KR20240040786A

KR20240040786A - 생물제약 조성물 및 안정한 동위원소 표지 펩티드 맵핑 방법

Info

Publication number: KR20240040786A
Application number: KR1020247006531A
Authority: KR
Inventors: 타일러 키이스 데이비스; 힐러리 앰버 슈에슬러
Original assignee: 글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 디벨로프먼트 리미티드
Priority date: 2021-08-03
Filing date: 2022-08-02
Publication date: 2024-03-28
Also published as: CN117794954A; CA3227515A1; IL310392A; TW202323822A; WO2023012669A3; WO2023012669A2

Abstract

정확하고 민감한 접합 부위 정량화를 위한 안정한 동위원소 표지 (SIL) 펩티드 맵핑 방법이 본원에 개시된다. 또한 BCMA를 표적화하는 항체 약물 접합체 (ADC)를 포함하는 조성물이 본원에 개시된다.

Description

생물제약 조성물 및 안정한 동위원소 표지 펩티드 맵핑 방법

관련 출원에 대한 상호-참조

본 출원은 2021년 8월 3일에 출원된 미국 특허 출원 번호 63/228,951을 우선권 주장하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 XML 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상기 XML 파일은 파일명이 054624_09_5031_Sequence_Listing.xml이고, 2022년 7월 25일에 생성되었으며, 크기가 15,855 바이트이다.

분야

안정한 동위원소 표지 (SIL) 펩티드 맵핑을 사용하여 소분자 세포독성 페이로드, 예를 들어 MMAF 또는 MMAE와 시스테인-접합된 항체 약물 접합체의 부위-특이적 접합 수준을 결정하는 방법이 본원에 개시된다.

항체 약물 접합체 (ADC)는 표적화 종양학 요법을 위해 모노클로날 항체 (mAb)의 특이성을 세포독성 소분자 약물의 효력과 조합한 성장하고 있는 부류의 생물제약품이다 (Hafeez et al., Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy. Molecules. 2020, 25, 4764; 및 Boni et al., The Resurgence of Antibody Drug Conjugates in Cancer Therapeutics: Novel Targets and Payloads. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 2020, 40, 1-17). 소분자 페이로드는 전형적으로 시스테인 또는 리신 단백질 잔기를 통해 접합되어 상이한 약물-로딩된 (DL) 종의 불균질 혼합물을 생성한다 (Ponziani et al., Antibody-Drug Conjugates: The New Frontier of Chemotherapy. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5510). ADC의 전체 약물-대-항체 비 (DAR)는 약물 효력 및 효능에 대한 그의 효과로 인해 중요한 품질 속성 (CQA)으로서 확인되었다 (Li et al., Impact of Physiolog ically Based Pharmacokinetics, Population Pharmacokinetics and Pharmacokinetics/Pharmacodynamics in the Development of Antibody-Drug Conjugates. The Journal of Clinical Pharmacology. 2020, 60, 105-119). 그 결과, ADC는 mAb 생물제약품에 대해 전형적으로 특징화된 단백질 서열 및 번역후 변형 (PTM)에 추가로 이들 약물-로딩된 종을 특징화하는 분석 과제를 요구한다.

여러 분석 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) (Bobaly et al., Optimization of non-linear gradient in hydrophobic interaction chromatography for the analytical characterization of antibody-drug conjugates. Journal of Chromatography A. 2017, 1481, 82-91), 친수성 상호작용 크로마토그래피 (HILIC) (D'Atri et al., Characterization of an antibody-drug conjugate by hydrophilic interaction chromatography coupled to mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 2018, 1080, 37-41), 모세관 겔 전기영동 (CGE) (Lechner et al., Insights from capillary electrophoresis approaches for characterization of monoclonal antibodies and antibody drug conjugates in period 2016-2018. Journal of Chromatography B. 2019, 1122-1123, 1-170), 및 기본 및 하위-단위 액체 크로마토그래피 질량 분광측정법 (LC-MS) (Zhu et al., Current LC-MS-based strategies for characterization and quantification of antibody-drug conjugates. Journal of Pharmaceutical Analysis. 2020, 10, 209-220)은 ADC에 대한 전반적 DAR을 결정할 수 있다. 이들 방법은 또한 접합 부위 위치에 관한 정성적 정보를 제공할 수 있지만; 부위-특이적 접합 수준은 평가하기 어려웠다.

효소적 소화물의 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광측정법 (LC-MS/MS) 분석 (펩티드 맵핑)은, 단백질 서열을 특징화하고, 천연 및 변형된 버전의 펩티드 사이의 상대 정량화를 수행함으로써 생물제약품의 번역후 변형 (PTM)을 정량화하기 위해 널리 사용되는 분석 방법이다. MMAF-접합된 펩티드는 소수성 약물 페이로드의 첨가로 인한 접합된 펩티드와 천연 펩티드 사이의 비교적 큰 질량 및 체류 시간 차이로 인해 이러한 접근법을 복잡하게 한다. 이들 차이는 매우 상이한 이온화 효율을 갖는 펩티드 쌍을 생성하며, 이는 이들 사이의 상대 정량화를 부적합하게 만든다.

그 결과, 대부분의 ADC 펩티드 맵핑 적용은 사실상 접합 부위 위치를 확인하는 것만으로 정성적이었으며, 이들 부위에서의 접합 수준을 정량화하기 위한 시도는 거의 기재되지 않았다. 문헌 [Q. Luo et al. (Structural Characterization of a Monoclonal Antibody-Maytansinoid Immunoconjugate. Analytical Chemistry. 2016, 88, 695-702)]에 기재된 한 방법은 ADC 샘플과 함께 비접합된 mAb 중간체 샘플을 분석하는 것을 수반하였다. mAb 샘플에서 검출된 비접합된 피크 면적을 ADC 샘플에서의 것과 비교하였으며, 임의의 면적 손실은 그 펩티드 부위에서의 접합에 기인하였다. 그러나, 이 방법은 mAb와 ADC 샘플 사이의 샘플 제조 변동을 정규화하지 않고, 단일 펩티드, 예컨대 시스테인-접합된 ADC에 대한 중쇄 힌지 펩티드 상의 다수의 접합 부위를 설명할 수 없다.

문헌 [L. Chen, et al. (In-depth structural characterization of Kadcyla® (ado-trastuzumab emtansine) and its biosimilar candidate. mAbs. 2016, 8, 1210-1223)]에 기재된 또 다른 방법은 접합된 펩티드 피크 면적을 기지의 펩티드 류신 엔케팔린 첨가의 피크 면적에 대해 정규화함으로써 샘플 제조 가변성을 보정하기 위해 시도하였다. 그러나, 이 방법은 주어진 접합 부위에 대한 진정한 부위-점유 백분율이 아니라 단지 샘플 사이의 상대 접합 정량화만을 제공한다.

문헌 [H. Sang, et al. (Conjugation site analysis of antibody-drug-conjugates (ADCs) by signature ion fingerprinting and normalized area quantitation approach using nano-liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 2017, 955, 67-78)]에 기재된 제3 방법은 접합된 펩티드의 피크 면적을 그의 각각의 비접합된 펩티드의 피크 면적에 대해 정규화함으로써 이온화 차이를 설명하기 위해 시도하였다. 이어서, 상기 비에 비접합 및 접합된 펩티드 보정 곡선의 기울기를 나누어 계산된 상대 이온화 강도 인자를 곱하여 정규화된 비를 산출하였다. 이어서, 상기 정규화된 비의 함수로서 부위 접합 수준을 계산하였다. 그러나, 이 방법은 모든 접합 부위 펩티드 쌍에 대한 보정 곡선을 구축하기 위해 표준의 분석을 요구한다. 추가로, 기재된 바와 같은 접합 수준 방정식은 단일 펩티드 상의 다수의 접합 부위를 설명하지 않는다.

안정한 동위원소 표지 (SIL)는 무거운 동위원소 원자를 관심 분석물 내로 혼입시키는 과정이며, 이는 질량 변화를 유발하고, 이는 이어서 질량 분광측정법에 의해 검출될 수 있다. SIL 펩티드 맵핑은 차등 표지된 샘플에서 단백질의 상대 정량화를 제공하기 위한 단백질체학 분야에서의 대중적인 방법이지만 (Liu et al., Advances and applications of stable isotope labeling-based methods for proteome relative quantitation. Trends in Anal. Chem. 2020, 124, 115815), 또한 단백질 PTM 특징화에도 적용되었다. 문헌 [Liu et al. (Accurate Determination of Protein Methionine Oxidation by Stable Isotope Labeling and LC-MS Analysis. Anal. Chem. 2013, 85, 11705-11709)]은 mAb 샘플을 산소-18 과산화수소와 반응시켜 관심 메티오닌을 완전히 산화시킴으로써 메티오닌 산화 수준을 조사하였다. 이어서, 동위원소 피크 면적을 사용하여 천연 (+16 Da) 및 SIL (+18 Da) 버전의 산화된 펩티드 사이의 상대 정량화를 수행하였다.

따라서, 관련 기술분야에서 ADC에 대한 개선된 분석 방법을 제공할 필요가 존재한다.

본 개시내용의 제1 측면에 따르면,

(i) 카르보닐 기를 함유하는 동위원소-표지된 세포독소 및 환원제를 사용하여 시스테인-접합된 항체 약물 접합체 (ADC)의 비점유된 시스테인 부위에 접합시켜 동위원소-표지된 ADC 샘플을 생성하는 단계; 및

(ii) 샘플을 펩티드 맵핑하는 단계

를 포함하는 방법 (예를 들어, 분석 방법)이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 56% 내지 약 80%이고/거나, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 58% 내지 약 81%이고/거나, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 15% 내지 약 46%이고/거나, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 11% 내지 약 15%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 약 5.9 내지 약 6.5의 pH에서 약 20 mg/mL 내지 약 60 mg/mL의 ADC, 약 10 mM 내지 약 30 mM의 시트레이트 완충제, 약 120 mM 내지 약 240 mM의 트레할로스, 약 0.01 mM 내지 약 0.1 mM의 EDTA, 약 0.01% 내지 약 0.05%의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물을 포함하는 제제가 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 제제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 암의 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 제제가 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 암의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서의 본원에 개시된 바와 같은 조성물의 용도가 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 항체 약물 접합체를 환원시켜 환원된 항체 약물 접합체를 형성하는 단계; 환원된 항체 약물 접합체를 동위원소-표지된 세포독소와 접합시켜 동위원소-표지된 항체 약물 접합체를 형성하는 단계; 동위원소-표지된 항체 약물 접합체로부터 동위원소-표지된 접합된 펩티드를 생성하고, 동위원소-표지된 접합된 펩티드에 대해 펩티드 맵핑을 수행하는 단계; 동위원소-표지된 접합된 펩티드에 대한 질량-대-전하 비를 검출하는 단계; 및 동위원소-표지된 접합된 펩티드의 질량-대-전하 비를 동위원소-표지되지 않은 접합된 펩티드에 대한 질량-대-전하 비와 비교하여 시스테인-접합된 항체 약물 접합체의 접합 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 시스테인-접합된 항체 약물 접합체의 접합 수준을 결정하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 세포독소는 MMAF 또는 MMAE이다. 또 다른 실시양태에서, 시스테인-접합된 항체 약물 접합체를 먼저 환원제에 의해 환원시킨 다음, 동위원소-표지된 세포독소와 접합시킨다. 한 실시양태에서, 환원제는 디티오트레이톨 (DTT) 또는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)이다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드 맵핑 전에 크기 배제 크로마토그래피 칼럼을 통해 샘플을 용리시킴으로써 과량의 환원제를 제거한다. 또 다른 실시양태에서, 접합은 시스테인-접합된 항체 약물 접합체를 동위원소-표지된 세포독소와 반응시킴으로써 일어난다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드 맵핑 전에 크기 배제 크로마토그래피 칼럼을 통해 샘플을 용리시킴으로써 과량의 동위원소-표지된 세포독소를 제거한다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드 맵핑은 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광측정법 (LC-MS/MS) 분석을 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 맵핑은 샘플을 변성시키고, 나머지 디술피드 결합을 환원시키고, 생성된 유리 술프히드릴을 알킬화하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드 맵핑은 샘플을 효소적으로 소화시켜 동위원소-표지된 접합된 펩티드를 생성하고, 임의로 효소적 소화물을 강산의 첨가에 의해 켄칭하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포독소를 동위원소-표지된 물과 반응시켜 동위원소-표지된 세포독소를 생성하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세포독소를 아세토니트릴 중에서 동위원소-표지된 물과 반응시킨다. 또 다른 실시양태에서, 시스테인-접합된 항체 약물 접합체는 벨란타맙 마포도틴이다.

도 1은 안정한 동위원소 표지된 MMAF의 UV 크로마토그램 및 MS 스펙트럼을 도시한다.
도 2는 안정한 동위원소 표지 전 및 후의 벨란타맙 마포도틴 경쇄 및 중쇄에 대한 환원 LC-MS 스펙트럼을 도시한다.
도 3은 벨란타맙 마포도틴 중 약물-로딩된 종의 불균질 혼합물의 개략적 표현을 도시한다.
도 4는 표준 및 안정한 동위원소 표지된 펩티드 맵핑으로부터 검출된 경쇄, 중쇄 fab 및 중쇄 힌지 피크에 대한 XIC를 비교한다.
도 5는 표지 및 비표지된 접합된 경쇄 펩티드에 대한 대표적인 MS 스펙트럼을 도시한다. 동위원소이성질체 기여도를 계산하는 데 사용된 천연 동위원소 비가 표지된다.
도 6은 표지 및 비표지된 접합된 중쇄 Fab 펩티드에 대한 대표적인 MS 스펙트럼을 도시한다. 동위원소이성질체 기여도를 계산하는 데 사용된 천연 동위원소 비가 표지된다.
도 7은 표지 및 비표지된 접합된 중쇄 힌지 펩티드에 대한 대표적인 MS 스펙트럼을 도시한다. 동위원소이성질체 기여도를 계산하는 데 사용된 천연 동위원소 비가 표지된다.
도 8은 모든 접합 부위에 대한 표준 및 안정한 동위원소 표지된 펩티드 맵핑 사이의 선형성 반응 곡선을 비교한다.
도 9는 벨란타맙 마포도틴 선형성 샘플에 대한 표준 및 SIL 펩티드 맵핑 계산된 DAR 및 이론적 DAR을 비교한다.
도 10은 벨란타맙 마포도틴 차등 DAR 샘플에 대한 접합 값을 도시한다.
도 11은 벨란타맙 마포도틴 차등 DAR 샘플에 대한 SIL 펩티드 맵핑 계산된 DAR 및 이론적 HIC DAR을 비교한다.
도 12는 약물-로드 분획을 수집하는 데 사용된 분석용 및 정제용-규모 소수성 상호작용 크로마토그래피 트레이스를 도시한다.
도 13은 정제된 DL0, DL2, DL4a, DL4b, DL6 및 DL8의 대표적인 NR-CGE 전기영동도를 나타낸다.
도 14는 정제된 DL0, DL2, DL4a, DL4b, DL6 및 DL8 약물-로드 변이체의 무손상 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 15는 정제된 DL0, DL2, DL4a, DL4b, DL6 및 DL8 약물-로드 변이체의 중쇄 (a) 및 경쇄 (b)의 환원 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 16은 정제된 DL0, DL2, DL4a, DL4b, DL6 및 DL8 약물-로드 변이체의 모세관 시차 주사 열량측정 (DSC) 트레이스를 보여준다.

안정한 동위원소 표지 (SIL) 펩티드 맵핑 방법

용어 "약" 또는 "대략"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정한 값에 대한 허용 오차 범위 내를 의미할 수 있으며, 이는 부분적으로 값이 측정 또는 결정되는 방식, 예를 들어 측정 시스템의 한계에 좌우될 것이다.

예를 들어, "약"은 관련 기술분야의 실시에 따라 플러스 또는 마이너스 10%를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 플러스 또는 마이너스 20%, 플러스 또는 마이너스 10%, 플러스 또는 마이너스 5% 또는 플러스 또는 마이너스 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 상기 용어는 값의 한 자릿수 이내, 5배 이내 또는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정한 값이 본 출원 및 청구범위에 기재되는 경우에, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 특정한 값에 대한 허용 오차 범위 내를 의미하는 것으로 가정되어야 한다. 또한, 값의 범위 및/또는 하위범위가 제공되는 경우에, 범위 및/또는 하위범위는 범위 및/또는 하위범위의 종점을 포함할 수 있다.

본 개시내용은 안정한 동위원소 표지 펩티드 맵핑 LC-MS/MS 분석을 사용하여 소분자 페이로드, 예를 들어 세포독소와 시스테인-접합된 항체 약물 접합체의 부위-특이적 접합 수준을 결정하는 방법을 제공한다.

본 개시내용의 제1 측면에 따르면,

(ii) 샘플을 펩티드 맵핑하는 단계

를 포함하는 분석 방법이 제공된다.

한 실시양태에서, 세포독소는 카르보닐 기, 예를 들어 이중 결합을 갖는 카르보닐 산소를 함유한다.

한 실시양태에서, 세포독소는 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF) 또는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)이다.

효소적 소화물의 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광측정법 (LC-MS/MS) 분석 (펩티드 맵핑)은, 단백질 서열을 특징화하고, 천연 및 변형된 버전의 펩티드 사이의 상대 정량화를 수행함으로써 생물제약품의 PTM을 정량화하는 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 분석 방법이다. 본원에 기재된 분석 방법은 비점유된 시스테인 부위를 안정한 동위원소-표지된 세포독소와 접합시켜 동일한 체류 시간 및 최소의 질량 및 소수성 차이를 갖는 펩티드 쌍을 생성하여, 하나의 다중-속성 분석 방법 (MAM)에서 다른 모니터링된 번역후 변형 (PTM)과 병행하여 상대 정량화를 허용함으로써, 선행 기술의 방법과 연관된 차등 이온화 효율 문제를 감소 (제거 포함)시킨다.

안정한 동위원소 표지 (SIL)는 무거운-동위원소 원자 (예를 들어, 탄소-13, 질소-15, 산소-18)를 관심 분석물 내로 혼입시키는 과정이며, 이는 질량 변화를 유발하고, 이는 질량 분광측정법에 의해 검출될 수 있다. 본원에 기재된 펩티드 맵핑 방법은 이용가능한 접합 부위를 동위원소 표지된 세포독소로 표지하여 동일한 체류 시간 및 최소의 질량 차이를 갖는 접합-부위 펩티드 쌍을 생성함으로써 펩티드 차등 이온화 효율 문제를 감소 (제거 포함)시킨다. 이 방법은 정확한 부위-특이적 접합 수준 정량화를 허용하고, 하나의 다중-속성 분석 방법 (MAM)에서 단백질 서열 및 PTM 특징화와 병행하여 "상향식(bottom-up)" DAR 특징화의 제1의 공지된 예를 제공한다.

한 실시양태에서, 분석 방법은 세포독소를 동위원소-표지된 물 (예를 들어, H₂ ¹⁸O)과 반응시켜 동위원소-표지된 세포독소를 생성하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 동위원소 표지된 물은 카르보닐 기를 함유하는 세포독소 (이중 결합을 갖는 산소, 예를 들어 케톤)와의 용매 교환을 겪어 동위원소 표지된 세포독소를 생성한다. 반응은 실온 또는 37℃에서 일어날 수 있다. 반응 시간은 2일 내지 수주에 일어날 수 있다. 한 실시양태에서, 반응 시간은 7일 내지 14일이다.

한 실시양태에서, 세포독소는 동위원소 표지된 물과의 반응 전에 유기 용매, 예를 들어 아세토니트릴 (ACN) 중에 용해된다. 한 실시양태에서, ACN 중 세포독소는 H₂ ¹⁸O와 반응하여 동위원소-표지된 세포독소를 생성한다. 또 다른 실시양태에서, ACN 중 MMAF 또는 MMAE는 H₂ ¹⁸O와 반응하여 동위원소-표지된 MMAF 또는 MMAE를 생성한다. 특정한 실시양태에서, 세포독소는 강산성 조건 하에 동위원소-표지된 물과 반응한다. 산은 TFA 또는 포름산을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 표지된 분자의 동위원소 순도는 동위원소-표지된 세포독소를 이온화하고 그와 연관된 질량-대-전하 비를 검출함으로써 평가될 수 있다.

한 실시양태에서, 시스테인-접합된 항체 약물 접합체 (ADC)의 비점유된 시스테인 부위는 동위원소-표지된 세포독소와 접합된다.

특정한 실시양태에서, 환원제는 동위원소-표지된 세포독소와의 접합 전에 ADC 쇄간 디술피드 결합을 환원시켜 유리 술프히드릴 기 (예를 들어, 비점유된 시스테인 부위)를 생성하는 데 사용된다. 이어서, 유리 술프히드릴 기는 동위원소-표지된 세포독소와의 접합에 이용가능하다. 따라서, 한 실시양태에서, ADC는 먼저 환원제에 의해 환원된 다음, 동위원소-표지된 세포독소와 접합된다.

한 실시양태에서, 환원제는 쇄간 디술피드 결합을 환원시킬 수 있는 임의의 화합물 또는 시약이다. 특정 실시양태에서, 환원제는 디티오트레이톨 (DTT), 2-메르캅토에탄올 및/또는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)이다. 추가 실시양태에서, 환원제는 DTT이다. 대안적 실시양태에서, 환원제는 TCEP이다. 추가의 환원제가 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.

환원제는 쇄간 디술피드 결합을 환원시키기 위해 적용된다. 한 실시양태에서, 환원제는 전부는 아니더라도 대부분의 디술피드 결합 부위의 후속 표지를 보장하기 위해 쇄간 디술피드 결합의 완전한 환원을 보장하도록 과량으로 적용된다. 환원제의 양의 최적화 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 환원제의 농도는 쇄내 디술피드 결합이 환원될 때까지 증가하는 양으로 첨가될 수 있으며, 이는 환원 반응 후에 분리된 중쇄 및 경쇄를 측정함으로써 검출될 수 있다. 쇄간 디술피드 결합의 완전한 환원이 일어나지 않으면, 디술피드 결합의 일부는 세포독소로 표지되지 않을 것이고 (천연이거나 또는 동위원소 표지됨), 천연 세포독소의 인위적으로 더 높은 정량화를 제공할 수 있다.

한 실시양태에서, 과량의 환원제는 접합 전에 제거된다. 특정 실시양태에서, 환원제는 후속 접합 단계를 방해하여, 접합 전에 과량의 환원제의 제거를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 과량의 환원제는 크기 배제 크로마토그래피 칼럼을 통해 샘플을 용리시킴으로써 제거된다. 또 다른 실시양태에서, 과량의 환원제는 분자량 컷오프 (MWCO) 필터에 의해 제거된다. 추가 실시양태에서, 과량의 환원제는 동위원소-표지된 세포독소와의 접합 전에 제거된다.

한 실시양태에서, 접합은 ADC를 동위원소-표지된 세포독소와 반응시킴으로써 일어난다. 반응은, 예를 들어 ADC 및 동위원소-표지된 세포독소를 실온에서 또는 약 37℃에서 혼합함으로써 일어날 수 있다. 반응 시간은 최적화될 수 있다. 한 실시양태에서, 반응 시간은 5분 내지 약 60분이다. 한 실시양태에서, 동위원소 표지된 세포독소는 동위원소 표지된 MMAF 또는 MMAE이다. 한 실시양태에서, ADC 대 표지된 세포독소의 비는 세포독소가 없는 디술피드 결합 (천연이거나 또는 동위원소 표지됨)이 없도록 보장하기 위해 최적화되며, 예를 들어 모든 생성된 ADC는 8의 약물 로드 (DL8)를 가져야 한다. ADC 약물 로드를 시험하기 위한 다양한 방법이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

한 실시양태에서, 과량의 동위원소-표지된 세포독소 (항체에 접합되지 않음)는 펩티드 맵핑 전에 제거된다. 한 실시양태에서, 과량의 동위원소-표지된 세포독소 (항체에 접합되지 않음)는 펩티드 맵핑 전에 크기 배제 크로마토그래피 칼럼을 통해 샘플을 용리시킴으로써 제거된다.

한 실시양태에서, 접합 후에, 동위원소-표지된 세포독소 및 동위원소-표지되지 않은 세포독소 (예를 들어, "천연 세포독소")의 혼합물을 갖는 ADC 샘플이 생성된다.

또 다른 실시양태에서, 동위원소-표지된 세포독소와의 접합 후에, ADC 샘플의 펩티드 맵핑, 예를 들어 LC-MS/MS 분석을 통한 펩티드 맵핑이 수행된다. 이 단계는 동위원소-표지된 항체 약물 접합체를 변성시키고, 모든 나머지 디술피드 결합을 환원시키고, 생성된 유리 술프히드릴을 알킬화하고, 샘플을 효소적으로 소화시키고, 샘플을 질량 분광측정법에 의해 분석하는 것을 수반한다. 다양한 펩티드 맵핑 방법이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Analytical Biochemistry 266, 31-47 (1999)]에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 변성제는, 예를 들어 구아니딘 HCl, 우레아, 또는 후속 환원을 위해 모든 디술피드간 및 디술피드내 결합을 개방하는 임의의 변성제를 포함할 수 있다. 환원제의 예는 TCEP 및 DTT를 포함할 수 있다. 환원 후, 디술피드 결합이 재형성되지 않도록 보장하기 위해 샘플에 알킬화제가 적용될 수 있다. 예시적인 알킬화제는 소듐 아이오도아세테이트를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 효소적 소화 전에, 잔류 변성제는, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 효소의 첨가 전에 제거될 수 있다. 특정 실시양태에서, 샘플의 펩티드는 효소적으로 소화된다. 예시적인 효소는 트립신 또는 Lys-C를 포함할 수 있다. 샘플의 효소적 소화는 강산, 예컨대 HCl 또는 TFA의 첨가에 의해 켄칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생성된 펩티드는 이어서 이온화되고, 천연 (동위원소 표지되지 않은) 및 동위원소-표지된 접합된 펩티드와 연관된 질량-대-전하 비가 검출 및 비교된다.

항체 약물 접합체

본원에 기재된 분석 방법은 카르보닐 기를 함유하는 세포독소, 예를 들어 MMAF 또는 MMAE를 포함하는 ADC를 분석하는 데 특히 매우 적합하다. 한 실시양태에서, ADC는 항-BCMA ADC이다. 추가 실시양태에서, 항-BCMA ADC는 벨란타맙 마포도틴이다. 벨란타맙 마포도틴은 말레이미도카프로일 (MC) 링커에 의해 MMAF 세포독성제에 연결된 항-BCMA 항체를 포함한다.

본 개시내용은 또한 항-BCMA 항체 약물 접합체 (ADC)를 포함하는 조성물 및 BCMA-매개된 질환 또는 장애를 치료하는 관련 방법을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같은 항-BCMA ADC를 포함하는 조성물은 또한 본원에 기재된 바와 같은 항-BCMA ADC의 집단으로 지칭될 수 있으며: 어구는 상호교환가능하다는 것이 이해될 것이다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및/또는 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 7에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및/또는 서열식별번호: 8에 따른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 9에 따른 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (HC); 및/또는 서열식별번호: 10에 따른 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (LC)를 포함한다.

본 개시내용의 한 측면에서, 본원에 기재된 분석 방법은 항체 (예를 들어, 벨란타맙) 상의 세포독성제의 특정 아미노산 잔기 위치뿐만 아니라 각각의 아미노산 잔기에서의 세포독소의 정량적 양을 결정할 수 있다. 한 실시양태에서, 세포독소는 시스테인 함유 아미노산, 예를 들어 경쇄 (LC) C214, 중쇄 (HC) C224, 중쇄 힌지 영역 (HC 힌지) C230 및/또는 중쇄 힌지 영역 (HC 힌지) C233에 접합된다. 한 실시양태에서, 중쇄 힌지 영역은 C230 및 C233 둘 다에 2개의 세포독소 분자를 함유한다. 이는 본원에서 "HC 힌지 DL2"로 지칭될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중쇄 힌지 영역은 C230 또는 C233에 1개의 세포독소 분자를 함유한다. 이는 본원에서 "HC 힌지 DL1"로 지칭될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 HC 힌지 DL2와 HC 힌지 DL1 이소형 사이를 구별할 수 있다. HC 힌지 DL1 이소형이 검출되는 경우에, 본원에 기재된 방법은 HC 힌지 DL1 이소형의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 9 (CDR은 밑줄표시됨; HC C224, HC C230 및 HC C233은 볼드체/밑줄표시됨)의 중쇄 서열을 포함하는 벨란타맙이다:

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 10 (CDR은 밑줄표시됨; LC C214는 볼드체/밑줄표시됨)의 경쇄 서열을 포함하는 벨란타맙이다:

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 2.1이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 38% 내지 약 44%이고/거나, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 40% 내지 약 46%이고/거나, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 5% 내지 약 9%이고/거나, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 3% 내지 약 7%인 조성물이 제공된다.

따라서, 본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 9의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 10의 경쇄 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE (특히, MMAF)이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 2.1이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 41%이고/거나, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 43%이고/거나, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 7%이고/거나, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 5%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 3.0이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 53% 내지 약 59%이고/거나, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 55% 내지 약 61%이고/거나, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 13% 내지 약 19%이고/거나, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 8% 내지 약 14%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 9의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 10의 경쇄 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE (특히, MMAF)이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 3.0이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 56%이고/거나, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 58%이고/거나, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 16%이고/거나, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 11%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 3.5이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 60% 내지 약 66%이고/거나, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 62% 내지 약 68%이고/거나, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 20% 내지 약 26%이고/거나, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 8% 내지 약 14%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 9의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 10의 경쇄 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE (특히, MMAF)이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 3.5이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 63%이고/거나, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 65%이고/거나, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 23%이고/거나, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 11%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 4.0이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 65% 내지 약 71%이고/거나, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 68% 내지 약 74%이고/거나, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 24% 내지 약 30%이고/거나, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 12% 내지 약 18%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 9의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 10의 경쇄 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE (특히, MMAF)이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 4.0이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 68%이고/거나, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 71%이고/거나, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 27%이고/거나, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 15%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 4.6이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 72% 내지 약 78%이고/거나, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 73% 내지 약 79%이고/거나, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 37% 내지 약 43%이고/거나, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 13% 내지 약 19%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 9의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 10의 경쇄 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE (특히, MMAF)이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 4.6이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 75%이고/거나, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 76%이고/거나, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 40%이고/거나, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 16%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체를 포함하며, 여기서 항체 (예를 들어, 벨란타맙)는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 5.0이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 75% 내지 약 81%이고/거나, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 77% 내지 약 83%이고/거나, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 43% 내지 약 49%이고/거나, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 11% 내지 약 17%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 9의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 10의 경쇄 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE (특히, MMAF)이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 5.0이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 78%이고/거나, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 80%이고/거나, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 46%이고/거나, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 14%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 5.7이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 81% 내지 약 87%이고/거나, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 82% 내지 약 88%이고/거나, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 56% 내지 약 61%이고/거나, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 10% 내지 약 16%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 9의 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 10의 경쇄 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE (특히, MMAF)이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 5.7이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 84%이고/거나, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 85%이고/거나, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 58%이고/거나, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 13%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 56% 내지 약 80%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 58% 내지 약 81%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 15% 내지 약 46%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 11% 내지 약 15%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 56% 내지 약 80%이고, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 58% 내지 약 81%이고, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 15% 내지 약 46%이고, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 11% 내지 약 15%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 3 내지 약 5이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 56% 내지 약 80%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 3 내지 약 5이고, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 58% 내지 약 81%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 3 내지 약 5이고, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 15% 내지 약 46%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 3 내지 약 5이고, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 11% 내지 약 15%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 3 내지 약 5이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 56% 내지 약 80%이고, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 58% 내지 약 81%이고, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 15% 내지 약 46%이고, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 11% 내지 약 15%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 63% 내지 약 76%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 65% 내지 약 78%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 22% 내지 약 40%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 11% 내지 약 16%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 63% 내지 약 76%이고, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 65% 내지 약 78%이고, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 22% 내지 약 40%이고, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 11% 내지 약 16%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 3.5 내지 약 4.6이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 63% 내지 약 76%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 3.5 내지 약 4.6이고, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 65% 내지 약 78%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 3.5 내지 약 4.6이고, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 22% 내지 약 40%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 3.5 내지 약 4.6이고, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 11% 내지 약 16%인 조성물이 제공된다.

본 개시내용의 추가 측면에 따르면, 세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체 (예를 들어, 벨란타맙)를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 평균 약물-항체 비 (DAR)는 약 3.5 내지 약 4.6이고, LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 63% 내지 약 76%이고, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 65% 내지 약 78%이고, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 22% 내지 약 40%이고, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 11% 내지 약 16%인 조성물이 제공된다.

본원에 기재된 조성물 중 항-BCMA ADC는, 예를 들어 B-세포 매개된 암, 예컨대 림프종 및 다발성 골수종을 포함한 다양한 BCMA-매개된 질환의 치료 및/또는 예방에 유용할 수 있다. 본원에 기재된 항-BCMA ADC는 인간 BCMA, 예를 들어 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 Q02223.2의 아미노산 서열을 함유하는 인간 BCMA 또는 그에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 상동성 또는 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 BCMA 단백질에 결합할 수 있다.

항-BCMA ADC는 항-BCMA 항원 결합 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항원 결합 단백질"은 항체, 항체 단편 및 항원에 결합할 수 있는 다른 단백질 구축물, 예를 들어 BCMA, 예를 들어 인간 BCMA에 결합할 수 있는 항-BCMA 항원 결합 단백질을 지칭한다. 항원 결합 단백질은 천연 항체 또는 그의 기능적 단편 또는 등가물의 구조로 포맷화될 수 있는 본 개시내용의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 항원 결합 단백질은 적절한 경쇄와 쌍형성되는 경우에 전장 항체, (Fab')2 단편, Fab 단편 또는 그의 등가물 (예컨대 scFV, 비-, 트리- 또는 테트라-바디, 탠드Ab 등)로 포맷화되는 본 개시내용의 V_H 영역을 포함할 수 있다. 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4; 또는 IgM; IgA, IgE 또는 IgD 또는 그의 변형된 변이체일 수 있다. 항체 중쇄의 불변 도메인은 이에 따라 선택될 수 있다. 경쇄 불변 도메인은 카파 또는 람다 불변 도메인일 수 있다. 추가로, 항원 결합 단백질은 모든 부류의 변형, 예를 들어 IgG 이량체, 더 이상 Fc 수용체에 결합하지 않거나 C1q 결합을 매개하지 않는 Fc 돌연변이체를 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 또한 항원 결합 영역 및 비-이뮤노글로불린 영역을 포함하는 WO86/01533에 기재된 유형의 키메라 항체일 수 있다.

항원 결합 단백질은 dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니안티바디 또는 미니바디일 수 있다. 항원 결합 단백질은 완전 인간, 인간화 또는 키메라 항체일 수 있다. 항원-결합 단백질은 인간화된 항체일 수 있다. 항원-결합 단백질은 모노클로날 항체일 수 있다.

예시적인 항-BCMA 항원 결합 단백질 및 그의 제조 방법은 국제 공개 번호 WO2012/163805에 개시되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 추가의 예시적인 항-BCMA 항원 결합 단백질은 WO2016/014789, WO2016/090320, WO2016/090327, WO2016/020332, WO2016/079177, WO2014/122143, WO2014/122144, WO2017/021450, WO2016/014565, WO2014/068079, WO2015/166649, WO2015/158671, WO2015/052536, WO2014/140248, WO2013/072415, WO2013/072406, WO2014/089335, US2017/165373, WO2013/154760 및 WO2017/051068에 기재된 것을 포함하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-BCMA 항원 결합 단백질은 BCMA 수용체에 대한 BAFF 및/또는 APRIL의 결합을 억제할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-BCMA 항원 결합 단백질은 FcγRIIIA에 결합할 수 있거나 또는 FcγRIIIA 매개된 이펙터 기능을 할 수 있다.

항-BCMA 항원 결합 단백질은 항체 ("항-BCMA 항체")를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 이뮤노글로불린-유사 도메인을 갖는 분자 (예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE)를 지칭하고, 이러한 유형의 모노클로날, 재조합, 폴리클로날, 키메라, 인간 및 인간화 분자를 포함할 수 있다. 모노클로날 항체는 항체를 발현하는 진핵 세포 클론 또는 원핵 유사 세포에 의해 생산될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 세포 내로 도입함으로써 이들 쇄를 재조합적으로 발현할 수 있는 진핵 세포주에 의해 생산될 수 있다. 상이한 진핵 세포주, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포, 하이브리도마 또는 동물 (예를 들어, 인간)로부터 유래된 불멸화 항체 세포로부터 항체를 생산하는 예시적인 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.

항체는, 예를 들어 래트, 마우스, 영장류 (예를 들어, 시노몰구스, 구세계 원숭이 또는 대형 유인원), 인간 또는 다른 공급원, 예컨대 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 분자 생물학 기술을 사용하여 생성된, 항체 분자를 코딩하는 핵산으로부터 유래될 수 있다.

항체는 임의의 이소형 또는 하위부류의 것일 수 있는 불변 영역을 포함할 수 있다. 불변 영역은 IgG 이소형, 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄ 또는 그의 변이체의 것일 수 있다.

항원 결합 단백질은, 예를 들어 항원 결합 단백질이 항체인 경우에 항체가 증진된 이펙터 기능/ADCC 및/또는 보체 활성화를 갖도록 돌연변이된 불변 도메인을 비롯하여, 1종 이상의 변형을 포함할 수 있다.

항-BCMA 항체는 증진된 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 활성 (ADCC) 이펙터 기능을 가질 수 있다. 본원에 사용된 용어 "이펙터 기능"은 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 활성 (ADCC), 보체-의존성 세포독성 활성 (CDC) 매개된 반응, Fc-매개된 식세포작용 및/또는 FcRn 수용체를 통한 항체 재순환 중 1종 이상을 지칭하는 것으로 의도된다. IgG 항체의 경우, 이펙터 기능성은 ADCC를 포함할 수 있고, ADCP는 중쇄 불변 영역과 면역 세포의 표면 상에 존재하는 Fcγ 수용체의 패밀리와의 상호작용에 의해 매개될 수 있다. 인간에서, 이들은 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)을 포함할 수 있다. 항원에 결합된 항원 결합 단백질과 Fc/Fcγ 복합체의 형성 사이의 상호작용은 세포독성, 면역 세포 활성화, 식세포작용 및/또는 염증성 시토카인의 방출을 포함한 다양한 효과를 유도할 수 있다.

항-BCMA 항체는 BCMA 수용체에 대한 BAFF 및/또는 APRIL의 결합을 억제할 수 있다. 항-BCMA 항체는 FcγRIIIA에 결합할 수 있거나 또는 FcγRIIIA 매개된 이펙터 기능을 할 수 있다.

항-BCMA 항체는 2개의 이뮤노글로불린 (Ig) 중쇄 ("HC") 및 2개의 Ig 경쇄 ("LC")를 포함할 수 있다. 기본 항체 구조 단위는, 예를 들어 서브유닛의 사량체를 포함할 수 있다. 각각의 사량체는 2쌍의 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있으며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함할 수 있다. 이러한 가변 영역은 초기에 절단가능한 신호 펩티드에 연결되어 발현될 수 있다. 신호 펩티드가 없는 가변 영역은 성숙 가변 영역으로 지칭될 수 있다. 따라서, 한 예에서, 경쇄 성숙 가변 영역은 경쇄 신호 펩티드가 없는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 각각의 쇄의 카르복시-말단 부분은 불변 영역을 정의할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 주로 이펙터 기능을 담당할 수 있다.

각각의 경쇄/중쇄 쌍의 성숙 가변 영역은 항체 결합 부위 (또한 항원 결합 부위로도 지칭됨)를 형성할 수 있다. "항원 결합 부위"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 상의 부위를 지칭하며, 이는 단일 가변 도메인일 수 있거나 또는 표준 항체 상에서 발견될 수 있는 바와 같이 쌍형성된 V_H/V_L 도메인일 수 있다. 따라서, 무손상 항체는, 예를 들어 2개의 결합 부위를 가질 수 있다. 이중기능적 또는 이중특이적 항체를 제외하고, 2개의 결합 부위는 동일할 수 있다. 쇄는 모두 상보성 결정 영역 또는 "CDR"로도 또한 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR)의 동일한 일반 구조를 나타낼 수 있다. 각각의 쌍의 2개의 쇄로부터의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 정렬될 수 있으며, 이는 특이적 에피토프에 대한 결합을 가능하게 한다. 따라서, 한 예에서, N-말단에서 C-말단으로, 경쇄 및 중쇄 둘 다는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다.

"CDR"은 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로서 정의된다. 이들은 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역이다. 이뮤노글로불린의 가변 부분에 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR (또는 CDR 영역)이 존재한다. 따라서, 본원에 사용된 "CDR"은 모든 3개의 중쇄 CDR, 모든 3개의 경쇄 CDR, 모든 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 적어도 2개의 CDR을 지칭한다. 한 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 1개 이상의 CDR 또는 본원에 기재된 바와 같은 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 항-BCMA 항체를 포함한다.

용어 "변이체", "항체 변이체", "CDR 변이체" 및 "번역후 변형 변이체"는 항체 서열에서의 적어도 1개의 아미노산 변화를 지칭한다. 변이체는 번역후 변형, 화학적 변화 또는 적어도 1개의 결실, 치환 또는 부가를 통한 서열 변화의 결과일 수 있다. 일부 번역후 변형은 서열을 변화시키지 않는 화학적 변화 (예를 들어, Met 및 산화된 Met; 또는 Asp 및 이성질체화된/이소-Asp; 또는 응집)를 유발하는 반면, 다른 것은 서열 변화, 예컨대 하나의 아미노산 잔기의 또 다른 것으로의 전환 (예를 들어, 탈아미드화를 통한 Asn의 Asp로의 전환; 또는 리신 결실)을 유발한다. 추가의 번역후 변형 변이체가 하기에 기재된다. 서열 변화를 포함하는 변이체 항체 서열은 설계된 서열 변화 또는 번역후 변형의 결과일 수 있다. 아미노산 서열 변화는 결실, 치환 또는 부가일 수 있다.

하나의 이러한 실시양태에서, 치환은 보존적 치환이다. 대안적 실시양태에서, 항체 변이체는 적어도 1개의 치환을 포함하고, 항원 결합 단백질의 정규 구조를 유지한다. 한 실시양태에서, 항체 변이체는 모 항체의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일하다 (예를 들어, 아미노산 서열 동일성을 갖는다). 또 다른 실시양태에서, 항체 변이체는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일한 중쇄 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일한 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

항원 결합 단백질은 FcRn에 대한 불변 도메인 또는 그의 단편의 친화도를 증가시키는 아미노산 변형 (예를 들어, 아미노산 치환)을 가질 수 있다. 치료적 및 진단적 IgG 항체 및 다른 생물활성 분자의 반감기 (예를 들어, 혈청 반감기)를 증가시키는 것은 이들 분자의 투여의 양 및/또는 빈도를 감소시키는 것을 비롯하여, 많은 이익을 갖는다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 하기 아미노산 변형 중 1종 이상을 갖는 IgG 불변 도메인의 전부 또는 부분 (FcRn 결합 부분)을 포함한다.

예를 들어, IgG1과 관련하여, M252Y/S254T/T256E (통상적으로 "YTE"로 지칭됨) 및/또는 M428L/N434S (통상적으로 "LS"로 지칭됨) 변형은 pH 6.0에서 FcRn 결합을 증가시킨다 (Wang et al. 2018).

반감기는 또한 T250Q/M428L, V259I/V308F/M428L, N434A 및 T307A/E380A/N434A 변형 (IgG1과 관련하여 및 카바트 넘버링)에 의해 증진될 수 있다 (Monnet et al.).

반감기 및 FcRn 결합은 또한 H433K 및 N434F 변형 (통상적으로 "HN" 또는 "NHance"로 지칭됨) (IgG1과 관련하여)을 도입함으로써 연장될 수 있다 (WO2006/130834).

WO00/42072는 변경된 FcRn 결합 친화도를 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드로서, Fc 영역의 아미노산 위치 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 및 447 (EU 인덱스 넘버링) 중 어느 1개 이상에서의 아미노산 변형을 포함하는 폴리펩티드를 개시한다.

WO02/060919는 야생형 IgG 불변 도메인에 비해 1개 이상의 아미노산 변형을 포함하는 IgG 불변 도메인을 포함하는 변형된 IgG로서, 여기서 변형된 IgG는 야생형 IgG 불변 도메인을 갖는 IgG의 반감기와 비교하여 증가된 반감기를 갖고, 여기서 1개 이상의 아미노산 변형은 위치 251, 253, 255, 285-290, 308-314, 385-389 및 428-435 중 1개 이상에서의 것인 변형된 IgG를 개시한다.

문헌 [Shields et al. (2001, J Biol Chem; 276:6591-604)]은 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 사용하여 인간 IgG1 항체의 Fc 영역 내의 잔기를 변경시킨 다음, 인간 FcRn에 대한 결합을 평가하였다. 알라닌으로 변화되는 경우 FcRn에 대한 결합을 효과적으로 제거하는 위치는 I253, S254, H435 및 Y436을 포함한다. 하기와 같은 다른 위치는 결합에서 덜 현저한 감소를 나타냈다: E233-G236, R255, K288, L309, S415 및 H433. 여러 아미노산 위치는 알라닌으로 변화된 경우 FcRn 결합에서 개선을 나타냈으며; 이들 중에서 주목할 만한 것은 P238, T256, E272, V305, T307, Q311, D312, K317, D376, E380, E382, S424 및 N434이다. 많은 다른 아미노산 위치는 FcRn 결합에서 약간의 개선 (D265, N286, V303, K360, Q362 및 A378) 또는 변화 없음 (S239, K246, K248, D249, M252, E258, T260, S267, H268, S269, D270, K274, N276, Y278, D280, V282, E283, H285, T289, K290, R292, E293, E294, Q295, Y296, N297, S298, R301, N315, E318, K320, K322, S324, K326, A327, P329, P331, E333, K334, T335, S337, K338, K340, Q342, R344, E345, Q345, Q347, R356, M358, T359, K360, N361, Y373, S375, S383, N384, Q386, E388, N389, N390, K392, L398, S400, D401, K414, R416, Q418, Q419, N421, V422, E430, T437, K439, S440, S442, S444 및 K447)을 나타냈다.

개선된 FcRn 결합과 관련하여 가장 현저한 효과가 조합 변이체에 대해 발견되었다. pH 6.0에서, E380A/N434A 변이체는 천연 IgG1에 비해 FcRn에 대해, E380A의 경우 2배 및 N434A의 경우 3.5배와 비교하여 8배 초과로 더 우수한 결합을 나타냈다. 여기에 T307A를 부가하는 것은 천연 IgG1에 비해 12배 개선된 결합을 유발하였다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 항원 결합 단백질은 E380A/N434A 치환을 포함하고, FcRn에 대한 증가된 결합을 갖는다.

문헌 [Dall'Acqua et al. (2002, J Immunol.;169:5171-80)]은 마우스 FcRn에 대한 인간 IgG1 힌지-Fc 단편 파지 디스플레이 라이브러리의 무작위 돌연변이유발 및 스크리닝을 기재한다. 이들은 위치 251, 252, 254-256, 308, 309, 311, 312, 314, 385-387, 389, 428, 433, 434 및 436의 무작위 돌연변이유발을 개시하였다. IgG1-인간 FcRn 복합체 안정성의 주요 개선은 Fc-FcRn 계면에 걸친 대역에 위치한 잔기 (M252, S254, T256, H433, N434 및 Y436)를 치환하고, 주변부에 있는 잔기, 예컨대 V308, L309, Q311, G385, Q386, P387 및 N389를 더 적은 정도로 치환하는 경우에 발생한다. M252Y/S254T/T256E ("YTE")와 H433K/N434F/Y436H 돌연변이를 조합함으로써 인간 FcRn에 대해 가장 높은 친화도를 갖는 변이체를 수득하였으며, 이는 야생형 IgG1에 비해 친화도의 57배 증가를 나타냈다. 이러한 돌연변이된 인간 IgG1의 생체내 거동은 야생형 IgG1과 비교하여 시노몰구스 원숭이에서 혈청 반감기의 거의 4배 증가를 나타냈다.

항원 결합 단백질은 FcRn에 대한 최적화된 결합을 가질 수 있다. 따라서, 항원 결합 단백질은 상기 항원 결합 단백질의 Fc 영역에 적어도 1개의 아미노산 변형을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 변형은 Fc 영역의 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서와 같은 EU 인덱스에 따른 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서의 것이다.

추가적으로, 다양한 공개 문헌은 변형된 반감기를 갖는 생리학상 활성인 분자를 수득하는 방법으로서, FcRn-결합 폴리펩티드를 분자 내로 도입하는 것 (WO97/43316, US5869046, US5747035, WO96/32478 및 WO91/14438) 또는 FcRn-결합 친화도는 보존되지만 다른 Fc 수용체에 대한 친화도는 크게 감소된 항체와 분자를 융합시키거나 (WO99/43713) 또는 항체의 FcRn 결합 도메인과 분자를 융합시키는 것 (WO00/09560, US4703039)에 의한 상기 방법을 기재한다.

항체 세포독성 및 반감기 둘 다를 개선시키기 위해 FcRn 친화도 증진된 Fc 변이체를 pH 6.0에서 스크린에 의해 확인하였다. 선택된 IgG 변이체는 저 푸코실화 분자로서 생성될 수 있다. 생성된 변이체는 hFcRn 마우스에서 증가된 혈청 지속성뿐만 아니라 보존된 증진된 ADCC를 나타낸다 (Monnet et al.). 예시적인 변이체는 (IgG1과 관련하여 및 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 EU 인덱스에 따른 넘버링) 하기를 포함한다:

P230T/V303A/K322R/N389T/F404L/N434S;

P228R/N434S;

Q311R/K334R/Q342E/N434Y;

C226G/Q386R/N434Y;

T307P/N389T/N434Y;

P230S/N434S;

P230T/V305A/T307A/A378V/L398P/N434S;

P23OT/P387S/N434S;

P230Q/E269D/N434S;

N276S/A378V/N434S;

T307A/N315D/A330V/382V/N389T/N434Y;

T256N/A378V/S383N/N434Y;

N315D/A330V/N361D/A387V/N434Y;

V259I/N315D/M428L/N434Y;

P230S/N315D/M428L/N434Y;

F241L/V264E/T307P/A378V/H433R;

T250A/N389K/N434Y;

V305A/N315D/A330V/P395A/N434Y;

V264E/Q386R/P396L/N434S/K439R;

E294del/T307P/N434Y (여기서 'del'은 결실을 나타냄).

또한, a) 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자는 재조합 숙주 세포에서 불활성화된 것인 단계; 및 b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 항원 결합 단백질의 생산 방법이 기재된다. 이러한 항원 결합 단백질의 생산 방법은, 예를 들어 바이오와, 인크.(BioWa, Inc.) (뉴저지주 프린스턴)로부터 입수가능한 포텔리젠트(POTELLIGENT) 기술 시스템을 사용하여 수행될 수 있으며, 여기서 FUT8 유전자의 기능적 카피가 결여된 CHOK1SV 세포는 기능적 FUT8 유전자를 갖는 세포에서 생산된 동일한 모노클로날 항체에 비해 증가된 증진된 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는 모노클로날 항체를 생산한다. 포텔리젠트 기술 시스템의 측면은 US7214775, US6946292, WO0061739 및 WO0231240에 기재되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한 항원 결합 단백질, 예컨대 항체를 생성하기 위한 다른 적절한 시스템 및 방법을 인식할 것이다.

항체는 통상적인 단백질 정제 절차에 의해 회수 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 항체는 배양 배지로부터 직접 수거될 수 있다. 세포 배양 배지의 수거는 정화를 통해, 예를 들어 원심분리 및/또는 심층 여과에 의해 이루어질 수 있다. 항체의 회수 후 적절한 순도를 보장하기 위한 정제가 이어진다. 따라서, 본원에 기재된 항체를 포함하는 세포 배양 배지가 또한 기재된다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 CHO 세포를 포함한다.

항체는 후속적으로 세포 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 이는 세포 배양 상청액을 수거하고, 세포 배양 상청액을 정제 배지 (예를 들어, 항체 분자에 결합하는 단백질 A 수지 또는 단백질 G 수지)와 접촉하도록 위치시키고, 항체 분자를 정제 배지로부터 용리시켜 용리액을 생산하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 본원에 기재된 항체를 포함하는 용리액이 제공된다.

1개 이상의 크로마토그래피 단계, 예를 들어 1개 이상의 크로마토그래피 수지; 및/또는 1개 이상의 여과 단계가 정제에 사용될 수 있다. 예를 들어, 수지, 예컨대 단백질 A, G 또는 L을 사용하는 친화성 크로마토그래피가 조성물을 정제하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 이온-교환 수지, 예컨대 양이온-교환이 조성물을 정제하는 데 사용될 수 있다.

대안적으로, 정제 단계는 친화성 크로마토그래피 수지 단계, 이어서 양이온-교환 수지 단계를 포함한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1 ("CDRH1")을 포함한다. 한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 ("CDRH1")은 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열에 대해 1개의 아미노산 변이를 갖는 아미노산 서열 ("변이체")을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2 ("CDRH2")를 포함한다. 한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 ("CDRH2")는 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열에 대해 1개의 아미노산 변이를 갖는 아미노산 서열 ("변이체")을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3 ("CDRH3")을 포함한다. 한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR3 ("CDRH3")은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 1개의 아미노산 변이를 갖는 아미노산 서열 ("변이체")을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1 ("CDRL1")을 포함한다. 한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역 CDL1 ("CDR1")은 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열에 대해 1개의 아미노산 변이를 갖는 아미노산 서열 ("변이체")을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2 ("CDRL2")를 포함한다. 한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역 CDL2 ("CDR2")는 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열에 대해 1개의 아미노산 변이를 갖는 아미노산 서열 ("변이체")을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3 ("CDRL3")을 포함한다. 한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역 CDL3 ("CDR3")은 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열에 대해 1개의 아미노산 변이를 갖는 아미노산 서열 ("변이체")을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및/또는 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 ("V_H")을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 ("V_L")을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_H; 및 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_L을 포함하며, 여기서 항-BCMA 항체는 BCMA에 대한 결합을 유지한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 9에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 영역 ("HC")을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 10에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 영역 ("LC")을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 9에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HC; 및 서열식별번호: 10에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함한다.

질의 아미노산 서열과 대상 아미노산 서열 사이의 "퍼센트 동일성"은 백분율로서 표현되는 "동일성" 값이며, 이는 쌍별 BLASTP 정렬이 수행된 후에 대상 아미노산 서열이 질의 아미노산 서열과 100% 질의 커버리지를 갖는 경우에 BLASTP 알고리즘에 의해 계산된다. 질의 아미노산 서열과 대상 아미노산 서열 사이의 이러한 쌍별 BLASTP 정렬은 국립 생물공학 연구 센터(National Center for Biotechnology Institute)의 웹사이트 상에서 이용가능한 BLASTP 알고리즘의 디폴트 세팅을 사용하여 낮은 복잡성 영역에 대한 필터를 끈 채 수행된다. 중요하게는, 질의 서열은 본원의 하나 이상의 청구항에서 확인된 아미노산 서열에 의해 기재될 수 있다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 V_H; 및 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 V_L을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HC 및 서열식별번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LC를 포함하는 벨란타맙이다.

항체의 서열은 카바트 넘버링 시스템에 의해 결정될 수 있다 (Kabat et al. Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987). 대안적으로, 이들은 코티아 넘버링 시스템 (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948), 접촉 정의 방법 (MacCallum R.M., and Martin A.C.R. and Thornton J.M, (1996), Journal of Molecular Biology, 262 (5), 732-745) 또는 항체 내의 잔기를 넘버링하고 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 CDR을 결정하는 임의의 다른 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 통상의 기술자에게 이용가능한 항체 서열에 대한 다른 넘버링 규정은 "AbM" (유니버시티 오브 배스(University of Bath)) 및 "접촉" (유니버시티 칼리지 런던(University College London)) 방법을 포함한다. 마지막으로, 항체 서열은 순차적으로 넘버링될 수 있다.

본원에 기재된 아미노산에 대해 수치 언급이 있는 경우에, 서열은 카바트 방법 또는 순차적 넘버링 방법에 따라 넘버링될 수 있다. 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 특정 아미노산 번호에 대한 수치 언급은 순차적 넘버링 시스템과 함께 본원에 기재된다. 본 명세서 전반에 걸쳐, 용어 "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3"은 카바트 넘버링을 따른다. 가변 영역 서열 및 전장 항체 서열 내의 아미노산 잔기는 이성질체화된 변이체 (예를 들어, D103), 탈아미드화된 변이체 (예를 들어, N388) 또는 산화된 변이체 (예를 들어, M34)와 같이 임의의 항체 서열 변이체 위치 또는 번역후 변형 변이체 위치를 나타내도록 순차적으로 넘버링된다.

CDR 내의 위치에 대한 언급 (예를 들어, M34 또는 D103)은 전체 항체 서열과 관련된 위치 번호를 제공한다 (순차적 넘버링). 따라서, CDRH1의 M34가 서열식별번호: 1의 제4 잔기, 예를 들어 밑줄표시된 것: NYWMH (서열식별번호: 1)을 지칭한다는 것이 이해될 것이다. 동등하게, CDRH3의 D103은 서열식별번호: 3의 제5 잔기, 예를 들어 밑줄표시된 것: GAIYDGYDVLDN (서열식별번호: 3)을 지칭한다.

한 실시양태에서, 조성물은 1차 서열 내의 1개 이상의 아미노산의 변화를 포함하는 항체 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호:9의 중쇄 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호:10의 경쇄 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 항체를 포함하고, 아스파르트산 (D)의 아스파라긴 (N)으로의 아미노산 변화, 예를 들어 CDRH3에서 D103N (예를 들어, 카바트 넘버링에서는 D99N)을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항체를 포함하고, 아스파르트산 (D)의 아스파라긴 (N)으로의 아미노산 변화, 예를 들어 CDRH3에서 D103N을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 벨란타맙을 포함하고, 아스파르트산 (D)의 아스파라긴 (N)으로의 아미노산 변화, 예를 들어 CDRH3에서 D103N을 포함한다.

한 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 9의 중쇄 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 10의 경쇄 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 항체의 혼합물을 포함하며, 여기서 혼합물 중 항체의 약 ≥5%, ≥10%, ≥15%, ≥20%, ≥25%, ≥50%, ≥75% 또는 ≥90%는 CDRH3에서 D103N을 포함한다.

한 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항체의 혼합물을 포함하며, 여기서 혼합물 중 항체의 약 ≥5%, ≥10%, ≥15%, ≥20%, ≥25%, ≥50%, ≥75% 또는 ≥90%는 CDRH3에서 D103N을 포함한다.

한 실시양태에서, 조성물은 벨란타맙을 포함하며, 여기서 벨란타맙의 약 ≥5%, ≥10%, ≥15%, ≥20%, ≥25%, ≥50%, ≥75% 또는 ≥90%는 CDRH3에서 D103N을 포함한다.

한 실시양태에서, 조성물은 G27Y, S30T, A93T, A24G, K73T, M48I, V67A, F71Y, D99N, M4L 및 K45E로 이루어진 군으로부터 선택된 카바트 넘버링 시스템을 사용하는 적어도 1개의 항체 변이체를 포함하는 벨란타맙을 포함한다.

항체-약물 접합체

항체 약물 접합체 (ADC)는 최근에 주목할 만한 임상 이익을 입증한 신흥 부류의 강력한 항암제이다. ADC는 링커를 통해 항체에 화학적으로 결합된 세포독성제로 구성된다. 추정상, 세포 표면에서의 항원 결합, 세포내이입, 리소솜으로의 트래픽킹, ADC 분해, 페이로드의 방출, 세포 프로세싱 (예를 들어, 유사분열)의 중단 및 아폽토시스를 포함한 일련의 사건에 의해, ADC는 세포-표면 단백질의 과다-발현을 보유하는 암 세포를 파괴할 수 있다. ADC는 모노클로날 항체의 항원-유도된 표적화 특성을 세포독성제의 강력한 항종양 효과와 조합한다. 예를 들어, 2011년에 아드세트리스(ADCETRIS)® (항-CD30 항체-MMAE ADC)는 불응성 호지킨 림프종 및 전신 역형성 림프종의 치료에 대한 규제 승인을 얻었다.

ADC는 암의 치료에서 세포독성제, 예를 들어 세포를 사멸시키거나 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 약물의 국부 전달에 사용되어 왔다 (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146; Payne, G. (2003) i 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172; 미국 특허 번호 4,975,278). ADC는 약물 모이어티의 종양으로의 표적화 전달 및 그 안의 세포내 축적을 가능하게 하며, 여기서 비접합된 약물의 전신 투여는 제거하고자 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에도 허용되지 않는 수준의 독성을 유발할 수 있다 (Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) pp. 475-506). 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 둘 다는 이들 전략에 유용한 것으로 보고되었다 (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87). 항체-독소 접합체에 사용되는 독소는 박테리아 독소, 예컨대 디프테리아 독소, 식물 독소, 예컨대 리신, 소분자 독소, 예컨대 겔다나마이신 (Mandler et al. (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), 메이탄시노이드 (EP 1391213; Liu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) 및 칼리케아미신 (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA ADC는 1종 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 단편)에 접합된 항체 또는 항체 단편, 또는 방사성 동위원소에 접합된 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, 방사성접합체)을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA ADC는 하기 일반 구조를 갖는다:

ABP-((링커)_n-Ctx)_m

여기서:

ABP는 항원 결합 단백질, 항체 또는 항체 단편이고;

링커는 부재하거나 또는 임의의 절단가능한 또는 비-절단가능한 링커이고;

Ctx는 본원에 기재된 임의의 세포독성제이고;

n은 0, 1, 2 또는 3이고;

m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.

예시적인 실시양태에서, 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 또는 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일에 공개된 WO 93/21232를 참조한다. 예를 들어, ²¹¹At, ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y 또는 ¹⁸⁶Re를 포함한 다양한 방사성핵종이 방사성-접합된 항체의 생산에 이용가능하다.

본 개시내용의 항-BCMA 항체 또는 그의 단편은 또한 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우리스타틴, 트리코테센 및 CC1065 또는 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 세포독성제에 접합될 수 있다. 적합한 세포독성제는, 예를 들어 모노메틸 아우리스타틴 (MMAF) 및 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 뿐만 아니라 MMAE의 에스테르 형태를 포함한 아우리스타틴, DNA 작은 홈 결합제, DNA 작은 홈 알킬화제, 에네디인, 렉시트롭신, 두오카르마이신, 파클리탁셀 및 도세탁셀을 포함한 탁산, 퓨로마이신, 돌라스타틴, 메이탄시노이드 및 빈카 알칼로이드를 포함한다. 구체적인 세포독성제는 토포테칸, 모르폴리노-독소루비신, 리족신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 돌라스타틴-10, 에키노마이신, 콤브레타스타틴, 칼리케아미신, 메이탄신, DM-1, DM-4, 네트롭신을 포함한다. 다른 적합한 세포독성제는 항튜불린제, 예컨대 아우리스타틴, 빈카 알칼로이드, 포도필로톡신, 탁산, 바카틴 유도체, 크립토피신, 메이탄시노이드, 콤브레타스타틴 또는 돌라스타틴을 포함한다. 항튜불린제는 디메틸발린-발린돌라이소류인-돌라프로인-페닐알라닌-p-페닐렌디아민 (AFP), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 비노렐빈, VP-16, 캄프토테신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에포틸론 A, 에포틸론 B, 노코다졸, 콜키신, 콜세미드, 에스트라무스틴, 세마도틴, 디스코데르몰리드, 메이탄신, DM-1, DM-4 또는 엘레우테로빈을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA ADC는 MMAE 또는 MMAF에 연결된 항-BCMA 항체를 포함한다.

예시적인 링커는 절단가능한 및 비-절단가능한 링커를 포함한다. 절단가능한 링커는 세포내 조건 하에 절단되기 쉬울 수 있다. 적합한 절단가능한 링커는, 예를 들어 세포내 프로테아제, 예컨대 리소솜 프로테아제 또는 엔도솜 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티드 링커를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 링커는 디펩티드 링커, 예컨대 발린-시트룰린 (val-cit) 또는 페닐알라닌-리신 (phe-lys) 링커일 수 있다. 다른 적합한 링커는, 예를 들어 5.5 미만의 pH에서 가수분해가능한 링커, 예컨대 히드라존 링커를 포함한다. 추가의 적합한 절단가능한 링커는, 예를 들어 디술피드 링커를 포함한다. 예시적인 링커는 6-말레이미도카프로일 (MC), 말레이미도프로파노일 (MP), 발린-시트룰린 (val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (ala-phe), p-아미노벤질옥시카르보닐 (PAB), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1 카르복실레이트 (SMCC) 및 N-숙신이미딜 (4-아이오도-아세틸) 아미노벤조에이트 (SIAB)를 포함한다.

한 실시양태에서, 링커는 티올-반응성 말레이미드, 카프로일 스페이서, 디펩티드 발린-5 시트룰린, p-아미노벤질옥시카르보닐, 자기-희생적 단편화 기 또는 프로테아제-저항성 말레이미도카프로일을 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 항-BCMA ADC는 하기 구조에 도시된 바와 같은 MC 링커에 의해 MMAE 또는 MMAF에 연결된 항-BCMA 항체를 포함한다:

본원에 기재된 항-BCMA ADC는 본원에 기재된 임의의 세포독성제와 함께 본원에 기재된 임의의 항-BCMA 항체를 함유할 수 있다.

한 실시양태에서, 항-BCMA ADC는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및/또는 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는 항-BCMA 항체를 포함하고, MMAE 또는 MMAF에 접합된다.

또 다른 실시양태에서, 항-BCMA ADC는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항-BCMA 항체를 포함하고; MMAF 또는 MMAE에 접합된다.

한 실시양태에서, 항-BCMA ADC는 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_H; 및/또는 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_L을 포함하는 항-BCMA 항체를 포함하고, MMAE 또는 MMAF에 접합된다.

또 다른 실시양태에서, 항-BCMA ADC는 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 V_H; 및 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 V_L을 포함하는 항-BCMA 항체를 포함하고; MMAF 또는 MMAE에 접합된다.

한 실시양태에서, 항-BCMA ADC는 서열식별번호: 9에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HC; 및/또는 서열식별번호: 10에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 항-BCMA 항체를 포함하고; MMAF 또는 MMAE에 접합된다.

또 다른 실시양태에서, 항-BCMA ADC는 서열식별번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HC 및 서열식별번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LC를 포함하는 항-BCMA 항체를 포함하는 벨란타맙 마포도틴이고; MMAF에 접합된다.

ADC의 제조 및 특징화

특정 천연 IgG1 분자는 16개의 디술피드 결합 (32개의 시스테인 또는 술프히드릴 기)을 포함한다. 특정 측면에서, 항체는 단지 4개의 쇄간 디술피드 결합만이 환원되고 세포독성제에 접합되어, 세포독성제에 대해 8개 이하의 부착 부위를 허용하는 방식으로 환원될 수 있다. 다시 말해서, 약물 로드 ("DL"), 예를 들어 항체 분자당 세포독성제의 수는 0 내지 8의 범위일 수 있고, DL0, DL2 (DL2a 및 DL2b 포함), DL4 (DL4a, DL4b 및 DL4c 포함), DL6 (DL6a 및 DL6b 포함) 및 DL8로서 본원에 기재된다.

접합 과정은 1) 각각의 항체 분자에 결합된 약물의 수 및 2) 세포독성제의 위치 둘 다가 달라지는, 주어진 ADC 조성물에 대한 약물-항체 부착의 불균질성으로 이어질 수 있다. 이는 다양한 DL 종을 갖는 ADC 조성물로 이어질 수 있다. 전체 불균질 ADC 조성물의 평균 약물-항체 비는 본원에서 "평균 DAR" 또는 "DAR"로 지칭된다. 예를 들어, ADC 조성물은 각각 그 자신의 DL을 갖는 항체 종들의 혼합물로 구성될 수 있고 (혼합물 중 일부 종은 DL2이고, 혼합물 중 일부 종은 DL4이고, 혼합물 중 일부 종은 DL6이고, 혼합물 중 일부 종은 DL8임), 전체 조성물에 대한 평균 DAR은 약 4일 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 용어 "퍼센트 DL"은 불균질 ADC 조성물 내 특정 DL 종의 퍼센트를 기재하는 데 사용될 수 있다 (예를 들어, 퍼센트 DL2는 총 불균질 ADC 조성물의 약 10% 내지 약 30%임).

약물은 항체 상의 술프히드릴 기를 통해 항체에 접합될 수 있다. 술프히드릴 기는 시스테인 측쇄 상의 술프히드릴 기일 수 있다. 시스테인 잔기는 항체 내에 자연적으로 존재할 수 있거나 (예를 들어, 쇄간 디술피드) 또는 다른 수단, 예를 들어 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 약물을 항체 상의 술프히드릴 기에 접합시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,659,241, 7,498,298 및 국제 공개 번호 WO 2011/130613, WO 2014/152199, WO 2015/077605 및 문헌 [Bioconjugate Chem. 2005, 16, 1282-1290] 참조). 항체는 전형적으로 술프히드릴 기를 접합에 이용가능하게 하기 위해 접합 전에 환원된다. 항체는 관련 기술분야에 공지된 조건을 사용하여 환원될 수 있다. 환원 조건은 일반적으로 항체의 임의의 실질적인 변성을 유발하지 않고 일반적으로 항체의 항원 결합 친화도에 영향을 미치지 않는 조건이다.

환원 단계에서 사용되는 환원제는 TCEP일 수 있고, TCEP는, 예를 들어 실온에서 30분 동안 과량으로 첨가될 수 있다. 예를 들어, pH 7.4의 10 mM TCEP 용액 250 μL는 실온에서 30분 내에 항체 1 내지 100 μg의 쇄간 디술피드를 용이하게 환원시킬 것이다. 그러나, 다른 환원제 및 조건이 사용될 수 있다. 반응 조건의 예는 5 내지 8의 pH 범위에 걸쳐 5℃ 내지 37℃의 온도를 포함한다.

ADC 조성물 중 퍼센트 DL 종 및/또는 평균 DAR을 계산하기 위한 다양한 방법이 존재하고 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 시스테인-연결된 ADC의 불균질성은 전형적으로 로딩된 약물의 수에 기초하여 DL 종을 분리하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 의해 측정된다. LC-MS 검정이 또한 DL 분포를 평가하기 위해 개발되었다. ADC 조성물에서 약물 로드 분포를 계산하는 예시적인 방법은, 예를 들어 문헌 [Journal of Chromatography B 1060 (2017) 182-189]에서 찾아볼 수 있다.

예를 들어, DL0은 항체 상에 약물 로드를 갖지 않는다. 예를 들어, DL2는 2의 약물 로드를 갖는다. 한 실시양태에서, DL2에 대한 접합 부위는 LC C214 및 HC C224이다. 예를 들어, DL4는 4의 약물 로드를 갖는다. 한 실시양태에서, DL4a에 대한 접합 부위는 LC C214, HC C224, LC C214 및 HC C224이다. 한 실시양태에서, DL4b에 대한 접합 부위는 HC C230, HC C233, HC C230 및 HC C233이다. 예를 들어, DL6은 6의 약물 로드를 갖는다. 한 실시양태에서, DL6에 대한 접합 부위는 LC C214, HC C224, HC C230, HC C233, HC C230 및 HC C233이다. 예를 들어, DL8은 8의 약물 로드를 갖는다. 한 실시양태에서, DL8에 대한 접합 부위는 LC C214, HC C224, LC C214, HC C224, HC C230, HC C233, HC C230 및 HC C233이다.

한 실시양태에서, 특정 DL 종의 퍼센트 (예를 들어, 퍼센트 DL0, 퍼센트 DL2, 퍼센트 DL4a, 퍼센트 DL4b, 퍼센트 DL6, 퍼센트 DL8)는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 사용하여 개별 DL 종을 분리하고, 각각의 DL 피크에 대한 곡선하 면적을 계산하고, 각각의 DL 피크를 합한 모든 DL 종에 대한 총 곡선하 면적으로 나눔으로써 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 평균 DAR은 하기 식을 사용하여 각각의 DL 종의 곡선하 면적으로부터 계산될 수 있다:

한 실시양태에서, 특정 DAR 하위-종의 퍼센트 (예를 들어, 총 DL2 중 DL2a의 퍼센트)는 HIC, 비-환원 분리 방법 및 질량 분광측정 기술을 포함할 수 있는 분석 기술의 조합을 사용한 특정 DL 종의 수집에 의해 결정된다.

한 실시양태에서, 항-BCMA ADC 조성물은 약 2 내지 약 7, 약 2 내지 약 6, 약 2.1 내지 약 5.7, 약 2.1 내지 약 5.0, 약 2.1 내지 약 4.6, 약 2.1 내지 약 4.1, 약 2.1 내지 약 3.5, 약 2.1 내지 약 3.0, 약 3.0 내지 약 5.7, 약 3.0 내지 약 5.0, 약 3.0 내지 약 4.6, 약 3.0 내지 약 4.1, 약 3.0 내지 약 3.5, 약 3.5 내지 약 5.7, 약 3.5 내지 약 5.0, 약 3.5 내지 약 4.6, 약 3.5 내지 약 4.1, 약 3.8 내지 약 4.5, 약 4.1 내지 약 5.7, 약 4.1 내지 약 5.0, 약 4.1 내지 약 4.6, 약 4.6 내지 약 5.7, 약 4.6 내지 약 5.0, 약 5.0 내지 약 5.7, 약 2.1, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.1, 약 4.6, 약 5.0 또는 약 5.7의 평균 DAR을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 조성물은 항-BCMA ADC를 포함하며, 여기서 평균 DAR은 약 2.1 내지 약 5.7, 약 3.4 내지 약 4.6, 약 3.8 내지 약 4.5 또는 약 4이다.

한 실시양태에서, 조성물은 항-BCMA ADC를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2 및 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAE 또는 MMAF이고; 여기서 평균 DAR은 약 2 내지 약 6, 약 2.1 내지 약 5.7, 약 3.4 내지 약 4.6 또는 약 3.8 내지 약 4.5이다.

한 실시양태에서, 조성물은 항-BCMA ADC를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 V_H 및 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 V_L을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAE 또는 MMAF이고; 여기서 평균 DAR은 약 2 내지 약 6, 약 2.1 내지 약 5.7, 약 3.4 내지 약 4.6 또는 약 3.8 내지 약 4.5이다.

한 실시양태에서, 조성물은 벨란타맙 마포도틴을 포함하며, 여기서 평균 DAR은 약 2 내지 약 6, 약 2.1 내지 약 5.7, 약 3.4 내지 약 4.6 또는 약 3.8 내지 약 4.5이다.

한 실시양태에서, 항-BCMA ADC 조성물 중 퍼센트 DL0 종은 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 5% 또는 약 2.8% 내지 약 4.7%이다.

한 실시양태에서, 항-BCMA ADC 조성물 중 퍼센트 DL2 종은 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 약 15.8% 내지 약 26.3%, 약 15% 내지 약 27%, 약 15% 내지 약 32% 또는 약 10% 내지 약 40%이다.

한 실시양태에서, 항-BCMA ADC 조성물 중 퍼센트 DL4a 종은 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 약 35.5% 내지 약 37.9%, 약 35% 내지 약 38%, 약 30% 내지 약 40% 또는 약 20% 내지 약 50%이다. 또 다른 실시양태에서, 퍼센트 DL4a 종은 항-BCMA ADC 조성물에서 우세한 종이고, 합한 모든 종의 약 ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80% 또는 ≥90%를 차지한다.

한 실시양태에서, 항-BCMA ADC 조성물 중 퍼센트 DL4b 종은 적어도 약 5%, 적어도 약 7%, 약 7.1% 내지 약 8.5%, 약 7% 내지 약 9%, 약 5% 내지 약 10% 또는 약 1% 내지 약 15%이다.

한 실시양태에서, 항-BCMA ADC 조성물 중 퍼센트 DL6 종은 적어도 약 10%, 적어도 약 14%, 약 14.0% 내지 약 19.1%, 약 14% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20% 또는 약 5% 내지 약 30%이다.

한 실시양태에서, 항-BCMA ADC 조성물 중 퍼센트 DL8 종은 적어도 약 1%, 적어도 약 6%, 약 6.0% 내지 약 12.0%, 약 4% 내지 약 15% 또는 약 1% 내지 약 20%이다.

한 실시양태에서, 조성물은 항-BCMA ADC를 포함하며, 여기서 퍼센트 DL2는 약 15% 내지 약 27% 또는 약 15% 내지 약 32%이고/거나, 퍼센트 DL4a는 약 35% 내지 약 38% 또는 약 30% 내지 약 40%이고/거나, 퍼센트 DL4b는 약 7% 내지 약 9% 또는 약 5% 내지 약 10%이고/거나, 퍼센트 DL6은 약 14% 내지 약 20% 또는 약 10% 내지 약 20%이고/거나, DL8은 약 6.0% 내지 약 12.0% 또는 약 4% 내지 약 15%이다.

한 실시양태에서, 조성물은 벨란타맙 마포도틴을 포함하며, 여기서 퍼센트 DL2는 약 15% 내지 약 27% 또는 약 15% 내지 약 32%이고/거나, 퍼센트 DL4a는 약 35% 내지 약 38% 또는 약 30% 내지 약 40%이고/거나, 퍼센트 DL4b는 약 7% 내지 약 9% 또는 약 5% 내지 약 10%이고/거나, 퍼센트 DL6은 약 14% 내지 약 20% 또는 약 10% 내지 약 20%이고/거나, DL8은 약 6.0% 내지 약 12.0% 또는 약 4% 내지 약 15%이다.

본원에 사용된 용어 "바람직하지 않은 DAR 종"은 최종 조성물에서 바람직하지 않고 최종 치료 생성물의 특정 특성 (예를 들어, 표적 결합, 효능, 안전성 등)에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 임의의 DAR 종을 지칭한다. 한 실시양태에서, 바람직하지 않은 DAR 종은 DL0, 예를 들어 접합 과정 후에 세포독성제와 결합되지 않은 항체이다. 한 실시양태에서, ADC 조성물 중 퍼센트 DL0은 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1% 또는 약 0.5% 이하이다. 또 다른 실시양태에서, ADC 조성물 중 퍼센트 DL0은 약 1% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 5% 또는 약 2.0% 내지 약 4.8%이다.

번역후 변형

본원에 기재된 항체의 "번역후 변형 생성물"은 조성물의 전부 또는 부분이 "번역후 변형"을 포함하는 것인 항체 조성물이다. 번역후 변형은 숙주 세포에서의 항체의 생산, 상류 및 하류 제조 및/또는 저장으로부터 유발될 수 있는 항체에 대한 변화이다 (예를 들어, 광, 온도, pH, 물에 대한 노출 또는 부형제 및/또는 즉각적 용기 밀폐 시스템과의 반응에 의한 영향)이다. 따라서, 본 개시내용의 조성물은 항체의 제조 또는 저장으로부터 형성될 수 있다. 예시적인 번역후 변형은 항체 서열 변화 (상기 기재된 바와 같은 "항체 변이체"), 특정 리더 서열의 절단, 다양한 당 모이어티의 다양한 글리코실화 패턴으로의 부가, 비-효소적 당화, 탈아미드화, 산화, 디술피드 결합 스크램블링 및 다른 시스테인 변이체, 예컨대 유리 술프히드릴, 라세미화 디술피드, 티오에테르 및 트리술피드 결합, 이성질체화, C-말단 리신 절단 및/또는 N-말단 글루타민 고리화를 포함한다.

한 예에서, 번역후 변형 생성물은 감소된 기능 및/또는 활성을 유발하는 화학적 변화를 포함하는 "생성물-관련 불순물"을 포함한다. 또 다른 예에서, 번역후 변형 생성물은 감소된 기능 및/또는 활성을 유발하지 않는 화학적 변화를 포함하는 "생성물-관련 물질"을 포함한다. 본원에 기재된 항체에 대한 생성물 관련 불순물은 이성질체화된 변이체 및 산화된 변이체를 포함한다. 본원에 기재된 항체에 대한 생성물 관련 물질은 탈아미드화 변이체, 글리코실화 변이체, C-말단 절단된 변이체 및 N-말단 피로-글루타메이트 변이체를 포함한다.

한 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 9의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 10의 경쇄 서열 (그의 1종 이상의 기능적 번역후 변형을 포함함)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13 또는 서열식별번호: 14의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 10의 경쇄 (그의 1종 이상의 기능적 번역후 변형을 포함함)를 포함한다.

본원에 제공된 퍼센트 변이체는 조성물 (예를 들어, 항체의 "집단") 중 항체의 총량의 백분율로서 표현된다. 예를 들어, 40% 이하의 산화된 변이체는 조성물에서 총량 100% 항체 중 40% 이하가 산화된 것을 지칭한다. 예를 들어, 25% 이하의 이성질체화된 변이체는 조성물에서 총량 100% 항체 중 25% 이하가 이성질체화된 것을 지칭한다.

당화는 환원당, 예컨대 글루코스와 단백질 내의 유리 아민 기 사이의 비-효소적 화학 반응을 포함하는 번역후 변형이고, 전형적으로 리신 측쇄의 엡실론 아민에서 또는 단백질의 N-말단에서 관찰된다. 당화는 생산 및/또는 저장 동안 환원당의 존재 하에 일어날 수 있다.

예를 들어 생산 및/또는 저장 동안 일어날 수 있는 탈아미드화는 효소 반응 또는 화학 반응일 수 있다. 탈아미드화는 분자내 고리화를 통한 간단한 화학 반응에 의해 일어날 수 있으며, 쇄 내 다음 아미노산의 아미드 질소가 아미드를 친핵성으로 공격하여 (N+1이 N을 공격함) 숙신이미드 중간체를 형성한다. 탈아미드화는 주로 아스파라긴 (N)을 이소-아스파르트산 (이소-아스파르테이트) 및 아스파르트산 (아스파르테이트) (D)으로 대략 3:1 비로 전환시킬 수 있다. 따라서, 이러한 탈아미드화 반응은 아스파르테이트 (D)의 이소-아스파르테이트로의 이성질체화와 관련될 수 있다. 아스파라긴의 탈아미드화 및 아스파르테이트의 이성질체화는 둘 다 중간체 숙신이미드를 수반할 수 있다. 훨씬 더 적은 정도로, 탈아미드화는 글루타민 잔기에서 유사한 방식으로 일어날 수 있다. 탈아미드화는 CDR, Fab (비-CDR 영역) 또는 Fc 영역에서 일어날 수 있다. 이성질체화는 중간체 숙신이미드를 수반하는 아스파르테이트 (D)의 이소-아스파르테이트로의 전환이다.

산화는 생산 및/또는 저장 동안 (예를 들어, 산화 조건의 존재 하에) 일어날 수 있고, 반응성 산소 종에 의해 직접적으로 또는 산화성 스트레스의 2차 부산물과의 반응에 의해 간접적으로 유도되는 단백질의 공유 변형을 유발한다. 산화는 주로 메티오닌 잔기에서 일어날 수 있지만, 또한 트립토판 및 유리 시스테인 잔기에서도 일어날 수 있다. 산화는 CDR, Fab (비-CDR) 영역 또는 Fc 영역에서 일어날 수 있다.

디술피드 결합 스크램블링은 생산 및/또는 저장 조건 동안 일어날 수 있다. 특정 상황 하에, 디술피드 결합은 파괴되거나 또는 부정확하게 형성되어, 쌍형성되지 않은 시스테인 잔기 (-SH)를 생성할 수 있다. 이들 유리 (쌍형성되지 않은) 술프히드릴 (-SH)은 셔플링을 촉진할 수 있다.

티오에테르의 형성 및 디술피드 결합의 라세미화는 생산 또는 저장에서 염기성 조건 하에 디-술피드 가교가 데히드로알라닌 및 퍼술피드 중간체를 통해 다시 시스테인 잔기로 베타 제거되어 일어날 수 있다. 후속하여 데히드로알라닌과 시스테인의 가교가 티오에테르 결합의 형성을 유발할 수 있거나 또는 유리 시스테인 잔기가 D- 및 L-시스테인의 혼합물과 디술피드 결합을 재형성할 수 있다.

트리술피드는 디술피드 결합 내로의 황 원자의 삽입으로부터 생성될 수 있고 (Cys-S-S-S-Cys), 생산 세포 배양물에서 황화수소의 존재로 인해 형성될 수 있다.

중쇄 및/또는 경쇄 내의 N-말단 글루타민 (Q) 및 글루타메이트 (글루탐산) (E)는 고리화를 통해 피로글루타메이트 (pGlu)를 형성할 수 있다. pGlu 형성은 생산 생물반응기에서 형성될 수 있지만, 이는 또한 가공 및 저장 조건의 pH 및 온도에 따라, 예를 들어 비-효소적으로 형성될 수 있다. N-말단 Q 또는 E의 고리화는 천연 인간 항체에서 통상적으로 관찰된다.

C-말단 리신 절단은 카르복시펩티다제에 의해 촉매되는 효소 반응이고, 재조합 및 천연 인간 항체에서 통상적으로 관찰된다. 이 과정의 변이체는 재조합 숙주 세포로부터의 세포 효소로 인해 하나 또는 둘 다의 중쇄로부터의 리신의 제거를 포함한다. 인간 대상체/환자에 대한 투여는 임의의 나머지 C-말단 리신의 제거를 유발할 가능성이 있다.

본 개시내용은 본원에 기재된 번역후 변형 중 1종 이상에 적용되었을 수 있거나 또는 그를 겪은 항체를 포괄한다. 예시적인 조성물은 1) 번역후 변형 (1종 이상)을 갖는 및 갖지 않는 항체 또는 2) 본원에 기재된 1종 초과의 유형의 번역후 변형을 갖는 항체의 혼합물 또는 블렌드를 포함할 수 있다.

조성물은 항체 변이체와 번역후 변형 변이체의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물은 산화 변이체, 탈아미드화 변이체, 이성질체화된 변이체, N-말단 피로-글루타메이트 변이체 및 C-말단 리신 절단된 변이체 중 1종 이상, 예컨대 2종 이상을 포함할 수 있다.

예를 들어, 한 실시양태에서, 조성물은 항체의 혼합물을 포함할 수 있으며, 여기서 혼합물 중 항체의 10%는 서열식별번호 9 및 10의 아미노산 서열을 포함하고, 혼합물 중 항체의 90%는 C-말단 리신 절단을 갖는 서열식별번호 9 및 10의 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 예시적인 실시양태에서, 조성물은 항체의 혼합물을 포함할 수 있으며, 여기서 혼합물 중 항체의 10%는 서열식별번호: 9 및 10의 아미노산 서열을 포함하고, 혼합물 중 항체의 90%는 C-말단 리신 절단을 갖는 서열식별번호: 9 및 10의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 100% 총 항체 혼합물 중에서, N-말단 글루타민의 100% 이하는 피로-글루타메이트로 고리화된다.

또 다른 예시적인 실시양태에서, 조성물은 항체의 혼합물을 포함할 수 있으며, 여기서 혼합물 중 항체의 10%는 서열식별번호: 9 및 10의 아미노산 서열을 포함하고, 혼합물 중 항체의 90%는 C-말단 리신 절단을 갖는 서열식별번호: 9 및 10의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 100% 총 항체 혼합물 중에서, 100% 이하는 N-말단 피로-글루타메이트이고, 23% 이하는 CDRH3의 D103에서 이성질체화된다.

또 다른 예시적인 실시양태에서, 조성물은 항체의 혼합물을 포함하며, 여기서 혼합물 중 항체의 20%는 서열식별번호: 9 및 10의 아미노산 서열을 포함하고, 혼합물 중 항체의 80%는 CDRH3에서 변이체 N103을 갖는 서열식별번호: 9 및 10의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 100% 총 항체 혼합물 중에서, 항체의 37% 이하는 CDRH1의 아미노산 M34에서 산화된다.

한 실시양태에서, 본원에 기재된 번역후 변형은 생성물-관련 불순물로서 명시되고 기재된 경우를 제외하고는, 항원 결합 친화도, 생물학적 활성, 약동학 (PK)/약역학 (PD), 응집, 면역원성 및/또는 Fc 수용체에 대한 결합에서 유의한 변화를 유발하지 않는다.

본원에 기재된 "기능" 또는 "활성"은 1) BCMA에 대한 결합, 2) FcγRIIIa에 대한 결합 및/또는 3) FcRn에 대한 결합 중 1종 이상으로서 정의된다. 한 실시양태에서, "감소된 기능" 또는 "감소된 활성"은 BCMA에 대한 결합, FcγRIIIa에 대한 결합 또는 FcRn에 대한 결합이 참조 표준과 비교하여 소정의 백분율로서 감소되고, 검정 가변성에 걸쳐 유의하다는 것을 의미한다. 예를 들어, 감소된 기능 또는 활성은 ≥5%, ≥10%, ≥15%, ≥20%, ≥25%, ≥30%, ≥35%, ≥40%, ≥45% 또는 ≥50%의 감소로서 기재될 수 있다.

한 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 서열식별번호: 9 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일하고 항체의 모든 번역후 변형 (존재하는 경우)을 포함하는 항체를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 벨란타맙 및 모든 번역후 변형 (존재하는 경우)을 포함한다.

항체 변이체는 항체의 조성물이 전하 기반-분리 기술, 예컨대 등전 포커싱 (IEF) 겔 전기영동, 모세관 등전 포커싱 (cIEF) 겔 전기영동, 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX) 및 음이온 교환 크로마토그래피 (AEX)에 의해 분석되는 경우에 통상적으로 관찰된다.

제약 조성물

본원에 기재된 조성물은 제약 조성물의 형태일 수 있다. "제약 조성물"은 본원에 기재된 조성물 (예를 들어, 활성 성분) 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 부형제(들)는 제제의 다른 성분과 상용성이고/거나, 제약 제제화가 가능하고/거나, 그의 수용자에게 유해하지 않고/거나, 활성 성분의 효능을 방해하지 않는다는 관점에서 허용되어야 한다.

본원에 사용된 "제약상 허용되는 부형제"는 임의의 및 모든 용매, 희석제, 담체, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및/또는 흡수 지연제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제의 예는 완충제, 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 뿐만 아니라 그의 조합 중 1종 이상을 포함한다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 폴리올, 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 보존제; 공용매; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 금속 착물 (예를 들어, Zn2+-단백질 착물); 생분해성 중합체; 및/또는 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨 또는 칼륨.

부형제 또는 다른 물질의 정확한 성질은, 예를 들어 경구, 직장, 비강, 국소 (협측 및 설하 포함), 질, 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 피내, 척수강내 및 경막외 포함) 및 종양내일 수 있는 투여 경로에 좌우될 수 있다. 바람직한 부형제는, 예를 들어 수용자의 상태 및 치료될 질환에 따라 달라질 수 있는 것으로 인지될 것이다.

부형제 및 각각의 농도의 혼합물은 함께 "제약 제제" (또는 "제제")를 형성한다. 제제는 액체 형태 또는 동결건조된 형태일 수 있다. 액체 제제의 조성물은 용기 내로 충전되고 동결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물을 포함하는 동결된 제제의 분취물은 동결건조될 수 있다. 동결건조물은 물 또는 다른 수용액의 첨가에 의해 재구성되어 조성물을 포함하는 재구성된 제제를 생성할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항-BMCA 항원 결합 단백질은 제제 중에 적어도 약 10 mg/mL 또는 적어도 약 20 mg/mL의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 항-BMCA 항원 결합 단백질은 제제 중에 약 20 mg/mL 내지 약 100 mg/mL 또는 약 20 mg/mL 내지 약 60 mg/mL의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 제제 중 항-BCMA 항원 결합 단백질의 농도는 약 20 mg/mL, 약 25 mg/mL, 약 50 mg/mL, 약 60 mg/mL 또는 약 100 mg/mL이다. 한 실시양태에서, 항-BMCA 항원 결합 단백질은 액체 제제 중에 약 20 mg/mL 또는 약 25 mg/mL의 농도로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 항-BMCA 항원 결합 단백질은 동결건조된 제제 중에 약 50 mg/mL 또는 약 60 mg/mL의 농도로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 항-BMCA 항원 결합 단백질은 재구성된 제제 중에 약 50 mg/mL의 농도로 존재한다.

특정 실시양태에서, 완충제는 시트레이트 완충제이다. 시트레이트 완충제는, 예를 들어 짝산/짝염기 시스템 (시트르산나트륨/시트르산)의 사용에 의해 또는 시트르산나트륨 용액의 HCl 적정에 의해 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 시트레이트 완충제의 농도는 약 10 mM 내지 약 30 mM이다. 바람직한 실시양태에서, 시트레이트 완충제의 농도는 25 mM이다. 일부 실시양태에서, 완충제는 약 5 mM 내지 약 35 mM 농도의 히스티딘 완충제이다.

완충제는 바람직한 pH 범위를 유지하는 것을 돕는 데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제의 pH는 약 5.5 내지 약 7 또는 약 5.9 내지 약 6.5, 바람직하게는 pH 6.2이다.

일부 실시양태에서, 제제는 폴리올을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리올은 당, 바람직하게는 비-환원당이다. 일부 실시양태에서, 비-환원당은 트레할로스이다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 120 mM 내지 약 240 mM 범위의 트레할로스를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 약 200 mM의 트레할로스를 포함한다.

한 실시양태에서, 제제는 킬레이트화제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 킬레이트화제는 EDTA이다. 특정 실시양태에서, 제제는 0.01 mM 내지 약 0.1 mM의 농도의 EDTA를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 0.05 mM의 농도의 EDTA를 포함한다.

일부 실시양태에서, 제제는 계면활성제를 포함한다. "계면활성제"는 친수성 및 소수성 기를 둘 다 함유하는 그의 화학적 조성 때문에 고체-고체, 고체-액체, 액체-액체 및 액체-공기 계면의 표면에서 그의 효과를 발휘할 수 있는 표면 활성제이다. 계면활성제는 단백질이 흡착되고 잠재적으로 응집될 수 있는 공기-물 및/또는 물-고체 계면에서 희석 용액 중 단백질의 농도를 감소시킬 수 있다. 계면활성제는 단백질 제제에서 소수성 계면에 결합할 수 있다. 일부 비경구로 허용되는 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 또는 폴리에테르 기를 포함한다. 폴리소르베이트 20 및 80은 본 개시내용의 제제에 적합한 계면활성제 안정화제이다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 0.01% 내지 약 0.05%의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 약 0.02%의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 제제는 약 0.02%의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

본 개시내용의 한 측면은 5.5 내지 6.5 범위의 pH에서 약 20 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 항-BCMA ADC, 약 10 mM 내지 약 25 mM의 완충제, 약 120 mM 내지 약 240 mM의 폴리올을 포함하는 제제에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 제제는 약 5.9 내지 약 6.5의 pH에서 약 20 mg/mL 내지 약 60 mg/mL의 항-BCMA ADC, 약 10 mM 내지 약 30 mM의 시트레이트 완충제, 약 120 mM 내지 약 240 mM의 트레할로스, 약 0.01 mM 내지 약 0.1 mM의 EDTA, 약 0.01% 내지 약 0.05%의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함한다.

한 실시양태에서, 조성물은 제제 중에 ADC를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL2 및 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독소는 MMAE 또는 MMAF이고; 여기서 제제는 약 5.9 내지 약 6.5의 pH에서 약 20 mg/mL 내지 약 60 mg/mL의 ADC, 약 10 mM 내지 약 30 mM의 시트레이트 완충제, 약 120 mM 내지 약 240 mM의 트레할로스, 약 0.01 mM 내지 약 0.1 mM의 EDTA, 약 0.01% 내지 약 0.05%의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함한다.

한 실시양태에서, 조성물은 제제 중에 ADC를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 V_H 및 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 V_L을 포함하고; 여기서 세포독소는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 제제는 약 5.9 내지 약 6.5의 pH에서 약 20 mg/mL 내지 약 60 mg/mL의 ADC, 약 10 mM 내지 약 30 mM의 시트레이트 완충제, 약 120 mM 내지 약 240 mM의 트레할로스, 약 0.01 mM 내지 약 0.1 mM의 EDTA, 약 0.01% 내지 약 0.05%의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함한다.

한 실시양태에서, 조성물은 제제 중에 ADC를 포함하며, 여기서 ADC는 벨란타맙 마포도틴이고; 여기서 제제는 약 5.9 내지 약 6.5의 pH에서 약 20 mg/mL 내지 약 60 mg/mL의 벨란타맙 마포도틴, 약 10 mM 내지 약 30 mM의 시트레이트 완충제, 약 120 mM 내지 약 240 mM의 트레할로스, 약 0.01 mM 내지 약 0.1 mM의 EDTA, 약 0.01% 내지 약 0.05%의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함한다.

한 실시양태에서, 조성물은 제제 중에 벨란타맙 마포도틴을 포함하며, 제제는 약 5.9 내지 약 6.5의 pH에서 약 20 mg/mL, 약 25 mg/mL, 약 50 mg/mL 또는 60 mg/mL 벨란타맙 마포도틴, 25 mM 시트레이트 완충제, 200 mM 트레할로스, 0.05 mM 디소듐 EDTA, 0.02% 폴리소르베이트 또는 80 폴리소르베이트 80을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 각각의 mL의 조성물은 약 6.2의 pH에서 벨란타맙 마포도틴 (50 mg), 시트르산 (0.42 mg), 에데트산이나트륨 2수화물 (0.019 mg), 폴리소르베이트 80 (0.2 mg), 트레할로스 2수화물 (75.6 mg) 및 시트르산삼나트륨 2수화물 (6.7 mg)을 포함한다.

"안정한" 제제는 그 안의 단백질이 제조, 수송, 저장 및 투여 동안 그의 물리적 및/또는 화학적 안정성을 본질적으로 유지하는 것이다. 안정성은 선택된 온도에서 선택된 기간 동안 측정될 수 있다. 예를 들어, 2℃ 내지 8℃의 권장 온도에서 저장된 생성물의 경우에, 제제는 실온, 약 30℃ 또는 40℃에서 적어도 1개월 동안 안정하고/거나 약 2 내지 8℃에서 적어도 1년 동안, 바람직하게는 적어도 2년 동안 안정하다. 예를 들어, 저장 동안 응집의 정도는 단백질 안정성의 지표로서 사용될 수 있다. 따라서, "안정한" 제제는, 예를 들어 단백질의 약 10% 미만, 바람직하게는 약 5% 미만이 제제 중에 응집체로서 존재하는 것일 수 있다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술이 관련 기술분야에서 이용가능하고, 예를 들어 문헌 [Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]에서 검토된다.

본 개시내용의 특정 측면에서, 제제는 조성물이 동결, 해동 및/또는 혼합에 대해 안정하게 유지되도록 한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 제제 중 조성물을 보유하는 용기를 포함하는 제조 물품, 예를 들어 키트에 관한 것이다. 한 측면에서, 제제를 포함하는 주사 장치가 제공된다. 주사 장치는 펜 주사기 장치 또는 자가주사기 장치를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제제는 사전충전된 시린지에 함유된다.

치료 방법 및 사용을 위한 조성물

본 개시내용의 조성물은 B-세포 관련 장애 또는 질환, 예컨대 항체-매개된 또는 형질 세포 매개된 질환, 또는 형질 세포 악성종양 (예를 들어, 암, 예컨대 다발성 골수종), 또는 항-BCMA ADC에 의해 치료될 수 있는 다른 질환의 치료에 대한 치료 접근법을 제공할 수 있다. 특히 본 개시내용의 목적은 BCMA (예를 들어, 인간 BCMA)에 특이적으로 결합하고 BCMA와 그의 리간드, 예컨대 BAFF 및/또는 APRIL 사이의 상호작용의 조정에 대해 반응성인 질환 및 장애의 치료에서 그러한 상호작용을 조정 (예를 들어, 억제 또는 차단)하는 항-BCMA ADC를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 개시내용의 또 다른 측면에서, B-세포 관련 장애 또는 질환, 예컨대 항체-매개된 또는 형질 세포 매개된 질환, 또는 형질 세포 악성종양 (예를 들어, 암, 예컨대 다발성 골수종)을 앓는 대상체 (예를 들어, 인간 환자)를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 항-BCMA ADC 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 암 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 치료 유효량의 본원에 기재된 항-BCMA ADC 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본원에 사용된 용어 "암" 및 "종양"은 상호교환가능하게 사용되고, 단수 또는 복수 형태로, 숙주 유기체에 대해 병원성이게 만드는 형질전환, 예컨대 악성 형질전환을 겪은 세포를 지칭한다. 원발성 암 세포는 널리 확립된 기술, 특히 조직학적 검사에 의해 비-암성 세포와 용이하게 구별될 수 있다. 본원에 사용된 암 세포의 정의는 원발성 암 세포뿐만 아니라 암 세포 선조로부터 유래된 임의의 세포를 포함한다. 이는 전이된 암 세포, 및 암 세포로부터 유래된 시험관내 배양물 및 세포주를 포함한다. 통상적으로 고형 종양으로서 나타나는 암의 유형을 지칭하는 경우에, "임상적으로 검출가능한" 종양은 종양 덩이에 기초하여; 예를 들어, 신체 검사 시 컴퓨터 단층촬영 (CT) 스캔, 자기 공명 영상화 (MRI), X선, 초음파 또는 촉진과 같은 절차에 의해 검출가능하고/거나, 환자로부터 수득가능한 샘플에서 1종 이상의 암-특이적 항원의 발현으로 인해 검출가능한 것이다. 종양은 조혈 (또는 혈액 또는 혈액학적 또는 혈액-관련) 암, 예를 들어 혈액 세포 또는 면역 세포로부터 유래된 암일 수 있으며, 이는 "액상 종양"으로 지칭될 수 있다. 혈액 종양에 기초한 임상 상태의 구체적 예는 백혈병, 예컨대 만성 골수구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 급성 림프구성 백혈병; 형질 세포 악성종양, 예컨대 다발성 골수종, MGUS 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 림프종, 예컨대 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종 등을 포함한다.

암은 비정상적 수의 모세포 또는 원치않는 세포 증식이 존재하거나 또는 림프성 및 골수성 악성종양 둘 다를 포함한 혈액암으로 진단되는 임의의 암일 수 있다. 골수성 악성종양은 급성 골수성 (또는 골수구성 또는 골수 또는 골수모구성) 백혈병 (미분화 또는 분화), 급성 전골수성 (또는 전골수구성 또는 전골수 또는 전골수모구성) 백혈병, 급성 골수단핵구성 (또는 골수단핵모구성) 백혈병, 급성 단핵구성 (또는 단핵모구성) 백혈병, 적백혈병 및 거핵구성 (또는 거핵모구성) 백혈병을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 백혈병은 함께 급성 골수성 (또는 골수구성 또는 골수) 백혈병 (AML)으로 지칭될 수 있다. 골수성 악성종양은 또한 만성 골수 (또는 골수성) 백혈병 (CML), 만성 골수단핵구성 백혈병 (CMML), 본태성 혈소판혈증 (또는 혈소판증가증) 및 진성 다혈구혈증 (PCV)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 골수증식성 장애 (MPD)를 포함한다. 골수성 악성종양은 또한 특히 불응성 빈혈 (RA), 과다 모세포 동반 불응성 빈혈 (RAEB) 및 변환 중 과다 모세포 동반 불응성 빈혈 (RAEBT)로 지칭될 수 있는 골수이형성증 (또는 골수이형성 증후군 또는 MDS); 뿐만 아니라 원인불명 골수 화생의 존재 또는 부재 하의 골수섬유증 (MFS)을 포함한다.

조혈암은 또한 림프절, 비장, 골수, 말초 혈액 및/또는 림프절외 부위에 영향을 미칠 수 있는 림프성 악성종양을 포함한다. 림프성 암은 B-세포 비-호지킨 림프종 (B-NHL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 B-세포 악성종양을 포함한다. B-NHL은 무통성 (또는 저-등급), 중간-등급 (또는 공격성) 또는 고-등급 (매우 공격성)일 수 있다. 무통성 B-세포 림프종은 여포성 림프종 (FL); 소림프구성 림프종 (SLL); 변연부 림프종 (MZL), 예컨대 결절성 MZL, 림프절외 MZL, 비장 MZL 및 융모성 림프구를 갖는 비장 MZL; 림프형질세포성 림프종 (LPL); 및 점막-연관-림프성 조직 (MALT 또는 림프절외 변연부) 림프종을 포함한다. 중간-등급 B-NHL은 백혈병성 침범의 존재 또는 부재 하의 외투 세포 림프종 (MCL), 미만성 대세포 림프종 (DLBCL), 여포성 대세포 (또는 등급 3 또는 등급 3B) 림프종 및 원발성 종격 림프종 (PML)을 포함한다. 고-등급 B-NHL은 버킷 림프종 (BL), 버킷-유사 림프종, 소형 비-분할 세포 림프종 (SNCCL) 및 림프모구성 림프종을 포함한다. 다른 B-NHL은 면역모세포성 림프종 (또는 면역세포종), 원발성 삼출 림프종, HIV 연관 (또는 AIDS 관련) 림프종 및 이식후 림프증식성 장애 (PTLD) 또는 림프종을 포함한다. B-세포 악성종양은 또한 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 전림프구성 백혈병 (PLL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (WM), 모발상 세포 백혈병 (HCL), 거대 과립 림프구 (LGL) 백혈병, 급성 림프성 (또는 림프구성 또는 림프모구성) 백혈병 및 캐슬만병을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. NHL은 또한 T-세포 비-호지킨 림프종 (T-NHL)을 포함할 수 있으며, 이는 특히 상세불명 (NOS) T-세포 비-호지킨 림프종, 말초 T-세포 림프종 (PTCL), 역형성 대세포 림프종 (ALCL), 혈관면역모세포성 림프성 장애 (AILD), 비강 자연 킬러 (NK) 세포/T-세포 림프종, 감마/델타 림프종, 피부 T 세포 림프종, 균상 식육종 및 세자리 증후군을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

조혈암은 또한 전형적 호지킨 림프종, 결절성 경화성 호지킨 림프종, 혼합 세포충실성 호지킨 림프종, 림프구 우세형 (LP) 호지킨 림프종, 결절성 LP 호지킨 림프종 및 림프구 고갈된 호지킨 림프종을 포함한 호지킨 림프종 (또는 질환)을 포함한다. 조혈암은 또한 형질 세포 질환 또는 암, 예컨대 다발성 골수종 (MM) (무증상 MM 포함), 의미 불명 (또는 미지 또는 불명확)의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 형질세포종 (골, 골수외), 림프형질세포성 림프종 (LPL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 형질 세포 백혈병 및 원발성 아밀로이드증 (AL)을 포함한다. 조혈암은 또한 추가의 조혈 세포, 예컨대 다형핵 백혈구 (또는 호중구), 호염기구, 호산구, 수지상 세포, 혈소판, 적혈구 및 자연 킬러 세포의 다른 암을 포함할 수 있다. 본원에서 "조혈 세포 조직"으로 지칭되는 조혈 세포를 포함하는 조직은 골수; 말초 혈액; 흉선; 및 말초 림프성 조직, 예컨대 비장, 림프절, 점막과 연관된 림프성 조직 (예컨대 장-연관 림프성 조직), 편도, 파이어판 및 충수, 및 다른 점막, 예를 들어 기관지 내층과 연관된 림프성 조직을 포함한다.

한 실시양태에서, 암은 결장직장암 (CRC), 위암, 식도암, 자궁경부암, 방광암, 유방암, 두경부암, 난소암, 흑색종, 신세포 암종 (RCC), EC 편평 세포암, 비소세포 폐 암종, 중피종, 췌장암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본원에 사용된 용어 "치료하는" 및 그의 파생어는 치료 요법을 포함하는 것으로 의도된다. 특정한 상태와 관련하여, 치료는 다음을 의미한다: (1) 상태 또는 상태의 생물학적 징후 중 1종 이상을 호전시키는 것; (2) (a) 상태를 유발하거나 또는 그의 원인이 되는 생물학적 캐스케이드에서의 1개 이상의 지점 또는 (b) 상태의 생물학적 징후 중 1종 이상을 방해하는 것; (3) 상태와 연관된 증상, 효과 또는 부작용 중 1종 이상, 또는 상태 또는 그의 치료와 연관된 증상, 효과 또는 부작용 중 1종 이상을 완화시키는 것; (4) 상태 또는 상태의 생물학적 징후 중 1종 이상의 진행을 늦추는 것 및/또는 (5) 상태의 생물학적 징후 중 1종 이상을 그 징후에 대해 완화 상태인 것으로 간주되는 기간 동안 완화 기간에 걸친 추가의 치료 없이 제거하거나 검출불가능한 수준으로 감소시킴으로써 상기 상태 또는 상태의 생물학적 징후 중 1종 이상을 치유하는 것. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 특정한 질환 또는 상태에 대해 완화인 것으로 간주되는 지속기간을 이해할 것이다.

B-세포 장애는 B-세포 발생/이뮤노글로불린 생산의 결함 (예를 들어, 면역결핍) 및 과도한/비제어된 증식 (예를 들어, 림프종, 백혈병)으로 나누어질 수 있다. 본원에 사용된 B-세포 장애는 두 유형의 질환을 지칭하며, 본원에 기재된 조성물로 B-세포 장애를 치료하는 방법이 제공된다.

특정한 측면에서, 질환 또는 장애는 다발성 골수종 (MM), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 고립성 형질세포종 (골, 골수외), 아밀로이드증 (AL), 무증상 다발성 골수종 (SMM), 고립성 형질세포종 (골, 골수외) 또는 발덴스트롬 마크로글로불린혈증이다.

예방적 요법이 또한 고려된다. 통상의 기술자는 "예방"이 절대적인 용어가 아니라는 것을 인지할 것이다. 의약에서, "예방"은 상태 또는 그의 생물학적 징후의 가능도 또는 중증도를 실질적으로 감소시키기 위한 또는 이러한 상태 또는 그의 생물학적 징후의 발병을 지연시키기 위한 약물의 예방적 투여를 지칭하는 것으로 이해된다. 예방적 요법은, 예를 들어 대상체가 암 발생 위험이 높은 것으로 간주되는 경우에, 예컨대 대상체가 강한 암 가족력을 갖는 경우에 또는 대상체가 발암물질에 노출된 경우에 적절하다.

"대상체" 또는 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 치료를 필요로 하는 임의의 사람, 예를 들어 암 치료를 필요로 하는 사람을 포함하도록 광범위하게 정의된다. 대상체는 포유동물을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체는 인간 환자이다. 암 치료를 필요로 하는 대상체는 새로 진단된, 재발성, 불응성, 진행성 질환, 완화 등을 포함한 다양한 단계로부터의 환자를 포함할 수 있다. 암 치료를 필요로 하는 대상체는 또한 줄기 세포 이식을 받았거나 또는 이식 부적격으로 간주되는 환자를 포함할 수 있다.

대상체는 본원에 기재된 조성물로의 치료를 위해 선택되도록 사전-스크리닝될 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체로부터의 샘플은 본원에 기재된 조성물로의 치료 전에 BCMA의 발현에 대해 시험된다.

대상체는 본 개시내용의 조성물로 치료되기 전에 적어도 1종의 선행 암 요법을 받았을 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체는 본 개시내용의 조성물로 치료되기 전에 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종, 적어도 5종, 적어도 6종 또는 적어도 7종의 선행 암 요법으로 치료되었다.

또 다른 실시양태에서, 대상체는 새로 진단된 암을 갖고, 본 개시내용의 조성물로 치료되기 전에 0종의 선행 요법을 받았다.

본 개시내용의 조성물은 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 조성물의 경우에, 적합한 경로는 경구, 직장, 비강, 국소 (협측 및 설하 포함), 질, 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 피내, 척수강내 및 경막외 포함) 및 종양내를 포함한다. 바람직한 경로는, 예를 들어 수용자의 상태 및 치료될 암에 따라 달라질 수 있는 것으로 인지될 것이다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 제약 조성물로서 투여된다.

본원에 사용된 용어 "투여하는"은 치료 목적을 달성하기 위한 본원에 기재된 조성물의 전달을 지칭하는 것으로 의도된다. 조성물은 임상 이익을 달성하기에 충분한 기간 동안 투여 간격으로 투여될 수 있다. 조성물은 요법을 특정한 부위에 표적화하는 방식으로 대상체에게 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 조성물은 주사에 의해 투여된다. 따라서, 한 측면에서 본 개시내용의 조성물, 제약 조성물 또는 제제를 포함하는 주사 장치가 제공된다. 주사 장치는 펜 주사기 장치 또는 자가주사기 장치를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 조성물의 "치료 유효량" 또는 "치료 유효 용량"은 B-세포 매개된 장애 또는 장애의 증상의 예방 또는 치료 또는 완화에 효과적인 양을 지칭한다. 치료 유효량 및 치료 요법은 일반적으로 실험적으로 결정되며, 환자의 연령, 체중 및 건강 상태 및 치료될 질환 또는 장애와 같은 인자에 의존할 수 있다. 이러한 인자는 담당 의사의 권한 내에 있다.

항-BCMA ADC를 포함하는 조성물의 적절한 치료 유효 용량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 것이다. 본원에 기재된 조성물의 적합한 용량은 환자에 대해 그의 체중에 따라 계산될 수 있으며, 예를 들어 적합한 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 예를 들어 약 1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 예를 들어 약 10 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 또는 예를 들어 약 1 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 예를 들어 약 10 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 범위일 수 있다.

한 실시양태에서, 항-BCMA ADC를 포함하는 조성물의 치료 유효 용량은 약 0.03 mg/kg 내지 약 4.6 mg/kg의 범위이다. 또 다른 실시양태에서, 항-BCMA ADC를 포함하는 조성물의 치료 유효 용량은 적어도 약 0.03 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.12 mg/kg, 0.24 mg/kg, 0.48 mg/kg, 0.96 mg/kg, 1 mg/kg, 1.92 mg/kg, 3.4 mg/kg 또는 4.6 mg/kg이다. 또 다른 실시양태에서, 항-BCMA ADC를 포함하는 조성물의 치료 유효 용량은 1.9 mg/kg, 2.5 mg/kg 또는 3.4 mg/kg이다.

특정 실시양태에서, 조성물은 1종 이상의 추가의 치료제와 함께 대상체에게 공-투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 1종 이상의 추가의 암 치료제와 함께 대상체에게 공-투여될 수 있다. 추가의 암 치료제는 다른 면역조정 약물, 치료 항체 (예를 들어, 항-CD38 항체, 예컨대 다라투무맙), CAR-T 치료제, BiTE, HDAC 억제제, 프로테아솜 억제제 (예를 들어, 보르테조밉), 항염증 화합물 및 면역조정 이미드 약물 (IMiD) (예를 들어, 탈리도미드 및 그의 유사체)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

"공-투여"는 동일한 제약 조성물 또는 개별 제약 조성물로 조합되어 대상체에게 투여되는 2종 이상의 상이한 제약 조성물 또는 치료 (예를 들어, 방사선 치료)의 투여를 의미한다. 따라서, 공-투여는 2종 이상의 제약 작용제를 포함하는 단일 제약 조성물을 동시에 투여하는 것 또는 2종 이상의 상이한 조성물을 동일한 대상체에게 동일하거나 상이한 시간에 투여하는 것을 수반한다.

본 개시내용의 한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 항-BCMA ADC를 포함하는 임의의 조성물의 치료 유효 용량을 투여함으로써 B-세포 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 B-세포 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

본 개시내용의 한 측면에서, 본 개시내용은 B-세포 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 제공한다. 본 개시내용의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 암의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 제공한다.

본 개시내용의 한 측면에서, B-세포 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서의 조성물의 용도가 제공된다. 본 개시내용의 또 다른 측면에서, 암의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서의 조성물의 용도가 제공된다.

본원에 개시된 모든 특허 및 참고 문헌은 명백하게 및 전적으로 본원에 참조로 포함된다.

실시예

시약 및 장비

표준 mAb 제조 절차를 사용하여 벨란타맙을 생산하고 정제하였다. 이어서, 벨란타맙을 MMAF와 접합시켜 벨란타맙 마포도틴 ADC 약물 물질을 생산하였다. 모든 샘플을 분석 전에 -80℃에서 제제 완충제 중에 저장하였다.

말레이미도카프로일 모노메틸아우리스타틴 F (mcMMAF)를 메드켐익스프레스(MedChemExpress) (뉴저지주 몬마우스 정션)로부터 구입하였다. 동위원소-표지된 물 (H₂ ¹⁸O, 97%), 디티오트레이톨 (DTT), 소듐 아이오도아세테이트 (IAA), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 염화칼슘 및 디메틸 술폭시드 (DMSO)를 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미주리주 세인트 루이스)로부터 구입하였다. 구아니딘 HCl을 엠피 바이오메디칼즈(MP Biomedicals) (캘리포니아주 어바인)로부터 구입하였다. 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 스핀 칼럼을 바이오-라드(Bio-Rad) (캘리포니아주 허큘레스)로부터 구입하였고, 트립신을 워싱턴 바이오케미칼(Worthington Biochemical) (뉴저지주 레이크우드)로부터 구입하였다. 트리스 염기, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 이나트륨 염, 염산 및 LC-MS-등급 트리플루오로아세트산 (TFA), 물 (H₂O) 및 아세토니트릴 (ACN)을 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific) (매사추세츠주 월섬)으로부터 구입하였다.

써모 사이언티픽 오비트랩 XL 질량 분광계에 연결된 워터스(Waters) BEH 300 C18 칼럼 (2.1 x 150 mm, 1.7 μm 입자)이 장착된 워터스 액퀴티 UPLC 시스템 상에서 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광측정법 (LC-MS/MS) 분석을 수행하였다.

제보(Xevo) G2-XS 질량 분광계에 연결된 워터스 BEH200 SEC (4.6 x 150 mm, 1.7 μm 입자)가 장착된 워터스 액퀴티 UPLC 시스템 상에서 환원 LC-MS 분석을 수행하였다.

실시예 1: MMAF의 안정한 동위원소 표지

샘플 제조

MMAF (20 mg)를 120 μL의 아세토니트릴 중에 용해시키고 H₂ ¹⁸O 중 2.5% (v/v) TFA 80 μL와 혼합하여 1% TFA 60:40 ACN:H₂ ¹⁸O 중 100 mg/mL MMAF의 최종 반응 조건을 제공하였다. 용액을 광으로부터 보호된 실온에서 14일 동안 반응시켰다. 분취물 (10 μL)을 분석시까지 -80℃에서 동결시켰다.

분취물을 50:50 ACN:H₂O로 1000x (0.1 mg/mL) 희석하고, 0.2 mL/분의 유량으로 5분에 걸쳐 0%에서 100% B의 선형 구배를 사용하는 역상 액체 크로마토그래피 분리를 사용하여 분석함으로써 표지된 MMAF의 동위원소 순도를 결정하였다. 이동상 A는 물 중 0.1% TFA였고, 이동상 B는 ACN 중 0.09% TFA였다. 칼럼을 3분 동안 100% B로 플러싱하고, 각각의 주입 후에 12분 동안 0% B로 재평형화시켰다. 칼럼 온도는 30℃이고, 오토샘플러 온도는 5℃이고, 주입 부피는 5 μL였다.

UV 검출 (215 nm)-후 데이터-의존성 획득 모드 (1 MS 스캔에 이어서 2 MS/MS 스캔)로 작동하는 MS 분석을 수행하였다. 전기분무 이온화 (ESI) 분무 전압은 4.5 kV이고, 시스 기체 유량은 40 L/분이고, 보조 기체 유량은 5 L/분이고, 모세관 전압은 60 V이고, 모세관 온도는 250℃이고, 튜브 렌즈는 120 V이고, 스캔 범위는 m/z 250 내지 2000이었다. 써모 엑스칼리버(Thermo Xcalibur) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 검사하였다.

결과 및 논의

이전에 기재된 산-매개된 용매 교환 메카니즘 (Liu et al., Advances and applications of stable isotope labeling-based methods for proteome relative quantitation. Trends in Anal. Chem. 2020, 124, 115815)을 사용하여 MMAF의 안정한 동위원소 표지를 수행하였다. 간략하게, 2개의 18-산소 원자를 산성 조건 하에 반응시켰을 때 오르토-산 중간체를 통해 동위원소-표지된 물로부터 카르복실산 관능기로 교환시킬 수 있다. 산 농도 [0.1% - 10% (v/v)], 산 유형 (TFA 또는 FA), 반응 온도 (실온, 37℃, 70℃) 및 유기 상 (ACN 또는 DMSO)을 포함한 여러 표지 최적화 조건을 조사하였다. 반응 시간은 1시간 - 6주의 범위였으며, 보다 높은 산 농도 및 온도는 예상된 바와 같이 보다 빠른 표지 동역학을 유발하였다. 50:50 ACN:H₂ ¹⁸O 중 0.1 mg/mL MMAF를 사용하여 최적화 실험을 수행하였다. 50:50 ACN:H₂ ¹⁸O 중에서 형성되는 얇은 유기 용매 층으로 인해, 농축된 배치 (100 mg/mL)를 60:40 ACN:H₂ ¹⁸O 중에서 표지하였다.

MMAF 가수분해의 최소화 (도 1)는 비점유된 ADC 접합 부위에 대해 표지된 MMAF와 잠재적으로 경쟁하는 말레이미드-함유 단편으로 인해 표지 반응 조건을 최적화하는 데 있어서 주요 인자였다. 표지 반응은 이러한 제한 하에 평형상태로 진행될 수 없었고, 최소 비표지된 (+0 Da) MMAF가 남아있을 때 중지되었다. 이는 단일-표지된 (+2 Da) 및 이중-표지된 (+4 Da) MMAF의 혼합물을 생성하였다. 이러한 불일치는 MS 데이터 처리 동안 설명되었다. 최종 표지 반응 조건 (14일 동안 실온에서 1% TFA)은 궁극적으로 충분한 표지 (+0 Da MMAF의 최소화) 및 최소 가수분해 (< 5%)에 기초하여 선택되었다.

실시예 2: ADC 환원 및 동위원소-표지된 MMAF와의 접합

샘플 제조

벨란타맙 마포도틴 (250 μg, 10 mg/mL)을 제제 완충제 (pH 6.2) 중에서 37℃에서 15분 동안 1.25 μL의 1 M DTT로 부분적으로 환원시켰다. 제제 완충제로 평형화된 SEC 스핀 칼럼을 통해 샘플을 용리시킴으로써 과량의 DTT를 제거하였다. 이어서, 샘플을 실온에서 30분 동안 1 μL의 100 mg/mL 동위원소-표지된 MMAF와 접합시켰다. 제제 완충제로 평형화된 SEC 스핀 칼럼을 통해 샘플을 용리시킴으로써 과량의 MMAF를 제거하였다.

샘플을 물로 1 mg/mL로 희석하고, 0.2 mL/분의 유량으로 65:35 ACN:H₂O 이동상 중 0.1% TFA를 사용하는 등용매 크기 배제 액체 크로마토그래피 분리를 사용하여 분석함으로써 접합 효율을 결정하였다. 칼럼 온도는 25℃이고, 오토샘플러 온도는 5℃이고, 주입 부피는 1 μL였다.

UV 검출 (215 nm)-후 민감성 모드로 MS 분석을 수행하였다. 전기분무 이온화 (ESI) 분무 전압은 2.2 kV이고, 샘플링 콘은 120이고, 소스 온도는 150℃이고, 소스 오프셋은 80 V이고, 탈용매화 온도는 500℃이고, 콘 기체 유량은 60 L/hr이고, 탈용매화 기체 유량은 800 L/hr이었다. 스캔 범위는 m/z 700 내지 5000이고, 스캔 시간은 1초였다. 워터스 매스링스(Waters MassLynx) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 검사하였다.

결과 및 논의

환원/접합 계획: 간략하게, 벨란타맙을 TCEP로 부분적으로 환원시키고, 후속적으로 MMAF와 접합시킨다. TCEP는 전형적으로 각각 MMAF 및 DTT의 말레이미드와 티올 기 사이의 경쟁 부반응을 피하기 위해 DTT에 유리하게 사용된다. 초기 환원/접합 실험은 TCEP가 DTT와 비교하여 더 큰 접합 효율을 가능하게 하였다는 것을 확인하였지만; 레거시 방법을 사용한 후속 펩티드 맵핑 분석은 DTT가 모든 나머지 디술피드 결합의 완전한 환원에 사용될 것을 요구하였다. 두 환원 단계를 위해 DTT를 선택하였고, 후속 MMAF 접합 전에 SEC 스핀 칼럼으로 과량의 DTT를 제거하여 최소 가수분해 단편 접합을 갖는 완전히 접합된 경쇄 및 중쇄를 생성하였다 (도 2).

실시예 3: 벨란타맙 마포도틴의 안정한 동위원소 표지 펩티드 맵핑 LC-MS/MS 분석

샘플 제조

벨란타맙 마포도틴 (250 μg, 10 mg/mL)을 환원시키고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 동위원소-표지된 MMAF와 접합시켰다. 이어서, 샘플을 표준 펩티드 맵핑 절차로 거의 건조되도록 증발시키고 (~5 μL), 60 μL의 변성 완충제 (6 M 구아니딘 HCl, 1.2 M 트리스 HCl, 2.5 mM Na₂EDTA, pH 7.5)를 첨가하여 변성시키고, 실온에서 2분 동안 볼텍싱함으로써 제조하였다. 샘플을 3 μL의 1 M DTT를 첨가하고 실온에서 20분 동안 인큐베이션함으로써 환원시킨 다음, 7.2 μL의 1 M IAA를 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 알킬화하였다. 4.2 μL의 1 M DTT를 첨가하여 알킬화물을 켄칭하였다. 이어서, 샘플을 SEC 스핀 칼럼을 사용하여 소화 완충제 (50 mM 트리스, 1 mM CaCl₂, pH 7.5)로 완충제 교환하고, 2.5 μL의 5 mg/mL 트립신 (1:20 효소:단백질)을 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 소화시켰다. 3 μL의 1 N HCl을 첨가하여 소화물을 켄칭하고, LC-MS/MS 분석을 위해 10 μL를 주입하였다.

90분 내 0%에서 40% B에 이어서 10분 내 40%에서 60% B의 2-단계 구배를 제외하고는 실시예 2에 기재된 바와 동일한 LC-MS/MS 조건을 사용하여 샘플을 분석하였다. 칼럼을 12분 동안 100% B로 플러싱하고, 각각의 주입 후에 18분 동안 0% B로 재평형화시켰다. 프로테인 메트릭스 바이오스(Protein Metrics Byos) 소프트웨어 (캘리포니아주 쿠퍼티노)를 사용하여 서열 커버리지 및 PTM 데이터를 분석하였다. 스카이라인(Skyline) 소프트웨어 (유니버시티 오브 워싱턴(University of Washington))를 사용하여 동위원소 접합 데이터를 분석하였다.

결과 및 논의

시스테인-접합된 ADC는 전형적으로 쇄간 디술피드 결합에 수반되는 시스테인 잔기에서 접합된다. 이들 디술피드 결합의 환원은 8개의 잠재적 접합 부위를 생성한다 (각각의 경쇄 상에 1개, 각각의 중쇄 Fab 영역에 1개 및 각각의 중쇄 힌지 영역에 2개). 짝수의 약물-로딩된 종은 전형적으로 각각의 디술피드 결합 환원이 2개의 유리 술프히드릴 기를 생성하는 것으로 인해 나타난다. 이러한 과정은 가능한 위치 이성질체와 함께 DL0 내지 DL8 범위의 약물-로딩된 종을 생성한다 (도 3).

SIL 펩티드 맵핑은 천연 및 접합된 펩티드에 대해 별개의 피크를 생성한 표준 펩티드 맵핑과 비교하여 천연 및 표지된 버전의 접합된 펩티드를 둘 다 함유한 액체 크로마토그래피 피크를 생성하였다 (도 4). SIL 샘플에 대한 접합된 펩티드 피크 데이터는 스카이라인 소프트웨어를 사용하여 추출된 이온 크로마토그램 (XIC)을 적분하여 관심 개별 동위원소에 대한 피크 면적을 생성함으로써 처리하였다.

SIL은 천연 및 SIL 펩티드의 동위원소 외피를 완전히 분리하기에 충분히 큰 질량 변화를 유도하지는 않았다. 이는 천연 또는 SIL 접합된 펩티드에 상응하는 동중 동위원소의 중첩으로 인해 동위원소 이성질체 (동위원소이성질체)의 혼합물을 생성하였다. 따라서, 비표지된 ADC 샘플로부터 계산된 이론적 동위원소 비를 사용하여 경쇄 및 중쇄 Fab 펩티드에 대한 M+2 - M+4 동위원소이성질체의 천연 동위원소 기여도를 계산하였다 (도 5 및 도 6). 이러한 계산은 또한 단일-표지된 (+2 Da) MMAF와 접합된 부위에 대해 보정하였다. 이어서, 합계낸 천연 동위원소이성질체 피크 면적을 총 동위원소이성질체 피크 면적으로 나누어 펩티드 접합 수준을 결정하였다.

이중-접합된 (DL2, C230 및 C233) 및 천연 (DL0) 버전의 힌지 펩티드에 대한 이론적 동위원소 비를 각각 비표지된 ADC 샘플 및 SIL mAb 중간체 샘플로부터 계산하였다 (도 7). mAb 샘플에 대한 DL0 동위원소 비는 2개의 이용가능한 힌지 접합 부위에서 SIL MMAF의 모든 조합으로 표지된 DL0 펩티드로부터의 동위원소이성질체 기여도를 설명하였다. 이들 DL2 및 DL0 이론적 동위원소 비를 사용하여 각각의 펩티드 형태의 동위원소이성질체 기여도를 계산하였다. 먼저, M 및 M+1 동위원소이성질체 피크 면적을 DL2 펩티드와 완전히 연관된 것으로 가정하였다. 이어서, M+1 피크 면적에 각각의 동위원소이성질체의 DL2 상대 이론적 동위원소 비를 곱하여 M+2 - M+14 동위원소이성질체에 대한 DL2 기여도를 산출하였다. 다음으로, M+15 및 M+16 동위원소이성질체를 DL0 펩티드와 완전히 연관된 것으로 가정하였다. 이어서, M+15 피크 면적에 각각의 동위원소이성질체의 DL0 상대 이론적 동위원소 비를 곱하여 M+2 - M+14 동위원소이성질체에 대한 DL0 기여도를 산출하였다. 최종적으로, DL2 및 DL0 동위원소이성질체 피크 면적 둘 다를 각각의 총 동위원소이성질체 피크 면적으로부터 차감하여 단일-접합된 (DL1, C230 또는 C233) 힌지 펩티드 기여도를 산출하였다. 이어서, 각각의 형태의 합계낸 동위원소이성질체 피크 면적을 총 동위원소이성질체 피크 면적으로 나누어 각각의 힌지-접합 펩티드 형태의 수준을 결정하였다. 흥미롭게도, 이러한 데이터 처리 방법을 문헌 [Jennings and Matthews (Determination of Complex Isotopomer Patterns in Isotopically Labeled Compounds by Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2005, 77, 6435-6444)]에 기재된 보다 엄격한 알고리즘과 비교하였으며, 두 방법은 유사한 결과를 생성하였다.

SIL 펩티드 맵핑과 표준 펩티드 맵핑의 비교

0.0-5.7 범위의 DAR을 갖는 샘플을 생성하는 벨란타맙 (mAb) 및 벨란타맙 마포도틴 (ADC)의 선형 조합으로 구성된 샘플을 시험함으로써 방법 선형성을 조사하였다 (표 1 및 표 2). 표준 펩티드 맵핑은 경쇄 및 중쇄 Fab 접합 수준을 정량화할 때 감소된 민감성 및 선형성을 겪었으며, 이는 천연 펩티드와 접합된 펩티드 사이의 상대 정량화를 사용하는 것의 비실용성을 보여준다. 한편, SIL 펩티드 맵핑은 모든 샘플에 걸쳐 두 부위에 대해 탁월한 선형성 (R² ≥ 0.996)을 생성하였다 (도 8). 두 방법은 단일- 및 이중-접합된 힌지 부위에 대해 선형 결과를 제공하였지만; SIL 펩티드 맵핑은 단일-접합된 힌지와 비교하여 이중-접합된 힌지의 양 사이에서 더 큰 불일치를 나타냈다. 단일-접합된 힌지는 직교 방법에 의해 임의의 약물-로딩된 버전의 벨란타맙 마포도틴에 대한 주요 이소형으로서 검출되지 않았다. 이러한 결과는 실험 4에 기재된 약물-로딩된 분획의 SIL 펩티드 맵핑 분석과 매우 상관관계가 있었다. 추가로, SIL 펩티드 맵핑으로부터 계산된 DAR 값은 표준 펩티드 맵핑과 비교하여 더 우수한 선형성 (R²= 0.998)을 나타냈고, HIC에 의해 결정된 이론적 DAR의 5% 내에서 상관관계가 있었다 (도 9).

벨란타맙 마포도틴 참조 표준 (DAR= 4.0)의 접합 수준을 정량화하고, 두 방법을 사용하여 비교하였다 (표 3). SIL 펩티드 맵핑 제제 (n= 4)를 표준 펩티드 맵핑 제제 (n= 4)와 병행하여 분석하여 반복성을 평가하였다. 표준 펩티드 맵핑 (~90% - 95%)과 비교하여 SIL 펩티드 맵핑에 의해 더 낮은 수준의 경쇄 및 중쇄 Fab 접합 (~70%)이 검출되었다. 표준 펩티드 맵핑 (각각 이중 및 단일-접합된 힌지에 대해 ~15% 및 ~12%)과 비교하여 더 높은 수준의 이중-접합된 힌지 (~25%) 및 더 낮은 수준의 단일-접합된 힌지 (~5% - 10%)가 검출되었다. SIL 펩티드 맵핑으로부터 계산된 DAR 값 (3.9 - 4.0)은 또한 4.0의 이론적 DAR과 비교하였을 때 표준 펩티드 맵핑으로부터 계산된 것 (4.6)보다 더 정확하였다. 벨란타맙 마포도틴의 전형적인 PTM을 또한 정량화하였으며, SIL과 표준 샘플 사이에 어떠한 주요 차이도 검출되지 않았다 (표 4). 모든 샘플에 대해 완전한 서열 커버리지가 또한 검출되었다.

표 1: 선형성 샘플에 사용된 벨란타맙 마포도틴 (ADC) 및 벨란타맙 (mAb) 조합

표 2: 벨란타맙 마포도틴 선형성 샘플에 대한 접합 값 및 계산된 DAR

표 3: 벨란타맙 마포도틴에 대한 표준 및 SIL 펩티드 맵핑 접합 값 및 계산된 DAR의 비교

표 4: 표준 및 SIL 펩티드 맵핑을 사용한 벨란타맙 마포도틴 샘플에 대한 번역후 변형 값

실시예 4: 소수성 상호작용 크로마토그래피 약물-로드 분획의 분석

샘플 제조

차등 DAR 샘플 (DAR = 2.1 - 5.7) 및 개별 약물-로드 샘플 (DL2, DL4a, DL4b 및 DL6)을 이전 실험 3에 기재된 바와 같이 SIL 펩티드 맵핑으로 분석하였다.

결과 및 논의

약물 효능에 대한 DAR의 영향을 평가하기 위한 전임상 연구의 일부로서 2.1 - 5.7 범위의 DAR을 갖는 벨란타맙 마포도틴 샘플을 제조하였다. 이들 샘플에 대한 DAR을 HIC 크로마토그램에서 상이한 약물 로드 종에 대한 피크 면적을 적분함으로써 계산하였다. SIL 펩티드 맵핑 결과 (표 5 및 도 10)는 증가하는 DAR 샘플에 걸쳐 41.8% - 85.8% 범위의 대등한 양의 경쇄 및 중쇄 Fab 접합을 나타냈다. 이러한 결과는 경쇄 및 중쇄 Fab 부위가 디술피드-결합 쌍형성된 것으로 인해 예상되었다. 이중-접합된 힌지는 7.2% - 57.4%의 범위를 나타낸 반면, 단일-접합된 힌지는 5.1% - 15.8%의 훨씬 더 작은 범위를 생성하였으며, 이는 힌지가 더 높은 DAR에서 이중-접합되는 것을 선호함을 강조한다. 흥미롭게도, 단일-접합된 힌지는 4.0 및 4.6 DAR 샘플에서 최대화되었으며, 이는 더 높은 DAR 샘플에서의 환원된 단일-접합된 힌지에 대한 변곡점을 보여준다. HIC 및 SIL 펩티드 맵핑으로부터 계산된 DAR 값은 10% 내에서 상관관계가 있었으며, 이는 "상향식" DAR 특징화를 위한 SIL 펩티드 맵핑의 실용성을 보여주면서 또한 부위-특이적 접합 수준을 제공하였다 (도 11 참조).

개별 약물-로드 벨란타맙 마포도틴 샘플 (DL2, DL4a, DL4b 및 DL6)을 스케일-업 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 방법으로부터 분획-수집하였다 (도 12). DL2, DL4 및 DL6에 대한 주요 위치 이성질체를 직교 분석 방법으로 확인하고, 이론적 접합 부위 점유율 값을 계산하는 데 사용하였다. DL4b 샘플에 대한 이론적 값은 이 샘플이 HIC 피크 중첩으로 인해 DL4a 및 DL4b 이소형의 혼합물이기 때문에 계산되지 않았다. SIL 펩티드 맵핑은 이론적 값과 매우 상관관계가 있는 값을 생성하였다 (표 6). SIL 펩티드 맵핑은 또한 이소형 DL4b 및 DL6에 대한 힌지 접합의 주요 형태를 이중-접합된 것으로서 확인하면서 미량의 단일-접합된 힌지를 검출하였다.

표 5: 벨란타맙 마포도틴 차등 DAR 샘플에 대한 접합 값 및 계산된 DAR

표 6: SIL 펩티드 맵핑을 사용한 벨란타맙 마포도틴 약물-로드 샘플에 대한 이론적 및 실험적 접합 값의 비교 (구조에 기초한 이론적 값)

실시예 5: 약물-로드 변이체의 비-환원 모세관 겔 전기영동 (NR-CGE) 분석

샘플 제조

HIC 정제용 정제 방법을 최적화하고, 60 mg 주입 및 280 nm UV 흡광도에서의 검출과 함께 3.5 mL/분의 유량으로 25℃에서 작동하는 도소(Tosoh) 토요펄 부틸-650S 칼럼 (35 μm, 8 mm x 10 cm) (부품 번호 45126)을 사용하는 AKTA 시스템 상에서 수행하였다. 방법은 pH 7.0에서 1.5 M 황산암모늄 및 50 mM 인산칼륨으로 구성된 초기 이동상 및 pH 7.0에서 20% 2-프로판올 및 50 mM 인산칼륨으로 구성된 용리 이동상의 구배 유동을 사용하였다. 4.5 mL 분획을 피크 정점에서 수집하였다. 각각의 DL 변이체 (DL0, DL2, DL4a, DL4b, DL6 및 DL8)에 대한 분획을 다수의 주입으로부터 수집하고, 풀링하고, 완충제를 제제 완충제로 교환하였다.

결과

정제된 DL 변이체인 DL0, DL2, DL4a, DL4b, DL6 및 DL8을 순도 분석을 위해 방출 및 안정성 HIC 방법을 사용하여 시험하였다. DL 변이체의 HIC 크로마토그램으로부터 수득된 결과가 표 7에 요약된다. DL0, DL2, DL4a 및 DL6의 순도는 90% 초과였다. DL4b 및 DL8은 각각 69.3% 및 81.9% 순도였다.

표 7: 정제된 DL0, DL2, DL4a, DL4b, DL6 및 DL8의 HIC 결과

주: ND = 검출되지 않음; 주요 DL 변이체는 볼드체임.

정제된 DL 변이체의 NR-CGE 분석을 방출 및 안정성 모세관 겔 전기영동 (CGE) 방법을 사용하여 수행하였다. 변성 샘플 제조 절차는 디술피드 결합에 의해 더 이상 연결되지 않는 중쇄 및 경쇄의 해리를 유도하고, 생성된 분리는 약물 접합의 특징적인 지문을 제공한다. 벨란타맙 마포도틴의 잠재적 이소형은 도 3에 개략적으로 도시되고, 각각의 DL 변이체의 이론적 NR-CGE 지문은 표 8에 제시된다.

표 8: 벨란타맙 마포도틴의 잠재적 이소형에 대한 이론적 중쇄 및 경쇄 조합

정제된 DL 변이체의 NR-CGE 분석에 대한 결과가 표 9에 요약된다. 정제된 DL0은 HIC에 의해 94.6% 순도이고 (표 7), NR-CGE에 의해 92.9% IgG이며, 이는 HIC에서의 DL0 피크가 비접합된 IgG일 가능성이 있다는 것을 나타낸다. 정제된 DL0의 NR-CGE 프로파일에서의 추가의 피크는 경쇄 (LC) 및 HC-HC-LC (HHLC) 종을 포함하며, 이는 분획에 존재하는 4.5% DL2로부터의 것일 가능성이 있다.

정제된 DL2는 NR-CGE 분석에서 LC 및 HHLC 종을 우세하게 함유하며, 이는 DL2a와 일치하고, 주요 DL2 변이체가 DL2a라는 것을 나타낸다. 일부 DL2b는 DL2 피크 하에 공동-용리되며, 이는 정제된 DL2에서의 4.4% IgG의 검출에 의해 시사된다.

정제된 DL4a는 NR-CGE 분석에서 LC 및 HC-HC (HHC) 종을 우세하게 함유하며, 이는 DL4a가 벨란타맙 마포도틴에서 우세한 DL4 변이체라는 것을 나타낸다. HIC에서의 DL4a 피크는 주로 LC와 HC 사이의 쇄간 디술피드 결합을 포함하는 4개의 시스테인 잔기에서 접합된 DL 변이체이다. HHLC 단편은 대략 6%로 관찰되고, DL2a 또는 DL4c로부터의 것일 가능성이 있다. 그러나, DL4a의 순도는 제시된 바와 같이 HIC에 의해 97.1%이기 때문에, 잠재적으로 DL4a 피크 하에 일부 종 공동-용리가 존재하며, 이는 보다 높은 HHLC 함량을 설명한다.

정제된 DL4b는 NR-CGE 분석에서 LC, HHC 및 HC-LC (HLC) 종을 우세하게 함유한다. HIC 결과는 분획의 28.6%가 DL4a라는 것을 시사하며, 이는 관찰된 LC 및 HHC 단편을 설명한다. HLC 단편은 DL4b의 결과이고, 벨란타맙 마포도틴의 HIC 분석에서 DL4b 피크 하에 용리되는 종이 힌지 영역 내의 2개의 쇄간 디술피드 결합을 포함하는 4개의 시스테인 잔기에서 우세하게 접합된다는 것을 나타낸다. 정제된 DL4b는 또한 잠재적으로 DL4c 또는 DL6a의 공동-정제로부터의 소량의 HHLC 및 HC 단편을 함유한다.

정제된 DL6은 NR-CGE 분석에서 LC, HC 및 HLC 종의 혼합물을 함유한다. 이는 DL6a와 일치하고, 벨란타맙 마포도틴에서 우세한 DL6 변이체가 힌지 영역 내의 2개의 쇄간 디술피드 결합을 포함하는 4개의 시스테인 잔기 및 LC와 HC 쇄간 디술피드 결합으로부터의 2개의 시스테인 잔기에서 접합된다는 것을 나타낸다. 잠재적으로 DL4a의 공동-정제로부터 HHC 종이 3.2%로 존재한다.

정제된 DL8은 LC 및 HC 종을 우세하게 함유하며, 이는 벨란타맙 마포도틴의 4개의 쇄간 디술피드 결합을 포함하는 8개의 시스테인 잔기에서의 접합과 일치한다. 잠재적으로 DL4b 또는 DL6a의 공동-정제로부터의 HLC 단편은 대략 11%로 존재하며, HIC 분석에서 보고된 피크와 일치한다 (표 7).

정제된 DL0, DL2, DL4a, DL4b, DL6 및 DL8의 대표적인 NR-CGE 전기영동도가 도 13에 나타나 있다.

표 9: 정제된 DL0, DL2, DL4a, DL4b, DL6 및 DL8에 대한 NR-CGE 결과

주: LOQ = 정량 한계

실시예 6: 무손상 및 환원 LC-MS로부터의 결과

실시예 5에 기재된 바와 같이 제조된 정제된 DL 변이체를 무손상 및 환원 LC-MS를 사용하여 분석하였다. 정제된 DL 변이체 내의 총 약물 로드를 무손상 LC-MS 분석을 사용하여 결정하였다. 총 중쇄 및 경쇄 약물 로드를 환원 LC-MS를 사용하여 결정하였다. 결과가 표 10에 제시되고, 스펙트럼이 도 14 및 도 15에 제시된다.

정제된 DL 변이체의 무손상 LC-MS 분석으로부터의 결과는 분석용 HIC 분석으로부터의 순도 결과 (표 7)와 상관관계가 있으며, 두 분석에서 거의 동일한 존재비의 유사한 종이 관찰된다. 이에 대한 예외는 DL3 변이체가 정제된 DL4b 분획에서 HIC에 의해 검출되었지만, 무손상 LC-MS 분석은 이 분획에서 3종의 약물 분자의 약물 로드와 상관관계가 있는 질량을 갖는 종을 검출하지 않는다는 것이다. 이는 정제된 DL4b 분획에서의 DL3 피크가 실제로 3종의 약물 분자의 약물 로드를 갖는 종이 아니라 또 다른 DL4 변이체라는 것을 시사한다.

정제된 DL 변이체의 환원 LC-MS 분석은 NR-CGE 결과에 의해 예측된 접합 패턴과 일치한다. 정제된 DL2는 DL2a와 일치하는 환원 LC-MS 프로파일: LC 및 HC 둘 다에 대해 50% DL0 및 50% DL1을 가지며, 이는 LC와 HC 사이의 쇄간 디술피드 결합을 포함하는 2개의 시스테인 잔기에서의 접합을 나타낸다.

정제된 DL4a의 환원 LC-MS 분석은 LC 및 HC에 대해 각각 93.6% 및 96.9% DL1을 나타내며, 이는 LC와 HC 사이의 두 쇄간 디술피드 결합을 포함하는 4개의 시스테인 잔기에서의 접합과 일치한다. 이는 정제된 DL4a가 거의 전적으로 DL4a 변이체라는 것을 나타낸다. DL2a 및 DL4b는 또한 HIC 결과에서 낮은 수준으로 관찰되고, 환원 LC-MS 분석에서 관찰된 LC DL0 및 HC DL2의 낮은 수준에 기여한다.

순수한 DL4b 변이체의 환원 LC-MS는 100% LC DL0 및 100% HC DL2로 이루어질 것으로 예상된다. LC DL0은 50.8%로 존재하고, HC DL2는 54.7%로 존재하며, 이는 샘플의 대략 50%가 DL4b를 함유한다는 것을 나타낸다. LC의 50%가 DL1이고 HC의 50%가 DL1이기 때문에, 집단에서 DL4a일 가능성이 있다는 것을 나타내며, 이는 HIC에 의해 검출된 30% DL4a와 일치한다. 다른 DL4 변이체는 환원 LC-MS 분석에서 검출된 LC DL1 및 HC DL1 피크에 기여할 수 있다.

정제된 DL6의 환원 LC-MS 분석은 정제된 DL6 분획이 변이체 DL6a라는 것을 나타낸다. 순수한 DL6a 변이체는 LC에 대해 50:50 DL0:DL1 및 HC에 대해 50:50 DL2:DL3으로 이루어질 것으로 예상된다. 순수한 DL6a 분획으로부터 예상되는 것보다 약간 더 많은 LC DL1 및 HC DL2가 존재하며, 이는 잠재적으로 일부 DL6b 변이체가 존재한다는 것을 나타낸다. 이들 결과는 벨란타맙 마포도틴에서 우세한 DL6 변이체가 힌지 내의 쇄간 디술피드 결합을 포함하는 4개의 시스테인 잔기 및 LC와 HC 사이의 쇄간 디술피드 결합을 포함하는 2개의 시스테인 잔기에서 접합된다는 것을 나타낸다.

정제된 DL8의 환원 LC-MS 분석은 100% LC DL1 및 100% HC DL3으로 이루어질 것으로 예상된다. 결과는 LC의 80% 초과가 DL1이고, HC의 80% 초과가 DL3이라는 것을 나타내며, 이들 결과는 HIC 순도에 기초하여 대략 80%의 예상된 존재비와 일치한다 (표 7). LC DL1 및 HC DL2는 각각 17% 및 14%로 검출되며, 이는 HIC 결과에 기초하여 DL6 및 DL4b가 DL8 변이체와 공동-정제된 결과일 가능성이 있다.

표 10: 정제된 DL0, DL2, DL4a, DL4b, DL6 및 DL8의 무손상 및 환원 LC-MS 결과

주: ME = 질량 오차; ND = 검출되지 않음; OM = 관찰된 질량; TM = 이론적 질량

실시예 7: LC-MS/MS에 의한 펩티드 맵핑

실시예 5에 기재된 바와 같이 제조된 정제된 DL 변이체의 접합 부위 및 번역후 변형을 펩티드 맵핑 LC-MS/MS를 사용하여 평가하였다.

SPR에 의한 항원, FcγRIIIa 및 FcRn 결합

SPR을 사용하여 정제된 DL 변이체의 항원, FcγRIIIa 및 FcRn 특이적 결합 활성을 측정하였다. 방출 및 안정성 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 방법을 사용하여 항원, FcγRIIIa 및 FcRn 분석을 수행하였다. 측정된 특이적 결합 활성은 정제된 DL 변이체에 대해 80 내지 110%였다. 3가지 SPR 활성 검정은 접합된 약물 분자의 수가 증가함에 따라 특이적 결합의 감소를 나타냈다 (표 11). 관찰된 경향에도 불구하고, 약물 로드의 함수로서 결합 활성의 감소는 최소이고, 사양 허용 기준 내에 남아있다. DAR이 증가함에 따라, SPR에 의한 항원 FcγRIIIa 결합 및 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 활성에서 유의한 변화가 없는 것으로 관찰되었다.

표 11: 정제된 DL0, DL2, DL4a, DL4b, DL6 및 DL8의 특이적 결합 활성

세포 성장 억제 및 ADCC 리포터 생물검정에 의한 효력

방출 및 안정성 세포 성장 억제 생물검정 및 ADCC 리포터 생물검정을 사용하여 정제된 DL 변이체의 생물학적 활성을 모니터링하였다. 결과가 표 12에 제시된다. 세포 성장 억제 생물검정에서 정제된 DL 변이체의 상대 효력은 약물 로드의 증가와 상관관계가 있었다. 세포 성장 억제 생물검정에서 정제된 DL0 변이체의 상대 효력은 비접합된 분자에 대해 예상된 바와 같이 0.0이었다.

ADCC 리포터 생물검정에서 정제된 DL 변이체의 상대 효력은 유사하였다. FcγRIIIa 및 FcRn 결합에서 관찰된 것 (표 11)과 유사하게, 증가된 상대 효력과 약물 로드의 감소 사이에 잠재적으로 상관관계가 존재한다. 이는 힌지 영역 근처의 약물의 접합이 Fc에서 단백질-단백질 상호작용에 영향을 미치는 경미한 입체형태적 변화를 유발할 수 있기 때문에 예상치 못한 것은 아니다.

표 12: 세포 성장 억제 및 ADCC 리포터 생물검정을 사용한 정제된 DL0, DL2, DL4a, DL4b, DL6 및 DL8의 상대 효력

모세관 시차 주사 열량측정 (DSC)

모세관 DSC 방법을 사용하여 벨란타맙 마포도틴 3차 구조의 변화 및 약물 접합 후의 열 안정성을 측정하였다 (도 16). 벨란타맙의 전형적인 온도기록도에서, 제1 피크는 CH2 도메인의 언폴딩에 상응하고, 제2 피크는 CH3 도메인 및 Fab의 언폴딩에 상응한다. mAb의 CH3 및 Fab 용융 전이는 종종 중첩되고, 전형적으로 CH2 도메인의 것과 비교할 때 유사하거나 더 높은 온도에서 발생한다. 용융 온도는 일반적으로 단백질 안정성과 상관관계가 있으며; 안정성을 증가시키는 것은 통상적으로 단백질을 언폴딩하는 데 요구되는 에너지의 양이 증가함에 따라 용융 온도가 보다 높아지는 것에 의해 반영된다.

표 13 및 도 16은 각각 정제된 DL 변이체의 전이 온도 및 DSC 온도기록도를 제시한다. 정제된 DL0의 DSC 온도기록도 및 전이 온도는 벨란타맙의 것과 유사하다. 벨란타맙과 비교할 때 Tm₂의 작은 증가가 관찰되며, 이는 제제 완충제의 차이로 인한 것일 가능성이 있다.

정제된 DL2의 DSC 분석은 Fab의 겉보기 전이 온도의 84.2℃에서 78.2℃로의 감소를 보여준다. 이는 LC와 HC 사이의 쇄간 디술피드 결합을 형성하는 시스테인 잔기인 LC C214 및 HC C224 상의 약물 접합의 결과일 가능성이 있다. 이 데이터는 NR-CGE 및 환원 LC-MS 결과와 일치한다.

정제된 DL4a의 DSC 분석은 정제된 DL2에서 관찰된 것과 유사하고, Fab의 겉보기 전이 온도의 감소를 보여준다. 그러나, 정제된 DL2와 비교할 때, 정제된 DL4a 변이체는 78.0℃에서 훨씬 더 큰 피크 면적을 갖는다. 이는 LC와 HC 사이의 쇄간 디술피드 결합을 포함하는 두 시스테인이 접합된다는 것을 보여주는 데이터와 상관관계가 있다. 잠재적으로 DL4a와 공동-정제된 또 다른 DL4 변이체로부터의 CH2 도메인의 겉보기 전이 온도의 약간의 감소가 또한 관찰된다.

정제된 DL4b의 DSC 분석은 정제된 DL2의 결과와 부분적으로 유사한 것으로 보이며: Fab 도메인의 겉보기 전이 온도의 감소가 존재한다. 그러나, DL2와 달리, CH2 도메인의 겉보기 전이 온도의 감소가 또한 존재한다. 이는 정제된 DL4b가 힌지 및 Fab 쇄간 디술피드 둘 다 내의 시스테인에서 접합되는 종을 함유한다는 것을 시사한다.

정제된 DL6의 DSC 분석은 CH2 도메인 및 Fab의 부분의 겉보기 전이 온도의 감소를 보여준다. 이동된 Fab의 비율은 정제된 DL2에서 관찰된 것과 유사하다. 이러한 데이터는 LC와 HC 사이의 쇄간 디술피드 결합을 형성하는 2개의 시스테인 잔기 및 힌지 쇄간 디술피드 결합 내의 4개의 시스테인 잔기의 약물 접합과 일치한다.

정제된 DL8의 DSC 분석은 정제된 DL6에 대해 관찰된 것과 유사한 CH2 도메인의 용융 온도의 감소를 보여준다. 추가적으로, 정제된 DL4a에서 관찰된 것과 유사한 Fab의 겉보기 전이 온도의 감소가 존재한다. 이들 결과는 4개의 쇄간 디술피드 결합 내의 8개의 시스테인 잔기의 접합과 일치한다.

시스테인 잔기의 부분적 환원 및 접합을 통한 쇄간 디술피드 결합의 파괴는 열적 언폴딩의 보다 낮은 전이 온도로 이어질 것으로 예상된다. 정제된 DL 변이체에 대해 생성된 모세관 DSC 데이터는 이러한 가설과 일치한다.

표 13: HIC 정제된 DL0, DL2, DL4a, DL4b, DL6 및 DL8의 모세관 DSC 결과

주: ND = 검출되지 않음

실시예 5-7로부터의 결론

정제된 DL 변이체를 특징화함으로써 벨란타맙 마포도틴 상의 접합 부위를 비롯하여 그의 순도, 효력 및 동일성을 결정하였다. 결과는 DL 분포가 쇄간 디술피드 결합의 부분적 환원 후에 짝수의 약물 (mcMMAF)과 접합된 DL 변이체의 불균질 혼합물이라는 것을 보여준다. 벨란타맙 마포도틴의 주요 약물 로드 변이체는 DL4a 종이고, LC와 HC 사이의 쇄간 디술피드 결합을 포함하는 각각의 LC C214 및 각각의 HC C224에서 접합된 4개의 MMAF 분자를 함유한다. DL0 변이체는 비접합된 벨란타맙인 것으로 확인되었다. DL 변이체의 상대 효력은 세포 성장 억제 검정에서 증가하는 약물 로드와 관련하여 증가하였으며, 벨란타맙 마포도틴은 전체 상대 효력에 기여하는 이들 DL 변이체의 분포로 구성된다. DL 분포는 약물-항체 비 (DAR)에 의해 제어될 것이다. HIC 방법은 방출 및 안정성에 대해 벨란타맙 마포도틴의 약물 로드 변이체를 모니터링하기 위해 약물 물질 및 약물 제품 둘 다에 대해 현재 시행되고 있다.

서열 목록

Claims

(i) 카르보닐 기를 함유하는 동위원소-표지된 세포독소 및 환원제를 사용하여 시스테인-접합된 항체 약물 접합체 (ADC)의 비점유된 시스테인 부위에 접합시켜 동위원소-표지된 ADC 샘플을 생성하는 단계; 및
(ii) 샘플을 펩티드 맵핑하는 단계
를 포함하는 분석 방법.
제1항에 있어서, 세포독소가 MMAF 또는 MMAE인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, ADC를 먼저 환원제에 의해 환원시킨 다음, 동위원소-표지된 세포독소와 접합시키는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 환원제가 디티오트레이톨 (DTT) 또는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 맵핑 전에 크기 배제 크로마토그래피 칼럼을 통해 샘플을 용리시킴으로써 과량의 환원제를 제거하는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 접합이 ADC를 동위원소-표지된 세포독소와 반응시킴으로써 일어나는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 맵핑 전에 크기 배제 크로마토그래피 칼럼을 통해 샘플을 용리시킴으로써 과량의 동위원소-표지된 세포독소를 제거하는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 맵핑이 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광측정법 (LC-MS/MS) 분석을 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 맵핑이 샘플을 변성시키고, 모든 나머지 디술피드 결합을 환원시키고, 생성된 유리 술프히드릴을 알킬화하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 맵핑이 샘플을 효소적으로 소화시켜 동위원소-표지된 접합된 펩티드를 생성하고, 임의로 효소적 소화물을 강산의 첨가에 의해 켄칭하는 것을 포함하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 동위원소-표지된 접합된 펩티드를 이온화하고, 질량-대-전하 비를 검출하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 동위원소-표지된 접합된 펩티드에 대해 검출된 질량-대-전하 비를 동위원소-표지되지 않은 접합된 펩티드와 비교하는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독소를 동위원소-표지된 물과 반응시켜 동위원소-표지된 세포독소를 생성하는 것을 포함하는 방법.
제13항에 있어서, 세포독소를 아세토니트릴 중에서 동위원소-표지된 물과 반응시키는 것인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, ADC가 벨란타맙 마포도틴인 방법.
세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 56% 내지 약 80%인 조성물.
세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 58% 내지 약 81%인 조성물.
세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 15% 내지 약 46%인 조성물.
세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 11% 내지 약 15%인 조성물.
세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 56% 내지 약 80%이고, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 58% 내지 약 81%이고, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 15% 내지 약 46%이고, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 11% 내지 약 15%인 조성물.
세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 63% 내지 약 76%이고/거나, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 65% 내지 약 78%이고/거나, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 22% 내지 약 40%이고/거나, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 11% 내지 약 16%인 조성물.
세포독성제에 접합되어 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는 항-BCMA 항체를 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1; 서열식별번호: 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2; 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3; 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1; 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2; 및 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하고; 여기서 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이고; 여기서 LC C214에서의 백분율 약물 로드는 약 65% 내지 약 71%이고/거나, HC C224에서의 백분율 약물 로드는 약 68% 내지 약 74%이고/거나, HC C230 및 C233에서의 HC 힌지 DL2의 백분율 약물 로드는 약 24% 내지 약 30%이고/거나, HC C230 또는 HC C233에서의 HC 힌지 DL1의 백분율 약물 로드는 약 12% 내지 약 18%인 조성물.
제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항-BCMA 항체가 벨란타맙인 조성물.
제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, ADC가 벨란타맙 마포도틴인 조성물.
제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 퍼센트 DL2가 적어도 약 30%, 약 15% 내지 약 27% 또는 약 15% 내지 약 32%이고/거나; 퍼센트 DL4a가 적어도 약 30%, 약 35% 내지 약 38% 또는 약 30% 내지 약 40%이고/거나; 퍼센트 DL4b가 적어도 약 5%, 약 7% 내지 약 9% 또는 약 5% 내지 약 10%이고/거나; 퍼센트 DL6이 적어도 약 10%, 약 14% 내지 약 20% 또는 약 10% 내지 약 20%이고/거나; DL8이 적어도 약 1%, 약 6.0% 내지 약 12.0% 또는 약 4% 내지 약 15%인 조성물.
제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 퍼센트 DL0이 약 10% 또는 약 5% 이하인 조성물.
제16항 내지 제26항 중 어느 한 항의 조성물 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제27항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 조성물 또는 제약 조성물.
암의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서의 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
a) 항체 약물 접합체를 환원시켜 환원된 항체 약물 접합체를 형성하는 단계;
b) 환원된 항체 약물 접합체를 동위원소-표지된 세포독소와 접합시켜 동위원소-표지된 항체 약물 접합체를 형성하는 단계;
c) 동위원소-표지된 항체 약물 접합체로부터 동위원소-표지된 접합된 펩티드를 생성하고, 동위원소-표지된 접합된 펩티드에 대해 펩티드 맵핑을 수행하는 단계;
d) 동위원소-표지된 접합된 펩티드에 대한 질량-대-전하 비를 검출하는 단계; 및
e) 동위원소-표지된 접합된 펩티드의 질량-대-전하 비를 동위원소-표지되지 않은 접합된 펩티드의 질량-대-전하 비와 비교하여 시스테인-접합된 항체 약물 접합체의 접합 수준을 결정하는 단계
를 포함하는, 시스테인-접합된 항체 약물 접합체의 접합 수준을 결정하는 방법.
제31항에 있어서, 세포독소가 MMAF 또는 MMAE인 방법.
제31항 또는 제32항에 있어서, 시스테인-접합된 항체 약물 접합체를 먼저 환원제에 의해 환원시킨 다음, 동위원소-표지된 세포독소와 접합시키는 것인 방법.
제33항에 있어서, 환원제가 디티오트레이톨 (DTT) 또는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)인 방법.
제34항에 있어서, 펩티드 맵핑 전에 크기 배제 크로마토그래피 칼럼을 통해 샘플을 용리시킴으로써 과량의 환원제를 제거하는 것인 방법.
제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 접합이 시스테인-접합된 항체 약물 접합체를 동위원소-표지된 세포독소와 반응시킴으로써 일어나는 것인 방법.
제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 맵핑 전에 크기 배제 크로마토그래피 칼럼을 통해 샘플을 용리시킴으로써 과량의 동위원소-표지된 세포독소를 제거하는 것인 방법.
제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 맵핑이 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광측정법 (LC-MS/MS) 분석을 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 맵핑이 샘플을 변성시키고, 나머지 디술피드 결합을 환원시키고, 생성된 유리 술프히드릴을 알킬화하는 것을 포함하는 것인 방법.
제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 맵핑이 샘플을 효소적으로 소화시켜 동위원소-표지된 접합된 펩티드를 생성하고, 임의로 효소적 소화물을 강산의 첨가에 의해 켄칭하는 것을 포함하는 것인 방법.
제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독소를 동위원소-표지된 물과 반응시켜 동위원소-표지된 세포독소를 생성하는 것을 포함하는 방법.
제41항에 있어서, 세포독소를 아세토니트릴 중에서 동위원소-표지된 물과 반응시키는 것인 방법.
제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인-접합된 항체 약물 접합체가 벨란타맙 마포도틴인 방법.