KR20230160289A - 세포의 선택적 투과성화 및/또는 단편화 방법 - Google Patents
세포의 선택적 투과성화 및/또는 단편화 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230160289A KR20230160289A KR1020237034344A KR20237034344A KR20230160289A KR 20230160289 A KR20230160289 A KR 20230160289A KR 1020237034344 A KR1020237034344 A KR 1020237034344A KR 20237034344 A KR20237034344 A KR 20237034344A KR 20230160289 A KR20230160289 A KR 20230160289A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- particles
- cells
- free surface
- cell
- particle
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 90
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 title description 7
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 title description 7
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 title description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 232
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 67
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 claims abstract description 45
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 27
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 14
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- -1 particulates Substances 0.000 claims description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 11
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 8
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 4
- 239000006260 foam Substances 0.000 claims description 4
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 claims description 4
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 claims description 3
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000011368 organic material Substances 0.000 claims description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 320
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 26
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 25
- 229920006381 polylactic acid film Polymers 0.000 description 22
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 21
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 21
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 21
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N ferric oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000001095 inductively coupled plasma mass spectrometry Methods 0.000 description 12
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 12
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 11
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 11
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N iron oxide Inorganic materials [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 11
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000013532 laser treatment Methods 0.000 description 9
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 description 9
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 9
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 8
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 description 8
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 7
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 7
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 7
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 7
- 229920005594 polymer fiber Polymers 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 6
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 6
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 6
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 6
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 5
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 238000004528 spin coating Methods 0.000 description 5
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 5
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 4
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 4
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 4
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 239000006096 absorbing agent Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 description 3
- 238000001446 dark-field microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000002101 nanobubble Substances 0.000 description 3
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HWSSEYVMGDIFMH-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-(2-methylprop-2-enoyloxy)ethoxy]ethoxy]ethyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCOCCOCCOC(=O)C(C)=C HWSSEYVMGDIFMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 2
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N Zinc monoxide Chemical compound [Zn]=O XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 2
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 2
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 2
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 2
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000003575 carbonaceous material Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000000942 confocal micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000001523 electrospinning Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 150000002735 metacrylic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002428 photodynamic therapy Methods 0.000 description 2
- 238000007626 photothermal therapy Methods 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003213 poly(N-isopropyl acrylamide) Polymers 0.000 description 2
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 2
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 2
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 2
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 2
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 238000002166 wet spinning Methods 0.000 description 2
- NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 11-cis-retinal Chemical compound O=C/C=C(\C)/C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002126 Acrylic acid copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000499489 Castor canadensis Species 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 208000022994 Isolated optic neuritis Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 235000011779 Menyanthes trifoliata Nutrition 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229920002518 Polyallylamine hydrochloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108090000244 Rat Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004330 Rhodopsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000820 Rhodopsin Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000517096 Zele Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000000184 acid digestion Methods 0.000 description 1
- 229920006322 acrylamide copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004397 blinking Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 description 1
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229910000420 cerium oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000012829 chemotherapy agent Substances 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000000315 cryotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000021040 cytoplasmic transport Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000003560 epithelium corneal Anatomy 0.000 description 1
- STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol dimethacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCOC(=O)C(C)=C STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000010035 extrusion spinning Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229910052733 gallium Inorganic materials 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000020169 heat generation Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 229960004657 indocyanine green Drugs 0.000 description 1
- MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M indocyanine green Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCCCN1C2=CC=C3C=CC=CC3=C2C(C)(C)C1=CC=CC=CC=CC1=[N+](CCCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=C(C=CC=C3)C3=C2C1(C)C MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010016980 iodopsin Proteins 0.000 description 1
- VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N iron(2+);oxygen(2-) Chemical class [O-2].[Fe+2] VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000395 magnesium oxide Substances 0.000 description 1
- CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N magnesium oxide Inorganic materials [Mg]=O CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXZKOIWUVFPNLO-UHFFFAOYSA-N magnesium;oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[Mg+2] AXZKOIWUVFPNLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002074 melt spinning Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 229940031182 nanoparticles iron oxide Drugs 0.000 description 1
- 239000011858 nanopowder Substances 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000011146 organic particle Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000013021 overheating Methods 0.000 description 1
- BMMGVYCKOGBVEV-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoceriooxy)cerium Chemical compound [Ce]=O.O=[Ce]=O BMMGVYCKOGBVEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RVTZCBVAJQQJTK-UHFFFAOYSA-N oxygen(2-);zirconium(4+) Chemical compound [O-2].[O-2].[Zr+4] RVTZCBVAJQQJTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001690 polydopamine Polymers 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002133 sample digestion Methods 0.000 description 1
- 230000009291 secondary effect Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002047 solid lipid nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- UWHCKJMYHZGTIT-UHFFFAOYSA-N tetraethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCO UWHCKJMYHZGTIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N titanium oxide Inorganic materials [Ti]=O OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000759 toxicological effect Toxicity 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 239000011787 zinc oxide Substances 0.000 description 1
- 229910001928 zirconium oxide Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F9/00—Methods or devices for treatment of the eyes; Devices for putting-in contact lenses; Devices to correct squinting; Apparatus to guide the blind; Protective devices for the eyes, carried on the body or in the hand
- A61F9/007—Methods or devices for eye surgery
- A61F9/008—Methods or devices for eye surgery using laser
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B18/00—Surgical instruments, devices or methods for transferring non-mechanical forms of energy to or from the body
- A61B18/18—Surgical instruments, devices or methods for transferring non-mechanical forms of energy to or from the body by applying electromagnetic radiation, e.g. microwaves
- A61B18/20—Surgical instruments, devices or methods for transferring non-mechanical forms of energy to or from the body by applying electromagnetic radiation, e.g. microwaves using laser
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
- C12M45/07—Means for pre-treatment of biological substances by electrical or electromagnetic forces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
- C12M45/20—Heating; Cooling
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B18/00—Surgical instruments, devices or methods for transferring non-mechanical forms of energy to or from the body
- A61B2018/00571—Surgical instruments, devices or methods for transferring non-mechanical forms of energy to or from the body for achieving a particular surgical effect
- A61B2018/00577—Ablation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F9/00—Methods or devices for treatment of the eyes; Devices for putting-in contact lenses; Devices to correct squinting; Apparatus to guide the blind; Protective devices for the eyes, carried on the body or in the hand
- A61F9/007—Methods or devices for eye surgery
- A61F9/008—Methods or devices for eye surgery using laser
- A61F2009/00861—Methods or devices for eye surgery using laser adapted for treatment at a particular location
- A61F2009/00872—Cornea
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Surgery (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Electromagnetism (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Laser Surgery Devices (AREA)
Abstract
본 발명은 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하는 방법에 관한 것이다. 전자기파를 흡수할 수 있는 재료와 입자를 포함하는 구조체와 세포가 서로 가까운 거리에 있다. 구조체에 매립되어 있는 입자의 일부가 구조체의 자유 표면에 노출된다. 구조체 및 특히 구조체 내의 입자는 전자기 방사선으로 조사되어 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화한다. 또한, 본 발명은 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하기 위한 광열 공정에 사용하기 위한 구조체에 관한 것이다.
Description
본 발명은, 예를 들어, 세포를 선택적으로 사멸 또는 제거하기 위한 세포의 선택적 투과성화(permeabilization) 및/또는 단편화(fragmentation) 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자를 포함하는 구조체(structure) 및 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하는 방법에서 이러한 구조체의 사용에 관한 것이다. 이 구조체는, 예를 들어, 각막 세포를 사멸 또는 절제하는 나노수술에 사용하기에 적합하다.
암과 같은, 여러가지 질병을 치료하기 위해서는 조직 표면의 세포를 사멸시키는 것이 필요하다. 암 수술의 큰 진전에도 불구하고, 종양에서 모든 암세포를 제거하는 것은 여전히 매우 어렵고, 특히 종양 세포가 건강한 조직과 얽혀 있는 경우 더욱 그렇다. 이는 방사선요법, 화학요법과 같은 보조 요법이 수술 다음으로 자주 선호되는 이유를 설명한다.
눈의 표면(결막 및 각막)의 공격적인 암을 다룰 때 안과학에서는 종양의 불완전한 제거가 또한 과제로 남아 있다. 특히 이러한 유형의 암의 경우 보조 요법의 사용은 매우 제한적이다. 실제로, 안구 표면에서 화학요법제의 침착 및 용량을 조절하는 것은 매우 어려운 일이며 인 시츄(in situ) 방사선요법 및 냉동요법도 손상된 결과를 보여준다.
광역학 요법(PDT, Photodynamic therapy) 및 광열 요법(PTT, photothermal therapy)은 세포 사멸을 위한 유망한 접근법인 것으로 입증되었다. 이러한 기술은 '단일 세포 사멸(single cell killing)'도 가능하게 할 수 있을 만큼 높은 공간 정밀도를 가지고 있다. 그러나, 레이저 광 치료 후 열 방출을 제어하지 못하면(표면 과열) 주변 조직에 돌이킬 수 없는 손상을 줄 수 있다.
최근, 세포, 예를 들어, 암세포를 사멸시키기 위해 나노입자 감응형 레이저 조사가 연구되어 왔다. 레이저 조사 시, 국소 가열과 같은 광열 효과를 통해 세포가 손상되거나 사멸된다. 이 접근법에서는 (자유) 나노입자가 암세포에 전달된다. 나노입자의 독성학적 효과에 대한 불확실성이 있기 때문에, 나노입자 감응형 레이저 조사에 대한 독성학적 우려가 있을 수 있다.
따라서, 최근에는 플라즈몬 나노입자와 세포의 직접적인 접촉을 감소 또는 회피하면서 세포를 선택적으로 사멸시키는 방법을 개발하는 것이 중요하다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하여 종래 기술의 결점을 회피하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자를 포함하는 구조체를 이용하여 높은 공간 분해능으로 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 높은 공간 분해능으로 세포를 선택적으로 사멸 또는 절제하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명의 추가 목적은 주변 세포 또는 조직 중에 미세입자 및/또는 나노입자와 같은 입자 또는 재료 또는 상기 입자의 단편의 확산 또는 축적을 제한하면서 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 구조체와 세포 사이의 직접적인 접촉을 필요로 하지 않고, 특히 구조체에 매립된 입자와 세포 사이의 직접적인 접촉을 필요로 하지 않으면서 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 방법은 미세입자 및/또는 나노입자와 같은 입자를 사용하여 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화함으로써 세포에 의한 입자 또는 재료 또는 상기 입자의 단편의 흡수를 감소 또는 방지할 수 있다.
본 발명의 추가 목적은 주변 세포 또는 조직에 미세입자 및/또는 나노입자와 같은 입자 또는 상기 입자의 재료 또는 단편의 확산 또는 축적을 제한하면서 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 예를 들어 낮은 플루엔스(fluence)의 레이저 펄스를 이용하여 세포를 사멸시키기 위해 세포를 단편화할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 조사(레이저 처치) 후에 세포, 예를 들어 조직으로부터 구조체를 간단히 제거할 수 있도록 세포를 투과성화 및/또는 단편화하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 표면 종양을 제거할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
추가 목적은 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하는 방법, 예를 들어 세포, 예를 들어 각막 세포를 선택적으로 사멸시키는 방법에 사용하기 위해 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자를 포함하는 구조체를 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하는 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo) 방법이 제공된다. 이 방법은, 예를 들어, 세포를 선택적으로 사멸시키거나 선택적으로 절제하는 것을 포함한다. 이 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 재료를 포함하고 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자를 포함하는 구조체를 제공하는 단계. 구조체는 부피(V)와 자유 표면(S)을 정의(defining)한다. 자유 표면(S)은 자유 표면적(AS를 갖는다. 입자는 구조체의 재료에 매립되어 있다. 입자의 적어도 일부는 자유 표면(S)에 부분적으로 노출되어 있다. 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 입자 각각은 자유 표면(S)에서 입자 없는 표면(P)을 정의한다. 입자 없는 표면(P)은 입자 없는 표면적(AP)을 갖는다. 입자는 모든 입자의 입자 없는 표면적(AP)의 합이 자유 표면적(AS)의 0.0001 내지 50% 범위가 되는 방식으로 재료에 매립된다;
- 적어도 하나의 세포, 바람직하게는 복수의 세포를 제공하는 단계;
- 구조체와 적어도 하나의 세포를 서로 100μm보다 짧은 거리(d)에 위치시키는 단계로서, 거리(d)는 적어도 하나의 세포와 구조체 사이의 최단 거리, 바람직하게는 적어도 하나의 세포와 구조체의 자유 표면(S) 사이의 최단 거리인, 단계;
- 전자기 방사선으로 구조체를 조사하는 단계.
구조체의 자유 표면(S)은 환경과 직접 접촉하는 구조체의 전체 표면이다. 구조체가 유체, 예를 들어 액체(예컨대 (생물학적) 세포를 포함하는 매체) 또는 가스(예를 들어, 공기)에 잠겨 있고 구조체가 해당 유체에 대해 불투과성인 재료를 포함하는 경우, 구조체의 자유 표면(S)은 유체와 접촉하거나 접촉할 수 있는 구조체 재료의 전체 표면으로 정의될 수도 있다.
자유 표면(S)은 자유 표면적(AS)을 정의한다.
바람직하게는, 구조체의 자유 표면적(AS) 대 구조체의 부피의 비율, 즉 AS/V 비는 10-2 내지 102 μm-1, 예를 들어 10-1 내지 50 μm-1 또는 1 내지 10 μm-1 범위이다.
'면적(area)'이라는 용어는 평면상의 평평한 표면의 크기, 즉 2차원 물체의 크기에 대한 측정치를 의미한다.
'표면적(surface area)'이라는 용어는 3차원 형상의 물체의 표면 크기에 대한 측정치를 의미한다.
'자유 표면적(free surface area)(AS)'이라는 용어는 구조체의 자유 표면의 크기에 대한 측정치를 의미한다.
본 발명에 따른 구조체에 존재하는 전자기 방사선를 흡수할 수 있는 입자의 농도는 바람직하게는 0.001 부피% 내지 20 부피% 범위(입자 부피/부피 구조)이다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 구조체에 존재하는 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자의 농도는 0.01 부피% 내지 10 부피% 또는 0.01 부피% 내지 5 부피% 범위이고, 예를 들어 0.05 부피%, 0.1 부피%, 0.2 부피%, 0.5 부피%, 1 부피%, 2 부피% 또는 5 부피%이다.
위에서 언급한 바와 같이, 구조체에 존재하는 입자의 일부는 구조체의 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된다. 따라서 이러한 입자는 재료에 부분적으로 매립되고 구조체의 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된다. 본 발명에 따른 구조체는 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 입자에 더하여 구조체의 재료에 의해 완전히 매립된 입자를 포함할 수 있다는 것이 명백하다.
자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 각각의 입자는 자유 표면(S)의 일부인 자유 표면을 갖는다. 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 입자가 차지하는 자유 표면(S)은 입자 없는 표면(P)라고 지칭된다. 입자 없는 표면(P)은 입자 없는 표면적 (Ap)를 갖는다.
'입자 없는 표면적(particle free surface area)(AP)'이라는 용어는 입자가 없는 표면(P)의 크기에 대한 측정치를 의미한다.
구조체의 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 입자는 재료로부터 돌출될 수도 있고 돌출되지 않을 수도 있다. 돌출된 입자는 재료에 의해 정의된 외부 표면에서 돌출된다.
본 발명에 따른 구조체는 재료에 의해 정의된 외부 표면으로부터 돌출된 구조의 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 입자와 재료에 의해 정의된 외부 표면에서 돌출되지 않은 구조체의 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 입자의 조합을 포함할 수 있다.
돌출된 입자는 재료의 표면에 대해 수직으로 측정하여, 예를 들어 50μm의 높이, 예를 들어 0.5μm 내지 10μm의 높이로 확장된다.
바람직하게는, 입자는 아래 나타낸 바와 같이 모든 입자의 입자 없는 표면적(AP)의 합이 자유 표면적(AS)의 0.0001 내지 50% 범위가 되도록 구조체, 더욱 특히 구조체의 재료에 매립된다:
i의 범위는 1부터 n까지이다(n은 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 입자의 수임).
바람직한 실시형태에서, 입자는 모든 입자의 입자 없는 표면적(AP)의 합이 자유 표면적(AS)의 1 내지 25%, 자유 표면적(AS)의 5 내지 25%, 자유 표면적(AS)의 15 내지 25%의 범위가 되도록 구조체에 매립된다. 모든 입자의 입자 없는 표면적(AP)의 합은, 예를 들어, 자유 표면적(AS)의 20%이다.
전자기 방사선을 구조체에 조사할 때, 구조체에 존재하는 입자, 특히 구조체의 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 입자는 광열 효과를 유발한다. 이러한 광열 효과는 특히 조사된 입자에 가까운 재료의 국부적이고 일시적인 가열을 유발하고 증기 마이크로버블 또는 증기 나노버블과 같은 증기 버블의 형성을 유도한다. 이러한 증기 버블은 근거리에 있는 세포의 투과성화 또는 단편화를 유발할 수 있다.
본 발명의 실시형태에서, 상기 방법은 세포와 구조체를 서로 접촉시키거나 서로 짧은 거리에 있게 하고 구조체에 조사, 특히 전자기 방사선으로 자유 표면(S)에 부분적으로 노출되는 구조체에 존재하는 입자를 조사함으로써 세포의 투과성을 증가시킬 수 있다. 이 방법은 입자와 세포 사이의 직접적인 접촉을 필요로하지 않고 세포의 투과성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 방법은 세포와 구조체를 서로 접촉시키거나 서로 짧은 거리에 있게 하고 구조체에 조사함으로써, 특히 전자기 방사로 자유 표면(S)에 부분적으로 노출되는 구조체에 존재하는 입자를 조사함으로써 세포를 단편화할 수 있게 한다. 이 방법은 입자와 세포 사이의 직접적인 접촉을 필요로하지 않고 세포를 단편화할 수 있다. 이 방법은 세포와 구조체를 서로 접촉시키거나 서로 짧은 거리에 두고 구조체, 특히 전자기 방사로 자유 표면(S)에 부분적으로 노출되는 입자를 조사함으로써 세포를 사멸시키거나 세포를 절제하는 것을 가능하게 한다. 특히, 이 방법은 입자와 세포 사이의 직접적인 접촉을 필요로하지 않고 세포를 사멸시키거나 세포를 제거하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 방법은 세포와 구조체를 서로 접촉시키거나 서로 짧은 거리에 두고 구조체를 조사함으로써, 특히 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 구조체에 존재하는 입자를 전자기 방사선으로 조사함으로써 다른 세포를 단편화시키면서 특정 세포의 투과성을 증가시킬 수 있다. 특히, 이 방법은 입자와 세포 사이의 직접적인 접촉을 필요로하지 않고 다른 세포를 단편화하면서 특정 세포의 투과성을 높일 수 있다.
세포와 구조체를 서로 접촉시킨다는 것은 세포와 구조체 사이에 직접적인 접촉이 있음을 의미한다. 이러한 경우 세포는 구조체의 자유 표면(S)과 접촉한다. 세포는 구조체의 재료와 직접 접촉할 수 있고 및/또는 구조체의 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 하나 이상의 입자와 직접 접촉할 수 있다.
세포와 구조체를 서로 근 거리에 위치시킨다는 것은 세포와 구조체 사이의 최단 거리(d), 특히 세포와 구조체의 자유 표면(S) 사이의 최단 거리가 100μm 또는 100μm 미만임을 의미한다. 세포와 구조체 사이의 최단 거리(d)는 예를 들어 50μm, 20μm, 10μm, 5μm, 3μm, 2μm, 1μm, 0.5μm 또는 0.1μm이다. 바람직하게는, 세포와 구조체의 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 입자 사이의 최단 거리(d)는 100μm 또는 100μm 미만이다. 구조체의 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 입자와 세포 사이의 가장 가까운 거리는 예를 들어 50μm, 20μm, 10μm, 5μm, 3μm, 2μm, 1μm, 0.5μm 또는 0.1μm이다.
적어도 하나의 세포는 예를 들어 세포의 현탁액 또는 세포의 조직을 포함한다. 조직의 예에는 안구 조직 또는 피부 조직이 포함된다. 특정 예는 종양 마진(tumour margins)을 포함한다.
단일 세포 분해능에서 공간적으로 선택적 투과성화 및/또는 단편화를 허용하려면, 자유 표면(S)에 적어도 부분적으로 노출된 입자의 밀도는, 각 세포가 자유 표면(S)에 적어도 부분적으로 노출된 입자에 충분히 가까이 있도록 선택되어야 한다.
100μm와 동일하거나 그 보다 짧은 거리(d)에 있는 세포의 밀도는 예를 들어 1개 세포/mm2 내지 105개 세포/mm2 범위, 예를 들어 10개 세포/mm2 내지 104개 세포/mm2 범위, 102개 세포/mm2 내지 104개 세포/mm2 또는 103개 세포/mm2 내지 3.103개 세포/mm2 범위이다.
구조체의 자유 표면(S)에 부분적으로 노출되는 입자의 밀도는 바람직하게는 1 입자/100㎛2 내지 10 입자/100㎛2, 예를 들어 1 입자/㎛2 내지 5 입자/100㎛2, 예를 들어, 2개 입자/㎛2, 3개 입자/100㎛2 또는 4개 입자/100㎛2이다.
본 발명에 따른 구조체에 매립된 입자는 전자기 방사선을 흡수할 수 있고 전자기 방사선 조사 시 광열 효과를 생성하도록 구성된 임의의 입자를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 '입자'는 약 1 nm 내지 약 40000 nm(40 μm), 예를 들어 1 nm 내지 10000 nm(10 μm), 10 nm 내지 2000 nm(2 μm), 50 nm 내지 1000 nm(1 μm) 또는 100 nm 내지 500 nm, 예를 들어 200 nm의 치수(더 특별하게는 입자의 가장 큰 치수)를 갖는 2개 이상의 입자의 입자 또는 그룹, 응집체 또는 클러스터를 의미한다.
치수는 바람직하게는 입자의 가장 큰 치수를 측정함으로써 측정된다. 입자의 가장 큰 치수는 해당 입자의 두 지점 사이의 가장 큰 거리에 해당한다. 입자의 최대 치수는 예를 들어 해당 입자의 폭(최대 너비), 높이(최대 높이) 또는 직경(최대 직경)을 지칭한다.
입자의 크기를 지정하는 대안적인 방법은 등가 구 직경(등가 체적 직경이라고도 함)에 의한 것이다. 불규칙한 모양의 물체의 등가 구 직경(또는 ESD)은 등가 부피의 구의 직경이다. 실시형태에서, 입자는 약 1 nm 내지 약 40000 nm(40 μm)의 등가 구 직경을 가질 수 있다. 실시형태에서, 입자는 약 1 nm 내지 약 10000 nm(10 μm)의 등가 구 직경을 가질 수 있다. 예를 들어, 입자는 약 10 nm 내지 200 nm(2 μm), 50 nm 내지 1000 nm(1 μm), 또는 100 nm 내지 500 nm, 예를 들어 200 nm의 등가 구 직경을 가질 수 있다.
입자의 치수(예를 들어 입자의 폭, 높이 또는 직경), 특히 입자의 최대 치수(예를 들어 입자의 최대 폭, 높이 또는 직경) 또는 등가 구 직경은 투과전자현미경(TEM), 주사전자현미경(SEM) 또는 원자력현미경(AFM)을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 '입자의 그룹(group of particles)', '입자의 응집체리(agglomerate of particles)' 및 '입자의 클러스터(cluster of particles)'는 상호교환적으로 사용된다.
입자의 클러스터는 적어도 2개의 개별 입자, 바람직하게는 10 내지 1000개의 개별 입자, 예를 들어 100 내지 1000개의 개별 입자를 포함한다. 클러스터의 개별 입자는 바람직하게는 클러스터의 적어도 하나의 개별 입자와 접촉하거나 해당 클러스터의 다른 개별 입자의 수 마이크로미터 거리에 위치한다.
입자가 클러스터를 구성(comprise)하는 경우, 클러스터의 개별 입자는 바람직하게는 약 1 nm 내지 약 200 nm, 예를 들어 50 nm 내지 100 nm의 치수(보다 특히 개별 입자의 최대 치수)를 갖는다.
클러스터는 바람직하게는 약 1000 nm 내지 약 40000 nm(10 μm), 예를 들어 10 nm 내지 2000 nm, 50 nm 내지 1000 nm 또는 100 nm 내지 500 nm, 예를 들어 200 nm의 치수(더 특별하게는 클러스터의 가장 큰 치수)를 갖는다.
본 명세서에 사용된 용어 '미세입자'는 1000 nm(> 1 μm) 초과 최대 10000nm(≤10μm)의 치수(더 특별하게는 입자의 가장 큰 치수)를 갖는 2개 이상의 입자의 그룹, 응집체 또는 클러스터를 지칭한다. 미세입자가 클러스터를 포함하는 경우, 그러한 클러스터의 개별 입자는 바람직하게는 약 1 nm 내지 약 200 nm, 예를 들어 50 nm 내지 100 nm의 치수(더 특별하게는 개별 입자의 최대 치수)를 갖는다.
'나노입자(nanoparticle)'라는 용어는 적어도 1 nm(≥1 nm) 최대 1000 nm(≤ 1 μm)의 치수(입자의 최대 치수)를 갖는 입자 또는 그룹, 응집체, 똔느 2개 이상의 입자의 클러스터를 지칭한다. 미세입자가 클러스터를 포함하는 경우, 그러한 클러스터의 개별 입자는 바람직하게는 약 1 nm 내지 약 200 nm, 예를 들어 50 nm 내지 100 nm의 치수(보다 특히 개별 입자의 최대 치수)를 갖는다.
100 nm 내지 1000 nm 범위의 치수(입자의 최대 치수)를 갖는 입자는 '미세입자'로도 지칭될 수 있다.
입자는 임의의 형상을 가질 수 있다. 예를 들어 구형, 타원형, 막대형, 피라미드형, 분지형 또는 불규칙한 모양을 가질 수 있다.
입자는 고체 입자일 수 있고, 하나 이상의 재료를 포함하는 쉘 구조 또는 코어-쉘 구조를 가질 수 있다.
바람직한 입자는 금속 입자, 금속 산화물 입자, 탄소 또는 탄소계 입자, 하나 이상의 광 흡수 화합물을 포함하는 입자, 또는 하나 이상의 광 흡수 화합물로 로딩되거나 관능화된 입자를 포함한다.
금속 입자의 예에는 금 입자, 은 입자, 백금 입자, 팔라듐 입자, 구리 입자 및 이들의 합금이 포함된다. 바람직한 금속 입자는 금 입자, 은 입자 및 이들의 합금을 포함한다.
금속 산화물 입자의 예는 산화철, 산화티타늄, 산화지르코늄, 산화세륨, 산화아연 및 산화마그네슘을 포함한다.
탄소 또는 탄소계 입자의 예는 그래핀 양자점, (환원된) 산화 그래핀 및 탄소 나노튜브를 포함한다.
하나 이상의 광 흡수 화합물을 포함하는 입자 또는 하나 이상의 광 흡수 화합물로 로딩되거나 관능화된 입자의 예는 합성 유기 또는 무기 흡수제를 포함하거나, 로딩되거나 또는 관능화된 입자뿐만 아니라 천연 생성 흡수제 또는 이이 유도체를 포함하거나 로딩되거나 또는 관능화된 입자를 포함한다. 특정 예로는 리포솜, 고체 지질 나노입자, 인도시아닌 그린과 같은 광 흡수 염료 분자, 무기 양자점(낮은 형광 양자 수율을 가짐), 안료와 같은 천연 생성 광 흡수제(예컨대 멜라닌, 로돕신, 포토신 또는 요오돕신) 및 폴리도파민과 같은 합성 유사체, 또는 광역학 치료에 사용되는 감광제를 포함하거나 로딩되거나 또는 관능화된 폴리머계 입자를 포함한다.
본 발명에 따른 방법 또는 제품의 실시형태에서, 입자는 생분해성일 수 있다. 실시형태에서, 입자는 생체적합성일 수 있다. 실시형태에서, 입자는 생분해성이고 생체적합성일 수 있다. 실시형태에서, 입자는 임상적으로 승인된 성분을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 유리하게는, 입자는 생분해성이고, 생체적합성이며, 임상적으로 승인된 성분을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명에 따른 구조체는 한 가지 유형의 입자 또는 다른 입자의 조합, 예를 들어 다른 크기, 다른 조성 및/또는 다른 형상(shape)을 갖는 입자를 포함할 수 있다.
전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자가 매립되는 구조체의 재료는 예를 들어 무기 재료 또는 무기계 재료, 예를 들어 실리카 또는 실리카계 재료 또는 세라믹 또는 세라믹계 재료, 유기 재료 또는 유기계 재료, 예컨대 탄소 또는 탄소 기반 재료 또는 폴리머 또는 폴리머 기반 재료를 포함한다. 구조체의 재료는 또한 상기 언급된 재료 중 적어도 하나를 포함하는 복합 재료, 예를 들어 유기 재료와 무기 재료를 포함하는 복합 재료를 포함할 수 있다.
구조체의 바람직한 재료는 폴리스티렌, 폴리카프로락톤, 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 아세토프탈레이트, 폴리락트산, 폴리락트산-코-글리콜산, 셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 콜라겐, 실크, 알기네이트, 히알루론산, 덱스트란, 전분, 폴리카보네이트 또는 폴리아크릴레이트를 포함하거나 이에 기반한다. 다른 실시형태에서 구조체의 재료는 겔 또는 하이드로겔을 포함한다. 겔은 유체에 의해 전체 부피에 걸쳐 팽창하는 비유체 폴리머를 포함한다. 하이드로겔은 팽윤제가 물인 겔이다. 특히, 하이드로겔은 (친수성) 고분자의 3차원 네트워크로 물 속에서 팽윤할 수 있고, 개별 고분자 사슬의 화학적 또는 물리적 가교로 인해 그의 구조를 유지하면서 많은 양의 물을 담을 수 있는 구조체를 말한다. 하이드로겔은 단독폴리머, 코폴리머, 반-상호침입(semi-interpenetrating) 네트워크 및 상호침입 네트워크를 포함할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 구조체는 표면 개질된 재료, 예를 들어 표면 개질된 폴리머 재료를 포함한다. 표면 변형은 예를 들어 코팅, 예를 들어 단백질 코팅, 항체를 포함하는 코팅, 지질을 포함하는 코팅, 폴리머 코팅 또는 이들의 조합의 적용을 포함한다.
재료는 가시광선에 대해 투명한 것이 바람직하다. 재료는 바람직하게는 450 내지 650nm 범위의 파장을 갖는 가시광선에 대한 투과율이 적어도 50%이거나, 450 내지 650nm 범위의 파장을 갖는 가시광선에 대한 투과율이 적어도 60%이다.
바람직하게는, 재료 및 입자를 포함하는 구조체는 450 내지 650 nm 범위의 파장을 갖는 가시광선에 대한 투과율이 적어도 25%, 450 내지 650 nm 범위의 파장을 갖는 가시광선에 대한 투과율이 적어도 35% 또는 450 nm 내지 650 nm 범위의 파장을 갖는 가시광선에 대한 투과율이 적어도 50%이다.
재료 및 재료에 매립된 입자를 포함하는 구조체는 연속적 또는 불연속적 구조체를 포함할 수 있다.
구조체는 단단하거나 유연할 수 있다. 유연한 구조체는 치료할 조직의 표면에 맞게 조정될 수 있으므로 바람직할 수 있다.
구조체는 편평하거나 평면일 수 있거나 구조체는 편평하지 않을 수 있으며, 예를 들어 곡선일 수 있다.
구조체는 편평하거나 편평하지 않은 외부 표면을 가질 수 있다.
구조체는 다공성 또는 비다공성 구조체를 포함할 수 있다.
일부 적용의 경우, 다공성 구조체는 높은 자유 표면적(As)를 갖고 따라서 본 발명의 방법에 따라 구조체 상에 또는 그 근처에 도입되는 세포에 노출될 수 있는 큰 표면적을 갖는다는 장점이 있기 때문에 바람직하다. 바람직하게는, 이러한 다공성 구조체 상에 또는 그 근처에 도입된 세포가 기공 내로 부분적으로 또는 완전히 침투할 수 있게 하는 기공 크기를 갖는다. 바람직하게는, 다공성 구조체는 세포 배지에 존재하는 분자가 세포에 접근하는 것을 제한하지 않는 기공 크기를 갖는다.
구조체의 다공성은 해당 구조체가 차지하는 전체 부피에 대한 구조체의 기공 또는 공극의 부피 비율, 즉 구조체의 부피(V)(재료의 부피와 재료에 매립된 입자의 부피) 및 해당 구조체의 기공 또는 공극의 부피의 합으로 정의된다. 다공성은 0% 내지 100% 범위일 수 있다. 구조체가 다공성 구조체를 포함하는 경우, 구조체의 다공성은 바람직하게는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%이다.
본 발명에 따른 구조체의 제1 그룹은 필름 또는 호일에 매립된 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자를 포함하는 필름 또는 호일을 포함한다. 이러한 필름 또는 포일은 예를 들어 비다공성이다. 예에는 폴리머 필름 또는 폴리머 포일에 매립된 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자를 포함하는 폴리머 필름 또는 폴리머 포일이 포함된다. 본 발명의 목적을 위해, '필름' 및 '포일'이라는 용어는 상호교환적으로 사용된다.
필름의 바람직한 예는 폴리스티렌, 폴리카프로락톤, 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 아세토프탈레이트, 폴리락트산, 폴리락트산-코-글리콜산, 셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 콜라겐, 실크, 알기네이트, 히알루론산, 덱스트란, 전분, 폴리머 필름에 산화철 입자 및/또는 탄소 입자가 매립되어 있는 폴리카보네이트 또는 폴리아크릴레이트를 포함하거나 이에 기반한 폴리머 필름을 포함한다. 폴리머 필름은 예를 들어 0.1 μm 내지 100 μm, 예를 들어 0.1 μm 내지 10 μm 범위의 두께를 갖는다.
바람직하게는; 이러한 필름은 제1 표면(S1)과, 제1 표면(S1)의 반대측의 제2 표면(S2)을 정의한다. 제1 표면(S1)은 제1 자유 표면적(AS1)을 정의하고, 제2 표면(S2)은 제2 자유 표면적(AS2)을 정의한다. 제1 표면은 예를 들어 상부 표면(상부 자유 표면적을 정의함)인 반면, 제2 표면은 하부 표면(하부 자유 표면적을 정의함)이다. 대안적으로, 제1 표면은 바닥 표면(바닥 자유 표면적을 정의함)인 반면, 제2 표면은 상부 표면(상부 자유 표면적을 정의함)이다.
조사될 때, 방사선은 예를 들어 제1 표면(S1) 또는 제2 표면(S2)에 충돌한다.
바람직하게는, 제1 자유 표면적(AS1)과 제2 자유 표면적(AS2)은 동일하거나 실질적으로 동일한 크기를 갖는다.
제1 그룹의 구조체는 예를 들어 두께(t), 길이(l) 및 폭(w)를 갖는다. 두께 범위는 바람직하게는 0.1μm 내지 10μm, 예를 들어 0.1μm 내지 10μm이다. 구조체의 부피(V)는 t.l.w 또는 t.AS1에 해당한다. 제1그룹의 구조의 길이(l)와 폭(w)은 일반적으로 구조체의 두께(t)보다 상당히 크기 때문에 구조체의 자유 표면적(AS)은 AS1+AS2로 추정할 수 있다. 조사되는 자유 표면은 일반적으로 구조체의 표면 중 하나(예를 들어, 제1 표면 S1 또는 제2 표면 S2)에 해당하며 AS1로 추정할 수 있다. 결과적으로, 구조체의 부피에 대한 구조체의 자유 표면적의 비율, 즉 S/V는 1/t에 해당한다.
바람직하게는, 제1 표면(S1) 또는 제2 표면(S2) 중 적어도 하나는 구조체의 자유 표면(S)을 적어도 부분적으로 노출시키는 입자를 포함한다. 제1 표면(S1) 또는 제2 표면(S2)에 부분적으로 노출된 각각의 입자는 제1 표면(S1) 또는 제2 표면(S2)에서 입자 없는 표면(P)을 정의한다. 입자 없는 표면(P)은 입자 없는 표면적(AP)을 갖는다. 입자는 제1 표면(S1)에 부분적으로 노출되거나 제2 표면(S2)에 부분적으로 노출된 모든 입자의 입자 없는 표면적(AP)의 합이 자유 표면적(AS1) 및 자유 표면적(AS2)의 합의 0.0001 내지 50% 범위가 되도록 재료에 매립된다. 더욱 바람직하게는, 입자는 제1 표면(S1)에 부분적으로 노출되거나 제2 표면(S2)에 부분적으로 노출된 모든 입자의 입자 없는 표면적(AP)의 합이 자유 표면적(AS1) 및 자유 표면적(AS2)의 합의 5 내지 25% 범위 또는 자유 표면적(AS1) 및 자유 표면적(AS2)의 합의 15 내지 25%가 되도록 재료에 매립된다.
특정의 실시형태에서, 제1 표면(S1) 또는 제2 표면(S2) 중 하나는 구조체의 자유 표면(S)에 적어도 부분적으로 노출된 입자를 포함한다. 제1 표면(S1)에 부분적으로 노출된 각각의 입자는 제1 표면(S1)에서 입자 없는 표면(P)을 정의한다. 입자 없는 표면(P)은 입자 없는 표면적(AP)을 갖는다. 입자는 제1 표면(S1)에 부분적으로 노출된 모든 입자의 입자 없는 표면적(AP)의 합이 자유 표면적(AS1)의 0.0001 내지 50% 범위가 되는 방식으로 재료에 매립된다.
바람직한 실시형태에서, 입자는 제1 표면(S1)에 부분적으로 노출된 모든 입자의 입자 없는 표면적(AP)의 합이 자유 표면적(AS1)의 5 내지 25% 범위이거나 또는 자유 표면적(AS1)의 15 내지 25% 범위가 되는 방식으로 재료에 매립된다.
본 발명에 따른 구조체의 두 번째 그룹은 하이드로겔에 매립된 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자를 포함하는 하이드로겔을 포함한다.
바람직한 하이드로겔은 호모폴리머, 코폴리머, 반-상호침입 네트워크 및 상호침입 네트워크를 포함한다. 폴리머의 예는 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 2-히드록시에틸 메타크릴레이트((HEMA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트(PEG-MA), 메타크릴산(MAA); 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC); 폴리비닐피롤리돈(PVP), 아크릴아미드/아크릴산 코폴리머 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드)(PNIPAM), 키토산, 아크릴레이트 변형 PEG, 아크릴레이트 변형 히알루론산, 헤파린 및 아민 말단 관능화된 4-암 스타-PEG를 포함한다. 가교제의 예에는 폴리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트(TEGDMA), 테트라(에틸렌 글리콜) 디메타크릴레이트 및 N,N-이사아크릴아미드가 포함된다.
입자는 예를 들어 산화철 입자 및/또는 탄소 입자를 포함한다.
본 발명에 따른 구조체의 제3 그룹은 재료와 재료에 내장된 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자를 포함하는 다공성 구조체를 포함한다. 예는 다공성 폴리머 구조체에 입자가 매립된 다공성 폴리머 구조체를 포함한다. 다공성 구조의 예는 섬유를 포함하는 구조(예를 들어 폴리머 섬유), 미립자를 포함하는 구조(예를 들어 폴리머 미립자), 섬유와 미립자의 조합을 포함하는 구조(예를 들어 폴리머 섬유 및/또는 폴리머 미립자의 조합) 및 폼을 포함하는 구조(예를 들어 폴리머 폼)을 포함한다. 섬유 및/또는 미립자는 상호 연결되거나 연결되지 않을 수 있다. 예를 들어 폴리머 미립자와 같은 미립자는 구형 미립자뿐만 아니라 불규칙한 형태의 미립자를 포함할 수 있다. 다공성 구조체에 매립된 입자는 예를 들어 산화철 입자 및/또는 탄소 입자를 포함한다.
제3 그룹의 구조체의 첫 번째 예는 (폴리머) 섬유를 포함하는 구조체이다. (폴리머) 섬유는 예를 들어 0.1μm 내지 10μm 범위의 섬유 직경, 예를 들어 0.5μm 또는 1μm의 직경을 갖는다. (폴리머) 섬유는 상호 연결되거나 연결되지 않을 수 있다. (폴리머) 섬유는 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해 얻어질 수 있다. (폴리머) 섬유를 제조하는 바람직한 기술은 전기방사이다. 대체 기술로는 습식 방사, 용융 방사, 압출 방사, 건식 스프레이 습식 방사, 유제 방사 및 현탁 방사가 포함된다. 폴리머의 바람직한 예는 폴리스티렌 섬유, 폴리카프로락톤 섬유, 에틸셀룰로오스 섬유, 셀룰로오스 아세토프탈레이트 섬유, 폴리락트산 섬유 및 폴리락트산-코-글리콜산 기반 섬유를 포함한다. (폴리머) 섬유는 표면 개질될 수 있다.
(폴리머) 섬유는 섬유 직경(dfibre)에 해당하는 직경과 섬유 길이(Lfibre)에 해당하는 길이를 갖는 긴 원통형으로 간주될 수 있으므로, 섬유의 부피(Vfibre)는 에 해당하고 섬유의 자유 표면적(Sfibre)은 에 해당한다. 결과적으로, 자유 표면적(Sfibre) 대 부피(Vfibre)의 비율은 4/dfibre에 해당한다.
제3 그룹의 구조체의 두 번째 예는 예를 들어 폴리머 (미소)구체와 같은 폴리머 미립자를 포함하는 구조체이다. 미립자는 예를 들어 0.1μm 내지 10μm 범위의 미립자 직경, 예를 들어 0.5μm 또는 1μm의 직경을 갖는다. 폴리머 미립자는 상호 연결되거나 연결되지 않을 수 있다. (폴리머) 미립자는 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해 얻어질 수 있다. 미립자의 바람직한 예는 폴리스티렌, 폴리카프로락톤, 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 아세토프탈레이트, 폴리락트산, 폴리락트산-코-글리콜산 기반 섬유를 포함한다. 폴리머 미립자는 표면 개질될 수 있다.
미립자가 직경(dms)의 미소구체인 경우, 미소구체의 부피(Vms)는 에 해당하고, 미소구체의 자유 표면적(Sms)는 에 해당한다. 결과적으로, 미소구체 부피(Vms)에 대한 자유 표면적(Sms)의 비율은 6/dms이다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 구조체와 적어도 하나의 세포를 서로 100μm 미만의 거리(d)에 위치시키는 단계를 포함한다.
적어도 하나의 세포는 예를 들어 복수의 세포, 예를 들어 세포 또는 세포 조직을 포함하는 현탁액을 포함한다.
구조체와 적어도 하나의 세포는 적어도 하나의 세포를 구조체 위에 또는 구조체에 가까이 위치시킴으로써 또는 구조체를 적어도 하나의 세포에 가까이 위치시킴으로써 서로 거리(d)만큼 떨어져 있게 될 수 있다.
세포는 예를 들어 구조체 위 또는 근처, 특히 구조체의 자유 표면(S) 위 또는 근처에서 세포를 포함하는 현탁액을 적용함으로써 구조체 위 또는 근처에 도입된다. 세포는 구조체 위나 근처에 연속적으로 도입되거나 구조체 위나 근처에 불연속적으로 도입될 수 있다.
현탁액 중의 세포의 농도는 바람직하게는 mL당 1 내지 106개 세포, 예를 들어 mL당 103 내지 105개 세포 범위이다.
바람직한 방법에서 현탁액, 즉 현탁액의 세포는 특정 기간 동안 구조체 위 또는 구조체 근처에서 배양된다.
대안적인 방법에서, 세포는 구조체 상에 또는 구조체 근처에 이들이 도입된 즉시 또는 직후에 전자기 방사선에 의한 구조체의 활성화에 의해 처리된다.
본 발명의 실시형태에서, 구조체 위 또는 구조체 근처에 적어도 하나의 세포를 도입한 후, 적어도 하나의 세포는 조사 단계 전(즉, 그 전에), 예를 들어 1분 이상 동안 또는 1시간 이상 동안 인큐베이션될 수 있다.
대안적으로, 구조체는 예를 들어 세포를 포함하는 조직에 구조체를 적용하거나 세포를 포함하는 조직으로부터 짧은 거리에 적용함으로써 적어도 하나의 세포에 가까워질 수 있으며, 구조체의 자유 표면(S)은 이로써 세포와 접촉하거나 또는 세포로부터 거리(d)만큼 떨어진 곳에 위치하게 된다.
구조체, 특히 구조체의 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 입자는 전자기 방사선, 예를 들어 펄스 방사선원으로 조사되는 것이 바람직하지만, 연속파 방사선원에 의한 조사도 고려될 수 있다.
용어 '방사선(radiation)' 및 '전자기 방사선(electromagnetic radiation)'은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
방사선원의 파장은 자외선 영역에서 적외선 영역까지의 범위일 수 있다. 바람직한 방법에서, 사용되는 방사선의 파장 범위는 근적외선 영역을 포함하여 가시광선부터 적외선 영역까지이다.
전자기 방사선은 펄스 레이저와 같은 레이저에 의해 생성될 수 있다. 펄스 레이저, 예를 들어, 피코-, 펨토- 및/또는 나노초 펄스 레이저에 의한 조사와 같은 레이저 조사는, 예를 들어, 레이저 유도 증기 나노버블 생성에 의해 세포의 장벽을 효율적으로 투과성화되도록 하기 위해 본 발명의 실시형태에 따른 구조체와 결합될 수 있다. 레이저 조사가 유리할 수 있지만, 동일하거나 유사한 효과를 얻기 위해 다른 (강한) 광원에 의한 조사가 반드시 배제되는 것은 아니다.
방사선원의 파장은 자외선 영역에서 적외선 영역까지의 범위일 수 있다. 바람직한 방법에서, 사용되는 방사선의 파장 범위는 가시광선부터 근적외선 영역까지이다.
펄스 방사선원이 사용되는 경우, 펄스는 바람직하게는 1fs 및 1ms 범위, 예를 들어 1fs 및 100μs 범위, 10fs 및 10μs 범위, 100fs 및 1μs 범위 또는 1ps 및 100ns 범위의 지속 시간을 갖는다.
레이저 펄스는 1 내지 500개의 레이저 펄스, 1 내지 100개의 레이저 펄스, 1 내지 20개의 레이저 펄스, 또는 1 내지 10개의 레이저 펄스(세포당 또는 세포 샘플당)와 같은 1 내지 1000개의 레이저 펄스로 구성될 수 있다. 레이저 펄스의 수는 예를 들어 광반응성 유기 입자 및 세포 유형에 따라 달라질 수 있다.
방사선원의 펄스당 플루엔스(단위 면적당 전달된 전자기 에너지)는 바람직하게는 0.0001 J/cm2 내지 1000 J/cm2, 예를 들어 0.001 J/cm2 내지 100 J/cm2, 0.01 J/cm2 내지 10 J/cm2, 0.1 J/cm2 내지 10 J/cm2, 예를 들어 0.1 J/cm2, 1 J/cm2 또는 5 J/cm2이다.
본 발명에 따른 방법의 이점은 구조체에 매립된 입자의 단편화 또는 방출이 감소되거나 방지된다는 점이다. ICP-MS 분석에 따르면 검출가능한 양의 입자 재료가 방출되지 않는 것으로 나타났다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 이점은 단일 세포를 투과성화 및/또는 단편화할 수 있게 하는 방법의 공간 분해능이다.
본 발명에 따른 방법의 추가 이점은 구조체와 세포 사이, 특히 입자와 세포 사이의 직접적인 접촉이 세포를 투과성화 및/또는 단편화하는 데 필요하지 않다는 것이며 그로 인해 세포에 의한 입자 또는 단편의 흡수를 감소시키거나 방지된다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 장점은 구조체의 제조 용이성이다.
본 명세서에 교시된 방법은 인간 또는 동물 신체의 세포 또는 세포들을 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하는 데에도 유용할 수 있다.
본 발명의 제2 양태에 따르면 구조체에 접촉하거나 근접한 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하기 위해 광열 공정에 사용하기 위한 상술한 구조체가 제공된다. 구조체는 재료로 구성되며 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자로 구성된다. 구조체는 부피(V)와 자유 표면(S)을 정의한다. 자유 표면(S)은 자유 표면적(AS)를 갖는다. 입자가 재료에 매립되어 있다. 입자의 적어도 일부는 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된다. 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 입자 각각은 자유 표면(S)에서 입자 없는 표면(P)를 정의한다. 입자 없는 표면(P)은 입자 없는 표면적(AP)을 갖는다. 입자는 모든 입자의 입자 없는 표면적(AP)의 합이 자유 표면적(AS)의 0.0001 내지 50% 범위가 되는 방식으로 재료에 매립된다.
광열 공정은 다음 단계를 포함한다:
- 구조체와 하나 이상의 세포를 서로 100 ㎛ 미만의 거리(d)에 두는 단계, 거리(d)는 하나 이상의 세포와 구조체 사이의 최단 거리임, 특히 하나 이상의 세포와 구조체의 자유 영역 표면(S) 사이의 최단 거리임;
- 적어도 하나의 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하기 위해 구조체에 전자기 방사선을 조사하는 단계.
본 발명에 따른 구조체는 대상의 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하기 위해 대상의 치료 방법에서 광열 과정에 사용하기에 특히 적합하며, 방법은 다음을 포함한다:
- 대상의 적어도 하나의 세포로부터 100μm 미만의 거리(d)에 구조체를 위시키는 단계, 거리(d)는 대상의 적어도 하나의 세포와 구조체 사이의 최단 거리, 특히 적어도 하나의 세포와 구조체의 자유 영역 표면(S) 사이의 최단 거리임;
- 적어도 하나의 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하기 위해 구조체에 전자기 방사선을 조사하는 단계.
적어도 하나의 세포는 바람직하게는 세포의 현탁액 또는 세포의 조직을 포함한다. 조직의 예에는 안구 조직 또는 피부 조직이 포함된다. 특정 예는 종양 마진을 포함한다.
치료 방법은 예를 들어 나노수술을 포함한다. 특정 치료법은 각막 세포를 사멸시키거나 절제하는 것을 포함한다.
본 명세서에 교시된 구조체 및 과정은 레이저 보조 치료와 같은 대상의 질병 또는 상태의 치료를 가능하게 한다.
용어 '대상(subject)', '개체(individual)' 또는 '환자(patient)'는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있으며 일반적으로 바람직하게는 인간을 의미하지만, 비인간 동물, 바람직하게는 온혈 동물, 훨씬 더 바람직하게는 포유동물에 대한 지칭도 포함할 수 있다.
상술한 구조체 중 임의의 것은 대상의 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하기 위해 대상의 치료 방법에서 광열 과정에 사용하기 위해 고려될 수 있으며, 방법은 다음을 포함한다
전자기 방사선은 상술한 임의의 소스에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게는, 전자기 방사선은 레이저에 의해 생성된 펄스 방사선을 포함한다.
바람직한 방법에서, 본 발명에 따른 구조체는 조사되기 전에 세포로부터, 예를 들어 세포 조직으로부터 가까운 거리에 위치하게 된다. 이러한 방식을 '세포 위의 구조체(structure on top of cells)'라고 지칭한다. 이러한 방법에서는 조사 후 구조체를 쉽게 제거할 수 있다.
특히 바람직한 방법에서 필름, 예를 들어 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자를 포함하는 폴리머 필름은 조사되기 전에 세포로부터, 예를 들어 세포 조직으로부터 가까운 거리로 이동된다('세포 위의 필름(film on top of cells)').
대안적인 방법에서, 세포는 구조체에 적용되며, 예를 들어 조사되기 전에 구조체 상에서 성장된다. 이러한 방법은 '구조체 위의 세포(cells on top of structure)'라고 지칭된다.
특히 바람직한 필름 방법에서, 세포는 필름 상에, 예를 들어 조사되기 전에 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자를 포함하는 폴리머 필름 상에 적용된다('필름 위의 세포(cells on top of film)'). 세포는 예를 들어 필름 위에서, 예를 들어 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자를 포함하는 폴리머 필름 위에서 성장한다.
본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 아래에서 더 자세히 논의될 것이다:
- 도 1a는 본 발명에 따라 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하는 구조체의 개략도를 보여준다;
- 도 1b는 도 1a에 나타낸 구조체의 단면을 보여주며 세포는 구조체로부터 거리(d)를 두고 위치한다;
- 도 2 및 도 3은 본 발명에 따라 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하는 방법을 개략적으로 도시하며, 이에 따라 세포는 도 2에 도시된 바와 같이 필름('필름 상단의 세포')에서 성장하고 필름이 도 3에 나타낸 것과 같이 세포층('세포 상단의 필름')에 적용된다;
- 도 4는 입자를 포함하는 구조체가 펄스 레이저로 조사되기 전에 소 눈의 각막에 적용되는 방법을 도시한다;
- 도 5는 IONP 농도에 따른 PLA 필름 내 입자 클러스터의 평균 크기를 보여준다;
- 도 6은 IONP 농도에 따른 함수로 PLA 필름의 클러스터 밀도(입자 클러스터 수/100μm²)를 보여준다;
- 도 7은 각각 0.3 J/cm² 및 1.6 J/cm²의 단일 레이저 펄스로 PLA-IOC 필름(0.1% IONs, 2%PA)을 조사하기 전과 후에 암시야 현미경으로 얻은 이미지를 보여준다;
- 도 8은 서로 다른 농도의 IONP를 갖는 PLA-IOC 필름에서 성장한 Hela 세포당 클러스터 수를 보여준다;
- 도 9는 0.1% IONP가 포함된 PLA 필름에서 성장한 Hela 세포의 FD500 흡수, 세포 생존율 및 rMFI(상대 평균 형광 강도)를 보여준다;
- 도 10은 0.3 J/cm²의 단일 레이저 펄스로 조사된 0.1% IONP를 사용하여 PLA 필름에서 성장한 FD500의 흡수를 보여주는 공초점 현미경으로 얻은 이미지를 보여준다;
- 도 11은 단일 조사 후 레이저 플루엔스의 함수로서 PLA-IOC 필름(0.1% IONP 없이 또는 0.1% IONP 포함)에서 성장한 Hela 세포의 세포 생존율을 보여준다;
- 도 12는 0.3 J/cm²의 레이저 펄스를 1회 또는 2회 조사한 PLA-IOC 필름(0.1% IONP)에서 성장한 Hela 세포의 세포 생존율을 보여준다;
- 도 13은 서로 다른 레이저 플루엔스(스케일 바는 1000μm)에서 단일 펄스로 조사된 PLA-IOC 필름(2% PLA, 0.1% IONPs)의 사전 정의된 영역(직경 6.5mm의 원)의 선택적 방사선을 보여준다;
- 도 14는 도 13에 나타낸 대로 선택적 방사선 조사 후 회수된 세포의 비율을 다양한 레이저 플루엔스의 함수로 보여준다;
- 도 15는 다양한 레이저 플루엔스의 함수로 도 13에 나타낸 대로 선택적 방사선 조사 후 사멸 세포(프로피디움 아이오다이드(PI)으로 염색)에 대한 생존 세포(칼세인 AM으로 염색)의 비율을 보여준다;
- 도 16은 PLA-IOC 필름(2% PLA, 0.1% IONPs)의 국소 조사 시 선택적 세포 사멸을 보여준다(스케일 바는 10μm);
- 도 17은 단일 레이저 펄스(0.3-1.3 J/cm²)를 조사한 PLA-IOC 필름(2% PLA, 0.1% IONPs)에서 성장한 세포의 단일 세포 절제 성공률을 보여준다. 레이저 플루엔스의 각 값에 대해, 30번의 단일 세포 절제 실험이 수행되었다(n = 30);
- 도 18은 PLA-IOC 필름(2% PLA, 0.1% IONPs)으로 덮인 Hela 세포의 공간 선택적 레이저 유도 사멸을 보여준다;
- 도 19는 도 18과 같이 PLA-IOC(2% PLA, 0.1% IONPs)로 덮인 Hela 세포를 미리 정의된 패턴(Ghent University 로고)에 따라 펄스 레이저로 조명하고 Calcein AM, PI로 염색하고, 병합된 사진의 결과이다. 스케일 바는 1000μm이다;
- 도 20과 도 21은 각각 도 18에 나타낸 바와 같이 1.6 J/cm²의 레이저 플루엔스를 이용하여 연속적인 수의 레이저 펄스를 조사한 후, 처치된 영역에서 생존 세포 대 사멸 세포의 비율과 세포의 총량을 보여준다;
- 도 22는 PLA-IOC 필름이 세포의 상부에 위치하는 경우(도 18에 도시된 바와 같이) 세포 사멸 동안의 기공 형성(왼쪽)과, 조사(1.6 J/cm²; 4회 연속) 후 Hela 세포에 의한 FD500의 흡수 결과(오른쪽)를 개략적으로 나타낸 것이다;
- 도 23은 PLA-IOC 필름에 4회 연속 조사(1.6 J/cm²)한 후 Hela 세포에 대한 ICP-MS 분석(철 함량)을 보여준다; '세포'는 처치되지 않은 세포를 의미한다. 'IONP' 및 'IONP + 레이저'는 각각 레이저 치료가 있거나 없는 유리 IONP(1g/L)가 있는 세포를 나타낸다; 'PLA-IOC' 및 'PLA-IOC + 레이저'는, 각각 레이저 처치가 없는 경우와 레이저 처치가 있는 경우, PLA-IOC 필름으로 덮인 세포에 관한 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타낸다. 통계적 유의성: 스튜던트 t 테스트, *는 p < 0.05, **는 p < 0.01, ns는 유의하지 않음을 나타냄;
- 도 24는 PLA-IOC 필름(2% PLA, 0.1% IONPs)으로 덮인 소 각막의 레이저 유도 세포 사멸을 보여준다. 각막을 절제하고 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)으로 염색했다. 적출된 소 눈의 각막 전체를 1.6 J/cm2의 레이저 펄스로 4회 조사했다;
- 도 25는 대조 실험(IOC가 없는 PLA 필름)과 비교하여 PLA-IOC 필름을 사용하여 도 24에 나타낸 레이저 유도 세포 사멸로 인해 발생하는 염색된 세포(사멸 세포)의 수를 보여준다;
- 도 26은 PLA-IOC 필름(2% PLA, 0.1% IONPs)으로 덮인 소 각막에서 레이저 유도된 세포 사멸을 보여준다. 각막을 절제하고 FD500 용액에 담갔다. IOC 필름(2% PLA, 0.1% IONPs). 적출된 소 눈의 각막 전체를 1.6 J/cm2의 레이저 펄스로 4회 조명했다;
- 도 27은 대조 실험(IOC가 없는 PLA 필름)과 비교하여 PLA-IOC 필름을 사용하여 도 26에 도시된 레이저 유도 세포 사멸로부터 발생하는 FD500의 흡수를 보여준다;
- 도 28은 칼세인으로 염색된 소 눈의 각막 상피를 분리하여 PLA-IOC 필름 위에 놓은 후 단일 세포를 1.6 J/cm² 및 4.5 J/cm²의 플루엔스로 4회 조명한 모습을 보여준다.
- 도 1a는 본 발명에 따라 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하는 구조체의 개략도를 보여준다;
- 도 1b는 도 1a에 나타낸 구조체의 단면을 보여주며 세포는 구조체로부터 거리(d)를 두고 위치한다;
- 도 2 및 도 3은 본 발명에 따라 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하는 방법을 개략적으로 도시하며, 이에 따라 세포는 도 2에 도시된 바와 같이 필름('필름 상단의 세포')에서 성장하고 필름이 도 3에 나타낸 것과 같이 세포층('세포 상단의 필름')에 적용된다;
- 도 4는 입자를 포함하는 구조체가 펄스 레이저로 조사되기 전에 소 눈의 각막에 적용되는 방법을 도시한다;
- 도 5는 IONP 농도에 따른 PLA 필름 내 입자 클러스터의 평균 크기를 보여준다;
- 도 6은 IONP 농도에 따른 함수로 PLA 필름의 클러스터 밀도(입자 클러스터 수/100μm²)를 보여준다;
- 도 7은 각각 0.3 J/cm² 및 1.6 J/cm²의 단일 레이저 펄스로 PLA-IOC 필름(0.1% IONs, 2%PA)을 조사하기 전과 후에 암시야 현미경으로 얻은 이미지를 보여준다;
- 도 8은 서로 다른 농도의 IONP를 갖는 PLA-IOC 필름에서 성장한 Hela 세포당 클러스터 수를 보여준다;
- 도 9는 0.1% IONP가 포함된 PLA 필름에서 성장한 Hela 세포의 FD500 흡수, 세포 생존율 및 rMFI(상대 평균 형광 강도)를 보여준다;
- 도 10은 0.3 J/cm²의 단일 레이저 펄스로 조사된 0.1% IONP를 사용하여 PLA 필름에서 성장한 FD500의 흡수를 보여주는 공초점 현미경으로 얻은 이미지를 보여준다;
- 도 11은 단일 조사 후 레이저 플루엔스의 함수로서 PLA-IOC 필름(0.1% IONP 없이 또는 0.1% IONP 포함)에서 성장한 Hela 세포의 세포 생존율을 보여준다;
- 도 12는 0.3 J/cm²의 레이저 펄스를 1회 또는 2회 조사한 PLA-IOC 필름(0.1% IONP)에서 성장한 Hela 세포의 세포 생존율을 보여준다;
- 도 13은 서로 다른 레이저 플루엔스(스케일 바는 1000μm)에서 단일 펄스로 조사된 PLA-IOC 필름(2% PLA, 0.1% IONPs)의 사전 정의된 영역(직경 6.5mm의 원)의 선택적 방사선을 보여준다;
- 도 14는 도 13에 나타낸 대로 선택적 방사선 조사 후 회수된 세포의 비율을 다양한 레이저 플루엔스의 함수로 보여준다;
- 도 15는 다양한 레이저 플루엔스의 함수로 도 13에 나타낸 대로 선택적 방사선 조사 후 사멸 세포(프로피디움 아이오다이드(PI)으로 염색)에 대한 생존 세포(칼세인 AM으로 염색)의 비율을 보여준다;
- 도 16은 PLA-IOC 필름(2% PLA, 0.1% IONPs)의 국소 조사 시 선택적 세포 사멸을 보여준다(스케일 바는 10μm);
- 도 17은 단일 레이저 펄스(0.3-1.3 J/cm²)를 조사한 PLA-IOC 필름(2% PLA, 0.1% IONPs)에서 성장한 세포의 단일 세포 절제 성공률을 보여준다. 레이저 플루엔스의 각 값에 대해, 30번의 단일 세포 절제 실험이 수행되었다(n = 30);
- 도 18은 PLA-IOC 필름(2% PLA, 0.1% IONPs)으로 덮인 Hela 세포의 공간 선택적 레이저 유도 사멸을 보여준다;
- 도 19는 도 18과 같이 PLA-IOC(2% PLA, 0.1% IONPs)로 덮인 Hela 세포를 미리 정의된 패턴(Ghent University 로고)에 따라 펄스 레이저로 조명하고 Calcein AM, PI로 염색하고, 병합된 사진의 결과이다. 스케일 바는 1000μm이다;
- 도 20과 도 21은 각각 도 18에 나타낸 바와 같이 1.6 J/cm²의 레이저 플루엔스를 이용하여 연속적인 수의 레이저 펄스를 조사한 후, 처치된 영역에서 생존 세포 대 사멸 세포의 비율과 세포의 총량을 보여준다;
- 도 22는 PLA-IOC 필름이 세포의 상부에 위치하는 경우(도 18에 도시된 바와 같이) 세포 사멸 동안의 기공 형성(왼쪽)과, 조사(1.6 J/cm²; 4회 연속) 후 Hela 세포에 의한 FD500의 흡수 결과(오른쪽)를 개략적으로 나타낸 것이다;
- 도 23은 PLA-IOC 필름에 4회 연속 조사(1.6 J/cm²)한 후 Hela 세포에 대한 ICP-MS 분석(철 함량)을 보여준다; '세포'는 처치되지 않은 세포를 의미한다. 'IONP' 및 'IONP + 레이저'는 각각 레이저 치료가 있거나 없는 유리 IONP(1g/L)가 있는 세포를 나타낸다; 'PLA-IOC' 및 'PLA-IOC + 레이저'는, 각각 레이저 처치가 없는 경우와 레이저 처치가 있는 경우, PLA-IOC 필름으로 덮인 세포에 관한 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타낸다. 통계적 유의성: 스튜던트 t 테스트, *는 p < 0.05, **는 p < 0.01, ns는 유의하지 않음을 나타냄;
- 도 24는 PLA-IOC 필름(2% PLA, 0.1% IONPs)으로 덮인 소 각막의 레이저 유도 세포 사멸을 보여준다. 각막을 절제하고 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)으로 염색했다. 적출된 소 눈의 각막 전체를 1.6 J/cm2의 레이저 펄스로 4회 조사했다;
- 도 25는 대조 실험(IOC가 없는 PLA 필름)과 비교하여 PLA-IOC 필름을 사용하여 도 24에 나타낸 레이저 유도 세포 사멸로 인해 발생하는 염색된 세포(사멸 세포)의 수를 보여준다;
- 도 26은 PLA-IOC 필름(2% PLA, 0.1% IONPs)으로 덮인 소 각막에서 레이저 유도된 세포 사멸을 보여준다. 각막을 절제하고 FD500 용액에 담갔다. IOC 필름(2% PLA, 0.1% IONPs). 적출된 소 눈의 각막 전체를 1.6 J/cm2의 레이저 펄스로 4회 조명했다;
- 도 27은 대조 실험(IOC가 없는 PLA 필름)과 비교하여 PLA-IOC 필름을 사용하여 도 26에 도시된 레이저 유도 세포 사멸로부터 발생하는 FD500의 흡수를 보여준다;
- 도 28은 칼세인으로 염색된 소 눈의 각막 상피를 분리하여 PLA-IOC 필름 위에 놓은 후 단일 세포를 1.6 J/cm² 및 4.5 J/cm²의 플루엔스로 4회 조명한 모습을 보여준다.
실시형태의 설명
본 발명은 특정 실시형태 및 특정 도면을 참조하여 설명될 것이지만, 본 발명은 이에 제한되지 않고 청구범위에 의해서만 제한된다. 도면은 개략적일 뿐이고 제한적이지 않다. 도면의 일부 요소의 크기는 설명의 목적으로 과장되었을 수 있으며 실제 비율로 그려지지 않았다. 치수 및 상대적 치수는 본 발명의 실시에 대한 실제 축척에 해당하지 않는다.
범위의 끝점을 참조할 때, 범위의 끝점 값이 포함된다.
본 발명을 설명할 때, 사용된 용어는 달리 표시되지 않는 한 다음 정의에 따라 해석된다.
설명 및 청구범위에 사용된 '첫 번째(first)', '두 번째(second)' 등의 용어는 유사한 요소를 구별하기 위해 사용되며 시간적으로, 공간적으로, 순위로 또는 임의의 다른 방식으로 시퀀스를 반드시 설명하는 것은 아니다. 이렇게 사용된 용어는 적절한 상황 하에서 상호 교환 가능하며, 본 명세서에 기술된 본 발명의 실시형태는 본 명세서에 기술되거나 예시된 것과 다른 순서로 동작할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
2개 이상의 항목을 나열할 때 '및/또는(and/or)'이라는 용어는 나열된 항목 중 어느 하나가 그 자체로 사용될 수 있거나 나열된 항목 중 2개 이상의 임의의 조합이 사용될 수 있음을 의미한다.
'면적(area)'이라는 용어는 평면의 평평한 표면 크기, 즉 2차원 물체의 크기에 대한 측정치를 의미한다.
'표면적(surface area)'이라는 용어는 3차원 형상 물체의 표면 크기에 대한 측정치를 의미한다.
'세포(cell)'라는 용어는 진핵 세포, 원핵 세포를 포함한 모든 유형의 생물학적 세포를 지칭한다. 세포는 인간 세포, 동물 세포 및 식물 세포를 지칭할 수 있다.
'단편화하다(fragmentize)'라는 용어는 무언가를 조각으로 부수거나 자르거나 분리하는 모든 방식을 지칭한다. 세포 조각화란 세포를 조각으로 부수거나 자르거나 다른 방법으로 분리하는 모든 방법을 말하며 세포 사멸 및 세포 절제를 포함한다.
용어 '투과성을 증가시키다(increase the permeability of)', '투과성화하다(permeabilize)', '투과성화하는(permeabilizing)' 및 '투과성화(permeabilization)'는 세포의 투과성, 특히 세포막 또는 세포 장벽, 적어도 부분적으로 또는 국부적으로 예를 들어, 세포의 원형질막의 투과성을 변경하는 임의의 방식을 의미한다. 투과성화 후, 막 또는 장벽, 예를 들어 세포의 원형질막은 예를 들어 분자, 거대분자, 입자 또는 나노입자와 같은 하나 이상의 유형의 화합물에 대해 더 투과성이 높아지는 방식으로 변경된다.
용어 '천공하다(perforate)', '천공하는(perforating)' 또는 '천공(perforation)'은 하나 이상의 개구, 구멍 또는 기공을 갖는 막 또는 장벽, 예를 들어 세포의 원형질막을 제공하는 임의의 방식을 의미한다. 예를 들어 세포의 원형질막과 같은 막 또는 장벽을 천공하면 세포의 원형질막과 같은 막 또는 장벽에 구멍이 생성되어 분자, 거대분자, 입자 또는 나노입자와 같은 화합물이, 막 또는 장벽을 거쳐, 예를 들어 세포의 원형질막을 거쳐 이동할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 '투과성을 증가시키다', '투과성화하다', '투과성화하는' 및 '투과성화' 및 용어 '천공하다', '천공하는' 및 '천공'은 상호교환적으로 사용된다. 유사하게, '개구(opening)', '구멍(hole)' 및 '기공(pore)'이라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
'증기 버블의 생성(generation of a vapour bubble)'이라는 용어는 증기 버블의 팽창, 증기 버블의 붕괴, 또는 증기 버블의 팽창과 붕괴의 조합, 그리고 압력파 및 주변 매체의 흐름과 같은, 기포 팽창과 붕괴의 결과일 수 있는 2차 효과를 포함한다.
용어 '증기 버블(vapour bubble)' 또는 '버블(bubble)'은 증기 나노버블 및 증기 마이크로버블을 의미한다. 바람직하게는, '증기 버블' 또는 '버블'이라는 용어는 10 nm 내지 100 μm 범위의 직경을 갖는 증기 버블을 의미한다. 증기 버블는 수증기 버블을 포함하지만, 실시형태는 이에 제한되지 않는다.
실험 결과
실시예 1
고분자 재료(11)와 전자기 복사를 흡수할 수 있는 입자(12)를 포함하는 필름을 포함하는 본 발명에 따른 구조체(10)의 실시예가 도 1a에 도시되어 있다. 입자의 일부는 한 표면, 예를 들어 구조체의 상부 표면(13)에 부분적으로 노출된다. 입자는 모든 입자의 입자 없는 표면적(AP)의 합이 자유 표면적(AS)의 0.0001 내지 50%, 더 바람직하게는 자유 표면적(As)의 5 내지 25% 또는 15 내지 25% 사이가 되도록 매립된다. 보다 구체적으로, 입자는 모든 입자의 입자 없는 표면적(AP)의 합이 자유 표면적(AS1)의 0.0001 내지 50%, 더욱 바람직하게는 자유 표면적(AS1)의 5 내지 25% 또는 자유 표면적(AS1)의 15 내지 25%가 되도록 매립된다.
도 1b는 구조체(10)로부터 짧은 거리(d)에 세포(15) 또는 복수의 세포(15)가 있는 도 1a의 구조체를 도시한다.
아래에 설명된 예는 구조체의 재료로서 폴리락트산(PLA)을 포함하고 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자로서 산화철 입자를 포함한다.
다른 재료 및 다른 입자도 또한 고려될 수 있다는 것이 분명하다. 이러한 구조체의 표면에서 생성된 증기 버블가 세포 또는 복수의 세포(도 1b)로부터 접촉 또는 짧은 거리(d)에서 세포를 투과성화 및/또는 단편화할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 두 가지 유형의 실험을 수행했다:
- 세포를 구조체의 상부에서 성장시켰고 구조체(더 구체적으로 구조체의 입자)를 전자기 방사선('구조체의 상부에 있는 세포')으로 조사한다(도 2);
- 구조체를 세포 층에 적용하고 구조체(더 구체적으로 구조체의 입자)에 (펄스형) 전자기 방사선을 방사한다('세포 상부의 구조체')(도 3).
또한, 입자를 포함하는 구조체를 소 눈의 각막에 적용하고 펄스 레이저로 조사했다(도 4).
1. 재료 및 방법
1.1 재료
크기가 50-100 nm인 산화철(Fe3O4) 나노입자(IONP), 분자량(Mw)이 80 kDa인 폴리락트산(PLA), 500 kDa의 FITC-덱스트란 및 클로로포름은 모두 Sigma-Aldrich (벨기에)에서 구입했다. 칼세인(Calcein) AM과 프로피디움 아이오다이드(PI)는 Fisher Scientific(미국)에서 구입했다. CellTiter-Glo®는 Promega(미국)에서 구입했다.
1.2 PLA-IOC(산화철 클러스터) 필름의 제조
IONP가 있거나 없는 PLA 필름을 1단계 스핀 코팅 방법으로 제조했다. 필름을 스핀 코팅 장치의 중앙에 위치한 정사각형 커버 유리(22mm x 22mm) 위에서 제조했다. 간단히 말하면, IONP를 PLA 용액(클로로포름의 2%, 4% 및 8%(w/v))에 분산시켰다; PLA 용액의 IONP 농도는 0.01%, 0.1%, 0.2%(w/v) 사이에서 다양했다. IONPs-PLA 분산액은 먼저 팁 초음파 처치기(Branson digital sonifier, Danbury, USA)를 사용하여 10% 진폭으로 1분간 초음파 처치했다. 다음으로, 스핀 코팅 장치의 중앙에 위치한 커버 유리 위에 분산액 0.5 mL를 도포했다. 스핀 코팅 속도와 시간은 각각 2000rpm과 20초로 설정했다. 스핀 코팅 후, 필름을 밤새 50℃ 오븐에 넣어 잔류 유기 용매를 증발시켰다.
형광 PLA-IOC 필름을 제조하기 위해, PLA(2%, w/v) 및 로다민 B(0.01% w/v)(벨기에 소재 Sigma-Aldrich)를 클로로포름에 밤새 용해시켰다. 그런 다음, 산화철 나노입자(0.1% w/v)를 PLA-Rhodamine B 용액에 첨가했다. 다음 PLA-Rhodamine B 필름을 위 단락에 설명된 대로 제조했다.
1.3 PLA-IOC 필름의 표면 형태
PLA-IOC 필름의 표면 형태를 주사 전자 현미경(SEM, FEI Quanta 200F(Thermo Scientific))으로 특성화했다. SEM 이미지를 20 kV의 가속 전압으로 획득했다. IONP의 농도에 따라 다양한 크기의 산화철 클러스터(IOC)가 관찰될 수 있다는 점에 유의해야 한다.
산화철 입자가 산화철 입자(IOC)의 클러스터로 배열되기 때문에 필름은 PLA-IOC 필름(PLA-IONP 필름 대신)으로 지칭된다. IOC의 크기와 분포는 SEM 이미지를 기반으로 계산했다.
1.4 레이저 유도 증기 버블(VNB) 형성 및 VNB 임계값
PLA-IOC 필름이 VNB를 생성하는 능력을 갖는지 평가하기 위해, 이들 필름을 펄스 레이저(HE 355 LD 레이저, OPOTEK Inc.; 7ns, 561nm)를 조사했다. VNB는 이들의 수명기간 동안 빛을 산란시키기 때문에 암시야 현미경으로 쉽게 시각화할 수 있다. 다양한 플루엔스의 레이저 펄스를 필름에 조사하기 전과 조사하는 동안 필름(얇은 물 층으로 덮여 있음)의 암시야 이미지를 기록했다. IOC의 90%가 VNB를 형성하는 단일 레이저 펄스의 플루엔스인 'VNB 임계값'은 레이저 플루엔스의 함수로 기포 수를 작도하여 결정했다.
1.5 세포 배양
Hela 세포(ATCC® CCL-2TM)를 10% 태아 소 혈청(FBS, Biowest), 2mM 글루타민 및 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신(Gibco-Invitrogen))이 보충된 DMEM/F-12(Gibco-Invitrogen)에서 배양했다(37℃ 및 5% CO2). 분할을 위해 먼저 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 세포를 세척한 후 트립신-EDTA 용액(Gibco-Invitrogen)을 사용하여 분리했다.
'상부 세포(cells on top)' 실험(도 2)의 경우, Hela 세포를 6웰 플레이트의 웰 바닥에 존재하는 PLA-IOC 필름의 상단에 파종했다; Hela 세포 농도는 1x106개 세포/mL였으며; 각 웰에 2mL의 세포를 적용했다. 인큐베이션 1일 후, 세포가 부착된 PLA-IOC 필름을 초기 웰에서 제거하고 새로운 웰(6웰 플레이트)에 배치했고; 이는 필름과 접촉하지 않고 웰의 플라스틱 바닥에 붙어 있는 세포를 제거하기 위해서였다.
PLA-IOC 필름을 세포의 상단에 배치한 실험('세포 상단의 구조체')(도 3)에서 Hela 세포를 6웰 플레이트의 웰에 0.5x106개 세포/mL(2mL)다음 농도로 파종했다. 다음날, 웰의 Hela 세포를 PLA-IOC 필름으로 덮었다. 세포와 필름 사이의 접촉을 최대화하기 위해 필름을 적용하기 전에 세포 배지의 90%를 제거하여 세포 위에 작은 층의 배지만 남도록 했다.
1.6 펄스 레이저 광에 노출된 PLA-IOC 필름에 의한 세포 사멸
전술한 바와 같이 세포를 PLA-IOC 필름에 파종하거나 세포를 PLA-IOC 필름으로 덮었다.
그런 다음 PLA-IOC 필름을 나노초 펄스 레이저(펄스 지속 시간 <7ns, 532nm 파장)로 조사했다. 갈바노 스캐너를 사용하여 레이저 빔을 빠르게 스캐닝하여 각 위치가 기본적으로 단일 레이저 펄스(또는 이웃 지점 사이의 중첩 영역에 두 개)를 받도록 했다; 6웰 플레이트의 웰에서 PLA-IOC 필름의 전체 표면을 단일 스캐닝하는 데 약 2분이 걸렸다. 어떤 경우에는 텍스트에 나타낸 대로 필름을 여러 번 스캔했다.
광 펄스에 노출된 PLA-IOC 필름에 의한 세포 사멸 정도는 CellTiter-Glo® 분석을 사용하여 세포의 대사 활성을 측정함으로써 평가되었다. 약간의 수정이 있기는 하지만 제조업체가 권장하는 대로 분석을 수행했다.
간단히 말해서, 광 펄스를 사용하여 PLA-IOC 필름의 세포를 처치한 후, 세포를 세포 인큐베이터에 2시간 동안 두어 사멸되도록 하는 데 충분한 시간을 허용했다. 2시간 후, 세포 배지를 제거하고 1 mL의 CellTiter-Glo 용액이 보충된 1 mL의 새로운 세포 배지(DMEM/F-12)로 교체했다. 이어서, 웰 플레이트를 실온에서 10분 동안 120rpm의 진탕기에 두었다. 마지막으로 상청액 150 μL를 96-웰 플레이트의 웰로 옮기고 마이크로플레이트 리더(Victor 3, PerkinElmer)를 사용하여 흡광도를 측정했다.
1.7 세포막의 투과성 측정
PLA-IOC 필름에 레이저 펄스를 적용하면 세포막이 어느 정도 투과성으로 변하는지 평가하기 위해, 상술한 대로 세포를 PLA-IOC 필름에 시딩하거나 세포를 PLA-IOC 필름으로 덮었다. 세포를 필름에서 성장시키는 경우에는 FITC-dextran(분자량 500 kDa; FD500)을 2 mg/mL 농도로 함유하는 DMEM/F-12 세포 배양 배지 1 mL를 첨가했다. 세포 위에 필름을 적용한 경우, 필름을 적용하기 전에 FD500(2mg/ml)을 함유한 DMEM/F-12 세포 배양 배지 300μl를 세포에 첨가했다. (전체 표면) 필름을 레이저 빔(상술한 바와 같이, 0.3 J/cm² 또는 1.6 J/cm²의 플루엔스)으로 스캔하고 세포를 DPBS로 여러 번 광범위하게 세척하여 과량의 FD500을 제거했다. 그런 다음 세포를 트립신 처치하고(0.25% 트립신 용액 사용) 세포 배지로 중화했다.
세포 현탁액을 수집하고 여러 번(500g, 5분) 원심분리하여 세척했다. 마지막으로, 펠릿을 유동 완충액(DPBS, 1% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.1% NaN3)에 재현탁시켰다. 막 투과성화 후에만 발생하는, FD500의 세포질 전달은 유세포 분석기(Cytoflex, Beckman Coulter, Krefeld, Germany)로 측정했고; 형광 염료는 488 nm에서 여기되었고 형광 강도를 530 nm에서 검출했다(대역통과 필터 530/30).
1.8 펄스 레이저 광에 노출된 PLA-IOC 필름에 의한 공간적 선택적 세포 사멸
첫 번째 실험 세트에서, Hela 세포를 PLA-IOC 필름(0.1% IONP) 상단의 6웰 플레이트에 시딩했다. 플루엔스를 증가시키면서, 레이저 펄스를 미리 정의된 구역의 필름에 적용했다. 레이저 조사 후, PLA-IOC 필름 위의 세포를 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에 2시간 동안 두었다.
그런 다음 1μl의 칼세인 AM(0.5mmol)과 10μl의 프로피디움 아이오다이드(1mg/ml)을 각 웰에 첨가했다. 칼세인 AM은 생존 세포를 염색하는 데 사용되었고 프로피디움 아이오다이드은 사렬 세포를 염색하는 데 사용되었다. 10분간 인큐베이션한 후, 세포를 공초점 현미경(C1-si, Nikon, Japan)으로 이미지화했다. 처치된 구역에서의 세포 사멸 정도를 평가했다.
두 번째 실험 세트에서, PLA-IOC 필름(IONP가 없거나 0.1% 포함)을 상술한 대로 시딩된 Hela 세포 위에 적용했다. 1.6 J/cm²의 4회 연속 레이저 조사를 미리 정의된 패턴(겐트 대학교 로고와 유사)에 따라 수행했다. 레이저 스캐닝 후, 2 mL DMEM/F-12를 웰에 첨가하고 필름을 세포에서 조심스럽게 제거했다. 30분 후, 2μl 칼세인 AM(0.5mmol)과 프로피듐 요오다이드(1mg/ml) 20μl를 첨가하여 생존 세포와 사멸를 모두 염색했다.
1.9 펄스 레이저 광에 노출된 PLA-IOC 필름에 의한 단일 세포 사멸
펄스 레이저 광을 사용한 PLA-IOC 필름의 조사가 선택된 표적 세포의 특이적 사멸('단일 세포 사멸')을 허용하는 정도를 평가하기 위해, 상술한 대로 세포를 PLA-IOC 필름의 상단에 파종했다. 먼저, (생존) 세포를 각 웰에 2 μl의 칼세인 AM(0.5 mmol)을 첨가하여 염색했다. 그런 다음 단일 세포를 무작위로 표적으로 선택하고 형광 현미경으로 이미지화했다. 이어서 하나의 레이저 펄스(변화하는 플루엔스)를 표적 세포에 적용했다. 30분 후, 10 μL 프로피디움 아이오다이드(1 mg/ml)을 각 웰에 첨가하고 세포를 형광 현미경으로 다시 이미지화했다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 세포의 적색 및 녹색 형광을 분석했다. 웰의 세포도 투과 현미경으로 이미지화했다; 이 이미지를(movies)를 기록하고 ImageJ 소프트웨어로 처리했다.
1.10 유도 결합 플라즈마 질량 분석기(ICP-MS) 측정
Hela 세포를 상술한 바와 같이 같이 6-웰 플레이트에 파종했다. 레이저 처치가 없는 경우, 세포 배양 배지(1.5ml), 유리 IONP 현탁액(1.5ml, 1g/l) 또는 PLA-IOC 필름(필름과 세포 사이에 매우 얇은 층의 배지가 유지됨)을 웰의 세포에/상에 첨가/적용했다. 20분 동안 인큐베이션한 후(37℃, 5% CO2), 세포 배지/유리 IONP(또는) 웰의 필름을 제거했다. 그런 다음 질산(65%) 1.5mL를 각 웰에 세포가 소화되도록 10분 동안 첨가했다. 10분 후, ICP-MS 분석을 위해 각 웰에서 1mL를 수집했다.
레이저 처치 효과를 측정하기 위해, 세포 배지/유리 IONP/PLA-IOC 필름(위 단락 참조)을 적용한 20분 후, 각 웰을 4회(1.6 J/cm²) 스캔했다. 레이저 처치 후 필름을 제거하고 웰을 새로운 세포 배양 배지로 두 번 부드럽게 세척했다. 이어서, 질산(65%) 1.5mL를 각 웰에 10분간 첨가했다. 세포의 소화 후, ICP-MS 분석을 위해 각 웰에서 1mL의 용액을 수집했다.
철(Fe)의 (초)미량 원소 측정을 Agilent 8800 ICP-MS/MS 기기(ICP-QQQ, Agilent Technologies, Japan)를 사용하여 수행했다. 시료 도입 시스템은 펠티에 냉각(℃) Scott 유형 스프레이 챔버에 장착된 동심 분무기(400 μL min-1)로 구성된다. 이 장비에는 두 개의 사중극자 유닛(Q1 및 Q2)와 두 사중극자 질량 필터(Q1-CRC-Q2) 사이에 위치한 충돌/반응 셀(CRC)로 구성된 직렬 질량 분석기 구성이 장착되어 있다.
세포-내 화학(화학적 분해능)을 훨씬 효과적으로 제어할 수 있는 결과로, MS/MS 모드는 기존 단일-사중극자 ICP-MS 기기에 비해 더 간단한 방법으로 스펙트럼 중첩을 처리할 수 있는 추가 수단을 제공한다. 이 연구에서는, CRC를 NH3/He(He의 10% NH3) 혼합물을 사용하여 가압하여 40ArO+와 40CaO+ 다원자 간섭 신호 및 질량 대 전하 - m/z - 56에서 가장 풍부한 Fe 동위원소(56Fe+, 91.7%) 신호 사이의 중첩과 같이, Fe의 (초)미량 원소 결정을 심각하게 방해하는 스펙트럼 간섭을 극복했다. 스펙트럼 중복을 극복하기 위해, 3.0 mL min-1의 NH3/He 도입 시 56Fe+ 이온이 56Fe(NH3)2+ 반응 생성물 이온으로 질량 이동되었다. 질량 이동 후 56Fe+는 새로 생성된 반응 생성물 이온(56Fe(NH3)2+, m/z = 90)의 m/z 비율에서 스펙트럼 간섭 없이 검출될 수 있다.
ICP-MS/MS 분석에는 고순도 시약만 사용했다. 초순수(비저항 18.2 MΩ cm)는 Milli-Q Element 정수 시스템(Millipore, France)에서 얻었다. 샘플 분해를 위해 끓는점 증류(sub-boiling distillation)로 추가 정제된 분석 전 순도 수준 14M HNO3(벨기에 Chem-Lab)과 과순도 9.8M H2O2(벨기에 Sigma Aldrich)를 사용했다. Fe 및 Ga의 L-1 단일 원소 표준 용액 1g(Inorganic Ventures, USA)의 적절한 희석액을 방법 개발, 최적화 및 보정 목적으로 사용했다. Fe의 정량적 원소 결정을 위해, 외부 보정은 보정 접근법(0, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10 및 20 μg L-1 Fe)에 따랐다. 5.0μg L-1의 Ga를 기기 불안정성, 신호 드리프트 및 매트릭스 효과를 보정하기 위한 내부 표준으로 사용했다.
ICP-MS/MS 분석을 위한 샘플 준비 전에, 모든 샘플을 Eppendorf 튜브에서 Teflon Savillex 비이커로 옮겼고, 이 비이커는 HNO3 및 HCl로 미리 세척한 후 Milli-Q 물로 헹구었다. 건조될 때까지(80℃) 증발시킨 후, 샘플을 핫 플레이트에서 약 18시간 동안 110℃에서 750 μL의 14 M HNO3와 250 μL의 9.8 M H2O2의 혼합물을 사용하여 산 분해를 통해 분해했다. ICP-MS/MS 분석에 앞서, 분해된 샘플을 Milli-Q 물 또는 HNO3(최종 산 농도 0.35 내지 0.70M HNO3)에 적절하게 희석했다. 오염을 방지하기 위해, 표준품 및 샘플 준비에는 금속이 없는 튜브만 사용했다(15 또는 50mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브, VWR, 벨기에). 분해 및 적절한 희석을 포함한, 전체 샘플 준비 절차를 클래스 10 클린룸에서 수행했다.
1.11 펄스 레이저 광에 노출된 PLA-IOC 필름에 의한 표면 각막 세포 사멸
신선한 절제된 소 눈을 지역 도축장(Flanders Meat Group, Zele)에서 수집했다. 적출 후, 눈을 이동 중에 차가운 CO2 독립 배지(Gibco-Invitrogen)에 보관하고 1시간 이내에 처치했다. 여분의 조직을 제거하고 눈을 차가운 DMEM으로 세척했다. 0.1% IONP(w/v)가 없거나 포함된 PLA 필름(2% PLA)을 사용했다. PLA-IOC 필름을 30mm 마이크로웰(Cellvis, USA)이 있는 55mm 유리 바닥 접시에 넣고 3mL 세포 배양 배지로 채웠다. 그 후, 눈을 접시에 옮기고 파라필름으로 고정하여 각막이 PLA-IOC 필름과 밀착되었는지 확인했다. 레이저 펄스를 적용하면 각막 세포막이 투과되는지 확인하기 위해 세포 배양 배지에 FD500(4mg/mL)을 보충했다.
전체 각막을 1.6 J/㎠ 플루엔스의 펄스 레이저로 반복적으로(4회) 스캔했다. 조사 후 DPBS로 눈을 3회 세척했다. 사멸 효율을 평가하기 위해, 요오드화 프로피듐(0.01 mg/ml)을 함유한 신선한 DMEM/F-12 배지가 보충된 새 접시에 눈을 놓고 실온에서 15분 동안 인큐베이션했다.
마지막으로, 트레핀 블레이드(Beaver Visitec International, Abingdon, UK)를 사용하여 12 mm 버튼을 각막에 펀칭했다. 이렇게 분리된 각막 조직을 상피쪽이 아래로 향하도록 유리 바닥 접시에 놓고 공초점 현미경(Nikon A1R)으로 이미지했다. 1μm 간격의 Z-스택을 기록하고 이용가능한 소프트웨어를 사용하여 3D 이미지를 얻었다.
공간적 선택적 세포 사멸 실험을 위해, 신선한 소 눈의 과량의 조직을 제거하고 눈을 DPBS로 세척했다. 칼세인 AM 용액(5μg/ml)을 각막 수준에 적용하여 살아있는 상피 세포를 염색하고 눈을 실온에서 10분 동안 인큐베이션했다.
그런 다음 눈을 DPBS로 3회 세척하고 트레핀 블레이드를 사용하여 각막을 분리했다. 그런 다음 각막을 PLA-IOC 필름 상단에 놓았다. 상피 세포는 형광 현미경으로 관찰할 수 있으며 단일 세포는 레이저(561 nm; < 7ns)로 조사되기 전에 표적화되었다.
2. 결과
2.1 PLA-IOC 필름의 물리화학적 특성 분석
세포 배양물(또는 조직)에서 각각의 단일 세포를 표적화할 수 있기 위해서는, 이상적으로는 각각의 단일 세포가 적어도 하나의 IOC와 접촉/근접해야 한다. 따라서 PLA 필름에서 IOC의 잘 제어된 분포가 요구된다. PLA 필름의 SEM 이미징을 통해 IONP가 필름 내에 클러스터(IOC)로 매립되어 있음이 나타났으며; 일부 IOC는 필름 밖으로 부분적으로 돌출되어 있었다. 필름 내 IOC의 평균 크기와 분포는 IONP 농도에 따라 달라진다. 실제로, IONP의 농도가 높을수록(PLA의 고정 농도에 대해) 더 큰 클러스터가 생성되었다(도 5). 클러스터 밀도는 0.1% IONP 농도에서 5.6 ± 2.4 IOC/100 μm²와 같았지만, 더 높은 IONP 농도에서는 더 낮았으며(도 6), 이는 더 큰 클러스터의 형성으로 설명될 수 있다.
2.2 PLA-IOC 필름에 의한 레이저 유도 증기 버블 형성
PLA-IOC 필름에 펄스 레이저 광을 적용하면 필름 표면에 증기 버블(VNB)가 형성되는지 여부를 평가하기 위해, PLA-IOC 필름에 각각 0.3 J/cm² 및 1.6J/cm²의 단일 레이저 펄스를 조사했다. 이러한 레이저 펄스를 사용하여 PLA-IOC 필름(0.1% 이온, 2%PA)을 조사하면 VNB가 발생했으며, 이는 (산란된) 빛의 국부적인 플래시가 암시야 현미경으로 감지되었기 때문이다(도 7). IOC가 없는 PLA 필름에서는 VNB를 관찰할 수 없었다. 낮은 플루엔스에서는 VNB의 수가 높은 플루엔스에 비해 확실히 낮았다.
이어서, 레이저 펄스의 플루엔스의 함수로서 VNB의 수를 측정하고 일반적으로 IOC의 90%(T90)가 VNB를 형성하는 레이저 플루엔스로 정의되는, PLA-IOC 필름의 VNB 임계값(0.1% IONP; 2% PLA)은 0.56 J/cm²인 것으로 결정되었다. IOC의 10%가 VNB의 형성을 초래하는 레이저 플루엔스에 해당하는 T10은 0.1 J/cm²인 것으로 결정되었다. T10보다 낮은 플루엔스의 경우 열 발생이 우세하고(가열 모드); T10과 T90 사이에서는 제한된 열과 기포가 모두 생성되며; T90보다 높은 플루엔스의 경우 VNB 형성이 주된 광열 효과이다(버블 모드).
다음 실험을 위해 0.01% IONP를 함유한 PLA 필름을 선택했다. 또한 이러한 PLA-IOC 필름은 IOC가 없는 PLA 필름만큼 투명하다는 점도 매력적이다.
2.3 펄스 레이저 광에 노출된 PLA-IOC 필름에 의한 세포 사멸
이어서, 필름의 표면('위의 세포')에서 성장한 Hela 세포를 사멸시키는 PLA-IOC 필름의 능력(도 2)을 평가했다. 필름 내 IOC는 빛을 강하게 산란시켜 쉽게 관찰할 수 있다(산화철의 굴절률은 2.9). PLA-IOC 필름에서 성장한 세포의 이미지를 기반으로, 필름의 IONP 농도가 0.1%일 때 각 세포가 4.6 +/- 0.5 IOC(도 8)와 접촉했고; 더 낮은(0.01%) 농도의 IONP에서 각 세포는 1.2 +/- 0.4 IOC와 접촉한 것으로 추정했다.
도 9는 필름을 낮은 플루엔스(단일 스캔, 0.3 J/cm²)에서 레이저로 스캔할 때 0.01% IONP가 있는 PLA-IOC 필름에서 성장한 (대부분의) 세포가 생존함을 보여준다(유세포 분석법으로 측정, 칼세인 AM 염색). PLA 필름(0.1%)에서 더 많은 양의 IONP를 사용하고 동일한 플루엔스에서 상당한 수의 세포가 사멸되었다(세포 생존율 52.8 ± 12.6%). 또한 IONP 없이 PLA 필름에서 성장한 모든 세포는 레이저 처치에서도 생존했음에 주목할 필요가 있다. 레이저 조사(세포 사멸을 유발할 수 있음) 후 세포막 투과성의 변화를 시각화하기 위해 형광 덱스트란(FD500)을 세포에 첨가했다. FD500은 크기가 크기 때문에(약 30nm) 세포막 위로 확산되지 않으므로 원형질막의 중요한 투과성 변화를 평가하는 데 매우 적합한 것으로 보고되었다. 도 9와 도 10에서 볼 수 있듯이 FD500은 레이저 펄스를 PLA-IOC 필름에 조사한 후 Hela 세포내로 들어갔고; IONP가 없는 PLA 필름의 경우 FD500이 세포에 들어가지 않았음에 주목할 필요가 있다.
이어서, 각각 더 높은 레이저 플루엔스 및 필름의 반복된 레이저 스캐닝을 사용하여 세포 사멸이 어떻게 최대화될 수 있는지 평가했다. 도 11에서 볼 수 있듯이, 레이저 플루엔스를 증가시키면 PLA-IOC 필름의 세포 살상 능력이 개선되었고; 레이저 플루엔스 0.8J/cm²에서 세포 생존율은 30%로 떨어졌다. 이는 1.6 J/cm²의 매우 높은 레이저 플루엔스에서도 세포 사멸을 유도하지 않는 IOC가 없는 PLA 필름의 경우에는 해당되지 않았다. IOC가 단일 레이저 펄스에서 살아남는 것(즉, 단편화되지 않음)이 관찰되었으므로 두 번째 펄스를 적용하면 필름의 세포 살상 능력을 더욱 향상시킬 수 있다는 가설을 세웠다. 두 번째 펄스의 효과를 관찰할 수 있는지 확인하기 위해, 0.3 J/cm²의 (낮은) 플루엔스를 선택했으며 0.3 J/cm²의 단일 펄스 이후에는 세포의 약 50%가 생존 가능하게 유지되었다. 따라서 필름은 0.3 J/cm²의 플루엔스에서 2회 연속 스캔되었다. 도 12에서 볼 수 있듯이, 세포 생존율은 46 ± 6%(단일 스캔)에서 25 ± 3%(2회 연속 스캔)로 떨어졌다.
2.4 펄스 레이저 광에 노출된 PLA-IOC 필름에 의한 공간적 선택적 세포 절제 및 세포 사멸
(i) 필름에서 IOC의 밀도와 크기를 제어할 수 있다는 사실과 (ii) 필름의 특정 영역을 스캔할 수 있는 고유한 능력을 고려하여, 버블 필름이 어느 정도까지 높은 공간 정밀도로 표적 세포를 사멸시킬 수 있는지 평가했다. 따라서, PLA-IOC 필름의 미리 정의된 원형 영역은 플루엔스가 증가하는 레이저 펄스로 스캔되었다(도 13).
사멸 세포에만 들어가는 프로피듐 요오다이드(PI)의 적색 형광에 의해 관찰될 수 있듯이 미리 정의된 영역(직경 6.5mm의 원)에 존재하는 세포가 선택적으로 사멸되었다. 그러나 1.3 J/cm²의 플루엔스에서 치료된 부위(살아 있는 세포와 죽은 세포)의 총 세포 수가 크게 감소한 것으로 관찰되었고(도 14), 이는 레이저 치료 시 세포가 '손실'(절제)되었음을 나타내며, 증기 버블에 의해 발휘되는 기계적 힘에 의해 발생할 가능성이 높다. 도 15에 도시된 바와 같이, 세포를 칼세인 AM 및 요오드화 프로피듐으로 염색하여 처치된 부위에 남아 있는 사멸 세포와 생존 세포의 비율을 결정할 수 있었고; 분명히, 이 비율은 레이저 플루엔스가 증가함에 따라 점차 감소했다.
도 16은 펄스 레이저로 PLA-IOC 필름의 국소 조사 시 단일 세포 사멸(눈금 막대는 10μm)을 보여준다. 사멸된 세포에만 들어가는 요오드화 프로피듐(PI)의 적색 형광으로 관찰할 수 있듯이 단일 세포 사멸이 얻어졌다. 필름의 상부 위에 있는 세포의 선택적 세포 처치에 대한 투과 이미지는 1.3 J/cm2의 유속에서 단일 세포 절제를 보여주었다. 0.3 내지 0.8 J/cm² 사이의 플루엔스를 사용하면, 세포 절제가 발생하지 않더라도 VNB가 생성될 수 있었다.
단일 세포 절제의 성공률은 플루엔스에 따라 증가했다(도 17). 게다가, 0.3 J/cm²의 플루엔스에서는 단일 세포 절제가 허용되지 않는 반면, 1.3 J/cm²의 플루엔스에서는 단일 세포 절제가 항상 성공적인 것으로 관찰되었다.
위의 모든 실험에서, 세포는 PLA-IOC 필름에서 성장했다. 본 발명에 따른 입자를 포함하는 구조체의 임상적 잠재력을 추가로 조사하기 위해, 세포층의 상부에 배치되었을 때 필름의 세포 사멸 능력을 평가했다(도 18). 이는 표적 조직의 표면을 덮기 위해 필름을 의도적으로 사용하는 것을 모사한다.
실험 부분에 요약된 바와 같이, 세포를 6-웰 플레이트에 접종한 후 세포 배지를 제거했지만 세포 상단에 얇은 배지 층이 남아 있었고; 이후 PLA-IOC 필름을 세포 상단 위에 놓았다. 세포와 필름 사이의 거리는 40μm로 추정되었다. 그런 다음 필름의 미리 정의된 영역(Ghent University 로고)을 레이저에 노출시켰다(도 19). 세포가 필름 상부 바로 위에서 배양된 도 13의 실험과 비교하여 필름과 세포 사이의 거리가 더 멀다고 추정되었므로, 1.6 J/cm²의 더 높은 플루엔스를 사용했다. 도 20에서 볼 수 있듯이 4번의 펄스가 필요했지만 약 25%의 생존 세포와 사멸 세포의 비율이 실현되었다. 또한 총 세포 수는 변경되지 않았다(도 21). 이는 세포와 IOC 사이의 거리가 길어서 세포에 작용하는 VNB에 의한 기계적 힘이 낮아지기 때문일 수 있다.
PLA-IOC 필름이 세포의 상부에 위치하는 경우 세포막의 천공이 세포 사멸에 관여하는지 여부를 평가하기 위해(도 22(왼쪽)), 세포를 FD500과 함께 배양하고 필름으로 덮었다. 그런 다음 필름에 방사선을 조사했다(1.6 J/cm², 4회 연속). 도 22(오른쪽)에서 볼 수 있듯이 녹색(FD500)과 빨간색(PI) 형광을 세포에서 관찰할 수 있었으며 반면, IOC가 없는 PLA 필름으로 덮고 레이저 펄스를 조사한 세포에서는 형광이 훨씬 적었다.
세포를 덮고 있는 PLA-IOC 필름의 레이저 조사 후 세포내 철의 양을 결정하기 위해, ICP-MS 실험을 수행했다. 도 23에 나타난 바와 같이, 세포를 유리 IONP(1g/L, 필름의 철 농도와 동일)에 노출시키면, 세포의 철 함량이 높아진다.
유리 IONP에 레이저를 조사하면 세포의 철분 수준이 더욱 증가한다. 이는 (i) IONP가 더 작은 조각으로 단편화되고 (ii) 세포막에 구멍을 뚫어 철분 흡수를 촉진하는 VNB(유리 IONP에 의해 생성됨)에 기인한 것일 수 있다. PLA-IOC 필름으로 덮인 세포(레이저 처치 없음)에서 철 함량은 처치되지 않은 세포와 마찬가지로 낮게 유지된다. PLA-IOC 필름을 조사하면 세포 내 철 함량이 증가하는 것을 관찰할 수 있다. 그러나, 세포 내 철분 함량은 유리 IONP 및 레이저로 처치한 세포에서의 양에 비해 훨씬 낮았다.
2.5 펄스 레이저 광에 노출된 PLA-IOC 필름에 의한 표면 각막 세포 사멸
필름이 배양된 세포층의 상부 위에 위치할 때 효율적인 세포 사멸이 달성될 수 있으므로(도 18), 다음 단계에서 조직(각막)의 표면 세포가 본 발명에 따른 구조체에 의해 사멸될 수 있는지 여부를 평가했다. 도 24에 설명된 대로 소의 눈은 필름 위에 위치시켰고; 전체 각막을 이후 1.6 J/cm²에서 4회 연속 조명했다. 그런 다음 각막을 절제하고 PI로 염색한 후 공초점 현미경으로 이미지를 촬영했다. 첫 번째 관찰에서는 다소 예기치 않게 PI 양성 세포가 대조 눈, 즉 PLA 필름이 없는 눈 또는 IOC가 없는 PLA 필름으로 덮인 눈에 존재한 것으로 나타났다. 이는 (i) 생체 외 소 각막 상피 세포가 이미 핵 제거 후 몇 시간 후에 사멸되지 시작하고 (ii) 예를 들어 깜박임으로 인한 전단력으로 인해 상피 세포 사멸이 생리학적으로 발생할 수 있는 것으로 알려져 있기 때문일 수 있다. 그러나, 공초점 현미경 이미지를 통해 IOC가 없는 PLA 필름을 사용한 대조 실험에 비해 1.6 J/cm² 레이저 펄스를 4회 조사한 PLA-IOC 필름으로 덮인 각막에서 PI 양성 세포의 유의한 증가가 관찰되었음을 확인했다(도 25).
각막 세포의 막 천공을 확인하기 위해, 녹색 형광성 FD500의 존재 하에 실험을 반복했다. 공초점 현미경 이미지는 IOC가 없는 PLA 필름을 사용한 대조 실험과 비교하여 PLA-IOC 필름으로 덮여 있고 1.6 J/cm²의 4 펄스로 처치된 각막의 녹색 형광에 명확한 차이가 있음을 보여준다. 이 관찰은 각막 세포막의 천공이 실제로 발생했음을 나타낸다. 또한 중요한 점은 녹색 형광(FD500)이 자연적으로 사멸된 세포의 적색 형광과 동일 위치에 있지 않다는 점이며, 이는 기공 형성이 각막을 덮고 있는 PLA-IOC 필름의 레이저 조사로 인한 것임을 제시한다. FD500이 처치되지 않은 각막 세포에 침투하지 않는 것을 관찰했다.
공간적 선택적 세포 사멸이 각막 수준에서 달성될 수 있는지 확인하기 위해, 상피 세포를 칼세인 AM(5μg/ml)으로 염색했다. 그런 다음 염색된 각막을 상피 쪽이 아래로 향하게 하여 필름 위에 놓았다(도 28). 관심 영역을 선택하고 레이저 조사(<7ns; 561nm)를 4회 적용했다. 1.6 J/cm²의 플루엔스에서 4회 조사한 후, 국소적인 형광 감소가 관찰되었으며 조사된 세포는 염색이 사라졌다. 더 높은 강도(4.5 J/cm², 4배)에서는 표적 부위의 세포가 더 이상 보이지 않았으며, 이는 절제가 발생했음을 제시한다. 두 플루엔스 모두에서 주변 세포(즉, 레이저 빔 외부에 위치)는 레이저 조사 후 염색이 소실되지 않았으며, 이는 그대로 남아 있음을 제시한다.
실시예 2
본 발명에 따른 구조체의 두 번째 실시형태는 나노섬유와 나노섬유에 내장된 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자를 포함하는 다공성 구조체를 포함하며, 이로써 입자의 일부는 구조체의 자유 표면(S), 특히 나노섬유의 자유 표면에 부분적으로 노출된다. 아래에 설명된 예는 구조체의 재료로서 폴리카프로락톤을 포함하고 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자로서 산화철 나노분말을 포함한다. 다른 재료나 다른 입자도 고려될 수 있다는 것은 분명하다.
1. 재료 및 방법
1.1 재료
나노섬유 웹의 합성을 위해 다음 재료를 사용했다:
· 폴리카프로락톤;
· N,N-디메틸포름아미드(DMF);
· 테트라히드로푸란(THF);
· 산화철(Fe3O4) 나노분말(IONP)(#MKBW3262, Sigma-Aldrich, 벨기에);
· 폴리(알릴아민 염산염)(PAH, Mw=17,560g/mol, #MKBZ2824V, Sigma-Aldrich, 벨기에);
· 진한 황산 용액(96%)(Sigma-Aldrich);
· 콜라겐 I 쥐 단백질(Thermo Fisher Scientific, #A1048301, GibcoTM, 벨기에).
1.2 나노섬유와 입자를 포함하는 구조체의 제조
IONP를 0 부피% 내지 1.15 부피% 사이의 다양한 농도의 PCL이 첨가된 1:1 DMF/THF 용액에 재분산시켰다.
이렇게 얻은 혼합물을 전기방사에 의해 나노섬유를 제조하는 데 사용했다. 나노섬유를 접지된 회전 수집기에 장착된 현미경 유리 슬라이드(#1000912, Marienfeld, Germany)에서 수집했다.
IONP는 나노섬유에 매립되었으며 입자의 일부는 나노섬유의 자유 표면(S)에 부분적으로 노출되었다.
Claims (15)
- 하기 단계를 포함하는, 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하는 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo) 방법:
- 재료를 포함하고 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자를 포함하는 구조체를 제공하는 단계로서, 상기 구조체는 부피(V) 및 자유 표면(S)을 정의(defining)하고, 상기 자유 표면(S)은 자유 표면적(AS)를 갖고, 상기 입자의 적어도 일부는 자유 표면(S)에 부분적으로 노출되고, 상기 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 입자 각각은 입자 없는 표면(P)를 정의하고, 상기 입자 없는 표면(P)은 입자 없는 표면적(AP.)을 갖고, 상기 입자는 모든 입자의 입자 없는 표면적(AP)의 합이 자유 표면적(AS)의 0.0001 내지 50% 범위가 되는 방식으로 상기 구조체에 매립되는, 단계;
- 적어도 하나의 세포를 제공하는 단계;
- 상기 구조체와 상기 적어도 하나의 세포를 서로 100μm 미만의 거리(d)에 위치시키는 단계로서, 거리(d)는 상기 적어도 하나의 세포와 상기 구조체의 자유 표면(S) 사이의 최단 거리인, 단계;
- 전자기 방사선으로 상기 구조체를 조사하는 단계. - 청구항 1에 있어서,
상기 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 입자의 적어도 일부는 상기 재료로부터 돌출되어 있는, 방법. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 입자는 1 nm 내지 40000 nm 범위의 치수를 갖는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 입자는 2 내지 1000개의 입자를 포함하는 클러스터를 갖는 클러스터로 배열되는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 세포는 세포의 현탁액 또는 세포의 조직을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 구조체의 자유 표면(S)에 부분적으로 노출되는 입자의 밀도는 1 내지 10 입자/100μm2 범위인, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
상기 입자는 금속 입자, 금속 산화물 입자, 탄소 또는 탄소계 입자, 및 하나 이상의 광 흡수 화합물을 포함하는 입자 및 하나 이상의 광 흡수 화합물로 로딩되거나 관능화된 입자로 이루어진 군으로부터 선택된 입자를 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
상기 재료는 무기 재료 또는 무기계 재료, 세라믹 또는 세라믹계 재료, 유기 재료 또는 유기계 재료, 하이드로겔 또는 이들 재료 중 적어도 하나를 포함하는 복합 물질(composite material)을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
전자기 방사선으로 구조체를 조사하는 단계는 1 fs 내지 1 ms 범위의 펄스 지속 시간 및/또는 0.001 내지 10 J/cm2 범위인 펄스당 플루엔스(fluence)를 갖는 펄스를 보유하는 펄스 방사선원을 사용하여 조사하는 것을 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
상기 구조체는 제1 자유 영역 표면(AS1)을 갖는 제1 표면(S1), 바람직하게는 제1 표면의 반대측에 있고 제2 자유 영역 표면(AS2)을 갖는 제2 표면(S2)을 정의하는 필름을 포함하며, 여기서 입자는 제1 표면(S1)에 부분적으로 노출된 모든 입자의 입자 없는 표면적(AP)의 합이 자유 표면적(AS1)의 0.0001 내지 50% 범위가 되는 방식으로 구조체에 매립되는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
상기 구조체는 섬유, 미립자, 섬유와 미립자의 조합 또는 폼(foam)을 포함하는 다공성 구조체를 포함하고, 상기 입자는 상기 섬유, 상기 미립자 또는 상기 폼에 매립되는, 방법. - 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하기 위한 광열 공정(photothermal process)에 사용하기 위한 구조체로서, 상기 구조체는 재료를 포함하고 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자를 포함하고, 상기 구조체는 재료를 포함하고 전자기 방사선을 흡수할 수 있는 입자를 포함하며, 상기 구조체는 부피(V) 및 자유 표면(S)을 정의하고, 자유 표면(S)은 자유 표면적 AS를 갖고, 상기 입자의 적어도 일부는 자유 표면(S)에 부분적으로 노출되고, 자유 표면(S)에 부분적으로 노출된 입자 각각은 입자 없는 표면(P)을 정의하고, 입자 없는 표면(P)은 입자 없는 표면적(AP.)을 갖고, 입자는 모든 입자의 입자 없는 표면적(AP)의 합이 0.0001 내지 50% 범위가 되는 방식으로 구조체에 매립되며,
상기 방법은,
- 구조체와 적어도 하나의 세포를 서로 100 μm 미만의 거리(d)에 위치시키는 단계로서, 상기 거리(d)는 적어도 하나의 세포와 상기 구조체의 자유 영역 표면(S) 사이의 최단 거리인, 단계;
- 적어도 하나의 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하기 위해 구조체에 전자기 방사선을 조사하는 단계
를 포함하는, 구조체. - 청구항 12에 있어서,
상기 광열 공정은 대상의 세포를 선택적으로 투과성화 및/또는 단편화하기 위한 대상 내의 요법(method of therapy)을 포함하는, 구조체. - 청구항 12 또는 청구항 13에 있어서,
적어도 하나의 세포는 세포의 현탁액 또는 세포의 조직을 포함하고/하거나 전자기 방사선이 레이저에 의해 생성된 펄스 방사선을 포함하는, 구조체. - 청구항 12 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
상기 요법은 나노수술을 포함하는, 구조체.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP21164292 | 2021-03-23 | ||
| EP21164292.1 | 2021-03-23 | ||
| PCT/EP2022/057464 WO2022200333A1 (en) | 2021-03-23 | 2022-03-22 | Method to selectively permeabilize and/or fragmentize cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230160289A true KR20230160289A (ko) | 2023-11-23 |
Family
ID=75441706
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020237034344A KR20230160289A (ko) | 2021-03-23 | 2022-03-22 | 세포의 선택적 투과성화 및/또는 단편화 방법 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4312840A1 (ko) |
| JP (1) | JP2024511615A (ko) |
| KR (1) | KR20230160289A (ko) |
| CN (1) | CN117042707A (ko) |
| WO (1) | WO2022200333A1 (ko) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7999161B2 (en) * | 2005-01-22 | 2011-08-16 | Alexander Oraevsky | Laser-activated nanothermolysis of cells |
| US20110117648A1 (en) * | 2007-07-26 | 2011-05-19 | The Regents Of The University Of California | Single cell surgery tool and a cell transfection device utilizing the photothermal properties of thin films and/or metal nanoparticles |
| CA2873204C (en) * | 2011-05-13 | 2021-10-19 | The Regents Of The University Of California | Photothermal substrates for selective transfection of cells |
-
2022
- 2022-03-22 JP JP2023558357A patent/JP2024511615A/ja active Pending
- 2022-03-22 WO PCT/EP2022/057464 patent/WO2022200333A1/en active Application Filing
- 2022-03-22 KR KR1020237034344A patent/KR20230160289A/ko unknown
- 2022-03-22 EP EP22717128.7A patent/EP4312840A1/en active Pending
- 2022-03-22 CN CN202280023902.XA patent/CN117042707A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2024511615A (ja) | 2024-03-14 |
| CN117042707A (zh) | 2023-11-10 |
| WO2022200333A1 (en) | 2022-09-29 |
| EP4312840A1 (en) | 2024-02-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Electrospun micropatterned nanocomposites incorporated with Cu2S nanoflowers for skin tumor therapy and wound healing | |
| RU2703703C2 (ru) | Кросслинкинг тканей глазного яблока | |
| Chiappini et al. | Biodegradable nanoneedles for localized delivery of nanoparticles in vivo: exploring the biointerface | |
| EP3157866B1 (en) | Graphene and graphene-related materials for manipulation of cell membrane potential | |
| Fraire et al. | Vapor nanobubble is the more reliable photothermal mechanism for inducing endosomal escape of siRNA without disturbing cell homeostasis | |
| Xiong et al. | Photothermal nanomaterial-mediated photoporation | |
| Iodice et al. | Enhancing photothermal cancer therapy by clustering gold nanoparticles into spherical polymeric nanoconstructs | |
| KR20170140315A (ko) | 향상된 치유를 위한 이층 장치 | |
| Ramon et al. | Vapor nanobubble-mediated photoporation constitutes a versatile intracellular delivery technology | |
| Hua et al. | Bubble forming films for spatial selective cell killing | |
| Zhao et al. | Synergistic cytotoxicity of low-energy ultrasound and innovative mesoporous silica-based sensitive nanoagents | |
| Niu et al. | Laser irradiated fluorescent perfluorocarbon microparticles in 2-D and 3-D breast cancer cell models | |
| JP6334214B2 (ja) | レーザーを用いた薬剤放出方法 | |
| WO2005077330A1 (en) | Electromagnetic radiation addressable materials | |
| KR20230160289A (ko) | 세포의 선택적 투과성화 및/또는 단편화 방법 | |
| Dehariya et al. | Recent advances of nanobubble-based systems in cancer therapeutics: A Review | |
| US20240175003A1 (en) | Method to selectively permeabilize and/or fragmentize cells | |
| Wang et al. | Hollow DNA/PLL microcapsules with tunable degradation property as efficient dual drug delivery vehicles by α-chymotrypsin degradation | |
| Huang et al. | The influence of laser intensity activated plasmonic gold nanoparticle-generated photothermal effects on cellular morphology and viability: a real-time, long-term tracking and monitoring system | |
| Akturk et al. | Gold nanocomposites for biomedical applications | |
| Singh et al. | Uric acid released from poly (ε‐caprolactone) fibers as a treatment platform for spinal cord injury | |
| US20210338595A1 (en) | Composition for treatment of vitreous disease or disorder | |
| Abouelatta et al. | Optimized molecular imprints in gamma-irradiated collagen shields of an antifungal drug: In vitro characterization, in-vivo bioavailability enhancement | |
| JP2016210992A (ja) | 組成物、その利用、及び当該組成物を製造するためのキット | |
| Kim et al. | Effect of lyophilized gelatin-norbornene cryogel size on calvarial bone regeneration |