KR20230151518A - 치료 세포를 동종이계 거부반응 및 활성화 유도된 세포 사멸로부터 보호하기 위한 FasL 발현 및 FasR 유전자 녹아웃 - Google Patents

치료 세포를 동종이계 거부반응 및 활성화 유도된 세포 사멸로부터 보호하기 위한 FasL 발현 및 FasR 유전자 녹아웃 Download PDF

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마이클 토마스 베툰
에릭 한스 슈벤
블라컴 토마스 존 반
세사르 아돌포 소머
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알로젠 테라퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

환자에게 동종이계 세포를 투여하는 것을 수반하는 요법을 개선하기 위한 조성물, 방법, 발현 벡터 및 조작된 면역 세포가 개시된다. FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 포함하고/하거나, 예를 들어, FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로부터 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 발현하도록, 및 감소된 수준에서 FasR을 발현하도록 변형되고, 항원 결합 단백질, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하고/하거나 발현하도록 추가로 변형된, 면역 세포 (예:T세포). 개선된 면역 세포, 및 개선된 면역 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 CAR T 세포 요법의 개선된 방법. 투여된 세포의 지속성을 개선하고 활성화 유도된 세포 사멸을 감소시키는 방법으로서, 개선된 세포를 투여하는 단계를 포함하는 방법.

Description

치료 세포를 동종이계 거부반응 및 활성화 유도된 세포 사멸로부터 보호하기 위한 FasL 발현 및 FasR 유전자 녹아웃
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 3월 4일에 출원된 미국 가출원 제63/156,902호에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다. 2022년 2월 24일에 생성된 전술한 ASCII 사본의 명칭은 AT-040_02WO_SL.txt이며, 크기는 102,560 바이트이다.
기술분야
본 개시는 대체적으로 질환을 치료하기 위해 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 면역 세포(예: T 세포)의 용도에 관한 것이다.
표적화된 세포 요법은 유전자 조작을 사용해 면역 효과기 세포를 암-표적화 수용체(T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR))로 무장시키고, 그런 다음 이들 조작된 세포를 자가 또는 동종이계 환경에서 암 환자에게 주입한다. 악성 종양 관련 항원을 인식하도록 유전적으로 변형된 면역 세포의 입양 전달은 암 치료에 대한 강력한 접근법으로서 부상했다(예를 들어, Brenner 등의 문헌[Current Opinion in Immunology, 22(2): 251-257 (2010)]; Rosenberg 등의 문헌[Nature Reviews Cancer, 8(4): 299-308 (2008)] 참조). 면역 세포는 키메라 항원 수용체(CAR), 항원 인식 모이어티로 이루어진 융합 단백질 및 T 세포 활성화 도메인을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다(예를 들어, Eshhar 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993), 및 Sadelain 등, Curr. Opin. Immunol, 21(2): 215-223 (2009) 참조). CAR-T 세포(CAR-T)와 같은 CAR을 함유하는 면역 세포는 표적 세포를 인식하고 살해하는 능력을 유지시키거나 향상시키면서 항원 특이성을 가지도록 조작된다.
그러나, CAR-변형 자가 세포 요법의 생성은 비용이 많이 들고, 몇 주의 프로세스 및 품질 시험이 필요하며, 사용된 환자-특이적 T 세포의 초기 품질 및 양에 따라 가변 효능의 산물을 산출한다. 자가 요법에 비해, 건강한 공여자 유래의 세포가 CAR로 변형된 다음 다수의 환자에게 투여되는 동종이계 CAR-변형 세포 요법은 필요 시 즉시 전달될 수 있는 더 저렴하고 더 강력한 제품을 약속한다(예를 들어, Graham 등의 Cells 2018, 7, 155; doi:10.3390/cells7100155 참조). 또한, 동종이계 요법은 바람직한 제품 특성(예: 유전자 편집 효율, 통합 부위, 유해한 오프 타겟 유전자 편집의 결여, 일배체형 등)에 대한 선택을 가능하게 하고, 보다 정교한 세포 조작(예: 효능, 지속성, 귀환 등을 개선하는 다중 유전자 편집)을 용이하게 한다. 동종이계 CAR-변형 세포 요법을 구현하는 데 있어서의 주요 장애물은 환자의 면역 체계(숙주)에 의한 생성물(공여자)의 거부 가능성이다.
또한, 자가 세포 요법과 마찬가지로, 시간 경과에 따라 종양 미세환경 굴복을 침윤하는 동종이계 효과기 세포가 활성화 유도된 세포 사멸(AICD)에 도달하여 치료적 지속성을 제한한다.
동종이계 세포 요법은 자가 세포 요법에 비해 많은 이점을 나타내지만, 동종이계 세포는 숙주와 구별되는 동종이계 세포 산물의 표면에서 T 및 NK 에피토프 결정 인자와 반응하는 숙주 또는 수용자 면역 체계 세포에 의한 거부 반응을 또한 직면한다. 본 개시는 수용자의 자연 방어에도 불구하고 투여된 세포의 증가된 지속성을 제공하는 개선된 동종이계 요법의 이점을 제공한다.
본 개시는 수용체-변형 세포 요법 생성물(예를 들어, CAR과 같은 항원 결합 단백질을 발현하도록 조작된 T 세포와 같은 면역 세포)이 2가지 측면에서 추가로 유전적으로 조작되는 반-공격 전략을 제공한다. 첫째, 세포는 Fas 리간드(FasL 또는 CD178로도 알려짐) 단백질 또는 단백질을 암호화하는 핵산 유래의 이의 유도체를 이종 발현하도록 조작된다. 둘째, Fas 수용체(Fas, FasR 또는 CD95로도 알려짐) 유전자의 발현 수준이 감소(예: 녹아웃을 통해 제거)되도록 세포가 유전적으로 변형된다. FasL의 발현은, FasL의 결합이 FasR-발현 세포에서 세포자멸사를 유발하기 때문에, 생성물 세포가 활성화 시 FasR을 발현하는 동종반응성 숙주 T 및 자연 살해(NK) 세포를 살해할 수 있게 한다. 세포의 FasR 발현 수준을 감소시키는 것(예를 들어, 세포에서 FasR 발현을 제거하는 것)은 FasL-유도된 동족살해 및 AICD로부터 생성물 세포를 보호한다.
본 개시는, 무엇보다도, 동종이계 세포를 환자에게 투여하는 요법을 개선하기 위한 조성물, 방법 및 관련 물질, 예를 들어, 발현 벡터, 조작된 세포 및 조성물을 제공한다. 본 개시의 일 양태는 면역 세포, 예를 들어 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 포함하고/하거나 발현하도록 변형된 T 세포이다(예를 들어, FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로부터 유래함). 본 개시의 제2 양태는 면역 세포, 예를 들어, T 세포가 감소된 수준으로 FasR을 발현하도록 변형되는 T 세포이다(예를 들어, 임의의 유전자 돌연변이 또는 유전자 편집 기술을 사용하여 세포를 유전적으로 변형시킴으로써). 양 양태의 구현예에서, 면역 세포, 예를 들어 T 세포는 (예를 들어, CAR과 같은 항원 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로부터) 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 항원 결합 단백질을 포함하고/하거나 발현하도록 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 면역 세포, 예를 들어, T 세포는 이들 변형 중 2개 또는 3개를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 본 개시는 면역 세포, 예를 들어, 항원 결합 단백질(예: CAR)을 발현하도록 변형된 면역 세포(예: T 세포)를 투여하거나, FasR 수준을 낮추거나 전혀 발현하지 않도록(예: FasR 녹아웃), FasL 단백질 또는 FasL 유도체 단백질을 발현하도록 변형된 면역 세포를 투여하는 단계를 포함하는 CAR T 세포 요법의 개선된 방법을 제공한다. 따라서, 이는 AICD가 감소되고/되거나 지속되는, 예를 들어, 3개의 변형을 포함하는 투여된 세포의 치료적 지속성이 항원 결합 단백질, 예를 들어, CAR을 발현하도록 변형된 투여 세포에 비해 증가되는, CAR T 세포 요법의 개선된 방법을 추가로 제공한다.
일 양태에서, 항원 결합 단백질을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 상기 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일 구현예에서, FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체의 아미노산 서열은 UniprotKB - P48023(야생형 인간 FasL, 서열번호 3)의 아미노산 서열, 인간 FasL 델타 2-74(서열번호 7), 인간 FasL Q130D(서열번호 10), 인간 FasL C82A(서열번호 8)의 아미노산 서열, 또는 인간 FasL SLEKQ126-130->EEAAA(SEQ ID NO:9)("SLEKQ" 및 "EEAAA"는 각각 서열번호 32 및 33으로 개시됨)의 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 벡터는 재조합 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 사이에 2A 펩티드 암호화 서열(서열 번호 2)을 더 포함하고/하거나, WPRE와 같은 전사후 조절 요소(PRE)를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터이다.
또 다른 양태에서, 본원에 제공된 상기 벡터를 포함하는 조작된 면역 세포가 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 상기 조작된 면역 세포는 FasR 발현 수준을 감소시키기 위해 변형되지 않은 조작된 면역 세포와 비교하여 FasR 발현 수준이 감소되도록, 예를 들어 유전적으로 변형된다.
또 다른 양태에서, 조작된 면역 세포, 예를 들어, 항원 결합 단백질 및 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 포함하는 단리된 조작된 면역 세포가 본원에 제공되며, 여기서 FasR 발현 수준이 동일하지만 FasR 발현 수준을 감소시키기 위해 유전적으로 변형되지 않은 조작된 면역 세포와 비교하여 감소되도록, 예를 들어 유전적으로 변형된다. 일 구현예에서, 상기 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 면역 세포에서, FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체는 야생형 인간 FasL, 인간 FasL 델타 2-74, 인간 FasL Q130D, 인간 FasL C82A 및 인간 FasL SLEKQ126-130->EEAA(각각 서열 번호 32 및 33) 중 임의의 하나 이상이다.
다양한 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 면역 세포는 조작된 T 세포(예를 들어, 조작된 알파/베타 T 세포 및/또는 조작된 감마/델타 T 세포), B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 비만 세포, 및/또는 골수 유래 식세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 조작된 T 세포(예: CAR T 세포)이다. 본원에 개시된 조작된 면역 세포의 다양한 구현예에서, 조작된 면역 세포는 인간 조작된 면역 세포, 예를 들어, 인간 조작된 T 세포이다.
본원에 개시된 조작된 면역 세포의 다양한 구현예에서, 상기 면역 세포는, 그러나 이에 한정되지는 않지만, FasR, CD52 및 TCR-알파와 같은 하나 이상의 유전자를 발현하도록 조작된 경우, 유전자의 발현 수준은 그렇게 변형되지 않은 상응하는 세포, 즉 대조 세포에서의 유전자 발현 수준에 비해 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%(예를 들어, 유전자 녹아웃) 감소된다. 일부 구현예에서, 유전자의 발현 수준은 세포 표면에서 측정된다. 일부 구현예에서, 유전자의 세포 표면 발현 수준은 유세포 계측법에 의해 측정된다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 면역 세포가 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 상기 조작된 면역 세포는 게놈이 FasR 발현 수준을 감소시키기 위해 변형되지 않은 조작된 면역 세포와 비교하여 FasR 발현 수준이 감소되도록, 예를 들어 유전적으로 변형된다. 일 구현예에서, 상기 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일 구현예에서, FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체의 아미노산 서열은 UniprotKB - P48023(서열번호 3), FasL 델타 2-74(서열번호 7), FasL Q130D(서열번호 10), FasL C82A(서열번호 8) 또는 FasL SLEKQ126-130->EEAAA (서열번호 9) ("SLEKQ" 및 "EEAAA"는 각각 서열번호 32 및 33으로 개시됨)로 구성되거나 이를 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 면역 세포는 내인성 TCRα 유전자 및 내인성 CD52 유전자 중 하나 이상의, 하나 이상의 게놈 변형을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 조작된 면역 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 TALEN, 징크 핑거, shRNA, Cas-CLOVER, 및 CRISPR/Cas 시스템과 같은 임의의 유전자 편집 기술을 사용하고/하거나, 임의의 공지된 유전자 녹다운 방법, 예를 들어 다양한 RNA 기반 기술(예를 들어, 안티센스 RNA, miRNA, siRNA; 예를 들어, Lam 등의 문헌[Mol. Ther.-Nucleic Acids 4:e252 (2015), doi:10.1038/mtna.2015.23]; Stridharan 및 Gogtay, Brit.의 문헌[J. Clin. Pharmacol. 82: 659-72 (2016)] 참조) 중 어느 하나를 사용하는 방법 중 어느 하나를 사용해 FasR의 기능적 발현을 감소시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체 및/또는 항원 결합 단백질(예를 들어 CAR 또는 TCR)을 암호화하는 핵산을 조작된 면역 세포 내로 도입하는 단계를 포함하거나 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 내인성 TCRα 유전자 및 내인성 CD52 유전자 중 하나 이상의 하나 이상의 게놈 변형을 조작된 면역 세포의 게놈 내에 도입하는 단계를 포함하거나 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 게놈 변형은 내인성 TCRα 유전자 및 내인성 CD52 유전자 중 하나 이상의 기능적 발현을 전체적으로 또는 부분적으로 파괴하고/하거나 방지한다.
또 다른 양태에서, 본원에 개시된 조작된 면역 세포 중 하나 이상을 포함하는 면역 세포의 집단이 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 면역 세포 집단은 본원에 개시된 조작된 세포의 104 이상, 105 이상, 106 이상, 또는 107 이상을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 면역 세포 집단은 본원에 개시된 조작된 면역 세포를 풍부하게 갖는다. 다양한 구현예에서, 면역 세포의 집단은 적어도 20%, 30%, 40% 또는 50%, 예를 들어, 20%, 30% 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 95% 초과의, 조작된 면역 세포, 즉 T 세포 (예: 알파/베타 T 세포 및/또는 감마/델타 T 세포), B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 비만 세포, 및/또는 골수-유래 세포이다. 다양한 구현예에서, 면역 세포의 집단은 적어도 20%, 30%, 40% 또는 50%, 예를 들어, 20%, 30% 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 95% 초과의 조작된 T 세포이다.
또 다른 양태에서, 조작된 세포, 예를 들어 본원에 개시된 조작된 면역 세포 또는 본원에 개시된 조작된 면역 세포를 포함하는 면역 세포 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 조작된 면역 세포는 항원 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 임의로 추가로 변형되는 예를 들어, 조작된 면역 세포의 FasR 발현 수준이 FasR 발현을 감소시키기 위해 게놈이 변형되지 않은 조작된 면역 세포와 비교하여 감소되도록 유전적으로 변형된다.
또 다른 양태에서, 환자에서 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 본원에 개시된 조작된 면역 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 전술한 방법의 일 구현예에서, 조작된 면역 세포는 환자 이외의 공여자로부터 유래된 동종이계 조작된 면역 세포이다.
또 다른 양태에서, 환자에서 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 본원에 개시된 면역 세포의 집단을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 전술한 방법의 일 구현예에서, 면역 세포의 집단은 환자 이외의 공여자로부터의 하나 이상의 동종이계 조작된 면역 세포로부터 유래된다.
또 다른 양태에서, 환자에서 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 본원에 개시된 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 전술한 방법의 일 구현예에서, 조성물은 환자 이외의 공여자로부터 유래된 하나 이상의 조작된 동종이계 면역 세포를 포함한다.
본원에 개시된 치료 방법의 구현예에서, 장애는 암, 자가면역 질환, 또는 감염일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여된 세포, 세포 또는 조성물의 집단은 1회 초과로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포, 세포 집단 또는 조성물은 대상체에게 한 번에 투여될 수 있거나, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 이상 간격을 둔 2회 이상으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 장애는 바이러스 질환, 박테리아 질환, 암, 염증성 질환, 면역 질환, 또는 노화 관련 질환일 수 있다.
일부 구현예에서, 암은 혈액암 또는 고형암일 수 있다. 일부 구현예에서, 혈액암은 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 호산구성 백혈병(CEL), 골수이형성증 증후군(MDS), 비호지킨 림프종(NHL), 또는 다발성 골수종(MM)일 수 있다. 일부 구현예에서, 고형암은, 담도암, 방광암, 뼈 및 연조직 암종, 뇌종양, 유방암, 자궁 경부암, 결장암, 결장직장 선암종, 대장암, 데스모이드 종양, 배아암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 위 선암종, 교모세포종　 다형,부인과 종양, 두경부 편평 세포 암종,간암, 폐암,악성 흑색종, 골육종, 난소암, 췌장암, 췌관 선암종, 원발성 성상세포 종양, 원발성 성상세포 종양, 원발성 갑상선암, 전립선암, 신장암, 신장 세포 암종, 횡문근 육종, 피부암, 연조직 육종, 고환 생식 세포 종양, 요로상피암, 자궁 육종, 또는 자궁암 중에서 선택될 수 있다.
또 다른 양태에서, 동종이계 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 요법에서 숙주 세포의 동종이계 세포 살해를 감소시키는 방법으로서(예: 활성화 유도된 세포 사멸(AICD)), 상기 방법은 본원에 개시된 조작된 면역 세포, 세포 집단 또는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 살해, 예를 들어 활성화 유도된 세포 사멸(AICD)은 10% 내지 90%만큼 감소된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 살해, 예를 들어, 활성화 유도된 세포 사멸(AICD)은 90% 이상 감소된다.
또 다른 양태에서, 환자에서 동종이계 세포의 지속성을 향상시키거나 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 상기 방법은 본원에 개시된 조작된 면역 세포, 세포 집단 또는 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 세포, 세포 집단 또는 조성물을 투여하는 단계는, 예를 들어, 세포가 CAR을 포함하고 FasL을 발현하지 않고 FasR을 감소된 수준으로 발현하지 않는 유사한 세포, 세포 집단 또는 조성물을 투여하는 단계와 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%만큼 또는 종점이 상기 열거된 백분율 중 임의의 두 백분율인 범위 내에 속하는 비율만큼 개선 또는 증가된 지속성을 초래한다. 일부 구현예에서, 지속성의 차이는 모집단 또는 조성물에서 투여된 세포의 반감기를 비교함으로써 측정되며, 여기서, 예를 들어, 반감기는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 또는 200%만큼 또는 이에 의해 증가되거나, 이의 종점은 인용된 백분율 중 임의의 2개에 속하는 백분율만큼 증가된다.
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포, (예: 본원에 개시된 T 세포), 조작된 면역 세포의 집단(예: 본원에 개시된 T 세포), 또는 본원에 개시된 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계는, 상응하는 면역 세포, 면역 세포의 집단 또는 그렇게 조작되지 않은 면역 세포를 포함하는 조성물의 지속성에 비해 증가된 지속성을 초래한다. 일부 구현예에서, 지속성은, 예를 들어, 1 내지 7일, 1 내지 12주(예를 들어, 1 내지 4주, 4 내지 8주, 또는 8 내지 12주), 또는 1 내지 12개월, 또는 이들 범위 내에 속하는 특정 기간만큼 증가한다. 일부 구현예에서, 지속성의 차이는 집단 또는 조성물에서 투여된 세포의 반감기를 비교함으로써 측정되며, 예를 들어, 반감기는 예를 들어, 1 내지 7일, 1 내지 12주(예를 들어, 1 내지 4주, 4 내지 8주, 또는 8 내지 12주), 또는 1 내지 12개월, 또는 이들 범위에 속하는 특정 시간 길이만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 지속성에서의 차이는 투여된 세포가 투여 후 검출될 수 있는 시간의 길이를 비교함으로써 측정된다. 일부 구현예에서, 지속성의 개선은, 예를 들어, 혼합 후 약 72시간, 5일 또는 7일차에 T 세포 또는 NK 세포와 같은 면역 세포의 존재 하에 조작된 세포 및 조작되지 않은 세포의 생존을 비교함으로써 시험관 내에서 측정된다. 일부 구현예에서, 이러한 시험관 내 검정에서, 측정 시점에 조작된 세포의 생존율은 조작되지 않은 세포가 생존율의 약 1.5배 내지 많게는 10배이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 것과 같은 투여된 세포의 숙주 거부반응 감소 및/또는 지속성의 증가는 당업자에게 공지된 다양한 기술 중 어느 하나에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 다음 중 임의의 하나 또는 조합이 사용된다: 유세포 계측법, 예를 들어, 정량적 PCR, 및 환자 종양 물질과의 생체 외 공동 인큐베이션 또는 CAR-T 세포에 의해 표적화된 항원을 발현하는 모델 종양 세포주와의 생체 외 공진. 일부 구현예에서, 녹아웃이 생존의 이점을 제공하는 정도를 결정하기 위해, qPCR을 사용해 관심 녹아웃을 갖는 CAR T 세포 및 갖지 않는 CAR T 세포의 수를 평가한다.
도 1a~1c. 자극된 T 세포는 FasR을 발현하고 반복 자극은 활성화 유도된 세포 사멸을 초래한다. 도 1a. 100 U/mL IL-2의 존재 하에 TransAct로 일차 T 세포를 자극하지 않거나 반복적으로 자극하였다(일정에 적색 점 있음). 이벤트는 유세포 계측법에 의해 평가된 바와 같이 전방 산란, 측면 산란, 및 7-AAD 흡수에 따라 생존, 사멸, 또는 파편으로 지정하였다. 도 1b. 반복 자극의 시간 경과에 따른 표면 CD69 및 FasR 발현의 정량화. 도 1c. 반복된 자극의 시간 경과에 따른 생존 세포, 사멸 세포 및 파편들의 정량화. 도 1b 및 1c는 3개의 기술적 복제물의 평균 + SD이다.
도 2. 사이토카인 활성화 NK 세포는 FasR을 발현한다. 3명의 공여자로부터 수집한 LRS 챔버로부터 NK 세포를 정제하고, 1000 U/mL IL-2로 48시간 동안 활성화한 다음, 유세포 계측법에 의해 FasR의 표면 발현을 평가하였다. 결과를 TransAct로 자극한 FasR+ T 세포와 비교한 다음, 100 U/mL IL-2의 존재 하에 2주 동안 증식시켰다.
도 3a~3b. 일차 T 세포에서 FasR 유전자의 CRISPR-매개 녹아웃. 도 3a. Cas9-복합 FasR sgRNA의 전기천공 유무에 따라 활성화된 일차 T 세포에서 FasR 발현을 보여주는 유세포 계측법 유사색 점 플롯. 도 3b. 활성화된 일차 T 세포에서 FasR KO 효율의 정량화. 3개의 기술적 복제물에 대한 평균 + SD가 도시되어 있다.
도 4 FasR 녹아웃은 FasR 매개 세포자멸사로부터 Jurkat T 세포를 보호한다. 2 μg/mL FasR 세포 엑토도메인-Fc 경쟁 차단제의 존재 하에 배지, 50 ng/mL 세포자멸-유도 항-FasR 항체(클론 CH11), 또는 50 ng/mL 항체로 72시간 동안 배양한 Jurkat 세포 또는 정제되지 않은 FasR KO Jurkat T 세포를 보여주는 유세포 계측법 유사색 점 플롯.
도 5a~5b. 형질도입된 일차 T 세포에서 BFP 및 표면 FasL 발현. 도 5a. 생성된 야생형 FasL 벡터 삽입체의 개략도. 생성된 돌연변이체 유도체는 개략도 위에 지정되어 있다. 도 5b. BFP 및 FasL의 유도체를 전달하는 MND-유도 렌티벡터를 이용한 (FasR 녹아웃에 대한 정제 없이) Cas9-복합 FasR sgRNA 및 형질도입과의 동시 전기천공 1주일 후 일차 T 세포를 보여주는 유세포 계측법 유사색 점 플롯. 공여자는 HLA-A2+. wt, 야생형이다. NTD, 형질도입되지 않음.
도 6a~6b. FasL-발현 T 세포는 FasR을 발현하는 자가 및 동종이계 세포를 사멸시킨다. 도 6a에서 Cas9 복합 FasR sgRNA를 이용한 동시 전기천공과 BFP 및 Fas의 유도체를 전달하는 MND 프로모터 기반 렌티벡터를 이용한 전이(FasR 녹아웃에 대한 정제 없이) 후 1주일 후 자가 FasR+ 일차 T 세포의 동족살해를 보여주는 유세포 계측법 유사색 점 플롯; 및 도 6b에서, 6a의 FasL-변형 HLA-A2+ 세포에 의한 FasR+ 동종이계 HLA-A2- 일차 T 세포의 선택적 살해. NTD, 형질도입되지 않음.
도 7a~7b. 일차 T 세포에서 FasR 및 β2m 유전자의 CRISPR-매개 이중 녹아웃. Cas9-복합 FasR 및 β2m sgRNA의 전기천공이 있는(도 7b) 또는 없는(도 7a) 상태에 따라 활성화된 일차 T 세포에서 FasR 및 β2m발현을 보여주는 유세포 계측법 유사색 점 플롯.
도 8a~8b. FasL 발현이 동종이계 NK 세포로부터 이들 HLA-A2-모델 세포 산물을 보호하는지 여부를 결정하기 위해, NK 세포를 3개의 HLA-A2+ 공여자로부터의 신선한 LRS 챔버로부터 제조하고, 48시간 동안 1000 U/mL IL-2로 활성화시킨 다음, HLA-A2 상태를 사용해 72시간 동안 FasL-발현, β2m KO 세포와 함께 인큐베이션하고, 유세포 계측으로 동종이계 세포 기원을 식별하기 위해 HLA-A2상태를 사용한다. 도 8a. 활성화된 NK 세포는 비활성 FasL로 형질도입되지 않았거나 형질도입된 β2m 녹아웃 세포를 완전히 살해했다. 대조적으로, β2m 녹아웃 세포는 FasL의 활성 유도체를 발현할 때 NK 세포 매개 살해로부터 보호되었다. 도 8b. 가정한 바와 같이, 이러한 보호 메커니즘은 FasL 매개 반격이었으며, 이는 활성 FasL로 무장한 T 세포를 포함하는 인큐베이션에서 생존 NK 세포 수가 극적으로 감소했기 때문이다. 이러한 살해는 FasR+ NK 세포에 특이적이었는데, 이는 이들이 이들 샘플로부터 소멸되었고 모든 나머지 NK 세포가 FasR-이기 때문이다(데이터 미도시).
도 9a~9b. FasR KO가 그 자체로 항원-특이적 T 세포-매개 살해로부터 HLA-A2-모델 세포 산물을 보호하는지 여부를 결정하기 위해, HLA-A2+ T 세포를 TransAct로 72시간 동안 활성화시킨 다음, TRAC ± FasR 유전자 녹아웃 및 mCherry-2A-전장 MART1/Melan-A 항원으로 형질도입하였다. 이들은 FasR KO가 있거나 없는 HLA-A2+ 모의 "이식편" 세포이다. 동시에, HLA-A2-T 세포를 TransAct로 72시간 동안 활성화시킨 다음, TRAC 녹아웃하고 HLA-A2-제한, MART1 항원-특이적 F5 TCR로 형질도입하였다. 이들은 HLA-A2 모의 "숙주" 세포이다. 형질도입 후 48시간차에, 모의 이식편/생성물 및 숙주/효과기 세포를 48시간 동안 공동-인큐베이션하고, 나머지 이식편/생성물 세포를 HLA-A2 상태를 사용하여 정량화하여 유세포 계측에 의해 동종이계 세포 기원 및 mCherry/항원 상태를 식별하였다. 도 9a. 유전자 편집 및 형질도입된 유전자가 표시된 검정에 사용된 세포의 만화도가 표시되어 있다. 도 9b. 비특이적 효과기 세포(F5 TCR 결여)는 3:1의 비율로 항원+ 이식편/생성물 세포를 고갈시키지 않았다. 대조적으로, 특이적 효과기 세포(F5 TCR을 발현함)는 투여량 의존적 방식으로 항원+ 이식편/생성물 세포를 고갈시켰다. FasR KO 세포가 존재하는 세포 집단은 FasR에 대해 보충한 세포 집단보다 상당히 더 적은 정도로 고갈되었는데(p<0.01, 다중 t 테스트 분석), 이는 FasR KO가 항원-특이적 T 세포-매개 살해로부터 보호를 제공한다는 것을 나타낸다.
본 개시는, 무엇보다도, 동종이계 세포를 환자에게 투여하는 요법을 개선하기 위한 조성물, 방법 및 관련 물질, 예를 들어, 발현 벡터 및 조성물을 제공한다. 본 개시의 일 양태는 면역 세포, 예를 들어 2개의 측면에서 변형된 T 세포이다: 먼저, FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체(예를 들어, FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로부터 유래함)를 발현하도록 변형되고, 두 번째는 감소된 수준으로 FasR을 발현하도록 변형된다(예를 들어, 공지된 상동 재조합 기술 및 메가뉴클레아제, 탈렌, 징크 핑거, shRNA, Cas-CLOVER, CRISPR/Cas 시스템 중 하나 이상을 사용하는 기술을 포함하되 이에 국한되지 않는 공지된 유전자 편집 기술을 사용하여 세포를 유전적으로 변형하여 FasR 유전자좌를 부분적으로 또는 전체적으로 삭제한다). 일부 구현예에서, 면역 세포, 예를 들어, T 세포는 (예를 들어, 항원 결합 단백질(예:CAR)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로부터) 항원 결합 단백질, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 제3의 관점에서 변형된다. 따라서, 예를 들어, 본 개시는 CAR 발현, FasL 단백질 또는 FasL 유도체 단백질 발현 및 감소된 FasR 발현의 세 가지 변형을 포함하는 면역 세포(예: T 세포)를 투여하는 단계를 포함하는 개선된 CAR T 세포 요법을 제공한다. 따라서, 이는 AICD가 감소되고/되거나 지속되는, 예를 들어, 3개의 변형을 포함하는 투여된 세포의 치료적 지속성이 FasR 발현에 대해 변형되지 않는다는 것을 제외하고는 동일한 투여된 세포에 비해 증가되는, 개선된 동종이계 CAR T 세포 요법의 방법을 추가로 제공한다.
일반 기술
본 개시의 실시는, 달리 명시되지 않는 한, 당 기술분야의 기술 범위 내에 있는, 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래의 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌[예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판 (Sambrook 외, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather 및 P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, 및 D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller 및 M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel 등, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 등, eds., 1994); Current Protocols in Immunology(J.E. Coligan 등, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley 및 Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway 및 P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL 프레스, 1988-1989), Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd 및 C. Dean, eds., 옥스퍼드 대학교 Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow 및 D. Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti 및 J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995). 예를 들어, 메가뉴클레아제, TALEN, 징크 핑거, shRNA, Cas-CLOVER, 및 CRISPR/Cas 시스템을 사용하는 유전자 편집 기술은 당업자의 기술 범위 내에 있으며, 문헌 [예컨대 T. Gaj 등의 게놈 편집 기술: Principles and Applications, Cold Spring Harb Perspect Biol 2016;8:a023754 및 그 인용문].
정의
본원에서 사용되는 바와 같이, "자가"는 대상체를 치료하는 데 사용되는 세포, 세포주, 또는 세포 집단이 전술한 대상체로부터 기원한다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "동종이계"는 대상체를 치료하는 데 사용되는 세포 또는 세포 집단이 전술한 대상체로부터 기원하는 것이 아니라 공여자로부터 기원한다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 유래하거나 그 내부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 외부로부터 도입되거나 그 외부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "면역 세포"는 선천적 및/또는 적응적 면역 반응의 개시 및/또는 실행에 기능적으로 관여하는 조혈 유래 세포를 지칭한다. 면역 세포의 예는 T 세포, 예를 들어 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 비만 세포, 및 골수 유래 식세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현"은 프로모터에 의해 유도되는 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 네이키드 또는 리포좀에 함유된 것) 및 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하는 당업계에 공지된 모든 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "작동가능하게 연결된"은, 하나의 기능이 다른 하나의 핵산 단편에 의해 영향을 받도록 하는, 하나의 핵산 단편 상의 핵산 서열의 연관성을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우(즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 조절 하에 있는 경우) 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "발현 조절 서열"은 핵산의 전사를 유도하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 프로모터, 예컨대 구성 프로모터 또는 유도성 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 조절 서열은 전사될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다.
"프로모터" 및 "프로모터 서열"은 상호교환적으로 사용되며 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 대체적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3'에 위치한다. 당업자는, 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발달 단계에서, 또는 상이한 환경 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음을 이해할 것이다.
본 개시의 벡터 중 어느 하나에서, 벡터는 본원에 개시된 프로모터를 임의로 포함한다.
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입체의 혼입을 위한 벡터(들)의 수용자일 수 있거나 수용자였던 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하며, 자손은 자연적, 우발적, 또는 의도적인 돌연변이로 인해 (형태학적 또는 게놈 DNA 보체에서) 반드시 원래 부모 세포와 완전히 동일할 필요는 없다. 숙주 세포는 본 개시의 폴리뉴클레오티드(들)로 생체 내 형질감염된 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "세포외 리간드 결합 도메인"은 리간드에 결합할 수 있는 올리고- 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 바람직하게는, 도메인은 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 세포외 리간드 결합 도메인은 특정 질환 상태와 연관된 표적 세포 상에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 식별하도록 선택될 수 있다. 용어 "줄기 도메인"은 막관통 도메인을 세포외 리간드 결합 도메인에 연결시키는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 특히, 줄기 도메인은 세포외 리간드 결합 도메인에 대한 더 높은 유연성 및 접근성을 제공하기 위해 사용된다.
용어 "세포내 신호 전달 도메인"은 효과기 신호 기능 신호를 전달하고 세포가 특수 기능을 수행하도록 유도하는 단백질의 부분을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "공자극 분자"는 공자극 리간드와 특이적으로 결합하여, 세포에 의한 공자극 반응, 예컨대, 이에 한정되지는 않으나 증식을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 톨 리간드 수용체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 공동자극 분자의 예는 CD27, CD28, CD8, 4-1 BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다.
"공자극 리간드"는 T 세포 상의 동족 공자극 신호 분자에 특이적으로 결합하여, 예를 들어, TCR/CD3 복합체와 펩티드가 로딩된 MHC 분자의 결합에 의해 제공되는 일차 신호에 더하여, 증식 활성화, 분화 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 제시 세포 상의 분자를 지칭한다. 공동 자극 리간드는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1 BBL, OX40L, 유도성 공자극 리간드(ICOS-L), 세포간 접착 분자(ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1 CB, HVEM, 림프독소 β수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, 톨 리간드 수용체에 결합하는 작용제 또는 항체 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특히, T 세포에 존재하는 보조 자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체는 CD27, CD28, 4-1 BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드와 같은 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 하나의 항원 식별 부위를 통해, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 이러한 용어는 온전한 다클론 또는 단클론 항체뿐만 아니라 그의 항원-결합 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv), 및 예를 들어 제한 없이 단일 사슬(scFv) 및 도메인 항체(예를 들어, 상어 및 낙타 항체를 포함함), 및 항체를 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다. 항체는 IgG, IgA, 또는 IgM(또는 이의 하위 부류)과 같은 임의의 클래스의 항체를 포함하며, 항체는 임의의 특정 클래스일 필요는 없다. 중쇄 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스에 배정될 수 있다. 면역글로불린에는 5가지 주요 클래스가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 및 이들 중 몇몇은 서브클래스(동형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 대응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 불린다. 면역글로불린의 상이한 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 구성은 잘 알려져 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 항체의 "항원 결합 단편" 또는 "항원 결합 부분"은 주어진 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 온전한 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 온전한 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 항체의 "항원 결합 단편"이라는 용어 내에 포함된 결합 단편의 예는 Fab; Fab'; F(ab')2; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; 단일 도메인 항체(dAb) 단편(Ward 등의 문헌[Nature 341:544-546, 1989]), 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
항체, 항체 접합체, 또는 표적에 "특이적으로 결합하는" 폴리펩티드는 당업계에서 잘 이해되는 용어이며, 이러한 특이적 결합을 결정하는 방법 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 분자는, 대체 세포 또는 물질보다 특정 세포 또는 물질과 더 큰 친화도로 더 자주, 더 빠르게, 더 긴 기간 및/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 결합하는 경우 "특이적 결합"을 나타내는 것으로 지칭된다. 항체가 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력, 더 용이한, 및/또는 더 긴 지속시간으로 결합하는 경우, 항체는 표적에 "특이적으로 결합한다". 또한, 본 정의를 읽음으로써, 예를 들어, 제1 표적에 특이적으로 결합하는 항체(또는 모이어티 또는 에피토프)는 제2 표적에 특이적으로 결합할 수 있거나 그렇지 않을 수 있음을 이해할 것이다. 이와 같이, "특이적 결합"은 (포함할 수 있지만) 배타적 결합을 반드시 필요로 하는 것은 아니다.
항체의 "가변 영역"은 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 단독으로 또는 조합하여 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변 영역이라고도 공지된 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 골격 영역(FR)으로 구성된다. 각 사슬의 CDR은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 2개의 기술이 있다: (1) 종간 서열 가변성에 기초한 접근법(즉, Kabat 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); 및 (2) 항원-항체 복합체에 대한 결정학적 연구에 기초한 접근법(Al-lazikani 등의 문헌[1997, J. Molec. Biol. 273:927-948]). 본원에서 사용되는 바와 같이, CDR은 접근법 중 하나 또는 두 접근법의 조합에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다.
가변 도메인의 "CDR"은 가변 영역 내의 아미노산 잔기로서, Kabat, Chothia의 정의, Kabat 및 Chothia 모두의 축적, AbM, 접촉, 및/또는 형태적 정의, 또는 당업계에 잘 공지된 임의의 CDR 결정 방법에 따라 식별된다. 항체 CDR은 Kabat 등에 의해 본래 정의된 초가변 영역으로서 식별될 수 있다. 예를 들어, Kabat 등의 문헌[1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C]을 참조한다. CDR의 위치는 또한 Chothia 등에 의해 본래 기술된 구조적 루프 구조로서 식별될 수 있다. 예를 들어, Chothia 등의 문헌[Nature 342:877-883, 1989]을 참조한다. CDR 식별에 대한 다른 접근법은, Kabat과 Chothia 간의 절충이며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어(현재 Accelrys®)를 사용하여 유도되는 "AbM 정의", 또는 MacCallum 등의 문헌[J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996]에 기술된 관찰된 항원 접촉에 기반한 CDR의 "접촉 정의"를 포함한다. CDR의 "형태적 정의"로서 본원에서 지칭되는 또 다른 접근법에서, CDR의 위치는 항원 결합에 엔탈피적으로 기여하는 잔기로서 식별될 수 있다. 예를 들어, Makabe 등의 문헌[Journal of Biological Chemistry, 283:1 156-1 166, 2008]을 참조한다. 또 다른 CDR 경계 정의는 전술한 접근법 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 이들은 특정 잔기 또는 잔기의 기 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견을 고려하여 단축되거나 길어질 수 있지만, 카바트 CDR의 적어도 일부와 중첩될 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, CDR은 접근법의 조합을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 접근법에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 본원에서 사용되는 방법은 임의의 이러한 접근법에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있다. 하나를 초과하는 CDR을 함유하는 임의의 주어진 구현예에 대해, CDR은 Kabat, Chothia, 연장된, AbM, 접촉, 및/또는 형태적 정의 중 어느 하나에 따라 정의될 수 있다.
본원에 개시된 항원은 당업계에 잘 공지된 기술, 예를 들어, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 이러한 기술 또는 당업계에 쉽게 공지된 다른 기술의 조합(예를 들어, Jayasena, S.D.등의 문헌[ClinChem., 45: 1628-50, 1999 및 Fellouse, F.A. 등의 J. MoI. Biol., 373(4):924-40, 2007]을 참조)을 사용하여 생산될 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같이, 본원에서 상호 교환적으로 사용되는 바와 같은, "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 사슬을 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 사슬에 통합될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 사슬의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어, "캡", 자연 발생 뉴클레오티드 중 하나 이상의 유사체로의 치환, 예를 들어, 전하가 없는 연결(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트, 등) 및 하전된 연결(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 등)과 같은 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신, 등)등과 같은 펜던트 모이어티를 함유하는 것들, 삽입제(예: 아크리딘, 소랄렌, 등)를 가지는 것들, 킬레이트제(예: 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속, 등)을 함유하는 것들, 알킬화제를 함유하는 것들, 변형된 연결(예를 들어, 알파 아노머 핵산, 등)을 가지는 것들뿐 아니라 폴리뉴클레오티드(들)의 변형되지 않은 형태도 포함된다. 또한, 당에 통상적으로 존재하는 임의의 하이드록실기는, 예를 들어, 포스폰산염기, 인산염기로 치환되거나, 표준 보호기에 의해 보호되거나, 추가 뉴클레오티드에 대한 추가의 결합을 준비하기 위해 활성화되거나, 고형 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나, 1 내지 20개의 탄소 원자의 아민 또는 유기 캡핑기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실도 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보오스, 카르보환 당 유사체, 알파- 또는 베타-아노머 당, 에피메화 당류, 에컨대, 아라비노오스, 자일로오스 또는 릭소오스, 피라노오스 당류, 퓨라노오스 당류, 세도헵툴로오스, 비순환 유사체 및 메틸 리보시드와 같은 무염기 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 당업계에 일반적으로 공지된 리보오스 또는 데옥시리보오스 당류의 유사체 형태를 함유할 수 있다. 하나 이상의 인산디에스테르 결합은 대안적인 연결 기로 대체될 수 있다. 이러한 대안적인 연결기는, 이에 제한되지는 않으나, 인산염이 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이트"), (O)NR2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("포마세탈")로 치환되는 구현예를 포함하고, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 치환되거나 미치환된 알킬(1-20C)(임의로, 에테르 (-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 또는 아랄딜을 함유함)이다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 전술한 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여, 본원에서 지칭된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "형질감염"은 세포에 의한 외인성 또는 이종 RNA 또는 DNA의 흡수를 지칭한다. 세포는 이러한 RNA 또는 DNA가 세포 내부에 도입되었을 때, 외인성 또는 이종 RNA 또는 DNA에 의해 "형질감염"된다. 형질감염된 RNA 또는 DNA가 표현형 변화에 영향을 미칠 때, 세포는 외인성 또는 이종 RNA 또는 DNA에 의해 "형질전환"된다. 형질전환 RNA 또는 DNA는 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA에 통합(공유 결합)될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "형질전환"은 핵산 단편이 숙주 유기체의 게놈 내로 전달되어 유전적으로 안정적인 유전을 초래하는 것을 지칭한다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "유전자이식" 또는 "재조합" 또는 "형질전환된" 유기체로서 지칭된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 순수한" 물질은 적어도 50% 순수(즉, 오염물이 없음), 보다 바람직하게는 적어도 90% 순수, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순수, 보다 더 바람직하게는 적어도 98% 순수, 및 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다. 항체와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "경쟁"은 제1 항체 또는 이의 항원 결합 단편(또는 부분)이 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합함으로써, 제2 항체의 부재 시 제1 항체의 결합에 비해 동족 에피토프에 대한 제1 항체의 결합의 결과가 제2 항체의 존재 시에 검출 가능하게 감소된다는 것을 의미한다. 제2 항체의 에피토프에 대한 결합이 제1 항체의 존재 시에 또한 검출 가능하게 감소될 수도 있는 대안이 있을 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다. 즉, 제1 항체는 제2 항체가 그의 각각의 에피토프에 대한 제1 항체의 결합을 억제하지 않고서 제2 항체가 그의 에피토프에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 그의 동족 에피토프 또는 리간드와 다른 항체의 결합을 검출 가능하게 억제하는 경우, 동일하거나, 더 크거나, 더 적은 정도이든 간에, 항체는 그들 각각의 에피토프(들)에 결합하기 위해 서로 "교차 경쟁"하는 것으로 언급된다. 경쟁 항체와 교차 경쟁 항체 모두는 본 개시에 포함된다. 이러한 경쟁 또는 교차 경쟁이 발생하는 메커니즘(예를 들어, 입체 장애, 구조 변화, 또는 공통 에피토프 또는 이의 일부에 대한 결합)에 상관없이, 당업자는 본원에 제공된 교시에 기초하여 이러한 경쟁 및/또는 교차 경쟁 항체가 본원에 개시된 방법에 포함되고 유용할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료"는 유익하거나 원하는 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 개시의 목적을 위해, 유익하거나 바람직한 임상 결과는, 이에 제한되지는 않으나, 다음 중 하나 이상을 포함한다: 신생물 또는 암세포의 증식을 감소(또는 파괴), 신생물 세포의 전이를 억제, 종양의 크기를 축소하거나 감소, 질환(예를 들어, 암)의 관해, 질환(예를 들어, 암)으로 인한 증상의 감소, 질환(예를 들어, 암)을 앓고 있는 이들의 삶의 질 증가, 질환(예를 들어, 암)을 치료하는 데 필요한 다른 약물의 투여량을 감소, 질환(예를 들어, 암)의 진행의 지연, 질환(예를 들어, 암)의 치유, 및/또는 질환(예를 들어, 암)을 갖는 대상의 생존 연장.
"개선하는"은 치료를 투여하지 않는 것과 비교 시 하나 이상의 증상의 완화 또는 개선을 의미한다. "개선하는"은 또한 증상의 지속시간을 단축시키거나 감소시키는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 약학적 조성물의 "유효 투여량" 또는 "유효량"은 임의의 하나 이상의 유익하거나 원하는 결과를 달성하기에 충분한 양이다. 예방적 사용을 위해, 유익하거나 바람직한 결과는, 질환의 발생 동안 나타나는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동적 증상, 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함하는, 위험을 제거하거나 감소시키는 것, 중증도를 완화시키는 것, 또는 질환의 시작을 지연시키는 것을 포함한다. 치료적 사용을 위해, 유익하거나 원하는 결과는 다양한 질환 또는 병태(예를 들어, 암)의 하나 이상의 증상의 발생을 감소 또는 다양한 질환 또는 병태(예를 들어, 암)의 하나 이상의 증상의 개선, 질환을 치료하는 데 필요한 다른 약물의 투여량의 감소, 다른 약물의 효과의 향상 및/또는, 질환의 진행을 지연시키는 것과 같은 임상 결과를 포함한다. 유효 투여량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 개시의 목적을 위해, 약물, 화합물 또는 약학적 조성물의 유효 투여량은 직접적 또는 간접적으로 예방적 또는 치료적 처치를 달성하기에 충분한 양이다. 임상적 맥락에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 약학적 조성물의 유효 투여량은 다른 약물, 화합물 또는 약학적 조성물과 함께 달성될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 따라서, "유효 투여량"은 하나 이상의 치료제를 투여하는 맥락에서 고려될 수 있고, 하나 이상의 다른 제제와 함께 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성되는 경우, 단일 제제는 유효량으로 투여되는 것으로 간주될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "대상체"는 임의의 포유동물, 예를 들어, 인간 또는 원숭이이다. 포유류는, 농장 동물, 스포츠 동물, 반려동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 랫트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 일 구현예에서, 대상체는 인간이다. 예시적인 일 구현예에서, 대상체는 원숭이, 예를 들어, 시노몰구스 원숭이이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터"는 숙주 세포에서 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달하고, 바람직하게는, 발현할 수 있는 구조체를 의미한다. 벡터의 예는, 이에 제한되지는 않으나, 바이러스 벡터, 내이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 응결제와 관련된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 생산자 세포와 같은 특정 진핵 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체" 또는 "약학적으로 허용 가능한 부형제"는 활성 성분과 조합될 때, 성분이 생물학적 활성을 유지하도록 하고 대상체의 면역 체계와 비반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예는, 이에 제한되지는 않으나, 인산염 완충 식염수 용액, 물, 유화액, 예컨대 오일/물 유화액, 및 다양한 유형의 습윤제와 같은 임의의 표준 약학적 담체를 포함한다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 바람직한 희석제는 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 생리식염수(0.9%)이다. 이러한 담체를 포함하는 본원에 개시된 조성물은 공지된 종래의 방법(예를 들어, A. Gennaro(편집)의 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990]; 및 Remington의 문헌[The Science 및 Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005] 참조)에 의해 제형화될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "동종반응성"은 흉선 발달 동안 접하지 않은 MHC 복합체를 식별하는 T 세포의 능력을 지칭한다. 동종반응성은 숙주 대 이식편 거부반응 및 이식편 대 숙주 질환으로 임상적으로 나타난다.
본원의 값 또는 파라미터에 대한 "약"은 그 값 또는 파라미터 그 자체에 대해 유도되는 구현예를 포함한다 (그리고 기술한다). 예를 들어, "약 X"를 지칭하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다. 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다.
본원에서 "포함하는"이라는 언어로 구현예가 기술되는 경우마다, "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"이라는 용어로 기술된 유사한 구현예가 또한 제공된다는 것으로 이해된다.
본 개시의 양태 또는 구현예가 마쿠쉬 그룹 또는 다른 그룹의 대안적인 것들의 관점에서 설명되는 경우, 공개된 대상은 전체로서 열거된 전체 그룹뿐만 아니라, 그룹의 각각의 구성원을 개별적으로 그리고 주요 그룹의 모든 가능한 하위 그룹뿐만 아니라, 하나 이상의 그룹 구성원이 없는 주요 그룹을 포함한다. 본 개시는 또한 공개된 대상에서의 그룹 구성원 중 어느 하나 이상의 명시적 배제를 고려한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 충돌하는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 조절할 것이다. 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다" 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 정수의 군을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 정수의 군을 배제하는 것을 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수형을 포함하고 복수 용어는 단수형을 포함한다.
예시적인 방법 및 물질이 본원에 기술되지만, 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 공개된 대상의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있다. 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 의도가 아니다.
"항원 결합 단백질"은 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 본원에서 사용된 "항원 결합 도메인"은 특정 표적 항원에 결합하는 임의의 폴리펩티드를 의미한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 종양 세포 상의 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 증식성 질환에 관여하는 세포 상의 항원 또는 바이러스 항원 또는 박테리아 항원에 결합한다.
항원 결합 도메인은 면역학적으로 기능적 단편인 항체 결합 영역을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 용어 항원 결합 도메인의 "면역학적 기능적 단편"(또는 "단편")은 전장 사슬에 존재하는 아미노산의 적어도 일부가 결여되어 있지만 표적 항원에 여전히 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 부분을 (그 부분이 어떻게 수득되거나 합성되는지에 관계없이) 포함하는 항원 결합 도메인의 종이다. 이러한 단편은 표적 항원에 결합한다는 점에서 생물학적으로 활성이고, 주어진 에피토프에 결합하기 위해 온전한 항체를 포함하는 다른 항원 결합 도메인과 경쟁할 수 있다.
면역학적 기능성 면역글로불린 단편은, scFv 단편, Fab 단편(Fab', F(ab')2, 등), 하나 이상의 상보성 결정 영역("CDR"), 디아바디(동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은, 짧은 펩티드 링커를 통해 연결된, 경쇄 가변 도메인과 동일한 폴리펩티드 상의 중쇄 가변 도메인), 도메인 항체, 2가 항원 결합 도메인(2개의 항원 결합 부위를 포함함), 다중특이적 항원 결합 도메인, 및 단쇄 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이들 단편은 인간, 마우스, 랫트, 낙타류 또는 토끼를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 포유류 공급원으로부터 유래될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 항원 결합 도메인은 비-단백질 성분을 포함할 수 있다.
가변 영역은 일반적으로 3개의 초가변 영역(CDR)에 의해 결합된 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 2개의 사슬로부터의 CDR은 일반적으로 특정 에피토프에 결합할 수 있는 프레임워크 영역에 의해 정렬된다. N-말단에서 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 가변 영역 둘 모두는 통상적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 관례상, 중쇄 내의 CDR 영역은 통상적으로 HC CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭된다. 경쇄 내의 CDR 영역은 통상적으로 LC CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체의 전장 경쇄 또는 중쇄에 존재하는 하나 이상의 상보성 결합 영역(CDR)을 포함하고, 일부 구현예에서는 단일 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 부분을 포함한다. 이들 단편은 재조합 DNA 기술로 생산될 수 있거나, 온전한 항체를 포함하는 항원 결합 도메인의 효소 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 이의 상보성 결정 영역(CDR) 중 하나 이상을 포함하는 항체 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 경쇄 CDR CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 중쇄 CDR CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단쇄 가변 단편(scFv)이다.
각각의 프레임워크에 대한 아미노산의 할당, CDR, 및 가변 도메인은 통상적으로 Kabat 넘버링(예를 들어, Kabat 등, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. 1991 참조), Chothia 넘버링(예를 들어, Chothia & Lesk, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani 등, (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia 등, (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano 등, (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; 및 미국 특허 제7,709,226호 참조), 접촉 넘버링, 또는 AbM 방식(항체 모델링 프로그램(Antibody Modeling program), Oxford Molecular)의 번호 부여 체계를 따른다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 재조합 항원 수용체이다. 본원에서 사용되는 용어 "재조합 항원 수용체"는 세포외 항원 결합 도메인 또는 세포외 리간드 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 비자연 발생 표면 수용체를 광범위하게 지칭한다. 일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 당업계에 공지되어 있다. CAR은 항원 식별 모이어티, 막관통 도메인 및 T 세포 활성화 도메인(예를 들어, Eshhar 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993)], 및 Sadelain 등의 문헌[Curr. Opin. Immunol, 21(2): 215-223 (2009)] 참조)을 포함하는 융합 단백질이다.
일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체의 세포내 도메인은 공동-자극 도메인 및 ITAM-함유 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체의 세포내 도메인은 세포내 단백질 또는 이의 기능적 변이체(예를 들어, 절단(들), 삽입(들), 결실(들) 또는 치환(들))를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "세포외 리간드 결합 도메인" 또는 "세포외 항원 결합 도메인"은 리간드 또는 항원에 결합할 수 있거나 리간드 또는 표면 항원과 같은 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 세포외 리간드 결합 또는 항원 결합 도메인은 특정 질환 상태와 연관된 표적 세포 상에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드, 예를 들어 종양 특이적 항원을 식별하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체, 또는 항체의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 Fv 또는 scFv, Fab 또는 scFab, F(ab')2 또는 scF(ab')2, Fd, 모노바디, 아피바디, 카멜화 항체, VHH 항체, 단일 도메인 항체, 또는 다핀을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드-결합 도메인은 표면 수용체에 결합하는 리간드, 또는 리간드에 결합하는 표면 수용체의 엑토도메인과 같은 결합 쌍의 파트너를 포함한다.
용어 "줄기 도메인" 또는 "힌지 도메인"은 막관통 도메인을 세포외 리간드 결합 도메인에 연결시키는 기능을 하는 임의의 폴리펩티드를 지칭하도록 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 특히, 줄기 도메인은 세포외 리간드 결합 도메인에 대한 더 높은 유연성 및 접근성을 제공하기 위해 사용된다.
용어 "세포내 신호 전달 도메인"은 효과기 신호 기능 신호를 전달하고 세포가 특수 기능을 수행하도록 유도하는 단백질의 부분을 지칭한다.
벡터
발현 벡터, 및 폴리뉴클레오티드 조성물의 투여는 본원에서 추가로 기술된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 제조하는 방법을 제공한다.
임의의 이러한 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 또한 본 개시에 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(암호화 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 일대일 방식으로 DNA 분자에 대응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가 코딩 서열 또는 비-코딩 서열은 본 개시의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있지만, 존재할 필요는 없고, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지 물질에 연결될 수 있지만, 연결될 필요는 없다.
폴리뉴클레오티드는 천연 서열(즉, 항체 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나, 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 함유하여, 천연 면역 반응성 분자에 비해 암호화된 폴리펩티드의 면역 반응성이 감소되지 않게 한다. 암호화된 폴리펩티드의 면역 반응성에 대한 효과는 일반적으로 본원에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다. 변이체는 바람직하게는 천연 항체 또는 이의 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 80%의 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 90%의 동일성, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95%의 동일성을 나타낸다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은, 2개의 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열이 이하에서 기술된 바와 같이 최대 상응성을 위해 정렬될 때 동일한 경우, "동일"한 것으로 언급된다. 2개의 서열 간의 비교는 일반적으로 서열 유사성의 국소 영역을 식별하고 비교하기 위해 비교 윈도우에 걸쳐 서열을 비교함으로써 수행된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "비교 윈도우"는 적어도 약 20개의 연속 위치, 일반적으로 30 내지 약 75, 또는 40 내지 약 50의 세그먼트를 지칭하며, 여기서 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후, 서열이 동일한 수의 연속 위치의 기준 서열과 비교될 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 기본 파라미터를 사용하여 생물정보학 소프트웨어(DNASTAR, Inc., Madison, WI)의 Lasergene Suite에서 Megalign 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 이 프로그램은 다음 참고 문헌에 설명된 여러 가지 정렬 체계를 구현한다: Dayhoff, M.O.의 문헌[1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358]; Hein J.의 문헌[1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA]; Higgins, D.G. 및 Sharp, P.M.의 문헌[1989, CABIOS 5:151 -153]; Myers, E.W. 및 Muller W.의 문헌[1988, CABIOS 4:1 1-17]; Robinson, E.D.의 문헌[1971, Comb. Theor. 1 1:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425]; Sneath, P.H.A. 및 Sokal, R.R.의 문헌[1973, Numeric Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA]; Wilbur, W.J. 및 Lipman, D.J.의 문헌[1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730].
바람직하게는, "서열 동일성의 백분율"은 적어도 20개의 위치의 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 부분은, 일반적으로, 2개의 서열의 최적 정렬에 대해 참조 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20% 이하, 대개 5 내지 15% 또는 10 내지 12%의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 일치하는 위치의 수를 산출하기 위해 두 서열 모두에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하고, 일치하는 위치의 수를 참조 서열에서의 총 위치 수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
변이체는, 또한, 또는 대안적으로, 천연 유전자, 또는 이의 일부 또는 상보체와 실질적으로 상동일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 다소 엄격한 조건 하에서 천연 항체(또는 상보적 서열)를 암호화하는 자연적으로 발생하는 DNA 서열에 혼성화될 수 있다.
적절한 "적당한 엄격한 조건"은 5 X SSC, 0.5% SDS, 1 .0 mM EDTA(pH 8.0)의 용액에서 예비 세척하는 단계; 50℃-65℃, 5 X SSC에서 밤새 혼성화하는 단계; 이어서 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC 각각을 사용해 65℃에서 20분 동안 2회 세척하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "매우 엄격한 조건" 또는 "높은(고) 가혹한 조건"은 다음과 같다: (1) 낮은 이온 강도와 고온, 예를 들어 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 구연산나트륨/0.1% 도데실황산나트륨을 사용하여 세척; (2) 혼성화 중에 변성제, 예를 들어, 포름아미드, 예를 들어, 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/pH 6.5에서 750 mM 염화나트륨을 갖는 50 mM 인산나트륨 완충액을 갖는 50% (v/v) 포름아미드, 42℃에서 75 mM 구연산 나트륨을 사용; 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5 x SSC(0.75 M NaCl, 0.075 M 구연산나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5 x Denhardt의 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA(50 μg/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 황산염을 사용, 42℃에서 0.2 x SSC(염화나트륨/시트르산나트륨)에서 그리고 55℃에서 50% 포름아미드에서 세척, 이어서 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1 x SSC로 이루어진 매우 엄격한 세척. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 수용하기 위해 필요에 따라 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인식할 것이다.
유전자 코드의 축퇴성의 결과로서, 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재함을 당업자는 이해할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열과 최소한의 상동성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용의 차이로 인해 변하는 폴리뉴클레오티드는 본 개시에 의해 구체적으로 고려된다. 또한, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자는 본 개시의 범위 내에 있다. 대립유전자는 주어진 염색체 유전자좌를 차지하는 유전자의 여러 형태 중 어느 하나이다. 본 개시는 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자를 포함한다. 생성된 mRNA 및 단백질은, 반드시 그럴 필요는 없지만, 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있다. 대립유전자는 표준 기술(예를 들어, 혼성화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 식별될 수 있다.
본 개시의 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성, 재조합 방법, 또는 PCR을 사용하여 수득될 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본원에서 상세히 기술될 필요는 없다. 당업자는 본원에 제공된 서열 및 상업적 DNA 합성기를 사용하여 원하는 DNA 서열을 생산할 수 있다.
재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하는 경우, 본원에서 추가로 논의되는 바와 같이, 원하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 적절한 벡터 내에 삽입될 수 있고, 이어서 벡터가 복제 및 증폭을 위한 적절한 숙주 세포 내에 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 세포는 직접 흡수, 세포내이입, 형질감염, F-결합 또는 전기천공에 의해 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 형질전환된다. 일단 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오티드는 비-통합 벡터(예컨대, 플라스미드)로서 세포 내에 유지되거나 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있다. 증폭된 폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, Sambrook 등의 문헌[1989]을 참조한다.
대안적으로, PCR은 DNA 서열의 재생산을 가능하게 한다. PCR 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,800,159호, 제4,754,065호 및 제4,683,202호뿐만 아니라 Mullis 등(eds.)의 문헌[PCR: 중합 효소 연쇄 반응, Mullis 등, eds., Birkauswer Press, Boston, 1994]에 기술되어 있다.
RNA는 적절한 벡터에서 단리된 DNA를 사용하여 적절한 숙주 세포에 삽입함으로써 수득될 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되는 경우, 예를 들어, Sambrook 등의 문헌[1989, 전술한 바와 같음]에 제시된 바와 같이, 당업자에게 잘 공지된 방법을 사용하여 RNA를 단리할 수 있다.
적절한 클로닝 벡터는 표준 기술에 따라 작제될 수 있거나, 당업계에서 이용 가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가-복제할 수 있고/있거나, 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 가질 수 있고/있거나, 벡터를 함유하는 클론을 선택하는데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 가질 수 있다. 적절한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어, pUC18, pUC19, Bluescript(예: pBS SK+) 및 이의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 pSA3 및 pAT28과 같은 셔틀 벡터를 포함한다. 이들 및 많은 다른 클로닝 벡터는 BioRad, Strategene 및 Invitrogen과 같은 상업적 벤더로부터 입수할 수 있다.
발현 벡터는 일반적으로 본 개시에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제 가능한 폴리뉴클레오티드 구조체이다. 발현 벡터는 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 일체형 부분으로서 숙주 세포에서 복제되어야 한다는 것이 내재되어 있다. 적절한 발현 벡터는 이에 한정되지 않지만, 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드를 포함하는 바이러스 벡터, 및 PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터(들)를 포함한다. 벡터 구성요소는 일반적으로, 이에 제한되지는 않으나, 신호 서열; 복제 기점; 하나 이상의 마커 유전자; (프로모터, 인핸서 및 터미네이터와 같은) 적절한 전사 조절 요소 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 발현(즉, 번역)을 위해, 일반적으로 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위, 및 정지 코돈과 같은 하나 이상의 번역 제어 요소가 또한 요구된다.
관심 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 사용하는 형질감염; 미세투과성 충돌; 리포펙션; 및 감염(예를 들어, 벡터가 우두 바이러스와 같은 감염원인 경우)을 포함하는 다수의 적절한 수단 중 어느 하나에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 따라 달라질 것이다.
FasL 단백질, FasL 유도체 단백질 또는 항원 결합 단백질(예: 본원에 개시된 CAR)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트 또는 발현 벡터(예를 들어, 박테리아 숙주 세포 내로 도입하기 위한 플라스미드, 또는 곤충 숙주 세포의 형질감염을 위한 바큘로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 포유류 숙주 세포의 형질감염을 위한 렌티바이러스와 같은 플라스미드 또는 바이러스 벡터)에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는, 예를 들어, 제한 없이 2A 펩티드를 암호화하는 서열과 같은 리보솜 스키핑 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 피코나비르류의 아프토바이러스 하위군에서 식별된 2A 펩티드는 코돈에 의해 암호화된 2개의 아미노산 사이에 펩티드 결합의 형성 없이 하나의 코돈에서 다음 코돈으로 리보솜 "스키핑"을 야기한다(Donnelly 및 Elliott의 문헌[2001]; Atkins, Wills 등의 문헌[2007]; Doronina, Wu 등의 문헌[2008] 참조). "코돈"은 리보솜에 의해 하나의 아미노산 잔기로 번역되는 mRNA 상의 (또는 DNA 분자의 센스 가닥 상의) 3개의 뉴클레오티드를 의미한다. 따라서, 2개의 폴리펩티드는, 틀 내에 있는 2A 올리고펩티드 서열에 의해 폴리펩티드가 분리될 때, mRNA 내의 단일의 연속된 열린 해독 틀로부터 합성될 수 있다. 이러한 리보솜 스키핑 메커니즘은 당업계에 잘 알려져 있고, 단일 메신저 RNA에 의해 암호화된 여러 단백질의 발현을 위해 여러 벡터에 의해 사용되는 것으로 알려져 있다.
막관통 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 유도하기 위해, 일부 구현예에서, 분비 신호 서열(리더 서열, 프리프로 서열 또는 프리 서열로도 알려짐)이 폴리뉴클레오티드 서열 또는 벡터 서열에 제공된다. 분비 신호 서열은 막관통 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되는데, 즉, 2개의 서열은 정확한 해독 틀에서 연결되고, 새롭게 합성된 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 유도하도록 위치한다. 특정 분비 신호 서열이 관심 핵산 서열의 다른 곳에 위치할 수 있지만, 분비 신호 서열은 관심 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 대해 일반적으로 5'에 위치한다(예를 들어, Welch 등의 미국 특허 제5,037,743호; Holland 등의 미국 특허 제5,143,830호 참조). 당업자는, 유전자 코드의 축퇴성의 관점에서, 이들 폴리뉴클레오티드 분자 사이에서 상당한 서열 변이가 가능하다는 것을 식별할 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 서열은 포유류 세포에서의 발현, 바람직하게는, 인간 세포에서의 발현에 대해 코돈 최적화된다. 코돈-최적화는, 일반적으로 이러한 종의 고도로 발현되는 유전자에서 빈번하게 발생하는 코돈에 대해 주어진 종의 고도로 발현되는 유전자에서 일반적으로 희귀한 코돈의 관심 서열로의 교환을 지칭하며, 이러한 코돈은 교환되는 코돈으로서 동일한 아미노산을 암호화하는 것이다.
면역요법에 사용하기 위한 면역 세포를 제조하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체 및 항원 결합 단백질, 예를 들어 CAR을 면역 세포 내로 도입하고, 세포를 증식시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 면역 세포를 조작하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 세포를 제공하는 단계 및 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 발현시키는 단계; 및 세포의 표면에서 적어도 하나의 항원 결합 단백질(예: CAR)을 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 항원 결합 단백질(예:CAR)을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드로 세포를 형질감염시키는 단계 및 세포에서 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 항원 결합 단백질(예:CAR)을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 및 NK 세포 길항제를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드로 세포를 형질감염시키는 단계; 및 세포에서 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체 및 항원 결합 단백질(예: CAR)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 세포에서의 안정적인 발현을 위해 하나 이상의 발현 벡터에 존재한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 세포에서의 안정적인 발현을 위해 바이러스 벡터 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 전기천공에 의해 세포 내로 직접 도입되는 mRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 사이토펄스 기술은 세포 내로 물질을 전달하기 위해 생존 세포를 일시적으로 투과가능하도록 하기 위해 사용될 수 있다. 파라미터는 최소 사망률을 갖는 높은 형질감염 효율을 위한 조건을 결정하기 위해 변형될 수 있다.
또한, 면역 세포, 예를 들어 T 세포를 형질감염시키는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 다음을 포함한다: T 세포를 RNA와 접촉시키고, T 세포에 (a) 센티미터당 약 2250 내지 3000 V의 전압 범위를 갖는 전기 펄스; (b) 0.1 ms의 펄스 폭; (c) 단계 (a)와 (b)의 전기 펄스 사이에서 약 0.2 내지 10 ms의 펄스 간격; (d) 단계 (b)의 전기 펄스와 단계 (c)의 제1 전기 펄스 사이에 약 100 ms의 펄스 폭 및 약 100 ms의 펄스 간격을 갖는 센티미터 당 약 2250 내지 3000 V의 전압 범위를 갖는 전기 펄스; 및 (e) 각각의 3개의 전기 펄스 사이에 2 ms의 펄스 간격 및 약 10 ms의 펄스 폭을 갖는 약 1600 V의 전압을 갖는 3개의 전기 펄스로 이루어진 애자일 펄스 연쇄를 인가하는 단계. 일부 구현예에서, T 세포를 형질감염시키는 방법은, T 세포를 RNA와 접촉시키는 단계 및 T 세포에 다음을 포함하는 애자일 펄스 연쇄를 인가하는 단계를 포함한다: (a) 센티미터 당 약 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 또는 3000V의 전압을 갖는 전기 펄스; (b) 0.1 ms의 펄스 폭; (c) 및 단계 (a)와 (b)의 전기 펄스 사이에서 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 ms의 펄스 간격; (d) 단계 (b)의 전기 펄스와 단계 (c)의 제1 전기 펄스 사이에서 100 ms의 펄스 폭 및 100 ms의 펄스 간격을 갖는, 센티미터 당 약 2250 내지 3000V, 예를 들어, 센티미터 당 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 또는 3000 V의 범위의 전압을 갖는 하나의 전기 펄스; 및 (e) 3개의 전기 펄스 각각의 사이에 약 2 ms의 펄스 간격 및 약 10 ms의 펄스 폭을 갖는 약 1600 V의 전압을 갖는 4개의 전기 펄스. 전술한 값 범위에 포함된 임의의 값이 본 출원에 개시된다. 전기천공 매질은 당업계에 공지된 임의의 적절한 매질일 수 있다. 일부 구현예에서, 전기천공 매질은 약 0.01 내지 약 1.0 밀리지멘스에 걸쳐진 범위에서 전도성을 갖는다.
일부 구현예에서, 방법은, 예를 들어 제한 없이, FasR, TCR의 성분, 면역억제제에 대한 표적, HLA 유전자, 및/또는 PDCD1 또는 CTLA-4와 같은 면역 관문 단백질을 발현시키는 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 불활성화시거나 감소시키는 단계에 의해 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 유전자를 불활성화시키는 단계에 의해, 관심 유전자는 기능적 단백질 형태로 발현되지 않도록 유도된다. 일부 구현예에서, 불활성화될 유전자는, 예를 들어 제한 없이, TCRα, TCRβ, β2-마이크로글로불린("β2m"), CD52, GR, 데옥시시티딘 키나아제(DCK), PD-1, 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 방법은 선택적 DNA 절단에 의해 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀 절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제를 세포 내에 도입하는 단계에 의해 하나 이상의 유전자를 불활성화시키거나 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 희귀 절단 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALE-뉴클레아제 또는 TALEN), megaTAL 뉴클레아제 또는 Cas9 엔도뉴클레아제일 수 있다.
또 다른 양태에서, 면역 세포, 예를 들어 T 세포를 유전적으로 변형시키는 단계는, 면역억제제에 대한 표적을 발현하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시키는 단계에 의해 면역 세포(예: T 세포)를 변형시키는 단계; 및 임의로 면역억제제의 존재 시 세포를 증식시키는 단계를 포함할 수 있다. 면역억제제는 여러 작용기전 중 하나에 의해 면역 기능을 억제하는 제제이다. 면역억제제는 면역 반응의 정도 및/또는 열성을 감소시킬 수 있다. 면역억제제의 비제한적인 예는 칼시뉴린 억제제, 라파마이신의 표적, 인터루킨-2 α쇄 차단제, 이노신 일인산 탈수소효소의 억제제, 디히드로폴산 환원효소의 억제제, 코르티코스테로이드, 및 면역억제성 항대사물을 포함한다. 일부 세포독성 면역억제제는 DNA 합성을 억제함으로써 작용한다. 다른 억제제들은 T 세포의 활성화를 통해 또는 헬퍼 세포의 활성화를 억제함으로써 작용할 수 있다. 본 개시에 따른 방법은 T 세포에서 면역억제제의 표적을 불활성화시킴으로써 면역 요법을 위한 T 세포에 대한 면역 억제 저항성을 부여할 수 있게 한다. 비제한적인 예로서, 면역억제제에 대한 표적은, 예를 들어, 제한 없이, CD52, 글루코코르티코이드 수용체(GR), FKBP 패밀리 유전자 구성원, 및 시클로필린 패밀리 유전자 구성원과 같은 면역억제제에 대한 수용체일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다.
FasR 세포 표면 발현의 하향 조절과 함께 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 발현하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 또한, 면역 세포, 예를 들어, CAR-T 세포와 같은 T 세포의 기능적 활성을 개선하기 위한 이러한 조성물 및 방법의 용도가 제공된다. 본원에 제공된 방법 및 조성물은 면역 세포, 예를 들어 CAR-T 세포와 같은 T 세포의 생체 내 지속성 및 치료 효능을 개선하는 데 유용하다.
본원에 제공된 면역 세포, 예를 들어, T 세포는 (i) FasL 단백질 및 (ii) 항원 결합 단백질, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현한다. 유리하게는, 본원에 제공된 면역 세포는 바이러스 단백질을 발현하지 않는 세포 및/또는 AICD에 대한 증가된 내성에 비해 개선된 생체 내 지속성을 나타낸다.
다양한 구현예에서, FasL 단백질은, 예를 들어, "UniprotKB - P48023"으로 기술된 야생형 인간 FasL 단백질의 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함한다. 예시적인 FasL 단백질 및/또는 FasL 단백질 유도체는 UniprotKB - P48023 (서열번호 3), FasL 델타 2-74 (서열번호 7), FasL Q130D (서열번호 10), FasL C82A (서열번호 8) 및 FasL SLEKQ126-130->EEAAA(서열번호 9)("SLEKQ" 및 "EEAAA"는 각각 서열번호 32 및 33으로 개시됨)의 아미노 서열로 이루어지거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, FasL 단백질은 FasL 야생형-UniprotKB - P48023의 아미노산 서열과 적어도 70%, 예를 들어, 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 95%, 97%, 또는 99%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, FasL 단백질 유도체는 FasL Δcyto (일명 FasL 델타 2-74), FasL C82A, FasL SLEKQ -->EEAAA (각각 서열번호 32 및 33) (즉, FasL SLEKQ126-130->EEAAA (각각 서열번호 32 및 33)), 또는 FasL Q130D의 아미노산 서열과 적어도 70%, 예를 들어, 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 95%, 97%, 또는 99%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 핵산은 FasL 야생형-UniprotKB - P48023의 아미노산 서열과 적어도 70%, 예를 들어, 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 95%, 97%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FasL 단백질을 암호화한다. 특정 구현예에서, 본 개시의 핵산은 FasL Δcyto (일명 FasL 델타 2-74), FasL C82A, FasL SLEKQ -->EEAAA (각각 서열번호 32 및 33) (일명 FasL SLEKQ126-130->EEAAA (각각 서열번호 32 및 33)), 또는 FasL Q130D의 아미노산 서열과 각각 적어도 70%, 예를 들어 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 95%, 97%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FasL 단백질 유도체를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 T 세포와 같은 면역 세포는, 예를 들어, 그렇게 변형되지 않은 유사한 세포에 비해 감소된 수준으로 FasR을 발현하도록 유전적으로 변형된다. 예를 들어, 면역 세포는, 예를 들어, FasR의 코딩 서열을 포함하는 게놈 DNA 및/또는 FasR 전사 대조군 및/또는 프로모터 및/또는 활성화 요소를 포함하는 게놈 DNA를 결실시키거나 파괴함으로써, 기능적 FasR이 세포 표면에서 발현되지 않도록, FasR 유전자좌의 전부 또는 일부를 녹아웃시키도록 유전적으로 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포 상의 FasR의 세포 표면 발현 수준은 FasR 발현을 감소시키기 위해 변형되지 않은 유사한 세포 상의 세포 표면 발현 수준에 비해 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%만큼 감소될 수 있다. 표면 FasR 발현은 형광 표지된 항-FasR/CD95 항체 및 유세포 계측법을 결합하여 세포 집단에 걸쳐 세포당 평균 형광 강도를 결정함으로써 측정될 수 있다. KO 효율은 대략 50%였으며, KO 세포는 FasR 염색에 대해 1~2 로그의 더 낮은 형광 강도를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는, 표 1에 열거된 아미노산 서열 중 하나 이상으로 구성되거나 이를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다; 예를 들어, 발현한다.
예시적인 단백질 서열
폴리펩티드 아미노산 서열 서열번호
BFP MSELIKENMHMKLYMEGTVDNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKVVEGGPLPFAFDILATSFLYGSKTFINHTQGIPDFFKQSFPEGFTWERVTTYEDGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIRGVNFTSNGPVMQKKTLGWEAFTETLYPADGGLEGRNDMALKLVGGSHLIANIKTTYRSKKPAKNLKMPGVYYVDYRLERIKEANNETYVEQHEVAVARYCDLPSKLGHKLN 1
P2A GGSGGRAKRATNFSLLKQAGDVEENPGP 2
FasL 야생형- UniprotKB - P48023 MQQPFNYPYPQIYWVDSSASSPWAPPGTVLPCPTSVPRRPGQRRPPPPPPPPPLPPPPPPPPLPPLPLPPLKKRGNHSTGLCLLVMFFMVLVALVGLGLGMFQLFHLQKELAELRESTSQMHTASSLEKQIGHPSPPPEKKELRKVAHLTGKSNSRSMPLEWEDTYGIVLLSGVKYKKGGLVINETGLYFVYSKVYFRGQSCNNLPLSHKVYMRNSKYPQDLVMMEGKMMSYCTTGQMWARSSYLGAVFNLTSADHLYVNVSELSLVNFEESQTFFGLYKL 3
FasL 엑토도메인 MQQPFNYPYPQIYWVDSSASSPWAPPGTVLPCPTSVPRRPGQRRPPPPPPPPPLPPPPPPPPLPPLPLPPLKKRGNHSTG 4
FasL 막관통 도메인 LCLLVMFFMVLVALVGLGLGMF 5
FasL TM 엑토도메인 QLFHLQKELAELRESTSQMHTASSLEKQIGHPSPPPEKKELRKVAHLTGKSNSRSMPLEWEDTYGIVLLSGVKYKKGGLVINETGLYFVYSKVYFRGQSCNNLPLSHKVYMRNSKYPQDLVMMEGKMMSYCTTGQMWARSSYLGAVFNLTSADHLYVNVSELSLVNFEESQTFFGLYKL 6
FasL Δcyto (일명 FasL 델타 2-74) MGNHSTGLCLLVMFFMVLVALVGLGLGMFQLFHLQKELAELRESTSQMHTASSLEKQIGHPSPPPEKKELRKVAHLTGKSNSRSMPLEWEDTYGIVLLSGVKYKKGGLVINETGLYFVYSKVYFRGQSCNNLPLSHKVYMRNSKYPQDLVMMEGKMMSYCTTGQMWARSSYLGAVFNLTSADHLYVNVSELSLVNFEESQTFFGLYKL 7
FasL C82A MQQPFNYPYPQIYWVDSSASSPWAPPGTVLPCPTSVPRRPGQRRPPPPPPPPPLPPPPPPPPLPPLPLPPLKKRGNHSTGLALLVMFFMVLVALVGLGLGMFQLFHLQKELAELRESTSQMHTASSLEKQIGHPSPPPEKKELRKVAHLTGKSNSRSMPLEWEDTYGIVLLSGVKYKKGGLVINETGLYFVYSKVYFRGQSCNNLPLSHKVYMRNSKYPQDLVMMEGKMMSYCTTGQMWARSSYLGAVFNLTSADHLYVNVSELSLVNFEESQTFFGLYKL 8
FasL SLEKQ->EEAAA (각각 서열 번호 32 및 33) (즉, FasL SLEKQ126-130->EEAAA (각각 서열 번호 32 및 33)) MQQPFNYPYPQIYWVDSSASSPWAPPGTVLPCPTSVPRRPGQRRPPPPPPPPPLPPPPPPPPLPPLPLPPLKKRGNHSTGLCLLVMFFMVLVALVGLGLGMFQLFHLQKELAELRESTSQMHTASEEAAAIGHPSPPPEKKELRKVAHLTGKSNSRSMPLEWEDTYGIVLLSGVKYKKGGLVINETGLYFVYSKVYFRGQSCNNLPLSHKVYMRNSKYPQDLVMMEGKMMSYCTTGQMWARSSYLGAVFNLTSADHLYVNVSELSLVNFEESQTFFGLYKL 9
FasL Q130D MQQPFNYPYPQIYWVDSSASSPWAPPGTVLPCPTSVPRRPGQRRPPPPPPPPPLPPPPPPPPLPPLPLPPLKKRGNHSTGLCLLVMFFMVLVALVGLGLGMFQLFHLQKELAELRESTSQMHTASSLEKDIGHPSPPPEKKELRKVAHLTGKSNSRSMPLEWEDTYGIVLLSGVKYKKGGLVINETGLYFVYSKVYFRGQSCNNLPLSHKVYMRNSKYPQDLVMMEGKMMSYCTTGQMWARSSYLGAVFNLTSADHLYVNVSELSLVNFEESQTFFGLYKL 10
FasL F275L (비활성 FasL) MQQPFNYPYPQIYWVDSSASSPWAPPGTVLPCPTSVPRRPGQRRPPPPPPPPPLPPPPPPPPLPPLPLPPLKKRGNHSTGLCLLVMFFMVLVALVGLGLGMFQLFHLQKELAELRESTSQMHTASSLEKQIGHPSPPPEKKELRKVAHLTGKSNSRSMPLEWEDTYGIVLLSGVKYKKGGLVINETGLYFVYSKVYFRGQSCNNLPLSHKVYMRNSKYPQDLVMMEGKMMSYCTTGQMWARSSYLGAVFNLTSADHLYVNVSELSLVNFEESQTLFGLYKL 11
WPRE NQPLDYKICERLTGILNYVAPFTLCGYAALMPLYHAIASRMAFIFSSLYKSWLLSLYEELWPVVRQRGVVCTVFADATPTGWGIATTCQLLSGTFAFPLPIATAELIAACLARCWTGARLLGTDNSVVLSGKLTSFPWLLACVATWILRGTSFCYVPSALNPADLPSRGLLPALRPLPRLRLRPQTSRISLWAASPP 12
일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 표 1에 열거된 서열 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드(예: 발현)를 포함하고/하거나 발현하고/하거나, 표 2에 열거된 핵산 서열 중 하나 이상을 포함하는 벡터와 같은 핵산을 포함하고/하거나 발현한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 FasL 야생형 (UniprotKB - P48023)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고/하거나 이를 발현한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 FasL Δcyto (일명 FasL 델타 2-74)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고/하거나 이를 발현한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 FasL C82A의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고/하거나 이를 발현한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 FasL SLEKQ-->EEAAA (각각 서열번호 32 및 33) (일명 FasL SLEKQ126-130->EEAAA (각각 서열번호 32 및 33))의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고/하거나 이를 발현한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 FasL Q130D의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고/하거나 이를 발현한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 핵산, 예를 들어, 표 2에 열거된 핵산 서열 중 하나 이상을 포함하는 벡터를 포함하고/하거나 이를 발현한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 핵산, 예를 들어, FasL 야생형의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하고/하거나 이를 발현한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 핵산, 예를 들어, FasL Δcyto의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하고/하거나 이를 발현한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 핵산, 예를 들어, FasL C82A의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하고/하거나 이를 발현한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 핵산, 예를 들어, FasL SLEKQ-->EEAAA (각각 서열번호 32 및 33)의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하고/하거나 이를 발현한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 핵산, 예를 들어, FasL Q130D의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하고/하거나 이를 발현한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 핵산, 예를 들어, 표 2에 열거된 핵산 서열 중 하나 이상을 포함하는 벡터를 포함하고/하거나 이를 발현한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 핵산, 예를 들어, FasL 야생형을 암호화하는 벡터를 포함하고/하거나 이를 발현한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 핵산, 예를 들어, FasL Δcyto를 암호화하는 벡터를 포함하고/하거나 이를 발현한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 핵산, 예를 들어, FasL C82A를 암호화하는 벡터를 포함하고/하거나 이를 발현한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 핵산, 예를 들어, FasL SLEKQ-->EEAAA (각각 서열번호 32 및 33)를 암호화하는 벡터를 포함하고/하거나 이를 발현한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포는 핵산, 예를 들어, FasL Q130D를 암호화하는 벡터를 포함하고/하거나 이를 발현한다.
본 개시는 그의 특성에 유의하게 영향을 미치지 않는 변형을 가지는 기능적으로 동등한 단백질 및 향상되거나 감소된 활성 및/또는 친화도를 가지는 변이체를 포함하는, 표 1에 나타낸 개시된 구현예의 단백질에 대한 변형을 포함한다. 폴리펩티드의 변형은 당업계에서 일상적인 관행이며, 따라서 본원에서 상세히 설명될 필요는 없다. 변형된 폴리펩티드의 예는 아미노산 잔기의 보존적 치환, 기능적 활성을 유의하게 심각히 변화시키지 않거나 그의 리간드에 대한 폴리펩티드의 친화도를 성숙(향상)시키는 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 첨가를 갖는 폴리펩티드, 또는 화학적 유사체의 사용을 포함한다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 길이에 이르는 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열 내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다.
치환 변이체는 단백질 내 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고, 그 자리에 상이한 잔기가 삽입된다. 보존적 치환은 "보존적 치환"이라는 제목 하에 표 3에 제시된다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 초래하는 경우, 표 3에서 "예시적인 치환"으로 명명된, 또는 아미노산 클래스와 관련하여 아래에서 추가로 설명되는 바와 같은, 보다 실질적인 변화가 도입되고, 생성물이 스크리닝될 수 있다.
아미노산 치환
원래의 잔기(자연 발생 아미노산) 보존적 치환 예시적인 치환
알라닌(A) 발린 발린; 류신; 이소류신
아르기닌(R) 라이신 라이신; 글루타민; 아스파라긴
아스파라긴(N) 글루타민 글루타민; 히스티딘; 아스파르트산, 라이신; 아르기닌
아스파르트산(D) 글루탐산 글루탐산; 아스파라긴
시스테인(C) 세린 세린; 알라닌
글루타민(Q) 아스파라긴 아스파라긴; 글루탐산
글루탐산(E) 아스파르트산 아스파르트산; 글루타민
글리신(G) 알라닌 알라닌
히스티딘(H) 아르기닌 아스파라긴; 글루타민; 라이신; 아르기닌
이소류신(I) 류신 류신; 발린; 메티오닌; 알라닌; 페닐알라닌; 노르류신
류신(L) 이소류신 노르류신; 이소류신; 발린; 메티오닌; 알라닌; 페닐알라닌
라이신(K) 아르기닌 아르기닌; 글루타민; 아스파라긴
메티오닌(M) 류신 류신; 페닐알라닌; 이소류신
페닐알라닌(F) 티로신 류신; 발린; 이소류신; 알라닌; 티로신
프롤린(P) 알라닌 알라닌
세린(S) 트레오닌 트레오닌
트립토판(T) 세린 세린
트립토판(W) 티로신 티로신; 페닐알라닌
티로신(Y) 페닐알라닌 트립토판; 페닐알라닌; 트레오닌; 세린
발린(V) 류신 이소류신; 류신; 메티오닌; 페닐알라닌; 알라닌; 노르류신
FasL 단백질 및 FasL 단백질 유도체는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입한 후, 세포에서 실시간으로 합성될 수 있다. 대안적으로, FasL 단백질 및 FasL 단백질 유도체 단백질은 세포 외부에서 생산되고 나서 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 구조체를 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 안정한 형질전환 방법이 폴리뉴클레오티드 구조체를 세포의 게놈 내로 통합하는데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 일시적인 형질전환 방법은 폴리뉴클레오티드 구조체를 일시적으로 발현하는 데 사용될 수 있고, 폴리뉴클레오티드 구조체는 세포의 게놈 내에 통합되지 않는다. 다른 구현예에서, 바이러스 매개 방법이 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 예를 들어, 렌티바리러스, 아데노바이러스), 리포좀 등과 같은 임의의 적절한 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 일시적 형질전환 방법은, 예를 들어, 제한 없이, 미세주입, 전기천공 또는 입자 충돌을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포, 예를 들어, 본 개시의 T 세포는 적어도 하나의 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체 및 적어도 하나의 CAR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포, 예를 들어, T 세포는, 예를 들어, 감소된 수준의 FasR을 발현하도록 유전적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포, 예를 들어, T 세포는 적어도 하나의 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체 및 2개 이상의 상이한 항원 결합 단백질, 예를 들어, 2개 이상의 상이한 CAR을 포함할 수 있으며, 각각의 CAR은 상이한 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다.
조작된 면역 세포의 일부 구현예에서, 예를 들어, 본원에 제공된 T 세포에서, CAR은 세포 외 리간드-결합 도메인(예를 들어, 단쇄 가변 단편(scFv)), 막관통 도메인, 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호 전달 도메인은 하나의 폴리펩티드 내에, 즉 단일 사슬 내에 있다. 다중 사슬 CAR 및 폴리펩티드 또한 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 다중 사슬 CAR은: 막관통 도메인 및 적어도 하나의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 막관통 도메인 및 적어도 하나의 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기에서, 폴리펩티드는 함께 조립되어 다중 사슬 CAR을 형성한다.
세포외 리간드 결합 도메인은 관심 표적에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 관심 표적은, 예를 들어 비제한적으로, 다음의 관심 분자 중 어느 하나일 수 있다: BCMA, EGFRvIII, Flt-3, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD70, CD33, CD133, MHC-WT1 , TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKG2D, CS1, CD44v6, ROR1, CD19, Claudin-18.2(Claudin-18A2, 또는 Claudin18 이소형 2), DLL3(델타-유사 단백질 3, 초파리 델타　상동체 3, 델타3), Muc 7(Mucin17, Muc3, Muc3), FAP 알파(섬유아세포 활성화 단백질 알파), Ly6G6D(림프구 항원 6 복합체 유전자좌 단백질 G6d, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25), RNF43(E3 유비퀴틴-단백질 리가아제 RNF43, RING 핑거 단백질 43).
일부 구현예에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 가요성 링커에 의해 연결된 표적 항원 특이적 단클론 항체의 경쇄 가변(VL) 영역 및 중쇄 가변(VH) 영역을 포함하는 scFv를 포함한다. 단쇄 가변 영역 단편은 짧은 연결 펩티드를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 연결함으로써 제조된다(Bird 등의 문헌[Science 242:423-426, 1988]). 연결 펩티드의 예는 아미노산 서열(GGGGS)3(서열번호 36), (GGGGS)4 (서열번호 37), 또는 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열번호 38)을 갖는 GS 링커이며, 이는 하나의 가변 영역의 카르복시 말단과 다른 가변 영역의 아미노 말단 사이에서 약 3.5 nm를 가교한다. 다른 서열의 링커가 설계되고 사용되고 있다(Bird 등, 1988, 전술한 문헌 참조). 대체로, 링커는 짧고, 가요성 폴리펩티드일 수 있고, 바람직하게는, 약 20개 이하의 아미노산 잔기로 구성된다. 약물 부착 또는 고형 지지체에 대한 부착과 같은 추가 기능을 위해 링커를 차례로 수정할 수 있다. 단쇄 변이체는 재조합적으로 또는 합성적으로 생성될 수 있다. scFv의 합성 생성을 위해, 자동화된 합성기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 생성을 위해, scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적절한 플라스미드 또는 다른 벡터는 적절한 숙주 세포, 효모, 식물, 곤충 또는 포유류 세포와 같은 진핵 세포, 또는 대장균과 같은 원핵 세포 내에 도입될 수 있다. 관심 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 연결과 같은 일상적인 조작에 의해 만들어질 수 있다. 생성된 scFv는 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 단리될 수 있다.
본 개시에 따른 CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 면역 세포의 활성화 및 면역 반응을 초래하는 표적에 대한 세포외 리간드-결합 도메인의 결합 후 세포내 신호 전달을 담당한다. 세포내 신호 전달 도메인은 CAR이 발현되는 면역 세포의 정상적인 효과기 기능 중 적어도 하나를 활성화시키는 능력을 갖는다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 사이토카인의 분비를 포함하는 세포 용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다.
일부 구현예에서, CAR에 사용하기 위한 세포내 신호 전달 도메인은, 예를 들어, 제한 없이, 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하기 위해 함께 작용하는 T 세포 수용체 및 공수용체의 세포질 서열일 수 있고, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열일 수 있다. 세포내 신호 전달 도메인은 세포질 신호 전달 서열의 2가지의 구분되는 부류를 포함한다: 항원 의존성 일차 활성화를 개시하는 것, 및 이차 또는 공자극 신호를 제공하도록 항원 독립적 방식으로 작용하는 것. 일차 세포질 신호 전달 서열은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호 전달 모티프를 포함할 수 있다. ITAM은 syk/zap70 클래스 티로신 키나아제에 대한 결합 부위로서 작용하는 다양한 수용체의 세포질 내 테일에서 발견되는 잘 정의된 신호 전달 모티프이다. 본 발명에 사용된 CAR에 사용된 ITAM의 예는, 비제한적인 예로서, TCRζ, FcRγ, FcRβ, FcRε, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 공자극 분자의 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 41BB(GenBank: AAA53133)의 단편, CD28 (NP_006130.1) 의 단편, OX40의 단편, CD40의 단편, 또는 CD27의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자의 일부를 포함한다.
CAR은 세포의 표면 막 상에서 발현된다. 따라서, CAR은 막관통 도메인을 포함한다. 본원에 개시된 CAR에 대한 적절한 막관통 도메인은 (a) 세포의 표면, 예를 들어, 제한 없이, 림프구 세포 또는 자연 살해(NK) 세포와 같은 면역 세포의 표면에서 발현되고, (b) 사전 정의된 표적 세포에 대한 면역 세포의 세포 반응을 유도하기 위해 리간드 결합 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인과 상호작용하는 능력을 갖는다. 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 막관통 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 비제한적인 예로서, 막관통 폴리펩티드는 α, β, γ 또는 δ와 같은 T 세포 수용체, CD3 복합체를 구성하는 폴리펩티드, IL-2 수용체, 예를 들어 p55(a 사슬), p75(β 사슬 또는 γ 사슬), Fc 수용체의 서브유닛 사슬, 특히 Fcγ 수용체 III 또는 CD 단백질의 도메인일 수 있다. 대안적으로, 막관통 도메인은 합성 도메인일 수 있고, 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 주로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전술한 막관통 도메인은 인간 CD8α 사슬(예를 들어, NP_001139345.1)로부터 유래된다. 막관통 도메인은 세포외 리간드 결합 도메인과 전술한 막관통 도메인 사이에 줄기(stalk) 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 줄기 도메인은 최대 300개의 아미노산, 예를 들어, 10 내지 100개의 아미노산,또는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 줄기 영역은 자연 발생 분자의 전부 또는 일부로부터, 예컨대 CD8, CD4, 또는 CD28의 세포외 영역의 전부 또는 일부로부터, 또는 항체 불변 영역의 전부 또는 일부로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 줄기 도메인은 자연적으로 발생하는 줄기 서열에 상응하는 합성 서열일 수 있거나, 완전히 합성된 줄기 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 전술한 줄기 도메인은 인간 CD8α 사슬(예를 들어, NP_001139345.1)의 일부이다. 또 다른 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 인간 CD8α 사슬의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 개시된 CAR은 BCMA에 특이적으로 결합하는 세포외 리간드 결합 도메인, CD8α 인간 줄기 및 막관통 도메인, CD3ζ 신호 전달 도메인, 및 4-1BB 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 벡터 (예: 플라스미드 벡터)를 통해 이식유전자로서 면역 세포 내에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터, 예를 들어 플라스미드 벡터는, 예를 들어, 벡터를 수용한 세포의 식별 및/또는 선택을 제공하는 선택 마커를 함유할 수도 있다.
CAR 폴리펩티드는 CAR 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입한 후, 세포에서 실시간으로 합성될 수 있다. 대안적으로, CAR 폴리펩티드는 세포 외부에서 생산된 후, 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 구조체를 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 안정한 형질전환 방법이 폴리뉴클레오티드 구조체를 세포의 게놈 내로 통합하는데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 일시적인 형질전환 방법은 폴리뉴클레오티드 구조체를 일시적으로 발현하는 데 사용될 수 있고, 폴리뉴클레오티드 구조체는 세포의 게놈 내에 통합되지 않는다. 다른 구현예에서, 바이러스 매개 방법이 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스(예를 들어, 렌티바이러스), 아데노바이러스), 리포좀 등과 같은 임의의 적절한 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 일시적 형질전환 방법은, 예를 들어, 제한 없이, 미세주입, 전기천공 또는 입자 충돌을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 포함될 수 있다.
또한, 본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 따라 수득된 단리된 T 세포와 같은 면역 세포가 본원에 제공된다. 이종 DNA를 발현할 수 있는 임의의 면역 세포는 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체와 관심 CAR를 발현시킬 목적으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는, 예를 들어 줄기 세포로부터 유래될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 줄기 세포는 성체 줄기 세포, 비-인간 배아 줄기 세포, 보다 구체적으로, 비-인간 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 전구 세포, 골수 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포일 수 있다. 대표적인 인간 세포는 CD34+ 세포이다. 단리된 세포는 또한 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만 세포, NK 세포, B 세포 또는 염증성 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구 또는 헬퍼 T 림프구로 이루어진 군으로부터 선택된 T 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 CD4+ T 림프구 및 CD8+ T 림프구로 이루어진 군으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포, 예를 들어 단리된 T 세포와 같은 T 세포는 예를 들어, 공지된 상동성 재조합 기술 및 메가뉴클레아제, TALEN, 징크 핑거, shRNA, Cas-CLOVER, 및 CRISPR/Cas 시스템 중 하나 이상을 사용하는 기술을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 유전자 돌연변이 또는 유전자 편집 기술을 사용하여 유전자 변형이 더 이루어지거나, 예를 들어, FasR 유전자 좌위를 부분적으로 또는 전체적으로 결실시키고, 및/또는 하나 이상의 공지 녹다운 방법(예: 다양한 RNA 기반 기술(예: 안티센스 RNA, miRNA, siRNA) 중 하나를 사용하여 그렇게 변형되지 않은 비슷한 세포에 비해 감소된 수준의 FasR을 발현하도록 하는 방법)을 사용한다.
본 개시의 제2 양태는 면역 세포, 예를 들어, 감소된 수준으로 FasR을 발현하도록 변형되는 T 세포이다(예를 들어, 임의의 유전자 돌연변이 또는 유전자 편집 기술을 사용해 세포를 유전적으로 변형시키는 것에 의해, 이는 메가뉴클레아제, TALEN, 징크 핑거, shRNA, Cas-CLOVER, 및 FaRIS/C 시스템 중 하나 이상을 부분적으로 사용하는 공지된 상동성 재조합 기술 및 기술을 포함하나 이에 한정되지 않음). 양 양태의 구현예에서, 면역 세포, 예를 들어 T 세포는 (예를 들어, CAR과 같은 항원 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로부터) 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 항원 결합 단백질을 포함하고/하거나 발현하도록 추가로 변형된다.
증식 및 유전자 변형 전에, 세포의 공급원은 다양한 비제한적인 방법을 통해 대상체로부터 수득될 수 있다. 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막삼출액, 비장 조직, 및 종양을 포함하는 다수의 비제한적인 공급원으로부터 수득할 수 있다. 일부 구현예에서, 이용 가능하고 당업자에게 공지된 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 건강한 공여자, 암으로 진단된 대상체 또는 감염으로 진단된 대상체로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 상이한 표현형 특성을 나타내는 혼합된 세포 집단의 일부일 수 있다.
또한, 본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 따른, 변형된, 예를 들어 형질전환된 면역 세포, 예를 들어 T 세포로부터 수득된 세포주가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 면역 세포, 예를 들어, 본 개시에 따른 T 세포는 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포, 예를 들어, 본 개시에 따른 T 세포는 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포, 예를 들어, 본 개시에 따른 T 세포는 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 예를 들어 유전적으로 변형되어, 감소된 수준으로 FasR을 발현한다.
본 개시의 면역 세포, 예를 들어, T 세포는 변형 이전에 또는 후에, 예를 들어 제한 없이, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호에 일반적으로 기술된 방법을 사용하여 활성화되고 확장될 수 있다. 면역 세포, 예를 들어 T 세포는 시험관 내 또는 생체 내에서 확장될 수 있다. 대체로, 본 개시의 면역 세포는, 예를 들어, 세포에 대한 활성화 신호를 생성하도록 면역 세포의 표면 상에서 CD3 TCR 복합체 및 공자극 분자를 자극하는 제제와 세포를 접촉시킴으로써 증식될 수 있다. 예를 들어, 칼슘 아이오노포어 A23187, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA), 또는 피토헤마글루티닌(PHA)과 같은 유사분열성 렉틴과 같은 화학물질이 면역 세포, 예를 들어 T 세포에 대한 활성화 신호하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 집단은, 예를 들어, 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 아이오노포어와 함께 단백질 키나아제 C 활성화제(예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해, 시험관 내에서 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상에서 부속 분자의 공동자극을 위해, 부속 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건은, 혈청(예를 들어, 소태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-2, IL-15, TGFβ, 및 TNF를 포함하는 증식 및 생존에 필요한 인자, 또는 당업자에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 기타 첨가제를 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들어, Minimal Essential Media 또는 RPMI 배지 1640 또는 X-vivo 5(Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는, 계면활성제, 플라스마산염, 및 N-아세틸-시스테인 및 2-메르캅토에탄올과 같은 환원제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 배지는 아미노산, 피루브산나트륨, 및 비타민이 추가된 혈청이 없거나 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 정의된 호르몬 세트 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인(들)을 갖는 RPMI 1640, AIM V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 10, and X-Vivo 20, Optimizer를 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양에만 포함되고, 대상체에게 주입될 세포의 배양에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지원하는 데 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 대기(예를 들어, 5% CO2가 더해진 공기)에서 유지된다. 다양한 자극 시간에 노출된 면역 세포, 예를 들어 T 세포는 상이한 특성을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 세포는 조직 또는 세포와 공동 인큐베이션함으로써 증식될 수 있다. 세포는 또한 생체 내에서, 예를 들어 세포를 대상체에게 투여한 후 대상체의 혈액 내에서 확장될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 임의의 세포를 포함하는 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 항원 결합 단백질, 예를 들어 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 감소된 수준의 FasR을 발현하도록 변형된다. 상기 조성물은, 예를 들어, 면역 세포(예:본 개시의 T 세포) 예를 들어 항원 결합 단백질(예: CAR 및 FasL 단백질 및/또는 FasL 단백질 유도체)을 발현하고 임의로, FasR 발현 수준과 관련하여 변형되지 않은 유사한 세포에 비해 감소된 수준으로 FasR을 기능적으로 발현하는 면역 세포, 또는 면역 세포(예:본 개시의 T 세포)를 포함하는 세포 집단; 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다.
일부 구현예에서, 공여자로부터 단리된 일차 세포는, 생성된 세포의 하위 모집단(예를 들어, 10%, 20%, 30%와 같은 100% 미만의 비율)이 원하는 변형을 모두 또는 일부 포함하는 세포 집단을 제공하도록, 본원에 기술된 바와 같이 조작된다. 이러한 결과적인 집단은, 본 개시의 치료 방법에 사용될 수 없고 본 개시의 조성물을 제조하기 위한 모든 또는 일부 변형을 포함하는 세포 및 세포의 혼합물을 포함한다. 대안적으로, 이러한 세포 집단("시작 집단")은 공지된 방법(예: 원하는 변형을 갖는 세포의 분류 및/또는 증식)에 의해 조작되어, 원하는 변형 중 하나 이상을 포함하는 세포가 풍부한(예: 원하는 항원 결합 단백질을 발현하는 세포, FasL 단백질 및/또는 FasL 단백질 유도체를 발현하는 세포, 및/또는 FasR 발현 수준과 관련하여 변형되지 않은 비슷한 세포에 비해 감소된 수준으로 FasR을 발현하는 세포가 풍부한) 세포 집단을 제공할 수 있다. 즉, 이러한 변형된 세포를 시작 집단보다 더 높은 백분율로 포함하는 세포 집단을 제공할 수 있다. 그런 다음, 변형된 세포에 대해 농축된 집단은 본원의 치료 방법에 사용될 수 있고, 예를 들어 본 개시의 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 농축된 세포의 집단은 하나 이상의 변형을 갖는 세포를 함유하거나, 이러한 세포를 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%로 함유한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 변형을 포함하는 농축된 세포 집단의 세포 비율은 원하는 변형을 포함하는 세포 시작 집단의 세포 비율보다 적어도 30% 더 높다.
치료 방법
전술한 방법에 의해 수득된 면역 세포, 예를 들어 T 세포, 또는 이러한 면역 세포 또는 T 세포로부터 유래된 세포주는 의약으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 의약은, 예를 들어, 바이러스 질환, 박테리아 질환, 암, 염증성 질환, 면역 질환, 또는 노화 관련 질환과 같은 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 위암, 육종, 골육종, 횡문근육종, 조직육종, 자궁육종, 림프종, 백혈병, 두경부암, 흉선암, 상피암, 침샘암, 간암, 위장암, 갑상선암, 폐암, 난소암, 유방암, 전립선암, 식도암, 췌장암, 신경교종, 백혈병, 다발성 골수종, 신장 세포 암종, 방광암, 자궁경부암, 융모막암종, 대장암, 구강암, 피부암, 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 국소 진행성 또는 전이성 흑색종, 편평 세포 두경부암(SCHNC), 난소암, 육종, 또는 재발성 또는 불응성 고전 호지킨 림프종(cHL)을 앓고 있는 이전에 치료된 성인 대상체이다.
일부 구현예에서, 본 개시에 따른 면역 세포, 예를 들어 T 세포, 또는 면역 세포 예를 들어 T 세포로부터 유래된 세포주는 이를 필요로 하는 대상체에서 장애의 치료를 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 장애는, 예를 들어 암, 자가면역 장애, 또는 감염일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시의 조작된 면역 세포에서 본 개시에 따라 녹다운 또는 녹아웃된 임의의 다른 유전자의 FasR 기능적 발현 수준, 또는 기능적 발현 수준은, 비-유전자 조작된 세포의 상응하는 발현 수준에 비해 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%만큼 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 면역 세포는, 조작되지 않은 것 외에는 조작된 면역 세포와 동일한(동일한 성분을 포함하는) 조작되지 않은 면역 세포에서의 발현 수준의 75% 이하, 50% 이하, 25% 이하, 10% 이하, 또는 0%의 발현 수준으로 FasR, 또는 본 개시에 따라 녹다운되거나 녹아웃된 임의의 다른 유전자를 기능적으로 발현한다. 일부 구현예에서, 하나의 유전자의 두 대립유전자 모두가 녹아웃되어, 본원에 개시된 조작된 면역 세포에서의 유전자의 발현 수준은 상응하는 조작되지 않은 세포의 발현 수준의 0%이다. 일부 구현예에서, 유전자의 2개의 대립유전자 중 하나는 녹아웃되어, 본원에 개시된 조작된 면역 세포에서 유전자의 발현 수준이 상응하는 비-조작 세포의 발현 수준이 50% 또는 약 50%(예: 보상 메커니즘이 나머지 대립유전자의 정상 발현보다 더 큰 발현을 유발하는 경우)가 된다. 예를 들어, 발현이 녹아웃 이외에 본원에 기술된 것과 같은 일부 수단에 의해 감소되는 경우, 중간 수준의 발현이 관찰될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 면역 세포의 집단은 세포들의 혼합물을 포함하고, 세포의 일부는 두 대립유전자가 변경되거나 녹아웃되고, 세포의 일부는 하나의 대립유전자만 변경되거나 녹아웃되고/되거나, 세포의 일부는 대립유전자가 변경되거나 녹아웃되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시의 조작된 세포에서 본 개시에 따라 조작되는 FasR 발현 수준, 또는 그 발현 수준이 다른 임의의 유전자는 당업자에게 공지된 표준 기술(예를 들어, RT-qPCR, 핵산 시퀀싱, 항체 염색, 또는 기술의 일부 조합)을 사용하여 유전자 산물 및 그 특성에 대한 세포를 검정함으로써 직접 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, FasR의 기능적 발현 수준은 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어 유세포 계측법에 의해 조작된 면역 세포의 표면에서 FasR의 발현 수준을 결정함으로써 측정된다. 이들 측정은 FasR의 기능적 발현 수준을 감소시키도록 조작되지 않은 유사한 세포에서 이루어진 상응하는 측정과 비교될 수 있다. 본 발명의 조작된 세포(예: 조작된 면역 세포)를 포함하는 세포 집단에서, 측정되는 물질의 풀링된 샘플(예: RNA 또는 단백질 또는 세포)은 다음 사실을 반영하게 된다: 세포 중 일부는 대립유전자 모두가 녹아웃된 관심 유전자를 발현하지 않고; 예를 들어 세포 중 일부는 대립유전자 중 하나만이 녹아웃된 관심 유전자를 50% 또는 상응하는 조작되지 않은 세포에 대해 약 50% 수준으로 발현하고; 집단이 조작되지 않은 세포를 포함하는 경우, 세포 중 일부는 관심 유전자를 정상 수준으로 발현함.
본 개시의 조작된 면역 세포에서의 FasR 발현의 기능적 발현 수준은, 예를 들어, 조작되지는 않았지만, 그 외에는 비슷한(예를 들어 동일한) 면역 세포가 효과기 세포(예를 들어 T세포 또는 NK세포)가 존재할 때, 생존하는 정도와 비교하여, 조작된 면역 세포가 동일한 조건 하에 생존하는 정도를 측정함으로써 검정할 수도 있다.
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포(예: 본원에 개시된 조작된 T 세포)를 투여하거나, 또는 이들 조작된 면역 세포(예: 조작된 T 세포)를 포함하는 세포 집단을 투여하는 단계는, 유사하지만 조작되지 않은 세포 또는 이들 조작된 세포를 포함하지 않는 유사한 집단에 비해 투여된 세포 또는 세포 집단의 숙주 거부반응을 상대적으로 감킨다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질(예: CAR)을 포함하고 FasR 발현 수준이 감소된 본원에 개시된 조작된 면역 세포 (예: 조작된 T 세포)를 포함하는 조작된 면역 세포를 투여하거나, 또는 그러한 조작된 면역 세포를 포함하는 세포 집단(예: 조작된 T 세포)을 투여하는 것은, 그러한 조작된 세포를 포함하지 않는 유사하지만 조작되지 않은 세포 또는 세포 집단에 비해 투여된 세포 또는 세포 집단에 대한 숙주 거부반응을 상대적으로 감소시킨다. 예를 들어, 이러한 투여는, 동일하지만 FasR을 감소된 수준으로 발현하도록 조작되지 않은 세포의 숙주 거부반응과 비교했을 때, 숙주 거부반응을 1% 내지 99%, 예를 들어, 5% 내지 95%, 10% 내지 90%, 50% 내지 90%, 예를 들어 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 숙주 거부반응은 90% 이상 감소된다
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질(예: CAR)을 포함하고 FasR 기능 발현 수준이 감소된 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포를 투여하는 단계, 또는 이러한 면역 세포를 포함하는 세포 집단(예: T 세포)을 투여하는 단계는, 동일하지만 FasR을 감소된 수준으로 발현하도록 조작되지 않은 세포의 지속성에 비해 세포의 지속성을 향상시키거나 개선하고/또는 세포의 지속성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 지속성은, 예를 들어, 1 내지 7일, 1 내지 12주(예를 들어, 1 내지 4주, 4 내지 8주, 또는 8 내지 12주), 또는 1 내지 12개월, 또는 이들 범위 내에 속하는 특정 기간만큼 증가한다. 일부 구현예에서, 지속성의 차이는 집단 또는 조성물에서 투여된 세포의 반감기를 비교함으로써 측정되며, 예를 들어, 반감기는 예를 들어, 1 내지 7일, 1 내지 12주(예를 들어, 1 내지 4주, 4 내지 8주, 또는 8 내지 12주), 또는 1 내지 12개월, 또는 이들 범위에 속하는 특정 시간 길이만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 지속성에서의 차이는 투여된 세포가 투여 후 검출될 수 있는 시간의 길이를 비교함으로써 측정된다. 일부 구현예에서, 지속성의 개선은, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포와 같은 면역 세포의 존재 하에 조작된 세포와 조작되지 않은 세포의 생존을 비교하되, 이들 세포를 면역 세포와 혼합한 후 약 72시간, 5일, 또는 7일차에 이들 세포의 생존을 비교함으로써 시험관 내에서 측정된다. 일부 구현예에서, 이러한 시험관 내 검정에서, 측정 시점에 조작된 세포의 생존율은 조작되지 않은 세포가 생존율의 약 1.5배 내지 많게는 10배이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 것과 같은 투여된 세포의 숙주 거부반응 감소 및/또는 지속성의 증가는 당업자에게 공지된 다양한 기술 중 어느 하나에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 다음 중 임의의 하나 또는 이들의 조합이 사용된다: 유세포 계측법, PCT(예: 정량적 PCR), 및 환자 종양 물질과의 생체 외 공동 인큐베이션 또는 CAR-T 세포에 의해 표적화된 항원을 발현하는 모델 종양 세포주와의 생체 외 공동 인큐베이션. 일부 구현예에서, 녹아웃이 생존의 이점을 제공하는 정도를 결정하기 위해, qPCR을 사용해 관심 녹아웃을 갖는 CAR T 세포 및 갖지 않는 CAR T 세포의 수를 평가한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 면역 세포, 예를 들어 T 세포는 대상체에게 비경구로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
일부 구현예에서, 방법은 제2 치료제의 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 치료제는, 예를 들어, 크리조티닙, 팔보시클립, 항-CTLA4 항체, 항-4-1 BB 항체, PD-1 항체, 또는 PD-L1 항체이다.
또한, 암의 치료 또는 종양 성장 또는 진행의 억제를 필요로 하는 대상체를 위한 의약의 제조에 있어서, 본원에서 제공된 면역 세포, 예를 들어 T 세포 중 어느 하나의 용도가 제공된다.
특정 구현예에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 조작된 면역 세포에서의 FasR 발현 수준은 비-유전자적으로 변형된 조작된 면역 세포에서의 FasR 발현 수준에 비해 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%만큼 감소된다. 일부 구현예에서, FasR 발현 수준은 세포 표면에서 측정된다. 일부 구현예에서, FasR의 세포 표면 발현 수준은 유세포 계측법에 의해 측정될 수 있다. 표면 FasR은 형광 표지된 항-FasR/CD95 항체 및 유세포 계측법을 결합하여 세포 집단에 걸쳐 세포당 평균 형광 강도를 결정함으로써 측정될 수 있다. KO 효율은 대략 50%였으며, KO 세포는 FasR 염색에 대해 1~2 로그의 더 낮은 형광 강도를 나타낸다.
일부 구현예에서, CAR과 같은 항원 결합 단백질 및 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 포함하고 FasR 발현 수준이 감소된 면역 세포(예: T 세포)를 투여하는 단계, 또는 이러한 면역 세포(예: T 세포)를 포함하는 세포 집단을 투여하는 단계는, 동일하지만　FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 포함하지 않고 FasR 발현 수준이 감소되지 않는 세포의 AICD와 비교하여 AICD 및/또는 거부 반응을 10% 내지 90%, 예를 들어, 50% 내지 90%, 예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%, 까지 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 살해, 예를 들어, 활성화 유도된 세포 사멸(AICD)은 90% 이상 감소된다. AICD를 평가하기 위한 검정은, 특히 FasL-발현 종양에 대한 반복 자극 시험관 내 검정(예를 들어, 표적 종양 세포의 반복 첨가) 또는 생체 내 종양 이종이식 검정을 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 항원 결합 단백질(예: CAR 및 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체)을 포함하고 FasR 발현 수준이 감소된 본 개시의 면역 세포 (예: T 세포)를 투여하는 단계 또는, 이러한 면역 세포(예: T 세포)를 포함하는 세포 집단을 투여하는 단계는, 동일하지만 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 포함하지 않고 FasR 발현 수준이 감소되지 않는 세포의 지속성과 비교하여 세포의 지속성을 강화 또는 개선 및/또는 증가시킨다. 일부 구현예에서, 지속성은 25% 내지 100%만큼, 예를 들어, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%만큼, 또는 그 종점들이 인용된 백분율 중 임의의 2개인 범위 내에 속하는 백분율만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 지속성의 차이는 모집단 또는 조성물에서 투여된 세포의 반감기를 비교함으로써 측정되며, 여기서, 예를 들어, 반감기는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 또는 200%만큼 또는 이에 의해 증가되거나, 이의 종점은 인용된 백분율 중 임의의 2개에 속하는 백분율만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 지속성에서의 차이는 투여된 세포가 투여 후 검출될 수 있는 시간의 길이를 비교함으로써 측정된다. 일부 구현예에서, 지속성의 개선은 세포를 활성화된 NK 세포와 혼합한 후 특정 시간, 예를 들어, 혼합 후 약 72시간, 5일 또는 7일차에 남아있는 세포의 백분율을 비교함으로써 시험관 내에서 측정된다. 일부 구현예에서, 이러한 시험관 내 검정에서, 활성 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 포함하지 않는 세포(예를 들어, 활성 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 포함하지 않는 세포 또는 비활성 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 포함하는 세포)와 같이 활성 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 포함하는 세포보다 약 1.5 내지 10배 더 많은 세포가 생존한다.
일부 구현예에서, 치료는 항체 요법, 화학요법, 사이토카인 요법, 수지상 세포 요법, 유전자 요법, 호르몬 요법, 레이저 광 요법 및 방사선 요법의 군으로부터 선택된 암에 대한 하나 이상의 요법과 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 치료는 면역억제 치료를 받는 대상체에게 투여되거나 투입될 수 있다. 실제로, 본원에 개시된 대상은 이러한 면역억제제에 대한 수용체를 암호화하는 유전자의 불활성화로 인해 적어도 하나의 면역억제제에 내성을 갖게 된 세포 또는 세포 집단에 의존할 수 있다. 이러한 양태에서, 면역억제 치료는 대상체 내에서 본 개시에 따른 면역 세포, 예를 들어 T 세포의 선택 및 확장을 도울 수 있다.
본 개시에 따른 세포 또는 세포 집단의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 주입 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 정맥내 또는 림프내 주사에 의해, 피하, 피내, 종양내, 결절내, 골수내, 근육내, 또는 복강내 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 본 개시의 세포 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여된다.
일부 구현예에서, 세포 또는 세포 집단의 투여는, 예를 들어, 체중 kg당 약 104 내지 약 109개의 세포의 투여를 포함할 수 있으며, 여기에는 이들 범위 내의 세포 수의 모든 정수 값이 포함된다. 일부 구현예에서, 세포 또는 세포 집단의 투여는, 예를 들어, 체중 kg당 약 105 내지 약 106개의 세포의 투여를 포함할 수 있으며, 여기에는 이들 범위 내의 세포 수의 모든 정수 값이 포함된다. 세포 또는 세포 집단은 하나 이상의 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 유효량은 단일 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 유효량은 일정 기간에 걸쳐 1회를 초과하는 투여량으로 투여될 수 있다. 투여 시기는 담당 의사의 판단에 따르며 이는 대상체의 임상적 병태에 따라 달라진다. 세포 또는 세포 집단은 혈액 은행 또는 공여자와 같은 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 개별적인 요구는 다양하지만, 특정 질환 또는 병태에 대한 주어진 세포 유형의 유효량의 최적 범위의 결정은 당 기술분야의 범위 내에 있다. 유효량은 치료적 또는 예방적 이익을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 용량은 수용자의 연령, 건강 및 체중, 존재하는 경우, 병행 치료의 종류, 치료의 빈도 및 원하는 효과의 성질에 따라 달라질 것이다. 일부 구현예에서, 유효량의 세포 또는 이들 세포를 포함하는 조성물은 비경구 투여된다. 일부 구현예에서, 투여는 정맥내 투여일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 종양 내 주사에 의해 직접 수행될 수 있다.
본 개시의 일부 구현예에서, 세포는, 이에 제한되지는 않으나, 제제를 사용한 치료, 예를 들어, 단클론 항체 요법, CCR2 길항제(예를 들어, INC-8761), 항바이러스 요법, 시도포비어 및 인터루킨-2, MS 대상체를 위한 시타라빈(ARA-C로도 알려짐) 또는 나탈리지맙 치료, 또는 건선 대상체를 위한 에팔리즈티맙 치료 또는 PML 대상체를 위한 다른 치료를 포함하는 임의의 수의 관련 치료 기법과 함께 (예를 들어, 이전, 동시에 또는 이후에) 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, BCMA 특이적 CAR-T 세포는 다음 중 하나 이상과 함께 접합되어 대상체에게 투여된다: 항-PD-1 항체(예를 들어, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 또는 PF-06801591), 항-PD-L1 항체(예를 들어, 아벨루맙, 아테졸리주맙, 또는 더발루맙), 항-OX40 항체(예를 들어, PF-04518600), 항-4-1 BB 항체(예를 들어, PF-05082566), 항-MCSF 항체(예를 들어, PD-0360324), 항-GITR 항체, 및/또는 항-TIGIT 항체. 추가의 구현예에서, 본 개시의 면역 세포, 예를 들어 T 세포는 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제, 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 시톡신, 플루다리빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인 및/또는 방사과 같은 다른 면역제거제들과 조합하여 사용될 수 있다. 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타아제 칼시뉴린(시클로스포린 및 FK506)을 억제하거나, 성장 인자 유도 신호 전달(라파마이신)에 중요한 p70S6 키나아제를 억제한다(Henderson, Naya 등의 문헌[Immunology. 1991 Jul; 73(3): 316-321]; Liu, Albers 등의 문헌[Biochemistry 1992 Apr 28;31(16):3896-901]; Bierer, Hollander 등의 문헌[Curr Opin Immunol. 1993 Oct;5(5):763-73]).
추가 실시양태에서, 본 개시내용의 세포 조성물은 골수 이식, 플루다라빈과 같은 화학요법제, 외부-빔 방사선 요법(XRT), 시클로포스파미드, 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체를 사용하는 T 세포 제거 요법과 함께(예를 들어, 그 이전에, 동시에 또는 이후에) 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 세포 조성물은 B-세포 제거 요법, 예컨대 CD20과 반응하는 제제(예: 리툭산) 후에 투여된다. 예를 들어, 일 구현예에서, 대상체는 고 투여량 화학요법을 이용한 표준 치료를 겪은 후, 말초 혈액 줄기 세포 이식을 받을 수 있다. 특정 구현예에서, 이식 후, 대상체는 본 개시의 증식된 면역 세포의 주입을 받는다. 일부 구현예에서, 확장된 세포는 수술 전 또는 후에 투여된다.
키트
본 개시는 또한 본 방법에서 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본원에 개시된 키트는 본 개시의 조성물을 포함하는 하나 이상의 용기 또는 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포 또는 본 개시의 T 세포와 같은 면역 세포를 포함하는 세포 집단을 포함한다. 다양한 구현예에서, 면역 세포, 예를 들어, T 세포는 본원에 기술된 것과 같은 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체 및 항원 결합 단백질(예: CAR)을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하며, 본원에 기술된 것과 같이 FasR을 감소된 수준으로 발현하도록 추가로 조작된다. 키트는 본 개시의 방법 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 지침을 추가로 포함한다. 일반적으로, 이들 지침은 전술한 치료 치료제를 위한 조성물, 예를 들어 T 세포 또는 세포 집단의 투여에 대한 설명을 포함한다.
키트 구성 요소의 사용에 관한 지침은 일반적으로 의도된 치료제에 대한 투여량, 투여 일정 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 투여량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중 투여량 패키지) 또는 서브-유닛 투여량일 수 있다. 본 개시의 키트에 제공된 지침은 일반적으로 라벨 또는 패키지 삽입부(예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트)에 대한 서면 지침이지만, 기계 판독 가능 지침(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 포함된 지침)도 허용 가능하다.
본 개시의 키트는 적절한 포장에 들어 있다. 적절한 포장은 바이알, 병, 항아리, 가요성 포장(예를 들어, 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백) 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 흡입기, 비강 투여 장치(예를 들어, 분무기) 또는 미니펌프와 같은 주입 장치와 같은 특정 장치와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 고려된다. 키트는 멸균 엑세스 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥 내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 용기도 또한 멸균 엑세스 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥 내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 본 개시에 따른 면역 세포, 예를 들어, T 세포 또는 그러한 세포의 집단이다. 용기는 제2 약학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 완충액 및 해석 정보와 같은 추가 구성요소를 임의로 제공할 수 있다. 일반적으로, 키트는 용기 및 용기 상에 또는 용기와 연관된 라벨 또는 패키지 삽입부(들)를 포함한다.
분류 및 고갈 방법
일부 구현예에서, 면역 세포 집단을　시험관 내에서 분류하는 방법이 제공되며, 여기서 면역 세포 집단의 하위 집합은 FasR을 감소된 수준으로 발현하고/하거나 항원 결합 단백질, 예를 들어 CAR을 발현하도록 본원에 기술된 바와 같이 조작된 면역 세포를 포함한다. 상기 방법은: 조작된 세포에 고유한 에피토프(예: 미모토프), 예를 들어 항원 결합 단백질의 에피토프 또는 항원 결합 단백질에 통합된 미모토프에 특이적인 단클론 항체와 면역 세포 집단을 접촉시키는 단계; 및 단클론 항체에 결합하는 면역 세포를 선택하여 항원 결합 단백질을 발현하는 조작된 면역 세포가 풍부한 세포 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 전술한 에피토프에 특이적인 전술한 단클론 항체는 형광단에 임의로 접합된다. 본 구현예에서, 단클론 항체에 결합하는 세포를 선택하는 단계는 형광 활성화 세포 분류(Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS)에 의해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 전술한 에피토프에 특이적인 전술한 단클론 항체는 자기 입자에 임의로 접합된다. 본 구현예에서, 단클론 항체에 결합하는 세포를 선택하는 단계는 자기 활성화 세포 분류(Magnetic Activated Cell Sorting, MACS)에 의해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질(예:CAR)을 발현하는 면역 세포를 분류하는 방법에 사용된 mAb는 알렘투주맙, 이브리투모맙 튜세탄, 뮤로모납-CD3, 토시투모맙, 압시시맙, 바실릭시맙, 브렌툭시맙 베도틴, 세툭시맙, 인플릭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 세톨리주맙 페골, 다클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 겜투주맙, 나탈리주맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 라니비주맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 베돌리주맙, 아달리무맙, 벨리무맙, 카나키누맙, 데노수맙, 골리무맙, 이필리무맙, 오파투무맙, 파니투무맙, QBEND-10 및/또는 우스테키누맙으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 전술한 mAb는 리툭시맙이다. 또 다른 구현예에서, 전술한 mAb는 QBEND-10이다.
일부 구현예에서, 전술한 CAR-발현 면역 세포를 시험관 내에서 분류하기 위한 방법을 사용할 때 수득된 CAR-발현 면역 세포의 집단은 CAR-발현 면역 세포의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR-발현 면역 세포를 시험관 내에서 분류하기 위한 방법을 사용할 때 수득된 CAR-발현 면역 세포의 집단은 CAR-발현 면역 세포의 적어도 85%를 포함한다.
일부 구현예에서, 전술한 CAR-발현 면역 세포를 시험관 내에서 분류하기 위한 방법을 사용할 때 수득된 CAR-발현 면역 세포의 집단은 초기(분류되지 않은) 세포 집단과 비교하여 시험관 내에서 증가된 세포독성 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 전술한 시험관 내에서의 세포독성 활성은 10%, 20%, 30% 또는 50%만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이다.
수용자에게 투여될 CAR-발현 면역 세포는 시험관 내에서 공급원 모집단으로부터 농축될 수 있다. 공급원 모집단을 농축하는 방법은 밀도 원심분리, 면역-자성 비드 정제, 친화도 크로마토그래피, 및 형광 활성화 세포 분류의 조합을 사용하여, CD34 항원과 같은 항원을 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
유세포 계측법을 사용하여 세포 집단 내의 특정 세포 유형을 정량화할 수 있다. 일반적으로, 유세포 계측법은 주로 광학 수단으로 세포의 구성 요소 또는 구조적 특징을 정량화하는 방법이다. 상이한 세포 유형은 구조적 특징을 정량화함으로써 구별될 수 있기 때문에, 유세포 계측법 및 세포 분류를 사용해 혼합물 내에서 상이한 표현형의 세포를 계수하고 분류할 수 있다.
유세포 계측법 분석은 두 가지 주요 단계를 포함한다: 1) 선택된 세포 유형을 하나 이상의 표지된 마커로 표지하는 단계, 및 2) 집단에서의 총 세포 수에 대한 표지된 세포의 수를 결정하는 단계. 일부 구현예에서, 세포 유형을 표지하는 방법은 특정 세포 유형에 의해 발현된 마커에 표지된 항체를 결합하는 단계를 포함한다. 항체는 형광 화합물로 직접 표지되거나, 예를 들어 제1 항체를 인식하는 형광 표지된 제2 항체를 사용하여 간접적으로 표지될 수 있다.
일부 구현예에서, CAR을 발현하는 T 세포를 분류하는 데 사용되는 방법은 자기 활성화 세포 분류(MACS)이다. 자기 활성화 세포 분류(MACS)는 초 상자성 나노입자 및 컬럼을 사용하여 표면 항원(CD 분자)에 따라 다양한 세포 집단을 분리하는 방법이다. MACS는 순수 세포 집단을 수득하는 데 사용될 수 있다. 단일 세포 현탁액 중의 세포는 마이크로비드로 자기적으로 표지될 수 있다. 샘플을 세포 친화적인 코팅으로 덮여 있는 강자성 구체로 구성된 컬럼에 도포하여, 세포를 신속하고 안전하게 분리할 수 있다. 표지되지 않은 세포는 통과하는 반면, 자기 표지된 세포는 컬럼 내에 유지된다. 관류는 표지되지 않은 세포 분획으로서 수집될 수 있다. 세척 단계 후, 컬럼을 분리기로부터 제거하고, 자기 표지된 세포를 컬럼으로부터 용리시킨다.
T 세포와 같은 특정 세포 집단의 정제에 대한 상세한 프로토콜은 Basu S 등, (2010) (Basu S, Campbell HM, Dittel BN, Ray A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41): 1546)에서 찾을 수 있다.
실시예
다음의 실시예는 예시적인 목적을 위해 포함되며, 이는 본 개시의 범위를 제한하고자 하는 의도가 아니다. 실제로, 본원에 도시되고 설명된 것들에 더하여 본 개시의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이고 첨부된 청구범위의 범위 내에 속할 것이다.
실시예 1: 활성화된 T 및 NK 세포에서 FasR 발현 검증
동종반응성 T 및 NK 세포가 활성화 시 FasL 매개 살해에 민감할 것임을 확인하기 위해 2개의 실험을 수행하였다.
A. 첫 번째 실험에서, (7-아미노락티노마이신 D (7-AAD)를 통해) 활성화 유도된 세포 사멸 및 FasR 및 CD69의 표면 발현을 평가하기 전에, 최대 8일 동안 100 U/mL IL-2의 존재 하에 TransAct로 일차 T 세포를 반복적으로 자극하였다(도 1a~1c 참조). 미자극 T 세포는 CD69에 대해 음성이었고, 약 40% FasR+였으며, 해동 시 높은 생존력을 나타냈다. 단일 자극은 CD69를 발현하는 세포의 >80%, FasR을 발현하는 세포의 >95%, 및 생존력의 최소 손실을 초래하였다.
반복된 자극 - 치료 과정에 걸쳐 CAR T 세포에 의한 암세포의 연속 사멸을 모델링함 - CD69+ 세포의 약 40%로의 점진적인 감소, 세포의 >95%에서 FasR의 안정한 발현, 및 심층 (~70~80%) 세포 사멸을 초래하였다 (도 1a~1c 참조). 이러한 결과에 기초하여, 활성화된 T 세포(동종반응성 T 세포 공격 세포 요법 포함)는 FasCAR T 세포에 의한 FasL 매개 살해에 민감해야 한다. 또한, 이들 결과에 기초하여, FasCAR T 세포에서의 FasR 녹아웃은 FasL-매개된 동족 살해를 예방하기 위해 필요할 것이고 종양 세포 결합에 따라 AICD에 대한 내성을 개선할 수 있을 것으로 예상된다.
B. 제2 실험에서, 새로 수집된 백혈병흡입 시스템(LRS) 챔버로부터 제조된 NK 세포를 1000 U/mL IL-2로 48시간 동안 활성화시킨 다음, 이들의 FasR 발현을 유세포 계측법에 의해 활성화된 FasR+ T 세포와 비교하였다(도 2). 사이토카인 활성화 NK 세포는 활성화된 T 세포보다 낮은 수준에서만 표면 FasR 발현을 나타냈다. 이러한 결과에 기초하여, 활성화된 NK 세포는 FasCAR T 세포에 의한 FasL 매개 살해에 민감해야 한다.
실시예 2: FasR 녹아웃, FasL 발현 세포의 유래
A. FasR 녹아웃
T 세포 지속성을 개선하고 AICD를 감소시키기 위해 2개의 변형을 수행하였다: FasR 유전자 녹아웃 및 FasL 유전자 전달.
CRISPR-매개 게놈 편집을 사용하여 FasR 유전자를 녹아웃하였다. CRISPR-매개 녹아웃을 위해 인간 FasR 유전자를 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(sgRNA) 분자를 설계하기 위해 Synthego의 웹 도구를 사용하였다. 활성화된 FasR+ 일차 T 세포 내로의 sgRNA 및 Cas9 효소의 전기천공은 약 50% FasR 유전자 녹아웃을 초래하였다(도 3a 및 3b).
FasR KO가 FasR매개 세포자멸사로부터 T 세포를 보호함을 입증하기 위해, FasR을 Jurkat T 세포에서 녹아웃하고 세포 사멸을 FasR+ 대 FasR KO Jurkat 세포에서 세포자멸사 활성화 항-FasR 항체(클론 CH11, 50 ng/mL) 또는 항체 + 경쟁적 차단제(2 μg/mL FasR 엑토도메인-Fc)와 함께 72시간 인큐베이션한 후 평가하였다(도 4). 항-FasR 항체로 인큐베이션하면 FasR+ Jurkat T 세포가 완전히 살해되었다. 가용성 FasR 엑토도메인으로 항체-FasR 결합을 경쟁적으로 차단하면 FasR+ Jurkat 세포의 살해를 방지하여, 세포자멸사를 통한 사멸이 FasR을 통해 특이적으로 매개되었음을 입증한다. 대조적으로, FasR 녹아웃 Jurkat T 세포는 경쟁적 차단이 없는 상태에서 항체 배양을 생존하여, 녹아웃이 FasR 매개 세포자멸사로부터 이들 세포를 효과적으로 보호했음을 나타낸다.
B. FasL 발현
FasL 유전자 전달을 가능하게 하기 위해, 야생형 인간 FasL(UniprotKB - P48023의 서열), 비활성 돌연변이체(F275L)(Schneider, P. 등의 J. Biol.Chem. 272, 18827-18833 (1997).), 세포질 도메인(Δaa 2-74), 및 FasL 상의 ADAM10 및 SPPL2a 절단 부위를 파괴하도록 설계된 3개의 돌연변이체(Q130D, C82A 및 SLEKQ126-130→EEAAA 각각 서열번호 32 및 33))을 포함하는 FasL의 다양한 유도체와 함께 형질도입 마커로서 청색 형광 단백질(BFP)을 공동 전달하는 렌티벡터를 설계하고 제조하였다. 렌티바이러스를 이들 중 하위 집합으로부터 제조하고, FasR 녹아웃 직후에 일차 T 세포를 형질도입하는데 사용하였다. 형질도입된 T 세포에서 BFP의 발현 및 FasL의 표면 발현을 유세포 계측법으로 평가하였다(도 5a 및 5b 참조). 작제물에 따라 이벤트의 30~70%에서 BFP의 발현에 의해 입증된 바와 같이, 모든 벡터는 일차 T 세포를 성공적으로 형질도입하였다. 또한, FasL 야생형의 경우에 세포성이 현저하게 더 낮긴 하지만, FasL의 4개의 모든 활성 버전이 세포 표면 상에서 관찰되었다. 특히, 강력한 BFP 발현에도 불구하고 비활성(F275L) FasL은 세포 표면 상에서 검출되지 않았으며, 이는 이러한 점 돌연변이가 생물발생을 방해하고 세포 표면으로 내보내는 것을 나타내거나, 비기능성으로 만드는 돌연변이 또한 유세포 계측법 염색에 사용된 항-FasL 항체에 의한 인식을 파괴한다는 것을 나타낸다.
실시예 3: FasL-발현, FasR KO T 세포의 기능을 시험하는 파일럿 실험
A. FasL-발현 T 세포는 FasR을 발현하는 자가 및 동종이계 세포를 살해한다.
중요하게는, FasR+ 세포(FasR 녹아웃이 발생하지 않은 세포)는 형질도입되지 않은(NTD) 세포에서 세포의 약 50%를 구성하였지만, 활성 형태의 FasL로 형질도입된 샘플에서는 완전히 부재하였고(도 6a), 이는 FasR 녹아웃이 FasL-발현 T 세포 산물의 동족 살해를 예방하기 위해 필요함을 나타낸다. FasL-FasR 결합에 기초한 동종이계 세포 사멸을 조사하기 위해, 도 6a에서 생성된 HLA-A2+ 공여자로부터 생성된 FasL+, FasR KO("FasR-"라고도 함) T 세포를 HLA-A2- 공여자의 FasR+ 및 FasR- T 세포와 배양하고, 유세포 계측법 분석 중에 HLA-A2 상태를 사용하여 동종이계 세포 살해를 조사했다. 도 6a에서 관찰된 자가 동족 살해에 의해 예측된 바와 같이, 활성 형태의 FasL을 발현하는 A2+ FasR KO 세포는 FasR+ 동종이계 세포를 살해했지만 FasR- 동종이계 세포는 살해하지 않았다(도 6b). 이는 FasL+, FasR-, CAR-발현 세포 생성물이 비-반응성 숙주 T 세포를 보존하면서 활성화된 동종이계 T 세포(예를 들어, 세포 생성물을 공격하는 동종반응성 T 세포)를 선택적으로 살해할 수 있음을 시사한다. 따라서, FasL+, FasR-, CAR-발현 세포 생성물은 FasL+, FasR-가 아닌 상응하는 CAR-발현 세포 생성물보다 더 오래 지속되고/되거나 더 적은 AICD를 겪을 것으로 예상된다.
B. 일차 T 세포에서 FasR 및 β2m 유전자의 CRISPR-매개 이중 녹아웃.
동종이계 숙주 T 세포는 비-자기 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자 상에 제시된 에피토프의 TCR 매개 인식에 기초하여 세포 산물을 거부한다. 동종이계 숙주 NK 세포는, 특히 세포 요법 산물이 (예를 들어, MHCI 분자의 불변 β2m 성분을 녹아웃함으로써) 숙주 T 세포에 대한 MHC 제시를 감소시키도록 조작되는 경우, 거부 반응에 기여할 수도 있다. 동종이계 NK 세포에 대한 표적인 모델 FasL-발현 세포를 생성하기 위해, CRISPR-매개 유전자 녹아웃을 사용하여 FasR 및 β2m에 대해 음성인 HLA-A2-T 세포를 생산하고(도 7a 및 도 7b), 이어서 이들 세포를 FasL 유도체로 형질도입하였다. FasR 녹아웃의 효율은 ~65%이었고, β2m 녹아웃의 효율은 ~75%였으며, 도 7b에서 알 수 있는 바와 같이, 세포의 >50%가 두 유전자의 녹아웃을 나타낸다.
FasL 발현이 동종이계 NK 세포로부터 이들 HLA-A2- 모델 세포 산물을 보호하는지 여부를 결정하기 위해, 3개의 HLA-A2+ 공여자로부터 신선한 LRS 챔버로부터 NK 세포를 제조하고, 이를 48시간 동안 1000 U/mL IL-2로 활성화시킨 다음, HLA-A2 상태를 사용하여 72시간 동안 FasL-발현, β2m KO 세포와 함께 배양하여 동종이계 세포 기원을 유세포 계측법으로 구별하였다(도 8a~8b). 활성화된 NK 세포는 비활성 FasL로 형질도입되지 않았거나 형질도입된 β2m 녹아웃 세포를 완전히 살해했다. 대조적으로, β2m 녹아웃 세포는 FasL의 활성 유도체를 발현할 때 NK 세포 매개 살해로부터 보호하였다(도 8a). 가정된 바와 같이, 이러한 보호 메커니즘은 FasL-매개 반격이었으며, 이는 활성 FasL로 무장한 T 세포를 포함하는 인큐베이션에서 살아있는 NK 세포 수가 극적으로 감소하였기 때문이다(도 8b). 이러한 살해는 FasR+ NK 세포에 특이적이었는데, 이는 이들이 이들 샘플로부터 소멸되었고 모든 나머지 NK 세포가 FasR-이기 때문이다(데이터 미도시).
SEQUENCE LISTING <110> ALLOGENE THERAPEUTICS, INC. <120> FASL EXPRESSION AND FASR GENE KNOCKOUT TO PROTECT THERAPEUTIC CELLS FROM ALLOGENEIC REJECTION AND ACTIVATION-INDUCED CELL DEATH <130> AT-040/02WO <140> <141> <150> 63/156,902 <151> 2021-03-04 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Met Ser Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met His Met Lys Leu Tyr Met Glu 1 5 10 15 Gly Thr Val Asp Asn His His Phe Lys Cys Thr Ser Glu Gly Glu Gly 20 25 30 Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Met Arg Ile Lys Val Val Glu Gly 35 40 45 Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr Ser Phe Leu Tyr 50 55 60 Gly Ser Lys Thr Phe Ile Asn His Thr Gln Gly Ile Pro Asp Phe Phe 65 70 75 80 Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Val Thr Thr Tyr 85 90 95 Glu Asp Gly Gly Val Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln Asp 100 105 110 Gly Cys Leu Ile Tyr Asn Val Lys Ile Arg Gly 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 22 atgcagcagc ctttcaacta tccttatcct cagatctatt gggtcgattc tagcgcctct 60 tctccttggg caccaccagg gactgtcttg ccatgcccga ctagcgtgcc acggagacca 120 ggccagcgtc gacctccccc acctccaccc ccccctcccc tgccaccacc acccccacca 180 cctccccttc cacccttgcc acttcctccg cttaagaaac ggggaaacca cagcactggc 240 ctctgcctgt tggtcatgtt cttcatggtg ctggttgcac tggtgggact gggattgggg 300 atgttccagc tgttccactt gcagaaggag ttggcagaac tgagggaaag cactagccag 360 atgcacaccg cctcagagga agccgctgcc atcggtcacc caagcccccc cccagaaaag 420 aaggagctga ggaaggtcgc acacctcacc ggtaaatcca attcccggtc aatgcccctg 480 gagtgggaag acacctatgg catcgttctg ctttcaggcg tcaaatacaa gaaaggaggg 540 ctggttatca atgaaacagg gctgtatttc gtttattcca aggtctactt tcgggggcag 600 tcctgtaaca atctccctct cagccacaaa gtctacatga ggaacagcaa atacccccag 660 gatctggtta tgatggaagg gaagatgatg agctactgca ctaccggcca gatgtgggcc 720 aggagttcct acctgggtgc cgtcttcaac cttacttccg cagaccatct gtacgtcaac 780 gtgagtgaac 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Claims (39)

  1. 항원 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)인, 벡터.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체는 UniprotKB - P48023(서열 번호 3), FasL 델타 2-74(서열 번호 7), FasL Q130D(서열 번호 10), FasL C82A(서열 번호 8) 또는 FasL SLEK126-130->EEAAA(서열 번호 9)의 아미노산 서열("SLEKQ" 및 "EEAAA"는 각각 서열 번호 32 및 33으로 개시됨)을 포함하는, 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 재조합 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 사이에서 2A 펩티드 암호화 서열을 추가로 포함하는, 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 조작된 면역 세포.
  7. 제6항에 있어서, 조작되지 않은 면역 세포와 비교하여 감소된 수준의 FasR 발현을 추가로 포함하는, 조작된 면역 세포.
  8. 제6항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 감소된 수준으로 FasR을 발현하도록 유전적으로 변형되지 않은 조작된 면역 세포와 비교하여 감소된 수준으로 FasR을 발현하도록 유전적으로 변형된 것인, 조작된 면역 세포.
  9. 항원 결합 단백질 및 FasL 또는 FasL 유도체를 포함하는 조작된 면역 세포로서, 상기 조작된 면역 세포는 조작되지 않은 면역 세포와 비교하여 FasR의 감소된 발현 수준을 추가로 포함하는, 조작된 면역 세포.
  10. 항원 결합 단백질 및 FasL 또는 FasL 유도체를 포함하는 조작된 면역 세포로서, 상기 조작된 면역 세포는 감소된 수준으로 FasR을 발현하도록 유전적으로 변형되지 않은 조작된 면역 세포와 비교하여 감소된 수준으로 FasR을 발현하도록 유전적으로 변형된 것인, 조작된 면역 세포.
  11. 제8항 또는 제10항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 TALEN, CRISPR/Cas9 및 megaTAL 뉴클레아제 중 어느 하나를 사용하여 유전적으로 변형되었거나, 예를 들어 shRNA 또는 마이크로 RNA를 사용하여 달성된 감소된 발현 수준을 나타내는, 조작된 면역 세포.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)인, 조작된 면역 세포.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, FasL 또는 FasL 유도체는 야생형 FasL(서열번호 3), FasL 델타 2-74(서열번호 7), FasL Q130D(서열번호 10), FasL C82A(서열번호 8), 및 FasL SLEKQ126-130->EEAAA (서열번호 9)("SLEKQ" 및 "EEAAA"는 각각 서열번호 32 및 서열번호 33으로 개시됨)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 면역 세포.
  14. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 제2 조작된 면역 세포에 비해 개선된 생체 내 지속성을 나타내고, 여기서 상기 제2 조작된 면역 세포는 바이러스 단백질을 포함하지 않는 것을 제외하고는 상기 단리된 T 세포의 모든 성분을 포함하는, 조작된 면역 세포.
  15. 항원 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 FasL 또는 FasL 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 면역 세포로서, 상기 조작된 면역 세포는 조작되지 않은 면역 세포와 비교하여 FasR의 발현 감소를 포함하는, 조작된 면역 세포.
  16. 제15항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)인, 조작된 면역 세포.
  17. 제15항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, FasL 또는 FasL 유도체는 UniprotKB P48023(서열번호 3), FasL 델타 2-74(서열번호 7), FasL Q130D(서열번호 10), FasL C82A(서열번호 8), 및 FasL SLEKQ126-130->EEAAA (서열번호 9) ("SLEKQ" 및 "EEAAA"는 각각 서열번호 32 및 서열번호 33으로 개시됨)로 제공된 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 면역 세포.
  18. 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 내인성 TCRα 유전자 및 내인성 CD52 유전자 중 하나 이상의 게놈 변형을 추가로 하나 이상 포함하는, 조작된 면역 세포.
  19. 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 T 세포인, 조작된 면역 세포.
  20. 제6항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포 중 하나 이상을 포함하는 조작된 면역 세포의 집단.
  21. 제6항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포를 104개 이상, 105개 이상, 또는 106개 이상을 포함하는 조작된 면역 세포의 집단.
  22. 제6항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포가 풍부한 조작된 면역 세포의 집단.
  23. 제6항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포 또는 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포 집단 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  24. 환자의 병태를 치료하는 방법으로서, 제6항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포, 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포 집단, 또는 제23항의 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 면역 세포는 환자 이외의 공여자로부터 유래된 동종이계 면역 세포이고, 상기 조작된 면역 세포 집단의 조작된 면역 세포는 환자 이외의 공여자로의 하나 이상의 동종이계 면역 세포로부터 유래되거나, 상기 조성물은 환자 이외의 공여자로의 하나 이상의 동종이계 면역 세포를 포함하는, 방법.
  26. 동종이계 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 요법에서 숙주 세포의 동종이계 세포 살해를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 제6항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포, 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포의 집단, 또는 제23항의 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  27. 환자에게 동종이계 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 동종이계 세포의 지속성을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 환자에게 제6항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포, 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포의 집단, 또는 제23항의 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 조작된 면역 세포로서, 제1 FasR 대립유전자의 제1 게놈 변형 및 임의로 제2 FasR 대립유전자의 제2 게놈 변형을 포함하고, 추가로 FasL 단백질 또는 FasL 단백질 유도체를 암호화하고 임의로 항원 결합 단백질을 추가로 암호화하는 벡터를 포함하는, 조작된 면역 세포.
  29. 제28항에 있어서, 상기 제1 게놈 변형은 기능 상실 게놈 변형인, 조작된 면역 세포.
  30. 제28항에 있어서, 상기 세포는 제1 게놈 변형 및 제2 게놈 변형을 포함하고, 추가로 제1 게놈 변형 및 제2 게놈 변형은 기능 상실 게놈 변형인, 조작된 면역 세포.
  31. 제28항에 있어서, 상기 제1 게놈 변형은 녹아웃인, 조작된 면역 세포.
  32. 제28항에 있어서, 상기 세포는 제1 게놈 변형 및 제2 게놈 변형을 포함하고, 추가로 상기 제1 게놈 변형 및 제2 게놈 변형은 녹아웃인, 조작된 면역 세포.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 UniprotKB - P48023 (서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는FasL 단백질을 암호화하는, 조작된 면역 세포.
  34. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 FasL 델타 2-74(서열 번호 7), FasL Q130D(서열 번호 10), FasL C82A(서열 번호 8) 또는 FasL SLEKQ126-130->EEAAA(서열 번호 9) ("SLEKQ" 및 "EEAAA"는 각각 서열번호 32 및 33으로 개시됨)의 아미노산 서열을 포함하는 FasL 단백질 유도체를 암호화하는, 조작된 면역 세포.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 항원 결합 단백질을 추가로 암호화하는, 조작된 면역 세포.
  36. 제35항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)인, 조작된 면역 세포.
  37. 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 내인성 TCRα 유전자 및 내인성 CD52 유전자 중 하나 이상의 게놈 변형을 추가로 포함하는, 조작된 면역 세포.
  38. 제37항에 있어서, 상기 세포는 TCRα의 기능 상실 게놈 변형을 포함하는, 조작된 면역 세포.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 세포는 CD52의 기능 상실 게놈 변형을 포함하는, 조작된 면역 세포.
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