CN117042707A - 选择性地透化和/或破碎细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及选择性地透化和/或破碎细胞的方法。使包含材料和能够吸收电磁辐射的颗粒的结构与细胞彼此处于近距离。嵌入结构中的颗粒的一部分被暴露于结构的自由表面。用电磁辐射照射结构并且特别是结构中的颗粒,以选择性地透化和/或破碎细胞。此外,本发明涉及用于在光热过程中使用以选择性地透化和/或破碎细胞的结构。
Description
技术领域
本发明涉及用于选择性地透化和/或破碎(碎片化,fragmentize)细胞、例如用于选择性地杀伤(杀死,kill)或消融(切除,ablate)细胞的方法。特别地,本发明涉及包含能够吸收电磁辐射的颗粒的结构以及这样的结构在用于选择性地透化和/或破碎细胞的方法中的用途。所述结构适于在纳米外科手术(nanosurgery)中使用,例如用于杀伤或消融角膜细胞。
背景技术
为了治疗多种疾病如癌症,需要杀伤在组织的表面处的细胞。尽管在癌症手术方面有重大进展,但是从肿瘤中移除所有癌细胞仍然极具挑战性,尤其是当肿瘤细胞与健康组织缠结在一起时。它解释了为什么辅助疗法诸如放疗和化疗经常是手术之后所优选的。
当处理在眼睛的表面(结膜和角膜)处的侵袭性癌症时,肿瘤的不完全移除仍然还是眼科面临的挑战。尤其是对于此类癌症,辅助疗法的使用是非常有限的。事实上,控制化疗药物在眼表面处的沉积和剂量非常具有挑战性,而原位放疗和冷冻疗法也显示出妥协的结果。
光动力疗法(PDT)和光热疗法(PTT)已被证明是有前途的用于细胞杀伤的方法。这样的技术具有可能甚至允许“单个细胞杀伤”的高空间精度。然而,对用激光治疗后的散热缺乏控制(表面过热)可能对周围组织造成不可逆转的损害。
最近,纳米颗粒敏化激光照射已被探索用于杀伤细胞,例如癌细胞。在激光照射后,细胞因光热效应(诸如局部加热)而被损坏或杀伤。在这种方法中,(游离的)纳米颗粒被递送至癌细胞。由于关于纳米颗粒的毒理学效应存在不确定性,所以关于这样的纳米颗粒敏化激光照射可能存在毒理学问题。
因此,目前感兴趣的是开发用于选择性地杀伤细胞的方法,从而减少或避免等离子体(plasmonic)纳米颗粒与细胞的直接接触。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于选择性地透化和/或破碎细胞的方法,从而避免现有技术的缺陷。
本发明的另一个目的是提供一种使用包含能够吸收电磁辐射的颗粒的结构以高空间分辨率选择性地透化和/或破碎细胞的方法。特别地,本发明的一个目的是提供一种以高空间分辨率选择性地杀伤或消融细胞的方法。
本发明的另一个目的是提供一种这样的方法,所述方法用于选择性地透化和/或破碎细胞,同时限制颗粒诸如微米颗粒(microparticle)和/或纳米颗粒或者颗粒的材料或碎片在周围细胞或组织中的扩散或积聚。
本发明的另一个目的是提供一种用于选择性地透化和/或破碎细胞的方法,其不需要结构和细胞之间的直接接触,特别是不需要嵌入结构中的颗粒和细胞之间的直接接触。根据本发明的方法允许使用颗粒诸如微米颗粒和/或纳米颗粒来选择性地透化和/或破碎细胞,从而减少或避免细胞对颗粒或者颗粒的材料或碎片的摄取。
本发明的另一个目的是提供一种这样的方法,所述方法用于选择性地透化和/或破碎细胞,同时限制颗粒诸如微米颗粒和/或纳米颗粒或者颗粒的材料或碎片在周围细胞或组织中的扩散或积聚。
本发明的另一个目的是提供一种允许破碎细胞、例如使用低能量密度(能流,fluence)的激光脉冲杀伤细胞的方法。
本发明的又一个目的是提供一种用于透化和/或破碎细胞的方法,其中结构可以在照射(激光处理)后从细胞(例如从组织)中简单地移除。
本发明的又一个目的是提供一种允许移除浅表肿瘤的方法。
另一个目的是提供一种包含能够吸收电磁辐射的颗粒的结构,其用于在用于选择性地透化和/或破碎细胞、例如用于选择性地杀伤细胞(例如角膜细胞)的方法中使用。
根据本发明的第一方面,提供了一种用于选择性地透化和/或破碎细胞的体外或离体方法。所述方法包括例如细胞的选择性杀伤或选择性消融。所述方法包括以下步骤:
-提供包含材料并且包含能够吸收电磁辐射的颗粒的结构。所述结构限定体积V和自由表面S。自由表面S具有自由表面积AS。颗粒嵌入结构的材料中。颗粒的至少一部分被部分地暴露于自由表面S。部分地暴露于自由表面S的颗粒中的每一个限定自由表面S中的颗粒自由表面P。颗粒自由表面P具有颗粒自由表面积AP。颗粒以使得所有颗粒的颗粒自由表面积AP的总和在自由表面积AS的0.0001至50%范围内的方式嵌入材料中;
-提供至少一个细胞,优选地多个细胞;
-使结构和至少一个细胞彼此处于小于100μm的距离d,距离d为至少一个细胞与结构之间的最短距离,优选地至少一个细胞与结构的自由表面S之间的最短距离;
-用电磁辐射照射结构。
结构的自由表面S是结构的与环境直接接触的总表面。在结构浸没在流体例如液体(诸如包含(生物)细胞的介质)或气体(例如空气)中并且结构包含对该流体是不可渗透的材料的情况下,结构的自由表面S也可以被定义为与流体接触或可以与流体接触的结构的材料的总表面。
自由表面S限定自由表面积AS。
优选地,结构的自由表面积AS与结构的体积的比率(即比率AS/V)在10-2至102μm-1、例如10-1至50μm-1或1至10μm-1的范围内。
术语“面积”是指平面中的平坦表面的尺寸(即二维物体的尺寸)的测量结果。
术语“表面积”是指三维形状物体的表面的尺寸的测量结果。
术语“自由表面积AS”是指结构的自由表面的尺寸的测量结果。
根据本发明的结构中存在的能够吸收电磁辐射的颗粒的浓度优选地在0.001体积%至20体积%(体积颗粒/体积结构)的范围内。更优选地,根据本发明的结构中存在的能够吸收电磁辐射的颗粒的浓度在0.01体积%至10体积%或0.01体积%至5体积%的范围内,并且例如为0.05体积%、0.1体积%、0.2体积%、0.5体积%、1体积%、2体积%或5体积%。
如上所提及的,结构中存在的颗粒的一部分被部分地暴露于结构的自由表面S。因此,这样的颗粒部分地嵌入材料中并且部分地暴露于结构的自由表面S。显然,除了部分地暴露于自由表面S的颗粒之外,根据本发明的结构还可以包括完全嵌入结构的材料中的颗粒。
部分地暴露于自由表面S的颗粒中的每一个都具有作为自由表面S的一部分的自由表面。被这样的部分地暴露于自由表面S的颗粒占据的自由表面S被称为颗粒自由表面P。颗粒自由表面P具有颗粒自由表面积Ap。
术语“颗粒自由表面积Ap”是指颗粒自由表面P的尺寸的测量结果。
部分地暴露于结构的自由表面S的颗粒可以从材料突出或不从材料突出。突出的颗粒从由材料限定的外表面突出。
根据本发明的结构可以包括从材料所限定的外表面突出的部分地暴露于结构的自由表面S的颗粒和不从材料所限定的外表面突出的部分地暴露于结构的自由表面S的颗粒的组合。
垂直于材料的表面所测量的,突出的颗粒延伸例如至50μm的高度,例如0.5μm至10μm的高度。
优选地,颗粒以这样的方式嵌入结构中,更特别地嵌入结构的材料中,所述方式使得所有颗粒的颗粒自由表面积AP的总和在自由表面积AS的0.0001至50%的范围内,如下所示:
其中i在1至n的范围内(n为部分地暴露于自由表面S的颗粒的数量)。
在优选的实施方案中,颗粒以这样的方式嵌入结构中,所述方式使得所有颗粒的颗粒自由表面积AP的总和在自由表面积AS的1至25%、自由表面积AS的5至25%、自由表面积AS的15至25%的范围内。所有颗粒的颗粒自由表面积AP的总和例如为自由表面积AS的20%。
在用电磁辐射照射结构时,结构中存在的颗粒(特别是部分地暴露于结构的自由表面S的颗粒)引起光热效应。这种光热效应特别地引起被照射颗粒附近的材料的局部和暂时加热,并且导致蒸汽泡(例如蒸汽微米泡或蒸汽纳米泡)的形成。这样的蒸汽泡可以引起短距离处的细胞的透化或破碎。
在本发明的实施方案中,所述方法允许通过使细胞和结构彼此接触或彼此处于短距离并且通过用电磁辐射照射结构、特别是照射结构中存在的部分地暴露于自由表面S的颗粒来增加细胞的渗透性。所述方法允许增加细胞的渗透性,而不需要颗粒与细胞之间的直接接触。
在本发明的其他实施方案中,所述方法允许通过使细胞和结构彼此接触或彼此处于短距离并且通过用电磁辐射照射结构、特别是照射结构中存在的部分地暴露于自由表面S的颗粒来破碎细胞。所述方法允许破碎细胞,而不需要颗粒与细胞之间的直接接触。所述方法允许通过使细胞和结构彼此接触或彼此处于短距离并且通过用电磁辐射照射结构、特别是部分地暴露于自由表面S的颗粒来杀伤细胞或消融细胞。特别地,所述方法允许杀伤细胞或消融细胞,而不需要颗粒与细胞之间的直接接触。
在本发明的其他实施方案中,所述方法允许通过使细胞和结构彼此接触或彼此处于短距离并且通过用电磁辐射照射结构、特别是照射结构中存在的部分地暴露于自由表面S的颗粒来增加特定细胞的渗透性、同时破碎其他细胞。特别地,所述方法允许增加特定细胞的渗透性,同时破碎其他细胞,而不需要颗粒与细胞之间的直接接触。
使细胞和结构彼此接触意指在细胞与结构之间存在直接接触。在这样的情况下,细胞接触结构的自由表面S。细胞可以与结构的材料直接接触和/或与部分地暴露于结构的自由表面S的一个或多个颗粒直接接触。
使细胞和结构彼此处于短距离意指细胞与结构之间的最短距离d、特别是细胞与结构的自由表面S之间的最短距离为100μm或小于100μm。细胞与结构之间的最短距离d例如为50μm、20μm、10μm、5μm、3μm、2μm、1μm、0.5μm或0.1μm。优选地,细胞与部分地暴露于结构的自由表面S的颗粒之间的最短距离d为100μm或小于100μm。细胞与部分地暴露于结构的自由表面S的颗粒之间的最近距离例如为50μm、20μm、10μm、5μm、3μm、2μm、1μm、0.5μm或0.1μm。
至少一个细胞包括例如细胞的悬浮液或细胞的组织。组织的实例包括眼组织或皮肤组织。特别的实例包括肿瘤边缘(margin)。
为了允许以单个细胞分辨率进行空间选择性透化和/或破碎,应对至少部分地暴露于自由表面S的颗粒的密度进行选择,使得每个细胞充分接近至少部分地暴露于自由表面S的颗粒。
被使得处于等于或小于100μm的距离d处的细胞的密度例如在1个细胞/mm2至105个细胞/mm2的范围内,例如在10个细胞/mm2至104个细胞/mm2、102个细胞/mm2至104个细胞/mm2或103个细胞/mm2至3.103个细胞/mm2的范围内。
部分地暴露于结构的自由表面S的颗粒的密度优选地在1个颗粒/100μm2至10个颗粒/100μm2,例如1个颗粒/μm2至5个颗粒/100μm2,例如2个颗粒/μm2、3个颗粒/100μm2或4个颗粒/100μm2的范围内。
嵌入根据本发明的结构中的颗粒可以包括能够吸收电磁辐射并且适于在用电磁辐射照射时生成光热效应的任何颗粒。
如本文中使用的,术语“颗粒”是指具有约1nm至约40000nm(40μm)、例如1nm至10000nm(10μm)、10nm至2000nm(2μm)、50nm至1000nm(1μm)或100nm至500nm、例如200nm的尺寸(更特别地颗粒的最大尺寸)的颗粒或者两个或更多个颗粒的团、聚集体或簇。
尺寸优选地通过测量颗粒的最大尺寸来测量。颗粒的最大尺寸对应于该颗粒的两个点之间的最大距离。颗粒的最大尺寸例如是指该颗粒的宽度(最大宽度)、高度(最大高度)或直径(最大直径)。
指定颗粒的尺寸的一种备选方式是通过等效球径(也称为等效体积直径)。不规则形状物体的等效球径(或ESD)是等效体积的球体的直径。在实施方案中,颗粒可以具有约1nm至约40000nm(40μm)的等效球径。在实施方案中,颗粒可以具有约1nm至约10000nm(10μm)的等效球径。例如,颗粒可以具有约10nm至200nm(2μm)、50nm至1000nm(1μm)或100nm至500nm(例如200nm)的等效球径。
颗粒的尺寸(例如颗粒的宽度、高度或直径)、特别是颗粒的最大尺寸(例如颗粒的最大宽度、高度或直径)或等效球径可以使用透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)或原子力显微镜(AFM)来测定。
出于本发明的目的,术语“颗粒的团”、“颗粒的聚集体”和“颗粒的簇”可互换使用。
颗粒的簇包括至少2个个体颗粒,优选地10至1000个个体颗粒,例如100至1000个个体颗粒。簇的个体颗粒优选地与簇的至少一个个体颗粒接触或者位于该簇的另一个个体颗粒的几微米的距离处。
在颗粒包括簇的情况下,簇的个体颗粒优选地具有约1nm至约200nm、例如50nm至100nm的尺寸(更特别地个体颗粒的最大尺寸)。
簇优选地具有约1000nm至约40000nm(10μm)、例如10nm至2000nm、50nm至1000nm或100nm至500nm(例如200nm)的尺寸(更特别地簇的最大尺寸)。
如本文中使用的,术语“微米颗粒”是指具有大于1000nm(>1μm)且至多10000nm(≤10μm)的尺寸(更特别地颗粒的最大尺寸)的颗粒或者两个或更多个颗粒的团、聚集体或簇。在微米颗粒包括簇的情况下,这样的簇的个体颗粒优选地具有约1nm至约200nm、例如50nm至100nm的尺寸(更特别地个体颗粒的最大尺寸)。
术语“纳米颗粒”是指具有至少1nm(≥1nm)且至多1000nm(≤1μm)的尺寸(颗粒的最大尺寸)的颗粒或者两个或更多个颗粒的团、聚集体或簇。在微米颗粒包括簇的情况下,这样的簇的个体颗粒优选地具有约1nm至约200nm、例如50nm至100nm的尺寸(更特别地个体颗粒的最大尺寸)。
尺寸(颗粒的最大尺寸)在100nm至1000nm范围内的颗粒也可以被称为“亚微米颗粒”。
颗粒可以具有任何形状。它们可以例如是球形的、椭圆形的、棒状的、金字塔形的、分支的,或者可以具有不规则的形状。
颗粒可以是固体颗粒,可以具有包含一种或多种材料的壳结构或核-壳结构。
优选的颗粒包括金属颗粒、金属氧化物颗粒、碳或碳基颗粒、包含一种或多种光吸收化合物的颗粒或者负载有一种或多种光吸收化合物或用一种或多种光吸收化合物功能化的颗粒。
金属颗粒的实例包括金颗粒、银颗粒、铂颗粒、钯颗粒、铜颗粒及其合金。优选的金属颗粒包括金颗粒、银颗粒及其合金。
金属氧化物颗粒的实例包括氧化铁、氧化钛、氧化锆、氧化铈、氧化锌和氧化镁。
碳或碳基颗粒的实例包括石墨烯量子点、(还原的)氧化石墨烯和碳纳米管。
包含一种或多种光吸收化合物的颗粒或者负载有一种或多种光吸收化合物或用一种或多种光吸收化合物功能化的颗粒的实例包括:包含合成的有机或无机吸收剂、负载有合成的有机或无机吸收剂或用合成的有机或无机吸收剂功能化的颗粒,以及包含天然存在的吸收剂或其衍生物、负载有天然存在的吸收剂或其衍生物或用天然存在的吸收剂或其衍生物功能化的颗粒。特别的实例包括脂质体,固体脂质纳米颗粒,聚合物基颗粒,其包含以下各项、负载有以下各项或用以下各项功能化:光吸收染料分子(诸如吲哚菁绿)、无机量子点(具有低荧光量子产率)、天然存在的光吸收剂如颜料(诸如黑色素、视紫质、光视蛋白或视紫蓝质)和合成类似物如聚多巴胺或者光动力疗法中使用的光敏剂。
在根据本发明的方法或产品的实施方案中,颗粒可以是可生物降解的。在实施方案中,颗粒可以是生物相容性的。在实施方案中,颗粒可以是可生物降解的且生物相容性的。在实施方案中,颗粒可以包含临床批准的组分或由临床批准的组分组成。有利地,颗粒是可生物降解的、生物相容性的并且包含临床批准的组分或由临床批准的组分组成。
根据本发明的结构可以包括一种类型的颗粒或不同颗粒的组合,例如具有不同尺寸、不同组成和/或不同形状的颗粒。
能够吸收电磁辐射的颗粒所嵌入的结构的材料包括例如无机材料或无机基材料,例如二氧化硅或二氧化硅基材料或者陶瓷或陶瓷基材料,有机材料或有机基材料,诸如碳或碳基材料或者聚合物或聚合物基材料。结构的材料还可以包括包含上述材料中的至少一种的复合材料,例如包含有机和无机材料的复合材料。
结构的优选材料包括或基于聚苯乙烯、聚己内酯、乙基纤维素、乙酰邻苯二甲酸纤维素、聚乳酸、聚乳酸-共-乙醇酸、纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、明胶、胶原蛋白、蚕丝、藻酸盐、透明质酸、葡聚糖、淀粉、聚碳酸酯或聚丙烯酸酯。在其他实施方案中,结构的材料包括凝胶或水凝胶。凝胶包含通过流体在其整个体积中膨胀的非流体聚合物。水凝胶是其中溶胀剂是水的凝胶。特别地,水凝胶是(亲水性)聚合物的三维网络,其可以在水中溶胀并且可以容纳大量的水,同时由于个体聚合物链的化学或物理交联而保持其结构。水凝胶可以包含均聚物、共聚物、半互穿网络和互穿网络。
在优选的实施方案中,结构包括表面改性材料,例如表面改性聚合物材料。表面改性包括例如施加涂层,例如蛋白质涂层、包含抗体的涂层、包含脂质的涂层、聚合物涂层或其组合。
材料优选地对于可见光是透明的。材料优选地对于波长在450至650nm范围内的可见光具有至少50%的透射率,或者对于波长在450至650nm范围内的可见光具有至少60%的透射率。
优选地,包含材料和颗粒的结构对于波长在450至650nm范围内的可见光具有至少25%的透射率,对于波长在450至650nm范围内的可见光具有至少35%的透射率,或对于波长在450至650nm范围内的可见光具有至少50%的透射率。
包含材料和嵌入材料中的颗粒的结构可以包括连续或不连续的结构。
结构可以是刚性的或柔性的。柔性结构可以是优选的,因为这样的结构可以适合于贴合待处理的组织的表面。
结构可以是平坦的或平面的,或者结构可以是非平坦的,例如弯曲的。
结构可以具有平坦或非平坦的外表面。
结构可以包括多孔的或无孔的结构。
对于一些应用,多孔结构是优选的,因为它们具有自由表面积As高并且因此可用来暴露于被引入到根据本发明的方法的结构上或附近的细胞的表面积大的优点。优选地,这样的多孔结构具有允许被引入到结构上或附近的细胞部分或完全渗透到孔隙中的孔隙尺寸。优选地,多孔结构具有不限制细胞培养基中存在的分子接近细胞的孔隙尺寸。
结构的孔隙率被定义为结构的孔隙或空隙的体积相对于该结构所占据的总体积(即结构的体积V(材料和嵌入材料中的颗粒的体积)与该结构的孔隙或空隙的体积的总和)的比率。孔隙率可以在0%至100%的范围内。在结构包括多孔结构的情况下,结构的孔隙率优选地为至少50%、至少60%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%。
根据本发明的第一类结构包括膜或箔,其包含嵌入膜或箔中的能够吸收电磁辐射的颗粒。这样的膜或箔例如是无孔的。实例包括聚合物膜或聚合物箔,其包含嵌入聚合物膜或聚合物箔中的能够吸收电磁辐射的颗粒。出于本发明的目的,术语“膜”和“箔”可互换使用。
膜的优选实例包括包含或基于聚苯乙烯、聚己内酯、乙基纤维素、乙酰邻苯二甲酸纤维素、聚乳酸、聚乳酸-共-乙醇酸、纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、明胶、胶原蛋白、蚕丝、藻酸盐、透明质酸、葡聚糖、淀粉、聚碳酸酯或聚丙烯酸酯的聚合物膜,其具有嵌入聚合物膜中的氧化铁颗粒和/或碳颗粒。聚合物膜具有例如在0.1μm至100μm、例如0.1μm至10μm范围内的厚度。
优选地,这样的膜限定第一表面S1和与第一表面S1相对的第二表面S2。第一表面S1限定第一自由表面积AS1并且第二表面S2限定第二自由表面积AS2。第一表面例如是顶表面(限定顶部自由表面积),而第二表面是底表面(限定底部自由表面积)。备选地,第一表面是底表面(限定底部自由表面积),而第二表面是顶表面(限定顶部自由表面积)。
当被照射时,辐射照射到例如第一表面S1上或第二表面S2上。
优选地,第一自由表面积AS1和第二自由表面积AS2具有相同或基本上相同的尺寸。
第一类结构具有例如厚度t、长度l和宽度w。厚度优选地在0.1μm至10μm、例如0.1μm至10μm的范围内。结构的体积V对应于t.l.w或t.AS1。由于第一类结构的长度l和宽度w典型地显著大于结构的厚度t,所以结构的自由表面积AS可以估算为AS1+AS2。被照射的自由表面通常对应于结构的表面中的一个(例如第一表面S1或第二表面S2),并且可以估算为AS1。因此,结构的自由表面积相对于结构的体积的比率(即S/V)对应于1/t。
优选地,第一表面S1或第二表面S2中的至少一个包括至少部分地暴露于结构的自由表面S的颗粒。部分地暴露于第一表面S1或第二表面S2的颗粒中的每一个限定第一表面S1或第二表面S2中的颗粒自由表面P。颗粒自由表面P具有颗粒自由表面积AP。颗粒以这样的方式嵌入材料中,所述方式使得部分地暴露于第一表面S1或部分地暴露于第二表面S2的所有颗粒的颗粒自由表面积AP的总和在自由表面积AS1和自由表面积AS2的总和的0.0001至50%的范围内。更优选地,颗粒以这样的方式嵌入材料中,所述方式使得部分地暴露于第一表面S1或部分地暴露于第二表面S2的所有颗粒的颗粒自由表面积AP的总和在自由表面积AS1和自由表面积AS2的总和的5至25%的范围内或者在自由表面积AS1和自由表面积AS2的总和的15至25%的范围内。
在特别的实施方案中,第一表面S1或第二表面S2中的一个包括至少部分地暴露于结构的自由表面S的颗粒。部分地暴露于第一表面S1的颗粒中的每一个限定第一表面S1中的颗粒自由表面P。颗粒自由表面P具有颗粒自由表面积AP。颗粒以这样的方式嵌入材料中,所述方式使得部分地暴露于第一表面S1的所有颗粒的颗粒自由表面积AP的总和在自由表面积AS1的0.0001至50%的范围内。
在优选的实施方案中,颗粒以这样的方式嵌入材料中,所述方式使得部分地暴露于第一表面S1的所有颗粒的颗粒自由表面积AP的总和在自由表面积AS1的5至25%的范围内或在自由表面积AS1的15至25%的范围内。
根据本发明的第二类结构包括水凝胶,其包含嵌入水凝胶中的能够吸收电磁辐射的颗粒。
优选的水凝胶包含均聚物、共聚物、半互穿网络和互穿网络。聚合物的实例包括聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、甲基丙烯酸2-羟乙酯((HEMA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEG-MA)、甲基丙烯酸(MAA);羧甲基纤维素(CMC);聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、丙烯酰胺/丙烯酸共聚物聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、壳聚糖、丙烯酸酯改性的PEG、丙烯酸酯改性的透明质酸、肝素和胺末端官能化的4-臂星形-PEG。交联剂的实例包括聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯(TEGDMA)、四(乙二醇)二甲基丙烯酸酯和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺。
颗粒包括例如氧化铁颗粒和/或碳颗粒。
根据本发明的第三类结构包括多孔结构,其包含材料和嵌入材料中的能够吸收电磁辐射的颗粒。实例包括多孔聚合物结构,其中颗粒嵌入多孔聚合物结构中。多孔结构的实例包括包含纤维(例如聚合物纤维)的结构、包含微粒(particulate)(例如聚合物微粒)的结构、包含纤维和微粒的组合(例如聚合物纤维和/或聚合物微粒的组合)的结构以及包含泡沫(例如聚合物泡沫)的结构。纤维和/或微粒可以是互连的或不互连的。微粒例如聚合物微粒可以包括球形微粒以及不规则形状的微粒。嵌入多孔结构中的颗粒包括例如氧化铁颗粒和/或碳颗粒。
第三类结构的第一实例是包含(聚合物)纤维的结构。(聚合物)纤维具有例如在0.1μm至10μm范围内的纤维直径,例如0.5μm或1μm的直径。(聚合物)纤维可以是互连的或不互连的。(聚合物)纤维可以通过本领域已知的任何技术获得。一种用于制造(聚合物)纤维的优选技术是静电纺丝。备选技术包括湿纺丝、熔体纺丝、挤出纺丝、干喷湿纺丝、乳液纺丝和悬浮液纺丝。聚合物的优选实例包括聚苯乙烯纤维、聚己内酯纤维、乙基纤维素纤维、乙酰邻苯二甲酸纤维素纤维、聚乳酸纤维和聚乳酸-共-乙醇酸基纤维。(聚合物)纤维可以被表面改性。
由于(聚合物)纤维可以被认为是长圆柱体,其中直径对应于纤维直径d纤维并且长度对应于纤维的长度L纤维,所以纤维的体积V纤维对应于并且纤维的自由表面积S纤维对应于πd纤维L纤维。因此,自由表面积S纤维与体积V纤维的比率对应于4/d纤维。
第三类结构的第二实例是包含聚合物微粒例如聚合物(微)球的结构。微粒具有例如在0.1μm至10μm范围内的微粒直径,例如0.5μm或1μm的直径。聚合物微粒可以是互连的或不互连的。(聚合物)微粒可以通过本领域已知的任何技术获得。微粒的优选实例包括聚苯乙烯、聚己内酯、乙基纤维素、乙酰邻苯二甲酸纤维素、聚乳酸、聚乳酸-共-乙醇酸基纤维。聚合物微粒可以被表面改性。
在微粒是具有直径dms的微球的情况下,微球的体积Vms对应于并且微球的自由表面积Sms对应于/>因此,自由表面积Sms相对于微球的体积Vms的比率为6/dms。
如上所提及的,根据本发明的方法包括使结构和至少一个细胞彼此处于小于100μm的距离d的步骤。
至少一个细胞包括例如多个细胞,例如包含细胞的悬浮液或细胞的组织。
通过使至少一个细胞在结构上或靠近结构或者通过使结构靠近至少一个细胞,可以使结构和至少一个细胞彼此处于距离d。
例如,通过在结构上或附近、特别是在结构的自由表面S上或附近施加包含细胞的悬浮液,将细胞引入到结构上或附近。细胞可以连续地引入到结构上或附近,或者不连续地引入到结构上或附近。
悬浮液中的细胞的浓度优选地在1至106个细胞/mL、例如103至105个细胞/mL的范围内。
在优选的方法中,将悬浮液(即悬浮液的细胞)在结构上或附近在一定时间段期间进行培养。
在备选的方法中,在将细胞引入到结构上或附近后立即或不久通过用电磁辐射激活结构来处理细胞。
在本发明的实施方案中,在结构上或附近引入至少一个细胞之后,可以在照射步骤前(即之前)温育至少一个细胞,例如在一分钟以上期间或者在一小时以上期间。
备选地,可以例如通过将结构施加在包含细胞的组织上或施加在与包含细胞的组织的短距离处来使结构靠近至少一个细胞,从而使结构的自由表面S与细胞接触或处于与细胞的距离d处。
优选地用电磁辐射、例如用脉冲辐射源来照射结构并且特别是部分地暴露于结构的自由表面S的颗粒,尽管也可以考虑通过连续波辐射源进行照射。
术语“辐射”和“电磁辐射”在本文中可以互换使用。
辐射源的波长范围可以为从紫外区域到红外区域。在优选的方法中,所使用的辐射的波长范围在可见光至红外区域内,包括近红外区域。
电磁辐射可以由激光器诸如脉冲激光器生成。激光照射,诸如通过脉冲激光器(例如皮秒、飞秒和/或纳秒脉冲激光器)的照射,可以与根据本发明实施方案的结构组合以有效地透化细胞的屏障,例如通过激光诱导的蒸汽纳米泡生成。虽然激光照射可以是有利的,但不是必需地排除通过另一种(强)光源的照射来实现相同或相似的效果。
辐射源的波长范围可以为从紫外区域到红外区域。在优选的方法中,所使用的辐射的波长范围在可见光至近红外区域内。
当使用脉冲辐射源时,脉冲的持续时间优选地在1fs至1ms的范围内,例如在1fs至100μs的范围内、在10fs至10μs的范围内、在100fs至1μs或在1ps至100ns的范围内。
激光脉冲可以由1至1000个激光脉冲、诸如1至500个激光脉冲、1至100个激光脉冲、1至20个激光脉冲或1至10个激光脉冲(每个细胞或每个细胞样品)组成。激光脉冲的数量可以例如取决于光响应性有机颗粒和细胞的类型。
辐射源的每个脉冲的能量密度(每单位面积传递的电磁能量)优选地在0.0001J/cm2至1000J/cm2,例如0.001J/cm2至100J/cm2、0.01J/cm2至10J/cm2、0.1J/cm2至10J/cm2,例如0.1J/cm2、1J/cm2或5J/cm2的范围内。
根据本发明的方法的一个优点是减少或避免嵌入结构中的颗粒的破碎或释放。ICP-MS分析表明,未释放出可检测量的颗粒的材料。
根据本发明的方法的另一个优点是方法的空间分辨率允许透化和/或破碎单个细胞。
根据本发明的方法的又一个优点是不需要结构和细胞之间、特别是颗粒和细胞之间的直接接触以透化和/或破碎细胞,从而减少或避免颗粒或颗粒的碎片被细胞摄取。
根据本发明的方法的又一个优点是结构的易于制造。
如本文中教导的方法也可以用于选择性地透化和/或破碎人体或动物体的一个或多个细胞。
根据本发明的第二方面,提供了一种如上所述的结构,其用于在光热过程中使用以选择性地透化和/或破碎接触或靠近结构的细胞。结构包含材料并且包含能够吸收电磁辐射的颗粒。结构限定体积V和自由表面S。自由表面S具有自由表面积AS。颗粒嵌入材料中。颗粒的至少一部分被部分地暴露于自由表面S。部分地暴露于自由表面S的颗粒中的每一个限定自由表面S中的颗粒自由表面P。颗粒自由表面P具有颗粒自由表面积AP。颗粒以使得所有颗粒的颗粒自由表面积AP的总和在自由表面积AS的0.0001至50%范围内的方式嵌入材料中。
光热过程包括以下步骤:
-使结构和至少一个细胞彼此处于小于100μm的距离d,距离d为至少一个细胞与结构之间的最短距离,特别是至少一个细胞与结构的自由面积表面S之间的最短距离;
-用电磁辐射照射结构以选择性地透化和/或破碎至少一个细胞。
根据本发明的结构特别适合在受试者的治疗方法中的光热过程中使用以选择性地透化和/或破碎受试者的细胞,所述方法包括:
-使结构与受试者的至少一个细胞处于小于100μm的距离d,距离d是受试者的至少一个细胞与结构之间的最短距离,特别是至少一个细胞与结构的自由面积表面S之间的最短距离;
-用电磁辐射照射结构以选择性地透化和/或破碎至少一个细胞。
至少一个细胞优选地包括细胞的悬浮液或细胞的组织。组织的实例包括眼组织或皮肤组织。特别的实例包括肿瘤边缘。
治疗的方法包括例如纳米外科手术。特别的治疗包括杀伤或消融角膜细胞。
如本文中教导的结构和方法允许对受试者的疾病或病况进行治疗,诸如激光辅助治疗。
术语“受试者”、“个体”或“患者”在本文中可以互换使用,并且典型地且优选地表示人类,但是也可以涵盖提及非人类动物,优选地温血动物,甚至更优选地哺乳动物。
上述结构中的任一个都可以考虑在受试者的治疗方法中的光热过程中使用以选择性地透化和/或破碎受试者的细胞,所述方法包括
电磁辐射可以由上述的任何源生成。优选地,电磁辐射包括由激光器生成的脉冲辐射。
在优选的方法中,在照射之前,使根据本发明的结构与细胞(例如与细胞的组织)处于近距离。这样的方法被称为“细胞顶部上的结构”。在这样的方法中,结构在照射后可以容易地移除。
在特别优选的方法中,在照射之前,使膜(例如包含能够吸收电磁辐射的颗粒的聚合物膜)与细胞(例如与细胞的组织)处于近距离(“细胞顶部上的膜”)。
在备选的方法中,在照射之前,将细胞施加到结构上,例如在结构上生长。这样的方法被称为“结构顶部上的细胞”。
在特别优选的方法中,在照射之前,将膜、细胞施加在膜上,例如施加在包含能够吸收电磁辐射的颗粒的聚合物膜上(“膜顶部上的细胞”)。细胞例如在膜上生长,例如在包含能够吸收电磁辐射的颗粒的聚合物膜上生长。
附图说明
下面将参照附图更详细地讨论本发明,其中:
-图1a示出了根据本发明的用于选择性地透化和/或破碎细胞的结构的示意图;
-图1b示出了图1a中示出的结构的横截面图,其中细胞位于距结构的距离d处;
-图2和图3示意性地示出了根据本发明的用于选择性地透化和/或破碎细胞的方法,其中如图2所示细胞在膜上生长(“膜顶部上的细胞”),并且如图3所示将膜施加到细胞层上(“细胞顶部上的膜”);
-图4示出了一种方法,其中在用脉冲激光照射之前将包含颗粒的结构施加到牛眼的角膜上;
-图5示出了PLA膜中的颗粒簇的平均尺寸与IONP的浓度的函数关系;
-图6示出了PLA膜中的簇密度(颗粒簇数量/100μm2)与IONP浓度的函数关系;
-图7示出了在分别用0.3J/cm2和1.6J/cm2的单激光脉冲照射PLA-IOC膜(0.1%ION,2%PA)之前和之后通过暗视场显微镜获得的图像;
-图8示出了在具有不同浓度的IONP的PLA-IOC膜上生长的每个Hela细胞的簇数量;
-图9示出了在具有0.1%IONP的PLA膜上生长的Hela细胞的FD500的摄取、细胞活力和rMFI(相对平均荧光强度);
-图10示出了通过共焦显微镜获得的图像,其示出了在用0.3J/cm2的单激光脉冲照射的具有0.1%IONP的PLA膜上生长的FD500的摄取;
-图11示出了在单次照射后作为激光能量密度的函数的在PLA-IOC膜(不具有或具有0.1%IONP)上生长的Hela细胞的细胞活力;
-图12示出了在用1个或2个0.3J/cm2的激光脉冲照射的PLA-IOC膜(0.1%IONP)上生长的Hela细胞的细胞活力;
-图13示出了在用处于不同激光能量密度的单脉冲照射的PLA-IOC膜(2%PLA、0.1%IONP)的预定区域(直径为6.5mm的圆圈)的选择性辐射(比例尺为1000μm);
-图14示出了在如图13所示的选择性辐射后取得的细胞的百分比与不同激光能量密度的函数关系;
-图15示出了在如图13所示的选择性辐射后的活细胞(用钙黄绿素AM染色)与死细胞(用碘化丙啶(PI)染色)的比率与不同激光能量密度的函数关系;
-图16示出了PLA-IOC膜(2%PLA,0.1%IONP)的局部照射后的选择性细胞杀伤(比例尺为10μm);
-图17示出了在用单激光脉冲(0.3-1.3J/cm2)照射的PLA-IOC膜(2%PLA,0.1%IONP)上生长的细胞的单个细胞消融的成功率。对于每个激光能量密度值,进行30次单个细胞消融实验(n=30);
-图18示出了用PLA-IOC膜(2%PLA,0.1%IONP)覆盖的Hela细胞的空间选择性激光诱导杀伤;
-图19示出了如图18所示的用PLA-IOC(2%PLA,0.1%IONP)覆盖的Hela细胞的照明结果,其按照预定义的图案(根特大学徽标)用脉冲激光照明,用钙黄绿素AM、PI染色以及合并的图片。比例尺为1000μm;
-图20和图21分别示出了在使用1.6J/cm2的激光能量密度的连续数量的激光脉冲后,如图18所示的处理区域中的活细胞与死细胞的比率以及细胞总量;
-图22是在PLA-IOC膜位于细胞顶部上(如图18所示)(左图)时的细胞杀伤期间的孔隙形成的示意图,以及在辐射(1.6J/cm2;连续4次)后Hela细胞对FD500的所得摄取(右图);
-图23示出了对在PLA-IOC膜的连续4次照射(1.6J/cm2)后的Hela细胞的ICP-MS分析(铁含量);“细胞”是指未经处理的细胞;“IONP”和“IONP+激光”是指分别在未进行或进行激光处理的情况下在游离IONP(1g/L)存在下的细胞;“PLA-IOC”和“PLA-IOC+激光”涉及分别在未进行或进行激光处理的情况下覆盖有PLA-IOC膜的细胞。数据显示为平均值±SD。统计学显著性:学生t检验,*表示p<0.05,**表示p<0.01,ns表示非显著性的;
-图24示出了覆盖有PLA-IOC膜(2%PLA,0.1%IONP)的牛角膜中的细胞的激光诱导杀伤。将角膜切除并且用碘化丙啶染色。将剜除的牛眼的整个角膜用1.6J/cm2的激光脉冲照射4次;
-图25示出了与对照实验(没有IOC的PLA膜)相比,使用PLA-IOC膜,图24所示的激光诱导细胞杀伤所产生的染色细胞(死细胞)的数量;
-图26示出了覆盖有PLA-IOC膜(2%PLA,0.1%IONP)的牛角膜中的细胞的激光诱导杀伤。将角膜切除并且浸入FD500溶液中。IOC膜(2%PLA,0.1%IONP)。将剜除的牛眼的整个角膜用1.6J/cm2的激光脉冲照射4次;
-图27示出了与对照实验(没有IOC的PLA膜)相比,使用PLA-IOC膜,图26所示的激光诱导细胞杀伤所产生的FD500的摄取;以及
-图28示出了牛眼的角膜上皮,其用钙黄绿素染色,分离并置于PLA-IOC膜的顶部上,随后以1.6J/cm2和4.5J/cm2的能量密度照射单个细胞四次。
具体实施方式
将关于特别实施方案并且参考某些附图来描述本发明,但是本发明不限于此而仅受权利要求限制。附图仅仅是示意性的并且是非限制性的。出于举例说明的目的,附图中的一些要素的尺寸可能被夸大并且未按比例绘制。尺寸和相对尺寸并不对应于用于本发明实践的实际缩图。
当提及范围的端点时,包括范围的端点值。
当描述本发明时,除非另有说明,否则所使用的术语根据以下定义进行解释。
说明书以及权利要求中使用的术语“第一”、“第二”等用于区分相似的要素,而不是必需地描述在时间上、空间上、排序或任何其他方式方面的顺序。应当理解,如此使用的术语在适当的情况下是可互换的,并且本文描述的本发明的实施方案能够以不同于本文描述或例示的其他顺序来操作。
当列出两个或更多个项目时,术语“和/或”意指可以采用所列项目中的任何一个本身,或者可以采用所列项目中的两个或更多个的任何组合。
术语“面积”是指平面中的平坦表面的尺寸(即二维物体的尺寸)的测量结果。
术语“表面积”是指三维形状物体的表面的尺寸的测量结果。
术语“细胞”是指所有类型的生物细胞,包括真核细胞和原核细胞。细胞可以是指人类细胞、动物细胞和植物细胞。
术语“破碎”是指将某物打碎、切割或以其他方式分离成碎片的任何方式。破碎细胞是指将细胞打碎、切割或以其他方式分离成碎片的任何方式,并且包括细胞的杀伤和细胞的消融。
术语“增加……的渗透性”、“透化(permeabilize/permeabilizing/permeabilization)”是指至少部分地或局部地改变细胞的渗透性、特别是细胞的膜或屏障(例如细胞的质膜)的渗透性的任何方式。在透化后,膜或屏障(例如细胞的质膜)以使得其对于一种或多种类型的化合物(例如分子、大分子、颗粒或纳米颗粒)更具渗透性的方式改变。
术语“穿孔(perforate/perforating/perforation)”是指提供具有一个或多个开口、孔或孔隙的膜或屏障(例如细胞的质膜)的任何方式。通过对膜或屏障(例如细胞的质膜)进行穿孔,在膜或屏障(例如细胞的质膜)中产生开口,从而允许化合物(诸如分子、大分子、颗粒或纳米颗粒)越过膜或屏障(例如越过细胞的质膜)的传输。
出于本发明的目的,术语“增加……的渗透性”、“透化(permeabilize/permeabilizing/permeabilization)”以及术语“穿孔(perforate/perforating/perforation)”可互换使用。类似地,术语“开口”、“孔”和“孔隙”可以互换使用。
术语“蒸汽泡的生成”包括蒸汽泡的膨胀、蒸汽泡的坍塌或者蒸汽泡的膨胀和坍塌的组合以及可能是泡膨胀和坍塌的结果的次级效应,诸如压力波和周围介质的流动。
术语“蒸汽泡”或“泡”是指蒸汽纳米泡和蒸汽微米泡。优选地,术语“蒸汽泡”或“泡”是指直径在10nm至100μm范围内的蒸汽泡。蒸汽泡包括水蒸汽泡,但是实施方案不限于此。
实验结果
实施例1
图1a示出了根据本发明的结构10的一个实施方案,结构10包括包含聚合物材料11和能够吸收电磁辐射的颗粒12的膜。颗粒的一部分被部分地暴露于一个表面,例如结构的顶表面13。颗粒以这样的方式嵌入,所述方式使得所有颗粒的颗粒自由表面积AP的总和在自由表面积As的0.0001至50%、更优选地自由表面积As的5至25%或自由表面积As的15至25%的范围内。更特别地,颗粒以这样的方式嵌入,所述方式使得所有颗粒的颗粒自由表面积AP的总和在顶部自由表面积AS1的0.0001至50%、更优选地自由表面积AS1的5至25%或自由表面积AS1的15至25%的范围内。
图1b示出了图1a的结构,其中一个细胞15或多个细胞15处于距结构10的短距离d处。
下面描述的示例包括聚乳酸(PLA)作为结构的材料并且包括氧化铁颗粒作为能够吸收电磁辐射的颗粒。
显然,也可以考虑其他材料和其他颗粒。为了评价在这样的结构的表面处生成的蒸汽泡是否可以透化和/或破碎接触的细胞或处于距一个细胞或多个细胞的短距离d处的细胞(图1b),进行了两种类型的实验:
-将细胞在结构的顶部上生长,并且将结构(更特别地结构中的颗粒)用(脉冲)电磁辐射照射(“结构顶部上的细胞”)(图2);
-将结构施加到细胞层上,并且将结构(更特别地结构中的颗粒)用(脉冲)电磁辐射照射(“细胞顶部上的结构”)(图3)。
此外,将包含颗粒的结构施加到牛眼的角膜上并且用脉冲激光照射(图4)。
1.材料和方法
1.1材料
尺寸为50-100nm的氧化铁(Fe3O4)纳米颗粒(IONP)、分子量(Mw)为80kDa的聚乳酸(PLA)、500kDa的FITC-葡聚糖和氯仿均购自Sigma-Aldrich(比利时)。钙黄绿素AM和碘化丙啶(PI)购自Fisher Scientific(USA)。购自Promega(USA)。
1.2PLA-IOC(氧化铁簇)膜的制备
通过一步旋涂法来制备具有或不具有IONP的PLA膜。在置于旋涂装置中央的方形盖玻片(22mm×22mm)上制备膜。简言之,将IONP分散在PLA溶液中(2%、4%和8%(w/v),于氯仿中);PLA溶液中的IONP的浓度在0.01%、0.1%和0.2%(w/v)之间变化。首先用尖端超声波仪(Branson数字超声波发生器,Danbury,USA)以10%的振幅对IONP-PLA分散体进行超声处理达1分钟。接下来,将0.5mL的分散体施加到置于旋涂装置中央的盖玻片上。将旋涂的速度和时间分别设定在2000rpm和20秒。在旋涂后,将膜置于50℃的烘箱中过夜,以允许蒸发任何残留有机溶剂。
为了制备荧光PLA-IOC膜,将PLA(2%,w/v)和罗丹明B(0.01%w/v)(Sigma-Aldrich,比利时)溶解在氯仿中过夜。然后,将氧化铁纳米颗粒(0.1%w/v)添加到PLA-罗丹明B溶液中。接下来,如以上段落中所述制备PLA-罗丹明B膜。
1.3PLA-IOC膜的表面形态
PLA-IOC膜的表面形态通过扫描电子显微镜(SEM,FEIQuanta 200F(ThermoScientific))进行表征。SEM图像是在20kV的加速电压下获得的。应注意的是,取决于IONP的浓度,可以观察到不同尺寸的氧化铁簇(IOC)。
由于氧化铁颗粒以氧化铁颗粒的簇(IOC)的形式布置,所以膜被称为PLA-IOC膜(而不是PLA-IONP膜)。IOC的尺寸和分布是基于SEM图像计算的。
1.4蒸汽泡(VNB)的激光诱导形成和VNB阈值
为了评价PLA-IOC膜是否具有生成VNB的能力,将它们用脉冲激光(HE 355LD激光器,OPOTEK Inc.;7ns,561nm)照射。VNB由于在其生存期期间散射光而可以容易地通过暗视场显微镜可视化。在用具有不同能量密度的激光脉冲照射膜之前和期间记录膜(覆盖有薄的水层)的暗视场图像。“VNB阈值”(其是90%的IOC形成VNB的单个激光脉冲的能量密度)通过绘制作为激光能量密度的函数的泡数量来确定。
1.5细胞培养
Hela细胞(CCL-2TM)在补充有10%胎牛血清(FBS,Biowest)、2mM谷氨酰胺和100U/mL青霉素/链霉素(Gibco-Invitrogen)的DMEM/F-12(Gibco-Invitrogen)中进行培养(在37℃和5%CO2下)。为了***,将细胞首先用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤,然后使用胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco-Invitrogen)脱离。
对于“顶部上的细胞”实验(图2),将Hela细胞接种在6孔板中的孔底部处存在的PLA-IOC膜的顶部上;Hela细胞浓度为1×106个细胞/mL;在每个孔中施加2mL的细胞。在温育一天后,将细胞粘附于其上的PLA-IOC膜从其最初的孔中取出并且置于(6孔板的)新孔中;这是为了移除不与膜接触而仅粘附至孔的塑料底部的细胞。
对于其中将PLA-IOC膜置于细胞顶部上(“细胞顶部上的结构”)的实验(图3),将Hela细胞以0.5×106个细胞/mL的浓度接种在6孔板的孔中(2mL)。在第二天,用PLA-IOC膜覆盖孔中的Hela细胞。为了使细胞与膜之间的接触最大化,在施加膜之前移除90%的细胞培养基,使得仅一小层的培养基保留在细胞的顶部上。
1.6通过暴露于脉冲激光的PLA-IOC膜的细胞杀伤
如上所述,将细胞接种到PLA-IOC膜上或将细胞用PLA-IOC膜覆盖。
然后用纳秒脉冲激光(脉冲持续时间<7ns,532nm波长)照射PLA-IOC膜。使用电扫描仪以允许快速扫描激光束,使得每个位置基本上接收单个激光脉冲(或在相邻点之间的重叠区域中的两个激光脉冲);6孔板的孔中的PLA-IOC膜的整个表面的单次扫描花费大约2分钟。在一些情况下,如本文中指出的,将膜扫描多次。
通过使用测定测量细胞的代谢活性来评价通过暴露于光脉冲的PLA-IOC膜的细胞杀伤的程度。测定是如制造商所推荐进行的,但是具有一些细微的修改。简言之,在用光脉冲处理PLA-IOC膜上的细胞后,将它们置于细胞温育器中达2小时,以允许具有足够的时间以死亡。在2小时后,移除细胞培养基并且更换为补充有1mL的CellTiter-Glo溶液的1mL新细胞培养基(DMEM/F-12)。然后将孔板在室温下放在120rpm的摇床上,持续10分钟。最后,将150μL的上清液转移到96孔板的孔中,并且利用微板读数器(Victor 3,PerkinElmer)测量吸光度。
1.7测量细胞膜的透化
为了评价在PLA-IOC膜上施加激光脉冲透化细胞的膜达到何种程度,如上所述,将细胞接种到PLA-IOC膜上或将细胞用PLA-IOC膜覆盖。在细胞在膜上生长的情况下,添加含有浓度为2mg/mL的FITC-葡聚糖(分子量500kDa;FD500)的1mL DMEM/F-12细胞培养基。在将膜施加在细胞的顶部上的情况下,在施加膜之前将300μl的含有FD500(2mg/ml)的DMEM/F-12细胞培养基添加到细胞上。用激光束(如上所述;以0.3J/cm2或1.6J/cm2的能量密度)扫描膜(的整个表面),并且将细胞用DPBS彻底清洗数次,以移除多余的FD500。然后将细胞进行胰蛋白酶处理(使用0.25%胰蛋白酶溶液)并且用细胞培养基中和。收集细胞的悬浮液并且通过离心洗涤数次(500g;5分钟)。最后,将沉淀重悬于流动缓冲液(DPBS、1%牛血清白蛋白(BSA)和0.1%NaN3)中。FD500的胞质递送(其仅在膜透化后发生)通过流式细胞术(Cytoflex,Beckman Coulter,Krefeld,德国)测量;荧光染料在488nm处激发,而荧光强度在530nm处检测(带通滤波器530/30)。
1.8通过暴露于脉冲激光的PLA-IOC膜的空间选择性细胞杀伤
在第一组实验中,将Hela细胞在6孔板中接种在PLA-IOC膜(0.1%IONP)的顶部上。在预定区域中将能量密度渐增的激光脉冲施加到膜上。在激光照射后,将PLA-IOC膜上的细胞置于温育器(37℃,5%CO2)中,持续2小时。然后向每个孔中加入1μl的钙黄绿素AM(0.5mmol)和10μl碘化丙啶(1mg/ml)。钙黄绿素AM用于对活细胞进行染色,而碘化丙啶用于对死细胞进行染色。在温育10分钟后,通过共焦显微镜(C1-si,Nikon,日本)对细胞进行成像。评价经处理的区域中的细胞杀伤的程度。
在第二组实验中,将PLA-IOC膜(不具有或具有0.1%IONP)施加到如上所述接种的Hela细胞的顶部上。根据预定图案(类似于根特大学的徽标)以1.6J/cm2进行四次连续的激光照射。在激光扫描后,将2mL DMEM/F-12添加到孔中,并且小心地将膜从细胞中取出。30分钟后,加入2μl钙黄绿素AM(0.5mmol)和20μl碘化丙啶(1mg/ml)以对活细胞和死细胞进行染色。
1.9通过暴露于脉冲激光的PLA-IOC膜的单个细胞杀伤
为了评价用脉冲激光照射PLA-IOC膜允许特异性杀伤选定的靶细胞(“单个细胞杀伤”)达到何种程度,如上所述,将细胞接种在PLA-IOC膜的顶部上。首先,通过向每个孔中添加2μl的钙黄绿素AM(0.5mmol)来对(活)细胞进行染色。然后随机选择单个细胞作为靶标并且通过荧光显微镜成像。随后将一个激光脉冲(变化的能量密度)施加到靶细胞上。30分钟后,将10μL碘化丙啶(1mg/ml)添加到每个孔中,并且通过荧光显微镜再次对细胞进行成像。使用ImageJ软件来分析细胞的红色和绿色荧光。孔中的细胞也通过透射显微镜成像;记录影片并且通过ImageJ软件处理。
1.10电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测量
如上所述,将Hela细胞接种到6孔板中。在不进行激光处理的情况下,将细胞培养基(1.5ml)、游离IONP的悬浮液(1.5ml;1g/l)或PLA-IOC膜(在膜和细胞之间保留非常薄的介质层)添加/施加至孔中的细胞/在孔中的细胞上。20分钟温育(37℃,5%CO2)后,移除孔中的细胞培养基/游离IONP(或)膜。然后向每个孔中加入1.5mL硝酸(65%)持续10分钟以消化细胞。10分钟后,从每个孔中收集1mL用于ICP-MS分析。
为了测量激光处理的效果,在施加细胞培养基/游离IONP/PLA-IOC膜(参见以上段落)后20分钟,将每个孔扫描四次(1.6J/cm2)。在激光处理后,移除膜并且将孔用新鲜细胞培养基轻轻洗涤两次。随后,向每个孔中加入1.5mL硝酸(65%)持续10分钟。在细胞消化后,从每个孔中收集1mL溶液用于ICP-MS分析。
使用Agilent 8800ICP-MS/MS仪器(ICP-QQQ,Agilent Technologies,日本)进行铁(Fe)的(超)痕量元素测定。进样***包括安装在珀尔帖冷却(2℃)的Scott型喷雾室上的同心雾化器(400μL min-1)。该仪器配备有串联质谱配置,其由两个四极单元(Q1和Q2)和位于两个四极滤质器之间的碰撞/反应池(CRC)组成(Q1-CRC-Q2)。作为对池内化学的显著更好控制(化学分辨率)的结果,与传统的单四极ICP-MS仪器相比,MS/MS模式提供了另外的用于以更直接的方式处理光谱重叠的手段。在这项工作中,CRC用NH3/He(在He中的10%NH3)混合物加压,以克服严重妨碍Fe的(超)痕量元素测定的光谱干扰,诸如40ArO+和40CaO+多原子干扰信号之间的重叠和质荷比-m/z-56的最丰富Fe同位素(56Fe+,91.7%)的那些。为了克服光谱重叠,在引入3.0mL min-1的NH3/He后,将56Fe+离子质量位移到56Fe(NH3)2+反应产物离子。在质量位移后,可以在新产生的反应产物离子(56Fe(NH3)2+,m/z=90)的m/z比率处不受光谱干扰地检测56Fe+。
对于ICP-MS/MS分析,仅使用高纯度试剂。超纯水(电阻率18.2MΩcm)获自Milli-QElement水净化***(Millipore,法国)。原分析纯度水平14MHNO3(Chem-Lab,比利时)通过亚沸蒸馏进一步纯化,并且将超纯9.8MH2O2(Sigma Aldrich,比利时)用于样品消化。将Fe和Ga(Inorganic Ventures,USA)的1g L-1单元素标准溶液的适当稀释物用于方法开发、优化和校准目的。对于Fe的定量元素测定,依赖于外部校准作为校准方法(0、0.5、1.0、2.5、5.0、10和20μg L-1Fe)。使用5.0μg L-1的Ga作为内标以校正仪器不稳定性、信号漂移和基质效应。
在用于ICP-MS/MS分析的样品制备之前,将所有样品从Eppendorf管转移至TeflonSavilex烧杯,所述烧杯已用HNO3和HCl预清洁并且随后用Milli-Q水漂洗。在蒸发至干燥(80℃)后,在热板上于110℃下,经由利用750μL的14M HNO3和250μL的9.8M H2O2的混合物的酸消化来消化样品,持续大约18小时。在ICP-MS/MS分析之前,将消化的样品在Milli-Q水或HNO3中适当稀释(最终酸浓度范围为0.35至0.70M HNO3)。为了避免污染,仅使用无金属的管用于标准品和样品制备(15或50mL聚丙烯离心管,VWR,比利时)。完整的样品制备程序(包括消化和充分稀释)在10级洁净室中进行。
1.11通过暴露于脉冲激光的PLA-IOC膜的浅层角膜细胞的杀伤
新鲜切除的牛眼是从当地屠宰场(Flanders Meat Group,Zele)收集的。在剜除后,在运输期间将眼睛保持在不依赖CO2的冷培养基(Gibco-Invitrogen)中,并且在一小时内进行加工。移除多余的组织并且将眼睛在冷DMEM中清洗。使用具有或不具有0.1%IONP(w/v)的PLA膜(2%PLA)。将PLA-IOC膜置于具有30mm微孔的55mm玻璃底培养皿中(Cellvis,USA),并且用3mL细胞培养基填充。随后,将眼睛转移到培养皿中并且用石蜡膜固定以使其固定化,从而确保角膜与PLA-IOC膜紧密接触。为了了解施加激光脉冲是否透化角膜细胞的膜,在细胞培养基中补充了FD500(4mg/mL)。
用能量密度为1.6J/cm2的脉冲激光对整个角膜进行重复(4次)扫描。在照射后,将眼睛用DPBS清洗3次。为了评估杀伤效率,将眼睛置于新培养皿中,补充了含有碘化丙啶(0.01mg/ml)的新鲜DMEM/F-12培养基,并且在室温下温育15分钟。
最后,使用环锯刀片(Beaver Visitec International,Abingdon,UK)将12mm的纽扣打入角膜中。将由此分离的角膜组织置于玻璃底皿上(其中上皮侧朝下)并且通过共焦显微镜(Nikon A1R)成像。记录步长为1μm的Z堆栈,并且使用可用软件获得3D图像。
对于空间选择性细胞杀伤实验,从新鲜牛眼中移除多余的组织,并且将眼睛在DPBS中清洗。将钙黄绿素AM的溶液(5μg/ml)施加在角膜水平处以对活的上皮细胞进行染色,并且将眼睛在室温下温育10分钟。然后将眼睛在DPBS中清洗三次并且使用环锯刀片来分离角膜。然后将角膜置于膜PLA-IOC膜的顶部上。可以通过荧光显微镜观察上皮细胞,并且在用激光(561nm;<7ns)照射之前将单个细胞作为靶标。
2.结果
2.1PLA-IOC膜的物理化学表征
为了能够靶向细胞培养物(或组织)中的每个单个细胞,理想地,每个单个细胞应与至少一个IOC接触/密切靠近。因此,要求IOC在PLA膜中的良好受控分布。PLA膜的SEM成像表明,IONP作为簇(IOC)嵌入膜内;一些IOC部分地从膜中突出。膜中的IOC的平均尺寸和分布取决于IONP浓度。事实上,较高浓度的IONP(对于固定浓度的PLA)导致较大的簇(图5)。对于0.1%IONP的浓度,簇密度等于5.6±2.4IOC/100μm2,而在较高IONP浓度下簇密度较低(图6),这可以通过较大簇的形成来解释。
2.2通过PLA-IOC膜的激光诱导蒸汽泡形成
为了评价向PLA-IOC膜施加脉冲激光是否导致在膜表面处形成蒸汽泡(VNB),用分别为0.3J/cm2和1.6J/cm2的单个激光脉冲照射PLA-IOC膜。用这样的激光脉冲照射PLA-IOC膜(0.1%ION,2%PA)产生VNB,因为通过暗视场显微镜检测到(散射)光的局部闪光(图7)。从不具有IOC的PLA膜中无法观察到VNB。在较低能量密度下,VNB的数量明显低于在较高能量密度下的数量。
随后,测量了作为激光脉冲能量密度的函数的VNB的数量,并且PLA-IOC膜(0.1%IONP;2%PLA)的VNB阈值(通常定义为90%(T90)的IOC形成VNB时的激光能量密度)被测定为0.56J/cm2。对应于10%的IOC导致形成VNB时的激光能量密度的T10被测定为0.1J/cm2。对于低于T10的能量密度,生热占主导(加热模式);在T10和T90之间同时产生约束热量和气泡;对于高于T90的能量密度,VNB形成是占主导的光热效应(泡模式)。
对于接下来的实验,选择了含有0.01%IONP的PLA膜。也具有吸引力的是,这样的PLA-IOC膜与不具有IOC的PLA膜一样透明。
2.3通过暴露于脉冲激光的PLA-IOC膜的细胞杀伤
随后,评价了PLA-IOC膜杀伤生长在膜表面上的Hela细胞(“顶部上的细胞”)的能力(图2)。膜中的IOC可以容易地观察到,因为它们强烈地散射光(氧化铁的折射率为2.9)。基于在PLA-IOC膜上生长的细胞的图像,估计当膜中的IONP的浓度等于0.1%时,每个细胞与4.6+/-0.5IOC接触(图8);在较低(0.01%)浓度的IONP下,每个细胞与1.2+/-0.4IOC接触。
图9示出了当膜用低能量密度的激光扫描(单次扫描;0.3J/cm2)时,在具有0.01%IONP的PLA-IOC膜上生长的(大多数)细胞存活(如通过流式细胞术测量的;钙黄绿素AM染色)。在PLA膜中的较高量的IONP(0.1%)的情况下并且在相同的能量密度下,大量的细胞被杀伤(细胞活力52.8±12.6%)。还要注意的是,在不具有IONP的PLA膜上生长的所有细胞均在激光处理下存活。为了可视化在激光照射(这可能引起细胞杀伤)后细胞膜渗透性的变化,将荧光葡聚糖(FD500)添加到细胞中。由于其具有大尺寸(约30nm),FD500不会扩散越过细胞膜,并且因此已报道为良好地适合评估质膜的显著渗透性变化。如图9和图10所示,在用激光脉冲照射PLA-IOC膜后,FD500进入到Hela细胞中;要注意的是,对于不具有IONP的PLA膜,FD500不会进入细胞。
随后,评价了如何可以通过分别使用较高的激光能量密度和膜的重复激光扫描来最大化细胞的杀伤。如图11所示,增加激光能量密度提高了PLA-IOC膜的细胞杀伤能力:在激光能量密度为0.8J/cm2时,细胞活力下降至30%。对于不会诱导任何细胞杀伤的不具有IOC的PLA膜来说,情况并非如此(即使在1.6J/cm2的极高激光能量密度下也并非如此)。由于观察到IOC在单个激光脉冲下存活(即不会破碎),所以推测施加第二脉冲可以进一步增强膜的细胞杀伤能力。为了确保可以观察到第二脉冲的效果,选择了0.3J/cm2的(低)能量密度,因为在0.3J/cm2的单个脉冲后,大约50%的细胞仍然存活。因此,将膜在0.3J/cm2的能量密度下连续扫描2次。如从图12可以看出的,细胞活力从46±6%(单次扫描)下降到25±3%(连续两次扫描)。
2.4通过暴露于脉冲激光的PLA-IOC膜的空间选择性细胞消融和细胞杀伤
考虑到(i)人们可以控制膜中的IOC的密度和尺寸的事实以及(ii)扫描膜中的特定区域的固有能力,评价了泡-膜允许以高空间精度杀伤靶细胞达到何种程度。因此,利用能量密度渐增的激光脉冲来扫描PLA-IOC膜中的预定圆形区域(图13)。
如通过仅进入死细胞的碘化丙啶(PI)的红色荧光可以观察到的,存在于预定区域(直径为6.5mm的圆圈)中的细胞被选择性地杀伤。然而,观察到在1.3J/cm2的能量密度下,处理区域的细胞的总数(活细胞加死细胞)显著减少(图14),表明细胞在激光处理后“丢失”(消融),很可能是由蒸汽泡施加的机械力造成的。如图15所示,用钙黄绿素AM和碘化丙啶对细胞进行染色允许确定处理区域中剩余的活细胞与死细胞的比率;显然,在增大激光能量密度后,这个比率逐渐下降。
图16示出了用脉冲激光局部照射PLA-IOC膜后的单个细胞杀伤(比例尺为10μm)。如通过仅进入死细胞的碘化丙啶(PI)的红色荧光可以观察到的,获得了单个细胞杀伤。对膜顶部上的细胞进行选择性细胞处理的透射图像显示出在1.3J/cm2的能量密度下的单个细胞消融。使用0.3至0.8J/cm2的能量密度,可以生成VNB,但是不发生细胞消融。
单个细胞消融的成功率随着能量密度而增加(图17)。除此之外,观察到虽然0.3J/cm2的能量密度不允许单个细胞消融,但是在1.3J/cm2的能量密度下,单个细胞消融总是成功的。
在以上所有实验中,细胞在PLA-IOC膜上生长。为了进一步探索根据本发明的包含颗粒的结构的临床潜力,评价了当置于细胞层的顶部上时膜的细胞杀伤能力(图18)。这模仿了膜用于覆盖靶组织的表面的预期用途。
如实验部分所概述的,在将细胞接种到6孔板中后,移除细胞培养基,但是在细胞顶部上留下一个薄的培养基层;随后将PLA-IOC膜置于细胞顶部上。细胞与膜之间的距离估算为40μm。然后将膜中的预定区域(根特大学徽标)暴露于激光(图19)。与图13中的其中细胞直接在膜顶部上培养的实验相比,由于估算膜与细胞之间具有更大距离,所以使用了1.6J/cm2的更高能量密度。如图20所示,细胞被杀伤,但是需要4个脉冲来实现约25%的活细胞与死细胞的比率。还要注意的是,细胞的总数没有变化(图21),可能是因为细胞和IOC之间的距离较长,从而降低了通过VNB作用在细胞上的机械力。
为了评价如果PLA-IOC膜位于细胞顶部上时细胞膜的穿孔是否也参与细胞的杀伤(图22(左图)),将细胞与FD500一起温育并且用膜覆盖。然后将膜随后进行照射(1.6J/cm2;连续4次)。如图22(右图)所示,在细胞中可以观察到绿色(FD500)和红色(PI)荧光,而荧光在覆盖有不具有IOC的PLA膜并且用激光脉冲照射的细胞中低得多。
为了测定在激光照射覆盖细胞的PLA-IOC膜后细胞内铁的量,进行ICP-MS实验。如图23所示,将细胞暴露于游离IONP(1g/L,相当于膜中的铁的浓度)导致细胞的较高铁含量。游离IONP的激光照射进一步增加细胞中的铁水平。这可能归因于(i)IONP破碎成较小的碎片,以及(ii)VNB(如游离IONP所生成的),其对细胞膜穿孔,由此促进铁摄取。在覆盖有PLA-IOC膜(不进行激光处理)的细胞中,铁含量保持与未经处理的细胞一样低。在照射PLA-IOC膜后,可以观察到细胞内铁含量的增加。然而,细胞内铁含量仍然远低于用游离IONP和激光处理的细胞中的量。
2.5通过暴露于脉冲激光的PLA-IOC膜的浅表角膜细胞的杀伤
由于当膜位于培养细胞层的顶部上时可以实现有效的细胞杀伤(图18),所以在下一步中评价了组织(角膜)的浅表细胞是否可以被根据本发明的结构杀伤。如图24所示,牛眼位于膜上;随后以1.6J/cm2连续照射整个角膜4次。然后切除角膜,用PI染色并且通过共焦显微镜成像。第一个观察结果是,有点出乎意料地,PI阳性细胞存在于对照眼睛(即不具有PLA膜的眼睛或覆盖有不具有IOC的PLA膜的眼睛)中。这可能是因为(i)离体牛角膜上皮细胞在剜除后几小时就已经开始死亡以及(ii)已知上皮细胞死亡可能由于例如眨眼所引起的剪切力而在生理上发生。然而,共焦显微镜图像确认了,与使用不具有IOC的PLA膜的对照实验相比,在用1.6J/cm2激光脉冲照射4次的PLA-IOC膜覆盖的角膜中观察到在PI阳性细胞的显著增加(图25)。
为了确认角膜细胞的膜穿孔,在绿色荧光FD500的存在下重复实验。共焦显微镜图像显示出,与使用不具有IOC的PLA膜的对照实验相比,在覆盖有PLA-IOC膜并且用1.6J/cm2的4个脉冲处理的角膜中的绿色荧光存在明显差异。该观察结果表明角膜细胞膜的穿孔确实发生了。同样重要的是,绿色荧光(FD500)并不与自然死亡细胞的红色荧光共定位,表明孔隙的形成是由于覆盖角膜的PLA-IOC膜的激光照射所致。观察到FD500不会穿透未经处理的角膜细胞。
为了检查空间选择性细胞杀伤是否可以在角膜水平下实现,用钙黄绿素AM(5μg/ml)对上皮细胞进行染色。然后将染色的角膜置于膜顶部上(图28),其中上皮侧朝下。选择感兴趣的区域并且施加激光照射(<7ns;561nm)四次。在1.6J/cm2的能量密度下进行4次照射后,可以观察到荧光的局部减少,并且照射的细胞失去其染色。在较高的能量密度(4.5J/cm2,四次)下,目标区域中的细胞不再可见,表明发生了消融。对于这两种能量密度,周围的细胞(即位于激光束的外部)在激光照射后没有失去染色,表明它们没有受到影响。
实施例2
根据本发明的结构的第二实施方案包括多孔结构,所述多孔结构包含纳米纤维和嵌入纳米纤维中的能够吸收电磁辐射的颗粒,其中颗粒的一部分被部分地暴露于结构的自由表面S,特别是纳米纤维的自由表面。下面描述的示例包括作为结构的材料的聚己内酯和作为能够吸收电磁辐射的颗粒的氧化铁纳米粉末。显然,也可以考虑其他材料和其他颗粒。
1.材料与方法
1.1材料
以下材料用于合成纳米纤维的网:
·聚己内酯(PCL,Mw≈70,000g/mol);
·N,N-二甲基甲酰胺(DMF);
·四氢呋喃(THF);
·氧化铁(Fe3O4)纳米粉末(IONP)(#MKBW3262,Sigma-Aldrich,比利时);
·聚(烯丙胺盐酸盐)(PAH,Mw=17,560g/mol,#MKBZ2824V,Sigma-Aldrich,比利时);
·浓硫酸溶液(96%)(Sigma-Aldrich);
·胶原蛋白I大鼠蛋白(Thermo Fisher Scientific,#A1048301,GibcoTM,比利时)。
1.2包含纳米纤维和颗粒的结构的制备
将IONP重新分散在1:1DMF/THF溶液中,向其中以0体积%至1.15体积%的不同浓度添加PCL。
将由此获得的混合物用于通过静电纺丝制造纳米纤维。将纳米纤维收集在安装在接地旋转收集器上的显微镜载玻片(#1000912,Marienfeld,德国)上。
IONP嵌入纳米纤维中,其中颗粒中的一部分被部分地暴露于纳米纤维的自由表面S。
Claims (15)
1.一种用于选择性地透化和/或破碎细胞的体外或离体方法,所述方法包括以下步骤:
-提供包含材料并且包含能够吸收电磁辐射的颗粒的结构,所述结构限定体积V和自由表面S,所述自由表面S具有自由表面积AS,所述颗粒的至少一部分被部分地暴露于所述自由表面S,部分地暴露于所述自由表面S的颗粒中的每一个限定颗粒自由表面P,所述颗粒自由表面P具有颗粒自由表面积AP,所述颗粒以使得所有颗粒的颗粒自由表面积AP的总和在所述自由表面积AS的0.0001至50%范围内的方式嵌入所述结构中;
-提供至少一个细胞;
-使所述结构与所述至少一个细胞彼此处于小于100μm的距离d,所述距离d为所述至少一个细胞与所述结构的所述自由表面S之间的最短距离;
-用电磁辐射照射所述结构。
2.根据权利要求1所述的方法,其中部分地暴露于所述自由表面S的颗粒的至少一部分从所述材料突出。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法,其中所述颗粒具有在1nm至40000nm范围内的尺寸。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述颗粒布置成簇,其中一个簇包括2至1000个颗粒。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述至少一个细胞包括细胞的悬浮液或细胞的组织。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中部分地暴露于所述结构的所述自由表面S的颗粒的密度在1至10个颗粒/100μm2的范围内。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述颗粒包括选自由以下各项组成的组中的颗粒:金属颗粒、金属氧化物颗粒、碳或碳基颗粒以及包含一种或多种光吸收化合物的颗粒和负载有一种或多种光吸收化合物或用一种或多种光吸收化合物功能化的颗粒。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述材料包括无机材料或无机基材料、陶瓷或陶瓷基材料、有机材料或有机基材料、水凝胶或者包含这些材料中的至少一种的复合材料。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中用电磁辐射照射所述结构包括使用具有脉冲持续时间在1fs至1ms范围内和/或每个脉冲的能量密度在0.001至10J/cm2范围内的脉冲的脉冲辐射源进行照射。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述结构包括膜,所述膜限定具有第一自由表面积AS1的第一表面S1以及优选地与所述第一表面相对的具有第二自由表面积AS2的第二表面S2,其中所述颗粒以使得部分地暴露于所述第一表面S1的所有颗粒的颗粒自由表面积AP的总和在所述自由表面积AS1的0.0001至50%范围内的方式嵌入所述结构中。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述结构包括多孔结构,所述多孔结构包含纤维、微粒、纤维和微粒的组合或者泡沫,其中所述颗粒嵌入所述纤维、所述微粒或所述泡沫中。
12.一种用于在光热过程中使用以选择性地透化和/或破碎细胞的结构,所述结构包含材料并且包含能够吸收电磁辐射的颗粒,所述结构包含材料并且包含能够吸收电磁辐射的颗粒,所述结构限定体积V和自由表面S,所述自由表面S具有自由表面积AS,所述颗粒的至少一部分被部分地暴露于所述自由表面S,部分地暴露于所述自由表面S的颗粒中的每一个限定颗粒自由表面P,所述颗粒自由表面P具有颗粒自由表面积AP,所述颗粒以使得所有颗粒的颗粒自由表面积AP的总和在所述自由表面积AS的0.0001至50%范围内的方式嵌入所述结构中,所述方法包括以下步骤:
-使所述结构与至少一个细胞彼此处于小于100μm的距离d,所述距离d为所述至少一个细胞与所述结构的所述自由面积表面S之间的最短距离;
-用电磁辐射照射所述结构以选择性地透化和/或破碎所述至少一个细胞。
13.根据权利要求12所述的结构,其中所述光热过程包括在受试者中用来选择性地透化和/或破碎所述受试者的细胞的治疗方法。
14.根据权利要求12或13所述使用的结构,其中所述至少一个细胞包括细胞的悬浮液或细胞的组织,和/或其中所述电磁辐射包括由激光器生成的脉冲辐射。
15.根据权利要求12至14中任一项所述使用的结构,其中所述治疗方法包括纳米外科手术。
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