KR20240042656A - 신규구조를 갖는 폴리펩타이드 접합체 약물 및 그 응용 - Google Patents

신규구조를 갖는 폴리펩타이드 접합체 약물 및 그 응용 Download PDF

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KR20240042656A
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후이닝 리
졘화 샤
?컹? 샤
즈간 쟝
하이잉 허
수후이 천
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메드샤인 디스커버리 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 신규 폴리펩타이드 접합체 약물 및 그 응용에 대해 공개하였는 바, 구체적으로 식(V) 으로 표기된 화합물을 공개하였다.

Description

신규구조를 갖는 폴리펩타이드 접합체 약물 및 그 응용
본 발명은 하기와 같은 우선권을 주장한다:
CN2021109452856, 출원일: 2021년 8월 17일;
CN2021109767108, 출원일: 2021년 8월 24일;
CN2021112144653, 출원일: 2021년 10월 19일;
CN2021112236320, 출원일: 2021년 10월 20일;
CN2021114658736, 출원일: 2021년 12월 3일;
CN2022100034604, 출원일: 2022년 1월 4일.
본 발명은 신규구조를 갖는 폴리펩타이드 접합체 약물 및 그 응용에 관한 것이다. 구체적으로 식(V)으로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그 염에 관한 것이다.
2020년 전 세계 암 신규 발병예는 약 1930만 예이고, 사망병례는 1000만 예 가까이 달한다. 대다수 조기 암환자에 대한 표준화된 치료 수단이 있다해도, 질환의 진전 및 기존 치료방식에 대해 약제내성 또는 민감하지 않은 등 원인으로 인해, 일부 암환자 특히 말기암 환자의 치료수단은 제한적이고 치료효과 또한 이상적이지 못하다. 따라서, 신규 표적, 신규 매커니즘과 신규 구조를 갖는 종양치료 약물을 연구하는 것은 시종일관 종양치료 분야에서 시급히 해결해야 할 과제이다.
EphA2는 근년래 주목받고 있는 신흥 종양관련 표적으로서, 악성변환 제어와 종양진전 조절과정에 사용된다고 보도된 바가 있다. 대다수 Eph키나아제와 달리, EphA2가 성인 중에서의 분포는 빠르게 증식하는 상피세포에 주로 국한되어 있다. 연구에 따르면, EphA2는 예를 들어 전립선, 폐, 식도, 직장, 자궁경부, 난소와 피부암과 같은 다양한 암에서 과도하게 발현된다. EphA2가 종양 중에서의 과발현은 암환자 예후가 좋지 않고, 전이될 위험이 높으며, 생존기가 짧은 등 임상증상과 직접 연관된다. EphA2와 그 리간드 Ephrin A1로 구성된 신호 채널은 ERK, AKT등 다양한 다운스트림 키나아제를 억제하도록 유도하여, 악성세포의 전이, 활력과 증식에 대한 조절작용을 일으킨다. 따라서 EphA2는 종양조직 약물전달 표적으로 될 수도 있고, 종양치료 표적으로서 작용을 발휘할 수도 있다.
본 발명은 식(V)으로 표시된 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그 염을 제공하였는 바,
Figure pct00001
여기서,
Figure pct00002
은
Figure pct00003
으로부터 선택되고;
Xi, Xii와 Xiii는 각각 독립적으로 Cys, hCys, βCys, Pen, Dap와 N-methyl-Dap으로부터 선택되고, Xi, Xii와 Xiii는 서로 다를 때 Cys이고;
또는,
Figure pct00004
은
Figure pct00005
으로부터 선택되고;
Xi, Xii와 Xiii는 각각 독립적으로 Cys, hCys, βCys, Pen, Dap와 N-methyl-Dap으로부터 선택된다.
본 발명은 식(I)으로 표시된 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그 염을 제공하였는 바,
Figure pct00006
여기서,
Xi, Xii와 Xiii는 각각 독립적으로 Cys, hCys, βCys, Pen, Dap와 N-methyl-Dap으로부터 선택된다.
본 발명은 식(I')으로 표시된 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그 염을 더 제공하였는 바,
Figure pct00007
여기서,
Xi, Xii와 Xiii는 각각 독립적으로 Cys, hCys, βCys, Pen, Dap와 N-methyl-Dap으로부터 선택되고,
조건은 Xi, Xii와 Xiii가 서로 다를 때 Cys이다.
본 발명의 또 일부 변량은 상기 각 변량이 임의로 조합된 것이다.
본 발명은 하기 식으로 표시된 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그 염을 더 제공하였다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
본 발명은 상기 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그 염이 EphA2 과발현된 고형암을 치료하는 약물을 제조함에 있어서의 응용을 더 제공하였다.
본 발명은 피험자에게 치료유효량의 상기 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그 염을 제공하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 피험자 몸에서 EphA2과발현된 고형암을 치료하는 방법을 더 제공하였다.
본 발명은 하기 제조방법을 참조한다:
Figure pct00013
본 발명은 하기의 측정 방법을 더 제공하였다:
측정 방법1 본 발명 화합물과 EphA2단백질의 결합 능력 측정
1.실험목적
SPR법으로 측정대상물과 표적 단백질 EphA2의 친화력을 검출한다.
2.재료와 기기
Figure pct00014
Biacore 8K(GE Healthcare)
Figure pct00015
96-well Plate(Cat# 650101, greiner bio-one)
Figure pct00016
CM5칩(Cat # BR-1005-30, GE Healthcare)
Figure pct00017
Amine Coupling Kit(Cat # BR-1000-50, GE Healthcare)
EDC
NHS
1 M 에탄올아민
Figure pct00018
10 mM 아세트산 나트륨 pH4.5(Cat # BR-1003-50, GE Healthcare)
Figure pct00019
DMSO(Cat # D4540, Sigma)
Figure pct00020
P20(Cat # BR-1000-54, GE Healthcare)
Figure pct00021
PBS(Cat # BR-1006-72, GE Healthcare)
Figure pct00022
EphA2(Cat#　13926-H08HD,　Sino Biological)
3.프로토콜
본 실험은 아민 커플링법을 사용하되, 즉 Biacore 8K를 이용하여 표적 단백질 EphA2를 CM5칩 상에 직접 고정시킨 후, 측정대상물을 분석물로 하여, 완충액(10mM PBS, pH7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 5% DMSO, 0.05% P20)으로 측정대상물을 수요되는 농도 구배로 희석하여, 멀티사이클 동력학 검출을 진행하되, 각 사이클마다 180 초 동안 샘플링하고, 180 초 동안 해리한 후, 다음 사이클을 진행하여, 표적 단백질 EphA2와 측정대상물의 친화력 동력학 분석 데이터를 획득한다. 최종적인 데이터는 Biacore Insight Evaluation Software(V 2.0.15.12933)에 의해 1: 1 모형에 따라 Kinetics피팅(fitting) 분석을 진행한다.
4.실험방법 및 절차
1) 완충액 조제: 10mM PBS, pH7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 5% DMSO, 0.05% P20.
2) CM5칩 활성화: 400 mM EDC와 100 mM NHS를 이용하여 10 μL/min의 유속으로 420초 동안 활성화한다.
3) 표적 단백질 커플링: 10 mM 아세트산 나트륨(pH 4.5)으로 표적 단백질을 10 μg/mL으로 희석하고, 10 μL/min의 유속으로 284 s 동안 커플링한다. 실험에서는 칩 상의 1#, 2#와 3# 채널을 사용하는데, 커플링 결과는 각각 1639.9RU, 1747.8RU와 1702.2RU이다.
4) CM5칩 블로킹: 1 M에탄올아민을 이용하여 10 μL/min의 유속으로 420초 동안 블로킹한다.
5) 분석물 농도: 완충액을 사용하여 측정대상물을 희석한다. 측정대상물은 100 nM으로부터 2배의 구배로 0.78 nM까지 희석한다.
6) 샘플링 분석: 측정대상물 작동액의 각 농도는 하나의 사이클을 이루는데, 30 μL/min의 유속으로 180초 동안 결합되었다가, 180초 동안 해리된다. 마지막 사이클은 5% DMSO용매 교정 사이클이다.
7) 모든 결과는 1:1 모형에 따라 kinetics피팅(fitting) 분석을 진행한다.
기술효과
본 발명 화합물과 EphA2는 아주 강한 결합작용을 가져, 종양세포계NCI-H1975와 SK-OV-3에서 체외 배양된 세포에 대한 뚜렷한 증식억제작용이 있다. 인간 난소암 SK-OV-3세포피하 이종이식 종양모델과 인간 전립선암PC-3피하 이종이식 종양모델 상에서 뚜렷한 종양생장 억제작용이 있고, 모두 뚜렷한 투여량 상관성을 나타낸다. 본 발명 화합물은 양호한 약물동태학 성질을 나타내고, 혈장 중 제거가 빠르며, 축적이 적고, MMAE방출량이 적으며, 체외 간 마이크로솜, 혈장과 전혈 안정성이 좋아, 양호한 약물 기량성(druggability)을 구비한다.
도 1: 본 발명 화합물이 인간 전립선암 세포피하 이종이식 종양 모델 상에서의 종양 성장 곡선이고;
도 2: 본 발명 화합물이 인간 전립선암 세포피하 이종이식 종양 모델 상에서의 동물체중 변화곡선이고;
도 3: 본 발명 화합물이 인간 난소암 SK-OV-3세포피하 이종이식 종양BALB/c누드 마우스 모델 상에서의 종양 성장 곡선이고;
도 4: 본 발명 화합물이 인간 난소암 SK-OV-3세포피하 이종이식 종양BALB/c누드 마우스 모델 상에서의 동물체중 변화율이다.
정의와 설명
별다른 설명이 없는 한, 본문에 사용되는 하기 용어와 단어는 하기 뜻을 구비한다. 하나의 특정된 용어 또는 단어는 특별한 정의가 없을 경우 불확정적이거나 명확하지 않은 것으로 여겨서는 안되고, 일반적인 뜻으로 이해해야 한다. 본문에 상품명이 나타날 때, 대응되는 상품 또는 그 활성성분을 의미한다.
여기서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"은, 그 화합물, 재료, 조성물 및/또는 제제에 있어서, 이들이 신뢰성 있는 의학판단적인 범위 내에서, 인간과 동물의 조직과 접촉되어 사용되는 것에 적용되고, 너무 많은 독성, 자극성, 과민성 반응 또는 기타 문제 또는 합병증이 없어, 합리적인 이익/위험과 맞물린다.
용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 본 발명 화합물의 염을 의미하는 바, 본 발명에서 발견된, 특정 치환기를 구비하는 화합물이 상대적으로 무독한 산 또는 염기와 제조된 것이다. 본 발명의 화합물에 상대적으로 산성인 관능기를 함유할 때, 순수한 용액 또는 적합한 불활성 용매에 충분한 양의 염기가 이러한 화합물과 접촉되는 방식으로 염기 부가염을 얻을 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염기 부가염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기아민 또는 마그네슘염 또는 유사한 염을 포함한다. 본 발명의 화합물에 상대적으로 염기성인 관능기를 함유할 때, 순수한 용액 또는 적합한 불활성 용매에 충분한 양의 산이 이러한 화합물과 접촉되는 방식으로 산부가염을 얻을 수 있다. 본 발명의 일부 특정된 화합물은 염기성과 산성의 관능기를 함유함으로써, 임의의 염기 또는 산부가염으로 전환가능하다.
본 발명의 약학적으로 허용가능한 염은 산성기 또는 염기성 기(basic group)를 함유하는 모체 화합물로 통상적인 화학방법에 의해 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염의 제조방법은: 물 또는 유기용매 또는 양자의 혼합물에서, 유리된 산 또는 염기 형식의 이러한 화합물이 화학계량적인 적당한 염 또는 산과 반응하여 제조된 것이다.
"아미노산"은 천연적으로 존재하는 것과 합성된 아미노산, 및 천연적으로 존재하는 아미노산과 유사한 작용을 일으키는 아미노산 유사물과 아미노산 시뮬런트를 의미한다. 천연적으로 존재하는 아미노산은 유전자 코드로 코딩하는 아미노산들, 및 향후 수식하는 아미노산들, 예를 들어, 하이드록시프롤린, γ-카르복시글루탐산과 O-포스포세린이다. 아미노산 유사물은 천연적으로 존재하는 아미노산과 같은 기본적인 화학구조를 구비하는 화합물을 의미하는 바, 예를 들어 호모세린, 노르루신, 메티오닌설폭시드, 메티오닌 메틸설포늄이다. 이러한 유사물은 수식된 R 관능기(예를 들어, 노르루신) 또는 수식된 펩타이드 골격을 구비할 수 있지만, 천연적으로 존재하는 아미노산과 같은 기본적인 화학구조를 유지한다. 아미노산 시뮬런트는 그 구조가 일반적인 아미노산 화학구조와 다르지만, 천연적으로 존재하는 아미노산과 비슷한 작용을 일으키는 화학 화합물을 의미한다.
본 발명 화합물의 치료 투여량은, 치료의 구체적인 용도, 화합물 투여방식, 환자의 건강상태 및 의사 처방에 의한 판단에 따라 결정된다. 본 발명 화합물은 약물 조성물 중의 비례 또는 농도에 의해 고정된 것이 아니라, 투여량, 화학특성(예를 들어 소수성)과 투여경로를 포함하는 다양한 요소에 의해 결정된다.
용어 "치료"는 본 발명에 따른 화합물 또는 제제를 투여하여 질환 또는 상기 질환과 관련된 하나 또는 다수의 증상을 개선 또는 제거하는 것을 의미하는 바,
(i) 질환 또는 질환 상태를 억제하되, 즉 질병 발전을 저지하고:
(ii) 질환 또는 질환상태를 완화하되, 즉 이 질환 또는 질환상태를 감퇴시키는 것을 포함한다.
용어 "치료유효량"은 (i) 특정 질환, 병세 또는 장애를 치료하고, (ii) 특정 질환, 병세 또는 장애를 경감, 개선 또는 제거하거나, 또는 (iii) 본문에 따른 특정 질환, 병세 또는 장애에 따른 하나 또는 여러가지 증상 발작을 예방 또는 지연시키는 본 발명 화합물의 사용량을 의미한다. "치료유효량"을 구성하는 본 발명 화합물의 양은 이 화합물, 질환 상태 및 그 엄중성, 투여방식 및 치료해야 할 포유동물의 연령에 의해 변화되는데, 본 기술분야의 당업자가 자신의 지식 및 본 공개내용에 의해 관례적으로 결정할 수 있다.
본 발명에서 별다른 요구가 없는 한, 전반 명세서와 그 뒤의 특허청구범위에서, 단어 "함유하다(comprise)" 및 그 영어 변형체 예를 들어 "포함한(comprises)"과 "포함하는(comprising)"은 개방식, 내포식의 뜻, 즉 "포함하나 이에 의해 한정되지 않는다"로 해석되어야 한다.
전반 본 명세서에서 언급된 "일 실시형태" 또는 "실시형태" 또는 "또 다른 실시형태 중" 또는 "일부 실시형태 중"은 적어도 하나의 실시형태 중 이 실시형태에 따른 관련된 구체적인 참고요소, 구조 또는 특징을 포함하는 것을 의미한다. 따라서, 전반 명세서 중 상이한 위치에서 나타난 단어 "일 실시형태 중" 또는 "실시형태 중" 또는 "또 다른 실시형태 중" 또는 "일부 실시형태 중"은 동일한 실시형태를 의미할 필요가 없다. 이밖에, 구체적인 요소, 구조 또는 특징은 임의의 적당한 방식으로 하나 또는 다수의 실시형태에 결합될 수 있다.
별다른 설명이 없는 한, 용어 "이성질체"는 기하 이성질체, 시스-트랜스 이성질체, 입체 이성질체, 거울상 이성질체, 광학 이성질체, 비거울상 이성질체와 호변 이성질체를 포함한다.
본 발명의 화합물은 특정된 기하 또는 입체 이성질체 형식으로 존재할 수 있다. 본 발명은 모든 이러한 화합물이 시스와 트랜스 이성질체, (-)- 와(+)-거울상 이성질체, (R)- 와 (S)-거울상 이성질체, 비거울상 이성질체, (D)-이성질체, (L)-이성질체, 및 그 라세미 혼합물과 기타 혼합물, 예를 들어 거울상 이성질체 또는 비거울상 이성질체가 풍부한 혼합물을 포함한다고 가정하면, 모든 이러한 혼합물은 모두 본 발명의 범위 내에 속할 것이다. 알킬기 등 치환기 중에는 또 다른 비대칭 탄소원자가 존재할 수 있다. 모든 이러한 이성질체 및 이들의 혼합물은, 모두 본 발명의 범위 내에 포함된다.
별다른 설명이 없는 한, 용어 "거울상 이성질체" 또는 "광학 이성질체"는 서로 거울상 관계를 이루는 입체 이성질체를 의미한다.
별다른 설명이 없는 한, 용어 "시스 이성질체" 또는 "기하 이성질체"는 이중결합 또는 사이클 탄소원자 단일결합이 자유롭게 회전되지 못해서 생기는 것이다.
별다른 설명이 없는 한, 용어 "비거울상 이성질체"는 분자가 두개 또는 다수의 비대칭 중심을구비하고, 분자간이 비거울상 관계를 이루는 입체 이성질체를 의미한다.
별다른 설명이 없는 한, "(+)"는 우선성을 나타내고, "(-)"는 좌선성을 나타내며, "(±)"는 라세미화를 나타낸다.
별다른 설명이 없는 한, 쐐기형 실선결합(
Figure pct00023
)과 쐐기형 점선결합(
Figure pct00024
)으로 하나의 입체 중심의 절대배열을 나타내고, 직선형 실선결합()과 직선형 점선결합()으로 입체 중심의 상대배열을 나타내고, 물결선()으로 쐐기형 실선결합() 또는 쐐기형 점선결합()을 나타내거나, 또는 물결선()으로 직선형 실선결합() 또는 직선형 점선결합()을 나타낸다.
별다른 설명이 없는 한, 용어 "이성질체를 다량 함유하는", "이성질체가 풍부한", "거울상 이성질체를 다량 함유하는" 또는 "거울상 이성질체가 풍부한"은 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함량이 100%보다 작고, 또한, 이 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함량이 60%보다 크거나 같고, 또는 70%보다 크거나 같고, 또는 80%보다 크거나 같고, 또는 90%보다 크거나 같고, 또는 95%보다 크거나 같고, 또는 96%보다 크거나 같고, 또는 97%보다 크거나 같고, 또는 98%보다 크거나 같고, 또는 99%보다 크거나 같고, 또는 99.5%보다 크거나 같고, 또는 99.6%보다 크거나 같고, 또는 99.7%보다 크거나 같고, 또는 99.8%보다 크거나 같고, 또는 99.9%보다 크거나 같음을 의미한다.
별다른 설명이 없는 한, 용어 "이성질체 과량" 또는 "거울상 이성질체 과량"은 두가지 이성질체 또는 두가지 거울상 이성질체 상대적 백분율 사이의 차이값을 의미한다. 예를 들어, 그중 하나의 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함량이 90%이고, 또 다른 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함량이 10%일 경우, 이성질체 또는 거울상 이성질체 과량(ee값)은 80%이다.
키랄합성 또는 키랄시약 또는 기타 통상적인 기술에 의해 광학활성의 (R)-와 (S)-이성질체 및 D와 L이성질체를 제조할 수 있다. 본 발명의 어느 하나의 화합물의 거울상 이성질체를 얻으려면, 비대칭합성 또는 키랄 보조제를 구비하는 유도체화 작용에 의해 제조할 수 있되, 여기서 얻어진 비거울상 이성질체 혼합물을 분리하고, 보조기(prosthetic group)가 갈라지면서 필요한 순수 거울상 이성질체가 제공되도록 한다. 또는, 분자에 염기성 관능기(예를 들어 아미노기) 또는 산성 관능기(예를 들어 카르복실기)가 함유될 때, 적당한 광학활성의 산 또는 염기로 비거울상 이성질체의 염을 형성한 후, 본 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 비거울상 이성질체를 분해한 후, 순수한 거울상 이성질체를 회수하여 얻는다. 이밖에, 거울상 이성질체와 비거울상 이성질체의 분리는 통상적으로 크로마토그래피에 의해 완성되고, 상기 크로마토그래피는 키랄 고정상을 사용하고, 화학 유도체화 방법과 임의적으로 결합된다(예를 들어 아민으로 카바메이트를 형성함) .
본 발명의 화합물은 하나 또는 다수의 이 화합물을 구성하는 원자 상에 비천연적인 비례의 원자 동위원소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방사성 동위원소로 화합물을 표기할 수 있되, 예를 들어 트리튬(3H), 요오드-125(125 I) 또는 C-14(14C)이다. 또 예를 들어, 중수소로 수소를 치환하여 중수소화 약물을 형성할 수 있되, 트리튬과 탄소로 구성된 결합은 일반 수소와 탄소로 구성된 결합보다 더 견고하고, 비중수소화 약물에 비해, 중수소화 약물은 독성 부작용을 줄이고, 약물 안정성을 증가하며, 치료효과를 증가하고, 약물 생물학적 반감기를 연장하는 등 우세가 있다. 본 발명의 화합물의 모든 동위원소 구성의 변환은, 방사성 여부를 막론하고, 모두 본 발명의 범위 내에 포함된다.
열거된 연결기가 그 연결방향을 가리키지 않을 경우, 그 연결방향은 임의적인 것인 바, 예를 들어,
Figure pct00033
중 연결기(L)는 -M-W-이고, 이때 -M-W-는 왼쪽으로부터 오른쪽으로 읽는 순서와 같은 방향으로 고리A와 고리B를 연결하여
Figure pct00034
를 구성할 수 있고, 왼쪽으로부터 오른쪽으로 읽는 순서와 반대되는 방향으로 고리A와 고리B를 연결하여
Figure pct00035
를 구성할 수도 있다. 상기 연결기, 치환기 및/또는 그 변이체의 조합은 이러한 조합이 안정적인 화합물을 발생하는 경우에만 허용된다.
별다른 규정이 없는 한, 어떠한 라디칼이 하나 또는 다수의 연결 가능 위치를 구비할 때, 이 라디칼의 임의의 하나 또는 다수의 위치는 화학결합에 의해 기타 라디칼과 연결될 수 있다. 이 화학결합의 연결방식이 위치고정되지 않고, 연결 가능 위치에 H원자가 존재할 때, 화학결합을 연결하면, 이 위치의 H원자의 개수는 연결된 화학결합의 개수에 따라 대응되게 감소되어 상응한 가수(Valence)의 라디칼로 변화된다. 상기 위치와 기타 라디칼을 연결시킨 화학결합은 직선형 실선결합(
Figure pct00036
), 직선형 점선결합(
Figure pct00037
), 또는 물결선(
Figure pct00038
)으로 나타낼 수 있다. 예를 들어 -OCH3중의 직선형 실선결합은 이 라디칼 중의 산소원자에 의해 기타 라이칼과 연결되는 것을 나타내고;
Figure pct00039
중의 직선형 점선결합은 이 라디칼 중의 질소원자의 양단이 기타 라디칼과 연결되는 것을 나타내고; 중의 물결선은 이 페닐기 중의 1과 2위치 탄소원자가 기타 라디칼과 연결되는 것을 나타낸다.
별다른 규정이 없는 한, 용어 "C1-4알킬기"는 직쇄 또는 측쇄의 1 내지 4개 탄소원자로 구성된 포화 탄화수소 라디칼을 나타내기 위한 것이다. 상기 C1-4알킬기는 C1-2, C1-3와 C2-3알킬기 등을 포함하고; 이는 일가(예: 메틸기), 이가(예: 메틸렌기) 또는 다가(예: 메틴기) 일 수 있다. C1-4알킬기의 구현예는 메틸기(Me), 에틸기(Et), 프로필기(n-프로필기와 이소프로필기 포함), 부틸기(n-부틸기, 이소부틸기, s-부틸기와 t-부틸기 포함) 등을 포함하나 이에 의해 한정되지 않는다.
별다른 설명이 없는 한, 본 발명 중 아미노산X과 TATA는 아미노산 잔기 상의 메르캅토기에 의해 연결되고; 예를 들어, Xi가 Pen일 때,
Figure pct00041
또는
Figure pct00042
는 모두
Figure pct00043
을 나타내고; Xi가 hCys일 때,
Figure pct00044
또는
Figure pct00045
는 모두
Figure pct00046
을 나타내고; Xi가 βCys일 때,
Figure pct00047
또는
Figure pct00048
는 모두
Figure pct00049
을 나타낸다.
본 발명의 화합물은 본 분야의 당업자가 숙지하고 있는 통상적인 방법에 의해 구조를 확인할 수 있고, 본 발명이 화합물의 절대배열에 관한 것일 경우, 이 절대배열은 본 분야의 통상적인 기술적 수단에 의해 확증할 수 있다. 예를 들어 단결정 X선 회절(SXRD)은, 배양된 단결정에 대해 Bruker D8 venture 회절계로 회절강도 데이터를 수집하되, 광원은 CuKα복사이고, 스캔방식은: φ/ω스캔인 바, 관련 데이터를 수집한 후, 나아가 직접법(Shelxs97)으로 결정체 구조를 해석하면, 절대배열을 확증할 수 있다.
본 발명의 화합물은 본 분야의 당업자가 숙지하고 있는 다양한 합성방법에 의해 제조될 수 있는 바, 이는 하기 열거된 구체적인 실시형태, 이와 기타 화학합성방법이 결합되어 형성된 실시형태 및 본 분야의 당업자가 숙지하고 있는 등가적 대체형태를 포함하는데, 바람직한 실시형태는 본 발명의 실시예를 포함하나 이에 의해 한정되지 않는다.
화합물은 본 분야의 통상적인 명명원칙에 따르거나 또는 ChemDraw® 소프트웨어를 사용하여 명명하되, 시중에 판매되는 화합물은 공급업자 목록명칭을 사용한다.
본 발명에 사용되는 용매는 시중에서 얻을 수 있다.
본 발명은 하기 약칭을 사용한다: eq.는 당량, 등량을 나타내고; SPPS는 폴리펩타이드 고상 합성법을 나타내고; TFA는 트리플루오로아세트산을 나타내고; DIEA는 디이소프로필에틸아민을 나타내고; DMF는 N,N-디메틸 포름아미드를 나타내고; HATU는 2-(7-아자벤조트리아졸)-N,N,N',N'-테트라메틸우라늄 헥사플루오로포스페이트를 나타내고; EDC는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로크로라이드를 나타내고; NHS는 N-히드록시-숙신이미드를 나타내고; TIS는 트리이소프로필실란을 나타내고; DTT는 DL-1,4-디티오트레이톨을 나타내고; MMAE는 모노메틸 오리스타틴E를 나타내되, 구체적인 구조는:
Figure pct00050
이고; PABC는
Figure pct00051
을 나타내고; Cit는 L-시트룰린을 나타내고; Val은 L-발린을 나타내고; Glutaryl은
Figure pct00052
을 나타내고; β-Ala는
Figure pct00053
을 나타내고; Sar는
Figure pct00054
을 나타내고; Sar10은
Figure pct00055
을 나타내고; Cys는 L-시스테인을 나타내고; hCys는
Figure pct00056
을 나타내고; βCys는
Figure pct00057
을 나타내고; Pen은
Figure pct00058
을 나타내고; N-methyl-Dap는
Figure pct00059
을 나타내고; 1Nal은 1-나프틸알라닌을 나타내고; hArg 또는 HArg는 L-호모알기닌을 나타내고; Hyp는 L-하이드록시프롤린을 나타내고; Trp는 L-트립토판을 나타내고; Pro는 L-프롤린을 나타내고; Thr는 L-트레오닌을 나타내고; Ser는 L-세린을 나타내고; Asp는 L-아스파라긴산을 나타내고; dAsp 또는 D-Asp는 D-아스파라긴산을 나타내고; Fmoc는 9-플루오레닐메톡카르보닐을 나타내고; Boc는 터트부톡시카르보닐을 나타내고; Trt는 트리페닐메틸을 나타내고; Pbf는 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐을 나타내고; PBS는 인산염 완충액을 나타낸다.
이하 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 기술하지만, 본 발명에 대해 어떠한 불리한 제한도 하지 않는다. 본문은 본 발명에 대해 기술하였는 바, 여기서 그 구체적인 실시형태에 대해서도 공개하였고, 본 기술분야의 당업자에 있어서, 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않는 상황에서 본 발명의 구체적인 실시형태에 대해 각종 변화와 개선을 진행하는 것은 자명한 것이다.
실시예 1
Figure pct00061
단계1: Peptide 1의 TFA염의 합성
이 폴리펩타이드는 표준적인 단계적 합성방법에 의해 합성된다.
1) DMF (20 mL)를 Rink amide MBHA 수지(0.5 mmol, 1.85 g, 기질: 0.27 mmol/g)가 함유된 용기에 넣어 수지를 2시간 동안 팽윤시킨다.
2) 펌핑한 후, DMF로 3회 세척하되, 매번마다 질소가스로 30초 동안 여기시킨다.
3) 20% 피페리딘/DMF을 넣은 후, 30분 동안 반응한다.
4) 펌핑한 후, DMF로 5회 세척하되, 매번마다 질소가스로 30초 동안 여기시킨다.
5) Fmoc 보호 아미노산의 용액에 넣고, 질소가스로 30초 동안 여기시킨 후, 축합제를 넣고, N2를 불어넣어 1시간 가까이 반응한다.
6) 단계2 내지 단계5를 반복하여 다음 아미노산을 축합시킨다.
표 1 원료 첨가 순서
Figure pct00062
폴리펩타이드 절단과 정제:
1) 측쇄가 보호된 폴리펩타이드가 함유된 플라스크에 절단 완충용액(90% TFA /2.5% TIS /2.5% H2O/5.0% DTT)을 넣고, 실온에서 2시간 동안 교반한다.
2) 차가운 이소프로필에테르로 이 폴리펩타이드를 침전시켜, 원심분리기(3000 rpms, 3 mins)로 원심분리한다.
3) 이소프로필에테르로 재차 두번 세척한다.
4) 건조하여 화합물Peptide 1의 TFA염을 얻는다.
단계 2: Peptide 2의 아세테이트의 합성
조생성물 Peptide 1의 TFA염(1.40 g, 470 μmol)을 50% MeCN/H2O (500 mL)에 용해시키고, 실온에서 교반된 용액에 TATA (140 mg, 560 μmol)를 서서히 첨가하여, 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후, NH4HCO3으로 pH값을 8까지 조절하고, 반응을 계속하여 실온에서 12시간 동안 교반한다. 액체 크로마토그래피-질량분석기(LCMS, Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)에서 반응이 완전하게 진행되었다고 나타나면, 교반을 멈추고, 역상(A: 0.075% TFA in H2O, B: CH3CN)으로 제조하고 정제하여, Peptide 2의 아세테이트를 얻는다.
표 2 정제조건
Figure pct00063
기타 2갈래의 폴리펩타이드Peptide 3, 4의 아세테이트의 합성방법은 Peptide 2의 아세테이트의 합성방법과 유사하다.
표 3 폴리펩타이드 서열2~4
Figure pct00064
단계 3: 중간체 INT_1의 TFA염의 합성
화합물1-1(200.0 mg, 178.0 μmol)을 DMF(5 mL)에 용해시키고, 0℃에서 DIEA(31.0 μL, 178.0 μmol)를 넣고, 10 mins동안 교반하는 동시에, 화합물1-2(290.4 mg, 890.1 μmol)를 별도의 반응용 플라스크에 넣고, DMF(5 mL)에도 용해시켜, 0℃에서 10 mins동안 교반한 후, 0℃에서 화합물1-1의 반응액을 교반된 화합물1-2의 반응액에 적가하되, 이 반응액을 0℃에서 30 mins동안 교반하고, 반응액을 여과하여 용해되지 않은 불순물을 제거하고, 여과액을 직접 역상으로 제조(TFA체계)하고 정제하여, 화합물INT_1의 TFA염을 얻는다.
단계 4: PDC_1의 아세테이트의 합성
폴리펩타이드 화합물peptide 2의 TFA염 (87.0 mg, 27.1 μmol)을 DMF (0.5 mL)에 용해시킨 후, DIEA (12.9 uL, 74.4 μmol)를 넣어, 실온에서 10 mins 동안 교반한다. 이어서 화합물INT_1의 TFA염(36.2 mg, 27.1μmol)을 DMF (0.3mL)에 용해시키고, 상기 폴리펩타이드 화합물peptide 2의 TFA염의 반응액에 적가한 후, 실온에서 2시간 동안 교반한다. LC-MS에서 반응이 완전하게 진행되었다고 나타나면, 반응을 멈추고, 반응액을 여과하여 용해되지 않은 불순물을 제거하고, 여과액을 직접 역상으로 제조(TFA체계)하고 정제하여, 동결건조한 후 AcOH염으로 제조 및 전환하여, PDC_1의 아세테이트를 얻는다.
실시예 2
실시예 3
PDC_2, PDC_3의 아세테이트 제조방식은 PDC_1의 아세테이트와 같다:
표 4 PDC_1~3의 구조와 질량 스펙트럼 데이터
Figure pct00067
실시예 4
1.중간체 3의 합성:
폴리펩타이드 합성:
이 폴리펩타이드는 표준적인 단계적 합성방법에 의해 합성된다.
1）DCM을 CTC Resin 수지(10.0 mmol, 10.0 g)와 Fmoc-Asp(OAll)-OH가 함유된 용기에 넣는다.
2）DIEA (4.00 eq)를 넣은 후 2시간 동안 교반한다.
3) MeOH (10.0 mL)를 넣고, 30분 동안 교반한다.
4）펌핑한 후, DMF로 3회 세척하되, 매번마다 질소가스로 30초 동안 여기시킨다.
5）20% 피페리딘/DMF을 넣은 후, 30분 동안 반응한다.
6）펌핑한 후, DMF로 5회 세척하되, 매번마다 질소가스로 30초 동안 여기시킨다.
7）Fmoc 보호 아미노산의 용액에 넣고, 질소가스로 30초 동안 여기시킨 후, 축합제를 넣고, N2를 불어넣어 1시간 가까이 반응한다.
8）단계4 내지 단계7을 반복하여, Fmoc-Lys(Alloc)-OH의 연결이 이루어질 때까지 다음 아미노산을 축합시킨다.
9）펌핑한 후, DMF로 3회 세척하고, DCM으로 3회 세척하되, 매번마다 질소가스로 30초 동안 여기시킨다.
10) OAll 와 Alloc 제거: DCM 수지 용액에 Pd(PPh3)4 (0.1 eq)와 PhSiH3 (10.0 eq)을 넣고, N2를 불어넣어 15분 가까이 반응하고, 펌핑한 후, 본 단계를 세번 반복한다.
11）펌핑한 후, DMF로 5회 세척하되, 매번마다 질소가스로 30초 동안 여기시킨다.
12）폐환: 축합제 용액 HATU (2.85 eq.), DIEA (6.0 eq.)를 넣고, N2를 불어넣어 1시간 가까이 반응한다.
13）펌핑한 후, DMF로 3회 세척하고, 메탄올로 3회 세척한다. 매번마다 질소가스로 30초 동안 여기시키고, 펌핑한 후 건조한다.
표 5 원료 첨가 순서
Figure pct00070
절단과 정제:
5) 측쇄가 보호된 폴리펩타이드가 함유된 플라스크에 절단 완충용액(20% HFIP/DCM)을 넣고, 실온에서 30분씩 2회 교반한다. 용액을 수집하여 회전 건조시켜, 역상을 제조 및 분리하여 중간체 3을 얻는다.
표 6 정제조건
Figure pct00071
2.중간체 4의 합성
폴리펩타이드 합성:
이 폴리펩타이드는 표준적인 단계적 합성방법에 의해 합성된다.
1) DMF (20 mL)를 Rink amide MBHA 수지(0.5 mmol, 1.85 g)가 함유된 용기에 넣어 수지를 2시간 동안 팽윤시킨다.
2) 펌핑한 후, DMF로 3회 세척하되, 매번마다 질소가스로 30초 동안 여기시킨다.
3) 20% 피페리딘/DMF를 넣은 후, 30분 동안 반응한다.
4) 펌핑한 후, DMF로 5회 세척하되, 매번마다 질소가스로 30초 동안 여기시킨다.
5) Fmoc 보호 아미노산의 용액에 넣고, 질소가스로 30초 동안 여기시킨 후, 축합제를 넣고, N2를 불어넣어 1시간 가까이 반응한다.
6) 단계2 내지 단계5를 반복하여 다음 아미노산을 축합시킨다.
표 7 원료 첨가 순서
Figure pct00072
Figure pct00073
폴리펩타이드 절단과 정제:
1) 측쇄가 보호된 폴리펩타이드가 함유된 플라스크에 절단 완충용액(90% TFA /2.5% TIS /2.5% H2O/5.0% DTT)을 넣고, 실온에서 2시간 동안 교반한다.
2) 차가운 이소프로필에테르로 이 폴리펩타이드를 침전시켜, 원심분리기(3000 rpms, 3 mins)로 원심분리한다.
3) 이소프로필에테르로 재차 두번 세척한다.
4) 조생성물 폴리펩타이드를 건조하여 중간체 4의 TFA염(조생성물)을 얻는다.
3.중간체 5의 TFA염의 합성
조생성물 중간체 4의 TFA염(1.40 g, 470 μmol)을 50% MeCN/H2O (500 mL)에 용해시키고, 실온에서 교반된 용액에 TATA (140 mg, 560 μmol)를 서서히 첨가하여, 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후, NH4HCO3으로 pH값을 8까지 조절하고, 반응을 계속하여 실온에서 12시간 동안 교반한다. LCMS에서 반응이 완전하게 진행되었다고 나타나면, 교반을 멈추고, 역상(A: 0.075% TFA/H2O, B: CH3CN)으로 제조하고 정제하여 중간체 5의 TFA염(조생성물)을 얻는다.
표 8 정제조건
Figure pct00074
4.화합물PDC_4의 아세테이트의 합성
중간체 5의 TFA염(60.0 mg, 18.6 μmol)을 DMF (0.3 mL)에 용해시킨 후, DIEA (12.9 μL, 74.4 μmol)를 넣고, 실온에서 10분 동안 교반한다. 이어서 화합물INT_1의 TFA염(24.8 mg, 18.6 μmol)을 DMF (0.2 mL)에 용해시키고, 상기 중간체 5의 반응액에 적가한 후, 실온에서 2시간 동안 교반하고, 반응액을 여과하여 용해되지 않은 불순물을 제거하고, 여과액을 직접 역상으로 제조(TFA체계)하고 정제하여, 동결건조한 후 아세테이트로 제조 및 전환하여, 화합물PDC_4의 아세테이트를 얻는다.
실시예 5
Figure pct00076
중간체 6의 합성:
이 폴리펩타이드는 표준적인 단계적 합성방법에 의해 합성된다.
1) DMF (30 mL)를 Rink amide MBHA 수지(0.5 mmol, 1.8 g, 기질: 0.28 mmol/g)가 함유된 용기에 넣어 수지를 2시간 동안 팽윤시킨다.
2) 펌핑한 후, DMF로 3회 세척하되, 매번마다 질소가스로 30초 동안 여기시킨다.
3) 20% 피페리딘/DMF를 넣은 후, 30분 동안 반응한다.
4) 펌핑한 후, DMF로 5회 세척하되, 매번마다 질소가스로 30초 동안 여기시킨다.
5) Fmoc 보호 아미노산 용액을 30초 동안 넣은 후, 축합제를 넣고, N2를 불어넣어 1시간 가까이 반응한다.
6) 단계2 내지 단계5를 반복하여 다음 아미노산을 축합시킨다.
표 9 원료 첨가 순서
Figure pct00077
Figure pct00078
20% 피페리딘/DMF로 Fmoc보호기를 제거하는 바, 반응시간은 30분이다. 축합반응은 발색반응으로 검출하되, 매번 반응후 모두 DMF로 수지를 3~5회 세척한다.
폴리펩타이드 절단과 정제:
1) 측쇄가 보호된 폴리펩타이드가 함유된 플라스크에 절단 완충용액(90% TFA /2.5% TIS /2.5% H2O/5.0% DTT)을 넣고, 실온에서 2시간 동안 교반한다.
2) 차가운 이소프로필에테르로 이 폴리펩타이드를 침전시켜, 원심분리기로(3000 rpms, 3 mins)원심분리한다.
3) 이소프로필에테르로 재차 두번 세척한다.
4) 조생성물을 건조하여 중간체 6을 얻는다.
중간체 7의 TFA염의 합성:
조생성물 폴리펩타이드 중간체 6 (1.20 g, 418 μmol)을 50% MeCN/H2O (500 mL)에 용해시키고, 실온에서 교반된 용액에 TATA (150 mg, 600 μmol)를 서서히 첨가하여, 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후, NH4HCO3으로 pH값을 8까지 조절하고, 반응을 계속하여 실온에서 12시간 동안 교반한다. LCMS에서 반응이 완전하게 진행되었다고 나타나면, 교반을 멈추고, 역상(TFA체계)으로 제조하고 정제하여, 중간체 7의 TFA염을 얻는다.
표 10 정제조건
Figure pct00079
PDC_5의 아세테이트 합성:
폴리펩타이드 중간체 7의 TFA염(60.6 mg)과 화합물INT_1의 TFA염(25.0 mg)을 DMF (0.7 mL)에 용해시키고, DIEA (9.68 mg, 74.9 μmol, 13.0 μL)를 넣는다. 실온에서 2시간 교반하여, LC-MS에서 반응이 완전하게 진행되었다고 나타나면, 반응을 멈추고, 반응액을 여과하여 용해되지 않은 불순물을 제거하고, 여과액을 직접 역상으로 제조(TFA체계)하고 정제하여, 동결건조한 후 아세테이트로 제조 및 전환하여, PDC_5의 아세테이트를 얻는다.
실시예 6
PDC_6의 아세테이트는 실시예 5의 합성방법을 참조하여, 실시예 5 원료 첨가 순서 표9 중 원료1을 Fmoc-Cys(Trt)-OH (2.0 eq.)으로 교체하고, 원료15를 Fmoc-hCys(Trt)-OH (3.0 eq.)으로 교체한다.
실시예 7
중간체 8의 합성:
이 폴리펩타이드는 표준적인 단계적 합성방법에 의해 합성된다.
1) DMF (30 mL)를 Rink amide MBHA 수지(0.5 mmol, 1.5 g, 기질: 0.33 mmol/g)가 함유된 용기에 넣어 수지를 2시간 동안 팽윤시킨다.
2) 펌핑한 후, DMF로 3회 세척하되, 매번마다 질소가스로 30초 동안 여기시킨다.
3) 20% 피페리딘/DMF를 넣은 후, 30분 동안 반응한다.
4) 펌핑한 후, DMF로 5회 세척하되, 매번마다 질소가스로 30초 동안 여기시킨다.
5) Fmoc 보호 아미노산 용액을 30초 동안 넣은 후, 축합제를 넣고, N2를 불어넣어 1시간 가까이 반응한다.
6) 단계2 내지 단계5를 반복하여 다음 아미노산을 축합시킨다.
표 11 원료 첨가 순서
Figure pct00083
Figure pct00084
20% 피페리딘/DMF로 Fmoc보호기를 제거하는 바, 반응시간은 30분이다. 축합반응은 발색반응으로 검출하되, 매번 반응후 모두 DMF로 수지를 3~5회 세척한다.
폴리펩타이드 절단과 정제:
1) 측쇄가 보호된 폴리펩타이드가 함유된 플라스크에 절단 완충용액(90% TFA /2.5% TIS /2.5% H2O/5.0% DTT)을 넣고, 실온에서 2시간 동안 교반한다.
2) 차가운 이소프로필에테르로 이 폴리펩타이드를 침전시켜, 원심분리기(3000 rpms, 3 mins)로 원심분리한다.
3) 이소프로필에테르로 재차 두번 세척한다.
4) 조생성물을 건조하여 중간체 8을 얻는다.
중간체 9의 TFA염의 합성:
조생성물 폴리펩타이드 중간체 8 (1.50 g, 500 μmol)을 50% MeCN/H2O (500 mL)에 용해시키고, 실온에서 교반된 용액에 TATA (186 mg, 750 μmol)를 서서히 첨가하여, 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후, NH4HCO3으로 pH값을 8까지 조절하고, 반응을 계속하여 실온에서 12시간 동안 교반한다. LCMS에서 반응이 완전하게 진행되었다고 나타나면, 교반을 멈추고, 역상(TFA체계)으로 제조하고 정제하여 중간체 9의 TFA염을 얻는다.
표 12 정제조건
Figure pct00085
PDC_7의 아세테이트 합성:
폴리펩타이드 중간체 9의 TFA염(40.0 mg)과 화합물INT_1의 TFA염(17.2 mg) 을 DMF (0.5 mL)에 용해시키고, DIEA (6.36 mg, 49.2 μmol)를 넣는다. 실온에서 5시간 동안 교반하여, LC-MS에서 반응이 완전하게 진행되었다고 나타나면, 반응을 멈추고, 반응액을 여과하여 용해되지 않은 불순물을 제거하고, 여과액을 직접 역상으로 제조(TFA체계)하고 정제하여, 동결건조한 후 아세테이트로 제조 및 전환하여, PDC_7의 아세테이트를 얻는다.
실시예 8
PDC_8의 아세테이트는 실시예 7의 합성방법을 참조하여, 실시예 7원료 첨가 순서 표 11중 원료1을 Fmoc-Pen(Trt)-OH (2.85 eq.)으로 교체하고, 원료15를 Fmoc-Cys(Trt)-OH (2.85 eq.)으로 교체한다.
표 13 PDC_4~8의 구조 서열과 질량 스펙트럼 데이터
Figure pct00087
바이오어세이
시험예 1 본 발명 화합물과 EphA2단백질의 결합능력 측정
1.실험목적
SPR법으로 측정대상물과 표적단백질 EphA2의 친화력을 검출한다.
2.재료와 기기
Figure pct00088
Biacore 8K (GE Healthcare)
Figure pct00089
96-well Plate (Cat# 650101, greiner bio-one)
Figure pct00090
CM5칩(Cat # BR-1005-30, GE Healthcare)
Figure pct00091
Amine Coupling Kit (Cat # BR-1000-50, GE Healthcare)
EDC
NHS
1 M 에탄올아민
Figure pct00092
10 mM 아세트산 나트륨 pH 4.5(Cat # BR-1003-50, GE Healthcare)
Figure pct00093
DMSO (Cat # D4540, Sigma)
Figure pct00094
P20 (Cat # BR-1000-54, GE Healthcare)
Figure pct00095
PBS (Cat # BR-1006-72, GE Healthcare)
Figure pct00096
EphA2 (Cat#　13926-H08HD,　Sino Biological)
3.프로토콜
본 실험은 아민 커플링법을 사용하되, 즉 Biacore 8K를 이용하여 표적 단백질 EphA2를 CM5칩 상에 직접 고정시킨 후, 측정대상물을 분석물로 하여, 완충액(10 mM PBS, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 5% DMSO, 0.05% P20)으로 측정대상물을 수요되는 농도 구배로 희석하여, 멀티사이클 동력학 검출을 진행하되, 각 사이클마다 180 초 동안 샘플링하고, 180 초 동안 해리한 후, 다음 사이클을 진행하여, 표적 단백질 EphA2와 측정대상물의 친화력 동력학 분석 데이터를 획득한다. 최종적인 데이터는 Biacore Insight Evaluation Software(V 2.0.15.12933)에 의해 1: 1 모형에 따라 Kinetics피팅(fitting) 분석을 진행한다.
4.실험방법 및 절차
1) 완충액 조제: 10 mM PBS, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 5% DMSO, 0.05% P20.
2) CM5칩 활성화: 400 mM EDC와 100 mM NHS를 이용하여 10 μL/min의 유속으로 420초 동안 활성화한다.
3) 표적 단백질 커플링: 10 mM 아세트산 나트륨(pH 4.5)으로 표적 단백질을 10 μg/mL으로 희석하고, 10 μL/min의 유속으로 284 s 동안 커플링한다. 실험에서는 칩 상의 1#, 2#와 3# 채널을 사용하는데, 커플링 결과는 각각 1639.9RU, 1747.8RU와 1702.2RU이다.
4) CM5칩 블로킹: 1 M에탄올아민을 이용하여 10 μL/min의 유속으로 420초 동안 블로킹한다.
5) 분석물 농도: 완충액을 사용하여 측정대상물을 희석한다. 측정대상물은 100 nM으로부터 2배의 구배로 0.78 nM까지 희석한다.
6) 샘플링 분석: 측정대상물 작동액의 각 농도는 하나의 사이클을 이루는데, 30 μL/min의 유속으로 180초 동안 결합되었다가, 180초 동안 해리된다. 마지막 사이클은 5% DMSO용매 교정 사이클이다.
7) 모든 결과는 1:1 모형에 따라 kinetics피팅(fitting) 분석을 진행한다.
5.실험결과
5개의 유효농도의 실험 데이터를 선택하여, 본 발명 화합물은 Biacore Insight Evaluation Software(V 2.0.15.12933)에 의해 1: 1 모형에 따라 Kinetics피팅 분석을 진행하되, 결과는 표 14에 나타난 바와 같다:
표 14 본 발명 화합물과 Human EphA2 SPR 결합결과
Figure pct00097
결론: 본 발명 화합물과 EphA2는 아주 강한 결합작용을 구비한다.
시험예 2: 본 발명 화합물이 NCI-H1975와 SK-OV-3에 대한 세포 체외 항증식 활성
1. 실험목적
본 발명 화합물이 종양세포계 NCI-H1975와 SK-OV-3에서 체외 세포 활성에 주는 영향을 검출하여 화합물이 세포 증식을 억제하는 작용을 연구한다.
2. 실험설계:
세포배양
종양세포계를 표 15에 나타난 배양조건에 따라 각각 37℃, 무CO2와 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 놓고 배양한다. 정기적으로 계대배양하고, 대수생장기에 있는 세포를 취하여 플레이팅한다.
표 15 세포배양 조건
Figure pct00098
세포 플레이팅
대수생장기에 있는 세포를 수집하여, 실온에서, 1000 rpm으로 3min 동안 원심분리한다. 상층액을 흡수하여 폐기하고, 5 mL배지에서 세포를 재현탁시켜, 20 μL 세포 현탁액을 흡수하여 트리판 블루와 1:1로 혼합하고, 3 min동안 염색하여 세포 생존율을 검출하고, 생존 세포를 계산한다. 세포밀도를 NCI-H1975 4000개/웰 또는 SK-OV-3 5000/웰로 조절한다. 배양판에 웰당 90 μL씩 세포 현탁액을 넣고, 블랭크 대조군 웰에는 세포를 함유하지 않은 배양액을 넣는다. 배양판을 각각 37℃, 무CO2와 37℃, 5% CO2, 및 상대적 습도가 100%인 인큐베이터에 넣고 밤새도록 배양한다.
화합물 저장판 제조
400X 화합물 저장판 제조: DMSO으로 측정 화합물을 최고 농도 구배로부터 최저 농도 구배까지 희석한다.
표 16 400X저장판 희석농도
Figure pct00099
10X화합물 작동액의 조제 및 화합물 처리세포
10X화합물 작동액의 조제: V형 바닥인 96웰판에 78 μL세포배양액을 넣고, 400X 화합물 저장판에서 2 μL화합물을 흡수하여 96웰판의 세포배양액에 넣는다. 용매 대조군과 블랭크 대조군에 2 μL DMSO를 넣는다. 화합물 또는 DMSO를 넣은 후 피펫(Pipet)으로 균일하게 혼합한다. 투약: 10 μL의 10X화합물 작동액을 취해 표 1에 따라 세포배양판에 넣는다. 용매 대조군과 블랭크 대조군에 10 μL DMSO-세포배양액 혼합액을 넣는다. DMSO최종농도는 0.25%이다. 96웰 세포판을 인큐베이터에 넣고 72 h동안 배양한다.
CellTiter-Glo 발광법에 따른 세포활성 검출
Promega CellTiter-Glo 발광법에 따른 세포활성 검출 키트(Promega-G7573)의 설명서에 따라 진행한다. EnVision® Multi-mode Plate Reader (EnVision 2104-10)에서 발광신호를 검출한다.
데이터 분석
이하 공식으로 화합물의 억제율(Inhibition rate, IR) : IR (%) = (1―(RLU화합물―RLU블랭크 대조군) / (RLU 용매 대조군―RLU 블랭크 대조군))*100%를 계산 및 검출한다. Excel에서 농도별 화합물의 억제율을 계산한 후, GraphPad Prism 6.02소프트웨어로 억제 곡선도를 제작하고 최소 억제율, 최대 억제율 및 IC50을 포함하는 관련 파라미터를 계산한다.
실험결과는 표 17에 나타난 바와 같다.
표 17 항종양세포증식결과
Figure pct00100
결론: 본 발명 화합물이 종양세포계NCI-H1975와 SK-OV-3에서 체외 배양된 세포에 대해 뚜렷한 증식 억제 작용이 있다.
시험예 3: 본 발명 화합물이 인간 전립선암PC-3세포피하 이종이식 종양BALB/c누드 마우스 모델에 대한 체내 약력학 연구
실험목적: 본 발명 화합물이 인간 전립선암PC-3세포피하 이종이식 종양 모델 상에서 발휘하는 체내 약효.
세포배양: 인간 전립선암PC-3세포(ATCC-CRL-1435)를 체외 부착 배양하되, 배양조건은 F-12K배지에 10％소태아혈청, 100 U/mL 페니실린과 100 μg/mL스트렙토마이신을 넣고, 37 ℃, 5% CO2인큐베이터에서 배양하는 것이다. 일주일에 두번씩 트립신-EDTA으로 통상적인 소화처리하여 계대배양한다. 세포 포화도가 80% - 90%로서, 수량이 요구에 도달할 경우, 세포를 수집하고, 계산, 접종한다.
동물: BALB/c nude마우스, 수컷, 6-8주령, 체중 22-27그램. 모두 70마리 마우스를 접종하여 약효 실험에 사용하되, 군마다 40마리씩 약효용 마우스를 넣는다. 베이징 바이탈 리버 실험동물 기술유한회사에서 제공한다.
종양접종: 0.1 mL(10×106개) PC-3세포를 각 마우스의 우측 등에 피하 접종시킨다. 종양 평균 체적이 150-200 mm3일 때 군별로 투여하되, 군당 8마리씩(n = 8) 투여한다.
투여체적: 동물 체중에 따라 투여체적(투여체적 = 10 μL/g)을 조절한다.
약물조제: 화합물은 50 mM 초산염 완충액(pH=5), 10% 자당을 용매로 하여 1 mg/mL균일용액으로 조제하여, -80℃ 냉장고에 저장한다. 투여 당일, 상응한 농도로 희석하여, IV(정맥주사) 투여한다.
약효연구: 종양 평균 체적이 150-200 mm3일 때 군별로 투여한다. 투여량: 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.5 mg/kg이다. 투여 빈도수: QW×3주이다.
실험결과: 도 1과 도 2에 나타난 바와 같다.
실험결론: 금번 실험에서, 본 발명 화합물의 3개 투여량군은 인간 전립선암PC-3세포피하 이종이식 종양 모델에서 뚜렷한 종양 생장 억제 작용을 나타내고, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.5 mg/kg군에서 투여량 상관성을 나타낸다.
시험예 4: 본 발명 화합물이 인간 난소암 SK-OV-3세포피하 이종이식 종양BALB/c누드 마우스 모델에 대한 체내 약력학 연구
실험목적: 투여약이 인간 난소암 SK-OV-3세포 피하 이식 종양 모델 상에서 일으키는 체내 약효를 평가한다.
세포배양: 인간 난소암 SK-OV-3세포(ECACC-91091004)를 체외 단층 배양하되, 배양조건은 McCoy's 5a배지에 10％소태아혈청, 100 U/mL 페니실린과 100 μg/mL 스트렙토마이신을 넣고, 37 ℃, 5% CO2인큐베이터에서 배양하는 것이다. 일주일에 두번씩 트립신-EDTA으로 통상적인 소화처리하여 계대배양한다. 세포 포화도가 80% - 90%로서, 수량이 요구에 도달할 경우, 세포를 수집하고, 계산, 접종한다.
동물: BALB/c누드 마우스, 수컷, 6-8주령, 체중 18-21그램. 베이징 바이탈 리버 실험동물 기술유한회사에서 제공한다.
종양접종: 0.2 mL(10Х106개) SK-OV-3세포를 각 마우스의 우측 등에 피하 접종시킨다.
투여체적: 동물 체중에 따라 투여체적(투여체적 = 10 μL/g)을 조절한다.
약물조제: 측정대상 화합물은 50 mM 초산염 완충액(pH=5), 10% 자당을 용매로 하여 1 mg/mL균일용액으로 조제하여, -80℃냉장고에 저장한다. 투여 당일, 상응한 농도로 희석하여, IV(정맥주사) 투여한다.
약효연구: 종양 평균 체적이 150-200 mm3일 때 군별로 투여하되, 군당 8마리씩(n = 8) 투여한다. 투여량: 1 mg/kg, 3 mg/kg이다. 투여 빈도수: QW×6주이다.
실험결과: 도 3과 도 4에 나타난 바와 같다.
실험결론: 금번 실험에서, 본 발명 화합물의 2개 투여량군은 인간 난소암 SK-OV-3세포피하 이종이식 종양 모델에서 뚜렷한 종양 생장 억제 작용을 나타내고, 1 mg/kg와 3 mg/kg군에서 투여량 상관성을 나타낸다.
시험예 5: 본 발명 화합물이 마우스 체내에 대한 약물동태학 분석
A. 실험목적
본 발명 화합물이 CD-1마우스 체내에서의 약물동태학을 측정한다.
B. 실험조작
표준 프로토콜로 화합물 정맥주사 및 경구투여후 CD-1마우스 약물동태학 특징을 측정하는 바, 본 발명 화합물을 청칭용액으로 조제하되, 용매: 50 mM 초산염 완충액(pH=5), 10% 자당으로, 2마리 마우스에게 단일적으로 2 mg/kg 측정대상 화합물을 정맥주사한다. 투여후 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24시간을 시점으로 하여, 전혈을 수집하고, 혈장을 제조하여 얻어, LC-MS/MS방법으로 측정대상 화합물과 그 잠재적 대사산물 MMAE의 농도를 분석하고, Phoenix WinNonlin소프트웨어로 예를 들어 피크농도(Cmax), 제거율(Cl), 반감기(T1/2), 조직분포(Vdss), 약물농도-시간 곡선하면적(AUC0-last) 등과 같은 약물동태학 파라미터를 계산한다.
C. 실험결과
실험결과는 표 18에 나타난 바와 같다.
표 18 마우스 약물동태학 측정 결과
Figure pct00101
결론: 본 발명 화합물은 CD-1마우스 혈액 중 반감기가 짧아, 제거가 빠르며, MMAE는 CD-1마우스 혈장 중의 방출량이 지극히 적다.
시험예 6: 본 발명 화합물이 랫트 혈장에 대한 약물동태학 분석
실험목적: 본 발명 화합물이 SD랫트 체내에서의 약물동태학을 측정한다.
6.1 표준 프로토콜로 화합물 정맥주사 및 경구투여후 랫트 약물동태학 특징을 측정하는 바, 측정대상 화합물을 청칭용액으로 조제하되, 용매: 50 mM 초산염 완충액(pH=5), 10% 자당으로, 2마리 SD랫트에게 단일적으로 2 mg/kg의 측정대상 화합물을 정맥주사한다. 투여후 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24시간을 시점으로 하여, 전혈을 수집하고, 혈장을 제조하여 얻어, LC-MS/MS방법으로 측정대상 화합물과 그 잠재적 대사산물 MMAE의 농도를 분석하고, Phoenix WinNonlin소프트웨어로 약물동태학 파라미터를 계산한다.
실험결과는 표 19에 나타난 바와 같다.
표 19 랫트 약물동태학 측정 결과
Figure pct00102
6.2 표준 프로토콜로 화합물 정맥주사 및 경구투여후 랫트 약물동태학 특징을 측정하는 바, 측정대상 화합물을 청칭용액으로 조제하되, 용매: 50 mM 초산염 완충액(pH=5), 10% 자당으로, 3마리 수컷SD랫트에게 단일적으로 2.5 mg/kg 또는 3.75 mg/kg 또는 5 mg/kg의 측정대상 화합물을 정맥주사한다. 투여후 0.083, 0.25, 0.5, 1, 4, 24시간을 시점으로 하여, 전혈을 수집하고, 혈장을 제조하여 얻어, LC-MS/MS방법으로 측정대상 화합물과 그 잠재적 대사산물 MMAE의 농도를 분석하고, 약물동태학 파라미터를 계산한다.
실험결과는 표 20에 나타난 바와 같다.
표 20 투여량별 랫트 약물동태학 측정 결과
Figure pct00103
결론: 본 발명 화합물은 랫트 혈액 중 반감기가 짧아, 제거가 빠르며, PDC의 노출량은 투여량이 증가됨에 따라 증가되고, 대사 안정성이 좋고; MMAE는 랫트 혈장 중의 방출량이 적고, 일정한 투여량 상관성을 나타낸다.
시험예 7: 본 발명 화합물이 필리핀원숭이 혈장에 대한 약물동태학 분석
A. 실험목적
본 발명 화합물이 필리핀원숭이 체내에서의 약물동태학을 측정한다.
B. 실험조작
표준 프로토콜로 화합물 정맥주사 및 경구투여 후 필리핀원숭이 약물동태학 특징을 측정하는 바, 본 발명 화합물을 청칭용액으로 조제하되, 용매: 50 mM 초산염 완충액(pH=5), 10% 자당으로, 2마리 필리핀원숭이에게 단일적으로 1 mg/kg측정대상 화합물을 정맥주사한다. 투여후 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24시간을 시점으로 하여, 전혈을 수집하고, 혈장을 제조하여 얻어, LC-MS/MS방법으로 측정대상 화합물과 그 잠재적 대사산물 MMAE의 농도를 분석하고, Phoenix WinNonlin소프트웨어로 약물동태학 파라미터를 계산한다.
C. 실험결과는 표 20에 나타난 바와 같다.
표 21 필리핀원숭이 약물동태학 측정 결과
Figure pct00104
결론: 정맥주사되는 본 발명 화합물은 필리핀원숭이 혈액 중 반감기가 짧아, 제거가 빠르며, MMAE는 필리핀원숭이 혈장 중의 방출량이 지극히 적다.
시험예 8: 본 발명 화합물 종속별 혈장 안정성 분석
A. 실험목적
본 발명 화합물이 랫트, 필리핀원숭이와 인간 혈장 중에서의 안정성을 측정한다.
B. 실험조작
2 μL측정대상 화합물(100 μM)의 작동액을 대응하는 배양판에 넣되, T0, T10, T30, T60, T120과 T240배양판을 포함하고, 각 샘플마다 세개의 평행홀을 준비한다. 그다음 작동액을 넣은 배양판에 98 μL의 SD랫트, 필리핀원숭이와 인간의 블랭크 혈장을 대응되게 넣는다. 모든 샘플은 37℃ 수욕조에서 배양한다. 측정대상 화합물의 최종 배양농도는 2　μM이다. 각 배양시점이 완료될 때마다, 상응한 배양판을 취해서, 정지액을 넣어, 단백질을 침전시키고, 20　분 동안 원심분리하여, 150　μL상층액을 취하여 LC-MS/MS의 방법으로 분석한다. 샘플 중 측정대상 화합물의 농도는 액체 크로마토그래피-질량분석(LC-MS/MS) 방법으로 반정량적 측정을 진행한다.
C. 실험결과
실험결과는 표 21에 나타난 바와 같다.
표 22 본 발명 화합물이 SD랫트, 필리핀원숭이와 인간 혈장 중에서의 안정성 결과
Figure pct00105
상기 방법으로, 측정대상 화합물과 인간 혈장 배양시간을 72시간까지 연장하되, 실험결과는 표 22에 나타난 바와 같다.
표 23 본 발명 화합물이 인간 혈장 중 72시간 배양한 안정성
Figure pct00106
결론: 본 발명 화합물은 SD랫트, 필리핀원숭이와 인간의 세개의 종속 혈장 중에서 우수한 안정성을 구비한다.
시험예 9: 본 발명 화합물 종속별 전혈 안정성 분석
A. 실험목적
본 발명 화합물이 SD랫트와 필리핀원숭이 전혈 중에서의 안정성을 측정한다
B. 실험조작
2 μL측정대상 화합물(100 μM)의 작동액을 대응하는 배양판에 넣되, T0, T10, T30, T60, T120과 T240배양판을 포함하고, 각 샘플마다 세개의 평행홀을 준비한다. 그다음 작동액을 넣은 배양판에 98 μL의 SD랫트와 필리핀원숭이의 블랭크 혈장을 대응되게 넣는다. 모든 샘플은 37℃ 수욕조에서 배양한다. 측정대상 화합물의 최종 배양농도는 2　μM이다. 각 배양시점이 완료될 때마다, 상응한 배양판을 취해서, 정지액을 넣어, 단백질을 침전시키고, 20　분 동안 원심분리하여, 100　μL상층액을 취하여 300　μL초순수로 희석하고, 균일하게 혼합한 후 LC-MS/MS의 방법으로 분석한다. 샘플 중 측정대상 화합물의 농도는 액체 크로마토그래피-질량분석(LC-MS/MS) 방법으로 반정량적 측정을 진행한다.
C. 실험결과
실험결과는 표 23에 나타난 바와 같다.
표 24 본 발명 화합물이 SD랫트와 필리핀원숭이 전혈 중에서의 안정성 결과
Figure pct00107
결론: 본 발명 화합물은 SD랫트와 필리핀원숭이 혈장 중에서 우수한 안정성을 구비한다.
시험예 10: 본 발명 화합물이 필리핀원숭이와 인간 간세포 중에서의 대사 안정성
A. 실험목적
본 발명 화합물이 필리핀원숭이와 인간 간세포 중에서의 대사 안정성을 고찰한다.
B. 실험조작
96웰판에서 배양하고, 외추출법을 사용한다. 약간의 96웰 샘플 침전판을 준비하여, T0, T15, T30, T60, T90, T0-MC, T90-MC와 블랭크 기질로 각각 명명한다. 소생 배양액과 인큐베이션 배양액을 사전에 취하여, 37℃ 수욕조에 놓고 예열한다. 액체 질소 탱크로부터 냉장보관한 필리핀원숭이와 인간의 간세포(liver cell)를 취하여 소생시키고, 인큐베이션 배양액으로 세포를 0.51Х106 cells/mL으로 희석한다. 198　μL의 간세포 혼탁액(0.5Х 106 cells/mL)을 예열된 배양판에 넣고, 배양액 대조군에 198　μL간세포를 함유하지 않은 인큐베이션 배양액을 T0-MC와 T90-MC배양판에 넣고, 모든 배양판을 37℃인큐베이터에서 10분 동안 배양한다. 그다음 2 μL피험체 작동액을 넣고, 균일하게 혼합하여, 인큐베이터 내의 로커(rocker)에 넣고 배양한다. 각 시점에서 3개의 중복샘플을 준비한다. 배양조건은 37℃, 포화습도, 5%CO2을 함유하는 것이다. 측정체계에서, 피험체의 최종농도는 1　μM이고, 대조품의 최종농도는 3　μM이며, 간세포의 최종농도는 0.5Х106 cells /mL이고, 총유기용매의 최종농도는 1.0%이되, 여기서 DMSO의 최종농도는 0.1%이다.
상응한 시점에서 배양이 완료될 때, 배양판을 취하고, 25 μL화합물과 세포의 혼합액을 취하여 125 μL정지액을 함유하는 샘플판에 각각 넣는다. 블랭크 샘플판에 대해, 25 μL간세포를 함유하지 않은 인큐베이션 배양액을 직접 넣는다. 모든 샘플판을 실링한후 로커에서 600　rpm으로 10분동안 요동한 후, 3220 ×g으로 20분 동안 원심분리한다. 피험체 상층액을 순수로 1:3의 비례로 희석한다. 모든 샘플을 균일하게 혼합한 후 LC-MS/MS의 방법으로 분석한다.
샘플 중 본 발명 화합물의 농도는 액체 크로마토그래피-질량분석(LC-MS/MS) 방법으로 반정량적 측정하되, 표준곡선과 질량제어 샘플을 포함하지 않는다. 분석물 피크면적과 내부표준물 피크면적의 비율로 샘플 중의 농도를 나타낸다. 분석물과 내부표준물의 보유시간, 크로마토그램 수집과 크로마토그램의 적분은 소프트웨어 Analyst(Sciex, Framingham, Massachusetts, USA) 으로 처리한다.
C. 실험결과
실험결과는 표 25에 나타난 바와 같다.
표 25 본 발명 화합물이 필리핀원숭이와 인간 간세포 중에 있어서의 대사 안정성 결과
Figure pct00108
결론: 본 발명 화합물은 필리핀원숭이와 인간 간 마이크로솜 중에서 우수한 대사 안정성을 구비한다.

Claims (4)

  1. 식(V)으로 표시된 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그 염에 있어서,
    Figure pct00109

    여기서,
    Figure pct00110
    은
    Figure pct00111
    으로부터 선택되고;
    Xi, Xii와 Xiii는 각각 독립적으로 Cys, hCys, βCys와 Pen으로부터 선택되고, Xi, Xii와 Xiii는 서로 다를 때 Cys이고;
    또는,
    Figure pct00112
    은
    Figure pct00113
    으로부터 선택되고;
    Xi, Xii와 Xiii는 각각 독립적으로 Cys, hCys, βCys와 Pen으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식(V)으로 표시된 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그 염.
  2. 하기 식으로 표시된 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그 염.
    Figure pct00114

    Figure pct00115

    Figure pct00116
  3. 제 1 항 내지 제 2 항 중의 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그 염이 EphA2 과발현된 고형암을 치료하는 약물을 제조함에 있어서의 응용.
  4. 피험자에게 치료유효량의 제 1항 내지 제 2 항 중의 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그 염을 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 필요로 하는 피험자 몸에서 EphA2과발현된 고형암을 치료하는 방법.
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