KR20230159476A - NKG2D, CXCR2 및 dap10/dap12 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

NKG2D, CXCR2 및 dap10/dap12 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

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데이비드 마크 데이비스
다니엘 라콤-영
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킹즈 컬리지 런던
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Abstract

NKG2D 폴리펩티드 및 CXCR2 폴리펩티드, 그리고 선택적으로 DNAX-활성화 10(DAP10) 폴리펩티드 및 DNAX-활성화 단백질 12(DAP12) 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 면역반응 세포가 제공된다. 또한 이러한 면역반응 세포를 제조하고 사용하는 방법도 제공된다.

Description

NKG2D, CXCR2 및 dap10/dap12 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법
키메라 항원 수용체(CAR)로 조작된 T-세포를 사용한 면역요법은 B 세포 악성종양 및 다발성 골수종의 관리에 있어 혁신적인 것으로 입증되었다. 그러나 고형 종양 면역 요법에 이 기술을 적용하는 것은 종양 선택적인 표적의 부족으로 인해 방해를 받는다. 대부분의 종양 항원은 세포 내에 존재하므로 CAR T-세포가 쉽게 인식할 수 없다. 결과적으로, 현재 개발 중인 대부분의 고형 종양 관련 CAR은 종양 세포에서 상향 조절되지만 정상 조직에서는 더 낮은 수준으로 발견되는 표적에 관여한다.
높은 수준의 종양 선택성을 나타내는 소수의 표적 그룹 중 하나는 NKG2D 리간드이다. 사람의 경우, 이들은 거의 모든 종양 세포 유형에서 비정상적으로 발현되는 8가지 스트레스 유발(stress-induced) 단백질(MICA, MICB, ULBP1-6) 그룹으로 구성된다. 또한 NKG2D 리간드는 내피, 조절 T-세포 및 골수 유래 억제 세포와 같은 종양 관련 기질 요소에서도 또한 발견된다(Parihar, R., et al., 2019, Cancer Immunol. Res. 7(3):363-375; Schmiedel & Mandelboim, 2018, Front. Immunol. (9)2040). NKG2D가 유전적으로 결핍된 마우스는 상피 및 림프성 악성 종양 모두에 대해 손상된 면역 감시(immunosurveillance)를 보여준다. NKG2D 리간드가 안전한 치료 표적이라는 증거는 건강한 조직에서 발견되지 않는다는 사실에 의해 뒷받침된다. 자가 NKG2D 표적(NKG2D-targeted) CAR을 사용하는 임상 시험에서는 심각한 안전성 문제를 드러내지 않았다(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30396908/ 참조).
NKG2D 수용체는 자연 살해(NK) 및 일부 T-세포 집단에 의해 자연적으로 발현된다. 각 NKG2D 동종이량체(homodimer)는 원형질막 내의 상보적으로 하전된 아미노산을 통해 2개의 동종이량체 DAP10 어댑터 분자와 결합한다. 이 상호작용은 NKG2D의 세포 표면 발현 및 기능에 필요한다. DAP10은 포스파티딜이노시톨 3-키나제를 통해 공동-자극을 제공하는 능력에서 CD28과 유사하지만, 중요하게는 조절 T-세포의 원치 않는 모집을 촉진하는 p56lck 결합 모티프가 결여되어 있다(Kofler, et al., 2011, Mol. Ther. 19:760-767). DAP10 공동-자극의 효능은 내재화 후 신호를 보내는 그것의 지속적인 능력에 의해 강조된다. 그러나 DAP10에는 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)가 없기 때문에 NKG2D 결합이 완전한 T-세포 활성화로 이어지지는 않는다.
동시 자극(신호 2라고도 알려짐) 외에 ITAM-의존성 신호 1을 제공하기 위해 상이한 방법을 사용하는 다양한 CAR이 개발되었는데, 이는 두 신호 유형 모두 완전한 T-세포 활성화를 유도하는 데 필요하기 때문이다. 최초의 NKG2D 표적 CAR은 Sentman et al.에 의해 개발되었고 CD3ζ에 대한 NKG2D의 융합으로 구성된다(Zhang et al, 2005, Blood 106:1544-1551). 명목상 1세대 CAR이지만, T-세포에서 내인성 DAP10과 연관되는데 이는 신호 1과 2가 모두 제공된다는 것을 의미한다. 이 CAR은 현재 Celyad Oncology에서 Cyad-01로서 임상 개발 중이다. 보다 최근에는 Chang et al. (2013, Cancer Res. 73:1777-1786)은 외인성 DAP10 외에 동일한 CAR을 공동 발현하도록 NK 세포를 조작하였다. 4-1BB (Song et al., 2013, Hum. Gene Ther. 24:295-305) 또는 CD28(Lehner et al., 2012, PLoS One 7:e31210) 중 하나를 포함하는 2개의 추가 NKG2D CAR도 기재되어 있는데 이는 DAP10에 의해 제공되는 것 대신에 대체 형태의 공동-자극을 제공하기 위한 것이다. 이러한 모든 CAR은 사이토카인 생산을 수반하는 T-세포 매개 종양 세포 사멸을 가능하게 하는 반면 Chang et al.에 기재된 CAR은 또한 일시적인 생체 내(in vivo) 항종양 활성도 입증했다.
CXCR2 수용체의 리간드는 (Glu-Leu-Arg) ELR 모티프, 즉 CXCL1-3 및 CXCL5-8을 포함하는 시스테인-X-시스테인(CXC) 패밀리의 케모카인을 포함한다. 종양 내에서 이러한 케모카인의 생성은 악성 세포뿐만 아니라 섬유아세포 및 대식세포와 같은 간질 요소에 의해서도 수행된다(Thuwajit et al., 2018, Med Res Rev. 38:1235-54; Thongchot et al, 2021, Int J Oncol. 58:14). 더욱이, 종양 세포는 간질 세포를 교육하여 이러한 인자를 생성함으로써 질병 진행 및 세포독성 화학요법에 대한 내성을 가능하게 한다(Le Naour, 2020, J Mol Cell Biol. 12:202-15).
CXC 패밀리 중 가장 잘 연구된 구성원은 인터루킨(IL)-8로도 알려진 CXCL8이다. 순환하는 CXCL8의 수준은 난소 종양(Zhang, et al., 2019, Oncol Lett. 17:2365-9), 악성 중피종(Judge, et al. 2016, Ann Surg Oncol. 23:1496-500), 췌장암(Hou, et al. 2018, J Clin Med. 7:502, 유방암(Milovanovic, et al. 2019, Cytokine 118:93-98; Autenshlyus, et al. 2021, 35: 20587384211034089), 식도암(Huang, et al. Cancer Biomark. 29:139-149) 및 두경부암(Rezaei, et al. 2019, 39:727-739)을 포함한 특정 암 환자에서 상승한다. CXCL8 외에도 CXCR2 리간드인 CXCL1, CXCL3 및 CXCL5의 높은 수준의 생산도 여러 암에서 설명되었다.
발명의 요약
제1 양상에서, NKG2D 폴리펩티드, CXCR2 폴리펩티드, 및 DNAX-활성화 10(DAP10) 폴리펩티드 또는 그의 기능적 변이체와 DNAX-활성화 12(DAP12) 폴리펩티드 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 면역반응 세포가 본원에 기술되어 있다. 일부 구체예에서, NKG2D, CXCR2, DAP10, 및 DAP12 폴리펩티드는 각각 포유동물 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, NKG2D, CXCR2, DAP10, 및 DAP12 폴리펩티드는 각각 인간 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, NKG2D 폴리펩티드의 서열은 서열번호 14의 서열에 대해 약 85% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 NKG2D 폴리펩티드는 인간 NKG2D 폴리펩티드의 기능적 변이체이고 서열번호 14의 아미노산 중 적어도 하나를 추가, 삭제 또는 치환하는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 일부 구체예에서, NKG2D 폴리펩티드의 기능적 변이체는 서열번호 14의 서열을 갖는 폴리펩티드의 절단된 버전이다. 일부 구체예에서, 상기 기능적 변이체는 키메라 NKG2D 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 상기 기능적 변이체는 인간-쥐과 키메라 NKG2D 폴리펩티드이다.
일부 구체예에서, 상기 DAP10 폴리펩티드는 서열번호 1의 DAP10 폴리펩티드에 대해 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 DAP10의 기능적 변이체이다. 일부 구체예에서, 상기 DAP10 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 중 임의의 것을 추가, 결실 또는 치환하는 하나 이상의 점 돌연변이를 갖는 DAP10의 기능적 변이체이다. 일부 구체예에서, DAP10 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 절단된 버전인 DAP10의 기능적 변이체이다. 일부 구체예에서, 상기 DAP10 폴리펩티드는 서열 번호 1-8 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구체예에서, 상기 DAP12 폴리펩티드는 서열번호 9의 DAP12 폴리펩티드에 대해 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 DAP12의 기능적 변이체이다. 일부 구체예에서, 상기 DAP12 폴리펩티드는 서열 번호 9의 아미노산 중 임의의 것을 추가, 결실 또는 치환하는 하나 이상의 점 돌연변이를 갖는 DAP12의 기능적 변이체이다. 일부 구체예에서, 상기 DAP12 폴리펩티드는 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 절단된 버전인 DAP12의 기능적 변이체이다. 일부 구체예에서, 상기 DAP12 폴리펩티드는 서열 번호 9-13 중 어느 하나의 것의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구체예에서, DAP10 폴리펩티드와 DAP12 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다. 일부 구체예에서, 상기 링커는 서열 번호 18-46 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구체예에서, 상기 융합 폴리펩티드는 N-말단 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 융합 폴리펩티드는 C-말단 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 N-말단 또는 C-말단 서열은 His-태그, FLAG-태그, Arg-태그, T7-태그, Strep-태그, S-태그, AviTag™, 앱타머-태그, myc 태그, CD8α 리더 서열, 4-1BB 엔도도메인, V5 태그, 또는 CD27 엔도도메인 중 하나 이상을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 60-63 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구체예에서, 상기 CXCR2 폴리펩티드는 서열 번호 87에 대해 약 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 특정 구체예에서, 상기 CXCR2 폴리펩티드는 서열번호 87의 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 면역반응 세포는 T-세포 또는 자연 살해(NK) 세포이다. 일부 구체예에서, 상기 면역반응 세포는 αβ T-세포, γδ T-세포, CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, 자연 살해 T(NKT) 세포 또는 이들의 임의의 조합이다.
제2 양상에서, 키메라 NKG2D 폴리펩티드 및 CXCR2 폴리펩티드를 포함하는 면역반응 세포가 본원에 기술되어 있다. 일부 구체예에서, 상기 키메라 NKG2D 폴리펩티드는 인간 NKG2D 세포외 도메인 또는 이의 변이체 및 쥐 NKG2D 막관통 도메인 또는 이의 변이체를 포함한다. 특정 구체예에서, 인간 NKG2D 세포외 도메인은 서열번호 95-97 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 키메라 NKG2D 폴리펩티드는 서열번호 95-97 중 어느 하나의 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 인간 NKG2D 세포외 도메인의 변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 쥐과 NKG2D 막관통 도메인은 서열번호 98-101 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 키메라 NKG2D 폴리펩티드는 서열 번호 98-101 중 어느 하나의 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 쥐과 NKG2D 막관통 도메인의 변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 면역반응 세포는 적어도 하나의 DAP12 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 면역반응 세포는 적어도 하나의 DAP10 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 세포는 서열번호 102에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
또한, NKG2D 폴리펩티드, CXCR2 폴리펩티드, 및 선택적으로 DNAX-활성화(DAP10) 폴리펩티드, DNAX-활성화(DAP12) 폴리펩티드 및/또는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 본원에 기술되어 있다.
(i) T-세포 또는 자연 살해(NK) 세포를 본원에 기술된 핵산 분자 또는 벡터로 형질도입하는 단계, 및 (ii) 상기 형질도입된 세포가 NKG2D 폴리펩티드, CXCR2 폴리펩티드, 및 선택적으로 DAP10/DAP12 융합 폴리펩티드를 발현하도록 T-세포 또는 자연 살해 세포를 배양하는 단계를 포함하는 면역반응성 세포를 제조하는 방법이 또한 본원에 기술되어 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 NKG2D 폴리펩티드는 세포막과 결합한다.
또한, 암을 가진 개체에게 치료적 유효량의, 본원에 기술된 면역반응 세포를 투여하는 것을 포함하는, 암을 가진 개체를 치료하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 일부 구체예에서, 상기 면역반응 세포는 그 개체에 대한 자가(autologous) T-세포 또는 자연살해(NK) 세포로부터 제조된다. 일부 구체예에서, 상기 암은 고형 종양 암이다. 일부 구체예에서, 상기 고형 종양 암은 간암, 폐암, 유방암, 전립선암, 림프암, 결장암, 신장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 갑상선암, 식도암, 소장암, 또는 이들의 임의의 조합이다.
본 발명의 이러한 및 기타 특징, 양상 및 이점은 잇따르는 발명의 설명 및 첨부 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 생성된 각 구축물의 구조를 보여주는 개략도이다. N1012는 본 발명에 따른 외인성 인간 NKG2D 단백질 및 융합된 외인성 DAP10/12 동종이량체(homodimer)를 포함하는 복합체를 포함한다. N1012는 서열번호 64를 포함하며, 이는 표 2에 기술되어 있다. 1012_10_N은 DAP10과 공동발현된 NKG2D, 및 DAP12 엔도도메인에 융합된 DAP10 세포외 및 막관통 도메인의 FLAG-태그된 융합을 포함한다. NKG2D 복합체는 세포에 이미 존재하는 내인성 DAP10과 상호작용하는 외인성 인간 NKG2D 단백질을 포함하며, 비교 목적으로만 제공된다.
도 2는 N1012를 발현하는 레트로바이러스 플라스미드(도 1에 도식적으로 표시됨) 또는 NKG2D 단독으로 형질감염된 지 3일 후 293T-세포에서 세포 표면 및 세포내(ICS) 모두에서 NKG2D의 발현을 나타내며, 형질도입되지 않은(UT) 293T-세포와 대비된다.
도 3의 A 및 B는 NKG2D 단독 또는 N1012를 코딩하는 레트로바이러스 벡터로 활성화된 미분획 인간 T-세포의 형질도입 후 T-세포의 CD4+ 서브세트에서 세포 표면 NKG2D 발현의 형질도입 백분율(도 3의 A) 및 중앙 형광 강도(MFI - 도 3의 B)를 보여준다. UT T-세포의 발현 및 MFI도 비교를 위해 표시된다.
도 4는 N1012, NKG2D 또는 NKG2D가 결여된 대조군 CAR을 발현하도록 형질도입된 활성화된 미분획 T-세포의 CD4+ 및 CD8+ 서브세트 내 세포 표면 NKG2D의 대표적인 발현 패턴을 보여준다. UT T-세포 내 NKG2D 발현이 비교로서 제공된다.
도 5a 내지 도 5b는 다양한 CAR T-세포:표적 비율에서 N1012+, NKG2D+ 또는 UT T-세포와의 공동-배양 후 11개의 상이한 종양 세포주의 생존율(viability)을 보여준다. 종양 세포 생존율은 MTT 어세이를 사용하여 72시간 후에 평가되었고 T-세포 공동-배양이 없을 때 관찰된 것의 백분율로서 표시된다.
도 6a 내지 도 6d는 CAR T-세포:표적 비율에서 8개의 상이한 종양 세포주와 공동-배양(co-culture)하는 동안 N1012, NKG2D 및 UT T-세포에 의해 분비되는 사이토카인(IFN-γ(도 6a 내지 도 6b) 및 IL-2(도 6c 내지 도 6d))의 수준을 보여준다. 공동-배양 상청액을 72시간 후에 제거하고 효소-링크된 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 사이토카인 존재에 대해 평가하였다.
도 7a 내지 도 7f은 다양한 CAR T-세포:표적 비율에서 N1012+, NKG2D+ 또는 UT T-세포와의 공동-배양 후 종양 및/또는 췌장 성상 PS1의 생존율을 보여준다. 도 7a의 A는 다양한 CAR T-세포:표적 비율에서 N1012+, NKG2D+ 또는 UT T-세포와의 공동-배양 후 췌장 성상 PS1 세포의 생존율을 보여준다. 1:1의 CAR T-세포:표적 비율로 추가된 경우 N1012+ T-세포는 또한 1:1 비율로 함께 성장한 PS1 및 BxPC3 세포 둘다로 구성된 단층의 강력한 용해를 보여준다(도 7a의 B). 이것은 NKG2D+ 또는 UT T-세포의 첨가시 관찰된 효능의 결여와 대조된다. 두 경우 모두, 표적 세포 생존율은 MTT 어세이에 의해 48시간 후에 평가되었고 T-세포 공동-배양이 없을 때 관찰된 것의 백분율로서 표시된다. 1:1 CAR T-세포:표적 비율에서 N1012+, NKG2D+ 또는 UT T-세포와의 공동-배양 후 종양 세포 및 기질 세포 단층의 생존율은 도 7b의 C(BxPC3_LT + PS1) 및 도 7b의 D(PaTU + PS1)에 나타난다. N1012+ T-세포에서 종양 및 기질 세포 둘 다의 강력한 용해가 관찰된 반면, NKG2D 또는 UT T-세포와 공동-배양될 때 표적 세포 생존율의 최소 감소가 관찰되었다(도 7b의 C-D). 1:1 CAR T-세포:표적 비율로 N1012+, NKG2D+ 또는 UT T-세포와 공동-배양한 후 종양 세포 단독의 생존 가능성은 도 7b의 C(BxPC3_LT) 및 도 7b의 D(PaTU_GFP)에 나와 있다. 1:1의 CAR T-세포:표적 비율로 N1012+, A2028z+, NKG2D+ 또는 UT T-세포와 공동-배양한 후 종양 세포 및 기질 세포 단층의 생존율은 도 7c의 E 및 F에 나타난다(최대 5회의 재자극 이후). 도 7c의 G 및 H는 상기 기재된 공동-배양 동안 N1012+, A2028z+, NKG2D+ 및 UT T-세포에 의해 분비되는 IFN-γ의 수준을 나타낸다. 종양 단독에서 분비되는 IFN-γ의 수준을 음성 대조군으로 결정하였다. 도 7d의 I 및 7e의 J는 N1012+, NKG2D+ 또는 UT T-세포와의 공동-배양 후 GFP 발현 PaTU 종양 세포가 mCherry 발현 PS1 세포(각각 3일 또는 8일 동안 1:1 비율)와 혼합된 종양 스페로이드(tumour spheroids)의 생존 가능성을 보여준다. .n.d. - 감지되지 않음. 도 7f의 K는 종양 스페로이드와의 공동-배양 동안 N1012+, UT T-세포 및 종양 단독에 의해 72시간 후에 분비되는 IFN-γ의 수준을 보여준다.
도 8a 내지 도 8f는 UT T-세포 또는 NKG2D만 발현하는 T-세포와 비교할 때 N1012를 발현하는 T-세포가 여러 차례 반복된 자극('재자극')을 겪을 수 있는 능력을 보여준다. N1012를 발현하는 T-세포는 여러 주기의 자극을 통해 Ju77 중피종 Ju77 세포와 HN3_LUC 두경부 편평 세포 암종(HNSCC) 세포 모두의 용해를 중재한다(도 8a). 중피종(Ju77, Ren), HNSCC(HN3_LUC) 또는 췌장암(BxPC3_LT) 세포와 공동-배양할 때 성공적인 재자극 주기의 총 횟수는 도 8b 및 도 8c에 나타나 있다. Ju77 또는 HN3_LUC 종양 세포에 의한 반복된 자극 시 T-세포의 증식은 도 8d에 표시된다. Ju77, Ren 또는 HN3_LUC 종양 세포를 사용한 배양 1일차와 비교할 때 T-세포의 최대 배수 확장은 도 8e 및 도 8f에 나타나 있다. 대조적으로, UT T-세포 또는 NKG2D 단독을 발현하는 것은 최소 표적 세포 용해 또는 증식을 나타낸다.
도 9a 내지 도 9c는 종양-보유 마우스에서 생체내(in vivo) 평가를 위한 CAR T-세포의 레트로바이러스 형질도입에 의한 조작을 보여준다. 도 9a 및 9b는 N1012 또는 NKG2D로 형질도입한 후 CD4+ 및 CD8+ T-세포에서 NKG2D의 세포 표면 발현을 보여준다. Davies et al., 2012, Mol. Med. 18:565-576에 기재된 바와 같이, pan-ErbB 표적화 CAR, T4을 발현하는 동일한 공여자로부터의 T-세포로 대비하였다. TMY로 지정된 제2 pan-ErbB 표적화 CAR도 또한 사용되었는데 이는 T4 내에 포함된 4ab 도메인이 없고 약간 변경된 CD28 힌지(MYPPPY 서열이 10개 아미노산 선형 myc 태그 서열로 대체됨)를 갖는 것이었다. 도 9c는 마우스로의 입양 전달(adoptive transfer) 후 표시된 종양 세포주에 대한 잔류 T-세포의 시험관내(in vitro) 세포독성 기능을 나타낸다.
도 10a 내지 도 10e는 지시된 CAR T-세포 10 x 106 로 복강 내(i.p.) 처리 전후의 생물발광 영상화(BLI)에 의해 확인된 바와 같이 NSG 마우스의 생체내(in vivo) ffLUC-태그된 BxPC3 세포의 복강 내의 성장을 보여준다. N1012의 경우에도 이 용량을 사용하거나('hi'로 표시) 더 낮은 용량을 투여했다('lo' - 4 x 106 세포). 마우스의 각 그룹으로부터 풀화된 BLI 방출은 도 10a에 나타나 있다. 개별 마우스로부터의 연속 생물발광 방출(serial bioluminescence emission)은 도 10b에 나타나 있다. 마우스의 무게는 도 10c에 나타나 있다. 88일에 i.p. ffLUC BxPC3 종양 재챌린지 후 개별 마우스로부터의 연속 생물발광 방출은 도 10d에 제시되어 있다. 145일 후에 종료된 실험의 생존 곡선은 도 10e에 나타나 있다.
도 11a 및 도 11b는 생물발광 영상화(BLI)에 의해 확인된 바와 같이, 지시된 T-세포 또는 PBS로 처리 전후에서 NSG 마우스의 생체내 ffLUC-태그된 BxPC3 세포의 i.p. 성장을 입증하는 또 다른 실험의 결과를 보여준다. 처리 그룹당 BLI 평균 총 플럭스(광자/초)는 도 11a에 표시되고 개별 마우스당 BLI 총 플럭스(광자/초)는 도 11b에 보여준다. 41일(T-세포 주입 후 29일)에 종양이 없었던 마우스는 ffLUC-태그 BxPC3 세포로 복강내로(i.p.) 재챌린지되었다(점선으로 표시).
도 12a 및 도 12b는 생물발광 영상화(BLI)에 의해 확인된 바와 같이 지시된 T-세포 또는 PBS로 처리한 전후에 NSG 마우스에서 생체내 ffLUC-태그된 H226 악성 중피종 세포의 i.p.성장을 보여준다. 처리 그룹당 BLI 평균 총 플럭스(광자/초)는 도 12a에 나타내고, 개별 마우스당 BLI 총 플럭스(광자/초)는 도 12b에 나타낸다. T-세포 지속성 및 기능 유지를 확인하기 위해 모든 무종양 마우스에 대해 초기 종양 접종 후 91일에 추가 1x106 ffLUC-태그된 H226 세포로 복강내 접종하였다. 종양 재챌린지의 타이밍은 N1012 그래프에서 제2 점선으로 표시된다.
도 13은 CD4+ T-세포에서 발현될 때 NKG2D, N1012 및 CYAD-01 CAR의 복제물의 세포 표면 발현의 형질도입 백분율(왼쪽 패널) 및 중앙 형광 강도(MFI)(오른쪽 패널)를 보여준다.
도 14의 A 및 B는 BxPC3-LT(도 14의 A), Ren 또는 Ju77 세포(도 14의 B)와 공동-배양되었을 때 N1012+ T-세포의 재자극(도 14의 A) 및 최대 배수 확장(도 14의 B)을 NKG2D T-세포 또는 Cyad-01의 복제물을 발현하는 것에 대비한다.
도 15a는 N1012, Cyad-01 복제물 또는 형질도입되지 않은 T-세포와 3일 또는 8일 동안 공동-배양한 후 종양 스페로이드의 생존 가능성을 보여준다. 종양 스페로이드는 T-세포 첨가 전 3일 동안 1:1 비율로 공동-배양된 GFP 발현 PaTU 종양 세포와 mCherry-발현 PS1 세포로 구성되었다. 첨가된 T-세포의 수는 2:1:1의 최종 T-세포:GFP PaTU:mCherry PS1 비율을 반영했다. 도 15b는 종양 스페로이드와의 공동-배양 동안 T-세포의 증식 수준을 보여준다.
도 16a-16c는 CAR 구축물 N1012, N1012_CXCR2, 및 NKG2D(도 16a) 및 CYAD-01_10(도 16b)의 도식이다. CYAD-01_10에서는 Cyad-01의 복제물이 추가적인 DAP10과 공동 발현되었다. 도 16c는 N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01_10, CYAD-01 복제물, 또는 NKG2D를 코딩하는 레트로바이러스 벡터로 활성화된 미분획 인간 T-세포의 형질도입 후 T-세포의 CD4+ 서브세트에서 세포 표면 NKG2D 발현의 형질도입 백분율(왼쪽 패널) 및 중앙 형광 강도(MFI)(오른쪽 패널)를 보여준다. 비교를 위해 형질도입되지 않은 T-세포에 대한 결과가 표시되어 있다.
도 17은 다양한 CAR T-세포:표적 비율에서 N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01_10 및 형질도입되지 않은 T-세포와의 공동배양 후 2개의 난소암 세포주 Kuramochi_LT(왼쪽) 및 Ovsaho_LT(오른쪽)의 생존성을 보여준다. 두 명의 독립 기증자에 대한 데이터가 표시되어 있다. 종양 세포 생존율은 72시간 후 MTT 분석으로 평가하였고 T-세포 없이 배양된 생존 세포 백분율로 표시되었다.
도 18은 CYAD-01의 복제물 또는 CYAD-01_10 T-세포와 비교하여 반복된 횟수의 자극 후에 N1012 및 N1012_CXCR2 T-세포의 개선된 능력을 보여준다.
도 19a-19b는 Ren 종양 세포 단층에 대한 16회 재자극 주기(도 19a) 및 23회 재자극 주기(도 19b) 후 N1012 및 N1012_CXCR2 T-세포가 CD4+에서 CD8+ 집단으로 거의 완전한 이동을 보여주는 유세포 분석 플롯이다.
도 20은 Ren 종양 세포 단층에 대한 28회 자극 후 CD45RO, CD62L 및 CD27 발현에 대해 평가된 N1012 T-세포의 유세포 분석 결과를 보여준다.
도 21은 Ren 종양 세포 단층에 대한 31회, 32회 및 33회 자극 후 CD45RO 및 CD62L의 발현에 대해 평가된 N1012 T-세포의 결과를 보여준다.
도 22는 음향 힘 램프(acoustic force ramp) 적용 시 Lo68_CD19 세포(왼쪽 패널) 및 SKOV-3 세포(오른쪽 패널)에 대해 표시된 CAR T-세포의 결합력(avidity) 플롯을 보여준다.
도 23a-23b는 4개의 다른 종양 세포주와 공동배양할 때 N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01 복제물 및 형질도입되지 않은 T-세포에 의해 분비되는 사이토카인 IFN-γ(도 23a) 및 IL-2(도 23b)의 수준을 보여준다. 공동-배양된 세포로부터 상청액을 제거하고 ELISA에 의해 사이토카인 존재에 대해 평가하였다.
도 24는 12일에 걸쳐 자극되지 않은 N1012 및 N1012_CXCR2 T-세포의 확장이 NKG2D 및 형질도입되지 않은 T-세포의 확장을 초과하는 반면, CYAD-01 복제물 및 CYAD-01_10 T-세포는 대조군 T-세포에 비해 실질적으로 더 낮은 확장을 나타냄을 보여준다.
도 25는 PBS 또는 CAR-T-세포(N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01 복제물, 또는 비형질도입)로 처리된 마우스에서 반딧불이 루시퍼라제(ffLuc)-발현 Ovsaho 종양 이종이식편으로부터의 생물발광 방출을 보여준다. T-세포를 종양 접종 후 6일차에 복강내(i.p.) 투여하고 7일차에 정맥 (i.v.) 주사하였다(세로 점선으로 표시). 종양 발달은 총 플럭스(광자/초)로 측정되었다.
도 26은 N1012 및 N1012_CXCR2 T-세포로 처리된 ffLuc Ovsaho 이종이식편-함유 마우스에서 항종양 활성을 입증하고(왼쪽 및 중간 패널) N1012 T-세포와 비교하여 N1012_CXCR2 T-세포의 종양 부위로의 향상된 수송(trafficking)을 입증하는(오른쪽 패널) 생물발광 영상화 결과를 보여준다. 종양 발달은 반딧불이 루시퍼라제 발현에 의해 총 플럭스(광자/초)로서 측정한다. T-세포 수송은 레닐라 루시퍼라제의 발현에 의해 모니터링되며, 총 플럭스(광자/초)로서 다시 한 번 정량화된다.
도 27은 종양 접종 7일 후 PBS 또는 CAR-T-세포(N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01_10, 또는 대조군 NKG2D 구축물)로 처리된 마우스에서 ffLuc-발현 SKOV-3 종양 이종이식편의 발달을 보여준다. 종양 발달은 반딧불이 루시퍼라제 발현에 의해 총 플럭스(광자/초)로서 측정한다.
도 28은 CAR T-세포(N1012, N1012_CXCR2, 또는 리포터 대조군 "레닐라 루시퍼라제")로 처리된 SKOV-3 이종이식편-함유 마우스에서의 종양 성장(왼쪽 패널) 및 T-세포 수송(오른쪽 패널) 평가의 결과를 보여준다.
도 29는 i.p.SKOV-3 종양 이종이식편으로 NSG 마우스에 i.v. 투여 후 지시된 레닐라 루시퍼라제 발현 CAR T-세포의 생물발광 영상화 결과를 보여준다. 다양한 시점에서 rLuc N1012, rLuc N1012_CXCR2 또는 rLuc 단독으로 발현하는 T-세포의 영상화가 표시되어 있다.
도 30은 PBS 또는 CAR T-세포(N1012_CXCR2, CYAD-01 복제물, N1012 또는 NKG2D) 투여 후 마우스의 피하(s.c.) CFPac-1 췌장 종양 이종이식편의 발달을 보여준다.
도 31은 N1012 또는 NKG2D T-세포에 비해 N1012_CXCR2 T-세포의 향상된 침윤을 입증하는 s.c. CFPac-1 종양의 CD3 면역조직화학 이미지를 보여준다.
도 32는 PBS, 고용량(10 x 106) CAR T-세포(N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01 복제물 또는 비형질도입) 또는 저용량(4x106) CAR T-세포(N1012, 또는 N1012_CXCR2)로 종양 접종 후 28일에 처리된 마우스에서의 s.c. CFPac-1 췌장 종양 이종이식편의 시간에 따른 발달을 보여준다.
도 33은 종양 접종 이후 14일에 PBS 또는 10 x 106 CAR T-세포(CYAD-01 복제물, N1012, N1012_CXCR2 또는 비형질도입) 투여 후 마우스에서의 s.c. BxPC3 췌장 종양 이종이식편의 발달을 보여준다.
도 34는 PBS 또는 10 x 106 CAR T-세포(CYAD-01 복제물, N1012, N1012_CXCR2, 또는 비형질도입)로 처리된 s.c. BxPC3 종양 이종이식편-함유 마우스의 생존곡선이다.
도 35는 종양 이식 후 111일에 PBS 또는 10 x 106 CAR T-세포(N1012_CXCR2, N1012, CYAD-01_10, 또는 비형질도입)를 투여한 후 마우스(PDX PD_008)에서의 s.c. 중피종 환자 유래된 이종이식 종양의 발달을 보여준다.
도 36은 중피종 환자 유래된 이종이식 종양-함유 NSG 마우스에 투여한 후 ffLuc/dsTomato(LT)-발현 CAR T-세포의 생물발광 영상화 결과를 보여준다. T-세포 투여 후 다양한 시점에 마우스를 10 x 106 CAR T-세포(N1012_LT, N1012_CXCR2_LT, 또는 LT)로 처리했다.
도 37은 종양 접종 후 7일에 PBS 또는 10 x 106 CAR-T-세포(N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01_10, 또는 대조군 NKG2D)로 i.p.처리된 i.p. SKOV-3 종양을 갖는 NSG 마우스의 Kaplan-Meier 생존 곡선을 보여준다.
도 38은 PBS 또는 CAR-T-세포(N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01 복제물, 또는 비형질도입)로 처리된 NSG 마우스에서의 i.p. ffLuc Ovsaho 종양 이종이식편의 발달을 보여준다. 5 x 106 T-세포를 종양 접종 후 6일차에 투여하고 5 x 106 T-세포의 추가 용량을 다음 날 i.v.로 투여했다. 초기 종양 접종 후 56일에 ffLuc Ovsaho 세포로 마우스를 재시험감염(re-challenge)시켰다.
도 39는 PBS 또는 CAR-T-세포(N1012, N1012_CXCR2, 또는 비형질도입)로 처리된 NSG 마우스에서의 i.p. ffLuc Kuramochi 종양 이종이식편의 발달을 보여준다. 5 x 106 T-세포를 종양 접종 후 17일차에 투여하고 5 x 106 T-세포의 추가 용량을 다음 날 i.v.로 투여했다. 초기 종양 접종 후 86일에 ffLuc Kuramochi 세포로 마우스를 재시험감염(re-challenge)시켰다.
도 40은 도 39에 기술된 바와 같이, 종양 접종 후 17일 및 18일에 PBS 또는 CAR-T-세포(N1012, N1012_CXCR2, 또는 비형질도입)로 처리된 i.p. ffLuc Kuramochi 종양을 갖는 마우스의 Kaplan-Meier 생존 곡선이다.
도 41은 PBS 또는 CAR-T-세포(N1012, N1012_CXCR2, 또는 비형질도입)로 처리된 NSG 마우스에서의 i.p. ffLuc Kuramochi 종양 이종이식편의 발달을 보여준다. 5 x 106 T-세포를 종양 접종 후 17일차에 투여하고 5 x 106 T-세포의 추가 용량을 다음 날 i.v.로 투여했다. 초기 종양 접종 후 86일에 ffLuc Kuramochi 세포로 마우스를 재시험감염(re-challenge)시켰다.
도 42는 rLuc 표지된 CAR T-세포(N1012_rLuc, N1012_CXCR2_rLuc)로 처리된 Kuramochi 종양 이종이식편-함유 NSG 마우스의 생물발광 영상화 결과를 보여준다. T-세포 침윤은 코엘렌테라진 투여 후 생물발광 영상화에 의해 4일에 걸쳐 평가되었다.
도 43은 PBS 또는 CAR-T-세포(N1012, N1012_CXCR2, Cyad-01 복제물 또는 비형질도입된 T-세포)로 처리된 Kuramochi 종양을 보유하는 NSG 마우스의 Kaplan-Meier 생존 곡선이다. 5 x 106 T-세포를 종양 접종 후 17일차에 투여하고 5 x 106 T-세포의 추가 용량을 다음 날 i.v.로 투여했다.
도 44는 종양 이식 후 111일에 PBS 또는 10 x 106 CAR T-세포(N1012_CXCR2, N1012, CYAD-01_10, 또는 비형질도입된 T-세포)를 i.v. 투여한 후 s.c. 중피종 환자 유래된 이종이식을 갖는 개별 NSG 마우스에서 캘리퍼 측정으로 평가한 종양 부피를 보여준다.
도 45는 종양 이식 후 111일에 PBS 또는 10 x 106 CAR T-세포(N1012_CXCR2, N1012, CYAD-01_10, 또는 비형질도입된 T-세포)로 i.v. 처리된 s.c. 중피종 환자 유래된 이종이식을 갖는 개별 NSG 마우스의 Kaplan-Meier 생존 곡선이다.
1. 정의
청구범위 및 명세서에서 사용되는 용어는 달리 명시하지 않는 한 아래와 같이 정의된다.
본원에 사용된 용어 "포유동물"은 인간 및 비인간을 모두 포함하며, 인간, 비인간 영장류, 개과, 고양이과, 쥐과, 소, 말, 및 돼지를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
"쥐과(murine)"라는 용어는 Murinae 아과(subfamily)의 설치류를 의미한다. "쥐과"라는 용어는 래트와 마우스를 포함한다.
"키메라 NKG2D 폴리펩티드"라는 용어는 둘 이상의 서로 다른 유기체로부터의 도메인으로 형성된 NKG2D 수용체를 의미한다. 키메라 NKG2D 폴리펩티드는 WO 2021/234163에 더 자세히 설명되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 백분율 "동일성"은 최대 일치성을 위해 비교하고 정렬할 때 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 특정 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 부분서열을 의미하며, 상기 일치성은 아래 설명된 서열 비교 알고리즘(예: BLASTP 및 BLASTN 또는 당업자가 이용할 수 있는 다른 알고리즘) 중 하나를 사용하거나 육안 검사를 통해 측정한 것이다. 적용에 따라, 백분율 "동일성"은 비교되는 서열의 영역, 예를 들어 기능적 도메인에 걸쳐 존재할 수 있거나, 대안적으로는 비교되는 두 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재할 수 있다.
서열 비교를 위해 일반적으로는 하나의 서열이 테스트 서열을 비교하는 참조 서열 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우 테스트 및 참조 서열이 컴퓨터에 입력되고 필요한 경우 하위 서열 좌표가 지정되며 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수에 기초하여 참조 서열에 대한 테스트 서열(들)의 서열 동일성 백분율을 계산한다.
본 명세서의 목적을 위해, 동일성 백분율 및 서열 유사성은 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)]에 개시되어 있는 BLAST 알고리즘을 사용하여 수행된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 이용가능하다.
본 명세서에 사용된 용어 "개체"는 인간 및 비인간 동물(예를 들어, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 가금류, 어류, 갑각류 등)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 동물을 광범위하게 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 유익하거나 원하는 결과를 달성하기에 충분한 조성물(예: 합성 펩티드)의 양을 의미한다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투여용량으로 투여될 수 있으며 특정 제제 또는 투여 경로로 제한되는 것을 의도하지 않는다.
"치료적 유효량"이라는 용어는 질병의 증상을 개선하는데 효과적인 양이다. 예방이 치료법으로 간주될 수 있으므로 치료적 유효량은 "예방적으로 유효량"일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "투여" 및 "투여하는"은 개체 또는 생체내(in vivo), 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo) 세포, 조직 및 기관에 약물, 전구약물, 또는 기타 제제, 또는 치료적 처치(예: 펩티드)를 제공하는 행위를 의미한다. 인체에 대한 예시적인 투여 경로는 뇌 또는 척수의 거미막 아래 공간(척수강내), 눈(안과적), 입(구강), 피부(국소 또는 경피), 코(비강), 폐(흡입제), 구강 점막(협측 또는 설측), 귀, 직장, 질, 주사(예: 정맥내, 피하, 종양내, 복강내 등) 등등으로 통할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료(처리)"는 유익하거나 의도된 임상 결과를 얻기 위한 접근 방식을 의미한다. 유익하거나 의도된 임상 결과는 증상의 완화, 질병의 중증도 감소, 질병 또는 상태의 근본 원인 억제, 질병을 비진행 상태로 유지, 질병 진행 지연 및/또는 질병 상태의 개선 또는 완화를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "약학적 조성물"은 활성 성분과 불활성 또는 활성 담체의 조합을 의미하며, 이는 조성물을 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외 치료 또는 진단 용도에 특히 적합하게 만든다.
본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용되는" 또는 "약리학적으로 허용되는"은 개체에게 투여될 때 유해 반응, 예를 들어 독성, 알레르기, 또는 면역학적 반응을 실질적으로 생성하지 않는 조성물을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "포함하다" 및 "함유하다"라는 단어와 단어의 변형, 예를 들어 "포함하는" 및 "포함한다"는 "포함하지만 이에 국한되지 않음"을 의미하며 다른 구성요소, 정수 또는 단계를 배제하지 않는다. 더욱이, 단수형은 문맥에서 달리 요구하지 않는 한 복수형을 포함한다: 특히, 부정관사가 사용되는 경우, 명세서는 문맥에서 달리 요구하지 않는 한 단수성뿐만 아니라 복수성도 고려하는 것으로 이해되어야 한다.
명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "일", "하나" 및 "상기"는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수형을 포함한다는 점에 유의해야 한다.
2. NKG2D, CXCR2, 및 선택적으로 DAP10, DAP12, 또는 DAP10/DAP12 융합 폴리펩티드를 포함하는 면역반응 세포
본 개시내용의 면역반응 세포는 NKG2D 폴리펩티드, CXCR2 폴리펩티드, 및 선택적으로 DNAX-활성화 단백질 10(DAP10) 폴리펩티드 또는 그의 기능적 변이체, DNAX-활성화 단백질 12(DAP12) 폴리펩티드 또는 그의 기능적 변이체, 및/또는 또는 DAP10 폴리펩티드 또는 그의 기능적 변이체와 DAP12 폴리펩티드 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다.
2.1. DAP10 폴리펩티드 및 이의 기능적 변이체
DAP10 폴리펩티드는 특정 유기체 및 특정 세포 유형에서 내인적으로 발현될 수 있다. 일 구체예에서, DAP10 폴리펩티드 또는 그의 변이체는 내인성이다. 대안적으로, DAP10 폴리펩티드 또는 그의 변이체는 외인성일 수 있다.
본 개시내용의 DAP10 폴리펩티드는 포유동물, 예를 들어 인간일 수 있다. 야생형 인간 DAP10은 UniProt 수탁 번호: Q9UBK5(서열번호 1)를 갖는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 이것은 93 아미노산 폴리펩티드이다. 처음 18 아미노산은 신호/리더 서열, 아미노산 19-48은 세포외 도메인, 아미노산 49-69는 막관통 도메인, 및 아미노산 70-93은 세포질/세포내 도메인으로 간주된다.
일 구체예에서, 본 개시내용의 융합 폴리펩티드에 사용된 DAP10 폴리펩티드는 서열번호 1의 DAP10 폴리펩티드에 대해 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 개시내용의 융합 폴리펩티드에 사용된 DAP10 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 개시내용의 융합 폴리펩티드에 사용되는 기능적 변이체 DAP10 폴리펩티드는 DAP10의 아미노산(예: 야생형 인간 DAP10(서열번호 1)의 아미노산)의 임의의 아미노산을 부가, 결실 또는 치환하는 점 돌연변이 중 하나 이상(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)을 포함할 수 있다.
DAP10 폴리펩티드의 절단된 버전은 또한 본 개시내용의 융합 폴리펩티드에 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 19-93만을 포함하는(즉, 아미노산 1-18, 신호/리더 서열이 없는) 절단된 버전의 DAP10이 본 개시내용의 융합 폴리펩티드에 사용될 수 있다. 이러한 서열은 본원에서 서열번호 2로 지칭된다. 다른 절단된 버전은 서열번호 1의 아미노산 19-69를 포함할 수 있으며, 이러한 서열은 DAP10의 세포외 및 막관통 도메인만을 포함하고 본원에서 서열번호 3으로 지칭된다. 본 발명에 사용된 DAP10의 추가적으로 절단된 버전은 서열번호 1의 아미노산 1-71(즉, 신호/리더 서열, 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포질/세포내 도메인으로부터의 2개 아미노산)을 포함할 수 있으며, 본 명세서에서 서열번호 4로 지칭된다. 본 발명에서 사용된 DAP10의 추가적인 절단 버전은 서열번호 1의 아미노산 19-71(즉, 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포질/세포내 도메인으로부터의 2개 아미노산)을 포함할 수 있으며, 이는 본원에서 서열번호 5로 지칭한다. 본 발명에 사용된 DAP10의 추가적인 절단 버전은 본원에서 서열번호 6으로 지칭되는 서열번호 1의 아미노산 70-93(즉, 세포내 도메인)을 포함할 수 있다. 본 발명에 사용된 DAP10의 또 다른 추가적인 절단 버전은 서열번호 1의 아미노산 49-93(즉, 막관통 및 세포질/세포내 도메인)을 포함할 수 있으며, 이는 본원에서 서열번호 7로 지칭된다. 본 발명에 사용된 DAP10의 또 다른 추가적인 절단 버전은 서열번호 1의 아미노산 49-69(즉, 막관통 도메인)를 포함할 수 있으며, 이는 본원에서 서열번호 8로 지칭된다.
DAP10 폴리펩티드의 다른 돌연변이된 버전 또는 절단된 버전이 또한 본 개시내용에서 사용하기에 적합하다. 일부 구체예에서, 본 개시내용에서 DAP10 폴리펩티드의 기능적 변이체로서 사용되는 돌연변이된 버전 또는 절단된 버전은 서열번호 1에 제시된 야생형 폴리펩티드의 활성을 보유한다.
일 구체예에서, 본 개시내용의 DAP10 폴리펩티드의 기능적 변이체는 서열번호 1에 나타낸 야생형 폴리펩티드의 활성의 10% 이상(예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)을 보유한다. 일 구체예에서, 상기 활성은 DAP10의 티로신 인산화 및/또는 포스파티딜이노시톨 3-키나제의 p85 서브유닛 및 다운스트림 항-아폽토시스 키나제, AKT의 동원 및 활성화의 평가에 의해 측정할 수 있다.
통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, DAP10은 일반적으로 동종이량체(homodimer)로 존재한다. 따라서, 일 구체예에서, 면역반응 세포는 본 개시내용에 따른 2개의 DAP10 폴리펩티드를 포함하는 DAP10 동종이량체를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 면역반응 세포는 DAP10 이종이량체(heterodimer)를 포함하고, DAP10 이종이량체의 각 펩티드는 본 개시내용의 상이한 DAP10 폴리펩티드를 포함한다.
2.2. DAP12 폴리펩티드 및 이의 기능적 변이체
DAP12 폴리펩티드는 특정 유기체 및 특정 세포 유형에서 내인적으로 발현될 수 있다. 일 구체예에서, DAP12 폴리펩티드 또는 그의 변이체는 내인성이다. 대안적으로, DAP12 폴리펩티드 또는 그의 변이체는 외인성일 수 있다.
본 개시내용의 DAP12 폴리펩티드는 포유동물, 예를 들어 인간일 수 있다. 야생형 인간 DAP12는 UniProt 수탁 번호: O43914(서열번호 9)를 갖는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 처음 21개 아미노산은 신호/리더 서열, 아미노산 22-40은 세포외 도메인, 아미노산 41-61은 막관통 도메인, 및 아미노산 62-113은 세포질/세포내 도메인으로 간주된다.
일 구체예에서, 본 개시내용의 융합 폴리펩티드에 사용되는 DAP12 폴리펩티드는 서열번호 9의 DAP12 폴리펩티드에 대해 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 개시내용의 융합 폴리펩티드에 사용된 DAP12 폴리펩티드는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 개시내용의 융합 폴리펩티드에 사용되는 기능적 변이체 DAP12 폴리펩티드는 DAP12의 아미노산(예: 야생형 인간 DAP12(서열번호 9)의 아미노산)의 임의의 아미노산을 부가, 결실 또는 치환하는 점 돌연변이 중 하나 이상(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)을 포함할 수 있다.
DAP12 폴리펩티드의 절단된 버전은 또한 본 개시내용의 융합 폴리펩티드에 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 9의 아미노산 22-113만을 포함하는(즉, 아미노산 1-21, 신호/리더 서열이 없는) 절단된 버전의 DAP12가 본 개시내용의 융합 폴리펩티드에 사용될 수 있다. 이러한 서열은 본원에서 서열번호 10으로 지칭된다. 다른 절단된 버전은 서열번호 9의 아미노산 62-113을 포함할 수 있으며, 이러한 서열은 DAP12의 세포질/세포내 도메인만을 포함하고 본원에서 서열번호 11로 지칭된다. 다른 절단 버전은 서열번호 9의 아미노산 41-61(즉, 막관통 도메인)을 포함할 수 있으며, 본 명세서에서 서열번호 12로 지칭된다. 또 다른 절단 버전은 서열번호 9의 아미노산 22-61(즉, 세포외 및 막관통 도메인)을 포함할 수 있으며, 이는 본원에서 서열번호 13으로 지칭된다.
DAP12 폴리펩티드의 다른 돌연변이된 버전 또는 절단된 버전이 또한 본 개시내용에서 사용하기에 적합하다. 일부 구체예에서, 본 개시내용에서 DAP12 폴리펩티드의 기능적 변이체로서 사용되는 이러한 돌연변이된 버전 또는 절단된 버전은 서열번호 9에 제시된 야생형 폴리펩티드의 활성을 보유한다.
일 구체예에서, 본 개시내용의 DAP12 폴리펩티드의 기능적 변이체는 서열번호 9에 나타낸 야생형 폴리펩티드의 활성의 10% 이상(예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)을 보유한다. 일 구체예에서, 상기 활성은 MTT와 같은 기능적 어세이 및 ELISA에 의한 사이토카인 분비 측정을 사용하여 측정할 수 있다.
통상의 기술자는 DAP12가 일반적으로 동종이량체로 존재한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 일 구체예에서, 면역반응 세포는 본 개시내용에 따른 2개의 DAP12 폴리펩티드를 포함하는 DAP12 동종이량체를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 면역반응 세포는 DAP12 이종이량체를 포함하며, DAP12 이종이량체의 각 펩티드는 본 개시내용의 상이한 DAP12 폴리펩티드를 포함한다.
2.3. DAP10/DAP12 융합 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드
본 발명의 융합 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드와 결합(associate)할 수 있다. 이러한 결합은 상보적으로 하전된 아미노산에 의해 제공되는 것과 같이 정전기력으로 인한 것일 수 있다.
본 발명의 융합 폴리펩티드와 결합할 수 있는 이러한 폴리펩티드의 일 예는 NKG2D 폴리펩티드이다(Wu et al., 2000, J. Exp. Med., 192(7):1059-1067 및 Rosen et al., 2004, J. Immunol., 173(4):2470-2478).
일 구체예에서, 이러한 폴리펩티드는 본 개시내용의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 인접한 키메라 구축물의 일부로서 유전적으로 코딩될 수 있다. 다음으로 융합 폴리펩티드 및 다른 폴리펩티드는 번역 동안(예를 들어, 리보솜 스킵 펩티드를 사용하여) 또는 번역 후 절단에 의해(예를 들어, 푸린 절단 부위를 사용하여) 분리될 수 있다. 따라서 융합 폴리펩티드 및 다른 폴리펩티드는 선택적 링커에 의해 연결될 수 있다. 이러한 링커는 절단을 용이하게 하는 절단 부위를 포함할 수 있다.
2.3.1. NKG2D 폴리펩티드 및 이의 기능적 변이체
본 개시내용의 NKG2D 폴리펩티드는 포유동물, 예를 들어 인간일 수 있다. 야생형 인간 NKG2D는 UniProt 수탁 번호: P26718(서열번호 14)를 갖는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 상기 폴리펩티드는 세포질 도메인(아미노산 1-51), 막관통 도메인(아미노산 52-72) 및 세포외 도메인(아미노산 73-216)을 포함하는 것으로 간주된다.
일 구체예에서, 본 개시내용에서 사용되는 NKG2D 폴리펩티드는 서열번호 14의 NKG2D 폴리펩티드에 대해 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 개시내용에서 사용된 NKG2D 폴리펩티드는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 개시내용에서 사용되는 기능적 변이체 NKG2D 폴리펩티드는 NKG2D의 아미노산(예: 야생형 인간 NKG2D(서열번호 14)와 같은 것)의 임의의 아미노산을 부가, 결실 또는 치환하는 점 돌연변이 중 하나 이상(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)을 포함할 수 있다.
NKG2D 폴리펩티드의 절단된 버전은 또한 본 개시내용의 융합 폴리펩티드에 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 14의 아미노산 73-216만을 포함하는(즉, 세포외 도메인) 절단된 버전의 NKG2D가 본 개시내용에 사용될 수 있다. 이러한 서열은 본원에서 서열번호 15로 지칭된다. 다른 절단된 버전은 서열번호 14의 아미노산 82-216을 포함할 수 있으며, 이러한 서열은 NKG2D의 세포외 도메인 부분을 포함하고 본원에서 서열번호 16으로 지칭된다. 추가적인 절단 버전은 서열번호 14의 아미노산 52-216(즉, 막관통 및 세포외 도메인)을 포함하며, 본 명세서에서 서열번호 17로 지칭된다.
NKG2D 폴리펩티드의 다른 돌연변이된 버전 또는 절단된 버전이 또한 본 개시내용에서 사용하기에 적합하다. 본 개시내용에서 NKG2D 폴리펩티드의 기능적 변이체로서 사용되는 임의의 이러한 돌연변이된 버전 또는 절단된 버전은 서열번호 14에 제시된 야생형 폴리펩티드의 활성을 바람직하게 보유하여야 한다.
일 구체예에서, 본 개시내용의 NKG2D 폴리펩티드의 기능적 변이체는 서열번호 14에 나타낸 야생형 폴리펩티드의 활성의 10% 이상(예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)을 보유한다. 일 구체예에서, 상기 활성은 NKG2D 리간드에 대한 지속적인 결합을 확인하기 위해 유세포 분석을 사용하고 표적 세포 용해, 사이토카인 분비 및 공동-자극을 확인하기 위한 다양한 세포 배양 어세이(MTT 및 ELISA와 같은 것)을 통해 측정할 수 있다.
일부 구체예에서, NKG2D 폴리펩티드는 키메라 폴리펩티드이다. 특정 구현예에서, NKG2D 폴리펩티드는 인간-쥐과의 키메라 폴리펩티드이다. 일 구체예에서, 상기 키메라 NKG2D 폴리펩티드는 N 말단에서 C 말단까지 쥐과 NKG2D 막관통 도메인 또는 이의 변이체 및 인간 NKG2D 세포외 도메인 또는 이의 변이체를 포함한다. 키메라 NKG2D 폴리펩티드는 WO 2021/234163에 더 자세히 설명되어 있으며, 이 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
2.3.2. CXCR2 폴리펩티드 및 이의 기능적 변이체
본 개시내용의 CXCR2 폴리펩티드는 포유동물, 예를 들어 인간일 수 있다. 야생형 인간 CXCR2는 UniProt 수탁번호 P25025(서열번호 87)를 갖는 아미노산 서열에 의해 코딩된다.
일 구체예에서, 본 개시내용의 CXCR2 폴리펩티드는 서열번호 87의 CXCR2 폴리펩티드에 대해 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 본 개시내용의 CXCR2 폴리펩티드는 서열번호 87의 아미노산 서열을 갖는다.
일 구체예에서, 본 개시내용의 CXCR2 폴리펩티드는 서열번호 87의 CXCR2 폴리펩티드의 기능적 변이체이다. 일 구체예에서, 기능적 변이체 CXCR2 폴리펩타이드는 CXCR2(예를 들어, 서열번호 87)의 아미노산들을 부가, 결실, 또는 치환하는 점 돌연변이 하나 이상(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)을 포함한다.
일 구체예에서, 본 개시내용의 기능적 변이체 CXCR2 폴리펩티드는 야생형 인간 CXCR2(서열번호 87)의 활성의 적어도 10%(예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 이상)를 보유한다. 일 구체예에서, 폴리펩티드의 활성은 CXCR2가 리간드(예를 들어 IL-8)에 결합하는지 확인하기 위해 유동 세포측정법을 사용하여 측정된다. 일 구체예에서, 상기 폴리펩티드의 활성은 관련 업계에 공지된 세포 배양 검정을 통해 측정된다.
2.4. 링커
본원에 기재된 DAP10/DAP12 융합 단백질의 DAP10 및 DAP12 모이어티는 연속적인 폴리펩티드 사슬에서 서로 직접 결합될 수 있거나, 적합한 링커를 통해 서로 간접적으로 결합될 수 있다. 상기 링커는 펩티드 링커일 수 있다. 펩티드 링커는 융합 폴리펩티드에 일반적으로 사용되며 링커를 선택하거나 설계하는 방법은 잘 알려져 있다. (예를 들어, Chen X et al., 2013, Adv.Drug Deliv.Rev.65(10):135701369 및 Wriggers W et al., 2005, Biopolymers 80:736-746. 참조) 링커는 또한 상기 기재된 바와 같은 키메라 구축물에서 본 개시내용의 융합 폴리펩티드를 다른 폴리펩티드(예를 들어, NKG2D 폴리펩티드)에 연결하는 데 사용될 수 있다.
펩티드 링커는 일반적으로 i) 가요성 링커, ii) 나선 형성 링커, 및 iii) 절단 가능한 링커로 분류되며, 각 유형의 예는 관련 업계에 공지되어 있다. 일 예에서, 가요성 링커는 본원에 기재된 융합 폴리펩티드에 포함된다. 가요성 링커는 글리신 및 알라닌과 같이 입체적으로 방해받지 않는 대부분의 아미노산을 함유할 수 있다. 친수성 아미노산 Ser은 또한 가요성 링커에 통상적으로 사용된다. 가요성 링커의 예는 폴리글리신(예를 들어, (Gly)4 및 (Gly)5), 폴리알라닌 폴리(Gly-Ala), 및 폴리(Gly-Ser) (예를 들어, (Glyn-Sern)n 또는 (Sern-Glyn)n, 여기서 각각의 n은 독립적으로 1과 같거나 큰 정수이다)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
펩티드 링커는 적절한 길이일 수 있다. 펩티드 링커 서열은 길이가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 그보다 많은 아미노산 잔기일 수 있다. 예를 들어, 펩티드 링커는 길이가 약 5 내지 약 50개의 아미노산; 길이가 약 10 내지 약 40개의 아미노산; 길이가 약 15 내지 약 30개의 아미노산; 또는 길이가 약 15 내지 약 20개의 아미노산일 수 있다. 펩티드 링커 길이의 변화는 활성을 보유하거나 향상시켜 활성 연구에서 우수한 효능을 일으킬 수 있다. 펩티드 링커 서열은 천연 또는 비-천연 발생 아미노산, 또는 천연 및 비-천연 발생 아미노산 둘 다의 혼합물로 구성될 수 있다.
일부 양상에서, 아미노산 글리신 및 세린은 링커 서열 내의 아미노산을 포함한다. 특정 측면에서, 링커 영역은 글리신 반복부(GSG3)n(서열번호 18)의 세트를 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수(예: 1 내지 약 20)이다. 보다 구체적으로, 상기 링커 서열은 GSGGG(서열번호 19)일 수 있다. 상기 링커 서열은 GSGG(서열번호 20)일 수 있다. 특정 다른 양상에서, 링커 영역 배향은 글리신 반복부(SerGly3)n의 세트를 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수(예: 1 내지 약 20)(서열번호 21)이다.
다른 구체예에서, 링커는 무작위 또는 반복 패턴으로 글리신(G) 및 세린(S)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 링커는 (GGGGS)n (서열번호 22)일 수 있으며, 여기서 n은 1 내지 20, 예를 들어 1 내지 4 범위의 정수이다. 특정 예에서, n은 4이고 링커는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 23)이다. 또 다른 특정 예에서, n은 3이고 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 24)이다.
다른 구체예에서, 링커는 무작위 또는 반복 패턴으로 글리신(G), 세린(S) 및 프롤린(P)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 링커는 (GPPGS)n일 수 있으며, 여기서 n은 1 내지 20 범위의 정수, 예를 들어 1 내지 4이다. 특정 예에서, n은 1이고 링커는 GPPGS(서열번호 25)이다.
일반적으로 링커는 인간과 같은 환자에게 투여될 때 면역원성이 아니다. 따라서, 링커는 면역원성이 낮거나 면역원성이 낮은 것으로 생각되도록 선택할 수 있다.
본 명세서에 기재된 링커는 예시적이며, 상기 링커는 원하는 경우 Glu 및 Lys와 같은 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 펩티드 링커는 원한다면 예를 들어, (G3S)(서열번호 26), (G4S)(서열번호 27), (GYS)(서열번호 28), 및/또는 (GlySer)(서열번호 29)의 다중 반복부를 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 펩티드 링커는 예를 들어, (SG4)(서열번호 30), (SG3)(서열번호: 31), (SG2)(서열번호: 32), (SG)2(서열번호 33) 또는 (SerGly)(서열번호 34)의 다중 반복부를 포함할 수 있다.
다른 양상에서, 펩티드 링커는 (G3S)+(G4S)+(GlySer)(서열번호 26 + 서열번호 27 + 서열번호 29)와 같은 반복 아미노산 서열 단위의 조합 및 배수를 포함할 수 있다. 다른 양상에서, Ser은 Ala, 예를 들어 (G4A)(서열번호 35) 또는 (G3A)(서열번호 36)로 대체할 수 있다. 또 다른 측면에서, 링커는 모티프 (EAAAK)n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수, 예를 들어 1 내지 약 20(서열번호 37)이다. 특정 양상에서, 펩티드 링커는 또한 절단가능한 링커를 포함할 수 있다.
상기 링커는 푸린 절단 부위(RRKR)(서열번호 38), P2A 리보솜 스킵 펩티드(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)(서열번호 39) 및/또는 T2A 리보솜 스킵 펩티드(EGRGSLLTCGDVEENPGP)(서열번호 40)와 같은 추가 도메인 및/또는 특징을 포함할 수 있다. 이들 도메인을 포함하는 링커의 예는 SGSG + P2A 리보솜 스킵 펩티드(SGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP)(서열번호 41), SGSG + T2A 리보솜 스킵 펩티드(SGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP)(서열번호 42), 및 푸린 절단 부위도 포함하는 버전, 즉, 푸린 절단 부위 + SGSG + P2A 리보솜 스킵 펩티드(RRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP)(서열번호 43) 및 푸린 절단 부위 + SGSG + T2A 리보솜 스킵 펩티드(RRKRSGSGEGRGSLLTCGDVENPGP4)(서열번호 44)을 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 대안적인 리보솜 스킵 펩티드는 F2A(VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP)(서열번호 45) 및 E2A(QCTNYALLKLAGDVESNPGP)(서열번호 46)를 포함한다.
2.5. N-말단 서열 및 C-말단 서열
다양한 서열이 본 개시내용의 융합 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에, 또는 본원에 개시된 NKG2D 폴리펩티드에 부착될 수 있다. 이들은 신호 펩티드, 정제 태그/서열, 또는 반감기 연장 모이어티와 같이 기능적일 수 있거나, 또는 단순히 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이들은 T-세포 자극 기능과 같은 기능을 포함할 수 있다.
2.5.1. 정제 태그 및 마커
다양한 태그 또는 마커가 정제를 돕기 위해 본 개시내용의 융합 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 부착될 수 있다. 임의의 친화성 태그는 정제를 돕기 위해 본 개시내용의 융합 폴리펩티드와 조합될 수 있다. 이러한 친화성 태그의 예로는 His-태그, FLAG-태그, Arg-태그, T7-태그, Strep-태그, S-태그, aptamer-태그, V5 태그, AviTagTM, myc 에피토프 태그 또는 이러한 태그의 임의의 조합이다. 일 구체예에서, 친화성 태그는 His-태그(보통 5-10개의 히스티딘 잔기를 포함), 예를 들어 6His 태그(즉, HHHHHH)(서열번호 47)이다. 또 다른 구체예에서, 친화성 태그는 FLAG 태그(즉, DYKDDDDK)(서열번호 48)이다. 또 다른 구체예에서, 친화성 태그는 AviTagTM(즉, GLNDIFEAQKIEWHE)(서열번호 49)이다. 또 다른 구체예에서, 친화성 태그는 V5 태그(GKPIPNPLLGLDST)(서열번호 50) 또는 (IPNPLLGLD)(서열번호 51)이다. 또 다른 구체예에서, 친화성 태그는 9e10 항체(EQKLISEEDL)(서열번호 52)에 의해 인식되는 myc 에피토프 태그이다. 본 개시내용에서 사용하기 위한 다양한 다른 태그는 관련 업계에 잘 알려져 있다.
N-말단에서 하나 이상의 태그, C-말단에서 하나 이상의 태그, 또는 N-말단 및 C-말단 각각에서 하나 이상의 태그를 포함하는 이러한 친화성 태그의 조합이 또한 사용될 수 있다. 이러한 조합의 예로는 AviTag(A)와 결합된 His 태그(H), 또는 AviTag(A) 및 FLAG 태그(F) 모두와 결합된 His 태그(H)를 포함한다. 태그는 두 방향 중 하나일 수 있으므로 AviTag/His 태그는 N-AH-C 또는 N-HA-C 방향을 가질 수 있는 반면 Avi/His/FLAG 태그는 N-AHF-C, N-FHA-C, 등의 방향을 가질 수 있다.
일 구체예에서, 본 개시내용에 따른 융합 폴리펩티드는 서열 "GLNDIFEAQKIEWHEGGHHHHHHDYKDDDDK" (서열번호 53)을 갖는 "AHF" 태그를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 개시내용에 따른 융합 폴리펩티드는 서열 "DYKDDDDKHHHHHHGGGLNDIFEAQKIEWHE" (서열번호 54)을 갖는 "FHA" 태그를 포함한다.
CD8α 리더 서열(UniProt: P01732의 아미노산 1-21 또는 아미노산 1-18을 포함하는 단축된 유도체)은 일반적으로 사용되는 T-세포 서열이며, 본원에서 서열번호 55로 지칭된다.
2.5.2. 공동-자극 서열
다양한 T-세포 공동-자극 활성화 서열은 CAR-T-세포를 조작하기 위한 이전 작업으로부터 알려져 있다. 이들은 또한 본 개시내용의 융합 폴리펩티드에 첨가될 수 있다.
4-1BB 엔도도메인(UniProt: Q07011의 아미노산 214-255)은 또한 N- 또는 C-말단 서열로 사용될 수 있다. 4-1BB 엔도도메인은 본원에서 서열번호 56으로 지칭된다. 4-1BB 엔도도메인은 공동자극 도메인으로서 작용할 수 있다.
CD27 엔도도메인(UniProt: P26842의 아미노산 213-260)은 또한 N- 또는 C-말단 서열로서 사용될 수 있다. CD27 엔도도메인은 본원에서 서열번호 57로서 지칭된다. CD27 엔도도메인은 공동-자극 도메인으로서 작용할 수 있다.
인간 IgG1 힌지(UniProt: P0DOX5의 아미노산 218-229)는 또한 N- 또는 C-말단 서열로서 사용될 수 있다. 인간 IgG1 힌지는 서열번호 58로서 지칭된다.
절단된 CD8α 힌지(Uniprot: P01732의 아미노산 138-182)도 N- 또는 C-말단 서열로서 사용될 수 있다. 절단된 CD8α 힌지는 서열번호 59로 지칭된다.
2.6. 예시적인 구축물
본 개시내용은 표 1에서 하기 예시적인 융합 폴리펩티드 구축물을 제공한다:
표 1: 예시적인 DAP10/DAP12 융합 폴리펩티드 구축물
또한, 상기 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 융합 폴리펩티드는 번역-결합된(translation-associated) 또는 번역후 절단을 위해 NKG2D 폴리펩티드를 갖는 단일 키메라 구축물로서 발현될 수 있다. 이러한 구축물에서, 발현 후, 번역된 폴리펩티드는 절단되어 별도의 폴리펩티드를 생성한 다음 자가-결합하여 CAR을 형성한다. 일 구체예에서, 본 개시내용의 융합 폴리펩티드는 NKG2D 폴리펩티드로부터 절단된다. 이러한 구축물의 예는 표 2에 나타나 있다.
표 2 내지 표 3: 예시적인 키메라 구축물
2.7. 본 개시내용의 NKG2D, CXCR2, DAP10, DAP12, 및 DAP10/DAP12 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
본 개시내용의 또 다른 양상은 본 개시내용의 하나 이상의 융합 폴리펩티드 또는 키메라 구축물을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이것은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 본원에서 구체적으로 제한되지 않는 한, 이 용어는 참조 핵산과 유사한 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예는 제한 없이 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포레이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)을 포함한다. 달리 표시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체(예: 축퇴 코돈 치환) 및 상보적 서열, 뿐만 아니라 명시적으로 표시된 서열을 암시적으로 포함한다. 구체적으로, 하기에 상세히 기술된 바와 같이, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., 1991, Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:2605-2608; and Rossolini et al., 1994, Mol. Cell. Probes 8:91-98).
따라서, 본 개시내용은 또한 서열번호 60-69, 87, 90, 및 102 중 어느 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
본 개시내용은 서열번호 60-69, 87, 90, 및 102 중 어느 하나를 코딩하는 핵산과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 추가로 제공한다. 서열 동일성은 전형적으로 참조 서열의 전체 길이를 따라 측정된다.
본 개시내용은 서열번호 70-79, 88, 91, 및 103 중 어느 하나와 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 또한 서열번호 70-79, 88, 91, 및 103 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 본 개시내용은 또한 서열번호 70-79, 91, 및 103 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 구성된진 핵산을 제공한다.
폴리뉴클레오타이드 서열은 신규(de novo) 고체상 DNA 합성에 의해 또는 기존 서열(예를 들어, 하기 실시예에 기재된 바와 같은 서열)의 PCR 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 핵산의 직접적인 화학적 합성은 Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90의 포스포트리에스테르법; Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:109의 포스포디에스테르법; Beaucage et al., 1981, Tetra. Lett., 22:1859의 디에틸포스포르아미다이트법; 및 미국 특허 제4,458,066호의 고체 지지체법에 의해 달성할 수 있다. PCR에 의해 폴리뉴클레오타이드 서열에 돌연변이를 도입하는 것은 예를 들어 PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif, 1990; Mattila et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19:967; and Eckert et al., 1991, PCR Methods and Applications 1:17에 기재된 바대로 수행할 수 있다.
2.8. 벡터
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
숙주 세포에서의 발현을 위해, 본 개시내용의 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 적합한 벡터에 존재할 수 있고, 적합한 숙주에 도입된 후, 서열은 관련 업계에 공지된 표준 클로닝 및 발현 기술에 따라 코딩된 폴리펩티드(들)을 생성하기 위해 발현될 수 있다(예를 들어, Sambrook, J., Fritsh, EF 및 Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989에 기재된 바와 같음). 본 개시내용은 또한 본 개시내용에 따른 핵산 서열을 포함하는 이러한 벡터에 관한 것이다.
다양한 발현 벡터를 사용하여 본 개시내용의 폴리펩티드(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있다. 바이러스 기반 발현 벡터 및 비-바이러스 발현 벡터 모두를 사용하여 포유동물 숙주 세포와 같은 숙주 세포에서 폴리펩티드(들)을 생성할 수 있다. 비-바이러스 벡터 및 시스템은 플라스미드, 전형적으로 단백질 또는 RNA를 발현하기 위한 발현 카세트를 갖는, 에피솜 벡터, 및 인간 인공 염색체를 포함한다(예를 들어, Harrington et al., 1997, Nat Genet. 15:345 참조). 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 인간) 세포에서 본 개시내용의 폴리펩티드(들)의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩티드의 발현에 유용한 비-바이러스 벡터는 pThioHis A, B 및 C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B 및 C,(캘리포니아주 샌디에이고 인비트로젠), MPS V 벡터, 및 기타 단백질을 발현시키기 위해 관련 업계에 공지된 수많은 기타 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터에는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노- 연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, SV40에 기초한 벡터, 유두종 바이러스, HBP 엡스타인 바르 바이러스, 백시니아 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트 바이러스(SFV)가 포함된다. Brent et al., supra; Smith, 1995, Annu. Rev. Microbiol. 49:807; and Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143 참조. 특히, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-연관 바이러스 벡터는 T-세포에서의 발현을 위해 일반적으로 사용된다. 이러한 벡터의 예에는 SFG 레트로바이러스 발현 벡터가 포함된다(Riviere et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:6733-6737 참조). 일 구체예에서, 렌티바이러스 벡터가 사용되며, 이들은 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터(소위 SIN 벡터)를 포함한다.
발현 벡터의 선택은 벡터가 발현되는 의도된 숙주 세포에 의존적이다. 포유동물 숙주 세포에 대한 발현 벡터는 복제 기점, 프로모터 및 인핸서와 같은 발현 조절 서열(예를 들어, Queen, et al., 1986, Immunol. Rev. 89:49-68 참조), 및 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열과 같은 필요한 처리 정보 부위를 포함한다. 이들 발현 벡터는 일반적으로 포유동물 유전자로부터 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형-특이적, 단계-특이적 및/또는 조절가능하거나 제어가능할 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPS V 프로모터, 테트라사이클린-유도성 CMV 프로모터( 인간 즉시-초기 CMV 프로모터와 같은 것), 구성적 CMV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터 및 관련 업계에 공지된 프로모터-인핸서 조합을 포함하며 이에 제한되지 않는다.
형질전환된 유기체의 배양은 발현 생성물이 숙주 세포에 의해 더 잘 용인되는 코딩 서열에 대한 집단을 편향시키지 않고 비-유도 조건 하에서 확장될 수 있다. 프로모터에 더하여, 다른 조절 요소가 또한 본 개시내용의 폴리펩티드(들)의 효율적인 발현을 위해 필요하거나 바람직할 수 있다. 이러한 요소는 전형적으로 ATG 개시 코돈 및 인접 리보솜 결합 부위 또는 기타 서열을 포함한다. 또한, 발현 효율은 사용 중인 세포 시스템에 적절한 인핸서를 포함함으로써 향상될 수 있다(예를 들어, Scharf et al., 1994, Results Probl. Cell Differ. 20:125; 및 Bittner et al., 1987, Meth. Enzymol., 153:516 참조). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서는 포유동물 숙주 세포에서 발현을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용은 서열번호 60-69, 87, 90, 102 중 어느 하나를 코딩하는 핵산과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터를 제공한다. 나아가 본 개시내용은 서열번호 60-69, 87, 90, 102 중 하나 이상을 코딩하는 핵산을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 서열번호 70-79, 88, 91, 103 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터를 제공한다.
2.9. 숙주 세포
본 개시내용의 폴리펩티드, 본 개시내용의 핵산, 본 개시내용의 벡터, 또는 이들 중 어느 하나 또는 둘 모두의 조합을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 세포는 일반적으로 본 개시내용에 따른 폴리펩티드(들)의 발현에 사용된다.
상기 핵산 또는 벡터는 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염될 수 있다.
용어 "형질감염"의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 도입하기 위해 일반적으로 사용되는 광범위한 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하는 것으로 의도된다.
대안적으로, 핵산 또는 벡터는 형질도입에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 상기 개시된 바와 같은 바이러스 벡터는 핵산 또는 벡터의 전달을 위해 사용될 수 있다.
원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 개시내용의 폴리펩티드(들)을 발현시키는 것이 가능하다. 대표적인 숙주 세포는 많은 E. coli 균주, CHO, CHO-K1, 및 HEK293과 같은 포유동물 세포주; Sf9 세포와 같은 곤충 세포; 및 효모 세포, 예를 들어 S. 세레비지애와 P. 파스토리스를 포함한다. 일 구체예에서 숙주 세포는 NK 세포(1차 NK 세포 또는 NK 세포주) 또는 T-세포(1차 T-세포, 또는 T-세포주)와 같은 면역반응성 세포이다. 다른 유형의 숙주 세포에는 대식세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 호중구 및 불변 NKT(iNKT) 세포가 포함된다. T-세포는 CD4+ 또는 CD8+ T-세포일 수 있다. 일 구체예에서 숙주 세포는 인간 세포이다. 일 구체예에서, 숙주 세포는 인간 T-세포이다. 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 1차 인간 T-세포이다. 사용될 수 있는 세포주는 NK 세포주 NK-92를 포함한다.
본 개시내용의 폴리펩티드(들)을 발현하기 위한 포유동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(Urlaub 및 Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220에 기술된 바와 같이 dhfr-CHO 세포를 포함하며, 예컨대 R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621에 기술된 바와 같은 DH FR 선택 마커와 함께 사용됨), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 일 구체예에서 숙주 세포는 CHO K1PD 세포이다. 다른 구체예에서 숙주 세포는 NSO1 세포이다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위한 또 다른 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 제시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입될 때, 융합 폴리펩티드는 숙주 세포에서 폴리펩티드의 발현 또는 폴리펩티드의, 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로의 분비를 허용하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산될 수 있다. 폴리펩티드는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지에서 회수할 수 있다.
3. 본 개시내용의 면역반응성 세포를 생산하는 방법
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 폴리펩티드를 포함하는 면역반응성 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 본 개시내용의 폴리펩티드(들)을 코딩하는 핵산 또는 벡터로 세포를 형질도입하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 폴리펩티드가 발현되고 NKG2D 폴리펩티드와 결합하여 CAR을 형성하도록 세포를 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 개시내용은 (i) 본 개시내용의 핵산 분자 또는 벡터를 면역반응 세포에 형질도입하는 단계, 및 (ii) 상기 형질도입된 세포가 NKG2D 폴리펩티드, DAP10/DAP12 융합 폴리펩티드, 및 CXCR2 폴리펩티드(여기서, NKG2D 폴리펩티드와 DAP10/DAP12 융합 폴리펩티드는 세포막에서 결합됨)를 발현하도록 면역반응 세포를 배양하는 단계를 포함하는 면역반응 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
추가 구체예에서, 본 개시내용은 (i) 환자로부터 T-세포 및/또는 NK 세포를 수득하는 단계, (ii) 본 개시내용의 핵산 또는 벡터를 T-세포 및/또는 NK 세포 내로 형질도입하는 단계, 및 (iii) 상기 형질도입된 세포가 NKG2D 폴리펩티드, DAP10/DAP12 융합 폴리펩티드, 및 CXCR2 폴리펩티드(여기서 NKG2D 폴리펩티드와 DAP10/DAP12 융합 폴리펩티드는 세포막에서 결합됨)를 발현하도록 T-세포 및/또는 NK 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
면역반응성 세포의 배양을 위한 다양한 방법은 관련 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Parente-Pereira AC et al. 2014, J. Biol. Methods 1(2):e7, Ghassemi S et al. 2018, Cancer Immunol Res 6(9):1100-1109, 및 Denman CJ et al. 2012, PLoS One 7(1): e30264 참조.
4. 약학적 조성물
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 약학적 조성물은 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 희석제 및/또는 담체를 포함할 수 있다. 담체는 일반적으로 의도된 투여 방식에 적합하도록 선택되고 조성물의 예를 들어 pH, 삼투압, 농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 용해 또는 방출율, 흡착, 또는 침투율을 개질, 유지, 도는 보존을 위한 제제를 포함할 수 있다. 전형적으로, 이들 담체는 염수 및/또는 완충 매질을 포함하는 수성 또는 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다.
약학적 조성물에 포함되기에 적합한 제제에는 아미노산(예: 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 라이신), 항균제, 산화방지제(예: 아스코르브산, 아황산나트륨, 또는 아황산수소나트륨), 완충제(예: 붕산염, 중탄산염, Tris-HCl, 구연산염, 인산염 또는 기타 유기산), 증량제(예: 만니톨 또는 글리신), 킬레이트제(예: 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)), 착화제(예: 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린), 충전제, 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물(예: 포도당, 만노스, 또는 덱스트린), 단백질(예: 유리 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린), 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 친수성 중합체(예: 폴리비닐피롤리돈), 저분자량 폴리펩티드, 염-형성 반대이온(예: 나트륨), 방부제(예: 벤잘코늄 염화물, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산, 또는 과산화수소), 용매(예: 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 폴리에틸렌 글리콜), 당 알코올(예: 만니톨 또는 소르비톨), 현탁제, 계면활성제 또는 습윤제(예: 플루로닉; PEG; 소르비탄 에스테르; 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80과 같은 폴리소르베이트; 트리톤; 트로메타민; 레시틴; 콜레스테롤 또는 틸록사팔), 안정성 향상제(예: 수크로스 또는 소르비톨), 등장성 향상제(예: 알칼리 금속 할로겐화물, 예를 들어 염화나트륨 또는 염화칼륨, 또는 만니톨 소르비톨), 전달 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 약제학적 아쥬반트가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
비경구 비히클에는 염화나트륨 용액, Ringer의 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨 및 락트화 링거가 포함된다. 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트와 같은 생리학적으로 허용되는 적절한 증점제가 포함될 수 있다. 정맥내 비히클에는 Ringer의 덱스트로스를 기반으로 하는 것과 같은 유체 및 영양 보충제 및 전해질 보충제가 포함된다. 일부 경우에 조성물의 장성을 조절하기 위한 제제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨이 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 많은 경우에 조성물은 실질적으로 등장성인 것이 바람직하다. 방부제 및 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스와 같은 기타 첨가제도 존재할 수 있다. 정확한 제형은 투여 경로에 따라 달라진다. 약학적 제제에 대한 추가 관련 원리, 방법 및 성분은 잘 알려져 있다(예를 들어, Allen, Loyd V. Ed, (2012) Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd Edition 참조).
본 개시내용의 약학적 조성물은 관련 업계에 공지된 다양한 방법 중 하나 이상을 사용하여 하나 이상의 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 개시내용의 약학적 조성물을 위한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척추 또는 기타 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입을 포함한다. 본원에 사용된 "비경구 투여"라는 문구는 일반적으로 주사에 의한 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관내, 피부밑(subcutaneous), 피하(subcuticular), 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일 구체예에서, 약학적 조성물은 종양내 투여된다. 비경구 투여가 고려되는 경우, 약학적 조성물은 일반적으로 멸균되고 발열원이 없고 비경구적으로 허용되는 조성물의 형태이다. 비경구 주사에 특히 적합한 비히클은 적절하게 보존된 멸균 등장액이다. 약학적 조성물은 동결건조 케이크와 같은 동결건조물의 형태일 수 있다.
대안적으로, 본원에 기재된 약학적 조성물은 비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어, 비강내, 경구, 질내, 직장, 설하 또는 국소로 투여될 수 있다.
특정 구체예에서, 약학적 조성물은 피하 투여용이다. 폴리펩티드 치료제(예를 들어, 항체, 융합 폴리펩티드 등)의 피하 투여에 적합한 제제 성분 및 방법은 관련 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 US2011/0044977, US8465739 및 US8476239를 참조하라. 전형적으로, 피하 투여를 위한 약학적 조성물은 적합한 안정화제(예를 들어, 메티오닌과 같은 아미노산, 및/또는 자당과 같은 당류), 완충제 및 강장제를 함유한다.
전형적으로, 세포 요법에서, 숙주 세포를 포함하는 조성물은 정맥내 주입에 의해 환자에게 투여된다.
본 개시내용의 약학적으로 유용한 조성물의 투여는 바람직하게는 "치료적으로 유효량" 또는 "예방적으로 유효량"(경우에 따라, 예방이 치료로 간주될 수 있음)으로 이루어지며, 이는 개인에게 이익을 나타내기에 충분하다. 투여되는 실제 양, 투여 속도 및 시간 경과는 치료되는 단백질 응집 질환의 성격과 중증도에 따라 달라질 것이다. 치료 처방(예: 복용량 결정 등)은 일반의 및 기타 의사의 책임이며 일반적으로 치료할 장애, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 실무자에게 알려진 기타 요인을 고려한다. 위에서 언급된 기술 및 프로토콜의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol,A.(ed), 1980에서 찾아볼 수 있다.
조성물은 치료할 상태에 따라, 단독으로 또는 다른 치료와 조합하여, 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다.
5. 치료 방법
일부 구체예에서, 본 개시내용의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 세포 및/또는 약학적 조성물은 질병 또는 장애를 치료하고, 예방하고/하거나 질병 증상의 발병을 지연시키기 위해 사용된다. 상기 방법은 치료적 유효량의 본 개시내용의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 세포 및/또는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 요법에서 또는 의약으로서 사용하기 위한 본 개시내용의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 숙주 세포 또는 약학적 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 병리학적 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 개시내용의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 숙주 세포 또는 약학적 조성물을 추가로 제공한다. 본 개시내용은 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 개시내용의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 숙주 세포 또는 제약 조성물을 제공한다. 또한 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 개시내용의 면역반응 세포가 제공된다. 본 개시내용은 또한 병리학적 장애 치료용 약제의 제조에 있어서 본 개시내용의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 숙주 세포 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다. 병리학적 장애의 치료 또는 예방에 있어서 본 개시내용의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 숙주 세포 또는 약학적 조성물의 용도도 제공된다. 본 개시내용은 병리학적 장애를 앓고 있는 환자에게 치료적 유효량의 본 개시내용의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 숙주 세포 또는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
본원에 사용된 용어 "질병" 및 "병리학적 장애"는 고형 종양 암, 연조직 종양, 전이성 병변 및 혈액암을 포함하나 이에 제한되지 않는 암을 포함한다. 예를 들어, 암은 간암, 폐암, 유방암, 전립선암, 림프계 암, 결장암, 신장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 급성 골수성 백혈병을 포함한 만성 또는 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 소아 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우암, 중추신경계 신생물(CNS), 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척수축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피양암, 편평세포암, T-세포 림프종, 골수이형성 증후군(MDS), 만성 골수성 백혈병-만성기(CMLCP), 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 피부 T-세포 림프종(CTCL), 말초 T-세포림프종(PTCL), 간세포암종(HCC), 위장관 기질종양(GIST), 비-소세포폐암종(NSCLC), 두경부 편평세포암종(SCCHN), 석면에 의해 유발되는 암을 포함한 환경유발성 암 및 상기 암의 조합일 수 있다. 특히, 암은 에스트로겐 수용체-양성(ERpos) 유방암 및/또는 전이성 형태의 유방암과 같은 유방암일 수 있다.
일 구체예에서 상기 암은 고형 종양 암이다. 일 구체예에서, 병리학적 장애의 치료는 종양-연관 기질 세포와 같은 비종양 세포의 표적화를 포함한다. 그러한 종양-연관 기질 세포의 예시적인 유형은 췌장 기질 세포를 포함한다. 표적이 될 수 있는 다른 유형의 비종양 세포에는 대식세포, 조절성 T-세포 및 골수-유래 억제 세포가 포함된다.
일 구체예에서, 환자는 화학요법제로 사전 치료를 받았다.
일 구체예에서, 환자에 대한 숙주 세포의 투여는 처리되지 않은 종양과 비교할 때 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 심지어 100%의 종양 크기의 감소를 초래한다.
환자에게 투여되는 숙주 세포의 양은 투여 경로, 치료되는 암, 환자의 체중 및/또는 환자의 연령을 고려해야 한다. 일반적으로, 약 1 x 106 내지 약 1 x 1011 세포가 환자에게 투여된다. 일 구체예에서, 약 1 x 107 내지 약 1 x 1010 세포, 또는 약 1 x 108 내지 약 1 x 109 세포가 환자에게 투여된다.
6. 키트
또 다른 양상에서, 시스템에 대해 본원에서 설명된 구성요소 또는 구체예가 키트로 제공된다. 예를 들어, 포유동물 세포, 관련 완충제, 배지, 유발제 또는 세포 배양 및 비리온 생산과 관련된 기타 구성요소뿐만 아니라 임의의 플라스미드가 단독으로 또는 다른 약제를 담은 별도의 용기와 선택적 사용 지침과 함께, 키트로서 냉동 및 포장된 선택적 구성요소와 제공될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 키트는 배양 용기, 바이알, 튜브 등을 포함할 수 있다.
7. 실시예
다음은 본 발명을 수행하기 위한 특정 구체예의 실시예이다. 실시예는 단지 설명의 목적으로만 제공되며 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다. 사용된 수치(예: 양, 온도 등)에 대한 정확성을 보장하기 위해 노력했다. 그러나 일부 실험적 오류와 편차는 물론 허용되어야 한다.
본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 관련 업계의 기술 내에서 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다.
7.1. 방법
T-세포 단리 및 레트로바이러스 형질도입
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 밀도-매개 원심분리를 통해 건강한 지원자의 혈액 샘플에서 단리되었다. T-세포는 72시간 동안 피토헤마글루티닌으로 활성화되었으며, 마지막 24시간 동안 100IU/mL IL-2가 첨가되었다. 1x106 활성화된 PBMC를 3mL 레트로바이러스 상청액으로 사전 처리된 레트로넥틴-코팅된 플레이트에 플레이팅했다. 각 웰은 이후 3mL 신선한 바이러스 상청액과 100IU/mL IL-2로 처리되었다. 레트로바이러스 형질도입은 GALV(stable gibbon ape leukemia virus)-유사형 293TVec 안정성 포장 세포에 의해 생성된 바이러스 입자로 수행되었다. 그 후, T-세포에 RPMI1640 배지 + 5% 정상 인간 AB 혈청 중 100IU/mL를 공급하였고, 신선한 배지 및 IL-2(100IU/mL)를 매주 3회 제공하였다.
유세포분석
293T-세포의 T-세포 형질도입 및 형질감염을 유세포 분석법으로 평가하여 적절한 이소형(isotype) 대조군으로 지시된 경우와 비교하였다. NKG2D-기반 구축물의 발현을 평가하기 위해, 세포를 마우스 항-인간 CD4-FITC, 마우스 항-인간 NKG2D-PE 및 마우스 항-인간 CD8-APC로 염색하고 적절하게 보상하였다. CD8+ T-세포에서 높은 수준의 내인성 NKG2D 발현으로 인해, 형질도입 효율을 형질도입되지 않은 CD4+ T-세포에서 NKG2D 발현에 대해 비교하였다. panErbB-특이적 T4 및 TMY CAR의 발현은 비오틴화된 염소 항-인간 EGF에 이어 PE-접합된 스트렙타비딘을 사용하여 평가되었다. 동일한 시약을 사용하여 염색된 N1012+ T-세포와 비교하여 형질도입 효율을 계산했다. 사용 전에, 형질도입 효율은 형질도입되지 않은 T-세포의 필수 비율을 스파이크하여 구축물간에 정규화했다. 이는 CAR+ T-세포의 총 수와 전체 T-세포 농도에 대해 모든 조건이 동일함을 보장했다.
세포내 염색을 수행하기 위해, 형질감염된 293T-세포를 실온에서 10분 동안 4% 포름알데히드에 고정시킨 후 투과성(permeabilization) 용액(PBS + 0.5% BSA + 0.1% 사포닌)으로 2회 세척하였다. 이어서 세포를 100uL 투과성 용액의 존재 하에 500ng PE-접합된 항-인간 NKG2D, 또는 적절한 이소형 대조군으로 염색하였다. 세포를 유세포 분석에 의한 분석 전에 투과성 용액으로 2회 추가로 세척하였다.
다수 회의 자극 후 T-세포 분화를 평가하기 위해 T-세포를 종양 세포 공동-배양물에서 제거하고 FITC-콘쥬게이트된 항인간 CD45RO, 알로피코시아닌(APC)-콘쥬게이트된 항인간 CD62L, PE-콘쥬게이트된 항인간 CCR7, FITC-콘쥬게이트된 항인간 CD4, APCCy7-콘쥬게이트된 항인간 CD8α 및 피코에리트린 시아닌7(PECy7)-콘쥬게이트된 항인간 CD27 항체로 염색했다. 2mL의 빙냉 PBS로 세척한 후 세포를 0.5mL의 빙냉 PBS에 재현탁하고 유세포 분석으로 평가했다. 적절한 이소형 및 형광 마이너스 원(FMO) 대조군으로 염색된 T-세포를 사용하여 염색 효율을 평가했다.
용량 반응 분석
1x104 종양 세포를 96-웰 플레이트의 웰(100μL)당 플레이팅하고 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션했다. 24시간 후 T-세포를 1:1 내지 1:64 범위의 log2 CAR T-세포:종양 세포 비율로 첨가하였다. 72시간 후, T-세포를 제거하고 100μL MTT 용액(500μg/mL)을 첨가한 후 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 약 1시간 동안 인큐베이션했다. MTT 용액을 제거한 후, 생성된 포르마잔 결정을 DMSO(100μL/웰)에 용해시키고 흡광도를 560nm에서 측정했다. 종양 세포 생존율은 다음과 같이 계산하였다: (T-세포가 있는 단층의 흡광도/T-세포가 없는 단층의 흡광도)*100.
재-자극 분석
1x105 종양 세포를 24-웰 플레이트의 3중 웰에 플레이팅하고 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션했다. 24시간 후, 1x105 CAR+ T-세포를 함유하는 1mL를 웰당 첨가하였다. 72시간 후, T-세포를 안온하게 제거하고 웰을 1mL PBS로 세척하였다. PBS를 제거한 후 1mL의 MTT(최종 농도 500μg/mL)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 약 1시간 동안 인큐베이션했다. 560nm에서 적절한 웰에서 흡광도를 측정하고 '용량 반응' 섹션에서 자세히 설명된 대로 종양 세포 생존율을 계산했다. 재-자극은 종양 세포 생존율이 50% 미만으로 측정된 경우 성공적인 것으로 간주되었다.
플레이트로부터 제거된 T-세포를 400xg에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 펠릿을 3.2mL R5 배지에 재현탁하고 1mL를 신선한 종양 단층(24-웰 플레이트의 웰당 1x105개 종양 세포)의 각 웰에 3중으로 첨가했다. 총 T-세포 수는 나머지 200μL의 작은 분취량의 트립판 블루 배제법(trypan blue exclusion)을 사용하여 평가했다.
결합력(Binding avidity)
표적 세포에 대한 CAR T-세포의 결합력은 증가하는 수준의 음향력에서 표적 세포에 결합된 T-세포의 백분율을 측정함으로써 평가되었다. CD19-조작된 LO68 또는 SKOV-3 종양 세포를 폴리-L-라이신으로 코팅된 z-Movi 미세유체 칩(Lumicks, Amsterdam, Netherlands)에 시딩하고 16시간 동안 배양했다. 다음날, 유동 분류된 CAR-T-세포를 칩에 연속적으로 흘려넣고 3분 선형 힘 램프를 초기화하기 전에 5분 동안 표적 세포와 인큐베이션했다. 힘 램프 동안 z-Movi 장치(Lumicks)는 플랫폼에 통합된 명시야 현미경을 사용하여 시계열 이미지를 캡처했다. 분리된 세포는 음향 노드를 향해 공중에 띄워져 XY 위치를 기반으로 세포를 추적할 수 있다. Z 위치의 변화는 회절 패턴의 변화를 가져오며, 이는 기판에 부착된 세포와 음향 노드에 매달린 세포 사이의 구별을 허용한다. 이 정보는 세포 분리 사건을 특정 파열력과 연관시키는 데 사용되었다. 세포 분리는 (z-Movi Tracking_v1.6.0)을 사용하여 획득했으며 실험 후 이미지 분석은 Cell Tracking offline analysis_v2.1을 사용하여 수행되었다.
ELISA
T-세포에 의한 IFN-γ 및 IL-2의 분비는 Duo-set 및 Ready-Steady-Go ELISA 키트를 각각 사용하여 공-배양 개시 24시간 후에 제거된 상청액 분취액에서 평가되었다.
종양 스페로이드(spheroid) 생성
종양 스페로이드를 생성하기 위해 1x103 종양 세포 및 1x103 PS1 성상 세포를 초저 친화도 96-웰 플레이트의 웰당 추가하고 37℃ 및 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션했다. 스페로이드 생성은 표준 광학 현미경 시각화에 의해 확인되었다.
생체 내(In vivo) 연구
생물발광 이미징
1x105 반딧불이 루시퍼라제(ffLUC)-태그된 BxPC3 세포를 NSG 마우스의 복강 내로 주사했다. 종양 접종 12일 후, 마우스(군 당 n = 5)를 PBS, 4x106(N1012+(N1012(lo)), T4+ 또는 TMY+ CAR T-세포) 또는 1x107(N1012(hi) 또는 NKG2D) CAR+ T-세포로 복강 내 처리했다. 대안적으로, NSG 마우스를 1x106 ffLUC-태그된 H226 악성 중피종 세포로 복강내 접종했다. 종양 접종 8일 후, 마우스를 PBS, 또는 4x106 N1012+ T-세포로 처리했다. 대조군으로서, 한 군의 마우스를 NKG2D만을 발현하는 4x106 T-세포로 처리하였다.
또 다른 연구에서는 NSG 마우스에 1 x 105 ffLuc-발현 Ovsaho 또는 5 x 105 ffLuc-발현 SKOV-3 세포로 복강내 접종을 실시했다. Ovasho 세포로 접종된 마우스를 복강내 주사(종양 접종 후 6일) 또는 정맥내 주사(접종 후 7일)를 통해 PBS 또는 5 x 106 CAR T-세포(N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01 복제물, 또는 비형질도입)로 처리했다. SKOV-3 세포로 접종된 마우스를 종양 접종 14일에 PBS 또는 1 x 107 CAR T-세포(N1012, N1012_CXCR2, 또는 CYAD-01_10)로 정맥내 처리했다.
T-세포 트래피킹을 평가하기 위해 T-세포를 이중 형질도입하여 CAR 구축물(N1012 또는 N1012_CXCR2)과 리포터 구축물, 레닐라 루시퍼라제(rLuc) 단독 또는 rLuc와 GFP를 모두 코딩하는 이중 리포터를 발현했다. Ovasho 세포로 접종된 마우스를 종양 접종후 7일에 정맥내 주사에 의해 5 x 106 CAR T-세포(N1012_Renilla Luciferase 또는 N1012_CXCR2_Renilla Luciferase)로 처리했다. SKOV-3 세포로 접종된 마우스를 종양 접종 후 14일에 정맥내 주사로 1 x 107 CAR T-세포(N1012_CXCR2_rLuc 또는 N1012_rLuc)로 처리했다. Kuramochi 세포로 접종된 마우스를 종양 접종 후 18에 정맥 주사로 2 x 106 CAR T-세포(N1012_CXCR2_rLuc 또는 N1012_rLuc)로 처리했다. T-세포 추적을 모니터링하기 위해 레닐라 루시퍼라제의 기질인 코엘렌테라진을 마우스에 정맥 투여했다.
종양 성장은 BLI에 의해 모니터링되었으며, 모든 데이터는 처리당 총 플럭스(광자/초) 또는 평균 총 플럭스(광자/초)로 표시되었다. 마우스를 면밀히 모니터링하고 건강 악화 징후에 대해 일주일에 3번 체중을 쟀다.
종양 부피
1 x 105 CFPac-1 또는 BxPC3 세포를 50μl의 Matrigel(1:1 PBS)로 NSG 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하 주사했다. CFPac-1 세포를 접종한 후 29일에 또는 BxPC3 세포를 접종한 후 14일에 마우스를 PBS 또는 1 x 107 CAR T-세포(N1012_CXCR2, N1012, NKG2D, CYAD-01 복제물, 비형질도입(UT))로 정맥 내로 처리했다.
종양 성장은 캘리퍼 측정을 통해 매주 측정되었으며 종양 부피(mm3)로 표시되었다.
면역조직화학
1 x 105 CFPac-1 세포를 50μl의 Matrigel(1:1 PBS)로 NSG 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하 주사했다. 접종 후 29일에 마우스를 PBS 또는 1 x 107 CAR T-세포(N1012_CXCR2, N1012, NKG2D, CYAD-01 복제물 또는 형질도입되지 않은(UT) T-세포)로 정맥내 처리했다. T-세포 주사 후 3일에 N1012, N1012_CXCR2, 및 NKG2D T-세포 치료 그룹 각각으로부터 3마리의 마우스를 희생시키고 면역조직화학(IHC) 분석을 위해 종양을 수확했다. 간략하게, 조직을 포르말린에 고정하고, 파라핀에 포매하고, 절개하고, 슬라이드에 장착하고, 표준 방법을 사용하여 항인간 CD3 항체(Abcam)로 염색했다.
7.2. 실시예 1: 293T-세포에서 NKG2D 및 DAP10/12 융합 단백질의 발현
293T-세포를 DAP10/12 융합 단백질 N1012 또는 NKG2D 발현 카세트를 함유하는 SFG 레트로바이러스 플라스미드 백본으로 형질감염시켰다. N1012(서열번호 64)는 본 발명에 따른 외인성 인간 NKG2D 단백질 및 융합 외인성 DAP10/12 동종이량체를 포함하는 복합체를 포함한다. N1012 플라스미드는 서열번호 64를 코딩하는 서열번호 74를 포함한다. NKG2D의 표면 발현은 72시간 후에 유세포 분석에 의해 평가되었다. NKG2D 발현은 N1012 플라스미드로 형질감염된 293T-세포의 표면에서 쉽게 검출된 반면, 대조군 NKG2D를 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포의 표면에서는 NKG2D 발현이 검출되지 않았다(도 2, 상단 패널). NKG2D 표면 발현이 DAP10의 발현에 의존한다는 점을 감안할 때, NKG2D 표면 발현의 부족은 NKG2D 플라스미드 내에서 DAP10 공동-발현의 부재로 설명될 수 있다. NKG2D-형질감염된 293T-세포에서 표면 NKG2D 발현의 결여가 불량한 형질감염으로 인한 것이 아님을 확인하기 위해 NKG2D 존재에 대한 세포내 염색이 착수되었다. 결정적으로, NKG2D의 세포내 발현은 N1012 또는 NKG2D 플라스미드로 형질감염된 293T-세포에서 관찰되었다(도 2, 하단 패널). 이는 두 구축물로부터 NKG2D의 성공적인 발현을 입증하고 또한 NKG2D의 표면 발현을 달성하기 위한 DAP10 공동-발현의 요건을 확인시켜준다.
7.3. 실시예 2: 1차 인간 T-세포에서 N1012 및 NKG2D의 발현
1차 인간 T-세포는 항-인간 CD3 및 항-인간 CD28 항체로 코팅된 상자성 비드로 활성화되었다. 활성화 48시간 후, N1012 또는 NKG2D를 발현하도록 레트로바이러스 형질도입에 의해 T-세포를 조작하였다. NKG2D의 표면 발현은 CD4 및 CD8 발현에 대한 공동 염색, 유세포 분석에 의해 평가되었다. NKG2D의 백분율 발현(도 3a) 및 중앙 형광 강도(MFI, 도 3b)를 미형질도입 T-세포에 대해 비교하였다. CD8+ T-세포에서 NKG2D의 내인성 발현으로 인해 데이터는 CD4+ T-세포에서 게이팅된다. 도시된 바와 같이, NKG2D 및 N1012 구축물 모두는 UT T-세포 또는 대조군 CAR을 발현하는 T-세포에 대조적으로 1차 인간 T-세포의 표면에서 높은 수준으로 재생산적으로발현된다(도 4).
7.4. 실시예 3: N1012 T-세포에 의한 표적 세포 파괴 및 인식의 평가
세포 용해 능력을 평가하기 위해 N1012+ T-세포를 5가지 다른 종양 유형(중피종, 난소암, 두경부 편평 세포 암종, 췌장암 및 유방암)을 나타내는 11개의 다른 인간 종양 세포주와, 또는 다양한 E:T 비율에서 종양-연관 기질 세포(PS1)와 공동-배양했다. 72시간 후, T-세포를 제거하고 MTT 어세이을 수행하여 종양 세포 생존율을 평가하였다. 표적 세포를 UT T-세포, 또는 NKG2D를 발현하는 세포와 공동-배양할 때 종양 생존율의 최소 감소가 관찰된 반면, N1012+ T-세포는 낮은 E:T 비율에서도 모든 표적 세포주의 강력한 용해를 보여주었다(도 5a, 도 5b 및 도 7a의 A 및 B). ELISA에 의한 공동-배양 상층액의 분석은 N1012+ T-세포에 의한 인터페론-γ(IFN-γ) 및 인터루킨-2(IL-2) 모두의 유의한 분비를 입증했지만, UT T-세포 또는 대조군 NKG2D 구축물을 발현하는 세포에 의한 것은 아니었다(도 6a 내지 6d). 이들 데이터는 N1012+ T-세포가 종양-연관 기질 세포를 포함하여 광범위한 다양한 종양 유형을 인식하고 용해하는 능력을 보여준다.
7.5. 실시예 5: N1012 T-세포에 의한 종양 스페로이드 파괴의 예시
3D 시스템 내에서 표적 세포 용해를 매개하는 N1012+ T-세포의 능력을 평가하기 위해 그것을 종양 스페로이드와 공동-배양했다. 스페로이드 생성 후, 6 x 103 CellTracker Violet-표지된 T-세포가 웰당 추가되었다. GFP 및 RFP를 각각 측정하여 형광 현미경을 사용하여 3시간 및 8일 후에 종양 세포 및 성상 세포 생존율을 평가하였다. GFP 및 RFP 신호의 정량화는 Image J 소프트웨어를 사용하여 수행되었으며 T-세포가 없는 상태에서 성장한 스페로이드의 형광 판독값의 백분율로 표시되었다. 스페로이드의 강력한 용해는 N1012+ T-세포에서 관찰되었지만 NKG2D 또는 UT T-세포에서는 관찰되지 않았다(도 7d의 I 내지 도e의 J). 또한, N1012+ T-세포만이 IFN-γ의 분비를 보여주었다(도 7f의 K).
스페로이드 생존 및 T-세포 증식은 유세포 분석을 사용하여 대안적으로 평가되었다. 이를 달성하기 위해, T-세포를 첨가한 지 3시간 또는 8일 후에 스페로이드를 플레이트에서 제거하고 유세포 분석 튜브에 넣었는데, 이는 동일한 튜브에 추가된 동일한 CAR T-세포로 처리된 최대 5개의 스페로이드와 함께였다. 스페로이드 분해는 Accutase 용액과 피펫 팁을 통한 격렬한 재현탁을 사용하여 달성되었다. 생성된 단일 세포 현탁액을 RPMI1640 배지 + 5% 정상 인간 AB 혈청에서 세척하고 후속적으로 카운팅 비드를 함유하는 PBS에 재현탁시켰다. 튜브당 동일한 수의 카운팅 비드를 획득하고 종양 세포(GFP 및 RFP 형광으로 평가) 및 T-세포(CellTracker Violet 형광으로 평가)의 결과적인 수를 결정했다. 데이터는 T-세포가 없는 상태에서 성장한 스페로이드에 존재하는 GFP 및 RFP 세포의 합계에 대한 백분율로서 표시된다(도 15).
7.6. 실시예 6: N1012 T-세포에 의한 연속 표적 인식의 예시
표적 세포의 연속 용해('재-자극')를 수행하는 N1012+ T-세포의 능력을 평가하기 위해, 단일층 파괴가 관찰되지 않을 때까지 매주 2회 신선한 단일층과 공동-배양하였다. UT 또는 NKG2D+ T-세포는 최소 표적 세포 파괴를 매개하고 증식의 증거를 나타내지 않은 반면, N1012+ T-세포는 여러 회의 재-자극을 통해 강력한 용해를 매개했다(도 8a 내지 도 8c). 표적 세포 파괴는 또한 N1012+ T-세포의 유의한 증식 및 확장과 연관이 있었다(도 8d 내지 8f).
CYAD-01 복제물 NKG2D CAR 및 대조군 T-세포와 비교할 때, N1012+ T-세포는 BxPC3_LT-세포에 대해 훨씬 더 많은 재-자극 횟수를 거쳤다(도 14의 A). 또한, N1012+ T-세포는 또한 CYAD-01 T-세포 또는 대조군보다 실질적으로 더 큰 증식을 보여주었다(도 14의 B).
7.7. 실시예 7: 췌장암의 생체내 모델에서 N1012 T-세포의 효능
생체 내에서 종양 세포를 표적화하는 N1012+ T-세포의 능력을 결정하기 위해, N1012, NKG2D를 발현하는 T-세포 또는 CAR(T4 및 TMY)을 표적화하는 범(pan)-ErbB의 2가지 상이한 반복을 생성하였다. 1차 인간 T-세포 내 다양한 구축물의 발현(도 9a 내지 도 9b) 및 T-세포의 효능은 1:1 비율로 72시간 공동-배양 후 3개의 종양 세포주에 대해 시험관 내에서 입증되었다(도 9c). 생체 내 기능을 평가하기 위해 NSG 마우스에서 복강내 반딧불이 루시퍼라제(ffLUC)-태그된 BxPC3 종양 이종이식편이 12일 동안 확립되었다. 종양-보유 마우스는 PBS, 4x106(N1012(lo), T4 또는 TMY) T-세포, 또는 1 x 107(N1012(hi) 또는 NKG2D) 형질도입된 T-세포로 복강 내 처리했다. 종양 성장은 생물발광 영상화에 의해 매주 측정되었으며, 마우스의 체중은 매주 3회 측정되었다. 데이터는 처리 군 당 평균 총 플럭스(광자/초)(도 10a), 또는 개별 마우스당 총 플럭스(광자/초)로 표시된다(도 10b). NKG2D+, T4+ 또는 TMY+ T-세포를 투여받은 마우스의 종양 부담은 PBS를 투여받은 마우스와 동일하여 효능 부족을 시사한다. 대조적으로, 종양은 각각 N1012(lo) 또는 N1012(hi)로 처리된 2/5 마우스 및 4/5 마우스에서 완전히 근절되었다. 이들 마우스는 T-세포 투여 후 76일 동안 종양이 없는 상태로 유지되었다. 체중의 백분율 변화를 측정하여 평가했을 때 독성의 증거는 관찰되지 않았다(도 10c).
N1012+ T-세포가 NSG 마우스 내에서 이식될 수 있고 면역학적 기억을 제공할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 종양을 완전히 거부한 마우스는 초기 종양 접종 후 88일(T-세포 주입 후 76일) 복강에 1 x 105 ffLUC-태그된 BxPC3 세포의 두 번째 접종을 받았다. 종양 재-챌린지(re-challenge)후 24시간에 BLI에 의해 발광성의 증가가 관찰된 반면, 4/5 마우스는 후속적으로 종양 크기의 실질적인 감소를 나타내어 N1012+ T-세포의 재-활성화를 나타낸다(도 10d). 실험은 145일 후에 종료되었고 N1012 T-세포의 강력한 항-종양 효능을 입증하는 생존 곡선이 생성되었다(도 10e).
생체 내 췌장암 모델에 대한 N1012+ T-세포의 효능을 추가로 확인하기 위해 반복 실험을 수행했다. 1x107 CAR+ 또는 대조군 비형질도입 T-세포를 1 x 105 ffLUC-태그된 BxPC3 세포를 접종한 지 12일 후 NSG 마우스에 복강내 주사했다. 종양 성장은 생물발광 영상화에 의해 매주 모니터링되었으며 데이터는 처리군 당 평균 총 플럭스(광자/초) (도 11a) 및 개별 마우스 당 총 플럭스(광자/초) (도 11b) 둘다로 표시된다. N1012+ T-세포로 처리된 마우스에서 유의하고 지속적인 종양 퇴행이 다시 한 번 관찰되었다. 실제로 종양은 N1012+ T-세포로 처리된 5/6 마우스에서 완전히 근절되었다. 대조적으로, UT T-세포로 처리된 마우스에서 종양 성장의 동역학은 PBS를 받은 마우스와 동일했다. 이들 데이터는 종양 박멸이 N1012+ 특이적임을 확인시켜준다.
메모리 T-세포의 잠재적 형성을 조사하기 위해, 41일(T-세포 주입 후 29일)에 종양이 없었던 마우스를 1 x 105 ffLUC 태그된 BxPC3 세포의 신선한 덩어리(bolus)로 복강내로 재-챌린지했다. 42일째에 종양을 확인하기 위해 마우스를 영상화했다. 후속 영상화는 5/5의 재-챌린지된 마우스가 검출 미만의 종양 부담을 감소시켰고, 3/5의 마우스가 장기간 종양 제어를 보여준다는 것을 입증했다(도 11b). 이들 데이터는 N1012 CAR T-세포가 표적의 재출현에 반응하여 재활성화할 수 있는 기억 집단을 형성할 수 있음을 시사한다.
7.8. 실시예 8: 악성 중피종의 생체내 모델에서 N1012 T-세포의 효능
또다른 생체내 모델에서 N1012의 효능을 확인하기 위해 NSG 마우스를 1 x 106 ffLUC-태그된 H226 악성 중피종 세포로 복강내 주사로 접종했다. 종양 세포 접종 후 8일에 마우스를 PBS, 또는 4 x 106 N1012+ T-세포로 처리했다. 대조군으로서, 한 군의 마우스를 NKG2D만을 발현하는 4 x 106 T-세포로 처리하였다. 종양 성장은 생물발광 영상화에 의해 매주 모니터링되었고 데이터는 처리당 평균 총 플럭스(광자/초)(도 12a) 및 개별 마우스(도 12b)당 총 플럭스(광자/초)로 표시된다. PBS를 받은 마우스에서 일관된 종양 성장이 관찰된 반면, N1012+ T-세포를 받은 마우스에서는 100% 종양 박멸이 관찰되었다.
T-세포 지속성 및 기능 유지를 확인하기 위해 모든 무종양 마우스를 초기 종양 접종 후 91일에 추가 1 x 106 ffLUC-태그된 H226 세포로 복강내 접종했다. 종양 흡수(Tumour take)는 생물발광 영상화에 의해 24시간 후 모든 마우스에서 확인되었다. 재-챌린지된 모든 마우스는 종양을 거부하여 N1012+ T-세포의 지속성과 장기간 종양 조절을 매개하는 이들 T-세포의 능력을 확인했다.
7.9. 실시예 9: N1012 T-세포의 CYAD-01 복제물 T-세포에 대한 비교
N1012 T-세포의 재자극 및 증식 잠재력을 CYAD-01 복제물 T-세포에 대해 비교했다. 앞서 언급한 바와 같이, CYAD-01 CAR은 NKG2D의 CD3ζ에 대한 융합으로 구성되며 Sentman et al.에 의해 원래 기술된 마우스 CAR의 인간 버전을 나타낸다(Zhang et al, 2005, Blood 106:1544-1551). 명목상 1세대 CAR이지만 T-세포에서 내인성 DAP10과 연관되어 신호 1 및 2가 모두 제공된다. CYAD-01 CAR은 현재 Celyad Oncology에 의해 임상 개발 중이며 이러한 CAR의 복제물은 이들 실시예에서는 비교 목적으로만 제공된다.
CYAD-01 복제물의 표면 발현은 유세포 분석으로 평가할 때 1차 인간 T-세포에서 확인되었다(도 13).
간단히 말해서, N1012 또는 CYAD-01 복제물 T-세포는 단층 파괴가 관찰되지 않을 때까지 매주 2회 신선한 단층과 함께 공동-배양되었다. 이를 달성하기 위해 1x105 종양 세포를 24-웰 플레이트의 3중 웰에 플레이팅하고 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션했다. 24시간 후, 1x105 CAR+/mL의 최종 농도로 웰당 1x105 CAR+ T-세포를 첨가하였다. 72시간 후, T-세포를 안온하게 제거하고 웰을 1mL PBS로 세척하였다. PBS를 제거한 후 1mL의 MTT(최종 농도 500μg/mL)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 약 1시간 동안 인큐베이션했다. 플레이트를 판독하고 종양 세포 생존율을 위에서 상세히 설명한 바와 같이 계산하였다. 재-자극은 종양 세포 생존율이 50% 미만으로 측정된 경우 성공적인 것으로 간주되었다.
표적 세포 인식에 대한 반응으로 T-세포 증식을 조사하기 위해 플레이트에서 제거된 T-세포를 400xg에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 펠릿을 3.2mL R5 배지에 재현탁하고 1mL를 신선한 종양 단층의 각 웰에 삼중으로 첨가했다. 총 T-세포 수는 나머지 200μL의 작은 분취량의 트립판 블루 배제법(trypan blue exclusion)을 사용하여 평가했다.
CYAD-01 복제물, NKG2D CAR 및 대조군 T-세포와 비교할 때, N1012+ T-세포는 BxPC3_LT-세포에 대해 훨씬 더 많은 횟수의 재-자극을 겪었다(도 14의 A). 나아가, N1012 T-세포는 또한 CYAD-01 복제물 T-세포 또는 대조군보다 실질적으로 더 큰 편균 배수 확장을 보여주었다(도 14의 B).
종양 스페로이드와 공동-배양할 때 스페로이드 생존율의 상당한 감소가 N1012+ T-세포에서 관찰되었지만 UT 대조군 T-세포에서는 관찰되지 않았으며 기능적 CYAD-01 복제물 CAR을 발현하는 세포에서도 관찰되지 않았다(도 15a). N1012 T-세포는 또한 UT 또는 CYAD-01 복제물 T-세포와 비교하여 현저한 증식을 보여주었다(도 15b).
7.10. 실시예 10: N1012 T-세포 및 N1012_CXCR2 T-세포 생성
CAR 구축물(예: N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01_10)을 발현하는 T-세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하고, T-세포를 활성화하고, CAR을 코딩하는 핵산을 함유하는 바이러스로 T-세포를 형질 도입하여 생성되었다(도 16a-16b).
간단히 말하면, 바이러스를 생성하기 위해 10cm2 조직 배양 접시에서 10% FBS 및 2mM L-글루타민(I10 배지)이 포함된 10mL의 IMDM 배지에 1.65 x 106 HEK293T-세포를 시딩하고 5% CO2, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션했다. 다음날, 표 4의 프로토콜에 따라 각 CAR 구축물에 대한 형질감염 믹스가 생성되었다. HEK293T-세포를 다음 플라스미드로 개별적으로 형질감염시켰다: N1012(DAP10/12 융합 단백질 및 인간 NKG2D 수용체(서열 번호 74)를 코딩함), N1012_CXCR2(DAP10/12 융합 단백질, 인간 NKG2D 수용체 및 CXCR2(서열 번호 74)를 코딩함) CYAD-01 복제물(CD3ζ(서열 번호 93)에 융합된 NKG2D 수용체를 코딩함), 및 CYAD-01_10(CYAD-01 복제물 및 DAP10(서열 번호 94)을 코딩함).
표 4: CAR 구축물에 대한 형질감염 프로토콜(10cm 2 접시당 부피)
시약 부피/양 인큐베이션 시간
무혈청 배지 470μL 실온에서 5분간 배양한다. 이것이 Mix A이다
진쥬스 30μL
PeqPam-3 4.6875μg 3개의 플라스미드를 모두 Mix A에 첨가하고 온화하게 섞은 다음 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. 이것이 Mix B이다
RDF 3.125μg
CAR을 포함하는 SFG 벡터(예: N1012_CXCR2) 4.6875μg
15분의 인큐베이션이 완료되면 Mix B를 HEK293T-세포에 적가하고 온화하게 휘젓는다. 그런 다음 세포를 다시 인큐베이터에 넣었다. 형질감염 48시간 후 상청액을 수집하고 미리 냉각된 50mL Falcon 튜브에 수집하여 4℃에 보관했다.
HEK293T-세포에 10mL의 신선한 I10 배지를 공급하고 인큐베이터로 되돌렸다. 추가 24시간 후, HEK293T-세포로부터 두 번째로 상청액을 수집하고 형질감염 48시간 후에 수집한 상청액과 합쳤다. 합하여진 상청액을 미리 라벨이 붙은 튜브에 분취하고 급속 냉동한 후 -80℃에 보관했다.
PBMC는 표준 Ficoll Paque-매개된 밀도 원심분리를 사용하여 단리되었다. RPMI + 5% 정상 인간 AB 혈청 및 2mM L-글루타민('R5' 배지)에 3 x 106 세포/mL의 농도로 재현탁되면 T-세포는 항인간 CD3 및 항인간 CD28 항체(세포:비드 비율 1:2)로 코팅된 상자성 비드, 또는 5ug/mL 농도의 피토헤마글루티닌(PHA)를 사용하여 활성화되었다. 활성화 후 48시간에, 1 x 106 T-세포를 RetroNectin으로 코팅된 비조직 배양 처리 플레이트에 플레이팅하고 일시적으로 형질감염된 HEK 293T-세포에서 수확한 3mL 바이러스 상층액과 혼합했다. T-세포에는 RPMI1640 배지 + 5% 정상 인간 AB 혈청 중 100IU/mL IL-2를 공급하고, 신선한 배지와 IL-2(100IU/mL)를 매주 3회 제공했다.
T-세포상에서 N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01 및 CYAD-01_10 CAR의 표면 발현을 유세포 분석법으로 평가했다. 간략하게, T-세포는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-컨쥬게이트된 항인간 CD4, 피코에리트린(PE)-컨쥬게이트된 항인간 NKG2D, Alexaflur_647(AF_647)-컨쥬게이트된 항인간 CXCR2 및 알로피코시아닌 시아닌7(APCCy7)-컨쥬게이트된 항인간 CD8a 항체로 얼음 위에서 30분 동안 염색하였다. 배경 CXCR2 발현에 대한 대조군으로서, 하나의 튜브를 FITC-컨쥬게이트된 CD4, PE-컨쥬게이트된 NKG2D, APCCy7-컨쥬게이트된 CD8a 및 AF_647-컨쥬게이트된 이소형 항체로 염색했다. 2mL의 빙냉 PBS로 세척한 후, 세포를 0.5mL의 빙냉 PBS에 재현탁시키고 유세포측정법으로 평가했다. CD8+ T-세포에서 NKG2D의 내인성 발현으로 인해 CD4+ T-세포 내에서 유전자 전달 효율을 계산하고 형질도입되지 않은(UT) T-세포에서 나타나는 효율과 비교했다. 도 16c에 나타낸 결과는 높은 수준의 유전자 전달이 모든 구축물에 의해 달성되지만(도 16c, 왼쪽 패널) N1012가 N1012_CXCR2(도 16c, 오른쪽 패널)를 비롯한 다른 CAR에 비해 상당히 더 높은 표면 발현을 갖는다는 것을 나타낸다.
7.11. 실시예 11: 인간 난소암 세포에 대한 N1012_CXCR2 T-세포의 효능 평가
난소암 세포에 대한 시험관 내 CAR T-세포의 항종양 효능을 평가하기 위해 세포독성(MTT) 분석을 수행했다. 간단히 말해서, 고급 장액성 난소암(HGSOC)을 대표하는 두 가지 상피 난소암 세포주인 Kuramochi와 Ovsaho를 log2 이펙터:타겟 비율 1:1 내지 1:64에서 CAR T-세포(N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01 복제물 또는 CYAD-01_10)와 별도로 공동-배양했다. 종양 세포 생존율은 전술한 바와 같이 MTT 분석을 수행하여 T-세포 첨가 후 48시간에 평가되었다. 종양 세포 생존율은 T-세포 없이 성장한 종양 세포의 백분율로 표현되었다(도 17). 결과는 N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01 복제물 및 CYAD-01_10 T-세포가 두 종양 세포주 모두에서 강력한 세포독성을 나타냄을 보여준다(도 17). 대조적으로, 형질도입되지 않은 T-세포는 무시할 정도의 종양 세포 사멸을 매개했다.
7.12. 실시예 12: N1012 및 N1012_CXCR2 T-세포는 우수한 증식을 나타낸다.
CAR T-세포가 다수 회의 표적 세포 용해를 겪는 능력을 평가하기 위해 재자극 분석을 수행했다. 간략하게, CAR-T-세포는 Ren 중피종 종양 세포와 1:1 이펙터 비율로 공동-배양되었다. 72시간 후, T-세포를 온화하게 제거하고 각 웰을 1mL PBS로 온화하게 세척했다. PBS를 제거한 후, 웰당 MTT 용액 0.5mL를 첨가하고 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 약 1시간 동안 인큐베이션했다. MTT 용액을 제거한 후, 생성된 포르마잔 결정을 DMSO(0.5mL/웰)에 용해시키고 560nm에서 흡광도를 측정했다. 종양 세포 생존율은 다음과 같이 계산되었다: (T-세포가 있는 단층의 흡광도/T-세포가 없는 단층의 흡광도)*100. 단층에서 제거된 T-세포를 400xg에서 5분간 원심분리하고 상층액을 제거했다. 펠릿을 3.2mL R5 배지에 재현탁시키고 1mL를 신선한 종양 단층의 각 웰에 3회 첨가했다. T-세포가 40% 초과의 표적 세포 용해를 매개하지 못할 때까지 분석을 매주 2회 반복했다. 표적 세포 인식에 반응하는 T-세포 증식을 조사하기 위해, 나머지 200μL의 작은 분취량의 trypan blue exclusion 에 의해 T-세포 수를 평가했다. 배수 확장은 다음과 같이 계산되었다(재자극 동안 달성된 최고 총 T-세포 수/시드된 초기 T-세포 수).
도 18에 나타낸 결과는 CYAD-01 복제물 및 CYAD-01_10 T-세포와 비교하여 재자극 검정 동안 N1012 및 N1012_CXCR2 T-세포의 증식 및 지속성이 상당히 개선되었음을 입증한다. 형질도입되지 않은 T-세포 또는 NKG2D를 발현하는 T-세포의 확장은 관찰되지 않은 반면, 모든 CAR+ T-세포는 처음에 시딩된 수로부터 증식했다. N1012 및 N1012_CXCR2 T-세포의 확장 수준은 CYAD-01 복제물 또는 CYAD-01_10 T-세포에서 관찰된 것보다 상당히 더 컸다. 또한, 추가적인 회의 자극에서 CYAD-01 복제물과 CYAD-01_10 T-세포의 수가 급격히 감소한 반면, N1012 및 N1012_CXCR2 T-세포는 모두 강력한 증식을 보여주었다. 실제로, N1012 및 N1012_CXCR2 T-세포는 처음에 시딩된 세포 수와 비교했을 때 T-세포 수에서 각각 59.7배 및 58.1배의 최대 확장을 보여주었다. 또한 N1012 및 N1012_CXCR2 T-세포 모두 폭발적인 증식을 보인 후에 T-세포 수의 수축을 보이고 그 후 추가적인 회의 증식이 이어지는 것이 분명했다(도 18). 이러한 증식 및 수축 패턴은 내인성 면역 반응의 패턴을 반영한다.
7.13. 실시예 13: T-세포 자극 후 T-세포 분화, CD4:CD8 비율, 및 공동-자극 분자의 발현 평가
자극 16 및 자극 23 이후 진행 중인 재자극 분석에서 T-세포의 작은 분취량을 제거하고 T-세포를 FITC-콘쥬게이트된 항인간 CD4 및 APCCy7-콘쥬게이트된 CD8a 항체로 염색했다. T-세포는 PECy7-콘쥬게이트된 항체를 사용하여 CD27에 대해 별도로 염색되었다. T-세포는 유세포 계측법으로 평가되었다. 두 시점 모두에서 N1012 및 N1012_CXCR2 T-세포는 CD8+ 하위세트를 향한 거의 완전한 이동을 보여주었으며 CD4+ 세포는 거의 검출되지 않았다(도 19a-19b). CD8+로의 전환은 자극 16보다 자극 23 후에 더 두드러졌다(도 19a에 대해 도 19b 비교). 임계적으로, N1012 T-세포는 28회 재자극 후에도 핵심 공동-자극 분자인 CD27의 발현을 유지했다(도 20, 오른쪽 패널). 결과는 또한 N1012 T-세포가 28회 자극 후에 일부 기억 T-세포(CD45RO+ CD62L+)를 유지한다는 것을 보여준다(도 20, 왼쪽 패널).
N1012 T-세포는 또한 중앙 기억 T-세포(CD45RO+ CD62L+)와 이펙터 기억 T-세포(CD45RO+ CD62L-) 사이를 순환하는 것으로 나타났다. 재자극의 진전된 회에서도 최종 고갈(CD45RO- CD62L-)에 대한 최소한의 증거가 관찰되었다(도 21).
7.14. 실시예 14: CAR T-세포의 결합력(avidity) 평가
표적 세포에 대한 NKG2D-표적화 CAR T-세포의 결합력을 평가하기 위해, 증가하는 음향력 수준에서 표적 세포에 결합된 T-세포의 백분율을 측정했다. 간략하게, CD19-조작된 LO68 또는 SKOV-3 종양 세포(둘 다 NKG2D 리간드를 발현함)를 폴리-L-라이신으로 코팅된 z-Movi 미세유체 칩(Lumicks, Amsterdam, Netherlands)에 시딩하고 16시간 동안 배양했다. 다음날, 유동 분류된 CAR-T-세포를 칩에 연속적으로 흘려넣고 3분 선형 힘 램프를 초기화하기 전에 5분 동안 표적 세포와 인큐베이션했다. 힘 램프 동안 z-Movi 장치(Lumicks)는 플랫폼에 통합된 명시야 현미경을 사용하여 시계열 이미지를 캡처했다. 분리된 세포는 음향 노드를 향해 공중에 띄워져 XY 위치를 기반으로 세포를 추적할 수 있다. Z 위치의 변화는 회절 패턴의 변화를 가져오며, 이는 기판에 부착된 세포와 음향 노드에 매달린 세포 사이의 구별을 허용한다. 이 정보는 세포 분리 사건을 특정 파열력과 연관시키는 데 사용되었다. 세포 분리는 (z-Movi Tracking_v1.6.0)을 사용하여 획득했으며 실험 후 이미지 분석은 Cell Tracking offline analysis_v2.1을 사용하여 수행되었다.
도 22에 나타낸 결과는 CAR T-세포의 결합력이 CAR의 세포 표면 발현 수준을 반영하는 것으로 나타났음을 입증한다(도 16c). N1012 CAR T-세포는 Lo68-19 및 SKOV3 세포 모두에 대해 N1012_CXCR2, CYAD-01 복제물, 및 CYAD-01_10 CAR T-세포보다 더 높은 결합력을 나타냈다(도 22). 모든 NKG2D CAR T-세포는 Lo68_19 세포에 대해 CD19-특이적 T-세포(FMC63)보다 낮은 결합력을 나타냈는데, 이는 리간드(들)에 대한 FMC63에 비해 NKG2D의 낮은 친화도를 반영한다.
7.15. 실시예 15: N1012 및 N1012_CXCR2 T-세포로부터 사이토카인 분비 평가
CAR T-세포에 의한 인터페론-감마(IFN-γ) 및 인터루킨-2(IL-2)의 분비는 다양한 종양 세포주와의 공동-배양 후 ELISA에 의해 평가되었다. CAR T-세포를 난소암(Kuramochi, Ovsaho) 및 췌장암(CFPac-1)에서 유래된 세포와 별도로 24시간 동안 공동-배양했다. 이후에 상청액을 제거하고 이전에 설명한 대로 ELISA로 평가했다.
결과는 N1012_CXCR2 T-세포가 테스트된 모든 세포주에 걸쳐 N1012 T-세포보다 실질적으로 더 적은 IFN-γ(도 23a) 및 IL-2(도 23b)를 분비한다는 것을 입증한다.
7.16. 실시예 16: 자극되지 않은 N1012 및 N1012_CXCR2 T-세포는 CYAD-01 복제물 또는 CYAD-01_10 T-세포에 비해 향상된 생체외(ex vivo) 확장을 나타낸다
N1012, N1012_CXCR2, CYAD-01 복제물, 및 CYAD-01_10 T-세포의 확장 및 결과적으로 확장 가능성을 평가하기 위해 실험을 수행했다. 간략하게, T-세포는 이전에 기술된 바와 같이 형질도입되었고, 100 IU/mL 재조합 인간 IL-2가 보충된 100% 부피의 R5 배지를 48-72시간마다 공급했다. 세포 확장은 12일 배양 기간 종료 시 T-세포의 총 수/형질도입된 T-세포의 초기 수로 계산되었다.
결과는 N1012 및 N1012_CXCR2 T-세포 모두 형질도입되지 않은 T-세포의 확장 수준을 약간 초과하는 확장 수준을 보여준다(도 24). 대조적으로, CYAD-01 복제물 및 CYAD-01_10 T-세포는 대조군 T-세포에 비해 실질적으로 더 낮은 확장을 나타낸다(도 24).
7.17. 실시예 17: 난소암 마우스 모델에서 N1012_CXCR2 T-세포의 생체내(in vivo) 항종양 효능 평가
생체 내 난소 종양에 대한 CAR T-세포의 효능을 평가하기 위해, CAR T-세포를 반딧불이 루시퍼라제(ffLuc)-발현 Ovsaho 난소 종양 이종이식편, ffLuc-발현 SKOV-3 난소 종양 이종이식편, 또는 ffLuc-발현 Kuramochi 종양 이종이식편을 보유하는 마우스에 주사했다. Ovsaho 종양 세포는 낮은 수준의 IL-8을 발현하고; SKOV-3 종양 세포는 중간 수준의 IL-8을 발현한다. 이어서 종양 성장을 생물발광 영상화로 모니터링하였다.
간략하게, 1 x 105 ffLuc-발현 Ovsaho 또는 Kuramochi 또는 5 x 105 ffLuc-발현 SKOV-3 세포를 NSG 마우스의 복강내로 주사하였다. Ovasho 세포를 접종한 마우스를 PBS[n=5] 또는 5 x 106 CAR T-세포(N1012[n=7], N1012_CXCR2[n=7], CYAD-01 복제물[n=4], 또는 형질도입되지 않은 T-세포)로 복강내 주사(종양 접종 후 6일) 또는 정맥 주사(접종 후 7일)를 통해 투여하여 처리했다. SKOV-3 세포를 접종한 마우스를 PBS[n=5] 또는 1 x 107 CAR T-세포(N1012 [n=11], N1012_CXCR2 [n=11], 또는 CYAD-01_10 [n=8])로 종양 접종 후 14일에 정맥 내 처리했다. 접종 후 17일째에, Kuramochi 세포로 접종된 마우스를 PBS 또는 2 x 106 CAR T-세포(N1012 또는 N1012_CXCR2) 또는 형질도입되지 않은 T-세포로 복강내 주사를 통해 처리했다. 18일째에 Kuramochi 세포를 접종한 마우스에 PBS 또는 2 x 106 CAR T-세포(N1012 또는 N1012_CXCR2) 또는 형질도입되지 않은 T-세포를 정맥 주사를 통해 처리했다.
결과는 N1012, N1012_CXCR2, 및 CYAD_01 복제물 T-세포로 처리된 마우스에서 Ovsaho 세포 종양에 대한 초기 항종양 효과를 보여준다(도 25 및 도 38). Ovasho 이종이식 마우스에 1 x 105 ffLuc 발현 Ovsaho 세포를 복강내 주사하여 초기 종양 접종 후 56일째에 종양을 다시 감염시켰다. 종양 재챌린지 후, N1012 또는 N1012_CXCR2 T-세포로 처리된 마우스에서는 종양 성장이 관찰되지 않았다(도 38). 이에 비해, CYAD-01 복제물 T-세포로 처리된 마우스는 종양 재챌린지 후 종양 성장의 현저한 증가를 보여주었다(도 38). 결과는 CYAD-01 복제물 T-세포와 비교하여 N1012_CXCR2 및 N1012 T-세포의 우수한 항난소종양 활성을 입증한다.
N1012_CXCR2 T-세포로 처리된 SKOV-3 이종이식 마우스는 N1012 또는 CYAD-01_10 T-세포로 처리된 마우스에 비해 우수한 항종양 활성(도 27) 및 생존(도 37)을 나타냈다.
N1012 또는 N1012_CXCR2 T-세포를 사용한 치료는 또한 Kuramochi 이종이식 마우스에서 항종양 활성을 입증했다(도 39 및 도 41). 종양을 거부한 N1012 및 N1012_CXCR2 처리된 마우스에 1 x 105 ffLuc-발현 Kuramochi 세포를 복강내 주사하여 86일에 종양을 다시 감염시켰다. 재챌린지된 일부 마우스에서는 종양 성장이 억제되었으며, 이는 마우스에서 항종양 활성이 유지되었음을 입증하는 것이다(도 39 및 도 41). 도 40 및 43은 각각 도 39 및 도 41에 상세히 설명된 실험에서 처리된 Kuramochi 이종이식편 보유 마우스의 Kaplan-Meier 생존 곡선이다. 단일 실험에 사용된 T-세포는 동일한 기증자로부터 나온 것이다. 도 41에 자세히 설명된 실험에 사용된 T-세포는 도 39에 자세히 설명된 실험에 사용된 T-세포와는 다른 기증자로부터 나온 것이다.
T-세포 트래피킹을 평가하기 위해, T-세포를 이중 형질도입하여 CAR 구축물(N1012 또는 N1012_CXCR2) 및 리포터 구축물(rLuc 단독 또는 GFP와 공동 발현된 rLuc)을 발현했다.
이전에 설명한 대로 Ovasho 세포로 접종된 마우스를 종양 접종 후 7일에 정맥 주사를 통해 5 x 106 CAR T-세포(N1012_SW[n=3] 또는 N1012_CXCR2_rLuc/GFP[n=3])로 처리했다. 생물발광 영상화(도 26, 오른쪽 패널)의 결과는 T-세포 주사 후 1~3일 사이에 N1012_CXCR2_rLuc/GFP T-세포가 N1012_SW T-세포보다 더 효율적으로 복막으로 수송되는 반면 동등한 항종양 활성이 두 치료 그룹(도 26, 왼쪽 및 중간 패널)에서 관찰되었음을 보여준다. Ovsaho 세포가 중간 수준에서 낮은 수준으로 IL-8을 발현한다는 점을 고려하면, N1012_CXCR2_rLuc/GFP T-세포의 증가된 수송은 IL-8 이외의 CXCR2 리간드 때문일 수 있다.
전술한 바와 같이 SKOV-3 세포로 접종된 마우스를 종양 접종 후 14일에 정맥내 주사에 의해 1 x 107 CAR T-세포(N1012_CXCR2_rLuc/GFP 또는 N1012_rLuc/GFP)로 처리하였다. 도 28 및 도 29에 나타낸 결과는 T-세포 투여 후 처음 4일 동안 N1012_CXCR2 T-세포가 N1012 T-세포보다 더 효율적으로 수송되었음을 입증한다(도 28, 오른쪽 패널 및 도 29). 도 28(왼쪽 패널)에 제시된 결과는 N1012_rLuc/GFP 및 N1012_CXCR2_rLuc/GFP T-세포로 처리된 마우스가 T-세포 투여 후 60일보다 더 항종양 활성을 유지한다는 것을 추가로 입증한다.
이전에 설명한 대로 Kuramochi 세포로 접종된 마우스를 종양 접종 후 18일째에 N1012 또는 N1012_CXCR2 및 이중 리포터 rLuc/GFP로 공동-형질도입된 2 x 106 CAR T-세포로 처리했다. 도 42에 제시된 결과는 N1012_CXCR2 T-세포가 T-세포 투여 후 처음 4일 동안 N1012 T-세포보다 복강 내로 더 효율적으로 수송되었음을 입증한다.
7.18. 실시예 18: 췌장암 마우스 모델에서 N1012_CXCR2 T-세포의 생체내 항종양 효능 평가
생체 내 췌장 종양에 대한 CAR T-세포의 효능을 평가하기 위해, CAR T-세포를 CFPac-1 또는 BxPC3 종양 세포를 보유하는 마우스에 주사했다.
간략하게, 1 x 105 CFPac-1 또는 BxPC3 세포를 50μl의 Matrigel(1:1 PBS)로 NSG 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하 주사했다. CFPac-1 세포를 접종한 지 29일 후 또는 BxPC3 세포를 접종한 지 14일 후, 마우스를 PBS 또는 1 x 107 CAR T-세포(N1012_CXCR2, N1012, NKG2D, CYAD-01 복제물 또는 비형질도입(UT) T-세포)로 정맥 내 처리했다. T-세포 주사 후 3일에 N1012, N1012_CXCR2 및 UT T-세포 치료 그룹 각각에서 3마리의 마우스를 희생시키고 면역조직화학(IHC) 분석을 위해 종양을 수확했다. 종양 성장은 캘리퍼 측정으로 매주 측정되었으며 종양 부피(mm3)로 표시되었다.
결과는 N1012_CXCR2 T-세포로 처리된 CFPac-1 이종이식 마우스의 종양이 T-세포 투여 후 완전히 근절되었으며 종양 재발이 관찰되지 않았음을 보여준다(도 30). 대조적으로, N1012 및 CYAD-01 복제물 T-세포로 처리된 CFPac-1 이종이식 마우스의 종양 성장은 항종양 활성 상실 및 종양 재발 이전에 T-세포 투여 후 처음에는 억제되었었다(도 30). IHC 분석은 N1012 또는 NKG2D T-세포와 비교하여 CFPac-1 종양으로의 N1012_CXCR2 T-세포의 향상된 침윤을 보여주었다(도 31).
N1012_CXCR2 T-세포로 처리된 BxPC3 이종이식 마우스는 N1012 또는 CYAD-01 복제물 T-세포로 처리된 마우스에 비해 개선된 종양 억제(도 33) 및 생존(도 34)을 나타냈는데, 이는 CXCR2의 존재가 CAR T-세포의 IL-8을 생성하는 BxPC3 종양으로의 귀소를 개선시킨다는 것을 시사한다.
CAR T-세포의 고용량 및 저용량 치료를 비교하기 위해 추가 연구가 수행되었다. 간략하게, 1 x 105 CFPac-1 세포를 NSG 마우스의 복강내로 주사하였다. 종양 접종 후 28일에, 마우스를 PBS[n=5], 고용량의 10 x 106 CAR T-세포(N1012[n=7], N1012_CXCR2[n=7], CYAD-01 복제물[n= 5]) 또는 저용량의 4 x 106 CAR T-세포(N1012 [n=6], N1012_CXCR2 [n=7])로 처리하였다. 도 32에 제시된 결과는 저용량 N1012_CXCR2 T-세포를 사용한 치료 효능이 고용량 N1012 T-세포를 사용한 치료를 추적한다는 것을 입증한다.
7.19. 실시예 19: 중피종 환자 유래된 이종이식(PDX) 종양 모델에서 N1012_CXCR2 T-세포의 항종양 효능 평가
중피종 환자 유래 이종이식(PDX) 마우스 종양 모델을 생성하여 생체 내에서 중피종의 N1012 및 N1012_CXCR2 CAR T-세포 치료의 효능을 평가했다. 중피종 PDX 모델을 확립하기 위해, 1차 환자 중피종 종양 단편(2 x 2mm)을 15G 투관침 임플란트 바늘을 사용하여 NSG 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하로 이식했다. 종양은 6개월에 걸쳐 성장했으며 새로운 코호트로 3회 계대배양되었다. 계대 4에서, 수컷 NSG 마우스의 실험 코호트에 PDX 물질을 왼쪽 옆구리에 이식했다. 종양 이식 후 111일째에 마우스에게 PBS[n=8] 또는 1 x 107 CAR T-세포(비형질도입(UT), N1012_CXCR2[n=8], N1012[n=9] 또는 CYAD-01_10[n= 5])로 정맥내 투여했다. 생물발광 영상화(N1012_CXCR2_LT [n=3], N1012_LT 또는 LT 단독 [n=3])에 의해 T-세포를 추적하기 위해 CAR 유무로 루시퍼라제 및 TD 토마토(LT)로 형질도입된 T-세포로 마우스의 하위 그룹을 처리했다. 종양 성장은 캘리퍼 측정에 의해 매주 측정했으며 종양 부피(mm3)로 표시했다.
도 35 및 도 44의 결과는 N1012 및 N1012_CXCR2 T-세포로 처리된 마우스에서 항종양 활성이 관찰되었음을 보여준다. 대조적으로, CYAD-01_10 T-세포로 치료된 마우스는 치료에 잘 반응하지 않았다. 도 36은 T-세포의 생물발광 영상을 보여주며, N1012 및 N1012_CXCR2 T-세포는 중피종 PDX 마우스의 종양 부위에 국한된 반면, LT 리포터(CAR 없음)로만 형질도입된 T-세포는 종양에 국한되지 않았음을 입증한다. 연구에서 마우스의 Kaplan-Meier 생존 곡선이 도 45에 나와 있다.
등가물 및 참조에 의한 통합
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 간행물, 데이터베이스 항목(예: Genbank 서열 또는 GeneID 항목), 특허 출원, 또는 특허가 그 전체가 참조로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 참조로 포함된다. 참조에 의한 통합의 이러한 진술은 37 CFR§1.57(b)(1)에 따라 출원인이 각각의 개별 출판물, 데이터베이스 항목(예: Genbank 서열 또는 GeneID 항목), 특허 출원, 또는 특허와 관련되도록 의도한 것이며 각각은 37 CFR§1.57(b)(2)에 따라 명확하게 식별되며, 마치 해당 인용이 참조에 의한 통합의 제출된 진술 바로 옆에 있지 않은 경우에도 마찬가지이다. 명세서 내에 참고로 포함된다는 전용 설명이 포함되어 있다고 해서 참조로 포함된다는 이러한 일반적인 설명이 어떤 식으로든 약화되지는 않는다. 본원에서 참고문헌을 인용한다고 해서 해당 참고문헌이 관련 선행 기술임을 인정하는 것은 아니며 이러한 간행물이나 문서의 내용이나 날짜에 대한 인정을 의미하지도 않는다.
본 발명은 바람직한 구체예 및 다양한 대체 구체예를 참조하여 구체적으로 도시되고 설명되었지만, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 형태 및 세부사항의 다양한 변경이 이루어질 수 있다는 것이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.
서열목록
서열번호 1 (인간 DAP10 전체 서열)
MIHLGHILFL LLLPVAAAQT TPGERSSLPA FYPGTSGSCS GCGSLSLPLL AGLVAADAVA
SLLIVGAVFL CARPRRSPAQ EDGKVYINMP GRG
서열번호 2 (DAP10 aa19-93 - 리더 서열 결핍)
QTTPGERSSL PAFYPGTSGS CSGCGSLSLP LLAGLVAADA VASLLIVGAV FLCARPRRSP
AQEDGKVYIN MPGRG
서열번호 3 (DAP10 aa19-69 - 세포외/막관통 도메인)
QTTPGERSSL PAFYPGTSGS CSGCGSLSLP LLAGLVAADA VASLLIVGAV F
서열번호 4 (DAP10 aa1-71)
MIHLGHILFL LLLPVAAAQT TPGERSSLPA FYPGTSGSCS GCGSLSLPLL AGLVAADAVA
SLLIVGAVFL C
서열번호 5 (DAP10 aa19-71)
QTTPGERSSL PAFYPGTSGS CSGCGSLSLP LLAGLVAADA VASLLIVGAV FLC
서열번호 6 (DAP10 aa70-93 - 세포내 도메인)
LCARPRRSPA QEDGKVYINM PGRG
서열번호 7 (DAP10 aa49-93 - 막관통 및 세포내 도메인)
LLAGLVAADA VASLLIVGAV FLCARPRRSP AQEDGKVYIN MPGRG
서열번호 8 (DAP10 aa49-69 - 막관통 도메인)
LLAGLVAADA VASLLIVGAV F
서열번호 9 (인간 DAP12 전체 서열)
MGGLEPCSRL LLLPLLLAVS GLRPVQAQAQ SDCSCSTVSP GVLAGIVMGD LVLTVLIALA
VYFLGRLVPR GRGAAEAATR KQRITETESP YQELQGQRSD VYSDLNTQRP YYK
서열번호 10 (DAP12 aa22-113 - 리더 서열 결핍)
LRPVQAQAQS DCSCSTVSPG VLAGIVMGDL VLTVLIALAV YFLGRLVPRG RGAAEAATRK
QRITETESPY QELQGQRSDV YSDLNTQRPY YK
서열번호 11 (DAP12 aa62-113 - 세포질/세포내 도메인)
YFLGRLVPRG RGAAEAATRK QRITETESPY QELQGQRSDV YSDLNTQRPY YK
서열번호 12 (DAP12 aa41-61 - 막관통 도메인)
GVLAGIVMGD LVLTVLIALA V
서열번호 13 (DAP12 aa22-61 - 세포외 및 막관통 도메인)
LRPVQAQAQS DCSCSTVSPG VLAGIVMGDL VLTVLIALAV
서열번호 14 (인간 NKG2D 전체 서열)
MGWIRGRRSR HSWEMSEFHN YNLDLKKSDF STRWQKQRCP VVKSKCRENA SPFFFCCFIA
VAMGIRFIIM VAIWSAVFLN SLFNQEVQIP LTESYCGPCP KNWICYKNNC YQFFDESKNW
YESQASCMSQ NASLLKVYSK EDQDLLKLVK SYHWMGLVHI PTNGSWQWED GSILSPNLLT
IIEMQKGDCA LYASSFKGYI ENCSTPNTYI CMQRTV
서열번호 15 (인간 NKG2D aa73-216 - 세포외 도메인)
IWSAVFLNSL FNQEVQIPLT ESYCGPCPKN WICYKNNCYQ FFDESKNWYE SQASCMSQNA
SLLKVYSKED QDLLKLVKSY HWMGLVHIPT NGSWQWEDGS ILSPNLLTII EMQKGDCALY
ASSFKGYIEN CSTPNTYICM QRTV
서열번호 16 (인간 NKG2D aa82-216 - 세포외 도메인)
LFNQEVQIPL TESYCGPCPK NWICYKNNCY QFFDESKNWY ESQASCMSQN ASLLKVYSKE
DQDLLKLVKS YHWMGLVHIP TNGSWQWEDG SILSPNLLTI IEMQKGDCAL YASSFKGYIE
NCSTPNTYIC MQRTV
서열번호 17 (인간 NKG2D aa52-216 - 막관통 및 세포외 도메인)
PFFFCCFIAV AMGIRFIIMV AIWSAVFLNS LFNQEVQIPL TESYCGPCPK NWICYKNNCY QFFDESKNWY ESQASCMSQN ASLLKVYSKE DQDLLKLVKS YHWMGLVHIP TNGSWQWEDG SILSPNLLTI IEMQKGDCAL YASSFKGYIE NCSTPNTYIC MQRTV
서열번호 18 (링커)
GSG
서열번호 19 (링커)
GSGGG
서열번호 20 (링커)
GSGG
서열번호 21 (링커)
SGGG
서열번호 22 (링커)
GGGGS
서열번호 23 (링커)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
서열번호 24 (링커)
GGGGSGGGGSGGGGS
서열번호 25 (링커)
GPPGS
서열번호 26 (링커)
GGGS
서열번호 27 (링커)
GGGGS
서열번호 28 (링커)
GYS
서열번호 29 (링커)
GS
서열번호 30 (링커)
SGGGG
서열번호 31 (링커)
SGGG
서열번호 32 (링커)
SGG
서열번호 33 (링커)
SGSG
서열번호 34 (링커)
SG
서열번호 35 (링커)
GGGGA
서열번호 36 (링커)
GGGA
서열번호 37 (링커)
EAAAK
서열번호 38 (푸린 절단 부위)
RRKR
서열번호39 (P2A 스킵 펩티드)
ATNFSLLKQAGDVEENPGP
서열번호 40 (T2A 스킵 펩티드)
EGRGSLLTCGDVEENPGP
서열번호 41 (SGSG + P2A)
SGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
서열번호 42 (SGSG + T2A)
SGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
서열번호 43 (푸린 + SGSG + P2A)
RRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
서열번호 44 (푸린 + SGSG + T2A)
RRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
서열번호 45 (F2A 스킵 펩티드)
VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
서열번호 46 (E2A 스킵 펩티드)
QCTNYALLKLAGDVESNPGP
서열번호 47 (His 태그)
HHHHHH
서열번호 48 (FLAG 태그)
DYKDDDDK
서열번호 49 (Avi 태그)
GLNDIFEAQKIEWHE
서열번호 50 (V5 태그)
GKPIPNPLLGLDST
서열번호 51 (V5 태그)
IPNPLLGLD
서열번호 52 (Myc 태그)
EQKLISEEDL
서열번호 53 (AHF 태그)
GLNDIFEAQKIEWHEGGHHHHHHDYKDDDDK
서열번호 54 (FHA 태그)
DYKDDDDKHHHHHHGGGLNDIFEAQKIEWHE
서열번호 55 (CD8α 리더 서열)
MALPVTALLL PLALLLHAAR P
서열번호 56 (4-1BB 엔도도메인)
KRGRKKLLYI FKQPFMRPVQ TTQEEDGCSC RFPEEEEGGC EL
서열번호 57 (CD27 엔도도메인)
QRRKYRSNKG ESPVEPAEPC HYSCPREEEG STIPIQEDYR KPEPACSP
서열번호 58 (인간 IgG1 힌지)
EPKSCDKTHT CP
서열번호 59 (절단된 CD8α 힌지)
TTTPAPRPPT PAPTIASQPL SLRPEACRPA AGGAVHTRGL DFACD
서열번호 60
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK
서열번호 61
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK
서열번호 62
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKEPKSCDKTHTCPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK
서열번호 63
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK
서열번호 64 (구축물 1/N1012)
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
서열번호 65 (구축물 3)
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
서열번호 66 (구축물 8)
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
서열번호 67 (구축물 9)
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
서열번호 68 (구축물 10)
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
서열번호 69 (구축물 11)
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
서열번호 70 (서열번호 60의 코딩 폴리펩티드)
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAG
서열번호 71 (서열번호 61의 코딩 폴리펩티드)
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGACGACGACGACAAGCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCtGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAG
서열번호 72 (서열번호 62의 코딩 폴리펩티드)
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGACGACGACGACAAGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACACACACATGCCCTCTTctggccggCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAG
서열번호 73 (서열번호 63의 코딩 폴리펩티드)
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGACGACGACGACAAGACCACAACACCTGCTCCTAGACCTCCCACCCCTGCTCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGAGACCCGAGGCCTGCAGACCCGCTGCTGGCGGCGCTGTGCATACCAGAGGCCTGGATTTCGCCTGCGACCTTctggccggCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAG
서열번호 74 (서열번호 64/구축물 1/N1012의 코딩 폴리펩티드)
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTG
서열번호 75 (서열번호 65/구축물 3의 코딩 폴리펩티드)
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGACGACGACGACAAGCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCtGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGCGGAGAAAGCGCtccGGCTCCGGCGAGGGCcgcGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCCATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAAACAACACCCGGCGAGAGATCCTCCTTGCCCGCTTTCTATCCCGGAACATCCGGAAGCTGTtccggaTGTGGATCCCTTTCTTTGcctttgCTTGCTGGATTGGTCGCAGCTGACGCTGTCGCTTCCCTCCTTATTGTCGGAGCTGTCTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCAGGCGGaagcgctccGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTG
서열번호76 (서열번호 66/구축물 8의 코딩 폴리펩티드)
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGAGAAGAAAGAGAAGCGGCAGCGGCGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGACccATGATTCATCTCGGACATATTCTCTTTCTCTTGCTCTTGCCTGTCGCTGCCGCTCAAACAACTCCCGGAGAAAGATCTTCTCTCCCCGCTTTTTATCCCGGAACATCTGGATCTTGTTCTGGATGTGGATCTTTGTCTCTCCCTCTCCTCGCTGGACTCGTCGCAGCTGATGCTGTCGCTTCTCTCTTGATTGTCGGAGCTGTCTTTTTGTGTAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTG
서열번호77 (서열번호 67/구축물 9의 코딩 폴리펩티드)
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGAGAAGAAAGAGAAGCGGCAGCGGCGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGACcTatggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgccgctagacccgattataaggacgacgacgacaagCAAACAACTCCCGGAGAAAGATCTTCTCTCCCCGCTTTTTATCCCGGAACATCTGGATCTTGTTCTGGATGTGGATCTTTGTCTCTCCCTCTCCTCGCTGGACTCGTCGCAGCTGATGCTGTCGCTTCTCTCTTGATTGTCGGAGCTGTCTTTTTGTGTAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTG
서열번호78 (서열번호 68/구축물 10의 코딩 폴리펩티드)
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGAGAAGAAAGAGAAGCGGCAGCGGCGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGACccATGATTCATCTCGGACATATTCTCTTTCTCTTGCTCTTGCCTGTCGCTGCCGCTCAAACAACTCCCGGAGAAAGATCTTCTCTCCCCGCTTTTTATCCCGGAACATCTGGATCTTGTTCTGGATGTGGATCTTTGTCTCTCCCTCTCCTCGCTGGACTCGTCGCAGCTGATGCTGTCGCTTCTCTCTTGATTGTCGGAGCTGTCTTTTTGTGTCAGAGGCGGAAGTACCGGAGCAACAAGGGCGAGAGCCCCGTGGAGCCTGCCGAGCCCTGCCACTACAGCTGTCCCCGGGAGGAGGAGGGCAGCACCATCCCCATCCAGGAGGACTACCGGAAGCCCGAGCCTGCCTGCAGCCCC
서열번호79 (서열번호 69/구축물 11의 코딩 폴리펩티드)
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGAGAAGAAAGAGAAGCGGCAGCGGCGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGACcTatggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgccgctagacccgattataaggacgacgacgacaagCAAACAACTCCCGGAGAAAGATCTTCTCTCCCCGCTTTTTATCCCGGAACATCTGGATCTTGTTCTGGATGTGGATCTTTGTCTCTCCCTCTCCTCGCTGGACTCGTCGCAGCTGATGCTGTCGCTTCTCTCTTGATTGTCGGAGCTGTCTTTTTGTGTCAGAGGCGGAAGTACCGGAGCAACAAGGGCGAGAGCCCCGTGGAGCCTGCCGAGCCCTGCCACTACAGCTGTCCCCGGGAGGAGGAGGGCAGCACCATCCCCATCCAGGAGGACTACCGGAAGCCCGAGCCTGCCTGCAGCCCC
서열번호 80 (A20FMDV2 펩티드)
NAVPNLRGDLQVLAQKVART
서열번호 81 (CD124 신호 펩티드)
MGWLCSGLLFPVSCLVLLQVASSGN
서열번호 82 (CD28 aa114-220)
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
서열번호 83 (CD247 aa52-164)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
서열번호 84 (WO 2019/182425의 서열번호 1)
MGWSCIILFLVATATGVHSQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKTSGYTFTDYSMHWVNQAP
GKGLKWMGWINTETGEPTYTDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARTAV
YWGQGTTLTVSSGSTSGSGKPGSGEGSDIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGSL
SWLQQKPDGTIKRLIYAASTLNSGVPKRFSGRRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYSS
YPWSFGGGTKLEIKEPKSPDKTHTCPPCPSHTQPLGVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVV
VDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSL
SLGKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGGRLVPRG
RGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRVKFSRSADAPAYQQGQN
QLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK
GERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
서열번호 85 (WO 2019/182425의 서열번호 9)
ARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG
서열번호 86 (WO 2019/182425의 서열번호 11)
GRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK
서열번호 87 (N1012_CXCR2에서 발현된 인간 CXCR2 폴리펩티드의 서열)
MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL
서열번호 88 (서열번호 87의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열)
atggaggatttcaatatggagagcgactccttcgaggatttttggaagggcgaggacctgtctaactacagctatagctccacactgcccccttttctgctggatgccgccccttgtgagccagagtccctggagatcaacaagtacttcgtggtcatcatctatgccctggtgtttctgctgtctctgctgggcaatagcctggtcatgctggtcatcctgtactccagggtgggccgctctgtgaccgacgtgtatctgctgaatctggccctggccgatctgctgttcgcactgacactgccaatctgggcagcaagcaaggtgaacggctggatcttcggcacctttctgtgcaaggtggtgtctctgctgaaggaggtgaacttctacagcggcatcctgctgctggcctgtatctccgtggaccggtatctggccatcgtgcacgccaccaggacactgacccagaagcggtacctggtgaagttcatctgcctgagcatctggggactgtccctgctgctggccctgcctgtgctgctgtttaggcgcacagtgtactctagcaacgtgtctccagcctgttatgaggatatgggcaacaataccgccaattggaggatgctgctgcgcatcctgccacagagcttcggctttatcgtgcccctgctgatcatgctgttctgctacggctttacactgcggaccctgttcaaggcccacatgggccagaagcaccgggccatgagagtgatcttcgccgtggtgctgatctttctgctgtgctggctgccctataacctggtgctgctggccgacacactgatgcggacccaggtcatccaggagacatgcgagcggagaaaccacatcgacagagccctggatgccaccgagatcctgggcatcctgcactcctgtctgaatcctctgatctatgccttcatcggccagaagtttaggcacggcctgctgaagatcctggccatccacggcctgatctccaaggactctctgcccaaggatagccgcccttccttcgtgggctcctctagcggccacacctctaccacactg
서열번호 89 (SFG N1012_CXCR2의 핵산 서열)
gatccggattagtccaatttgttaaagacaggatatcagtggtccaggctctagttttgactcaacaatatcaccagctgaagcctatagagtacgagccatagataaaataaaagattttatttagtctccagaaaaaggggggaatgaaagaccccacctgtaggtttggcaagctagcttaagtaacgccattttgcaaggcatggaaaaatacataactgagaatagagaagttcagatcaaggtcaggaacagatggaacagctgaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggaacagctgaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggtccccagatgcggtccagccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaaggacctgaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctcaataaaagagcccacaacccctcactcggggcgccagtcctccgattgactgagtcgcccgggtacccgtgtatccaataaaccctcttgcagttgcatccgacttgtggtctcgctgttccttgggagggtctcctctgagtgattgactacccgtcagcgggggtctttcacatgcagcatgtatcaaaattaatttggttttttttcttaagtatttacattaaatggccatagtacttaaagttacattggcttccttgaaataaacatggagtattcagaatgtgtcataaatatttctaattttaagatagtatctccattggctttctactttttcttttatttttttttgtcctctgtcttccatttgttgttgttgttgtttgtttgtttgtttgttggttggttggttaatttttttttaaagatcctacactatagttcaagctagactattagctactctgtaacccagggtgaccttgaagtcatgggtagcctgctgttttagccttcccacatctaagattacaggtatgagctatcatttttggtatattgattgattgattgattgatgtgtgtgtgtgtgattgtgtttgtgtgtgtgattgtgtatatgtgtgtatggttgtgtgtgattgtgtgtatgtatgtttgtgtgtgattgtgtgtgtgtgattgtgcatgtgtgtgtgtgtgattgtgtttatgtgtatgattgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgttgtgtatatatatttatggtagtgagaggcaacgctccggctcaggtgtcaggttggtttttgagacagagtctttcacttagcttggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctttgctcttaggagtttcctaatacatcccaaactcaaatatataaagcatttgacttgttctatgccctagggggcggggggaagctaagccagctttttttaacatttaaaatgttaattccattttaaatgcacagatgtttttatttcataagggtttcaatgtgcatgaatgctgcaatattcctgttaccaaagctagtataaataaaaatagataaacgtggaaattacttagagtttctgtcattaacgtttccttcctcagttgacaacataaatgcgctgctgagaagccagtttgcatctgtcaggatcaatttcccattatgccagtcatattaattactagtcaattagttgatttttatttttgacatatacatgtgaaagaccccacctgtaggtttggcaagctagcttaagtaacgccattttgcaaggcatggaaaaatacataactgagaatagaaaagttcagatcaaggtcaggaacagatggaacagctgaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggaacagctgaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggtccccagatgcggtccagccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaaggacctgaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctcaataaaagagcccacaacccctcactcggcgcgccagtcctccgattgactgagtcgcccgggtacccgtgtatccaataaaccctcttgcagttgcatccgacttgtggtctcgctgttccttgggagggtctcctctgagtgattgactacccgtcagcgggggtctttcatttgggggctcgtccgggatcgggagacccctgcccagggaccaccgacccaccaccgggaggtaagctggccagcaacttatctgtgtctgtccgattgtctagtgtctatgactgattttatgcgcctgcgtcggtactagttagctaactagctctgtatctggcggacccgtggtggaactgacgagttcggaacacccggccgcaaccctgggagacgtcccagggacttcgggggccgtttttgtggcccgacctgagtcctaaaatcccgatcgtttaggactctttggtgcaccccccttagaggagggatatgtggttctggtaggagacgagaacctaaaacagttcccgcctccgtctgaatttttgctttcggtttgggaccgaagccgcgccgcgcgtcttgtctgctgcagcatcgttctgtgttgtctctgtctgactgtgtttctgtatttgtctgaaaatatgggcccgggctagactgttaccactcccttaagtttgaccttaggtcactggaaagatgtcgagcggatcgctcacaaccagtcggtagatgtcaagaagagacgttgggttaccttctgctctgcagaatggccaacctttaacgtcggatggccgcgagacggcacctttaaccgagacctcatcacccaggttaagatcaaggtcttttcacctggcccgcatggacacccagaccaggtcccctacatcgtgacctgggaagccttggcttttgacccccctccctgggtcaagccctttgtacaccctaagcctccgcctcctcttcctccatccgccccgtctctcccccttgaacctcctcgttcgaccccgcctcgatcctccctttatccagccctcactccttctctaggcgcccccatatggccatatgagatcttatatggggcacccccgccccttgtaaacttccctgaccctgacatgacaagagttactaacagcccctctctccaagctcacttacaggctctctacttagtccagcacgaagtctggagacctctggcggcagcctaccaagaacaactggaccgaccggtggtacctcacccttaccgagtcggcgacacagtgtgggtccgccgacaccagactaagaacctagaacctcgctggaaaggaccttacacagtcctgctgaccacccccaccgccctcaaagtagacggcatcgcagcttggatacacgccgcccacgtgaaggctgccgaccccgggggtggaccatcctctagactgccatgatccacctgggccacatcctgttcctgctgctgctgcccgtggccgctgcccagaccacccctggcgagcggagcagcctgcctgccttctaccctggcaccagcggcagctgcagcggctgcggcagcctgagcctgcccctgctggccggcctggtggccgccgacgccgtggccagcctgctgatcgtgggcgccgtgttcctgtgcgccaggcccaggcggagccctgcccaggaggacggcaaggtgtacatcaacatgcccggccggggctacttcctgggcaggctggtgcccaggggcaggggcgctgccgaggctgccacccggaagcagcggatcaccgagaccgagagcccctaccaggagctgcagggccagcggagcgacgtgtacagcgacctgaacacccagaggccctactacaagaggcggaaaaggtctgggagtggggctaccaatttctctctcctcaagcaagccggagacgttgaggaaaaccctggacccatgggctggatccggggacggaggagccggcacagctgggagatgagcgagttccacaactacaacctggacctgaagaagagcgacttcagcacccggtggcagaagcagcggtgccccgtggtgaagagcaagtgccgggagaacgccagccccttcttcttctgctgcttcatcgccgtggctatgggcatccggttcatcatcatggtggccatctggagcgccgtgttcctgaacagcctgttcaaccaggaggtgcagatccccctgaccgagagctactgcggcccctgccccaagaactggatctgctacaagaacaactgctaccagttcttcgacgagagcaagaactggtacgagagccaggccagctgcatgagccagaacgccagcctgctgaaggtgtacagcaaggaggaccaggacctgctgaagctggtgaagagctaccactggatgggcctggtgcacatccccaccaacggcagctggcagtgggaggacggcagcatcctgagccccaacctgctgaccatcatcgagatgcagaagggcgactgcgccctgtacgccagcagcttcaagggctacatcgagaactgcagcacccccaacacctacatctgcatgcagcggacagtgcggagaaagagatccggatctggagagggaagaggaagcctgctgacctgcggcgacgtggaggagaacccaggacccatggaggatttcaatatggagagcgactccttcgaggatttttggaagggcgaggacctgtctaactacagctatagctccacactgcccccttttctgctggatgccgccccttgtgagccagagtccctggagatcaacaagtacttcgtggtcatcatctatgccctggtgtttctgctgtctctgctgggcaatagcctggtcatgctggtcatcctgtactccagggtgggccgctctgtgaccgacgtgtatctgctgaatctggccctggccgatctgctgttcgcactgacactgccaatctgggcagcaagcaaggtgaacggctggatcttcggcacctttctgtgcaaggtggtgtctctgctgaaggaggtgaacttctacagcggcatcctgctgctggcctgtatctccgtggaccggtatctggccatcgtgcacgccaccaggacactgacccagaagcggtacctggtgaagttcatctgcctgagcatctggggactgtccctgctgctggccctgcctgtgctgctgtttaggcgcacagtgtactctagcaacgtgtctccagcctgttatgaggatatgggcaacaataccgccaattggaggatgctgctgcgcatcctgccacagagcttcggctttatcgtgcccctgctgatcatgctgttctgctacggctttacactgcggaccctgttcaaggcccacatgggccagaagcaccgggccatgagagtgatcttcgccgtggtgctgatctttctgctgtgctggctgccctataacctggtgctgctggccgacacactgatgcggacccaggtcatccaggagacatgcgagcggagaaaccacatcgacagagccctggatgccaccgagatcctgggcatcctgcactcctgtctgaatcctctgatctatgccttcatcggccagaagtttaggcacggcctgctgaagatcctggccatccacggcctgatctccaaggactctctgcccaaggatagccgcccttccttcgtgggctcctctagcggccacacctctaccacactgtgacagccactcgag
서열번호 90 (protein encoded by 서열번호 89 (포함: (i) 전장 DAP10/DAP12 세포내 도메인의 융합; (ii) 퓨린 절단 부위 (RRKR); (iii) SGSG 링커; (iv) P2A 스킵 서열; (v) NKG2D; (vi) 퓨린 절단 부위 (RRKR); (vii) SGSG 링커; (viii) T2A 스킵 서열; (ix) CXCR2)
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL
서열번호 91 (서열번호 90의 폴리펩티드 코딩)
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACAGTGCGGAGAAAGAGATCCGGATCTGGAGAGGGAAGAGGAAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCAGGACCCATGGAGGATTTCAATATGGAGAGCGACTCCTTCGAGGATTTTTGGAAGGGCGAGGACCTGTCTAACTACAGCTATAGCTCCACACTGCCCCCTTTTCTGCTGGATGCCGCCCCTTGTGAGCCAGAGTCCCTGGAGATCAACAAGTACTTCGTGGTCATCATCTATGCCCTGGTGTTTCTGCTGTCTCTGCTGGGCAATAGCCTGGTCATGCTGGTCATCCTGTACTCCAGGGTGGGCCGCTCTGTGACCGACGTGTATCTGCTGAATCTGGCCCTGGCCGATCTGCTGTTCGCACTGACACTGCCAATCTGGGCAGCAAGCAAGGTGAACGGCTGGATCTTCGGCACCTTTCTGTGCAAGGTGGTGTCTCTGCTGAAGGAGGTGAACTTCTACAGCGGCATCCTGCTGCTGGCCTGTATCTCCGTGGACCGGTATCTGGCCATCGTGCACGCCACCAGGACACTGACCCAGAAGCGGTACCTGGTGAAGTTCATCTGCCTGAGCATCTGGGGACTGTCCCTGCTGCTGGCCCTGCCTGTGCTGCTGTTTAGGCGCACAGTGTACTCTAGCAACGTGTCTCCAGCCTGTTATGAGGATATGGGCAACAATACCGCCAATTGGAGGATGCTGCTGCGCATCCTGCCACAGAGCTTCGGCTTTATCGTGCCCCTGCTGATCATGCTGTTCTGCTACGGCTTTACACTGCGGACCCTGTTCAAGGCCCACATGGGCCAGAAGCACCGGGCCATGAGAGTGATCTTCGCCGTGGTGCTGATCTTTCTGCTGTGCTGGCTGCCCTATAACCTGGTGCTGCTGGCCGACACACTGATGCGGACCCAGGTCATCCAGGAGACATGCGAGCGGAGAAACCACATCGACAGAGCCCTGGATGCCACCGAGATCCTGGGCATCCTGCACTCCTGTCTGAATCCTCTGATCTATGCCTTCATCGGCCAGAAGTTTAGGCACGGCCTGCTGAAGATCCTGGCCATCCACGGCCTGATCTCCAAGGACTCTCTGCCCAAGGATAGCCGCCCTTCCTTCGTGGGCTCCTCTAGCGGCCACACCTCTACCACACTGTGACAGCCACTCGAG
서열번호 92 (Cyad-01 CAR(CD3ζ의 세포내 도메인에 융합된 NKG2D)의 복제물의 아미노산 서열)
MRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
서열번호 93 (서열번호 92의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열)
ATGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCcGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGATGCATTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCATGGGCTGGATCCGCGGCCGCAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTTATAATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGtaa
서열번호 94 (CYAD-01_10 - 서열번호 92 및 서열번호 1의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열)
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCcGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGgacacctacgatgcaTTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCATGGGCTGGATCCGCGGCCGCAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTTATAATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGtaa
서열번호 95 (인간 세포외 NKG2D 도메인)
LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
서열번호 96 (인간 세포외 NKG2D 도메인)
IWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
서열번호 97 (서열번호 95의 N-말단 아미노산에서 8 제외)
PLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
서열번호 98 (마우스 NKG2D TM 도메인; UniProt 기탁번호: 054709)
VVRVLAIALAIRFTLNTLMWLAI
서열번호 99 (마우스 NKG2D TM 도메인)
KISPMFVVRVLAIALAIRFTLNTLMWLAIFKETFQPV
서열번호 100 (래트 NKG2D)
MSKCHNYDLKPAKWDTSQEHQKQRSALPTSRPGENGIIRRRSSIEELKISPLFVVRVLVA
AMTIRFTVITLTWLAVFITLLCNKEVSVSSREGYCGPCPNDWICHRNNCYQFFNENKAWN
QSQASCLSQNSSLLKIYSKEEQDFLKLVKSYHWMGLVQSPANGSWQWEDGSSLSPNELTL
VKTPSGTCAVYGSSFKAYTEDCSNPNTYICMKRAV
서열번호 101 (rat NKG2D TM 도메인; UniProt accession no: 070215 aa 52-74)
LFVVRVLVAAMTIRFTVITLTWL
서열번호 102 (N5 폴리펩티드)
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMKISPMFVVRVLAIALAIRFTLNTLMWLAIFKETFQPVLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
서열번호 103 (서열번호 102의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산)
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGACGACGACGACAAGCTGAGACCCGTGCAGGCCCAGGCCCAGAGCGACTGCAGCTGCAGCACCGTGAGCCCCGGCGTGCTGGCCGGCATCGTGATGGGCGACCTGGTGCTGACCGTGCTCATCGCCCTTGCCGTGTACTTCCTGGGCAGACTGGTCCCCAGGGGCAGAGGAGCTGCCGAGGCCGCTACCAGAAAGCAGAGGATCACCGAGACAGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGAGATCCGACGTGTACAGCGACCTCAACACCCAGAGACCCTATTACAAGAGGCGGAAGCGCTCCGGCTCCGGCGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCCATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAAACAACACCCGGCGAGAGATCCTCCTTGCCCGCTTTCTATCCCGGAACATCCGGAAGCTGTTCCGGATGTGGATCCCTTTCTTTGCCTTTGCTTGCTGGATTGGTCGCAGCTGACGCTGTCGCTTCCCTCCTTATTGTCGGAGCTGTCTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCTGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCAGGCGGAAGCGCTCCGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGACCCATGAAAATATCTCCAATGTTCGTTGTTCGAGTCCTTGCTATAGCCTTGGCAATTCGATTCACCCTTAACACATTGATGTGGCTTGCCATTTTCAAAGAGACGTTTCAGCCAGTACTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCAAAAAATTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTG
서열번호 104 (인간 IgG1 힌지 - UniProt: P0DOX5의 aa 218-232)
EPK SCDKTHTCPP CP
서열번호 105 (CYAD-01_10 (NKG2D-CD3ζ + 리보솜 스킵 펩티드 + DAP10)의 아미노산 서열)
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
SEQUENCE LISTING - Rule 13ter <110> King's College London <120> COMPOSITIONS COMPRISING NKG2D, CXCR2, AND DAP10/DAP12 FUSION POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE THEREOF <130> P4099PC00 <140> PCT/EP2022/057653 <141> 2022-03-23 <150> US63/164959 <151> 2021-03-23 <150> US63/288593 <151> 2021-12-11 <160> 106 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala 1 5 10 15 Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr 20 25 30 Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro 35 40 45 Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile 50 55 60 Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln 65 70 75 80 Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly 85 90 <210> 2 <211> 75 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly 1 5 10 15 Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro Leu 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Leu Leu Lys Ile Leu Ala Ile His Gly Leu Ile Ser Lys Asp 740 745 750 Ser Leu Pro Lys Asp Ser Arg Pro Ser Phe Val Gly Ser Ser Ser Gly 755 760 765 His Thr Ser Thr Thr Leu 770 <210> 91 <211> 2337 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> construct <400> 91 atgatccacc tgggccacat cctgttcctg ctgctgctgc ccgtggccgc tgcccagacc 60 acccctggcg agcggagcag cctgcctgcc ttctaccctg gcaccagcgg cagctgcagc 120 ggctgcggca gcctgagcct gcccctgctg gccggcctgg tggccgccga cgccgtggcc 180 agcctgctga tcgtgggcgc cgtgttcctg tgcgccaggc ccaggcggag ccctgcccag 240 gaggacggca aggtgtacat caacatgccc ggccggggct acttcctggg caggctggtg 300 cccaggggca ggggcgctgc cgaggctgcc acccggaagc agcggatcac cgagaccgag 360 agcccctacc aggagctgca gggccagcgg agcgacgtgt acagcgacct gaacacccag 420 aggccctact acaagaggcg gaaaaggtct gggagtgggg ctaccaattt ctctctcctc 480 aagcaagccg gagacgttga ggaaaaccct ggacccatgg gctggatccg gggacggagg 540 agccggcaca gctgggagat gagcgagttc cacaactaca acctggacct gaagaagagc 600 gacttcagca cccggtggca gaagcagcgg tgccccgtgg tgaagagcaa gtgccgggag 660 aacgccagcc ccttcttctt ctgctgcttc atcgccgtgg ctatgggcat ccggttcatc 720 atcatggtgg ccatctggag cgccgtgttc ctgaacagcc tgttcaacca ggaggtgcag 780 atccccctga ccgagagcta ctgcggcccc tgccccaaga actggatctg ctacaagaac 840 aactgctacc agttcttcga cgagagcaag aactggtacg agagccaggc cagctgcatg 900 agccagaacg ccagcctgct gaaggtgtac agcaaggagg accaggacct gctgaagctg 960 gtgaagagct accactggat gggcctggtg cacatcccca ccaacggcag ctggcagtgg 1020 gaggacggca gcatcctgag ccccaacctg ctgaccatca tcgagatgca gaagggcgac 1080 tgcgccctgt acgccagcag cttcaagggc tacatcgaga actgcagcac ccccaacacc 1140 tacatctgca tgcagcggac agtgcggaga aagagatccg gatctggaga gggaagagga 1200 agcctgctga cctgcggcga cgtggaggag aacccaggac ccatggagga tttcaatatg 1260 gagagcgact ccttcgagga tttttggaag ggcgaggacc tgtctaacta cagctatagc 1320 tccacactgc ccccttttct gctggatgcc gccccttgtg agccagagtc cctggagatc 1380 aacaagtact tcgtggtcat catctatgcc ctggtgtttc tgctgtctct gctgggcaat 1440 agcctggtca tgctggtcat cctgtactcc agggtgggcc gctctgtgac cgacgtgtat 1500 ctgctgaatc tggccctggc cgatctgctg ttcgcactga cactgccaat ctgggcagca 1560 agcaaggtga acggctggat cttcggcacc tttctgtgca aggtggtgtc tctgctgaag 1620 gaggtgaact tctacagcgg catcctgctg ctggcctgta tctccgtgga ccggtatctg 1680 gccatcgtgc acgccaccag gacactgacc cagaagcggt acctggtgaa gttcatctgc 1740 ctgagcatct ggggactgtc cctgctgctg gccctgcctg tgctgctgtt taggcgcaca 1800 gtgtactcta gcaacgtgtc tccagcctgt tatgaggata tgggcaacaa taccgccaat 1860 tggaggatgc tgctgcgcat cctgccacag agcttcggct ttatcgtgcc cctgctgatc 1920 atgctgttct gctacggctt tacactgcgg accctgttca aggcccacat gggccagaag 1980 caccgggcca tgagagtgat cttcgccgtg gtgctgatct ttctgctgtg ctggctgccc 2040 tataacctgg tgctgctggc cgacacactg atgcggaccc aggtcatcca ggagacatgc 2100 gagcggagaa accacatcga cagagccctg gatgccaccg agatcctggg catcctgcac 2160 tcctgtctga atcctctgat ctatgccttc atcggccaga agtttaggca cggcctgctg 2220 aagatcctgg ccatccacgg cctgatctcc aaggactctc tgcccaagga tagccgccct 2280 tccttcgtgg gctcctctag cggccacacc tctaccacac tgtgacagcc actcgag 2337 <210> 92 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> construct <400> 92 Met Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 1 5 10 15 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 20 25 30 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 35 40 45 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 100 105 110 Arg Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met 115 120 125 Ser Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser 130 135 140 Thr Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg 145 150 155 160 Glu Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met 165 170 175 Gly Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu 180 185 190 Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr 195 200 205 Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr 210 215 220 Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys 225 230 235 240 Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln 245 250 255 Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His 260 265 270 Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser 275 280 285 Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu 290 295 300 Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn 305 310 315 320 Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val 325 <210> 93 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> construct <400> 93 atgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 120 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300 acctacgatg cattgcacat gcaggccctg ccccctcgca tgggctggat ccgcggccgc 360 aggagccggc acagctggga gatgagcgag ttccacaact acaacctgga cctgaagaag 420 agcgacttca gcacccggtg gcagaagcag cggtgccccg tggtgaagag caagtgccgg 480 gagaacgcca gccccttctt cttctgctgc ttcatcgccg tggctatggg catccggttt 540 ataatcatgg tggccatctg gagcgccgtg ttcctgaaca gcctgttcaa ccaggaggtg 600 cagatccccc tgaccgagag ctactgcggc ccctgcccca agaactggat ctgctacaag 660 aacaactgct accagttctt cgacgagagc aagaactggt acgagagcca ggccagctgc 720 atgagccaga acgccagcct gctgaaggtg tacagcaagg aggaccagga cctgctgaag 780 ctggtgaaga gctaccactg gatgggcctg gtgcacatcc ccaccaacgg cagctggcag 840 tgggaggacg gcagcatcct gagccccaac ctgctgacca tcatcgagat gcagaagggc 900 gactgcgccc tgtacgccag cagcttcaag ggctacatcg agaactgcag cacccccaac 960 acctacatct gcatgcagcg gaccgtgtaa 990 <210> 94 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> construct <400> 94 atgatccacc tgggccacat cctgttcctg ctgctgctgc ccgtggccgc tgcccagacc 60 acccctggcg agcggagcag cctgcctgcc ttctaccctg gcaccagcgg cagctgcagc 120 ggctgcggca gcctgagcct gcccctgctg gccggcctgg tggccgccga cgccgtggcc 180 agcctgctga tcgtgggcgc cgtgttcctg tgcgccaggc ccaggcggag ccctgcccag 240 gaggacggca aggtgtacat caacatgccc ggccggggca ggcggaaaag gtctgggagt 300 ggggctacca atttctctct cctcaagcaa gccggagacg ttgaggaaaa ccctggaccc 360 atgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 420 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 480 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 540 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 600 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 660 acctacgatg cattgcacat gcaggccctg ccccctcgca tgggctggat ccgcggccgc 720 aggagccggc acagctggga gatgagcgag ttccacaact acaacctgga cctgaagaag 780 agcgacttca gcacccggtg gcagaagcag cggtgccccg tggtgaagag caagtgccgg 840 gagaacgcca gccccttctt cttctgctgc ttcatcgccg tggctatggg catccggttt 900 ataatcatgg tggccatctg gagcgccgtg ttcctgaaca gcctgttcaa ccaggaggtg 960 cagatccccc tgaccgagag ctactgcggc ccctgcccca agaactggat ctgctacaag 1020 aacaactgct accagttctt cgacgagagc aagaactggt acgagagcca ggccagctgc 1080 atgagccaga acgccagcct gctgaaggtg tacagcaagg aggaccagga cctgctgaag 1140 ctggtgaaga gctaccactg gatgggcctg gtgcacatcc ccaccaacgg cagctggcag 1200 tgggaggacg gcagcatcct gagccccaac ctgctgacca tcatcgagat gcagaagggc 1260 gactgcgccc tgtacgccag cagcttcaag ggctacatcg agaactgcag cacccccaac 1320 acctacatct gcatgcagcg gaccgtgtaa 1350 <210> 95 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly 1 5 10 15 Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe 20 25 30 Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser 35 40 45 Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu 50 55 60 Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro 65 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<210> 97 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys 1 5 10 15 Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr 20 25 30 Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val 35 40 45 Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His 50 55 60 Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu 65 70 75 80 Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln 85 90 95 Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu 100 105 110 Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val 115 120 125 <210> 98 <211> 23 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 98 Val Val Arg Val Leu Ala Ile Ala Leu Ala Ile Arg Phe Thr Leu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Met Trp Leu Ala Ile 20 <210> 99 <211> 37 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 99 Lys Ile Ser Pro Met Phe Val Val Arg Val Leu Ala Ile Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ile Arg Phe Thr Leu Asn Thr Leu Met Trp Leu Ala Ile Phe Lys Glu 20 25 30 Thr Phe Gln Pro Val 35 <210> 100 <211> 215 <212> PRT <213> Rattus exulans <400> 100 Met Ser Lys Cys His Asn Tyr Asp Leu Lys Pro Ala Lys Trp Asp Thr 1 5 10 15 Ser Gln Glu His Gln Lys Gln Arg Ser Ala Leu Pro Thr Ser Arg Pro 20 25 30 Gly Glu Asn Gly Ile Ile Arg Arg Arg Ser Ser Ile Glu Glu Leu Lys 35 40 45 Ile Ser Pro Leu Phe Val Val Arg Val Leu Val Ala Ala Met Thr Ile 50 55 60 Arg Phe Thr Val Ile Thr Leu Thr Trp Leu Ala Val Phe Ile Thr Leu 65 70 75 80 Leu Cys Asn Lys Glu Val Ser Val Ser Ser Arg Glu Gly Tyr Cys Gly 85 90 95 Pro Cys Pro Asn Asp Trp Ile Cys His Arg Asn Asn Cys Tyr Gln Phe 100 105 110 Phe Asn Glu Asn Lys Ala Trp Asn Gln Ser Gln Ala Ser Cys Leu Ser 115 120 125 Gln Asn Ser Ser Leu Leu Lys Ile Tyr Ser Lys Glu Glu Gln Asp Phe 130 135 140 Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val Gln Ser Pro 145 150 155 160 Ala Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ser Leu Ser Pro Asn 165 170 175 Glu Leu Thr Leu Val Lys Thr Pro Ser Gly Thr Cys Ala Val Tyr Gly 180 185 190 Ser Ser Phe Lys Ala Tyr Thr Glu Asp Cys Ser Asn Pro Asn Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Met Lys Arg Ala Val 210 215 <210> 101 <211> 23 <212> PRT <213> Rattus exulans <400> 101 Leu Phe Val Val Arg Val Leu Val Ala Ala Met Thr Ile Arg Phe Thr 1 5 10 15 Val Ile Thr Leu Thr Trp Leu 20 <210> 102 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> construct <400> 102 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Arg Pro 20 25 30 Val Gln Ala Gln Ala Gln Ser Asp Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro 35 40 45 Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu 50 55 60 Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg 65 70 75 80 Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu 85 90 95 Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp 100 105 110 Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser 115 120 125 Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn 130 135 140 Pro Gly Pro Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu 145 150 155 160 Pro Val Ala Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro 165 170 175 Ala Phe Tyr Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu 180 185 190 Ser Leu Pro Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser 195 200 205 Leu Leu Ile Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser 210 215 220 Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly 225 230 235 240 Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys 245 250 255 Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Lys Ile Ser Pro 260 265 270 Met Phe Val Val Arg Val Leu Ala Ile Ala Leu Ala Ile Arg Phe Thr 275 280 285 Leu Asn Thr Leu Met Trp Leu Ala Ile Phe Lys Glu Thr Phe Gln Pro 290 295 300 Val Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys 305 310 315 320 Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln 325 330 335 Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met 340 345 350 Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp 355 360 365 Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile 370 375 380 Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro 385 390 395 400 Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr 405 410 415 Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr 420 425 430 Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val 435 440 <210> 103 <211> 1320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> construct <400> 103 atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctaga 60 cccgattata aggacgacga cgacaagctg agacccgtgc aggcccaggc ccagagcgac 120 tgcagctgca gcaccgtgag ccccggcgtg ctggccggca tcgtgatggg cgacctggtg 180 ctgaccgtgc tcatcgccct tgccgtgtac ttcctgggca gactggtccc caggggcaga 240 ggagctgccg aggccgctac cagaaagcag aggatcaccg agacagagag cccctaccag 300 gagctgcagg gccagagatc cgacgtgtac agcgacctca acacccagag accctattac 360 aagaggcgga agcgctccgg ctccggcgag ggccgcggca gcctgctgac ctgcggcgac 420 gtggaagaga accccggacc catgatccac ctgggccaca tcctgttcct gctgctgctg 480 cccgtggccg ctgcccaaac aacacccggc gagagatcct ccttgcccgc tttctatccc 540 ggaacatccg gaagctgttc cggatgtgga tccctttctt tgcctttgct tgctggattg 600 gtcgcagctg acgctgtcgc ttccctcctt attgtcggag ctgtcttcct gtgcgccagg 660 cccaggcgga gccctgccca ggaggacggc aaggtgtaca tcaacatgcc cggccggggc 720 aggcggaagc gctccgggag tggggctacc aatttctctc tcctcaagca agccggagac 780 gttgaggaaa accctggacc catgaaaata tctccaatgt tcgttgttcg agtccttgct 840 atagccttgg caattcgatt cacccttaac acattgatgt ggcttgccat tttcaaagag 900 acgtttcagc cagtactgtt caaccaggag gtgcagatcc ccctgaccga gagctactgc 960 ggcccctgcc caaaaaattg gatctgctac aagaacaact gctaccagtt cttcgacgag 1020 agcaagaact ggtacgagag ccaggccagc tgcatgagcc agaacgccag cctgctgaag 1080 gtgtacagca aggaggacca ggacctgctg aagctggtga agagctacca ctggatgggc 1140 ctggtgcaca tccccaccaa cggcagctgg cagtgggagg acggcagcat cctgagcccc 1200 aacctgctga ccatcatcga gatgcagaag ggcgactgcg ccctgtacgc cagcagcttc 1260 aagggctaca tcgagaactg cagcaccccc aacacctaca tctgcatgca gcggaccgtg 1320 <210> 104 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 105 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> construct <400> 105 Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala 1 5 10 15 Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr 20 25 30 Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro 35 40 45 Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile 50 55 60 Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln 65 70 75 80 Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly Arg Arg Lys 85 90 95 Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly 100 105 110 Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser 115 120 125 Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu 130 135 140 Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg 145 150 155 160 Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln 165 170 175 Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr 180 185 190 Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp 195 200 205 Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 210 215 220 Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg 225 230 235 240 Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu 245 250 255 Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys 260 265 270 Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe 275 280 285 Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe Ile Ile Met Val 290 295 300 Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val 305 310 315 320 Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp 325 330 335 Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn 340 345 350 Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu 355 360 365 Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser 370 375 380 Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln 385 390 395 400 Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu 405 410 415 Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr 420 425 430 Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr 435 440 445 Val <210> 106 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 1 5

Claims (58)

  1. 다음을 포함하는 면역반응 세포:
    (a) NKG2D 폴리펩티드;
    (b) (i) DNAX-활성화 10(DAP10) 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 변이체 및 (ii) DNAX-활성화 단백질 12(DAP12) 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드; 및
    (c) CXCR2 폴리펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서, NKG2D 폴리펩티드, DAP10 폴리펩티드, DAP12 폴리펩티드, 및 CXCR2 폴리펩티드 각각이 포유동물 폴리펩티드인 것인 면역반응 세포.
  3. 청구항 2에 있어서, NKG2D 폴리펩티드, DAP10 폴리펩티드, DAP12 폴리펩티드, 및 CXCR2 폴리펩티드 각각이 인간 폴리펩티드인 것인 면역반응 세포.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, NKG2D 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열 번호 14의 서열과 약 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 면역반응 세포.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NKG2D 폴리펩티드가 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 기능적 변이체인 것인 면역반응 세포.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 기능적 변이체가 서열번호 14의 아미노산 중 적어도 하나를 추가, 결실, 또는 치환하는 하나 이상의 점 돌연변이를 갖는 것인 면역반응 세포.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 기능적 변이체가 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 절단된 버전인 것인 면역반응 세포.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 기능적 변이체가 키메라 NKG2D 폴리펩티드인 것인 면역반응 세포.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 갖는 것인 면역반응 세포:
    A-B-C-D-E,
    여기서
    A는 선택적 N-말단 서열이고;
    B는 DAP10 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체이고;
    C는 선택적 링커 서열이고;
    D는 DAP12 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체이고; 및
    E = 선택적 C-말단 서열이다.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DAP10 폴리펩티드가 서열번호 1의 DAP10 폴리펩티드에 대해 적어도 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 DAP10의 기능적 변이체인 것인 면역반응 세포.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DAP10 폴리펩티드가 서열번호 1의 DAP10 폴리펩티드의 임의의 아미노산을 부가, 결실, 또는 치환하는 점 돌연변이 하나 이상(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)을 갖는 서열번호 1의 기능적 변이체인 것인 면역반응 세포.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DAP10 폴리펩티드가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 절단된 버전인 DAP10 폴리펩티드의 기능적 변이체인 것인 면역반응 세포.
  13. 청구항 7에 있어서, 상기 DAP10의 절단된 버전이 서열번호 1의 아미노산 19-93, 19-69, 1-71, 19-71, 19-48, 49-69, 49-93, 또는 70-93을 포함하거나 이로 구성된 것인 면역반응 세포.
  14. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DAP10 폴리펩티드가 서열 번호 1-8 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성된 것인 면역반응 세포.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DAP12 폴리펩티드가 서열번호 9의 DAP12 폴리펩티드에 대해 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 DAP12의 기능적 변이체인 것인 면역반응 세포.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DAP12 폴리펩티드가 서열번호 9의 DAP12 폴리펩티드의 임의의 아미노산을 부가, 결실, 또는 치환하는 점 돌연변이 하나 이상(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)을 갖는 서열번호 9의 기능적 변이체인 것인 면역반응 세포.
  17. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DAP12 폴리펩티드가 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 절단된 버전인 DAP12 폴리펩티드의 기능적 변이체인 것인 면역반응 세포.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 DAP12의 절단된 버전이 서열번호 9의 아미노산 22-113, 62-113, 22-61, 또는 41-61을 포함하거나 이로 구성된 것인 면역반응 세포.
  19. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DAP12 폴리펩티드가 서열번호 9-13 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성된 것인 면역반응 세포.
  20. 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DAP10 폴리펩티드와 DAP12 폴리펩티드가 링커에 의해 연결된 것인 면역반응 세포.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 링커가 서열번호 18-46 중 어느 하나에 열거된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 것인 면역반응 세포.
  22. 청구항 20 또는 청구항 21에 있어서, 상기 링커가 서열번호 33 또는 38-44 중 어느 하나에 열거된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 것인 면역반응 세포.
  23. 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드가 N-말단 서열을 포함하는 것인 면역반응 세포.
  24. 청구항 1 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드가 C-말단 서열을 포함하는 것인 면역반응 세포.
  25. 청구항 23 또는 청구항 24에 있어서, 상기 N-말단 또는 C-말단 서열이 His-태그, FLAG-태그, Arg-태그, T7-태그, Strep-태그, S-태그, AviTagTM, 앱타머-태그, myc 태그, CD8α 리더 서열, 4-1BB 엔도도메인, V5 태그, 또는 CD27 엔도도메인 중 하나 이상을 포함하는 것인 면역반응 세포.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 N-말단 또는 C-말단 서열이 CD8α 리더 서열, 4-1BB 엔도도메인, 또는 CD27 엔도도메인 중 하나 이상을 포함하는 것인 면역반응 세포.
  27. 청구항 1 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드가 서열번호 60 내지 63 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 구성된 것인 면역반응 세포.
  28. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는:
    (a) 서열번호 84를 포함하지 않고/않거나;
    (b) 항-EpCAM 펩티드를 포함하지 않고/않거나;
    (c) 서열번호 85를 포함하지 않고/않거나;
    (d) 서열번호 86을 포함하지 않고/않거나;
    (e) 서열번호 85 및 서열번호 86 둘 다를 포함하지 않는
    것인 면역반응 세포.
  29. 청구항 1 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드가 C-말단에서 인간 DAP12 폴리펩티드의 엔도도메인에 융합된 전장 인간 DAP10을 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 엔도도메인은 인간 DAP12의 아미노산 62-113에 의해 코딩되는 것인 면역반응 세포.
  30. 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드가 서열번호 60의 서열을 갖는 것인 면역반응 세포.
  31. 청구항 1 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CXCR2 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열 번호 87의 서열에 대해 약 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 면역반응 세포.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 CXCR2 폴리펩티드가 서열번호 87의 아미노산 서열을 갖는 것인 면역반응 세포.
  33. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역반응 세포가 T-세포 또는 자연 살해(NK) 세포인 것인 면역반응 세포.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 면역반응 세포가 αβ T-세포, γδ T-세포, CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, 자연살해 T(NKT) 세포, 또는 이들의 임의의 조합인 것인 면역반응 세포.
  35. NKG2D 폴리펩티드, CXCR2 폴리펩티드, 및 선택적으로 DNAX-활성화(DAP10) 폴리펩티드, DNAX-활성화(DAP12) 폴리펩티드, 및/또는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 것인 핵산 분자.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드가 (i) DNAX-활성화 10(DAP10) 폴리펩티드, 또는 그의 기능적 변이체 및 (ii) DNAX-활성화 단백질 12(DAP12) 폴리펩티드, 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 것인 핵산 분자.
  37. 청구항 35 또는 청구항 36에 있어서, 상기 핵산 분자가 NKG2D 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 및 CXCR2 폴리펩티드를 코딩하는 키메라 폴리뉴클레오티드인 것인 핵산 분자.
  38. 청구항 37에 있어서, 상기 핵산 분자가 5'에서 3'으로, (i) 인간 DAP12의 엔도도메인과의 프레임 내 인간 DAP10; (ii) 제1 프로테아제 절단 부위; (iii) 제1 링커; (iv) 제1 리보솜 스킵 펩티드; (v) 인간 NKG2D; (vi) 제2 프로테아제 절단 부위; (vii) 제2 링커; (viii); 제2 리보솜 스킵 펩티드; 및 (ix) 인간 CXCR2를 코딩하는 것인 핵산 분자.
  39. 청구항 35 내지 청구항 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 서열 번호 88의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
  40. 청구항 35 내지 청구항 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호 91의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 핵산 분자.
  41. 청구항 35 내지 청구항 40 중 어느 한 항의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  42. 청구항 41에 있어서, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터인 것인 벡터.
  43. 청구항 42에 있어서, 상기 벡터가 SFG 레트로바이러스 벡터인 것인 벡터.
  44. 다음 단계를 포함하는, 청구항 1 내지 청구항 34 중 어느 한 항의 면역반응 세포를 제조하는 방법:
    (a) 청구항 35 내지 청구항 40 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 청구항 41 내지 청구항 43 중 어느 한 항의 벡터로 T-세포 또는 자연 살해 세포(natural killer cell)를 형질도입시키는 단계; 및
    (b) 상기 형질도입된 세포가 NKG2D 폴리펩티드, DAP10/DAP12 융합 폴리펩티드, 및 CXCR2 폴리펩티드를 발현하도록 T-세포 또는 자연 살해 세포를 배양하는 단계(여기서, NKG2D 폴리펩티드와 DAP10/DAP12 융합 폴리펩티드는 세포막에서 겹합됨).
  45. 청구항 1 내지 청구항 34 중 어느 한 항의 면역반응 세포의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 가진 개체를 치료하는 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 면역반응 세포는 상기 개체에 대해 자가 (autologous) T-세포 또는 NK 세포로부터 제조되는 것인 방법.
  47. 청구항 45 또는 청구항 46에 있어서, 상기 암이 고형 종양 암인 것인 방법.
  48. 청구항 47에 있어서, 상기 고형암은 간암, 폐암, 유방암, 전립선암, 림프암, 결장암, 신장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 갑상선암, 식도암, 소장암, 또는 이들의 임의의 조합인 것인 방법.
  49. 청구항 48에 있어서, 상기 고형 종양 암이 난소암인 것인 방법.
  50. 청구항 1 내지 청구항 34 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것인 면역반응 세포.
  51. 다음을 포함하는 면역반응 세포:
    (a) 인간 NKG2D 세포외 도메인 또는 이의 변이체 및 쥐과 NKG2D 막관통 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 키메라 NKG2D 폴리펩티드;
    (b) CXCR2 폴리펩티드.
  52. 청구항 51에 있어서, 상기 인간 NKG2D 세포외 도메인이 서열번호 95, 서열번호 96, 또는 서열번호 97에 제시된 서열을 갖는 것인 면역반응 세포.
  53. 청구항 51 또는 청구항 52에 있어서, 상기 쥐과 NKG2D 막관통 도메인이 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 또는 서열번호 101에 제시된 서열을 갖는 것인 면역반응 세포.
  54. 청구항 51에 있어서, 상기 키메라 NKG2D 폴리펩티드가 인간 NKG2D 세포외 도메인의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체가 서열 번호 95, 96, 또는 97 중 임의의 것에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 면역반응 세포.
  55. 청구항 51, 청구항 52, 또는 청구항 54 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 NKG2D 폴리펩티드가 쥐과 NKG2D 막관통 도메인의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체가 서열 번호 98, 99, 100, 또는 101 중 임의의 것에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 면역반응 세포.
  56. 청구항 51 내지 청구항 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 하나 이상의 DNAX-활성화 단백질 12(DAP12) 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 추가로 포함하는 것인 면역반응 세포.
  57. 청구항 51 내지 청구항 56 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 하나 이상의 DNAX-활성화 단백질 10(DAP10) 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 추가로 포함하는 것인 면역반응 세포.
  58. 청구항 57에 있어서, 상기 세포가 서열번호 102에 제시된 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것인 면역반응 세포.
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