KR101054953B1 - SNP 14, a molecule for diagnosing and treating liver cancer, and a kit comprising the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 SNX14 (sorting nexin 14) 의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암을 진단 및 치료하기 위한 마커 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 상기 마커를 이용하여 간암을 진단하기 위한 마이크로어레이 및 상기 마커의 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 상기 마커는 간암의 조기 진단에 활용되어 간암환자의 수술 또는 약물 치료시기를 신속히 결정하여 생존 향상에 크게 기여 할 수 있을 것으로 판단된다.The present invention provides a marker detection composition for diagnosing and treating liver cancer, including a preparation for measuring expression level of SNX14 (sorting nexin 14), a kit including the composition, and a microarray for diagnosing liver cancer using the marker. And a method for detecting the marker. According to the present invention, the marker may be utilized for early diagnosis of liver cancer to quickly determine the time of surgery or medication for liver cancer patients, and thus, may significantly contribute to improving survival.
간암, 마커, 마이크로어레이, 진단, 키트 Liver Cancer, Marker, Microarray, Diagnostics, Kit
Description
본 발명은 SNX14 (sorting nexin 14) 의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암을 진단 및 치료하기 위한 마커 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 상기 마커를 이용하여 간암을 진단하기 위한 마이크로어레이 및 상기 마커의 검출 방법에 관한 것이다.The present invention provides a marker detection composition for diagnosing and treating liver cancer, including a preparation for measuring expression level of SNX14 (sorting nexin 14), a kit including the composition, and a microarray for diagnosing liver cancer using the marker. And a method for detecting the marker.
간암 (hepatocellular carcinoma)은 세계적으로 가장 치명적인 암의 하나로, 아시아와 사하라 이남 아프리카에서는 해마다 약 오십만 명 이상이 간암으로 사망하고 있다. 특히, 중국에서는 암으로 인해 사망하는 남성의 두번째 요인으로 꼽힐 만큼 간암은 치명적이다. 간암의 위험 요인이 B형 간염 또는 C형 간염 바이러스에 의한 고질적인 감염이라고 할지라도 간암 세포 내의 분자 메커니즘은 아직도 명확히 규명되지 않은 상태이다. 최근 간암 진단 및 환자의 수술 후 생존을 예측하기 위한 마커에 관한 연구가 꾸준히 진행되고 있으나 탁월한 효과가 있는 진단마커는 개발되지 않은 실정이다. 또한, 간 절제술은 간암 환자 중에서 전이가 발생하지 않은 비교적 초기 환자의 치료법으로서, 현재 전체 간암 환자의 약 20% 내외가 간 절제술에 의한 치료를 받고 있으나, 간 절제술을 받은 간암환자의 경우에도 장기 생존율은 높지 않은 편이다. 특히, 수술 후 5년 이내 생존율이 30-40% 정도로 사망하는 환자가 많은 실정이다. 또한, 예전부터 임상 병리분석에 의한 간암 진단 방법이 사용되고 있으나, 보편성과 정확성의 문제로 인해 모든 간암 환자에게 적용되지 못하고 있다. 따라서, 효과적이고 특이성 높은 간암 진단 마커를 개발 해야 할 필요성이 크다. Hepatocellular carcinoma is one of the most deadly cancers in the world, with more than half a million people dying from liver cancer each year in Asia and sub-Saharan Africa. In China, liver cancer is fatal, making it the second leading cause of death from cancer in China. Although the risk factor for liver cancer is chronic infection with hepatitis B or hepatitis C virus, the molecular mechanisms in liver cancer cells are still unclear. Recently, studies on markers for diagnosing liver cancer and predicting postoperative survival of patients have been steadily progressing, but diagnostic markers having excellent effects have not been developed. In addition, liver resection is a treatment for relatively early patients without metastasis among liver cancer patients. Currently, about 20% of all liver cancer patients are treated by liver resection, but long-term survival rate is also observed in liver cancer patients who have undergone liver resection. Is not high. In particular, many patients die about 30-40% of survival within 5 years after surgery. In addition, a method for diagnosing liver cancer by clinical pathology has been used in the past, but it has not been applied to all liver cancer patients due to problems of universality and accuracy. Therefore, there is a great need to develop effective and specific liver cancer diagnostic markers.
최근의 연구에서 간암 발생에 있어서 변형된 p53, 베타-카테닌, AXINI, p21(WAF1/CIP1) 및 p27 Kip 등의 유전자가 관련된다는 것이 밝혀졌다. 그러나 이러한 개개의 유전자의 변화들은 간암 환자들의 외적 특성과 임상 특성을 정확하게 반영하지 못하므로, 개체의 간암 내의 세포와 분자의 다양성은 기존의 유전자 연구 외에 새로운 접근 방식을 필요로 하고 있다. Recent studies have shown that genes such as p53, beta-catenin, AXINI, p21 (WAF1 / CIP1) and p27 Kip are involved in the development of liver cancer. However, these individual gene changes do not accurately reflect the external and clinical characteristics of liver cancer patients, so the diversity of cells and molecules within individual liver cancers requires a new approach in addition to conventional genetic studies.
이와 관련하여 마이크로어레이 테크놀로지는 개개의 유전자의 측정범위를 넘어서 한번의 실험으로 수만여 개의 유전자 발현을 동시에 측정할 수 있는 새로운 기술로서 간암을 포함한 거의 대부분의 암 연구에 적용되어 왔으며, 암의 발생 및 진행과정에 활발하게 참여하는 유전자를 추출함으로써 암 진단 및 예후 예측의 수준을 분자 수준에서 가능하도록 하였다. 비록 간암의 진단이 그들의 병리학적 연구결과에 의해 정확하게 결정되는 것은 어렵지만, 그들의 분자 발현 프로파일의 차이 점을 이용하여 비종양 간 조직으로부터 간암을 구별하는 것은 가능하다. 왜냐하면, 분자 발현 프로파일의 차이는 간암 발생에 포함된 유전자들의 정확한 세트(set)를 선택하는 것이 가능케 하기 때문이다. 또한 이것은 치료에 대한 적절한 목표를 설정하는 것을 용이하게 할 수 있고 따라서 간암 치료상의 효과를 극대화할 것으로 기대되고 있다.In this regard, microarray technology is a new technology that can simultaneously measure the expression of tens of thousands of genes in a single experiment beyond the range of individual genes, and has been applied to almost all cancer research including liver cancer. By extracting genes that actively participate in the process, the level of cancer diagnosis and prognosis prediction is made possible at the molecular level. Although the diagnosis of liver cancer is difficult to determine accurately by their pathological findings, it is possible to distinguish liver cancer from non-tumor liver tissue using differences in their molecular expression profiles. This is because the difference in molecular expression profiles makes it possible to select the exact set of genes involved in liver cancer development. It is also expected to facilitate setting appropriate targets for treatment and thus maximize the effectiveness of treating liver cancer.
본 발명자들은 cDNA 마이크로어레이 분석과 정량 역전사 PCR 을 통하여 간암 진단을 분자수준에서 정확하게 확인 할 수 있는 마커를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 마이크로에레이를 통해 일차적으로 발현 차이가 매우 크게 나타난 수만여 개의 유전자를 정량 역전사 PCR(quantitive reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 재확인하고, mRNA 수준에서 비종양 조직에 비해 종양조직에서 매우 높게 발현되는 유전자를 확인 할 수 있었다. 이에, 본 발명자들은 SNX14 가 간암 특이 발현 유전자임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors endeavored to develop markers capable of accurately confirming the diagnosis of liver cancer at the molecular level through cDNA microarray analysis and quantitative reverse transcription PCR. As a result, tens of thousands of genes whose expression difference was largely expressed through microarray were reconfirmed through quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (PCR), and the mRNA level was significantly higher in tumor tissue than in non-tumor tissue. The gene to be expressed could be confirmed. Accordingly, the present inventors have completed the present invention by identifying that SNX14 is a liver cancer specific expression gene.
따라서, 본 발명의 목적은 SNX14 의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다 Accordingly, it is an object of the present invention to provide a composition for detecting markers for diagnosing liver cancer, comprising an agent for measuring the expression level of SNX14.
본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는, 간암을 진단하기 위한 마커 검출용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for detecting markers for diagnosing liver cancer, comprising the composition.
본 발명의 또 다른 목적은, SNX14를 포함하는, 간암을 진단하기 위한 마이크로어레이를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a microarray for diagnosing liver cancer, including SNX14.
본 발명의 또 다른 목적은, 간암 마커 SNX14 를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for detecting liver cancer marker SNX14.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 SNX14 (sorting nexin 14) 의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물에 관한 것이다. As one aspect for achieving the above object, the present invention relates to a composition for detecting markers for diagnosing liver cancer, comprising an agent for measuring the expression level of SNX14 (sorting nexin 14).
본 발명에서 용어, "진단" 은 병리상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 간암 발병 여부를 확인하는 것이다. As used herein, the term "diagnostic" means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to determine whether the liver cancer.
본 발명에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 간암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질 로, 정상 세포에 비하여 간암을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 간암진단 마커는 정상 간 조직 세포에 비하여, 간암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 SNX14 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다. As used herein, the term "diagnostic marker, diagnostic marker, or diagnostic marker" is a substance capable of diagnosing liver cancer cells from normal cells, and increases or decreases in cells with liver cancer compared to normal cells. Organic polypeptides such as visible polypeptides or nucleic acids such as mRNA, lipids, glycolipids, glycoproteins, and the like. For purposes of the present invention, the hepatic cancer diagnostic markers of the present invention are SNX14 genes and proteins encoded by them that exhibit specifically high levels of expression in liver cancer cells as compared to normal liver tissue cells.
SNX14 (sorting nexin 14) 의 유전자 및 그 단백질 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 에 등록되어 있다(GeneID: 57231, NP_722523). 본원에서는 SNX14 의 유전자 및 아미노산 서열을 각각 서열번호 1과 서열번호 2에 나타내었다. 또한, SNX14의 구체적인 기능 및 간암과의 연관성은 전혀 알려져 있지 않았다. Gene and protein information of SNX14 (sorting nexin 14) are registered in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) (GeneID: 57231, NP_722523). Herein, the gene and amino acid sequences of SNX14 are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively. In addition, the specific function of SNX14 and its association with liver cancer are not known at all.
본 발명자는 다음과 같은 입증을 통하여 SNX14 가 간암 진단 마커가 될 수 있음을 규명하였다. The present inventors have found that SNX14 can be a diagnostic marker for liver cancer through the following verification.
구체적으로, 간암 환자 중 간암 수술을 받은 환자로부터 종양조직 146개와 간암이 아닌 환자로부터 정상 조직 5개를 채취하여 RNA를 분리 정제 하였다. 정상조직 5개로부터 분리 정제한 RNA는 혼합하여 대조 RNA로 사용하였다. 이렇게 조직으로부터 분리한 RNA와 대조 RNA를 역전사(reverse transcription)시켜 cDNA를 제조하였는데, 이 과정에서 Cy5-dUTP, Cy3-dUTP를 cDNA에 각각 결합하도록 하였다 (도 1). 이렇게 혼성화 시킨 DNA 칩은 레이저 스캐너를 이용하여 각 스팟에서의 Cy5와 Cy3의 강도(intensity)를 측정하였다. 이 두 가지 종류의 형광강도의 상대적인 비율을 컴퓨터 소프트웨어(IMAGENE program)를 이용하여 수치화하여 발현도를 측정하였다. 수치화한 발현도를 정규화 과정을 거쳐(normalization process) 생존상관률(p)이 0.05 이하인 유전자만 선정한 후 정상조직에서 각 유전자 발현의 하위 30% 강도(intensity) 평균값이 1000 이하이면서 1.5 fold 이상 종양에서 과발현된 샘플수가 40개 이상인 유전자만 선정하였다. 이어서, 종양 조직(146개)에서 각 유전자 발현의 상위 30% intensity 평균값에서 정상조직에서 각 유전자 발현의 상위 30% intensity 평균값을 뺀 후, 한 유전자에서 발현 정도의 차이를 나타내는 IQR이 0.43 이상인 유전자 18개를 최종 선정하였다. 이러한 과정을 통해 선정된 유전자를 종양조직과 비종양조직 30쌍에서 RT-PCR 및 아가로즈 전기영동 과정을 통해 재확인 하였다 (도 4). Specifically, RNA was isolated and purified from 146 tumor tissues from liver cancer patients and 5 normal tissues from non-liver cancer patients. RNA purified from five normal tissues was mixed and used as a control RNA. Thus, cDNA was prepared by reverse transcription of RNA and control RNA isolated from tissues, in which Cy5-dUTP and Cy3-dUTP were bound to cDNA, respectively (FIG. 1). The hybridized DNA chip was measured by using a laser scanner to measure the intensity of Cy5 and Cy3 at each spot. The relative ratios of these two types of fluorescence intensities were quantified using computer software (IMAGENE program) and the expression levels were measured. The quantified expression was normalized to select only genes with a survival correlation (p) of 0.05 or less, and overexpressed in tumors of 1.5 fold or more with a mean 30% intensity average of 1000 or less in each tissue in normal tissues. Only genes with more than 40 samples were selected. Subsequently, after subtracting the average value of the top 30% intensity of each gene expression from normal tissue from the top 30% intensity average of each gene expression in tumor tissue (146), genes with an IQR of 0.43 or higher, representing a difference in expression level in one gene, 18 The dog was finally selected. Genes selected through this process were reconfirmed through RT-PCR and agarose electrophoresis in 30 pairs of tumor and non-tumor tissues (FIG. 4).
본 발명에서 용어, "SNX14 의 발현수준을 측정하는 제제" 란 상기와 같이 간암 세포에서 발현이 증가하는 마커인 SNX14 의 발현수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 마커에 특이적인 항체, 프라이머 쌍 또는 프로브를 말한다. In the present invention, the term "agent for measuring the expression level of SNX14" refers to a molecule that can be used for detection of a marker by identifying the expression level of SNX14, which is a marker for increasing expression in liver cancer cells as described above, preferably Refers to antibodies, primer pairs or probes specific for the marker.
SNX14 의 발현수준은 SNX14 유전자의 mRNA 의 발현수준 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 확인함으로써 알 수 있다. 본 발명에서 "mRNA 발현수준 측정"이란 간암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 간암 마커 유전자의 mRNA 존재여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The expression level of SNX14 can be determined by confirming the expression level of mRNA of the SNX14 gene or the expression level of the protein encoded by the gene. In the present invention, "mRNA expression level measurement" refers to a process of confirming the presence and expression level of mRNA of liver cancer marker gene in a biological sample in order to diagnose liver cancer, by measuring the amount of mRNA. Analytical methods for this include RT-PCR, competitive RT-PCR, Real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA), northern blotting (northern) blotting), DNA chips, and the like, but is not limited thereto.
본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 간암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 간암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. In the present invention, "protein expression level measurement" refers to a process of confirming the presence and expression level of a protein expressed in a liver cancer marker gene in a biological sample to diagnose liver cancer. An antibody that specifically binds to a protein of the gene Check the amount of protein using. Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay, radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, and Rocket immunoelectrolysis There are, but are not limited to, electrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, protein chip, and the like.
유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, SNX14 유전자의 핵산 서열이 NM_153816 (NCBI) 에 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다. Agents for measuring mRNA levels of genes are preferably primer pairs or probes, and since the nucleic acid sequence of the SNX14 gene is identified in NM_153816 (NCBI), those skilled in the art will appreciate that primers specifically amplify specific regions of these genes based on the sequence. Alternatively, the probe can be designed.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로는 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 SNX14 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 간암을 진단 할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. As used herein, the term “primer” refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 ′ hydroxyl group, which may form complementary templates and base pairs and is a starting point for copying a template. By short nucleic acid sequence is meant to function. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures. In the present invention, PCR can be performed using the sense and antisense primers of the SNX14 polynucleotide to diagnose liver cancer through the generation of a desired product. PCR conditions, sense and antisense primer lengths can be modified based on what is known in the art.
본 발명에서 용어, "프로브" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작 될 수 있다. 본 발명에서는 SNX14 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 간암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. As used herein, the term "probe" refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA, which is short to several bases to hundreds of bases, which is capable of specific binding with mRNA. You can check the presence. Probes may be prepared in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, and the like. In the present invention, hybridization may be performed using a probe complementary to the SNX14 polynucleotide, and liver cancer may be diagnosed through hybridization. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on what is known in the art.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등) 로의 변형이 있 다. Primers or probes of the invention can be synthesized chemically using phosphoramidite solid support methods, or other well known methods. Such nucleic acid sequences may also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution with one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, eg, uncharged linkages such as methyl phosphonate, phosphoester, phosphoro Amidate, carbamate, etc.) or charged linkages (eg phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게 항체이다. Agents for measuring protein levels are preferably antibodies.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 SNX14 에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. As used herein, the term "antibody" refers to a specific protein molecule directed to an antigenic site as it is known in the art. For the purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to SNX14, a marker of the present invention, which is a protein encoded by the marker gene by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method. Can be obtained and prepared from conventional proteins by conventional methods. Also included are partial peptides that may be made from such proteins, and the partial peptides of the present invention include at least seven amino acids, preferably nine amino acids, more preferably twelve or more amino acids.
본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수항체도 포함된다. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited and a part thereof is included in the antibody of the present invention and all immunoglobulin antibodies are included as long as they are polyclonal antibody, monoclonal antibody or antigen-binding. Furthermore, the antibodies of the present invention also include special antibodies such as humanized antibodies.
본 발명의 간암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다. Antibodies used in the detection of liver cancer diagnostic markers of the invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains. The functional fragment of an antibody molecule means the fragment which has at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2, and Fv.
또, 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 간암 진단 마커 검출용 조성물을 포함 하는, 간암을 진단하기 위한 마커 검출용 키트에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a marker detection kit for diagnosing liver cancer, comprising the composition for detecting liver cancer diagnostic marker.
본 발명의 키트는 간암진단 마커인 SNX14 의 mRNA 발현수준 또는 단백질의 발현수준을 확인함으로써 마커를 검출 할 수 있다. 본 발명의 마커 검출용 키트에는 간암진단 마커의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.The kit of the present invention can detect the marker by checking the mRNA expression level or protein expression level of SNX14, a liver cancer diagnostic marker. The marker detection kit of the present invention includes a primer, a probe, or an antibody that selectively recognizes a marker for measuring the expression level of a liver cancer diagnostic marker, as well as one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for analytical methods. May be included.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 SNX14 의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단 마커 검출용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. As a specific example, the kit for measuring the mRNA expression level of SNX14 in the present invention may be a kit containing the necessary elements necessary to perform RT-PCR. RT-PCR kits, in addition to each primer pair specific for the marker gene, RT-PCR kits can be used in test tubes or other appropriate containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerases and reverse transcriptases, DNase, RNase inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like. In addition, the kit of the present invention may be a kit for detecting a diagnostic marker including an essential element necessary to perform a DNA chip. The DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached with a probe, and the substrate may include a cDNA corresponding to a quantitative control gene or a fragment thereof.
또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 SNX14 의 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스 틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용 될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다. As another specific example, the kit for measuring the protein expression level of SNX14 in the present invention comprises a substrate, a suitable buffer, a secondary antibody labeled with a chromophore or a fluorescent substance, and a chromogenic substrate for immunological detection of the antibody. It may include. The substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96-well plate synthesized with a polyvinyl resin, a 96-well plate synthesized with a polystyrene resin, a slide glass made of glass, and the like, and the chromase is peroxidase, alkaline. Phosphatases (alkaline phosphatase) can be used, the fluorescent material can be used FITC, RITC, etc., the color substrate is ABTS (2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline-6- Sulfonic acid)) or OPD (o-phenylenediamine), TMB (tetramethyl benzidine) and the like can be used.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 마커를 포함하는, 간암을 진단하기 위한 마이크로어레이에 관한 것이다. 본 발명의 마이크로어레이는 본 발명의 마커를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. As another aspect, the invention relates to a microarray for diagnosing liver cancer, comprising a marker according to the invention. The microarray of the present invention can be easily prepared by a manufacturing method commonly used in the art using the marker of the present invention.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 간암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 SNX14 의 발현수준을 정상 조직의 발현 수준과 비교하여 간암 마커 SNX14 를 검출하는 방법에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a method for detecting liver cancer marker SNX14 by comparing the expression level of SNX14 from a patient's sample with the expression level of normal tissue to provide information necessary for diagnosing liver cancer.
보다 구체적으로는, 유전자의 발현 수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다. More specifically, the expression level of the gene can be detected at the mRNA level or the protein level, and the separation of the mRNA or protein from the biological sample can be performed using known processes.
본 발명에서 용어 “환자의 시료”란 간암 마커 유전자인 SNX14 의 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. As used herein, the term "patient sample" includes, but is not limited to, samples such as tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine, which differ in the expression level of the liver cancer marker gene SNX14. .
상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 유전자 발현 수준을 간암 의심환자에서의 유전자 발현 수준과 비교함으로써 간암 의심 환자의 실제 암 환자 여부를 진단할 수 있다. 즉, 간암으로 추정되는 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 정상 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현 수준이 정상 세포의 것보다 간암으로 추정되는 세포 유래에서 더 많이 발현되면 간암으로 추정되는 세포를 간암으로 예측할 수 있는 것이다. Through the detection methods, it is possible to diagnose whether the cancer patient is a real cancer patient by comparing the gene expression level in the normal control group with the gene expression level in the suspected liver cancer patient. That is, after measuring the expression level of the marker of the present invention from the cells suspected of liver cancer, and comparing the two by measuring the expression level of the marker of the present invention from normal cells, the expression level of the marker of the present invention is that of normal cells. If more expression is derived from a cell suspected of liver cancer, a cell suspected of liver cancer can be predicted as liver cancer.
mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 간암 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 간암 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증감여부를 판단하여 간암 의심 환자의 실제 간암 발병 여부를 진단할 수 있다. Analytical methods for measuring mRNA levels include, but are not limited to, reverse transcriptase polymerase reaction, competitive reverse transcriptase polymerase reaction, real time reverse transcriptase polymerase reaction, RNase protection assay, northern blotting, and DNA chip. Through the above detection methods, it is possible to compare the mRNA expression level in the normal control group and the mRNA expression level in the suspected liver cancer patient, and to determine whether the liver cancer marker gene is significantly increased or decreased in the expression level of the liver cancer suspected patient. Can be diagnosed.
mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 간암 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다. mRNA expression level measurement is preferably using a reverse transcriptase polymerase reaction method or a DNA chip using a primer specific for the gene used as a liver cancer marker.
상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 간암 진단 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 간암 발생 여부를 간편하게 진단 할 수 있다. The reverse transcriptase polymerase reaction is electrophoresis after the reaction to confirm the band pattern and the thickness of the band by checking the mRNA expression and degree of the gene used as a diagnostic marker for liver cancer, and compared with the control group, it is easy to determine the occurrence of liver cancer I can diagnose it.
한편, DNA 칩은 상기 간암 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 간암의 발병 여부를 판독할 수 있다. On the other hand, the DNA chip is a DNA chip in which the nucleic acid corresponding to the liver cancer marker gene or a fragment thereof is attached to a glass-like substrate at a high density, and isolates the mRNA from the sample, cDNA labeled at the end or the inside of the fluorescent material Probes can be prepared, hybridized to DNA chips and read for the development of liver cancer.
단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 간암 의심환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 간암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 간암 의심 환자의 실제 간암 발병 여부를 진단할 수 있다. Analytical methods for measuring protein levels include Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, Protein chips and the like, but is not limited thereto. Through the above analysis methods, the amount of antigen-antibody complex formation in the normal control group and the amount of antigen-antibody complex formation in suspected liver cancer patients can be compared, and whether the significant expression level of liver cancer marker gene to protein is increased. By judging, it is possible to diagnose whether liver cancer suspected patient actually develops liver cancer.
본 발명에서 용어 “항원-항체 복합체”란 간암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. As used herein, the term “antigen-antibody complex” means a combination of a liver cancer marker protein and an antibody specific thereto, and the amount of the antigen-antibody complex formed can be quantitatively measured through the size of a signal of a detection label. Do.
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체 에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 간암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 간암 발병 여부를 확인할 수 있다. Protein expression level measurement is preferably by using an ELISA method. ELISA is a direct ELISA using a labeled antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, an indirect ELISA using a labeled antibody that recognizes a capture antibody in a complex of antibodies that recognize an antigen attached to a solid support, attached to a solid support Direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes the antigen in the antibody-antigen complex, a labeled antibody that recognizes the antibody after reacting with another antibody that recognizes the antigen in the complex of the antigen with the antibody attached to the solid support Various ELISA methods include indirect sandwich ELISA using secondary antibodies. More preferably, the antibody is enzymatically developed by attaching the antibody to the solid support, reacting the sample, and then attaching a labeled antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex, or to an antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex. It is detected by the sandwich ELISA method which attaches a labeled secondary antibody and enzymatically develops. By confirming the degree of complex formation between the liver cancer marker protein and the antibody, it is possible to determine whether the liver cancer.
또한, 바람직하게는, 상기 간암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 간암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 간암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다. Also preferably, Western blot using at least one antibody against the liver cancer marker. The whole protein is isolated from the sample, electrophoresed to separate the protein according to size, and then transferred to the nitrocellulose membrane to react with the antibody. The amount of the generated antigen-antibody complex can be confirmed by using a labeled antibody to confirm the amount of the protein produced by the expression of the gene, thereby confirming the occurrence of liver cancer. The detection method consists of a method of examining the expression level of the marker gene in the control group and the expression level of the marker gene in cells with liver cancer. mRNA or protein levels can be expressed as absolute (eg μg / ml) or relative (eg relative intensity of signals) differences of the marker proteins described above.
또한, 바람직하게는, 상기 간암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 정상 대장 상피 조직 및 간암으로 의심되는 조직 을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 μm 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다. Also preferably, immunohistostaining is performed using at least one antibody against the liver cancer marker. After collecting and fixing normal colon epithelial tissue and tissue suspected of liver cancer, paraffin embedding blocks are prepared by methods well known in the art. These are cut into slices of several μm thickness, adhered to glass slides, and reacted with a selected one of the above antibodies by a known method. The unreacted antibody is then washed and labeled with one of the above-mentioned detection labels to read whether or not the antibody is labeled on a microscope.
또한, 바람직하게는, 상기 간암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 간암 발병 여부를 확인할 수 있다.Also, preferably, at least one antibody against the liver cancer marker is arranged at a predetermined position on the substrate to use a protein chip immobilized at a high density. In the method of analyzing a sample using a protein chip, the protein is separated from the sample, and the separated protein is hybridized with the protein chip to form an antigen-antibody complex, which is read to confirm the presence or expression level of the protein, You can check whether you have liver cancer.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 간암 절제 수술의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 간암 절제 수술을 받은 환자의 시료로부터 SNX14 의 발현 수준을 정상 세포의 발현 수준과 비교하여 간암 마커 SNX14 를 검출하는 방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention provides a method for detecting liver cancer marker SNX14 by comparing the expression level of SNX14 with the expression level of normal cells from a sample of a patient undergoing liver cancer resection to provide information necessary for predicting the prognosis of liver cancer resection. It is about a method.
상기 검출 방법을 통하여, 예측 유전자의 발현 패턴을 분석함으로써 신규 간암절제 수술을 받은 환자의 예후를 미리 예측할 수 있으며, 이런 예측을 바탕으로 환자의 예후 치료에 활용할 수 있을 것이다.Through the detection method, it is possible to predict the prognosis of the patient who has undergone a new liver cancer resection surgery by analyzing the expression pattern of the predictive gene, and based on this prediction, it can be used for the prognosis treatment of the patient.
본 발명자들은 정상 간 조직에 비해 간암 조직에서 발현이 눈에 뛰게 증가하는 유전자들을 확인, 선별하여 진단 마커로서의 활용가능성을 평가하였다. 따라서, 본 발명에 따른 간암 진단 마커인 SNX14 를 사용하면 간암의 유무를 정확하고 손쉽게 측정할 수 있으며, 나아가 간암의 종양 형성의 연구에 활용될 수 있다. 또한 간암의 조기 진단과 수술 및 치료시기 결정에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 판단된다. The present inventors identified and selected genes whose expression is remarkably increased in liver cancer tissues compared to normal liver tissues, and evaluated their applicability as diagnostic markers. Therefore, using the liver cancer diagnostic marker SNX14 according to the present invention can accurately and easily measure the presence or absence of liver cancer, it can be further utilized in the study of tumor formation of liver cancer. It is also expected to contribute to the early diagnosis of liver cancer and the decision of timing of surgery and treatment.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These embodiments are only for illustrating the present invention, and thus the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.
실시예Example 1: One: 시험군Test group 및 시험조직 샘플의 선택 And selection of test tissue samples
시험용 표본은 원자력병원에서 간암 치료로 수술을 받은 98명의 환자와 서울대병원에서 간암 치료로 수술을 받은 58명의 환자로부터 수득하였다. 연구 목적으로 수술 표본과 임상병리학적 데이터를 사용하겠다는 동의를 환자로부터 받았다. 모든 조직은 외과적으로 적출되고 즉시 액체 질소에서 재빨리 냉각한 후 영하 80°C 에서 저장하였다. RNA는 시험 매뉴얼 (RNeasy MiniElute Cleanup Kit, Qiagen)에 따라 냉각된 조직으로부터 분리되었다. 총 RNA의 품질(quality)은 아가로즈 젤 전기영동 후 28S 와 18S rRNA사이의 밴드 비율로부터 판단하였다. Test specimens were obtained from 98 patients who underwent surgery for liver cancer at Nuclear Hospital and 58 patients who underwent surgery for liver cancer at Seoul National University Hospital. Patients were informed to use surgical specimens and clinicopathological data for research purposes. All tissues were surgically extracted and immediately cooled in liquid nitrogen and stored at minus 80 ° C. RNA was isolated from cooled tissue according to the test manual (RNeasy MiniElute Cleanup Kit, Qiagen). The quality of total RNA was determined from the band ratio between 28S and 18S rRNA after agarose gel electrophoresis.
실시예Example 2: 2: cDNAcDNA 마이크로어레이Microarray 데이터 분석 및 유전자 선별 Data Analysis and Gene Screening
실험에 사용한 마이크로어레이는 인간 cDNA 클론 총 24,094개로 구성되어 있다. 마이크로어레이 실험 방법은 3DNA 어레이 검출 키트 (Genisphere Inc. PA, USA)를 사용하여 제조사가 제시하는 방법에 따라 수행하였다. 그 후 스캔어레이 스캐너 (PerkinElmer, Boston, MA, USA)를 사용하여 스캔하였다. 스캔한 이미지 파일로부터 IMAGENE 4.0 (Biodiescovery, Marina del Rey, CA, USA)를 이용하여 수치화된 데이터를 얻었고, 형광 강도(intensity)와 스폿 위치를 고려하여 표준화 (normalization)하였다 (spatially dependent method). 표준화된 마이크로어레이 데이터에서 정규화 과정을 거쳐(normalization process) 생존상관률(p)이 0.05 이하인 유전자만 선별한 후 정상조직에서 각 유전자 발현의 하위 30% 강도(intensity) 평균값이 1000 이하이면서 1.5 fold 이상 종양에서 과발현된 샘플수가 40개 이상인 유전자만 선정하였다. 이어서, 종양 조직(146개)에서 각 유전자 발현의 상위 30% intensity 평균값에서 정상조직에서 각 유전자 발현의 상위 30% intensity 평균값을 뺀 후, 한 유전자에서 발현 정도의 차이를 나타내는 IQR이 0.43 이상인 유전자 18개를 최종 선정하였다. 그리고, 환자의 혈액에서 간암의 유무를 손쉽게 측정하는 등 보다 효과적인 진단 방법을 위하여 세포 밖으로 배출되는 되는 단백질과 유사성이 있다고 보고 되어진 간암 특이단백질에 해당하는 유전자를 선별하였다.The microarrays used in the experiment consisted of a total of 24,094 human cDNA clones. Microarray experiments were performed using the 3DNA array detection kit (Genisphere Inc. PA, USA) according to the method suggested by the manufacturer. It was then scanned using a scan array scanner (PerkinElmer, Boston, Mass., USA). Digitized data was obtained from the scanned image file using IMAGENE 4.0 (Biodiescovery, Marina del Rey, Calif., USA) and normalized in consideration of fluorescence intensity and spot location (spatially dependent method). In the normalized microarray data, only those genes with a survival correlation (p) of 0.05 or less were selected from the normalization process, and the average 30% intensity of each gene expression in normal tissues was 1000 or less and 1.5 fold or more. Only genes with over 40 samples overexpressed in the tumor were selected. Subsequently, after subtracting the average value of the top 30% intensity of each gene expression from normal tissue from the top 30% intensity average of each gene expression in tumor tissue (146), genes with an IQR of 0.43 or higher, representing a difference in expression level in one gene, 18 The dog was finally selected. In addition, genes corresponding to liver cancer specific proteins, which are reported to have similarities with proteins released out of cells, were selected for more effective diagnostic methods such as the easy measurement of liver cancer in the blood of patients.
실시예Example 3: 예측 유전자에 대한 3: for predictive genes RTRT -- PCRPCR 을 통한 발현 재확인 및 간암 예측Expression reconfirmation and liver cancer prediction
마이크로어레이 데이타에서 SNX14 은 146개의 종양조직 중에서 97개의 종양조직에서 정상조직에 비해 1.5fold 이상 발현이 증가되어 있었다. 이 유전자들의 발현을 재확인 하기 위해, 각각 30개의 종양조직과 인접한 비종양조직, 그리고 5명의 환자의 정상 간조직에서 RNA를 추출한 뒤, 역전사 반응을 통해 cDNA를 합성하였다. 이를 다음과 같은 조건의 RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction)을 통해 SNX14 유전자 발현을 재확인하였다 (도 3).In the microarray data, SNX14 increased more than 1.5fold in 97 tumor tissues compared to normal tissue in 146 tumor tissues. To reconfirm the expression of these genes, RNA was extracted from 30 tumor tissues, adjacent non-tumor tissues, and normal liver tissues of 5 patients, respectively, and cDNA was synthesized by reverse transcription. This was again confirmed SNX14 gene expression through RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) under the following conditions (Fig. 3).
annealingannealing
TmTm
사이클 (cycle (
cyclecycle
)수)Number
(서열번호 3)atactccccgaaaccttgct
(SEQ ID NO: 3)
56℃
56 ℃
27
27
(서열번호 4)cataatttttggggccaatg
(SEQ ID NO: 4)
그 결과, SNX14 은 비종양조직에 비해 15 개의 종양조직에서 발현이 증가 되었고, 정상 간조직에 비해 20 개의 종양조직에서 이 마커의 발현이 확연히 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 4). As a result, the expression of SNX14 was increased in 15 tumor tissues compared to non-tumor tissues, and it was confirmed that the expression of this marker was significantly increased in 20 tumor tissues compared to normal liver tissue (FIG. 4).
도 1은 간암 진단 유전자의 발현 프로파일을 측정하기 위한 mRNA의 역전사와 DNA 칩에서 혼성화 및 분석 과정을 나타낸 모식도이다. Figure 1 is a schematic diagram showing the hybridization and analysis of the reverse transcription of mRNA and DNA chip for measuring the expression profile of liver cancer diagnostic gene.
도 2은 선별된 간암 유전자인 SNX14 의 유전자 서열 및 단백질 서열을 나타낸 것이다. Figure 2 shows the gene sequence and protein sequence of the selected liver cancer gene SNX14.
도 3은 선별된 간암 진단 유전자인 SNX14 의 유전자의 발현을 측정할 수 있는 RT-PCR 용 프라이머 서열, RT-PCR 실험의 조건 및 conserved domain 을 나타낸 것이다. Figure 3 shows the primer sequence for RT-PCR, the condition of the RT-PCR experiment and the conserved domain, which can measure the expression of the gene of SNX14, the selected liver cancer diagnostic gene.
도 4은 선별된 간암 특이 유전자인 SNX14 의 발현을 30개의 종양조직에서 RT-PCR을 통해 재확인한 것이다. Figure 4 is reconfirmed the expression of selected liver cancer specific gene SNX14 via RT-PCR in 30 tumor tissues.
<110> Korea Institute of Radiological and Medical Sciences <120> SNX14, the molecular marker for diagnosing and curing hepatocellular carcinoma and a kit, including the marker <130> PA090021/KR <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2841 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(2841) <223> nucleotide sequence of SNX14 <400> 1 atggtgccct gggtgcggac gatggggcag aagctgaagc agcggctgcg actggacgtg 60 ggacgcgaga tctgccgcca gtacccgctg ttctgcttcc tgctgctctg tctcagcgcc 120 gcctccctgc ttcttaacag gtatattcat attttaatga tcttctggtc atttgttgct 180 ggagttgtca cattctactg ctcactagga cctgattctc tcttaccaaa tatattcttc 240 acaataaaat acaaacccaa gcagttagga cttcaggaat tatttcctca aggtcatagc 300 tgtgctgttt gtggtaaagt gaaatgtaaa cgacataggc cttctttgct acttgaaaac 360 taccagccat ggctagacct gaaaatttct tccaaggttg atgcatctct ctcagaggtt 420 cttgaattag tgttggaaaa ctttgtttat ccgtggtaca gggatgtgac agatgatgaa 480 tcctttgttg atgaactgag aataacatta cgtttttttg catctgtctt aataagaagg 540 attcacaagg tggatattcc atctattata accaagaaac tattaaaagc agcaatgaag 600 catatagaag tgatagttaa agccagacag aaagtaaaaa atacagagtt tttacagcaa 660 gctgctttag aagaatatgg tccagagctt catgttgctt tgagaagtcg aagagatgaa 720 ttgcactatt taaggaaact tactgaactg ctttttcctt atattttgcc tcctaaagca 780 acagactgca gatctctgac cttacttata agagagattc tgtctggctc tgtgttcctt 840 ccttctttgg atttcctagc tgatccagat actgtgaatc atttgcttat catcttcata 900 gatgacagtc cacctgaaaa agcaactgaa ccggcttctc ctttggttcc attcttgcag 960 aaatttgcag aacctagaaa taaaaagcca tctgtgctga agttagaatt gaagcaaatc 1020 agagagcaac aagatctttt atttcgtttt atgaactttc tgaaacaaga aggcgcagtg 1080 cacgtgttgc agttttgttt gactgtggag gaatttaatg atagaatttt acgaccagaa 1140 ttatcaaatg atgaaatgct gtctcttcat gaagaattgc agaagattta taaaacatac 1200 tgtttggatg aaagtattga caaaattaga tttgatccct tcattgtaga agagattcaa 1260 agaattgctg aaggcccata catagatgtt gtgaaacttc aaactatgag atgtcttttt 1320 gaagcatatg aacatgttct ttcccttttg gagaatgtat ttactcctat gttctgccat 1380 agtgatgagt atttcagaca acttttaaga ggtgcagaat caccaacacg caattcaaaa 1440 ttgaacagag gtagcctaag tttggatgat tttcggaaca cacagaaaag gggagaatca 1500 tttggaatca gcagaatagg tagcaaaatt aaaggagtat tcaaaagtac cacaatggag 1560 ggagctatgt tgcctaatta tggtgtagct gaaggtgaag atgattttat tgaagaaggt 1620 attgttgtaa tggaagatga ttctccagtg gaggctgtga gcacacctaa tactccccga 1680 aaccttgctg catggaaaat tagcattcca tatgtagact tttttgagga tccctcctct 1740 gaaaggaagg agaaaaaaga aagaattcct gtgttttgta ttgatgttga aagaaatgat 1800 agaagagcag ttggacacga gcctgaacat tggtctgtct atagaagata tcttgaattc 1860 tatgtacttg aatcaaaact aacagaattt catggtgcat ttcctgatgc ccagcttcct 1920 tctaagagga tcattggccc caaaaattat gaattcttaa agtcaaagag ggaagagttc 1980 caagaatatc tacagaaact tctgcagcat ccagaactga gtaatagtca acttctggca 2040 gactttcttt cccctaatgg tggggaaaca caatttcttg ataagatact accagatgta 2100 aatcttggga aaattataaa atctgttcct ggaaaactaa tgaaagagaa aggtcagcat 2160 ttggaacctt ttatcatgaa tttcattaat tcttgtgagt ctccaaagcc taaaccaagt 2220 agaccagaac tgaccattct cagccctact 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Leu Ser Ala Ala Ser Leu Leu Leu Asn Arg Tyr 35 40 45 Ile His Ile Leu Met Ile Phe Trp Ser Phe Val Ala Gly Val Val Thr 50 55 60 Phe Tyr Cys Ser Leu Gly Pro Asp Ser Leu Leu Pro Asn Ile Phe Phe 65 70 75 80 Thr Ile Lys Tyr Lys Pro Lys Gln Leu Gly Leu Gln Glu Leu Phe Pro 85 90 95 Gln Gly His Ser Cys Ala Val Cys Gly Lys Val Lys Cys Lys Arg His 100 105 110 Arg Pro Ser Leu Leu Leu Glu Asn Tyr Gln Pro Trp Leu Asp Leu Lys 115 120 125 Ile Ser Ser Lys Val Asp Ala Ser Leu Ser Glu Val Leu Glu Leu Val 130 135 140 Leu Glu Asn Phe Val Tyr Pro Trp Tyr Arg Asp Val Thr Asp Asp Glu 145 150 155 160 Ser Phe Val Asp Glu Leu Arg Ile Thr Leu Arg Phe Phe Ala Ser Val 165 170 175 Leu Ile Arg Arg Ile His Lys Val Asp Ile Pro Ser Ile Ile Thr Lys 180 185 190 Lys Leu Leu Lys Ala Ala Met Lys His Ile Glu Val Ile Val Lys Ala 195 200 205 Arg Gln Lys Val Lys Asn Thr Glu Phe Leu Gln Gln Ala Ala Leu Glu 210 215 220 Glu Tyr Gly Pro Glu Leu His Val Ala Leu Arg Ser Arg Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu His Tyr Leu Arg Lys Leu Thr Glu Leu Leu Phe Pro Tyr Ile Leu 245 250 255 Pro Pro Lys Ala Thr Asp Cys Arg Ser Leu Thr Leu Leu Ile Arg Glu 260 265 270 Ile Leu Ser Gly Ser Val Phe Leu Pro Ser Leu Asp Phe Leu Ala Asp 275 280 285 Pro Asp Thr Val Asn His Leu Leu Ile Ile Phe Ile Asp Asp Ser Pro 290 295 300 Pro Glu Lys Ala Thr Glu Pro Ala Ser Pro Leu Val Pro Phe Leu Gln 305 310 315 320 Lys Phe Ala Glu Pro Arg Asn Lys Lys Pro Ser Val Leu Lys Leu Glu 325 330 335 Leu Lys Gln Ile Arg Glu Gln Gln Asp Leu Leu Phe Arg Phe Met Asn 340 345 350 Phe Leu Lys Gln Glu Gly Ala Val His Val Leu Gln Phe Cys Leu Thr 355 360 365 Val Glu Glu Phe Asn Asp Arg Ile Leu Arg Pro Glu Leu Ser Asn Asp 370 375 380 Glu Met Leu Ser Leu His Glu Glu Leu Gln Lys Ile Tyr Lys Thr Tyr 385 390 395 400 Cys Leu Asp Glu Ser Ile Asp Lys Ile Arg Phe Asp Pro Phe Ile Val 405 410 415 Glu Glu Ile Gln Arg Ile Ala Glu Gly Pro Tyr Ile Asp Val Val Lys 420 425 430 Leu Gln Thr Met Arg Cys Leu Phe Glu Ala Tyr Glu His Val Leu Ser 435 440 445 Leu Leu Glu Asn Val Phe Thr Pro Met 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