 있는 것이 보고된 바 있다.“Exosome” is a small type of membrane vesicle secreted by most cells. It has been reported that these exosomes contain various types of proteins, genetic materials (DNA, mRNA, miRNA), and lipids derived from the cells.

엑소좀은 예를 들어 시료로부터 TFF(tangential flow filtration), 초원심분리(ultracentrifugation), 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 및 엑소좀 분리 키트(exosome isolation kit)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나로 분리할 수 있다. 이러한 엑소좀은 직경이 10nm 내지 300 nm일 수 있다. 상기 엑소좀은 바람직하게는 직경이 40nm 내지 200nm, 더 바람직하게는 50 nm 내지 150nm일 수 있다. 상기 엑소좀(exosomes)은 CD63 및 CD81 양성인 것을 특징으로 할 수 있다.Exosomes can be separated from samples, for example, by one selected from the group consisting of tangential flow filtration (TFF), ultracentrifugation, size exclusion chromatography, and exosome isolation kit. You can. These exosomes can be 10 nm to 300 nm in diameter. The exosomes may preferably have a diameter of 40 nm to 200 nm, more preferably 50 nm to 150 nm. The exosomes may be characterized as being positive for CD63 and CD81.

본 발명의 일실시양태에 따르면, 무혈성 골괴사증 환자의 혈청으로부터 엑소좀을 추출하고 정상인의 것과 대비하여, 특이적으로 발현하는 단백질 또는 핵산으로 상향 발현(up-regulation)하는 5개의 마커 및 하향 발현(down-regulation)하는 2개의 마커를 특정하였고, 이를 이용하여 상기 질환의 진단을 목적한다. According to one embodiment of the present invention, exosomes are extracted from the serum of avascular osteonecrosis patients, and compared to those of normal people, five markers are up-regulated and down-regulated as specifically expressed proteins or nucleic acids. Two markers of down-regulation were identified and used to diagnose the disease.

보다 구체적으로, 본 발명은 대퇴골두 무혈성 괴사증 환자에서 IGHV3-23, FN1, VWF, FGB 및 PRG4의 단백질 또는 핵산의 발현이 증가하고, FCGBP 및 ZSWIM9의 단백질 또는 핵산의 발현은 감소하는 것을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명에서 규명된 상술한 기전을 이용하여 무혈성 괴사증을 진단하는 것이 가능하다. More specifically, the present invention confirmed that in patients with femoral head avascular necrosis, the expression of proteins or nucleic acids of IGHV3-23, FN1, VWF, FGB and PRG4 increased, and the expression of proteins or nucleic acids of FCGBP and ZSWIM9 decreased. Accordingly, it is possible to diagnose avascular necrosis using the above-described mechanism identified in the present invention.

본 발명에서 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 골의 괴사가 진행되기 전, 진행 중 또는 진행 후, 또는 예후 예측을 위하여 골 조직의 손상 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.As used herein, the term “diagnosis” means confirming the presence or characteristics of a pathological condition. For the purpose of the present invention, the above diagnosis can be interpreted as checking whether bone tissue is damaged before, during, or after bone necrosis progresses, or to predict prognosis.

본 발명의 단백질 및 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제는 무혈성 골괴사 상태와 정상군에서 생물학적 시료의 검체에서 발현 수준을 측정할 수 있는 인자를 의미한다. 구체적으로, 감소되거나 증가하는 마커에 대한 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다.The agent for measuring the expression level of proteins and nucleic acids of the present invention refers to a factor that can measure the expression level in biological samples in avascular osteonecrosis and normal groups. Specifically, it refers to a molecule that can be used for detection of a marker that is decreased or increased.

생물학적 시료에서 단백질 및 핵산을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 단백질 및 핵산의 발현 수준은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 측정될 수 있다. The process of isolating proteins and nucleic acids from biological samples can be performed using known processes, and the expression levels of the proteins and nucleic acids can be measured by various methods known to those skilled in the art.

구체적으로 상기 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정하는 것일 수 있다.Specifically, the agent may be measured using an antibody that specifically binds to the protein.

상기 "항체"는 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미하며, 본 발명의 목적상 항체는 본 발명의 IGHV3-23, FN1, VWF, FGB, PRG4, FCGBP 또는 ZSWIM9 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 모두 포함할 수 있다. 뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함될 수 있다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태를 비롯하여, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab"), F(ab") 2 및 Fv 등이 될 수 있다. 상기 항체는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 제조된 것이라면 모두 사용할 수 있다.The "antibody" means a specific protein molecule directed against an antigenic site, and for the purposes of the present invention, an antibody is specific for the IGHV3-23, FN1, VWF, FGB, PRG4, FCGBP or ZSWIM9 protein of the present invention. refers to an antibody that can bind to and can include antibodies such as polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies. In addition, special antibodies such as humanized antibodies may also be included. The antibody may include functional fragments of the antibody molecule, including intact forms with two full-length light chains and two full-length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment that possesses at least an antigen-binding function and may be Fab, F(ab"), F(ab") 2, and Fv. The above antibodies can be used by anyone skilled in the art as long as they are manufactured using known techniques.

이를 이용하여, 면역분석(immunoassay, 예컨대, 방사능 면역분석 방법, 방사능 면역-침전 방법, 효소-결합 면역흡착 방법 (ELISA), 도트 블롯 분석, 웨스턴 블롯, 억제 또는 경쟁 분석 및 샌드위치 분석)를 통하여 정량적으로 또는 정성적으로 실시될 수 있다.Using this, quantitative immunoassays (e.g., radioimmunoassay method, radioimmunoprecipitation method, enzyme-linked immunosorbent method (ELISA), dot blot analysis, Western blot, inhibition or competition assay, and sandwich analysis) are performed. It can be conducted visually or qualitatively.

본 발명에서 상기 제제는 상기 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것일 수 있다.In the present invention, the agent may include a primer or probe that specifically binds to the nucleic acid.

즉, 핵산의 검출은 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 프라이머를 이용한 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.That is, detection of nucleic acid can be performed by an amplification reaction using one or more oligonucleotide primers that hybridize to the nucleic acid molecule or the complement of the nucleic acid molecule. For example, detection of nucleic acid using primers can be performed by amplifying the gene sequence using an amplification method such as PCR and then confirming whether the gene has been amplified using a method known in the art.

프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 갖는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다. 본 발명에서는 상기 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 스트레스 여부를 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.A primer is a short nucleic acid sequence that has a short free 3' hydroxyl group that can form a base pair with a complementary template and serves as a starting point for copying the template strand. means. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and a reagent for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer solution and temperature. In the present invention, stress can be diagnosed by confirming the expression level by performing PCR amplification using sense and antisense primers that specifically bind to the one or more nucleic acids. PCR conditions and lengths of sense and antisense primers can be modified based on those known in the art.

프로브는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수십 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 핵산와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 무혈성 골괴사증 여부를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.A probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA that is as short as a few bases or as long as several tens of bases and is labeled. Probes may be manufactured in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, etc. In the present invention, avascular osteonecrosis can be diagnosed by confirming the expression level by performing hybridization using a probe complementary to nucleic acid. Selection of appropriate probes and hybridization conditions can be modified based on those known in the art.

이러한 프라이머 또는 프로브는 공지된 서열을 바탕으로 당업자가 적절히 디자인할 수 있다.Such primers or probes can be appropriately designed by those skilled in the art based on known sequences.

예컨대, 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.For example, primers or probes can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. These nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution of a native nucleotide with one or more homologs, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages (e.g., methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphorylates). amidates, carbamates, etc.) or charged linkages (e.g. phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).

위와 같이, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, IGHV3-23, FN1, VWF, FGB, PRG4, FCGBP 및 ZSWIM9으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 포함하는 무혈성 골괴사증 진단용 키트를 제공한다.As described above, the present invention is an aspect for achieving the above object, measuring the expression level of any one or more proteins or nucleic acids selected from the group consisting of IGHV3-23, FN1, VWF, FGB, PRG4, FCGBP and ZSWIM9. Provided is a kit for diagnosing avascular osteonecrosis comprising a composition containing an agent.

바람직하게는, 본 발명의 키트는, 담체, 세정버퍼, 시료 희석액, 효소 기질, 반응 정지액 및 사용법을 교시하는 설명서 중 하나 이상을 추가로 더 포함하는 것일 수 있다. 상기한 재료 이 외 무혈성 골괴사증 진단 키트로 사용되기에 적합하도록 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 더 포함될 수 있다.Preferably, the kit of the present invention may further include one or more of a carrier, a washing buffer, a sample diluent, an enzyme substrate, a reaction stop solution, and instructions teaching how to use the kit. In addition to the above-described materials, tools and reagents commonly used in the art that are suitable for use as an avascular osteonecrosis diagnostic kit may be further included.

상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.Examples of the tools or reagents include, but are not limited to, suitable carriers, labeling substances capable of generating detectable signals, chromophores, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, etc. If the labeling substance is an enzyme, it may include a substrate that can measure enzyme activity and a reaction stopper. Carriers include soluble carriers and insoluble carriers. Examples of soluble carriers include physiologically acceptable buffers known in the art, such as PBS, and examples of insoluble carriers include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, and polyester. It may be acrylonitrile, fluororesin, cross-linked dextran, polysaccharide, polymers such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof.

키트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 디바이스, 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR) 디바이스, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등의 형태를 가질 수 있으며, 바람직하게는 마이크로어레이로 구성되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 항체가 다수의 단백질이 고정될 수 있는 단백질 칩에 제공되는 경우에는, 2개 이상의 항체에 대한 항원-항체 복합체 형성을 관측할 수 있다.The kit includes a reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) device, a real-time PCR device, an ELISA plate, a dip-stick device, an immunochromatography test strip, and a radial fractionation immunoassay device, and a flow-through device. It may have a form such as a flow-through device, and is preferably configured as a microarray, but is not limited thereto. Additionally, when antibodies are provided on a protein chip on which multiple proteins can be immobilized, the formation of antigen-antibody complexes for two or more antibodies can be observed.

바람직하게는, 대상은 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상은 인간일 수 있다. 또한 무혈성 골괴사증이 유발된 것으로 의심되는 인간일 수 있다.Preferably, the subject may be a mammal. In some embodiments, the subject can be a human. It may also be a human suspected of having avascular osteonecrosis.

본 발명의 키트는 상술한 조성물을 구성으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the kit of the present invention includes the above-described composition, duplicate content is omitted to avoid excessive complexity of the specification.

위와 같이, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서,As above, the present invention is an aspect for achieving the above object,

(a) 무혈성 골괴사증이 의심되는 피검체의 시료로부터 IGHV3-23, FN1, VWF, FGB 및 PRG4 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정한 결과 상응하는 정상 대조군의 IGHV3-23, FN1, VWF, FGB 및 PRG4 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 비교하여 발현이 증대되는 경우 무혈성 골괴사증이 발생한 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 무혈성 골괴사증을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. (a) measuring the expression level of one or more proteins or nucleic acids selected from the group consisting of IGHV3-23, FN1, VWF, FGB, and PRG4 from a sample of a subject suspected of having avascular osteonecrosis; and (b) when the expression level of the protein or nucleic acid is measured and the expression is increased compared to any one or more selected from the group consisting of IGHV3-23, FN1, VWF, FGB and PRG4 of the corresponding normal control group, avascular bone It provides a method of providing information for diagnosing avascular osteonecrosis, including the step of determining that necrosis has occurred.

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서,The present invention is an aspect for achieving the above object,

(a) 무혈성 골괴사증이 의심되는 피검체의 시료로부터 FCGBP, ZSWIM9 또는 이들 모두의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정한 결과 상응하는 정상 대조군의 FCGBP, ZSWIM9 또는 이들 모두와 비교하여 발현이 저감되는 경우 무혈성 골괴사증이 발생한 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 무혈성 골괴사증을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. (a) measuring the expression level of protein or nucleic acid of FCGBP, ZSWIM9, or both from a sample of a subject suspected of having avascular osteonecrosis; and (b) measuring the expression level of the protein or nucleic acid and determining that avascular osteonecrosis has occurred if the expression is reduced compared to FCGBP, ZSWIM9, or both of the corresponding normal control group. Provides a method of providing information for diagnosis.

상기 "상응하는 정상 대조군 시료의 단백질 또는 핵산 발현 수준과 비교" 한다는 것은 진단의 대상인 개체의 특정 단백질 또는 핵산과 동일한 종류의 대조군 단백질 또는 핵산의 발현 정도를 비교한다는 것이다.The above-mentioned “comparison with the protein or nucleic acid expression level of a corresponding normal control sample” means comparing the expression level of a specific protein or nucleic acid of the subject of diagnosis with the same type of control protein or nucleic acid.

본 명세서에서 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 언급하면서 사용되는 용어 "증대(고발현)"는 바이오 마커가 비정상 프로세스, 질환 혹은 개체 내 기타 병태를 나타내거나 이의 징후인 경우, 건강하거나 정상인 개체 또는 비교 대상인 개체로부터 획득된 생물학적 시료에서 검출되는 바이오 마커의 값 혹은 수준 범위 보다 높은 생물학적 시료 내의 바이오 마커의 값 혹은 수준을 지칭한다.The term "enhanced" (high expression), as used herein when referring to the expression level of the protein or nucleic acid, means that the biomarker indicates or is a symptom of an abnormal process, disease, or other condition in an individual, compared to a healthy or normal individual. It refers to the value or level of a biomarker in a biological sample that is higher than the value or level range of the biomarker detected in the biological sample obtained from the subject.

본 명세서에서 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 언급하면서 사용되는 용어 "저감(저발현)"은 바이오 마커가 비정상 프로세스, 질환 혹은 개체 내 기타 병태를 나타내거나 이의 징후인 경우, 건강하거나 정상인 개체 또는 비교 대상인 개체로부터 획득된 생물학적 시료에서 검출되는 바이오 마커의 값 혹은 수준 범위 보다 낮은 생물학적 시료 내의 바이오 마커의 값 혹은 수준을 지칭한다.The term "low expression" used herein when referring to the expression level of the protein or nucleic acid refers to the term "low expression" when the biomarker indicates or is a symptom of an abnormal process, disease, or other condition in an individual, or in a healthy or normal individual or comparison. It refers to the value or level of a biomarker in a biological sample that is lower than the value or level range of the biomarker detected in the biological sample obtained from the subject.

본 명세서에서 사용되는 용어 "시료"란 본 발명의 단백질 또는 핵산 발현이 검출될 수 있는 개체로부터 얻어지는 모든 시료를 의미한다.As used herein, the term “sample” refers to any sample obtained from an individual in which expression of a protein or nucleic acid of the present invention can be detected.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 시료는 혈액, 타액(saliva), 생검(biopsy), 피부 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 특별히 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 혈액, 소변 또는 타액이며, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the sample is any one selected from the group consisting of blood, saliva, biopsy, skin tissue, liquid culture, feces and urine, but is not particularly limited thereto. is blood, urine or saliva, and can be prepared by processing by a method commonly used in the technical field of the present invention.

상기 정상 대조군은 골괴사가 발생하지 않은 정상의 피검체로부터 회수한 생물학적 시료 또는 생체 외에서 손상되지 않은 골 세포를 의미할 수 있다.The normal control group may refer to a biological sample recovered from a normal subject in which osteonecrosis has not occurred or to bone cells that are not damaged in vitro.

상기 "단백질 수준을 측정하기 위한 방법"은, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 이러한 방식은 공지된 것으로써 그 기재를 생략한다.The "method for measuring protein levels" includes Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion, Ouchteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, and FACS. And it may be any one selected from the group consisting of protein chips. Since this method is known, its description is omitted.

또한, 상기에서 단백질의 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다. 상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, the method of measuring the protein level described above may be performed including a known process of isolating a protein from a biological sample using a known technique. The protein level can be measured using antibodies. In this case, the marker protein in the sample and the antibody specific for it form a complex, that is, an antigen-antibody complex, and the amount of the antigen-antibody complex formed is measured by a detection label (detection label). It can be measured quantitatively through the size of the signal of the label. These detection labels may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent substances, ligands, luminescent substances, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but are not limited thereto.

또한, 상기 "핵산 수준을 측정하기 위한 방법"은, 서던 블랏, PCR, RT-PCR 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 역시도 이러한 방식은 공지된 것으로써 그 기재를 생략한다.Additionally, the “method for measuring nucleic acid level” may be any one selected from the group consisting of Southern blot, PCR, RT-PCR, and DNA chip, but is not limited thereto. Again, since this method is known, its description is omitted.

상기 방법에 관한 사항은 키트 및 조성물에 대해서도 적용 가능하다. The above method is also applicable to kits and compositions.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군의 단백질 또는 핵산의 양과 무혈성 골괴사가 진행된 경우의 단백질 또는 핵산의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 정상 대조군과 비교함으로써 무혈성 골괴사증을 예측 및 진단할 수 있다.Therefore, through the above detection methods, the present invention can confirm the amount of protein or nucleic acid in the normal control group and the amount of protein or nucleic acid in the case of avascular osteonecrosis, and compare the level of expression with the normal control to determine the amount of avascular osteonecrosis. can be predicted and diagnosed.

본 발명의 조성물을 이용한 무혈성 골괴사증의 진단은, 기존 X선 촬영(X-ray), 컴퓨터단층촬영(computed tomography; CT) 등이 주를 이루는 진단법이 아닌 생화학 마커를 기반으로 하는 진단법을 제공함에 따라 빠르고 정확도 높은 진단이 가능한 장점이 있다.Diagnosis of avascular osteonecrosis using the composition of the present invention provides a diagnostic method based on biochemical markers rather than a diagnostic method mainly based on existing X-ray imaging (X-ray) and computed tomography (CT). It has the advantage of enabling quick and highly accurate diagnosis.

도 1은 혈청으로부터 엑소좀 펠렛의 분리 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 혈청 유래 엑소좀의 특성을 분석한 결과를 나타낸 도이다 (a: 나노입자분석기 분석 결과, b: 유세포분석기(FACS) 분석 결과, c: 투과 전자 현미경 관찰 결과).
도 3은 혈청 유래 엑소좀으로부터 분리한 단백질의 정량 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 혈청 유래 엑소좀으로부터 분리한 단백질의 프로테오믹스 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 혈청 유래 엑소좀으로부터 분리한 단백질의 클러스터링 및 히트 맵 결과를 나타낸 도이다 (a: 클러스터링, b: 히트 맵).
도 6은 단백질의 발현 변화를 산점도(scatter plot)로 나타낸 도이다.Figure 1 is a diagram showing the results of separation of exosome pellets from serum.
Figure 2 is a diagram showing the results of analyzing the characteristics of serum-derived exosomes (a: nanoparticle analysis result, b: flow cytometry (FACS) analysis result, c: transmission electron microscope observation result).
Figure 3 is a diagram showing the quantitative results of proteins isolated from serum-derived exosomes.
Figure 4 is a diagram showing the results of proteomics analysis of proteins isolated from serum-derived exosomes.
Figure 5 is a diagram showing the clustering and heat map results of proteins isolated from serum-derived exosomes (a: clustering, b: heat map).
Figure 6 is a diagram showing protein expression changes as a scatter plot.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Below, preferred embodiments are presented to aid understanding of the present invention. However, the following examples are provided only to make the present invention easier to understand, and the content of the present invention is not limited by the following examples.

실시예 1. 정상군과 대조군의 혈청 유래 엑소좀 분리Example 1. Isolation of serum-derived exosomes from normal and control groups

40~50대 남성을 대상으로 한 대조군 (정상인 n=3)과 환자군 (대퇴골두 무혈성 괴사증 환자, n=3)을 채혈하여 혈청분리튜브 (serum separating tube)에 담아 원심분리기를 사용하여 4℃에서 10분간 3,000rpm으로 원심분리하여 상층액에서 혈청을 분리하였다.Blood was collected from the control group (normal people, n=3) and the patient group (femoral head avascular necrosis patients, n=3) targeting men in their 40s and 50s, placed in a serum separating tube, and centrifuged at 4°C. Serum was separated from the supernatant by centrifugation at 3,000 rpm for 10 minutes.

이후, 분리한 혈청은 3,000 x g에서 15분간 원심분리하여 찌꺼기를 제거하고, 혈청 상층액을 ExoQuick 용액 (System Biosciences사)을 제조사에서 제공한 프로토콜 비율에 따라 처리하였다. 혈청 250㎕에 ExoQuick 67㎕를 넣고 잘 섞어준 뒤, 4 ℃에서 30분간 반응시켰다. 이후 3,000 x g에서 10분간 원심분리를 한 후, 엑소좀 펠렛을 확인하였다. 펠렛은 phosphate-buffered saline (PBS)에서 부유시켰다. Afterwards, the separated serum was centrifuged at 3,000 x g for 15 minutes to remove debris, and the serum supernatant was treated with ExoQuick solution (System Biosciences) according to the protocol ratio provided by the manufacturer. 67㎕ of ExoQuick was added to 250㎕ of serum, mixed well, and reacted at 4°C for 30 minutes. After centrifugation at 3,000 x g for 10 minutes, the exosome pellet was confirmed. The pellet was suspended in phosphate-buffered saline (PBS).

도 1에 나타낸 바와 같이, 혈청에서 엑소좀 펠렛을 분리할 수 있었다.As shown in Figure 1, exosome pellets could be separated from serum.

실시예 2. 혈청 유래 엑소좀의 특성 분석Example 2. Characterization of serum-derived exosomes

분리한 혈청 유래 엑소좀의 크기, 크기 분포 및 농도를 확인하기 위하여 나노입자분석기 (Nanosight NS300)로 분석하였다. 나노입자분석기에 1㎖의 엑소좀 용액을 로딩하고 크기, 크기 분포 및 농도를 측정하여 도 2의 a에 나타내었다.To confirm the size, size distribution, and concentration of the isolated serum-derived exosomes, they were analyzed using a nanoparticle analyzer (Nanosight NS300). 1 ml of exosome solution was loaded into the nanoparticle analyzer, and the size, size distribution, and concentration were measured and shown in Figure 2 (a).

도 2의 a에 나타낸 바와 같이, 대조군에서 평균 크기 106.5㎚, 농도 5.17X10¹⁰ particles/㎖의 엑소좀을 분리하였고, 환자군에서 평균 크기 99.3㎚, 농도 9.50X10¹⁰ particles/㎖을 분리할 수 있었다.As shown in Figure 2 a, exosomes ^with an average size of 106.5 nm and a concentration of ^5.17

한편, 분리한 혈청 유래 엑소좀의 표면 마커의 검출을 확인하기 위하여, 유세포분석기(FACS; Galios (Beckman Coulter사))를 이용하였다.Meanwhile, to confirm the detection of surface markers of the isolated serum-derived exosomes, a flow cytometer (FACS; Galios (Beckman Coulter)) was used.

구체적으로, 혈청으로부터 분리된 100㎕의 엑소좀을 10㎕의 알데히드/설페이트 라텍스 비드와 함께 실온에서 15분간 배양하였다. 이후, 샘플을 회전 혼합기에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, 비드 결합 엑소좀을 3,000 x g에서 10분간 원심분리하여 상층액은 제거하고 펠렛을 anti-CD63, CD81 항체를 포함하는 100㎕의 PBS로 1시간 동안 샘플을 반응시켰다. 이후, 3,000 x g에서 10분간 원심분리하여 상층액은 제거하고 펠렛을 500㎕의 PBS에 서스펜션시킨 후, 유세포분석기를 이용하여 엑소좀의 표면 마커를 검출한 결과를 도 2의 b에 나타내었다.Specifically, 100 μl of exosomes isolated from serum were incubated with 10 μl of aldehyde/sulfate latex beads for 15 minutes at room temperature. The samples were then incubated overnight in a rotating mixer. Afterwards, the bead-bound exosomes were centrifuged at 3,000 Afterwards, the supernatant was removed by centrifugation at 3,000

도 2의 b에 나타낸 바와 같이, 대조군에서 CD63은 49.8%, CD81은 63.7%의 비율로 엑소좀 특이적 표면항원 발현을 확인하였고, 환자군에서 CD63은 45.4%, CD81은 88.6%의 비율로 엑소좀 특이적 표면항원 발현을 확인하였다.As shown in Figure 2b, in the control group, exosome-specific surface antigen expression was confirmed at a rate of 49.8% for CD63 and 63.7% for CD81, and in the patient group, exosome expression was 45.4% for CD63 and 88.6% for CD81. Expression of specific surface antigens was confirmed.

또한, 분리한 혈청 유래 엑소좀의 형태를 확인하기 위하여, 엑소좀을 차가운 물에 현탁시키고, 동일한 양의 2% 파라포름알데히드를 10분간 처리하여 고정시켰다. 이후, 용액을 폼바 탄소 코팅 그리드에 로딩하고 10분간 반응시켰다. 용액을 제거한 후 건조시킨 뒤에 투과 전자 현미경 (Bio-TEM)을 사용하여 형태를 관찰하였다.Additionally, in order to confirm the shape of the isolated serum-derived exosomes, the exosomes were suspended in cold water and fixed by treating them with the same amount of 2% paraformaldehyde for 10 minutes. Afterwards, the solution was loaded onto the Pomba carbon-coated grid and reacted for 10 minutes. After removing the solution and drying it, the shape was observed using a transmission electron microscope (Bio-TEM).

도 2의 c에 나타낸 바와 같이, 대조군과 환자군 혈청 유래 엑소좀의 형태를 확인하였다.As shown in Figure 2c, the shapes of exosomes derived from control and patient serum were confirmed.

위 결과를 통해 엑소좀의 특성을 확인하였다. Through the above results, the characteristics of exosomes were confirmed.

실시예 3. 엑소좀의 프로테오믹스 분석Example 3. Proteomics analysis of exosomes

혈청으로부터 분리한 엑소좀에서 단백질을 분리하고, BCA 어세이를 통해 측정한 단백질 정량 값을 바탕으로 FASP 소화(digestion)를 진행하였다. 단백질 정량값은 도 3에 나타내었다.Proteins were isolated from exosomes isolated from serum, and FASP digestion was performed based on protein quantification measured through BCA assay. Protein quantitative values are shown in Figure 3.

FASP 다이제스션의 초기량은 각 시료 동일하게 100㎍으로 시작하였다. 이후, 500mM TCEP (Final conc. 5mM TCEP)를 첨가한 후, 37℃에서 300rpm으로 30분간 인큐베이션하여 단백질을 리덕션(reduction)시키고, 15분간 14,000 x g로 원심분리하였다.The initial amount of FASP digestion was the same for each sample, 100 μg. Afterwards, 500mM TCEP (Final conc. 5mM TCEP) was added, the protein was reduced by incubation at 37°C at 300rpm for 30 minutes, and centrifuged at 14,000 x g for 15 minutes.

이후, 500mM IAA (Final conc. 50mM)을 첨가한 후, 1시간 동안 25℃의 어두운 곳에서 인큐베이션하여 단백질을 알킬화(alkylation)하고, 15분간 14,000 x g로 원심분리하였다. 그 후, 8M Urea (in 0.1M Tris/HCL, pH 8.5) 100㎕를 첨가한 후, 15분간 14,000 x g로 원심분리하였으며, 이를 3회 반복하였다.Afterwards, 500mM IAA (Final conc. 50mM) was added, and the protein was alkylated by incubation in the dark at 25°C for 1 hour and centrifuged at 14,000 x g for 15 minutes. Afterwards, 100㎕ of 8M Urea (in 0.1M Tris/HCL, pH 8.5) was added and centrifuged at 14,000 x g for 15 minutes, and this was repeated three times.

그 후, 트립신을 50mM ABC에 녹여 트립신 : 단백질이 1 : 50의 비율이 되도록 농도를 맞춰 첨가한 뒤, 37℃에서 300rpm으로 18시간 동안 배양시켜 펩타이드로 소화시켰다. 이후, 50 mM의 ABC 40㎕를 첨가하고, 모든 용액이 필터를 통과할 때까지 진공(vacuum)을 걸어주고, 이것을 2회 반복하였다.Afterwards, trypsin was dissolved in 50mM ABC and added at a concentration of trypsin:protein at a ratio of 1:50, followed by incubation at 37°C and 300rpm for 18 hours to digest into peptides. Afterwards, 40㎕ of 50mM ABC was added, a vacuum was applied until all the solution passed through the filter, and this was repeated twice.

이후, 15㎕L의 포름산 (pH 2)을 첨가하여 단백질 소화를 중단시켰다. 또한, C18 micro spin-column을 사용하여 탈염을 진행하였다. 데이터 분석을 위해 각 시료별로 LC-MS/MS 데이터를 Proteome discoverer를 이용하여 분석하였다. 데이터베이스는 Uniprot의 human database를 사용하였다. 엑소좀 시료의 프로테오믹스 분석을 위해 UPLC-Exactive 장비를 이용하여 분석을 수행하였고, 이를 도 4에 나타내었다.Then, protein digestion was stopped by adding 15 μl of formic acid (pH 2). In addition, desalting was performed using a C18 micro spin-column. For data analysis, LC-MS/MS data for each sample was analyzed using Proteome discoverer. Uniprot's human database was used as the database. For proteomics analysis of exosome samples, analysis was performed using UPLC-Exactive equipment, and this is shown in Figure 4.

실시예 4. 클러스터링 히트 맵(heatmap)Example 4. Clustering heatmap

상기 실시예 3의 LC-MS를 통해 나온 데이터에 대하여 클러스터링 히트맵으로 나타내었다.The data obtained through LC-MS in Example 3 was shown as a clustering heat map.

도 5의 a에 나타낸 바와 같이, 대조군 3명과 환자군 3명의 엑소좀에서 총 312개의 단백질에 대한 분석을 수행한 결과, 대조군과 환자군간의 클러스터링 조합이 이루어진 것을 확인할 수 있었다.As shown in Figure 5a, as a result of analyzing a total of 312 proteins in the exosomes of 3 control groups and 3 patient groups, it was confirmed that a clustering combination was achieved between the control group and the patient group.

또한, 도 5의 b에 나타낸 바와 같이, 클러스터링에서 확인된 312개의 단백질 중 p값이 0.05보다 작고, fold change값이 2배 이상으로 발현하는 단백질을 선별한 결과 14개 단백질을 확인할 수 있었고, 이를 히트맵으로 나타내었다.In addition, as shown in Figure 5b, among the 312 proteins identified in clustering, 14 proteins were identified as a result of selecting proteins with a p value less than 0.05 and a fold change value of more than 2 times. Shown as a heat map.

실시예 5. 각 샘플 별 raw dataExample 5. Raw data for each sample

상기 실시예 4에서 확인된 14개 단백질에 대한 각 샘플 별 raw data를 확인하고, 이를 표 1 및 표 2에 나타내었다. 표 1은 상향 조절되는 단백질군을 나타내며, 표 2는 하향 조절되는 유전자 군을 나타낸다. 각각의 값은 log 처리하여 표준화시켰으며, 환자군과 정상대조군의 평균값을 정리한 결과를 아래와 같이 나타내었다. Raw data for each sample for the 14 proteins identified in Example 4 were confirmed, and are shown in Tables 1 and 2. Table 1 shows the protein groups that are upregulated, and Table 2 shows the gene groups that are downregulated. Each value was standardized by log processing, and the results of summarizing the average values of the patient group and normal control group are shown below.

GeneGene Fold change Fold change Average of normalized data(Log2)Average of normalized data(Log2) 환자군patient group 정상대조군 Normal control group FN1FN1 100100 20.2520.25 -- VWFVWF 3.3793.379 25.3525.35 22.6122.61 IGHV3-23IGHV3-23 100100 21.5721.57 -- FGBFGB 100100 22.2622.26 -- PRG4PRG4 3.8273.827 19.9119.91 18.2318.23

GeneGene Fold change Fold change Average of normalized data(Log2)Average of normalized data(Log2) 환자군patient group 정상대조군Normal control group FCGBPFCGBP 0.430.43 21.1121.11 22.2622.26 ZSWIM9ZSWIM9 0.4090.409 23.8623.86 25.0825.08

상기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, FN1, IGHV3-23 및 FGB의 경우 정상대조군에서 확인되지 않았던 반면, 환자군에서 이의 발현이 크게 증가하는 것을 확인하였다. 또한, VWF 및 PRG4의 경우 정상군에서 낮은 발현 수준을 나타내었으나, 환자군에서 이의 발현 정도가 크게 증가하는 것을 확인하였다.As can be seen in Table 1 above, while FN1, IGHV3-23, and FGB were not confirmed in the normal control group, their expression was confirmed to be significantly increased in the patient group. In addition, VWF and PRG4 showed low expression levels in the normal group, but their expression levels were confirmed to be significantly increased in the patient group.

또한, 상기 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, FCGBP 및 ZSWIM9는 환자군에서 이의 발현이 크게 감소하는 것을 확인하였다.In addition, as can be seen in Table 2 above, the expression of FCGBP and ZSWIM9 was confirmed to be significantly reduced in the patient group.

정리하자면, 환자군에서 대조군에 비해 FN1, VWF, IGHV3-23, FGB 및 PRG4의 단백질 발현이 증대되었고, FCGBP 및 ZSWIM9의 단백질 발현이 저감되었음을 확인할 수 있었다.In summary, it was confirmed that the protein expression of FN1, VWF, IGHV3-23, FGB, and PRG4 was increased in the patient group compared to the control group, and the protein expression of FCGBP and ZSWIM9 was decreased.

실시예 6. 산점도(scatter plot)로 나타낸 단백질 변화Example 6. Protein changes shown in scatter plot

대조군과 환자군 사이에서 각 단백질에 대한 log₂(Normalized data)의 분포도를 도 6에 나타내었다.The distribution of log ₂ (Normalized data) for each protein between the control and patient groups is shown in Figure 6.

도 6에서 가로축은 대조군의 log₂(Normalized data) 값을, 세로축은 실험군의 log₂(Normalized data) 값을 나타낸다. 또한, 가운데 검은색 사선에 위치한 단백질들은 두 샘플에서 같은 발현값을 갖는 유전자들이고, 적색 사선과 녹색 사선은 각각 2배 기준 증가와 감소를 나타낸다. 즉, 적색 사선 위에 위치한 유전자들이 대조군에 비해 실험군에서 2배 이상 상향(up-regulated)된 단백질들, 녹색 사선 아래에 위치한 유전자들은 대조군에 비해 실험군에서 2배 이상 하향(down-regulated)되는 단백질이다.In Figure 6, the horizontal axis represents the log ₂ (Normalized data) value of the control group, and the vertical axis represents the log ₂ (Normalized data) value of the experimental group. In addition, the proteins located in the black diagonal line in the middle are genes with the same expression value in the two samples, and the red and green diagonal lines indicate a two-fold increase and decrease, respectively. In other words, genes located above the red diagonal line are proteins that are up-regulated more than two times in the experimental group compared to the control group, and genes located below the green diagonal line are proteins that are down-regulated more than two times in the experimental group compared to the control group. .

도 6에 나타낸 바와 같이, 표 1 및 표 2의 결과와 마찬가지로 환자군에서 대조군에 비해 FN1, VWF, IGHV3-23, FGB 및 PRG4의 단백질 발현이 증대(상향)되었고, FCGBP 및 ZSWIM9의 단백질 발현이 저감(하향)되었음을 확인할 수 있었다.As shown in Figure 6, similar to the results in Tables 1 and 2, protein expression of FN1, VWF, IGHV3-23, FGB, and PRG4 was increased (up) in the patient group compared to the control group, and protein expression of FCGBP and ZSWIM9 was decreased. It was confirmed that it was (downgraded).

Claims

IGHV3-23 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 무혈성 골괴사증 진단용 조성물.A composition for diagnosing avascular osteonecrosis comprising an agent for measuring the expression level of IGHV3-23 protein or nucleic acid.

제1항에 있어서, 상기 조성물은 FN1, VWF, FGB, PRG4, FCGBP 및 ZSWIM9으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것인, 무혈성 골괴사증 진단용 조성물.The method of claim 1, wherein the composition further comprises an agent for measuring the expression level of one or more proteins or nucleic acids selected from the group consisting of FN1, VWF, FGB, PRG4, FCGBP, and ZSWIM9, for diagnosing avascular osteonecrosis. Composition.

제1항에 있어서, 상기 무혈성 골괴사증은 대퇴골두 무혈성 골괴사, 상완골두 무혈성 골괴사, 척추체 무혈성 골괴사, 슬관절 무혈성 골괴사 및 족부 무혈성 골괴사로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 무혈성 골괴사증 진단용 조성물.The composition for diagnosing avascular osteonecrosis according to claim 1, wherein the avascular osteonecrosis is any one selected from the group consisting of avascular osteonecrosis of the femoral head, avascular osteonecrosis of the humeral head, avascular osteonecrosis of the vertebral body, avascular osteonecrosis of the knee joint, and avascular osteonecrosis of the foot.

제1항에 있어서, 상기 단백질은 엑소좀 유래인 것인, 무혈성 골괴사증 진단용 조성물.The composition for diagnosing avascular osteonecrosis according to claim 1, wherein the protein is derived from exosomes.

제1항에 있어서, 상기 제제는 상기 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인, 무혈성 골괴사증 진단용 조성물.The composition for diagnosing avascular osteonecrosis according to claim 1, wherein the agent comprises an antibody that specifically binds to the one or more proteins or a primer or probe that specifically binds to the one or more nucleic acids.

제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 무혈성 골괴사증 진단용 키트.A kit for diagnosing avascular osteonecrosis comprising the composition according to any one of claims 1 to 5.

제6항에 있어서, 상기 키트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 디바이스, 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR) 디바이스, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 무혈성 골괴사증 진단용 키트.The method of claim 6, wherein the kit includes a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) device, a real time polymerase chain reaction (Real time PCR) device, an ELISA plate, a dip-stick device, an immunochromatographic test strip, and a radioactive split immunosorbent. A kit for diagnosing avascular osteonecrosis, which is any one selected from the group consisting of a test device and a flow-through device.

(a) 무혈성 골괴사증이 의심되는 피검체의 시료로부터 IGHV3-23 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정한 결과 정상 대조군의 IGHV3-23와 비교하여 발현이 증대되는 경우 무혈성 골괴사증이 발생한 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 무혈성 골괴사증을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.(a) measuring the expression level of IGHV3-23 protein or nucleic acid from a sample of a subject suspected of having avascular osteonecrosis; and
(b) measuring the expression level of the protein or nucleic acid and determining that avascular osteonecrosis has occurred if the expression is increased compared to IGHV3-23 in the normal control group; providing information for diagnosing avascular osteonecrosis, including How to provide.

제8항에 있어서, 상기 정보를 제공하는 방법은,
(a) FN1, VWF, FGB 및 PRG4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 더 측정하는 단계; 및
(b) 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정한 결과 상응하는 정상 대조군의 FN1, VWF, FGB 및 PRG4 및 FCGBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 비교하여 발현이 증대되는 경우, 무혈성 골괴사증이 발생한 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 무혈성 골괴사증을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.The method of claim 8, wherein the method of providing the information is:
(a) further measuring the expression level of one or more proteins or nucleic acids selected from the group consisting of FN1, VWF, FGB, and PRG4; and
(b) When the expression level of the protein or nucleic acid is measured and the expression is increased compared to any one or more selected from the group consisting of FN1, VWF, FGB and PRG4 and FCGBP of the corresponding normal control group, avascular osteonecrosis A method of providing information for diagnosing avascular osteonecrosis, including the step of determining that it has occurred.

제8항에 있어서, 상기 정보를 제공하는 방법은,
(a) FCGBP, ZSWIM9 또는 이들 모두의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 더 측정하는 단계; 및
(b) 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정한 결과 상응하는 정상 대조군의 FCGBP, ZSWIM9 또는 이들 모두와 비교하여 발현이 저감되는 경우, 무혈성 골괴사증이 발생한 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 무혈성 골괴사증을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.The method of claim 8, wherein the method of providing the information is:
(a) further measuring the expression level of protein or nucleic acid of FCGBP, ZSWIM9, or both; and
(b) determining that avascular osteonecrosis has occurred if the expression level of the protein or nucleic acid is measured and the expression is reduced compared to FCGBP, ZSWIM9, or both of the corresponding normal control group; How to provide information to diagnose .

제8항에 있어서, 상기 무혈성 골괴사증은 대퇴골두 무혈성 골괴사, 상완골두 무혈성 골괴사, 척추체 무혈성 골괴사, 슬관절 무혈성 골괴사 및 족부 무혈성 골괴사로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 무혈성 골괴사증을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.The method of claim 8, wherein the avascular osteonecrosis is any one selected from the group consisting of avascular osteonecrosis of the femoral head, avascular osteonecrosis of the humeral head, avascular osteonecrosis of the vertebral body, avascular osteonecrosis of the knee joint, and avascular osteonecrosis of the foot. How to provide information for.

제8항에 있어서, 상기 시료는 피검체로부터 분리된 혈액, 타액(saliva), 생검(biopsy), 피부 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변인, 무혈성 골괴사증을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.The method of claim 8, wherein the sample is blood, saliva, biopsy, skin tissue, liquid culture, feces, and urine isolated from the subject, and a method for providing information for diagnosing avascular osteonecrosis. .

제8항에 있어서, 상기 (a) 단계의 단백질 수준을 측정하기 위한 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 무혈성 골괴사증을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.The method of claim 8, wherein the methods for measuring the protein level in step (a) include Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion method, Ouchteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, A method of providing information for diagnosing avascular osteonecrosis, which is any one selected from the group consisting of immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, and protein chip.

제8항에 있어서, 상기 (a) 단계의 핵산 수준을 측정하기 위한 방법으로는 서던 블랏, PCR, RT-PCR 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 무혈성 골괴사증을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.The method of claim 8, wherein the method for measuring the nucleic acid level in step (a) is any one selected from the group consisting of Southern blot, PCR, RT-PCR, and DNA chip. How to provide information for.