WO2022012531A1 - 一种经修饰的免疫细胞的制备方法 - Google Patents
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/26—Universal/off- the- shelf cellular immunotherapy; Allogenic cells or means to avoid rejection
Definitions
- the present application relates to the field of biomedicine, in particular to a method for preparing a universal chimeric antigen T cell, including knocking out Fas protein and transferring FasL protein.
- the method comprises administering a Cas protein to the immune cell.
- the CD24 protein comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:59.
- the vector comprises a viral vector.
- the present application provides a population of cells comprising said immune cells, wherein at least 20% of the immune cells in said cell population do not substantially express Fas and at least 5% of the immune cells overexpress FasL.
- Figure 5 shows the fold expansion of the modified immune cells described in the present application and allogeneic T cells co-cultured on day 6.
- Figure 7 shows the expansion fold of the modified immune cells described in the present application after co-culture with allogeneic T cells.
- gene silencing generally refers to the inhibition of the expression of a gene, which can be inhibited by blocking the transcription or translation of the gene.
- chimeric antigen receptor generally refers to a fusion protein comprising an extracellular domain capable of binding an antigen and at least one intracellular domain.
- CAR is the core component of chimeric antigen receptor T cells (CAR-T), which can include targeting moieties (eg, moieties that bind tumor-associated antigens (TAAs)), hinge regions, transmembrane regions, and cells internal domain.
- targeting moieties eg, moieties that bind tumor-associated antigens (TAAs)
- TAAs tumor-associated antigens
- CRISPR/Cas system or “CRISPR-Cas system” generally refers to a nuclease system consisting of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) and CRISPR-related proteins (i.e. Cas proteins), It can cut almost all genomic sequences adjacent to the protospacer-adjacent motif (PAM) in eukaryotic cells.
- CRISPR/Cas system may be used to collectively refer to transcripts involving CRISPR-associated (“Cas”) genes, as well as other elements involved in their expression or directing their activity, and may include sequences encoding Cas genes, tracr (transactivating CRISPR) sequences (e.g.
- the present application provides a method for preparing a modified immune cell, the modification comprising the steps of: a) down-regulating the expression and/or activity of Fas protein in the immune cell, b) up-regulating the expression and/or activity of the Fas protein in the immune cell FasL protein expression and/or activity such that Fas protein expression and/or activity in the modified immune cells is reduced or eliminated compared to immune cells without the modification, and the modified Elevated expression and/or activity of FasL protein in immune cells.
- the method can include administering to the immune cell one or more substances selected from the group consisting of antisense RNA, siRNA, shRNA, CRISPR/Cas systems, RNA editing systems such as RNA adenosine deaminase (ADAR), RNA-Guided Endonuclease, Zinc Finger Nuclease (ZFN), Mega-TAL Nuclease, Transcription Activator-Like Effector Nuclease (TALEN), Meganuclease, Base Editing, CRISPR interference (or CRISPRi), and, Zinc finger gene repressor and/or transcription activator-like effector (TALE) gene repressor-mediated transcriptional repression.
- the method may include administering to immune cells using inhibitory proteins, which may include substances capable of inhibiting the activity or function of the Fas protein, eg, inhibitory ligands, receptors, antibodies of the Fas protein and/or enzymes.
- the target polynucleotide of the CRISPR complex can be any polynucleotide endogenous or exogenous to the eukaryotic cell.
- the target polynucleotide can be a polynucleotide that resides in the nucleus of a eukaryotic cell.
- the backbone sequence of the present application can be derived from the backbone sequence described in PCT application publication WO2019011118A1, for example, can be the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 34-45 (listed as 5' to 3') , where the first region in lowercase font represents the tracr mate sequence, and the second region in lowercase font represents the tracr sequence, and the last poly-U sequence represents the transcription terminator.
- the number of U in the poly-U is not limited to what is shown in this example, and can be increased or decreased. In some cases, poly-U can be removed without affecting activity.
- a crRNA targeting a nucleic acid molecule encoding a Fas protein described herein may comprise at least 80% (eg, at least 85%, at least 90%) of the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1-15 %, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or at least 100%) nucleotides of sequence identity sequence.
- proteins that can be fused to Cas proteins include, but are not limited to, epitope tags, reporter genes, and protein domains having one or more of the following activities: methylase activity, demethylase activity, transcriptional activation activity, transcriptional repression activity, transcriptional release factor activity, histone modification activity, RNA cleavage activity and nucleic acid binding activity.
- the FasL protein may also comprise a hinge region.
- the hinge region may contain fewer protease cleavage sites than the hinge region of the native FasL protein.
- the hinge region may be a hinge region derived from a transmembrane protein other than FasL.
- the hinge region may be a hinge region derived from the tumor necrosis factor superfamily.
- the hinge region can be a hinge region derived from TNFSF10 or OX40L.
- nucleic acid molecules described herein can also be linked to many types of vectors.
- the nucleic acid can be ligated to, including but not limited to, plasmids, phagemids, phages, viruses and/or cosmids.
- Particular vectors of interest can include expression vectors, replication vectors, probe generation vectors, and sequencing vectors.
- the methods of the present application may comprise introducing the vectors described herein into immune effector cells.
- the vectors described herein can be introduced into the immune effector cells, such as T lymphocytes, B cells, macrophages, or natural killer (NK) cells.
- each or each cell may comprise one or one of the vectors described herein.
- each or each cell may comprise a plurality (eg, 2 or more) or more (eg, 2 or more) of the vectors described herein.
- the vectors described herein can be introduced into the cells.
- immune effector cells can be transfected with a retroviral vector, and the viral genome with the nucleic acid encoding the fusion protein can be integrated into the host genome to ensure long-term and stable expression of the target gene.
- a transposon using a transposon, a plasmid carrying a nucleic acid encoding the fusion protein and a plasmid carrying a transposase are introduced into target cells.
- Gene or protein expression levels can be detected by a variety of methods, including methods at the nucleic acid level (including by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) or by Southern blotting, in situ hybridization for mRNA quantification, next-generation sequencing ) and methods at the protein level (including immunofluorescence labeling and analysis by flow cytometry, histochemistry, immunoblot analysis, and in vitro binding studies).
- RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
- protein expression levels can be quantified by ELISA techniques well known to those skilled in the art. Quantitative measurements can be done using a number of standard assays. For example, transcript levels can be measured using RT-PCR and hybridization methods including RNase protection, Southern blot analysis, RNA dot analysis. Immunohistochemical staining and flow cytometry, Western blot analysis can also be used to assess whether and how much Fas protein and/or Fas gene is present.
- FasL and its variants FasL-M1 and FasL-M2 can protect allogeneic T cells from killing, so that T cells expressing FasL, FasL-M1 and FasLF-M2 can survive more under the killing effect of allogeneic T cells. .
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Abstract
一种制备经修饰的免疫细胞的方法，该修饰包括以下步骤：a）下调该免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性，b）上调该免疫细胞中FasL蛋白的表达和/或活性，使得，与未经该修饰的免疫细胞相比，该经修饰的免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性降低或消除，且，该经修饰的免疫细胞中FasL蛋白的表达和/或活性升高。
Description
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种通用型嵌合抗原T细胞的制备方法，包括敲除Fas蛋白并转入FasL蛋白。
免疫细胞在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。免疫细胞治疗面临的最大挑战是异体排斥作用，包括输入的细胞对病人体内细胞的排斥作用，即GvHD，以及病人体内细胞对输入细胞的排斥作用，即HvGR。避免HvGR的方法目前仍处于探索阶段，如果不采用一些策略抑制病人体内杀伤性细胞的异体排斥，输入的免疫细胞将会很快被清除。在人体中实施对外源细胞杀伤作用的细胞主要包括T细胞或NK细胞。
因此，需要采取策略抑制体内免疫细胞对输入的免疫细胞的杀伤，从而发挥输入型免疫细胞的治疗效果。
发明内容
本申请提供了一种制备经修饰的免疫细胞的方法，所述修饰包括以下步骤：a)下调所述免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性，b)上调所述免疫细胞中FasL蛋白的表达和/或活性。根据所述方法制得的经修饰的免疫细胞可以具有较高的Fas蛋白敲除效率和较高的FasL蛋白表达效率，能有效抑制异体排斥作用。例如，能够抵抗T细胞和/或PBMC细胞的杀伤作用。
一方面，本申请提供了一种制备经修饰的免疫细胞的方法，所述修饰包括以下步骤：
a)下调所述免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性，b)上调所述免疫细胞中FasL蛋白的表达和/或活性，使得，与所述免疫细胞相比，所述经修饰的免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性降低或消除，且，所述经修饰的免疫细胞中FasL蛋白的表达和/或活性升高。
在某些实施方式中，所述步骤a)包括下调所述免疫细胞中编码Fas蛋白的核酸分子的表达和/或活性。
在某些实施方式中，所述步骤a)所述下调方式包括通过基因敲除(knock out)、基因敲减(knock down)、基因突变、基因缺失、基因沉默或上述的任意组合来下调。
在某些实施方式中，所述步骤a)的所述下调包括向所述免疫细胞施用一种或多种选自下 组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA、CRISPR/Cas***、RNA编辑***如RNA腺苷脱氨酶(ADAR)、RNA指导的核酸内切酶、锌指核酸酶(ZFN)、Mega-TAL核酸酶、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶(Meganuclease)、碱基编辑、CRISPR干扰，和，锌指蛋白(Zinc finger)基因阻遏物和/或转录激活子样效应物(TALE)基因阻遏物介导的转录抑制。
在某些实施方式中，所述步骤a)包括向所述免疫细胞施用靶向编码Fas蛋白的核酸分子的指导RNA。
在某些实施方式中，所述步骤a)包括靶向所述免疫细胞中编码Fas蛋白的核酸分子的外显子1-5中的任意一个或多个。
在某些实施方式中，所述Fas蛋白包括SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述编码Fas蛋白的核酸分子包括NCBI数据库gene ID:355下或Ensembl数据库ENSG00000026103下所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述靶向Fas蛋白的核酸分子的指导RNA包含如SEQ ID NO:1-15中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述靶向编码Fas蛋白的核酸分子的指导RNA为单链指导RNA。
在某些实施方式中，所述靶向编码Fas蛋白的核酸分子的指导RNA为包含crRNA和tracrRNA的双链指导RNA。
在某些实施方式中，所述crRNA包含如SEQ ID NO:1-15中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法包括下调所述免疫细胞中T细胞受体(TCR)、T细胞受体α恒定区蛋白、T细胞受体β恒定区蛋白和/或PD-1蛋白的表达和/或活性。
在某些实施方式中，所述的方法包括下调编码所述TCR、T细胞受体α恒定区蛋白、T细胞受体β恒定区蛋白和/或所述PD-1蛋白的核酸分子的表达和/或活性。
在某些实施方式中，所述的方法包括向所述免疫细胞施用靶向编码所述T细胞受体α恒定区蛋白的核酸分子(TRAC)的指导RNA。
在某些实施方式中，所述T细胞受体α恒定区蛋白包括SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述靶向编码所述T细胞受体α恒定区蛋白的核酸分子(TRAC)的指导RNA包含如SEQ ID NO:31-33中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法包括向所述免疫细胞施用靶向编码所述PD-1蛋白的核酸分子的指导RNA。
在某些实施方式中，所述方法包括靶向所述免疫细胞中编码所述PD-1蛋白的核酸分子的外显子1-3。
在某些实施方式中，所述PD-1蛋白包括SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述靶向编码所述PD-1蛋白的核酸分子的指导RNA包含如SEQ ID NO:16-30中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述靶向编码所述Fas蛋白的核酸分子的指导RNA、靶向编码所述PD-1蛋白的核酸分子和/或靶向编码所述TCR的核酸分子的指导RNA包含化学修饰。
在某些实施方式中，所述的方法包括向所述免疫细胞施用Cas蛋白。
在某些实施方式中，所述Cas蛋白为Cas9蛋白。
在某些实施方式中，所述步骤b)包括上调所述免疫细胞中编码FasL蛋白的核酸分子的表达和/或活性。
在某些实施方式中，所述步骤b)包括向所述免疫细胞施用编码FasL蛋白的核酸分子。
在某些实施方式中，所述的方法包括向所述免疫细胞施用包含编码FasL蛋白的核酸分子的载体。
在某些实施方式中，所述FasL蛋白包括胞外结构域。
在某些实施方式中，所述FasL蛋白的胞外结构域包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述FasL蛋白包括铰链区。
在某些实施方式中，所述铰链区源自肿瘤坏死因子超家族。
在某些实施方式中，所述铰链区源自FasL、TNFSF10或OX40L。
在某些实施方式中，所述FasL蛋白包括胞内结构域
在某些实施方式中，所述FasL蛋白包括如SEQ ID NO:50-52和63-64中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述编码FasL蛋白的核酸分子包括如SEQ ID NO:53-55所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法还包括上调所述免疫细胞中的PD-L1和/或CD24蛋白的表达和/或活性。
在某些实施方式中，所述的方法包括向所述免疫细胞施用编码PD-L1蛋白的核酸分子和/或编码CD24蛋白的核酸分子。
在某些实施方式中，所述的方法包括向所述免疫细胞施用包含编码PD-L1蛋白的核酸分 子和/或编码CD24蛋白的核酸分子的载体。
在某些实施方式中，所述PD-L1蛋白包括如SEQ ID NO:56-57中任一项所示的氨基酸序列
在某些实施方式中，所述编码PD-L1蛋白的核酸分子包括如SEQ ID NO:58所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述CD24蛋白包括如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述编码CD24蛋白的核酸分子包括如SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述载体包含病毒载体。
在某些实施方式中，所述免疫细胞包括T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、浆细胞、粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞、白细胞、干细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些实施方式中，所述步骤b)在所述步骤a)之后进行。
在某些实施方式中，所述步骤b)在所述步骤a)中的下调成功后进行。
在某些实施方式中，所述下调成功包括，与经所述步骤a)前的免疫细胞相比，经过所述步骤a)后的所述免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性降低至少50％。
在某些实施方式中，所述下调成功包括基因编辑发生。
在某些实施方式中，所述步骤b)在所述步骤a)至少6小时后进行。在某些实施方式中，所述的方法还包括以下步骤：使所述经修饰的免疫细胞包括嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)和/或至少一种合成受体。
在某些实施方式中，所述的方法还包括以下步骤：使所述经修饰的免疫细胞包括表达嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)和/或至少一种合成受体的核酸分子。
另一方面，本申请提供了根据所述的方法制得的经修饰的免疫细胞，与未经所述修饰的免疫细胞相比，所述经修饰的免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性降低或消除，且，所述经修饰的免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性升高。
在某些实施方式中，所述的免疫细胞包括嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)和/或至少一种合成受体。
另一方面，本申请提供了细胞群，其包含所述的免疫细胞，且所述细胞群中至少20％的免疫细胞基本上不表达Fas，至少5％的免疫细胞过表达FasL。
在某些实施方式中，所述的细胞群中的至少15％的免疫细胞基本上不表达PD-1。
在某些实施方式中，所述的细胞群中的至少5％的免疫细胞过表达PD-L1。
在某些实施方式中，所述的细胞群中的至少5％的免疫细胞过表达CD24。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含所述的免疫细胞和/或所述的细胞群，以及药学上可接受的载体。
另一方面，本申请提供了所述的免疫细胞、所述的细胞群和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于***。
另一方面，本申请提供了靶向编码Fas蛋白的核酸分子的指导RNA，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:1-15中任一项所示的核苷酸序列。
另一方面，本申请提供了靶向编码PD-1蛋白的核酸分子的指导RNA，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:16-30中任一项所示的核苷酸序列。
另一方面，本申请提供了CRISPR/Cas***，其包括所述靶向编码Fas蛋白的核酸分子的指导RNA和Cas蛋白。
在某些实施方式中，所述Cas蛋白包括Cas9蛋白。
另一方面，本申请提供了异体细胞移植的方法，其包括施用有效量的所述的免疫细胞、所述的细胞群和/或所述药物组合物。
另一方面，本申请提供了***的方法，其包括施用有效量的所述的免疫细胞、所述的细胞群，和/或所述的药物组合物。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是靶向Fas的指导RNA的敲除效率。
图2显示的是本申请所述经修饰的免疫细胞中Fas的敲除效率及FasL的表达效率。
图3显示的是本申请所述经修饰的免疫细胞的扩增效率。
图4显示的是本申请所述经修饰的免疫细胞与异体T细胞共同培养后的扩增倍数。
图5显示的是本申请所述经修饰的免疫细胞与异体T细胞共同培养第6天时的扩增倍数。
图6显示的是本申请所述经修饰的免疫细胞中FasLF、FasL-M1和FasL-M2的表达效率。
图7显示的是本申请所述经修饰的免疫细胞与异体T细胞共同培养后的扩增倍数。
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“修饰”通常是指分子或细胞的状态或结构改变。分子可以以多种方式被修饰，包括化学、结构和功能修饰。细胞可以通过改变核苷酸或蛋白质序列而被修饰。在蛋白质的范围内，修饰可以指参照分子内至少一个氨基酸残基被置换，删除或添加的片段。在核酸范围内，修饰可以是指参照分子内至少一个核酸残基被置换，删除或添加的片段。所述修饰使得细胞中蛋白质的表达和/或活性被改变。
在本申请中，术语“下调”通常是指经本申请所述修饰后的免疫细胞中，编码一种或多种蛋白质或其功能性片段的核酸分子(例如，RNA或DNA)的水平和/或活性、或一种或多种蛋白质或其功能性片段的水平和/或活性降低或消除，低于未经本申请所述修饰的免疫细胞中的水平。
在本申请中，术语“上调”通常是指经本申请所述修饰后的免疫细胞中，编码一种或多种蛋白质或其功能性片段的核酸分子(例如，RNA或DNA)的水平和/或活性、或一种或多种蛋白质或其功能性片段的水平和/或活性增加，高于未经本申请所述修饰的免疫细胞中的水平。未经本申请所述修饰的免疫细胞中的水平也可以不存在所述编码一种或多种蛋白质或其功能性片段的核酸分子(例如，RNA或DNA)，或所述编码一种或多种蛋白质或其功能性片段的核酸分子(例如，RNA或DNA)不表达。
在本申请中，术语“基因敲除(knock out)”通常是指使基因缺失或功能消除的基因工程技术。
在本申请中，术语“基因敲减(knock down)”通常是指使基因部分缺失或功能部分丧失 或降低的基因工程技术。
在本申请中，术语“基因突变”通常是指基因的核苷酸序列中一个或多个核苷酸的***、取代、缺失、移码突变或错义突变，通常引起该基因功能的降低或缺失。
在本申请中，术语“基因缺失”通常是指基因的核苷酸序列中一个或多个核苷酸，例如，核苷酸片段的丢失，也包括编码蛋白的全部基因的丢失。
在本申请中，术语“基因沉默”通常是指基因的表达受到抑制，可通过阻碍该基因的转录或翻译来抑制。
在本申请中，术语“Fas”通常是指一种细胞表面的死亡受体，也可称为Fas受体、APT1、CD95、FAS1、APO-1、FASTM、ALPS1A或肿瘤坏死因子受体超家族成员6(TNFRSF6)。成熟的Fas蛋白包括胞外结构域、跨膜区和/或胞内结构域。外显子1至外显子5编码细胞外区域，外显子6编码跨膜区，外显子7-9编码细胞内区域。该术语包含全长的未加工的Fas、前体、成熟体，以及由细胞内加工或人为修饰的任何形式的Fas或其变体、衍生物、类似物、同源物、片段及其功能性变体，例如，可变剪切体和/或等位变体。示例性的人Fas蛋白的氨基酸序列可参见NCBI数据库登录号NP_000034.1(变体1)、NP_001307548.1(变体4)、NP_690610.1(变体2)和/或NP_690611.1(变体3)。编码Fas蛋白的核酸分子可参见NCBI数据库gene ID:355下或Ensembl数据库ENSG00000026103下所示的核苷酸序列。
在本申请中，术语“FasL”通常是指一种II型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子(TNF)家族。Fas-FasL相互作用在调节免疫***和癌症进展中起重要作用，也称为Fas配体、TNFSF6、CD178、CD95L、FASLG、TNLG1A或APT1LG1。其受体可包括Fas受体和/或DcR3。Fas-FasL结合触发的凋亡在免疫***的调节中起着基本作用。该术语包含全长的未加工的FasL、前体、成熟体，以及由细胞内加工或人为修饰的任何形式的FasL或其变体、衍生物、类似物、同源物、片段及其功能性变体，例如，可变剪切体和/或等位变体。又例如，铰链区进行了突变或替换的变体。FasL蛋白可包括胞内结构域、跨膜区、铰链区和/或胞外结构域；各个区域均可进行突变、替换、***、或删除等改动，而不影响Fas-FasL结合，仍然起到抵抗异体排斥的作用。示例性的人FasL蛋白的氨基酸序列可参见NCBI数据库登录号NP_001192172.1(变体2)和/或NP_034307.1(变体1)。
在本申请中，术语“PD-1”通常是指程序性细胞死亡1，也可称为PDCD1、CD279、PD1或SLEB2，一种I型跨膜蛋白，并与BTLA、CTLA-4，ICOS和CD28一起构成T细胞共刺激受体的CD28家族。“PD-1”包括完整的PD-1及其片段，还包括人PD-1的功能性变体、同工型、物种同源物、衍生物、类似物，以及具有至少一个与PD-1共同表位的类似物。示例性 的人PD-1编码区序列可以在NCBI GenBank登录号NM_005018.3下找到。
在本申请中，术语“PD-L1”通常是指程序性细胞死亡1配体1，也可称为B7同源物1、B7-H1或CD274，其与PD-1结合后下调T细胞活化和细胞因子分泌。“PD-L1”包括完整的PD-L1及其片段，还包括人PD-1的功能性变体、同工型、物种同源物、衍生物、类似物，以及具有至少一个与PD-L1共同表位的类似物。示例性的人PD-L1序列可在NCBI GenBank登录号NM_001267706.1、NM_014143.4或NM_001314029.2下找到。
在本申请中，术语“CD24”通常是指一种细胞表面受体蛋白，也称为热稳定抗原24(HSA)。“CD24”包括完整的CD24及其片段，还包括人CD24的功能性变体、同工型、物种同源物、衍生物、类似物，以及具有至少一个与CD24共同表位的类似物。示例性的人CD24序列可在NCBI GenBank登录号NM_001291737、NM_001291738、NM_001291739、NM_013230或NM_001359084下找到。
在本申请中，术语“嵌合抗原受体(CAR)”通常是指包含能够结合抗原的胞外结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。CAR是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)的核心部件，其可包括靶向部分(例如，结合肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)的部分)、铰链区、跨膜区和细胞内结构域。
在本申请中，术语“T细胞表面受体(TCR)”通常可以包括αβ形式或γδ形式的TCR。根据T细胞表面受体(TCR)类型的不同，可将T细胞分为αβT细胞和γδT细胞。αβT细胞表达αβTCR。αβTCR有很多亚型，其表达于αβT细胞表面，负责以主要组织相容性复合体(MHC)依赖的形式识别特异性抗原。γδT细胞是指T细胞的TCR由γ链和δ链构成的T细胞，其免疫作用介于固有免疫和适应性免疫之间，为MHC非限制型T细胞，具有一定的非特异性杀伤肿瘤细胞的作用，并且具有广泛的抗瘤谱。
在本申请中，术语“嵌合自身抗体受体(CAAR)”通常是指包含自身抗原、能够被自身抗体识别的蛋白，英文名称为chimeric autoantibody receptors。CAAR可以指导经遗传修饰表达CAAR的免疫细胞攻击表达能够识别该抗原的抗体的B细胞(可参见Science.2016 Jul 8；353(6295):179-84.doi:10.1126/science.aaf6756.Epub 2016 Jun 30.Reengineering Chimeric Antigen Receptor T Cells for Targeted Therapy of Autoimmune Disease Christoph T Ellebrecht et al.)。
在本申请中，术语“合成受体”通常是指工程化的细胞表面蛋白或蛋白复合物，其包含(1)可以特异性结合靶分子的靶结合域，和(2)可以激活信号传导途径的功能域。在工程单元中，靶结合域可包含细胞外结构域，功能结构域可包含细胞内结构域。合成受体还可包 括跨膜序列。合成受体可以是蛋白质复合物，其包含从外源核酸表达的蛋白质。合成受体也可以是蛋白质复合物，其包含至少一种外源表达的蛋白质和至少一种内源表达的蛋白质。在一些实施方案中，工程细胞可以是免疫细胞，例如T细胞，自然杀伤(NK)细胞，B细胞，巨噬细胞等，并且功能域可以直接或间接激活免疫细胞。在某些实施方案中，合成受体可以选自：嵌合抗原受体(“CAR”)，T细胞受体(“TCR”)，TCR受体融合构建体(“TRuC”)，T细胞抗原偶联剂(“TAC”)，嵌合自身抗体受体(“CAAR”)，抗体TCR受体(“AbTCR”)和嵌合CD3ε受体。在一些实施方案中，合成受体可以是CAR。在一些实施方案中，合成受体可以是TCR。在一些实施方案中，合成受体可以是TRuC。在一些实施方案中，合成受体可以是TAC。在一些实施方案中，合成受体可以是AbTCR。在一些实施方案中，合成受体可以是嵌合CD3ε受体。
在本申请中，术语“CRISPR/Cas***”或“CRISPR-Cas***”通常是指由成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(即Cas蛋白)组成的核酸酶***，能够对真核细胞中几乎所有与前间区序列邻近基序(protospacer-adjacent motif，PAM)相邻的基因组序列进行切割。“CRISPR/Cas***”可用来统称涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的转录物，以及涉及其表达或指导其活性的其他元件，可包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或其活性部分)、tracr配偶序列(在内源CRISPR/Cas***背景下，涵盖“同向重复”和加工的部分同向重复)、指导序列(在内源CRISPR/Cas***背景下也称为“spacer”)、或来自CRISPR座位的其他序列和转录物。已经鉴定出五种类型的CRISPR***(例如，I型、II型、III型、U型和V型)。
在本申请中，术语“Cas蛋白”也称为“CRISPR相关蛋白”通常是指与CRISPR序列互补的一类酶，能够使用CRISPR序列作为指导(guide)，从而识别和切割特定的DNA链。Cas蛋白的非限制性实例包括：Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csxl2)、CaslO、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4，和/或他们的同系物、或其修饰形式。在一些实施例中，该Cas蛋白是Cas9蛋白。
在本申请中，术语“Cas9蛋白”或“Cas9核酸酶”，也称为Csn1或Csx12，通常是指II型CRISPR/Cas***中一类既参与crRNA生物合成又参与摧毁入侵DNA的蛋白质。Cas9蛋白通常包括RuvC核酸酶结构域和HNH核酸酶结构域，分别切割双链DNA分子的两条不同的链。已经在不同的细菌物种如嗜热链球菌(S.thermophiles)、无害利斯特氏菌(Listeria innocua) (Gasiunas，Barrangou et al.2012；Jinek，Chylinski et al.2012)和化脓性链球菌(S.Pyogenes)(Deltcheva，Chylinski et al.2011)中描述了Cas9蛋白。例如，化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9蛋白，其氨基酸序列参见SwissProt数据库登录号Q99ZW2；脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号A1IQ68；嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号Q03LF7；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号J7RUA5。
在本申请中，术语“指导RNA”通常是指CRISPR中包含的RNA组分，也可称为guide RNA(gRNA)。指导RNA一般包含指导序列和骨架序列，这两个序列可以在同一个分子中或不同的分子中。指导RNA的作用可以为指导Cas9蛋白切割与指导序列互补的DNA位点，也即靶序列。一般而言，指导序列是与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交、并且指导CRISPR复合物与该靶序列特异性结合的任何多核苷酸序列。指导序列与其相应的靶序列之间的互补程度是约或多于约50％或更多。一般一个指导序列的长度为约或多于约12个核苷酸。骨架序列为指导RNA中必须的，除指导序列之外的其余序列，一般包含tracr序列和tracr配偶序列，这些序列一般不会因为靶序列的变化而改变。该术语包括单链指导RNA(sgRNA)以及由crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(反式激活crRNA)组成的双链指导RNA。
在本申请中，术语“CRISPR干扰”也称为CRISPR interference或CRISPRi，通常是指缺少内切核酸酶活性的Cas蛋白(例如Cas9)，该失活的Cas蛋白(例如Cas9)会产生感兴趣基因的特异性沉默或减少。
在本申请中，术语“siRNA”也可称为siRNA寡核苷酸”、“RNAi寡核苷酸”或“短干扰RNA”，通常是指通过转录后基因剪接而起作用的寡核苷酸，也称为RNA干扰(RNAi)。
在本申请中，术语“shRNA”也可称为短发夹RNA，通常是指人工单链干扰RNA分子，其在茎环或发夹结构中包含“siRNA双链体”的有义链和反义链。
在本申请中，术语“RNA腺苷脱氨酶(ADAR)”通常是指一种可用于RNA编辑的酶，其可将RNA中的腺苷转变为肌苷。
在本申请中，术语“碱基编辑”通常是指在基因组上引起单个碱基改变的基因编辑技术。
在本申请中，术语“互补”通常是指核酸(例如RNA)包含使其能够非共价结合的核苷酸序列(例如，Watson-Crick碱基配对)，在适当的体外和/或体内温度和溶液离子强度条件下，以序列特异性、反平行的方式(即核酸特异性结合互补核酸)“杂交”或“互补”至另一个核酸。如本领域所知，标准的Watson-Crick碱基配对包括：腺嘌呤(A)与胸苷(T)配对，腺 嘌呤(A)与尿嘧啶(U)配对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。
在本申请中，术语“多肽”、“肽”、“蛋白”和“蛋白质”可互换地使用，通常是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物。这些修饰可以包含：二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵(如与标记组分结合)。术语“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换地使用，通常是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、根据连接分析定义的多个座位(一个座位)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、micro-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。多核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。
在本申请中，所述“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，用以将***的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA***细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中，术语“质粒”通常是指细菌、酵母菌等生物中染色体或拟核以外的DNA分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力，使其能够在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒在遗传工程研究中被用作基因的载体。
在本申请中，术语“逆转录病毒载体”通常是指可以可控并表达外源基因，但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。此类病毒多具有反转录酶。反转录病毒至少含有三种基因：gag，包含组成病毒中心和结构的蛋白质的基因；pol，包含反转录酶的基因和env，包含组成病毒外壳的基因。通过逆转录病毒转染，逆转录病毒载体可将自身基因组及其携带的外源基 因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，例如，可将CAR分子整合进宿主细胞中。
在本申请中，术语“慢病毒载体”通常是指属于逆转录病毒的一种二倍体RNA病毒载体。慢病毒载体是以慢病毒的基因组为基础，将其中多个和病毒活性相关的序列结构去除，使其具有生物学的安全性，然后再在这个基因组骨架中引入实验所需要的目标基因的序列和表达结构，并将之制备成载体。通过慢病毒载体转染，逆转录病毒载体可将自身基因组及其携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，例如，可将CAR分子整合进宿主细胞中。
除了本文提到的特定蛋白质和核苷酸之外，本申请还可包括其功能性变体、衍生物、类似物、同源物及其片段。
术语“功能性变体”指与天然存在序列具有基本上同一的氨基酸序列或由基本上同一的核苷酸序列编码并能够具有天然存在序列的一种或多种活性的多肽。在本申请的上下文中，任何给定序列的变体是指其中残基的特定序列(无论是氨基酸或核苷酸残基)已经经过修饰而使得所述多肽或多核苷酸基本上保留至少一种内源功能的序列。可以通过天然存在的蛋白质和/或多核苷酸中存在的至少一个氨基酸残基和/或核苷酸残基的添加、缺失、取代、修饰、替换和/或变异来获得变体序列，只要保持原来的功能活性即可。
在本申请中，术语“衍生物”通常是指本申请的多肽或多核苷酸而言包括自/对序列的一个(或多个)氨基酸残基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失和/或添加，只要所得的多肽或多核苷酸基本上保留其至少一种内源功能。
在本申请中，术语“类似物”通常对多肽或多核苷酸而言，包括多肽或多核苷酸的任何模拟物，即拥有该模拟物模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源功能的化学化合物。
通常，可以进行氨基酸取代，例如至少1个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20个以上)氨基酸取代，只要经修饰的序列基本上保持需要的活性或能力。氨基酸取代可包括使用非天然存在的类似物。
用于本申请的蛋白质或多肽也可以具有氨基酸残基的缺失、***或取代，所述氨基酸残基产生沉默的变化并导致功能上等同的蛋白质。可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进行有意的氨基酸取代，只要保留内源性功能即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且含具有相似亲水性值的不带电极性头基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
在本申请中，术语“同源物”通常是指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的氨基酸序列或核苷酸序列。术语“同源性”可以等同于序列“同一性”。同源序列 可以包括可以与主题序列是至少80％、85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。同源性可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，也可以在序列同一性方面表达同源性。在本申请中，提及的氨基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。
为了确定序列同一性，可进行序列比对，其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行，例如，使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数，包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。
在本申请中，术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项的两项。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
发明详述
一方面，本申请提供了一种制备经修饰的免疫细胞的方法，所述修饰包括以下步骤：a)下调所述免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性，b)上调所述免疫细胞中FasL蛋白的表达和/或活性，使得，与未经所述修饰的免疫细胞相比，所述经修饰的免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性降低或消除，且，所述经修饰的免疫细胞中FasL蛋白的表达和/或活性升高。
下调
在本申请中，所上述方法可包括下调所述免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性。可以有多种方法来下调所述免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性。例如，可以在基因或蛋白水平下调Fas蛋白的表达和/或活性。例如，可以通过改变Fas蛋白的结构和/或序列、编码Fas蛋白基因的转录、翻译和/或Fas蛋白的细胞运输。
在某些情形中，所述方法可包括下调所述免疫细胞中编码Fas蛋白的核酸分子的表达和/或活性。所述下调包括编码Fas蛋白的基因的功能表达在所述免疫细胞中被降低或消除。在某些情形中，可以通过基因敲除、基因敲减、基因突变、基因缺失、基因沉默或前述的任意组合来减少或消除。在某些情形中，可以通过，改变所述免疫细胞的基因组来实现下调效果。
在本申请中，所述免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性可以通过基因敲除来下调。基因敲除是一种遗传技术，通过破坏基因功能使其无效。例如，在核酸中***编码序列，从而破坏基因功能。此外，完整的编码Fas蛋白的基因或其部分可缺失，使得所述经修饰的免疫细胞不表达Fas蛋白或不表达功能性的Fas蛋白。另一可行的方法是向编码Fas蛋白的基因序列中引入一种或多种敲除突变，其提供非功能的或功能更少的表达产物。例如，可以引入一种或多种移码突变，其产生非功能的或功能更少的蛋白。替代或补充地，一个或多个终止密码子能引入编码序列，从而获得截短、非功能或功能更少的Fas蛋白。所述方法还可包括但不限于在编码Fas蛋白的基因的启动子、5'UTR、3'UTR和/或其它调控元件中引入一种或多种突变。实现基因缺失以抑制或消除靶基因功能表达的方法为技术人员熟知，本文在此不做详述。
在某些情形中，编码所述Fas蛋白的基因可通过遗传工程而在功能上敲除。示例包括但不限于基因编辑，如工程核酸酶介导的基因编辑(GEEN)。基因编辑通常是指使用人工工程核酸酶或“分子剪刀”，在基因组内***、取代或移出DNA。所述核酸酶在所需基因组位置产生特异双链断裂(DSB)，利用细胞内源机制通过同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)天然过程修复所诱导的断裂。敲除基因或降低基因的表达水平的方法可包括进行基因敲除、条件性基因敲除法(例如，利用Cre/LoxP和/或FLP-frt***)、诱导性基因敲除法(例如，以Cre/loxp***为基础的敲除，包括四环素诱导、干扰素诱导、激素诱导、腺病毒诱导等)、利用随机***突变进行基因敲除(例如，基因捕获法)、利用RNAi引起的基因敲除、锌指核酸内切酶(zinc finger nucleases，ZFN)介导的基因编辑技术、转录激活子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)介导的基因编辑技术、成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR associated proteins，Cas)(CRISPR/Cas)***介导的基因编辑技术和/或NgAgo-gDNA基因编辑技术。
在某些情形中，所述方法可包括向免疫细胞施用选自下组的一种或多种物质：反义RNA、siRNA、shRNA、CRISPR/Cas***、RNA编辑***如RNA腺苷脱氨酶(ADAR)、RNA指导的核酸内切酶、锌指核酸酶(ZFN)、Mega-TAL核酸酶、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶(Meganuclease)、碱基编辑、CRISPR干扰(CRISPR interference，或CRISPRi)，和，锌指蛋白(Zinc finger)基因阻遏物和/或转录激活子样效应物(TALE)基因阻遏物介导的转录抑制。在本申请中，所述方法可包括向免疫细胞施用使用抑制性蛋白，所述抑制性蛋白可包括能够抑制Fas蛋白活性或功能的物质，例如，Fas蛋白的抑制性配体、 受体、抗体和/或酶。
在本申请中，编码Fas蛋白的核酸序列的外显子的可包括一种或多种突变。在本申请中，编码Fas蛋白的核酸序列的外显子可以被全部或部分删除。所述外显子可包括外显子1-5中任意一个或多个，例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个或5个)。外显子1-5中任意一个或多个的突变或删除可涵盖数种不同的功能剪接变体。
在本申请中，所述Fas蛋白可包括SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。例如，本申请所述Fas蛋白可包含与SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的氨基酸序列
在本申请中，所述编码Fas蛋白的核酸分子可参见NCBI数据库gene ID:355下或Ensembl数据库ENSG00000026103下所示的核苷酸序列。例如，本申请所述编码Fas蛋白的核酸分子可包含与NCBI数据库gene ID:355下或Ensembl数据库ENSG00000026103下所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的核苷酸序列。
在本申请中，所述方法可包括下调所述免疫细胞中T细胞受体(TCR)、T细胞受体α恒定区蛋白、T细胞受体β恒定区蛋白和/或PD-1蛋白的表达和/或活性。
在某些情形中，所述方法可包括靶向所述免疫细胞中编码所述T细胞受体α恒定区蛋白的核酸分子(TRAC)的外显子1-3。
例如，所述T细胞受体α恒定区蛋白可包括如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。例如，所述T细胞受体α恒定区蛋白可包含与SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的氨基酸序列。
在某些情形中，所述方法可包括靶向所述免疫细胞中PD-1蛋白的核酸分子的外显子1-3。
例如，所述PD-1蛋白可包括如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。例如，所述PD-1蛋白可包含与SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的氨基酸序列。
CRISPR***和指导RNA
可以使用CRISPR***下调所述Fas蛋白的表达和/或活性。在本申请中，所述方法包括向所述免疫细胞施用CRISPR/Cas***，所述***可包括RNA组分，有时被称为指导RNA(gRNA)。
本申请所述的指导RNA可包括单链指导RNA(sgRNA)以及由crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(反式激活crRNA)组成的双链指导RNA。在某些实施方式中，指导RNA是由一条crRNA和一条tracrRNA组成的双链结构。CrRNA一般包含指导序列和tracr配偶序列，tracrRNA一般包含tracr序列。在某些实施方式中，指导RNA可以为单链分子，该单链分子可包含指导序列、tracr配偶序列和tracr序列，这个单链分子也称为嵌合型单链指导RNA(sgRNA)。当tracr序列和tracr配偶序列被包含在单个转录物中，这两者之间的杂交产生具有二级结构(如发夹)的转录物。用于在发夹结构中使用的序列可以是环形成序列，例如，在长度上可以为四个核苷酸的序列，例如，用于在发夹结构中使用的序列可具有序列GAAA的序列。也可以使用更长或更短的环序列，例如可替代的序列。在某些情形种，这些序列可以包括三联体(例如，AAA)，以及其他的核苷酸(例如C或G)。环形成序列的实例可包括CAAA和AAAG。在某些情形中，该转录物或转录的多核苷酸序列可以具有至少两个或更多个发夹。在一些具体的情形中，该转录物可具有两个、三个、四个或五个发夹。在另外一些情形中，该转录物可以具有至多五个发夹。在某些情形中，该单个转录物还可包括一种转录终止序列，例如，为一个Poly-U序列，又例如，为六个U的核苷酸序列。
在某些情形中，本申请所述的指导RNA可以与靶核酸互补。在另一些情形中，所述的指导RNA可以与靶核酸相同(当说到相同时，由于编码RNA和DNA的碱基的区别，RNA中的“U”对应于DNA中的胸腺嘧啶“T”)。在另一些情形中，编码所述指导RNA的核酸序列(例如，DNA)可以与靶核酸相同或互补。所述指导RNA可以由编码其的序列进行转录或复制得到，例如，所述指导RNA可通过编码其的DNA序列转录得到。在本申请中，术语“靶核酸”、“靶核酸”和“靶区域”可以互换的使用，通常是指可以被gRNA识别的核酸序列，所述靶核酸可以指双链核酸，也可以指单链核酸。
所述指导RNA可以和靶序列杂交，并与一种或多种Cas蛋白复合，以形成CRISPR复合物。CRISPR复合物的形成导致在该靶序列中或其附近(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、或更多个碱基对之内)的一条链或两条链的切割。tracr序列(其可以包含或其组成为野生型tracr序列的全部或部分(例如野生型tracr序列的约或多于约20、26、32、45、48、54、63、67、85个、或更多个核苷酸))也可以形成CRISPR复合物的一部分，如通 过沿着该tracr序列的至少一部分杂交到与该指导序列可操作地连接的tracr配偶序列的全部或部分上。在某些情形中，该tracr序列与一个tracr配偶序列具有足够的互补性以进行杂交，并参与一种CRISPR复合物的形成。在某些实施方式中，当进行比对时，沿着该tracr配偶序列的长度，该tracr序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％序列互补性。在一些实施方式中，将驱动CRISPR***的一个或多个元件的表达的一个或多个载体引入到宿主细胞中，使得该CRISPR***的这些元件的表达在一个或多个靶位点指导CRISPR复合物的形成。
一般而言，tracr配偶序列包括与tracr序列具有足够互补性以促进CRISPR复合物在靶序列处的形成，其中该CRISPR复合物包含杂交到tracr序列上的tracr配偶序列。通常，互补程度是就tracr配偶序列与tracr序列沿着这两个序列的较短者的长度的最佳比对而言。可以通过任何适合的比对算法来确定最佳比对，并且可以进一步将二级结构造成的影响考虑进来，比如在该tracr序列或tracr配偶序列之内的自我互补性。在进行最佳比对时，在该tracr序列与tracr配偶序列之间沿着这两者的较短者的长度的互补程度是约或多于约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、或更高。该tracr序列在长度上为约或多于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50个、或更多个核苷酸。
在靶序列与指导序列之间的互补杂交促进CRISPR复合物的形成。完全互补性不是必需的，只要存在足够互补性以引起杂交并且促进一种CRISPR复合物的形成即可。CRISPR复合物的靶多核苷酸可以是对真核细胞而言内源或外源的任何多核苷酸。例如，该靶多核苷酸可以是一种驻留在真核细胞的细胞核中的多核苷酸。该靶多核苷酸可以是一个编码基因产物(例如，蛋白质)的序列或一个非编码序列(例如，调节多核苷酸或无用DNA)。不希望被理论所束缚，该靶序列应该与PAM(原型间隔子邻近基序)相关；也就是说，由CRISPR复合物识别的短序列相关。
在一些情形中，指导RNA与靶核酸之间的互补百分比可为至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％，或100％。在一些情形中，指导RNA与靶核酸之间的互补百分比可以为至多约30％、至多约40％、至多约50％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％、至多约95％、至多约97％、至多约98％、至多约99％，或100％。
本申请的方法包括提供靶向免疫细胞基因组的核酸，其可以将相关活性多肽(例如Cas 蛋白)引导至靶核酸内的特定靶序列(例如，编码Fas蛋白的基因)。靶向基因组的核酸可以是RNA。
在本申请中，所述指导RNA可以包含一个可变长度的间隔子序列，该序列在指导RNA序列的5’端具有17-30个核苷酸。在其他情形中，指导RNA可以包含可变长度的间隔区序列，其在指导RNA序列的5’末端具有17-24个核苷酸。例如，所述指导RNA可以包含21个核苷酸的序列。例如，所述指导RNA可以包含20个核苷酸的序列。例如，所述指导RNA可以包含19个核苷酸的序列。例如，所述指导RNA可以包含18个核苷酸的序列。例如，所述指导RNA可以包含17个核苷酸的序列。例如，所述指导RNA可以包含22个核苷酸的序列。例如，所述指导RNA可以包含23个核苷酸的序列。例如，所述指导RNA可以包含24个核苷酸的序列。
在本申请中，所述指导RNA可以是靶向编码Fas蛋白的核酸分子的指导RNA，且所述靶向编码所述Fas蛋白的核酸分子的指导RNA可包含SEQ ID NO:1-15中任一项所示的核苷酸序列。例如，本申请所述靶向编码所述Fas蛋白的核酸分子的指导RNA可包含与SEQ ID NO:1-15中任一项所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的核苷酸序列。
例如，本申请所述靶向编码所述Fas蛋白的核酸分子的指导RNA可包含SEQ ID NO:2-4、7-10和12中任一项所示的核苷酸序列。例如，本申请所述靶向编码所述Fas蛋白的核酸分子的指导RNA可包含与SEQ ID NO:2-4、7-10和12中任一项所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的核苷酸序列。
在本申请中，所述指导RNA可以是靶向免疫细胞中编码T细胞受体α恒定区蛋白的核酸分子(TRAC)的指导RNA，且所述靶向编码T细胞受体α恒定区蛋白的核酸分子(TRAC)的指导RNA可包含SEQ ID NO:31-33中任一项所示的核苷酸序列。例如，本申请所述靶向编码T细胞受体α恒定区蛋白的核酸分子(TRAC)的指导RNA可包含与SEQ ID NO:31-33中任一项所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的核苷酸序列。
在本申请中，所述指导RNA可以是靶向编码PD-1的核酸分子的指导RNA，且所述靶向编码PD-1的核酸分子的指导RNA可包含SEQ ID NO:16-30中任一项所示的核苷酸序列。例 如，本申请所述靶向编码PD-1的核酸分子的指导RNA可包含与SEQ ID NO:16-30中任一项所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的核苷酸序列。
在某些情形中，所述指导RNA可包含骨架序列，骨架序列不影响所述sgRNA对靶序列的识别，因此，骨架序列可以是现有技术中任何可行的序列。骨架序列一般包含tracr配偶序列和tracr序列。骨架序列的结构可参见如文献Nowak et al.Nucleic Acids Research 2016.44:9555-9564中的Figure 1(图1)中A和B，Figure 3(图3)中A、B、C，以及Figure 4(图4)中A、B、C、D、E中所记载的除spacer序列之外的部分。
本申请的骨架序列可以来自PCT申请公布文本WO2019011118A1所记载的骨架序列，例如，可以为SEQ ID NO:34-45中任一项所示的核苷酸序列(列出为5’到3’)，其中小写字体的第一区代表tracr配偶序列，且小写字体的第二区代表tracr序列，并且该最后的poly-U序列代表转录终止子。其中poly-U中U的个数不限于此例所示，可以增加或减少。在某些情形中，poly-U可以被去掉而不影响活性。在某些情形中，可以使用与以下序列相似程度达到约或多于约50％、60％、70％、80％、90％或更高的骨架序列。有些时候，该tracr序列可以是一个与包含该tracr配偶序列的转录物分开的转录物。在某些情形中，嵌合型单链指导RNA(sgRNA)设计可以在同向重复与tracrRNA之间掺入至少12bp的双链体结构。在某些情形中，含有与Cas9蛋白结合的关键的RNA二级结构，但序列被突变、或含有***序列的设计也可以被使用，如已经发表的文献Nowak et al.Nucleic Acids Research 2016.44:9555-9564和Adamson et al.Cell 2016.167:1867-1882所示。
表1 示例性的骨架序列
本申请所述骨架序列可包含SEQ ID NO:34-45中任一项所示的核苷酸序列，例如，所述骨架序列可包含SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述指导RNA可以为靶向编码Fas蛋白的核酸分子的双链指导RNA，其可包含crRNA和tracrRNA。所述靶向编码Fas蛋白的核酸分子的crRNA可包含SEQ ID NO:1-15中任一项所示的核苷酸序列。例如，本申请所述靶向编码Fas蛋白的核酸分子的crRNA可包含与SEQ ID NO:1-15中任一项所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的核苷酸序列。
例如，本申请所述靶向编码所述Fas蛋白的核酸分子的crRNA可包含SEQ ID NO:2-4、7-10和12中任一项所示的核苷酸序列。例如，本申请所述靶向编码所述Fas蛋白的核酸分子的crRNA可包含与SEQ ID NO:2-4、7-10和12中任一项所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的核苷酸序列。
在本申请中，所述指导RNA可以是靶向编码T细胞受体的核酸分子的双链指导RNA，其可包含crRNA和tracrRNA。所述靶向编码T细胞受体的核酸分子的指导RNA可包含SEQ ID NO:31-33中任一项所示的核苷酸序列。例如，本申请所述靶向编码T细胞受体的核酸分子的指导RNA可包含与SEQ ID NO:31-33中任一项所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的核苷酸序列。
在本申请中，所述指导RNA可以是靶向编码PD-1的核酸分子的双链指导RNA，其可包含crRNA和tracrRNA。所述靶向编码PD-1的核酸分子的crRNA可包含SEQ ID NO:16-30中任一项所示的核苷酸序列。例如，本申请所述靶向编码PD-1的核酸分子的crRNA可包含与SEQ ID NO:16-30中任一项所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)序列同一性的核苷酸序列。
在本申请中，所述Cas蛋白、sgRNA和/或tracr配偶序列以及tracrRNA序列可操作地连接到相同的启动子上并且可以表达。在某些情形中，所述Cas酶、sgRNA、和/或tracr配偶序列以及tracrRNA序列可以各自可操作地连接到位于分开的载体上的分开的调节元件上。所述指导RNA和Cas蛋白可以形成CRISPR复合物。
本申请所述用于CRISPR***的指导RNA可以通过化学方法合成，例如，高效液相色谱法。例如，将两个或两个以上的RNA分子连接在一起。长度较长的RNA(例如编码Cas9的RNA)可以通过酶促反应得到。
本申请的指导RNA还可包含修饰(例如，化学修饰)，例如，核苷酸的缺失、***、转位、失活和/或激活。所述修饰可包括引入一个或多个突变(包括单个或多个碱基对改变)、增加发夹的数目、交联、断开具体的核苷酸段以及其他修饰。修饰可以包括包含至少一个非天然存在的核苷酸、或一个经修饰的核苷酸、或其类似物。所述指导RNA可以在核糖、磷酸和/或碱基部分处被修饰。经修饰的指导RNA可以包括2’-O-甲基类似物、2’-脱氧类似物或2’-氟代类似物。可以修饰指导RNA的核酸骨架，例如，可以使用硫代磷酸骨架。还可以使用锁核酸(LNA)或桥联核酸(BNA)。指导RNA中的修饰的实例还可包括但不限于：2-氨基嘌呤、5-溴代-尿苷、假尿苷、肌苷、7-甲基鸟苷。这些修饰可以应用于本申请CRISPR***的任意组分。在某些情形中，可以对RNA组分(例如该指导RNA或嵌合多核苷酸序列)做出这些修饰。例如，所述指导RNA的化学修饰可包括2’-甲氧基和/或3’-硫代磷酸酯修饰。在某些情形中，含有与Cas9蛋白结合的关键的RNA二级结构，但序列被突变、或含有***序列的设计也可以被使用，如已经发表的文献Nowak et al.Nucleic Acids Research 2016.44:9555-9564和Adamson et al.Cell 2016.167:1867-1882所示。
在某些实施方式中，本申请的所述方法可包括向宿主细胞(例如，免疫细胞)施用一种 或多种所述Cas蛋白。
另一方面，本申请提供了一种CRISPR酶。在一些情形中，所述CRISPR酶可以是II型CRISPR***酶。在某些情形中，所述CRISPR酶可以是Cas9蛋白。在某些实施例中，所述Cas9蛋白可以是肺炎链球菌、化脓链球菌或嗜热链球菌Cas9蛋白，并且可包括源自于这些生物体的突变的Cas9蛋白。所述Cas蛋白还可以是一种Cas9蛋白的同系物或直向同源物。本申请所述***可包括所述的Cas蛋白。所述Cas蛋白可以包含任何其他蛋白质，以及任选地在任何两个结构域之间的连接序列。可以融合到Cas蛋白上的蛋白质的实例包括但不限于，表位标签、报告基因、以及具有下列活性的一者或多者的蛋白质结构域：甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录阻抑活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。
本申请的CRISPR***可以通过本领域已知的方法转入免疫细胞，例如：磷酸钙转染、原生质融合、电穿孔、脂质体转染、微注射、病毒感染(如杆状病毒、痘苗病毒、腺病毒和其他病毒)等。例如，可以使用点转的方法将所述CRISPR***(例如，Cas蛋白和/或指导RNA)导入免疫细胞。电转方法请参见文献Schumann et al.PNAS 2015.112:10437-10442。
上调
本申请所述方法还可包括上调所述免疫细胞中FasL蛋白的表达和/或活性。可以有多种方法来上调所述免疫细胞中FasL蛋白的表达和/或活性。上调可表现在，增强或提高FasL蛋白的表达水平或增强或提高FasL蛋白的活性，或两者的组合。可以在基因或蛋白水平上调FasL蛋白的表达和/或活性。例如，可以通过改变FasL蛋白的结构和/或序列、编码Fas蛋白基因的转录、翻译和/或FasL蛋白的细胞运输来提高FasL蛋白的表达和/或活性。
在某些情形中，所述方法可包括上调所述免疫细胞中编码FasL蛋白的核酸分子的表达和/或活性。所述上调包括编码FasL蛋白的基因的功能表达在所述免疫细胞中被增强或提高。在某些情形中，可以通过向所述免疫细胞施用编码FasL蛋白的核酸分子。
在本申请中，所述FasL蛋白可包括胞外结构域。例如，所述FasL蛋白的胞外结构域可包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。例如，所述FasL蛋白的胞外结构域可包含与SEQ ID NO.52所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的氨基酸序列。
在本申请中，所述FasL蛋白可包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。例如，所述FasL蛋白可包含与SEQ ID NO.52所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少 90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的氨基酸序列。
在本申请中，所述FasL蛋白还可以包含铰链区。与天然FasL蛋白的铰链区相比，所述铰链区可以包含较少的蛋白酶切位点。例如，所述铰链区可以是源自FasL以外的跨膜蛋白的铰链区。例如，所述铰链区可以是源自肿瘤坏死因子超家族的铰链区。例如，所述铰链区可以是源自TNFSF10或OX40L的铰链区。
在本申请中，所述FasL蛋白可包括胞内结构域。
在本申请中，所述FasL蛋白可包含如SEQ ID NO:50-51和63-64中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述FasL蛋白可包含与SEQ ID NO.50-51和63-64中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的氨基酸序列。
在本申请中，所述FasL蛋白可包含如SEQ ID NO:50-52和63-64中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述FasL蛋白可包含与SEQ ID NO.50-52和63-64中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的氨基酸序列。
例如，所述编码FasL的核酸分子可包括SEQ ID NO:53-55中任一项所示的核苷酸序列。例如，所述编码FasL的核酸分子可包含与SEQ ID NO.53-55中任一项所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的核苷酸序列。
在某些情形中，所述方法可包括上调所述免疫细胞中编码PD-L1蛋白的核酸分子的表达和/或活性。所述上调包括编码PD-L1蛋白的基因的功能表达在所述免疫细胞中被增强或提高。
在某些情形中，可以通过向所述免疫细胞施用编码PD-L1蛋白的核酸分子。例如，所述PD-L1蛋白可包含全长PD-L1蛋白的胞外域和/或跨膜域。例如，所述PD-L1蛋白可包括如SEQ ID NO:56-57中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述PD-L1蛋白可包括与SEQ ID NO:56-57中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％， 或至少100％)序列同一性的氨基酸序列。
例如，所述编码PD-L1蛋白的核酸分子可包括SEQ ID NO:58所示的核苷酸序列。例如，所述编码PD-L1的核酸分子可包括与SEQ ID NO:58所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的核苷酸序列。
在某些情形中，所述方法可包括上调所述免疫细胞中编码CD24的核酸分子的表达和/或活性。所述上调包括编码CD24的基因的功能表达在所述免疫细胞中被增强或提高。在某些情形中，可以通过向所述免疫细胞施用编码CD24的核酸分子。
例如，所述CD24可包括如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。例如，所述CD24可包括与SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的氨基酸序列。
例如，所述编码CD24的核酸分子可包括SEQ ID NO:60中任一项所示的核苷酸序列。例如，所述编码CD24的核酸分子可包括与SEQ ID NO:60中任一项所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的核苷酸序列。
所述修饰还可包括上调或下调其他可行的免疫相关分子的表达和/或活性水平。所述免疫相关分子包括但不限于，主要组织相容复合体(MHC)(例如，MHC I、MHC II和/或MHC III)、细胞因子(IL2、IL10和/或IL12)和/或免疫检查点抑制剂(例如，CTLA-4、LAG-3、TIM-3和/或TIGIT)。
编码FasL蛋白(或，PD-L1和/或CD24)的核酸分子可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离，或所述核酸分子可以被合成生产以获得。
本申请也提供了包含所述FasL蛋白的核酸分子的载体。简单概括，通常可通过可操作地连接编码目的多肽或其部分的核酸(例如，FasL、PD-L1和/或CD24)至启动子下游，并将构建体并入表达载体，实现编码目的多肽的天然或合成核酸的表达。该载体可以是在真核细胞中适于复制和整合的。典型的载体可包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本申请所述核酸分子也可被连接至许多类型的载体。例如，该核酸可被连接至，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体、病毒和/或粘粒。特定的感兴趣载体可包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
可以将病毒载体直接给予至患者(体内)或可以通过间接的形式，例如，在体外使用病毒处理细胞，然后将处理过的细胞给予至患者(离体)。病毒载体技术在本领域中是公知的，并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。常规的基于病毒的***可以包括用于基因转移的逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及单纯疱疹病毒载体。在某些情形中，可以用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒的方法将基因转移整合进宿主基因组中，使***的基因长期表达。慢病毒载体是能够转导或感染非***细胞并典型地产生较高病毒效价的逆转录病毒载体。慢病毒载体可包含长末端重复序列5’LTR和截短的3’LTR、RRE、rev应答元件(cPPT)、中央终止序列(CTS)和/或翻译后调控元件(WPRE)。
本申请的方法可包括向免疫效应细胞中引入本申请所述的载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述免疫效应细胞中，例如T淋巴细胞、B细胞、巨噬细胞或天然杀伤(NK)细胞。在某些实施方式中，每种或每个细胞可包含一个或一种本申请所述的载体。在某些实施方式中，每种或每个细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述细胞中。例如，可以通过逆转录病毒载体进行转染免疫效应细胞，将带有编码所述融合蛋白核酸的病毒基因组能整合到宿主基因组，保证目的基因长期、稳定地表达。又例如，利用转座子，通过携带编码所述融合蛋白的核酸的质粒和携带转座酶的质粒导入到靶细胞中。在本申请中，可通过本领域已知的方法将本申请所述的带有编码所述融合蛋白的核酸的载体引入所述细胞中，非限制性的实例包括病毒转导、电穿孔转染、脂质体递送、聚合物载体、化学载体、脂质复合物、聚合复合物、树枝状聚合物、纳米粒子、乳剂、天然内吞或吞噬途径、细胞穿透肽、显微注射法、微针递送法、粒子轰击法等。
例如，可采用电穿孔转染法，可以使用的电传孔仪器的非限制性实例包括：Neon转染***(Thermo Fisher Scientific)、Gemini仪器和AgilePulse/CytoPulse仪器(BTX-Harvard apparatus)、4D-Nucleofector***、Amaxa Nucleofector II、Nucleofector 20 2b仪器(Lonza)、CTX-1500A仪器(Celetrix)、MaxCyte GT或VLX仪器(MaxCyte)、Gene Pulser Xcell(Biorad)。在厂商的指导的基础上，可修改脉冲持续时间、强度，脉冲之间的间隔，脉冲次数，已达到高转染 效率而低死亡率的最佳条件。
在本申请中，首先，通过步骤a)下调所述免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性，所述下调可以使用本领域任何可行的方法如上文提到的那些方法进行。
然后，在步骤a)下调所述免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性成功之后，可以进行步骤b)。所述下调成功可以包括，与经所述步骤a)前的免疫细胞相比，经过所述步骤a)的该免疫细胞中Fas蛋白的活性或水平降低至少50％(例如，至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或降低更多)。例如，在进行所述步骤a)前或进行所述步骤a)的过程中，免疫细胞的Fas蛋白的表达和/或活性为100％，一定时间后，当该免疫细胞中Fas的表达和/或活性逐渐降低至起始阶段的50％时，此时可认为步骤a)的下调成功，可以进行步骤b)。例如，进行步骤a)之后，可以通过检测免疫细胞中的Fas蛋白的含量和/或活性、Fas基因含量和/或活性、Fas基因的转录程度(如，mRNA的含量)等判断Fas蛋白相对于进行步骤a)之前活性或水平下降的程度。
可以通过多种方法检测基因或蛋白质的表达水平，包括在核酸水平的方法(包括通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)或通过Southern印迹、原位杂交的mRNA定量、二代测序)和在蛋白质水平的方法(包括免疫荧光标记并用流式细胞术分析、组织化学、免疫印迹分析和体外结合研究)。此外，可以通过本领域技术人员众所周知的ELISA技术来定量蛋白的表达水平。可以使用许多标准分析来完成定量测量。例如，可使用RT-PCR和包括RNA酶保护、Southern印迹分析、RNA斑点(RNAdot)分析在内的杂交方法测量转录水平。也可以使用免疫组织化学染色和流式细胞检测、Western印迹分析来评估是否存在Fas蛋白和/或Fas基因，以及存在多少Fas蛋白和/或Fas基因。
在本申请中，当使用基因编辑(例如，施用CRISPR/Cas***)进行下调时，可以在基因编辑发生以后进行步骤b)。可以通过多种方法判断基因编辑是否成功，例如，包括但不限于，免疫荧光标记所编辑基因编码的蛋白并用流式细胞术分析、二代测序(NGS)、琼脂糖凝胶进行基因组编辑检测、毛细管电泳进行基因编辑检测、TIDE分析方法(利用gRNA序列以及未修饰和已编辑DNA的扩增子测序数据来确定不同indel长度的曲线对混合曲线的贡献度)或数字PCR(dPCR)。例如，当通过本领域的技术手段检测到目的基因被敲除后，可进行步骤b)。
在本申请中，所述步骤b)在所述步骤a)至少6小时后(例如，之后6小时、8小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、1周、2周或更久后)进行。
在本申请中，所述方法可包括a)下调所述免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性，b)上调所述免疫细胞中FasL蛋白的表达和/或活性。在某些情形中，所述步骤b)在实施所述步骤a)之后(例如，之后6小时、8小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、1周、2周或更久后进行)实施。
修饰的免疫细胞
另一方面，本申请提供了一种经修饰的免疫细胞。所述免疫细胞可包括T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。在某些情形中，所述免疫细胞可包括T淋巴细胞。所述T淋巴细胞可包括胸腺细胞、天然T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化的T淋巴细胞。所述T细胞可以是辅助T细胞(Th)，例如辅助T细胞1(Th1)或辅助T细胞2(Th2)细胞。所述T淋巴细胞可以是CD4+辅助T细胞(HTL；CD4
+T细胞)、细胞毒性T细胞(CTL；CD8
+T细胞)、肿瘤浸润细胞毒性T细胞(TIL；CD8
+T细胞)、CD4+/CD8
+T细胞、CD4-/CD8
-T细胞或任何其他T淋巴细胞亚型。在某些情形中，所述经修饰的T细胞是人类T细胞。
在某些情形中，所述免疫细胞可包括B细胞。在某些情形中，所述B细胞可包括效应B细胞(浆细胞)、记忆B细胞。所述B细胞可包括B2细胞、B1细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、调节性B细胞。在某些情形中，所述免疫细胞可包括巨噬细胞。所述B细胞可包括I型巨噬细胞(M1)、II型巨噬细胞(如M2a、M2B、M2c)。在某些情形中，所述免疫细胞可包括NK细胞。在某些情形中，所述NK细胞可包括CD56bright和CD56dim。在某些情形中，所述NK细胞可包括NK1和NK2。在某些情形中，所述NK细胞可包括A-NK和NA-NK。
所述免疫细胞中的T细胞受体、T细胞受体α恒定区蛋白和/或T细胞受体β恒定区蛋白的表达和/或活性下调。在本申请中，下调T细胞受体、T细胞受体α恒定区蛋白和/或T细胞受体β恒定区蛋白的表达和/或活性的操作可以在步骤a)之前、同时或之后进行，也可以在步骤b)之前、同时或之后进行。在某些情形中，所述下调可包括下调编码所述T细胞受体、T细胞受体α恒定区蛋白和/或T细胞受体β恒定区蛋白的核酸分子的表达和/或活性；和/或，包括下调所述T细胞受体、T细胞受体α恒定区蛋白和/或T细胞受体β恒定区蛋白的表达和/或活性。
本申请的经修饰的免疫细胞可以在任何修饰步骤之前或之后被活化和扩增。免疫细胞可以在体外或体内扩增。通常，本申请的免疫细胞可以例如通过与刺激CD3-TCR复合物和免疫细胞表面上的共刺激分子以产生免疫细胞活化信号的试剂接触来扩增。例如，在适合于刺激 免疫细胞增殖的条件下，免疫细胞群可与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。适用于免疫细胞培养的条件包括可能含有增殖和活力所必需的因子的合适培养基细胞可以保持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和环境(例如，空气加5％CO
2)。
本申请所述经修饰的免疫细胞，与未经所述修饰的免疫细胞相比，所述经修饰的免疫细胞中的Fas蛋白的表达和/或降低或消除，且FasL蛋白的表达和/或活性升高。
使用本申请所述的方法得到的经修饰的免疫细胞可以具有好的扩增效率。例如，与采用首先进行步骤b)，之后进行步骤a)的方法得到的经修饰的免疫细胞相比，使用本申请所述的方法得到的经修饰的免疫细胞的扩增效率可以增加至少20％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％或更高)。例如，可使用流式细胞检测所述免疫细胞的扩增效率。
使用本申请所述的方法得到的经修饰的免疫细胞中的Fas蛋白可以具有好的敲除效率。例如，与采用首先进行步骤b)，之后进行步骤a)的方法得到的经修饰的免疫细胞相比，使用本申请所述的方法得到的经修饰的免疫细胞中的Fas蛋白的敲除效率可以增加至少10％(例如，至少10％，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％或更高)。例如，可使用流式细胞检测Fas蛋白的敲除效率。
在本申请中，所述经修饰的免疫细胞具有与未经所述修饰的免疫细胞相当或更高的扩增能力和类似或更高的免疫特性，和抗肿瘤活性，尤其是抑制或杀伤瘤细胞的活性。
本申请中，所述免疫细胞可以是敲除了T细胞受体(TCR)的通用型T细胞，或者所述T细胞可以是包含嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(CAR-T细胞)。
在扩增和遗传修饰本申请的细胞之前，可以通过各种非限制性方法从受试者，例如患者，获得细胞来源。免疫细胞可以获自许多非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在某些情形中，可以使用本领域技术人员可利用的和已知的任何数量的免疫细胞系。在另一些情形中，所述细胞可以源自健康供体、源自确诊患有癌症的患者或获自确诊感染的患者。在另一些情形中，所述细胞是存在不同表型特性的细胞的混合群体的一部分。在某些情形中，所述免疫细胞可以是衍生自对象的自体细胞。如本文所用，“自体”通常是指用于治疗对象的细胞、细胞系或细胞群源自所述对象。在某些情形中，所述免疫细胞可以衍生自异体细胞，例如源自与所述对象人类白细胞抗原(HLA)相容的供体。可以使用标准方案将来自供体的细胞转化为非同种异体反应性细胞，并根据需要进行复制，从而产生可以施用至一个或多个患者的细胞。
另一方面，本申请提供了一种细胞群，所述细胞群可包含所述的免疫细胞，且所述细胞群中至少20％(例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多)的免疫细胞基本上不表达Fas蛋白。基本上不表达可以指，与未经所述修饰的免疫细胞相比，所述经修饰的免疫细胞中Fas蛋白的表达程度降低至少约50％(例如，约50％、约60％、约70％、约80％、约90％，或99％或更多)，或者，施用本领域常规技术检测不到所述Fas蛋白的表达。
在本申请中，所述细胞群中至少15％(例如，至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多)的免疫细胞基本上不表达PD-1蛋白。基本上不表达可以指，与未经所述修饰的免疫细胞相比，所述经下调PD-1修饰的免疫细胞中，PD-1蛋白的表达程度降低至少约50％(例如，约50％、约60％、约70％、约80％、约90％，或99％或更多)，或者，施用本领域常规技术检测不到所述PD-1蛋白的表达。
在本申请中，所述细胞群中至少5％(例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多)的免疫细胞过表达FasL蛋白。
在本申请中，所述细胞群中至少5％(例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多)的免疫细胞过表达PD-L1蛋白。
在本申请中，所述细胞群中至少5％(例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多)的免疫细胞过表达CD24蛋白。
过表达可以指，与未经所述修饰的免疫细胞相比，所述经修饰的免疫细胞中蛋白的表达程度提高至少约10％(例如，约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％，或99％或更多)。
药物组合物和用途
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含所述的免疫细胞和/或所述的细胞群，以及药学上可接受的载体。
本申请所述的“药学上可接受的载体”可包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介 质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在某些情形中，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。所述“有效量”通常是指施用于受试者之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或细胞的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
所述方法还进一步包括给所述受试者施用放疗和/或化疗和/或另外的肿瘤靶向药物(例如靶向其它抗原的抗体或小分子化合物)。
例如，“有效量”的本本身的细胞或药物组合物导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。在实际应用中，本申请的药物组合物中细胞的剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本申请免疫细胞和/或药物组合物的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的***速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。
另一方面，本申请提供了所述的免疫细胞、所述的细胞群和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于***。
本申请还提供一种用于***的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用治疗有效量的所述经修饰的免疫细胞、细胞群和/或所述药物组合物。
本申请还提供一种异体细胞移植的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用治疗有效量的所述经修饰的免疫细胞、细胞群和/或所述药物组合物。所述方法可以降低受试者体内免疫***对输入的异体细胞的杀伤。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的经修饰的免疫细胞、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1 分离和激活人原代T细胞
将人外周血单个核细胞(PBMCs，购自上海妙顺生物)稀释到2×10
6/ml，按照细胞与磁珠1:3的比例使用抗人的CD3/CD28磁珠(Thermo Fisher Scientific)激活T细胞。
实施例2 设计并制备gRNA
根据Fas的基因序列设计了15个指导RNA(gRNA)的spacer(核酸序列分别为SEQ ID NO:1-15)，并合成了包含这些序列和gRNA骨架序列(SEQ ID NO:35)的PCR引物。PCR扩增合成转录模板，反应体系为20μl，如下表2，反应条件如下表3。合成指导RNA1至指导RNA20(分别称为gRNA1至gRNA20)。
表2 PCR反应体系
| 试剂 | 体积(μl) |
| Q5 hot start HF 2X mix | 10 |
| 正向引物(10μM)：sgRNA引物 | 1 |
| 反向引物(10μM)：通用引物 | 1 |
| ddH 2O | 8 |
表3 PCR反应条件
然后进行gRNA体外转录，反应体系为20μl，见表4。加入试剂在冰上操作，然后37℃反应2-4h，结束后加入1μl的DNAase酶，在37℃反应15min。具体操作步骤可参见PCT专利申请公布文本WO2019011118A1。
表4 转录反应体系
| 试剂 | 体积(μl) |
| 上一步的PCR产物 | 8 |
| 转录buffer | 10 |
| T7转录酶 | 2 |
接下来纯化gRNA，将磁珠(Beckman，A63987)从冰箱取出后上下颠倒8-10次，并且多次震荡，直到所有磁珠都充分悬浮。然后按照1:1.8倍体积在gRNA产物中加入磁珠，并在 室温下孵育5-10分钟。孵育后放置在磁性分离器上2分钟，吸出上清液，将EP管继续留在磁性分离器上。在每管中加入200μl 80％的乙醇清洗，无需震荡并保持EP管在磁性分离器上，吸出上清液，重复此步骤一次，最后尽可能吸尽上清液。室温下风干5分钟后加入100μl RNAase free水混匀，室温下静置2-5分钟，将EP管放在磁性分离器上1-2分钟直到磁珠被磁铁吸附，将带有gRNA的上清液转移到新的EP管中。最后使用Nanodrop根据操作说明测定纯化的gRNA浓度。
实施例3 制备敲除Fas的T细胞
将激活的T细胞去除磁珠后，使用CRISPR/Cas9电转敲除T细胞中的Fas。细胞处理操作流程参考专利WO2019011118A1进行。简而言之，用实施例2中的gRNA与从IDT购买的Cas9蛋白在Neon试剂盒(Thermo，MPK1096)提供的T缓冲液中混合，室温孵育5到10分钟，然后按照厂家提供的T细胞电转指南与重悬在T缓冲液的数量为0.2×10
6/ml的6μl T细胞混合，在Neon的10μl移液器枪头中进行电转。电转方法请参见文献Schumann et al.PNAS 2015.112:10437-10442。
将电转后的T细胞放置于37摄氏度、5％CO
2的细胞培养箱中48小时后，摇晃并收取悬浮细胞，用识别Fas的抗体对细胞进行染色，并用流式细胞仪(Beckman Coulter CytoFLEX)进行分析。
图1和表5为gRNA剪切效率结果。结果显示，所有指导RNA均能剪切Fas，且其中SEQ ID NO:2-4、7-10和12的敲除效率均大于30％。后续实验均采用敲除效率大于30％的gRNA进行。
表5 Fas gRNA的敲除效率
实施例4 表达FasL的慢病毒包装
用全合成的方法得到慢病毒载体质粒pELPs(序列参考专利US9499629B2中的Sequence1)，合成FasL及截短序列FasLF。其中，FasL的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示，编码FasL的核苷酸序列如SEQ ID NO:53所示，FasLF的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示，编码FasL的核苷酸序列如SEQ ID NO:54所示。
其中，FasL序列参考GenBank ID AY225406.1，但突变了第376个-第390个核酸序列，改变了相应氨基酸序列，使之不会被分泌至细胞外环境。
将编码FasL及FasLF的核酸连接到pELPs中EF-1α启动子下游，得到质粒pELPs-FasL及pELPs-FasLF，并进行慢病毒包装。
实施例5 Fas敲除和/或转染病毒
用表6所示条件，分别处理PBMC细胞，将冻存的PBMC复苏的时间记为第0天，使用实施例3的方法敲除T细胞的Fas或使用实施例4的病毒将FasL转入细胞。在进行Fas敲除以及加入表达FasL或FasLF的病毒的处理后，将细胞放置于37摄氏度，5％CO
2的细胞培养箱中继续培养，第3天及第6天时用识别Fas、FasL的抗体染色并用流式细胞仪(Beckman Coulter CytoFLEX)检测细胞生长情况及Fas敲除效率、FasL表达效率。
表6 处理条件
结果如图2、3所示，如果先加入包含编码FasL/FasLF的核酸分子的病毒，再敲除Fas(条件1-2)，则细胞扩增效率低，Fas敲除效果较差。而先敲除Fas，再表达FasL/FasLF(条件3-4)，能制备出Fas敲除效果好，扩增效率更高的表达FasL/FasLF的T细胞。
实施例6 表达FasL的T细胞对异体T细胞的杀伤有抵抗作用
为证明表达FasL/FasLF的T细胞可以抵抗异体T细胞杀伤，本实施例采用体外细胞混合培养的方法，对比表达或不表达FasL/FasLF的细胞在异体T细胞存在的情况下的细胞数量变化趋势。
(1)按照实施例5的条件3制备表达FasLF的T细胞，在细胞复苏时激活T细胞，第3天电转Cas9/gRNA的步骤中同时加入了靶向Fas和TRAC的gRNA，以达到同时敲除Fas和TCR的目的。其中，靶向TRAC的gRNA序列如SEQ ID NO:31-33所示。然后在第4天加入表达FasL/FasLF的病毒。
为了尽量保证实验结果反映的是敲除了TCR的靶细胞被异体T细胞细胞杀伤的效果，用MACS磁珠分选的方法去除靶细胞中CD3阳性的细胞，缺失了TCR的T细胞不能被异体的效应细胞激活导致扩增。
(2)然后制备来自与表达FasLF的T细胞相同来源(供体1)及不同来源(供体2)的T细胞：将用CD3/CD28磁珠激活的PBMC培养10天后用MACS磁珠分选的方法去除CD56阳性的细胞，排除NK细胞的干扰。
(3)按照表7所示，分别将按照步骤(2)制备的不同来源的效应细胞与来自步骤(1)的来自供体1的靶细胞按照5:1的比例混合，其中组1、2为空白对照组，将靶细胞单独培养。并在混合后当天(第0天)、第2天、第4天、第6天分别对效应细胞和靶细胞进行计数。
表7 混合条件
| 组别 | 效应细胞 | 靶细胞 |
| 1 | 无 | 供体1(敲除TCR) |
| 2 | 无 | 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasLF) |
| 3 | 供体1 | 供体1(敲除TCR) |
| 4 | 供体1 | 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasLF) |
| 5 | 供体2 | 供体1(敲除TCR) |
| 6 | 供体2 | 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasLF) |
然后用识别Fas、FasL、CD3的抗体对细胞进行染色，并用流式细胞仪(Beckman Coulter CytoFLEX)进行分析。由于靶细胞为CD3阴性，而效应细胞中98％以上为CD3阳性，因此可以用CD3染色来区分靶细胞群和效应细胞群，并分别对两群细胞进行计数，再通过体积换算为每个样品孔中效靶细胞的总细胞数。统计细胞扩增倍数时，将第0天的细胞数设为1倍，其余时间点的总细胞数与第0天的细胞数相除得到细胞扩增倍数。
结果显示，在第6天时，可以比较明显地看出各组样品中靶细胞扩增倍数的区别(图4)。在单独培养的对照组1、2中(图5中的对照组A)，扩增倍数区别不大，2扩增稍快于1，证明敲除Fas并表达FasLF的处理不会影响细胞生长。在与自体细胞共培养的对照组3、4中(即图5的对照组B)，细胞生长状况差别也不大。但在与异体细胞共培养的实验组5、6中(即图5的实验组)，没有敲除Fas、表达FasLF的实验组5表现出明显的扩增缓慢，而敲除Fas、表达FasLF的实验组6仍然正常扩增。实验证明敲除Fas、表达FasL的T细胞在与异 体T细胞共同培养时可以抵抗异体T细胞的杀伤。
实施例7 表达FasL及PDL1/CD24的T细胞对异体PBMC的杀伤有抵抗作用
为证明同时表达FasL和PDL1，或FasL和CD24，或FasL和PDL1、CD24的T细胞可以抵抗异体PBMC细胞的杀伤作用，本实施例采用体外细胞混合培养的方法，对比不表达外源蛋白，以及表达FasL、PDL1、CD24的细胞在异体PBMC细胞存在的情况下的细胞数量变化趋势。在本实施例中均使用截短的蛋白进行实验。此外，本实验还敲除了PD-1。
(1)PD-1 gRNA筛选：根据PD-1的基因序列设计并合成了15个gRNA(核酸序列分别为SEQ ID NO:16-30)，将gRNA分别与Cas9蛋白混合后，对Jurkat细胞进行电转。将Jurkat细胞培养24小时后，在培养基中加入anti-CD3抗体，培养30小时后检测PD-1的表达情况，结果如表8所示，所有gRNA均能成功敲除PD-1。
表8 PD-1 gRNA的敲除效率
(2)构建同时表达FasLF+PDL1F、FasLF+CD24、FasLF+PDL1F+CD24的慢病毒载体并包装慢病毒：在实施例4的基础上，合成P2A-PDL1F(SEQ ID NO:61)，P2A-CD24(SEQ ID NO:62)，用Gibson同源重组的方法将基因片段构建到质粒pELPs-FasLF上，得到慢病毒载体pELPs-FasLF-P2A-PDL1F和pELPs-FasLF-P2A-CD24。另外合成CD24-P2A-PDL1F-IRES-FasLF(SEQ ID NO:47)，用限制性内切酶同时处理质粒pELPs和基因片段，将合成的基因片段连接到pELPs中EF-1α启动子下游，得到慢病毒载体pELPs-CD24-P2A-PDL1F-IRES-FasLF。用所得到的慢病毒载体分别进行慢病毒包装。
(3)制备表达FasLF，FasLF+PDL1F，FasLF+CD24，FasLF+PDL1F+CD24的T细胞： 采用实施例5中的条件3，在加入慢病毒时对应样品分别加入包含编码FasLF的核酸分子的慢病毒及步骤(2)中得到的三种慢病毒。
(4)按照表9所示，将按照步骤(3)制备的靶细胞用CellTrace颜料染色。将不同来源的PBMC和靶细胞按20:1的比例混合，并在混合后当天(第0天)、第2天、第4天、第6天分别对效应细胞和靶细胞进行计数。
表9 混合条件
| 组别 | 效应细胞 | 靶细胞 |
| 1 | 无 | 供体1(敲除TCR) |
| 2 | 无 | 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasLF) |
| 3 | 无 | 供体1(敲除TCR、Fas、PD-1，表达FasLF+PDL1F) |
| 4 | 无 | 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasLF+CD24) |
| 5 | 无 | 供体1(敲除TCR、Fas、PD-1，表达FasLF+PDL1F+CD24) |
| 6 | 供体1 | 供体1(敲除TCR) |
| 7 | 供体1 | 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasLF) |
| 8 | 供体1 | 供体1(敲除TCR、Fas、PD-1，表达FasLF+PDL1F) |
| 9 | 供体1 | 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasLF+CD24) |
| 10 | 供体1 | 供体1(敲除TCR、Fas、PD-1，表达FasLF+PDL1F+CD24) |
| 11 | 供体2 | 供体1(敲除TCR) |
| 12 | 供体2 | 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasLF) |
| 13 | 供体2 | 供体1(敲除TCR、Fas、PD-1，表达FasLF+PDL1F) |
| 14 | 供体2 | 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasLF+CD24) |
| 15 | 供体2 | 供体1(敲除TCR、Fas、PD-1，表达FasLF+PDL1F+CD24) |
| 16 | 供体3 | 供体1(敲除TCR) |
| 17 | 供体3 | 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasLF) |
| 18 | 供体3 | 供体1(敲除TCR、Fas、PD-1，表达FasLF+PDL1F) |
| 19 | 供体3 | 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasLF+CD24) |
| 20 | 供体3 | 供体1(敲除TCR、Fas、PD-1，表达FasLF+PDL1F+CD24) |
用识别CD3、Fas、FasL、PD-1、PDL1、CD24的抗体对细胞进行染色，并用流式细胞仪(Beckman Coulter CytoFLEX)进行分析靶细胞的扩增倍数，作为检测抵抗杀伤能力的指标。靶细胞可用CellTrace染料与效应细胞PBMC区分。
如表10所示，FasLF对PBMC细胞杀伤有一定抵抗作用，这种抵抗作用在同时有PDL1F或CD24表达时更强，而同时表达FasLF、PDL1F及CD24三种蛋白时，抵抗PBMC杀伤的效果好，这三种蛋白在抵抗PBMC杀伤的功能上有协同作用。
表10 抵抗PBMC杀伤能力
| 靶细胞 | 抵抗PBMC杀伤能力 |
| 供体1(敲除TCR) | -- |
| 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasLF) | + |
| 供体1(敲除TCR、Fas、PD-1，表达FasLF+PDL1F) | ++ |
| 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasLF+CD24) | ++ |
| 供体1(敲除TCR、Fas、PD-1，表达FasLF+PDL1F+CD24) | +++ |
实施例8 FasL铰链区进行了替换的变体同样对异体T细胞的杀伤有抵抗作用
对FasL铰链区进行了替换得到两个FasL变体FasL-M1(氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示)和FasL-M2(氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示)，胞外区不变。按照实施例4和实施例5的方法进行慢病毒包装，转染T细胞。如图6所示，FasL-M1及FasL-M2均可在T细胞中表达。
然后按照实施例6，采用体外细胞混合培养的方法，对比表达FasL、FasL-M1、FasL-M2与不表达外源蛋白的T细胞在异体T细胞存在的情况下的细胞数量变化趋势。
(1)按照实施例6(1)的方法用来自供体1的T细胞制备对照组T细胞及表达FasL、FasL-M1、FasL-M2的T细胞，并用MACS分选出CD3阴性的细胞。
(2)按照实施例6(2)的方法制备与(1)中所用T细胞不同来源(供体2)的T细胞，用MACS分选的方法去除CD56阳性的细胞。
(3)按照表11所示，将(2)中的效应T细胞与(1)中的靶细胞按照5：1的比例混合。
表11 混合条件
| 组别 | 效应细胞 | 靶细胞 |
| 1 | 无 | 供体1(敲除TCR、Fas) |
| 2 | 无 | 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasLF) |
| 3 | 无 | 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasL-M1) |
| 4 | 无 | 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasL-M2) |
| 5 | 供体2 | 供体1(敲除TCR、Fas) |
| 6 | 供体2 | 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasLF) |
| 7 | 供体2 | 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasL-M1) |
| 8 | 供体2 | 供体1(敲除TCR、Fas，表达FasL-M2) |
然后用识别Fas、FasL、CD3的抗体对细胞进行染色，并用流式细胞仪(Beckman Coulter CytoFLEX)进行分析。由于靶细胞为CD3阴性，而效应细胞中98％以上为CD3阳性，因此可以用CD3染色来区分靶细胞群和效应细胞群，并分别对两群细胞进行计数，再通过体积换算为每个样品孔中效靶细胞的总细胞数。统计细胞扩增倍数时，将第0天的细胞数设为1倍，其余时间点的总细胞数与第0天的细胞数相除得到细胞扩增倍数。
如图7，在单独培养的组1-4中，靶细胞正常扩增，4组细胞扩增倍数相似。而在与异体T细胞共培养的组5-8中，组5扩增明显较差，组6-8扩增情况相似。可见FasL及变体FasL-M1、FasL-M2均可对异体T细胞杀伤起到保护作用，使表达了FasL、FasL-M1、FasLF-M2的T细胞在异体T细胞的杀伤作用下存活更多。
Claims (66)
- 制备经修饰的免疫细胞的方法，所述修饰包括以下步骤.a)下调所述免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性，b)上调所述免疫细胞中FasL蛋白的表达和/或活性，使得，与未经所述修饰的免疫细胞相比，所述经修饰的免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性降低或消除，且，所述经修饰的免疫细胞中FasL蛋白的表达和/或活性升高。
- 根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤a)包括下调所述免疫细胞中编码Fas蛋白的核酸分子的表达和/或活性。
- 根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述步骤a)的所述下调包括通过基因敲除(knock out)、基因敲减(knock down)、基因突变、基因缺失、基因沉默或上述的任意组合来下调。
- 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述步骤a)的所述下调包括向所述免疫细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA、CRISPR/Cas***、RNA编辑***如RNA腺苷脱氨酶(ADAR)、RNA指导的核酸内切酶、锌指核酸酶(ZFN)、Mega-TAL核酸酶、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶(Meganuclease)、碱基编辑、CRISPR干扰，和，锌指蛋白(Zinc finger)基因阻遏物和/或转录激活子样效应物(TALE)基因阻遏物介导的转录抑制。
- 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述步骤a)包括向所述免疫细胞施用靶向编码Fas蛋白的核酸分子的指导RNA。
- 根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述步骤a)包括靶向所述免疫细胞中编码Fas蛋白的核酸分子的外显子1-5中的任意一个或多个。
- 根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述Fas蛋白包括SEQ ID NO:46示的氨基酸序列。
- 根据权利要求2-7中任一项所述的方法，其中所述编码Fas蛋白的核酸分子包括NCBI数据库gene ID:355下或Ensembl数据库ENSG00000026103下所示的核苷酸序列。
- 根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其中所述靶向编码Fas蛋白的核酸分子的指导RNA包含如SEQ ID NO:1-15中任一项所示的核苷酸序列。
- 根据权利要求5-9中任一项所述的方法，其中所述靶向编码Fas蛋白的核酸分子的指导RNA为单链指导RNA。
- 根据权利要求5-10中任一项所述的方法，其中所述靶向编码Fas蛋白的核酸分子的指导RNA为包含crRNA和tracrRNA的双链指导RNA。
- 根据权利要求11所述的方法，其中所述crRNA包含如SEQ ID NO:1-15中任一项所示的核苷酸序列。
- 根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其包括下调所述免疫细胞中T细胞受体(TCR)复合物、T细胞受体α恒定区蛋白、T细胞受体β恒定区蛋白、CD3-epsilon、CD3-gamma、CD3-delta、CD3-zeta、CD3-eta、和/或PD-1蛋白的表达和/或活性。
- 根据权利要求13所述的方法，其包括下调编码所述TCR复合物、T细胞受体α恒定区蛋白、T细胞受体β恒定区蛋白、CD3-epsilon、CD3-gamma、CD3-delta、CD3-zeta、CD3-eta、和/或所述PD-1蛋白的核酸分子的表达和/或活性。
- 根据权利要求13-14中任一项所述的方法，其包括向所述免疫细胞施用靶向编码所述T细胞受体α恒定区蛋白的核酸分子(TRAC)的指导RNA。
- 权利要求15所述的方法，其包括靶向所述免疫细胞中编码所述T细胞受体α恒定区蛋白的核酸分子(TRAC)的外显子1-3。
- 根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中所述T细胞受体α恒定区蛋白包括如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述靶向编码所述T细胞受体α恒定区蛋白的核酸分子(TRAC)的指导RNA包含如SEQ ID NO:31-33所示的核苷酸序列。
- 根据权利要求13-18中任一项所述的方法，其包括向所述免疫细胞施用靶向编码所述PD-1蛋白的核酸分子的指导RNA。
- 权利要求19所述的方法，其包括靶向所述免疫细胞中编码所述PD-1蛋白的核酸分子的外显子1-3。
- 根据权利要求13-20中任一项所述的方法，其中所述PD-1蛋白包括SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述靶向所述PD-1蛋白的核酸分子的指导RNA包含如SEQ ID NO:16-30中任一项所示的核苷酸序列。
- 根据权利要求5-22中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含化学修饰。
- 根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其包括向所述免疫细胞施用Cas蛋白。
- 根据权利要求24所述的方法，其中所述Cas蛋白为Cas9蛋白。
- 根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述步骤b)包括上调所述免疫细胞中编码FasL蛋白的核酸分子的表达和/或活性。
- 根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述步骤b)包括向所述免疫细胞施用编码FasL蛋白的核酸分子。
- 根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其包括向所述免疫细胞施用包含编码FasL蛋白的核酸分子的载体。
- 根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述FasL蛋白包括胞外结构域。
- 根据权利要求29所述的方法，其中所述FasL蛋白的胞外结构域包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述FasL蛋白包括铰链区。
- 根据权利要求31所述的方法，其中所述铰链区源自肿瘤坏死因子超家族。
- 根据权利要求31-32中任一项所述的方法，其中所述铰链区源自FasL、TNFSF10或OX40L。
- 根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述FasL蛋白包括胞内结构域。
- 根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述FasL蛋白包括如SEQ ID NO:50-52和63-64中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求26-35中任一项所述的方法，其中所述编码FasL蛋白的核酸分子包括如SEQ ID NO:53-55中任一项所示的核苷酸序列。
- 根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其还包括上调所述免疫细胞中的PD-L1蛋白和/或CD24蛋白的表达和/或活性。
- 根据权利要求37所述的方法，其包括向所述免疫细胞施用编码所述PD-L1的核酸分子和/或编码CD24蛋白的核酸分子。
- 根据权利要求37-38中任一项所述的方法，其包括向所述免疫细胞施用包含所述编码PD-L1蛋白的核酸分子和/或所述编码CD24蛋白的核酸分子的载体。
- 根据权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述PD-L1蛋白包括如SEQ ID NO:56-57中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述编码PD-L1蛋白的核酸分子包括如SEQ ID NO:58所示的核苷酸序列。
- 根据权利要求37-41中任一项所述的方法，其中所述CD24蛋白包括如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求38-42中任一项所述的方法，其中所述编码CD24蛋白的核酸分子包括SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列。
- 根据权利要求28-43中任一项所述的方法，其中所述载体包含病毒载体。
- 根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包括T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、浆细胞、粒细胞、树突状细胞、淋巴细 胞、白细胞、干细胞和/或外周血单个核细胞。
- 根据权利要求1-45中任一项所述的方法，其中所述步骤b)在所述步骤a)之后进行。
- 根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述步骤b)在所述步骤a)中的下调成功后进行。
- 根据权利要求47所述的方法，其中所述下调成功包括，与经所述步骤a)前的免疫细胞相比，经过所述步骤a)后的所述免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性降低至少50％。
- 根据权利要求47-48中任一项所述的方法，其中所述下调成功包括基因编辑发生。
- 根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述步骤b)在所述步骤a)至少6小时后进行。
- 根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：使所述经修饰的免疫细胞包括嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)和/或至少一种合成受体。
- 根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：使所述经修饰的免疫细胞包括表达嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)和/或至少一种合成受体的核酸分子。
- 根据权利要求1-52中任一项所述的方法制得的经修饰的免疫细胞，与未经所述修饰的免疫细胞相比，所述经修饰的免疫细胞中Fas蛋白的表达和/或活性降低或消除，且，所述经修饰的免疫细胞中FasL蛋白的表达和/或活性升高。
- 根据权利要求53所述的免疫细胞，其包括嵌合抗原受体(CAR)、T细胞表面受体(TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)和/或至少一种合成受体。
- 细胞群，其包含权利要求53-54中任一项所述的免疫细胞，且所述细胞群中至少20％的免疫细胞基本上不表达Fas，至少5％的免疫细胞过表达FasL。
- 根据权利要求55所述的细胞群，其中的至少15％的免疫细胞基本上不表达PD-1。
- 根据权利要求55-56中任一项所述的细胞群，其中的至少5％的免疫细胞过表达PD-L1。
- 根据权利要求55-57中任一项所述的细胞群，其中的至少5％的免疫细胞过表达CD24。
- 药物组合物，其包含权利要求53-54中任一项所述的免疫细胞和/或权利要求55-58中任一项所述的细胞群，以及药学上可接受的载体。
- 权利要求53-54中任一项所述的免疫细胞、权利要求55-58中任一项所述的细胞群和/或权利要求59所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于***。
- 靶向编码Fas蛋白的核酸分子的指导RNA，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:1-15中任一项所示的核苷酸序列。
- 靶向编码PD-1蛋白的核酸分子的指导RNA，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:16-30中任一项所示的核苷酸序列。
- CRISPR/Cas***，其包括权利要求61-62中任一项所述的指导RNA和Cas蛋白。
- 根据权利要求63所述的***，其中所述Cas蛋白包括Cas9蛋白。
- 异体细胞移植的方法，其包括施用有效量的权利要求53-54中任一项所述的免疫细胞、权利要求55-58中任一项所述的细胞群，和/或权利要求59所述的药物组合物。
- ***的方法，其包括施用有效量的权利要求53-54中任一项所述的免疫细胞、权利要求55-58中任一项所述的细胞群，和/或权利要求59所述的药物组合物。
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