KR20230174633A - 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 질경이 추출물(Plantago asiatica L. extract)은 GSK-3β/β-Catenin와 MAPK/CREB의 신호전달 기전을 통해 모유두세포에서 모발 성장인자와 세포 증식을 증가시켰으며, 또한 신생 혈관 생성을 촉진시켰음을 확인하였으며, 이러한 결과를 통해 질경이 추출물을 탈모 예방 및 모발 성장 효과를 나타내는 헤어케어 제품의 소재로 이용할 수 있는 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다.

Description

천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물{Composition for preventing hair loss and promoting hair growth using natural material}

본 발명은 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 질경이 추출물(Plantago asiatica L. extract)이 GSK-3β/β-Catenin과 MAPK/CREB의 신호전달 기전을 통해 모유두세포에서 모발 성장인자와 세포 증식을 증가시켰으며, 또한 신생 혈관 생성을 촉진시켰음을 확인하였으며, 이러한 결과를 통해 질경이 추출물을 탈모 예방 및 모발 성장 효과를 나타내는 헤어케어 제품의 소재로 이용할 수 있는 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다.

머리털뿐만 아니라, 인체의 모든 털은 일정한 성장기간이 지나면 성장이 정지되고 휴지기에 들어가서 탈모되고, 다시 털이 나는 과정을 반복한다.

이것을 털의 성장주기라고 하는데 머리털은 성장기가 1 ~ 6년 이상으로 길고 휴지기는 2 ~ 3개월 이하로 짧은 것으로 알려져 있다.

일반적으로 대머리나 탈모의 주된 원인으로 남성 호르몬의 작용, 모근 혈류량의 감소, 과민성 두피, 지용성 두피, 스트레스, 유전적 요인, 노화 등이 있다.

탈모의 원인이나 탈모 위치 등에 따라 적절한 발모제를 사용하여야 하나 발모 및 탈모의 기전이 명확히 밝혀지지 않았으며, 탈모증의 완전 치료는 불가능하다.

종래의 발모제는 대부분 탈모를 예방하기 위하여 활용되고 있는데, 종래 발모제로 사용된 화학 물질은 인체에 적지 않은 부작용을 야기할 수 있으며, 두피의 생성을 가속화하여 증상을 악화시킬 수 있다는 문제점이 있었다.

따라서, 최근에는 다양한 식물 천연물 추출물을 유효 성분으로 사용한 모발 성장 촉진제나 발모제에 대한 관심이 이루어지고 있다.

그러나, 식물 추출물에서 유래한 상당수의 발모제는 모발의 성장이나 탈모 억제에서 기대했던 것만큼 효과가 발휘되지 못하는 경우가 많다.

대한민국 공개특허공보 제10-2004-0001683호에는 솔잎, 은행잎, 뽕뿌리, 영지버섯, 호두, 대추, 검정콩 등의 혼합 추출액을 성분으로 하는 천연발모제를 기술하고 있다.

이와 같이, 본 발명의 천연소재인 질경이 추출물만을 이용하여 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물을 개발하고자 하는 시도는 없었다.

본 출원에서는 질경이 추출물을 탈모 예방 및 모발 성장 효과를 나타내는 헤어케어 제품의 소재로 이용할 수 있음을 확인하여 본 출원을 완성하였다.

대한민국 공개특허공보 제10-2004-0001683호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 연구 개발된 것으로서, 본 발명의 목적은 질경이 추출물(Plantago asiatica L. extract)을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 모발 성장 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명인 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물은,

질경이 추출물(Plantago asiatica L. extract)을 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 질경이 추출물을 유효성분으로 포함하는 크림, 로션, 토닉, 스프레이, 오일, 용액, 현탁액, 젤, 연고를 제공한다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 것과 같이, 질경이 추출물(Plantago asiatica L. extract)은 모유두세포에서 모발 성장인자와 세포 증식을 증가시키는 효과와, 신생 혈관 생성을 촉진시키는 효과를 제공할 수 있다.

따라서, 질경이 추출물을 탈모 예방 및 모발 성장 효과를 나타내는 헤어케어 제품의 소재로 이용할 수 있게 된다.

도 1은 본 발명의 질경이 추출물의 모유두세포 증식에 미치는 영향을 나타낸 결과값이다.
도 2는 본 발명의 질경이 추출물이 모유두세포의 모발 성장인자에 미치는 영향을 나타낸 결과값이다.
도 3은 본 발명의 질경이 추출물이 모유두세포의 GSK-3β/β-Catenin 신호전달에 미치는 영향을 나타낸 결과값이다.
도 4는 본 발명의 질경이 추출물이 모유두세포의 MAPK/CREB 신호전달에 미치는 영향을 나타낸 결과값이다.
도 5는 본 발명의 질경이 추출물이 tube formation에 미치는 영향을 나타낸 결과값이다.
도 6은 본 발명의 모발 성장 신호 경로에 대한 질경이 추출물의 제안된 메커니즘을 나타낸 예시도이다.

이하, 본 발명을 설명한다.

질경이는 미백, 항염, 항산화 등 다양한 효과가 있다고 알려져 있다.

하지만, 탈모 억제, 모발 성장 관련 효과에 대한 연구가 미흡하여 모유두세포의 증식 및 모발 성장 관련 신호전달 기전 연구를 진행했다.

모유두세포에서 질경이 추출물(Plantago asiatica L. extract, PAE.)의 효능을 확인한 결과, 세포 증식 촉진 및 모발 성장인자(KGF, VEGF)를 증가시켰다.

이는 질경이 추출물이 GSK-3β/β-Catenin 신호전달을 통해 세포내 β-Catenin를 증가시키고, MAPK/CREB 신호전달을 통해 CREB(ser 133)를 인산화시켰기 때문이다.

세포 내 β-Catenin의 증가 및 CREB(ser 133)의 인산화는 핵 내로 이동을 야기하여 모발 성장인자의 전사인자로서 역할을 기대할 수 있었다.

또한, 신생 혈관 생성은 모발 성장기(anagen)에 필수적이다.

Tube formation assay를 확인한 결과, 질경이 추출물은 신생 혈관 형성을 촉진시켰다.

종합적으로 질경이 추출물은 GSK-3β/β-Catenin와 MAPK/CREB의 신호전달 기전을 통해 모유두세포에서 모발 성장인자와 세포 증식을 증가시켰으며, 또한, 신생 혈관 생성을 촉진시켰다.

이러한 결과를 통해, 질경이 추출물을 탈모 예방 및 모발 성장 효과를 나타내는 헤어케어 제품의 소재로 이용할 수 있음을 제안한다.

한편, 본 발명에서 "유효성분으로 포함된다"는 의미는 본 발명의 조성물로부터 모발 상태의 개선 효과를 나타낼 수 있는 정도로 조성물에 배양물 여과액이 첨가되는 것을 의미하고, 성분 전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 제형화하는 것을 포함하는 의미이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1 : 질경이 추출물(PAE)의 제조

질경이 전초는 삼홍건재약업(국산)에서 구매하였다.

질경이 전초 50g을 70% EtOH 1000g으로 (1:20) 상온에서 24 시간 정치 추출 후 5um 여과(No. 2, HYUNDAI MICRO)했다.

여과액은 감압 농축기를 이용해 파우더화 했다.(8.17g)

실험예 1 : 세포 배양

인체 두피 유래 모유두세포(Human Hair Follicle Dermal Papilla Cells, HDP cells) 및 탯줄유래 혈관 내피 세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)는 세포 바이오에서 구매하여 사용하였으며, 각각 CEFOgro-HDP, CEFOgro-HUVEC(CEFO) 배지를 이용해 37℃, 5% CO₂ 습윤 배양기에서 배양하였다.

3일마다 배지를 교환해줬으며, 세포가 dish의 80% 정도 차면 계대 배양을 진행했다.

실험예 2 : 실시간 중합효소 연쇄반응(Quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR)

모유두세포에 질경이 추출물을 10, 25, 50 ppm 처리후 48 시간 동안 반응시켰으며, 무처리군도 동시에 진행했다.

Total RNA는 NucleoZOL (740404.200, MN) 시약을 사용하여 추출하였다.

분리된 RNA를 elisa reader(SpectraMax ABS Plus, Molecular devices)를 이용하여 정량한 뒤 HiSenScript™ RH(-) RT PreMix Kit(intron, 25087)을 이용하여 cDNA를 합성하였다.

합성된 cDNA는 Real-Time PCR Master mix (Biofact, DQ385-40h)을 이용하여 유전자를 증폭한 후 QuantStudio 3 Real-Time PCR Instrument(Thermo Fisher Scientific) 기기로 증폭 산물을 정량 분석하였다.

상기의 표 1은 Specific primer sequences used for qPCR이며, 각 primer 조건은 상기와 같다.(표 1 참조)

실험예 3 : 단백질 발현 측정법(Western blot)

HDP cells를 60 mm culture dish에 분주하고 5% CO₂가 공급되는 37℃ 습윤 배양기에서 18 시간 동안 안정화시켰다.

계열 희석한 시료를 전 처리 한 뒤, 각각의 단백이 인산화 또는 발현되는 시간 동안 반응시켰다.

PBS로 세척한 뒤 RIPA 완충액을 이용하여 1 시간 동안 10 min 간격으로 강하게 교반하여 세포를 용해했다.

12,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 상층액을 얻고, Bradford 법으로 정량했다.

동량의 단백을 sample loading buffer와 혼합하여 100℃에서 10분 동안 가열하고 SDS-PAGE를 수행했다.

전기영동 후, gel을 polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane에 transfer시킨 후 5% skim milk가 들어있는 1 x TTBS 완충용액 상에서 1시간 동안 흔들어 blocking 하였다.

1차 항원을 넣고 4℃에서 membrane을 18시간 동안 반응시켰다.

β-Catenin(#8480, CST, 1:1000), GSK-3β(#12456, CST, 1:1000), Phospho-GSK-3β (Ser9)(#5558, CST, 1:1000), p44/42 MAPK (Erk1/2)(#4695, CST, 1:1000), Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204)(#4370, CST, 1:1000), GAPDH(#5174, CST 1:5000) 반응시킨 membrane을 1 x TTBS로 3회 씻어주고, 5% skim milk와 horseradish-peroxidase conjugated anti-rabbit IgG(Thermo Fisher Scientific, 31460; 1:2000)를 넣어 실온에서 1시간 반응시켰다.

PVDF membrane을 enhanced chemiluminescence reagent(RPN2232, GE Healthcare) 용액으로 반응시키고, Chemi DocTM XRS+ machine을 이용하여 발광하는 각각의 band를 동정하였다.

실험예 4 : 질경이 추출물의 모유두세포 증식에 미치는 영향

세포 증식 평가는 MTT(Thiazolyl blue Tetrazolium Bromide)(M2128, Sigma)를 이용하여 진행하였다.

HDP cells를 96 well plate에 5 x 10³ cells/well로 접종후 37 ℃, 5% CO₂, 습윤 배양기에서 18 시간 동안 안정화시켰다.

이후 2% FBS DMEM 배지 교환하고, 시료를 처리하여 48 시간 동안 반응시켰다.

48 시간 뒤 배지를 제거한 후 0.5 mg/ml MTT 시약을 100 ul/well로 처리하여 formazan이 생성되면 상층액을 제거했다.

생성된 formazan은 DMSO로 용해시켜 590 nm에서 최대 흡광도를 측정하여 무처리군에 대한 % 비율로 나타냈다.

실험결과, 각 농도에서 무 처리군에 비해 4.95%, 8.14%, 10.24% 증가했으며, 질경이 추출물 50 ppm 처리 시 양성대조군(minoxidil)과 유사한 결과가 나타났다.

(표 2, 도 1 참조)

실험예 5 : 질경이 추출물이 모유두세포의 모발 성장인자에 미치는 영향

질경이 추출물이 모유두세포 증식에 영향이 있어, 모발 성장에 미치는 영향을 확인하기 위해 모유두세포에 질경이 추출물을 농도별(10, 25, 50 ppm)로 처리하고 48 hr 뒤에 각 인자별 유전자 발현을 확인하였다.

KGF의 경우 질경이 추출물 처리 시 각각 최대 42.23% 증가했으며 양성대조군인 minoxidil과 유사한 효능이 있었다. (표 3, 도 2A 참조)

또한, VEGF의 경우 질경이 추출물의 농도 의존적으로 증가했으며, 최대 31.82% 증가했다. 양성대조군과 비교하였을 때도 질경이 추출물이 더 우수했다.(표 4, 도 2B 참조)

실험예 6 : 질경이 추출물이 모유두세포의 GSK-3β/β-Catenin 신호전달에 미치는 영향

앞선 실험에서 질경이 추출물이 모발 성장인자인 KGF 및 VEGF에 우수한 효과가 있었기 때문에 이들의 메커니즘을 확인했다.

모유두세포에 질경이 추출물(50 ppm)을 처리 후 0, 1, 2, 5, 10, 20 min 동안 각각 반응시켜 western blot assay를 수행했다. 질경이 추출물 처리 시 1 min부터 20 min까지 GSK-3β의 ser 9이 인산화된 것을 확인할 수 있었다(표 5, 도 3A, 도 3B 참조).

GSK-3β(ser9)의 인산화로 인한 활성이 억제됨에 따라 10 min부터 total β-Catenin의 단백질양이 증가한 것을 확인할 수 있었다(표 6, 도 3A, C 참조).

결과적으로, 질경이 추출물이 GSK-3β/β-Catenin의 기전을 활성화시켜, β-Catenin이 모발 성장인자의 전사인자로서 작용하는 가능성을 확인했다.

실험예 7 : 질경이 추출물이 모유두세포의 MAPK/CREB 신호전달에 미치는 영향

질경이 추출물이 모발 성장인자인 KGF 및 VEGF에 우수한 효과가 있어 이들의 메커니즘을 확인하기 위해 MAPK/CREB 기전을 확인했다.

모유두세포에 질경이 추출물(50 ppm)을 처리 후 0, 1, 2, 5, 10, 20 min 동안 각각 반응시켜 western blot assay를 수행했다.

질경이 추출물 처리 시 2 min부터 ERK의 thr202/tyr204이 인산화된 것을 확인할 수 있었다(표 7, 도 4A, B 참조).

ERK가 활성화됨에 따라 5 min부터는 CREB의 ser 133의 인산화가 된 것을 확인할 수 있었다(표 8, 도 4A, C 참조).

결과적으로, 질경이 추출물이 MAPK/CREB의 기전을 활성화시켜, CREB가 모발 성장인자의 전사인자로서 작용하는 가능성을 확인했다.

실험예 8 : 질경이 추출물이 tube formation에 미치는 영향

Matrigel ^ⓡ Matrix (354234, CORNING)을 serum free DMEM으로 1:1 희석하여 96 well plate에 30 μl씩 분주한 뒤, 37℃에서 30 min 동안 굳혔다.

Matrigel이 분주된 96 well plate에 계열 희석한 질경이 추출물(1, 2.5, 5, 10, 25, 50 ppm)과 VEGF(50 ng/ml)을 분주했다.

HUVECs를 시료가 처리된 96well plate에 2.5 x 10⁴ cells/well로 분주하여 4시간 동안 반응시켰다.

혈관이 생성되면 도립 현미경(Ts2, Nikon)을 이용하여 사진 촬영 후 개수를 확인했다(표 9, 도 5 참조).

실험결과, control(무처리군)과 비교하여 질경이 추출물의 10 ppm까지 농도 의존적으로 혈관 신생을 촉진시켰으며, control 대비 최대 43.15% 증가했다(표 9, 도 5 참조).

결과적으로, 질경이 추출물은 VEGF의 mRNA를 효과적으로 증가시켰으며 이로 인해 혈관 신생을 촉진시키는 효과를 예측할 수 있었다.

결론적으로, 질경이 추출물은 GSK-3β/β-Catenin 및 MAPK/CREB 신호전달 기전을 통해 모유두세포의 증식과 모발 성장인자를 증가시킨다.

뿐만 아니라, 모발 성장기에 필수적인 신생 혈관 형성도 촉진 시켜 탈모 예방 및 모발 성장 효과를 나타내는 헤어케어 제품의 소재로 이용 가능성을 시사하는 바이다.

이때, 상기에서도 언급하였듯이, 본 발명의 질경이 전초의 추출물은,

질경이 전초 50 중량부에 70% 에탄올 1,000 중량부를 가한 후, 상온에서 24시간 정치하여 추출하는 단계;

상기 추출물을 여과장치를 이용하여 여과한 여과액을 감압 농축기를 이용하여 파우더화하여 수득하는 단계;를 통해 수득한 추출물이다.

따라서, 상기 질경이 전초의 추출물을 모발 성장 조성물에 함유시킬 경우에, 모발 성장 조성물 전체 함량에 대하여 0.001 ~ 50 중량% 함유되어 있는 것을 특징으로 한다.

실시예 2 : 본 발명의 추출물을 함유하는 헤어토닉 제조

본 발명의 추출물을 함유하는 헤어토닉을 제조하기 위해 통상적인 제조 방법에 따라 제조하였다.

본 발명의 추출물 2g에 정제수 134.44g, l- 멘톨 0.2 g , D- 판테놀 1.2g , 살리실산 0.1g, 글리세린 2g , 초산토코페롤 0.06g, 에탄올 30g, 조합향을 혼합하여 헤어토닉 200g을 얻었다.

실시예 3 : 본 발명의 추출물을 함유한 샴푸 제조

본 발명의 추출물을 함유하는 샴푸을 제조하기 위해 통상적인 제조 방법에 따라 제조하였다.

본 발명의 추출물 2g에 정제수 112g, 라우릴황산나트륨액 40g, 폴리옥시에틸렌라우일황산나트륨액 30g, 야자유지방산디에탄올아미드 10g, 폴리쿼터늄 0.6g, 프로필렌글리콜 4g, 피록톤올아민 1g, 파라옥시안식향산에스테르 0.4g, 조합향을 혼합하여 샴푸 200g를 얻었다.

실시예 4 : 본 발명의 추출물을 함유한 스프레이 제조

본 발명의 추출물을 함유하는 스프레이를 제조하기 위해 통상적인 제조 방법에 따라 제조하였다.

본 발명의 추출물 2g에 정제수 40g, 계면활성제 02g, 알칼리 금속벤조에이트 0.02g, 탄화수소 가스추진제 157.78g을 혼합하여 스프레이 200g를 얻었다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

1. 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물에 있어서,
   질경이 추출물(Plantago asiatica L. extract)을 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 질경이 추출물은,
   질경이 전초의 추출물인 것을 특징으로 하는 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
   
3. 제 2항에 있어서,
   상기 질경이 전초의 추출물은,
   질경이 전초 50 중량부에 70% 에탄올 1,000 중량부를 가한 후, 상온에서 24시간 정치하여 추출하는 단계;
   상기 추출물을 여과장치를 이용하여 여과한 여과액을 감압 농축기를 이용하여 파우더화하여 수득하는 단계;를 통해 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
4. 제 2항에 있어서,
   질경이 전초의 추출물은,
   모발 성장 조성물 전체 함량에 대하여 0.001 ~ 50 중량% 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
   
5. 제 2항에 있어서,
   상기 모발 성장 조성물의 제형은,
   크림, 로션, 토닉, 스프레이, 오일, 용액, 현탁액, 젤, 연고 제형인 것을 특징으로 하는 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
   
6. 제 2항에 있어서,
   상기 질경이 전초의 추출물은,
   정제수, 탄소수 1 ~ 4 의 알코올, 글리세롤, 에틴렌글리콜,프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 으로부터 선택되는 1 이상의 유기용매 추출물 또는 초임계 추출물인 것을 특징으로 하는 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물
7. 제 1항에 있어서,
   상기 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물은,
   모유두 세포의 증식을 촉진하는 조성물인 것을 특징으로 하는 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
   
8. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물은,
   헤어 또는 두피용 제품에 적용되는 조성물인 것을 특징으로 하는 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
   
9. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물은,
   화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
   
10. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물은,
    의약외품용 조성물인 것을 특징으로 하는 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.
    
11. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물은,
    의약 조성물인 것을 특징으로 하는 천연소재를 이용한 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물.