KR20230131326A - 인슐린 수용체 특이적 압타머 및 이의 이용 - Google Patents

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이조운이
이대견
오은주
윤나오
류성호
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주식회사 압타머사이언스
포항공과대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 인슐린 수용체(Insulin receptor, IR)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 포함하는 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 압타머는 당뇨병, 당뇨 합병증, 대사성 증후군, 비만 및 심혈관 질환 등의 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료 및 진단에 적용할 수 있다.

Description

인슐린 수용체 특이적 압타머 및 이의 이용{Insulin receptor aptamer and uses thereof}
본 발명은 인슐린 수용체(Insulin receptor, IR)에 특이적으로 결합하는 압타머, 이를 포함하는 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 진단용 조성물에 관한 것이다.
인슐린(Insulin)은 인체의 췌장에서 분비되는 혈당 조절 호르몬으로서, 혈액 내의 잉여 포도당을 세포로 옮겨 세포에 에너지원을 공급하는 한편 혈당을 정상 수준으로 유지시켜 주는 역할을 한다. 그러나 당뇨 환자의 경우 이러한 인슐린이 부족하거나 인슐린 저항성 및 베타 세포의 기능소실로 인하여 인슐린이 정상적인 기능을 수행하지 못한다. 그로 인해 당뇨 환자는 혈액 내의 포도당을 에너지원으로 이용하지 못하고 혈중 포도당 수준이 높은 고혈당 증세를 나타내어 결국 소변으로 당을 배출하게 되며, 이는 다양한 합병증을 야기한다. 따라서 인슐린 생성에 이상이 있거나(제1형, Type I), 인슐린 내성으로 인해(제2형, Type II) 당뇨병이 발병한 환자는 인슐린을 투여함으로써 혈당을 정상 수준으로 조절할 수 있다.
오늘날 당뇨병 환자의 혈당을 정상적으로 조절하기 위해 많은 종류의 인슐린 유도체들이 개발되어 사용되고 있다. 그러나, 인슐린은 포도당 흡수 이외에도 세포 분열을 유도하고, 몇몇 인슐린 유도체에 도입된 아미노산 서열의 변화는 인슐린 유사 성장인자 1(Insulin like growth factor 1, IGF-1) 수용체에 대한 결합력과 활성화를 증가시키며, 당뇨병 치료를 위한 장기간의 인슐린 투여는 죽상동맥경화를 유발할 수 있고, 지속된 인슐린 투여와 암 발병률 증가 사이에 유의미한 상관관계가 있음이 보고된 바, 인슐린에 의한 부작용에 관한 우려가 지속적으로 제기되어 왔다.
따라서, 세포 분열을 유도하지 않고 포도당 흡수만을 증가시키는 인슐린 수용체에 대한 편향된 작용제(biased agonist)의 개발은 좋은 대안이 될 수 있다.
한편, 압타머(Aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 DNA, RNA 등의 단일가닥 뉴클레오티드이다. 1990년 이후 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 압타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 압타머는 높은 결합력과 특이성으로 표적분자에 선택적으로 결합할 수 있다는 특성이 있어서 특정한 물질을 감별하는 용도로 사용될 수 있다.
현재 압타머의 높은 결합력 및 특이성을 이용한 기능적 압타머를 발굴하기 위한 대부분의 노력은 표적에 대한 압타머의 저해 능력에 초점이 맞춰져 있다. 특히 임상적 응용을 위해서 표적분자의 활성을 방해하는 다양한 종류의 저해성 압타머(inhibitory aptamer)가 질병치료를 위해 개발되어 왔다(e.g Macugen, Fovista). 하지만 분자간의 상호작용은 필연적으로 구조적인 변화를 동반한다는 점을 염두해 봤을 때, 만약 압타머-단백질 결합이 단백질의 적절한 구조 변화를 유도시킬 수 있다면 단백질 기능의 활성화가 가능해질 것이라 여겨진다. 따라서 이론적으로 압타머는 특정 단백질-단백질 결합을 모방함으로써 기능적 작용제로 역할을 할 수 있는 잠재력을 가진다.
그러나, 현재 표적의 기능을 활성화시키는 작용제 압타머의 개발은 어려운 문제로 남아있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 부작용이 감소된 인슐린 관련 질환 치료제를 개발하고자 노력한 결과, 인슐린 수용체의 선택적 인산화를 유도하여, 포도당 흡수와 관련된 신호전달만을 활성화시키는 압타머를 개발하고, 이를 포함하는 인슐린 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 진단용 조성물을 개발하여, 본 발명을 완성하였다.
1. Mary E Herman, et al., Prog Cardiovasc Dis. Nov-Dec 2017;60(3):422-434.
본 발명의 하나의 목적은 인슐린 수용체 특이적 압타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 인슐린 수용체 특이적 압타머를 포함하는, 인슐린 수용체 작용제(agonist)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 인슐린 수용체 특이적 압타머를 유효성분으로 포함하는, 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 인슐린 수용체 특이적 압타머를 포함하는, 당뇨병 또는 당뇨 합병증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 하나의 양태는 인슐린 수용체 특이적 압타머를 제공한다.
본 발명에서, 용어 "압타머"는 "Chemical Antibody"로서 특정 화합물부터 단백질까지 다양한 종류의 표적 리간드에 높은 특이도와 친화도로 결합할 수 있는 특성을 가지는 짧은 길이 (20~80개 염기)의 단일 가닥 핵산 분자를 의미한다. 압타머는 SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 통해 생체 외 (In Vitro)에서 제조할 수 있다.
압타머는 표적 단백질에 대해 나노몰 (nM) 내지 펨토몰 (fM)수준의 높은 결합력과 선택성을 지니고 있다는 점에서 항체와 유사한 특성을 가지는 올리고 핵산 분자로 여겨진다. 한편, 항체와 비교할 때 압타머는 다음과 같은 여러 가지 장점을 가지고 있다: (1) 화학 합성법으로 제조되는 압타머는 항체와 같은 단백질 기반의 물질보다 목적하는 화학적 변이가 용이하며, (2) SELEX 과정을 통해 선택성과 친화도를 극대화할 수 있으며, (3) 화학적 합성으로 만들어지므로 순도가 높고, (4) 기기 분석을 통해 만들어진 물질을 동정할 수 있으며, (5) 열에 안정하여 실온에서 장기간 보존이 가능하다.
본 발명에서 용어, "SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)"는 표적 물질과 결합하는 압타머를 선별하는 방법이다. 일반적으로 공지된 방법의 경우, 표적 단백질을 무작위적인 염기서열을 가진 올리고 뉴클레오티드 라이브러리 (DNA 또는 RNA)와 함께 일정 온도에서 반응시킨 후에, 표적과 결합하지 않은 DNA/RNA 라이브러리는 제거한다. 표적과 결합한 뉴클레오티드를 분리한 후 유전자 증폭 방법을 통해 증폭시켜 위 과정을 여러 차례 반복하여 표적에 높은 결합력을 가지는 압타머를 선별해낸다.
본 발명의 경우, 상기와 같은 일반적인 SELEX 방법을 변형하여 압타머를 제조하였으며, 그에 관한 구체적인 방법에 대해서는 하기에 기재되어 있다.
압타머 선별 과정에는 일반적으로 1014 내지 1015개 정도의 서로 다른 서열, 즉 다양성을 가지는 라이브러리로부터 단일 가닥 핵산 풀 (pool)을 확보하는 과정이 필요하다. 이를 위한 방법으로 여러 가지 방법이 이용되고 있으나 일반적으로 비대칭 PCR을 사용하여 한쪽 가닥만을 증폭시키는 방법, 이중 가닥 핵산의 한 가닥 끝 부분에 비오틴 (biotin)을 붙인 후 스트렙타비딘 (streptavidin)으로 감싼 비드 (bead)를 이용하여 한 가닥만을 선택적으로 분리하는 방법이 가장 많이 이용되고 있다.
이후, 확보한 라이브러리를 표적 분자에 결합시켜 결합력이 높은 압타머를 골라내는 선택 과정을 진행한다. 표적 분자가 단백질인 경우에는 보통 단백질에 표지된 비오틴을 스트렙타비딘 비드를 이용해 풀 다운 (Pull down)한다. 표적 단백질과 변형 핵산 라이브러리의 결합을 유도한 후 버퍼로 씻어내어 표적 단백질에 결합하지 않은 변형 핵산 라이브러리들을 제거한다.
플레이트 (Plate)의 경우에도 마찬가지로 핵산 라이브러리와 표적 단백질의 결합을 유도한 후 버퍼로 씻어내어 표적 단백질에 결합하지 않는 핵산들을 제거한다. 이러한 방법들을 사용하여 리간드에 대해 친화도를 가지는 압타머들을 얻을 수 있다. 보통 5-15 회의 선별-증폭 과정을 반복하면 높은 친화도를 가지는 압타머를 얻을 수 있다. 선별 과정이 종료되면 증폭한 핵산을 클로닝한 후 개개의 클론으로부터 서열 분석을 통해 그 서열을 확인하고, 압타머를 합성하여 표적 분자와의 친화도 및 결합력을 측정한다.
본 발명에서, 용어 "표적 분자"는 본 발명의 압타머로 검출할 수 있는 물질을 의미한다. 구체적으로, 상기 표적 분자는 분리된 시료 내에 존재하는 것으로 포획 압타머가 결합할 수 있는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 보조인자 (cofactor), 약물, 염료, 성장인자 및 규제 물질 (controlled substance)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 상기 표적 분자는 인슐린 수용체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "인슐린 수용체 특이적 압타머(Insulin receptor aptamer)"는 인슐린에 특이적인 친화도로 결합할 수 있는 압타머를 의미한다. 상기 인슐린 수용체(Insulin receptor, IR)는 인간 인슐린 수용체 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 본 발명의 압타머는 인슐린 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 압타머는 10 내지 90개, 구체적으로 15 내지 80개, 보다 구체적으로 20 내지 50개의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 압타머를 구성하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 이루는 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상이 화학적 또는 물리적으로 변형(modification)된 형태를 포함할 수 있다.
상기 화학적 또는 물리적 변형은, 예를 들어, 상기 염기서열을 구성하는 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상이 포스포로티오에이트 핵산, 포스포로디티오에이트 핵산, 포스포로아미데이트 핵산, 아마이드-연결된 핵산, MMI-연결된 핵산, 2'-O-메틸 RNA, 알파-핵산 및 메틸포스포네이트 핵산, 당 변형된 뉴클레오티드 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변형을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 당 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 핵산, 2'-O-알릴 핵산, 2'-O-알카이닐 핵산, 헥소스 핵산, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 염기 변형을 갖는 뉴클레오티드는 C-5(5' 탄소, 5번째 탄소)에 치환기를 갖는 피리미딘, C-5에 치환기를 갖는 티민, C-5에 치환기를 갖는 dUTP (deoxyuracil), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린, 이노신 및 디아미노퓨린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 염기 변형을 갖는 뉴클레오티드 중 하나인, C-5에 치환기를 갖는 피리미딘에서 상기 치환기는 나프틸기, 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴- 및 피리딜- 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 염기 변형을 갖는 뉴클레오티드 중 하나인, C-5에 치환기를 갖는 dUTP에서 상기 치환기는 소수성 치환기일 수 있으며, 상기 소수성 치환기는, 예를 들면, 벤질기, 피롤벤질기, 페닐에틸기, 페닐프로필기, 티오페닐메틸기, 플루오로벤질기, 나프틸기, 2-나프틸기, 나프틸-2-에틸기, 2-나프틸-2-에틸기, 트립토판기, 3-벤조티오페닐-2-에틸기, 3-벤조푸라닐-2-에틸기, 벤지미다졸-2-에틸기, 티로신기, 피리디닐메틸기, 메틸렌디옥시벤질기, 3-메틸렌디옥시페닐-2-에틸기, 3-메톡시벤질기, 4-메톡시벤질기, 3,4-디메톡시벤질기, R-테트라하이드로퓨란기, S-테트라하이드로퓨란기, 모포리노-2-에틸기, 트레오닌기, 트립토판기 및 이소부틸기 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일예로, 상기 벤질기로의 치환은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5'-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, BndU)으로의 치환, 상기 페닐에틸기로의 치환은 5-(N-2-페닐에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-2-phenylethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, PedU)으로의 치환, 상기 페닐프로필기로의 치환은 5-(N-3-페닐프로필카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-3-phenylpropylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, PpdU)로의 치환, 상기 티오페닐메틸기로의 치환은 5-(N-2-티오페닐메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-2-thiophenylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, ThdU)으로의 치환, 상기 플루오로벤질기로의 치환은 5-(N-4-플루오로벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-4-fluorobenzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, FBndU)으로의 치환, 상기 나프틸기로의 치환은 5-(N-1-나프틸메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, NapdU)으로의 치환, 상기 2-나프틸기로의 치환은 5-(N-2-나프틸메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-2-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, 2NapdU), 상기 나프틸-2-에틸기로의 치환은 5-(N-1-나프틸-2-에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-1-naphthyl-2-ethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, NedU)으로의 치환, 상기 2-나프틸-2-에틸기로의 치환은 5-(N-2-나프틸-2-에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-2-naphthyl-2-ethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, 2NedU)으로의 치환, 상기 트립토판기로의 치환은 5-(N-3-인돌-2-에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-3-indole-2-ethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, TrpdU)으로의 치환, 상기 3-벤조티오페닐-2-에틸기로의 치환은 5-(N-3-벤조티오페닐-2-에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-3-benzothiophenyl-2-ethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, BtdU)으로의 치환, 상기 3-벤조푸라닐-2-에틸기로의 치환은 5-(N-3-벤조푸라닐-2-에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-3-benzofuranyl-2-ethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, BfdU)으로의 치환, 상기 벤지미다졸-2-에틸기로의 치환은 5-(N-1-벤지미다졸-2-에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-1-benzimidazol-2-ethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, BidU)으로의 치환, 상기 티로신기로의 치환은 5-(N-4-하이드로페닐-2-에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-1-hydroxyphenyl-2-ethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, TyrdU)으로의 치환, 상기 피리디닐메틸기로의 치환은 5-(N-4-피리디닐메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-4-pyridinylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, PyrdU)으로의 치환, 상기 메틸렌디옥시벤질기로의 치환은 5-(N-3,4-메틸렌디옥시벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-3,4,-methylenedioxybenzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, MBndU)로의 치환, 상기 3-메틸렌디옥시페닐-2-에틸기로의 치환은 5-(N-3,4-메틸렌디옥시페닐-2에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-3,4-methylenedioxyphenyl-2ethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, MPedU)으로의 치환, 상기 3-메톡시벤질기로의 치환은 5-(N-3-메톡시벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-3-methoxybenzylcarboxyamide)-2'-deoxyurinde, 3MBndU)으로의 치환, 상기 4-메톡시벤질기로의 치환은 5-(N-4-메톡시벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-4-methoxybenzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, 4MBndU)으로의 치환, 상기 3,4-디메톡시벤질기로의 치환은 5-(N-3,4-디메톡시벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-3,4-dimethoxybenzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, 3,4MBndU)으로의 치환, 상기 R-테트라하이드로퓨란기로의 치환은 5-(N-R-테트라하이드로퓨라닐메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-R-tetrahydrofuranylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, RTHFdU)으로의 치환, , 상기 S-테트라하이드로퓨란기로의 치환은 5-(N-S-테트라하이드로퓨라닐메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-S-tetrahydrofuranylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyurinde, STHFdU)으로의 치환, 상기 모포리노-2-에틸기로의 치환은 5-(N-모포리노-2-에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-morpholino-2-ethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, MoedU)으로의 치환, 상기 트레오닌기로의 치환은 5-(N-R-2-하이드로프로필카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-R-2-hydroxypropylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, ThrdU) 및 상기 이소부틸기로의 치환은 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (5-(N-iso-butylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, iBudU)으로의 치환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 압타머는 하기의 일반식 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
[일반식 1]
5'- CABBACGCAB GAGBCBAGAB CCGBCAG- 3' (서열번호 4);
여기서 상기 일반식 1의 B는 뉴클레오티드의 5번째 탄소 위치가 소수성 작용기로 치환된 데옥시리보스 우라실(deoxyuracil, dUTP)이고,
상기 일반식 1의 C는 변형 또는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 변형은 뉴클레오티드에 링커(C3 linker) 결합; 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기(2-O-Me, 2-O-Methoxy-DNA) 도입; 및 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소(2-F, 2-Fluorine-DNA) 도입;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변형을 포함하고,
상기 일반식 1의 G는 변형 또는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 변형은 뉴클레오티드에 링커 결합; 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기 도입; 및 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소 도입;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변형을 포함하고,
상기 일반식 1의 A는 변형 또는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 변형은 뉴클레오티드에 링커 결합; 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기 도입; 및 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소 도입;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 소수성 작용기는 구체적으로 벤질기, 피롤벤질기, 페닐에틸기, 페닐프로필기, 티오페닐메틸기, 플루오로벤질기, 나프틸기, 2-나프틸기, 나프틸-2-에틸기, 2-나프틸-2-에틸기, 트립토판기, 3-벤조티오페닐-2-에틸기, 3-벤조푸라닐-2-에틸기, 벤지미다졸-2-에틸기, 티로신기, 피리디닐메틸기, 메틸렌디옥시벤질기, 3-메틸렌디옥시페닐-2-에틸기, 3-메톡시벤질기, 4-메톡시벤질기, 3,4-디메톡시벤질기, R-테트라하이드로퓨란기, S-테트라하이드로퓨란기, 모포리노-2-에틸기, 트레오닌기, 트립토판기 및 이소부틸기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 보다 구체적으로 나프틸기, 벤질기, 피롤벤질기, 이소부틸기 및 트립토판으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 보다 더욱 구체적으로 나프틸기 또는 벤질기 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 나프틸기로 치환되어 변형된 데옥시리보스 우라실은 나프틸-우라실 뉴클레오티드(Naphthyl-dU)로 명명하고, 본 발명에서 기재되는 염기서열에서 W로 표시된다. 또한, 상기 벤질기로 치환되어 변형된 우라실은 벤질-우라실 뉴클레오티드(Benzyl-dU)로 명명하고, 본 발명에서 기재되는 염기서열에서 Y로 표시된다. 즉, 상기 일반식 1의 B는 나프틸-우라실 뉴클레오티드(5-(N-1-나프틸메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, Naphthyl-dU, NapdU) 또는 벤질-우라실 뉴클레오티드(5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, Benzyl-dU, BndU) 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 나프틸기는 아래 화학식 1에, 벤질기는 화학식 2에 표시하였다.
[화학식 1]
[화학식 2]
본 발명에서, 링커는 뉴클레오티드가 링커로 치환된 것으로서, 상기 뉴클레오티드의 염기 또는 염기 및 오탄당을 포함하는 뉴클레오사이드가 제거되었지만 포스페이트 백본(phosphate backbone)은 남아 상기의 빈 공간은 유지된 채로 남아있는 상태를 의미할 수 있고, 빈 공간 양 옆의 뉴클레오티드는 본래의 일정한 거리를 유지하며 연결된 상태를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 링커는 '스페이서(spacer)'와 혼용되서 사용될 수 있다. 상기 링커 또는 스페이서는 탄소 3개로 구성될 수 있지만, 뉴클레오티드 사이의 일정한 거리를 유지할 수 있다면, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 링커 또는 스페이서는 탄소 3개로 구성되는 링커 또는 스페이서일 수 있으며, 이는 C3 링커(C3 linker), C3 스페이서(C3 spacer) 또는 L과 혼용될 수 있다. 상기 C3 링커는 본 발명의 압타머의 5' 말단, 3' 말단, 중간 또는 양 말단의 뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 5'-말단(화학식 3), 3'-말단(화학식 4), 중간(화학식 5)의 뉴클레오티드에 상기 C3 링커가 결합되어 연결된 구조는 하기의 화학식에 표시하였다.
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
상기 압타머는 상기 일반식 1의 서열의 3' 말단 또는 5' 말단 중 선택되는 어느 하나로부터 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 제외된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 압타머는 하기의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
5'- CABBACGCAB GAGBCBAGAB CCGBC- 3' (서열번호 82);
여기서 상기 일반식 1의 B는 뉴클레오티드의 5번째 탄소 위치가 소수성 작용기로 치환된 데옥시리보스 우라실로서, dUTP 뉴클레오티드의 5번째 탄소가 나프틸기로 치환된 나프틸-우라실 뉴클레오티드; 또는 dUTP 뉴클레오티드의 5번째 탄소가 벤질기로 치환된 벤질-우라실 뉴클레오티드; 중 선택되는 어느 하나 이상이고,
상기 일반식 1의 C는 변형 또는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 변형은 뉴클레오티드에 링커 결합; 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기 도입; 및 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소 도입;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변형을 포함하고,
상기 일반식 1의 G는 변형 또는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 변형은 뉴클레오티드에 링커 결합; 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기 도입; 및 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소 도입;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변형을 포함하고,
상기 일반식 1의 A는 변형 또는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 변형은 뉴클레오티드에 링커 결합; 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기 도입; 및 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소 도입;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변형을 포함할 수 있으며, 본 서열에 포함되는 뉴클레오티드에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 압타머는 서열번호 5 내지 서열번호 81의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 압타머는 서열번호 5 내지 서열번호 81의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 구체적으로 90% 이상인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, '상동성 (homology)' 또는 '동일성 (identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치 (Needleman-Wunsch) 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다 (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호 (즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스 (동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법 (예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
또한, 상기 압타머는 이의 3' 말단 또는 5' 말단 중 선택되는 어느 하나 이상에 PEG(polyethylene glycol), idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 아민 링커(amine linker), 티올 링커(thiol linker) 및 콜레스테롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 결합된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 압타머의 3' 말단 또는 5' 말단 중 선택되는 어느 하나 이상에 PEG가 결합될 경우, 압타머의 반감기가 증가하고, 인슐린 수용체 및 Akt 인산화 활성이 증가할 수 있으며, 특히, 3' 말단에 PEG가 결합된 압타머의 경우, 5' 말단에 PEG가 결합된 압타머에 비해 낮은 농도에서 더 강한 IR 및 Akt 인산화 활성을 나타낼 수 있다(도 28).
본 발명의 압타머는 인슐린과 경쟁적 또는 비경쟁적으로 인슐린 수용체에 결합할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 제작한 단일 핵산 치환 압타머(서열번호 5~71)의 인슐린 수용체에 대한 결합력을 확인한 결과, 일부 압타머가 인슐린 수용체에 대한 Kd 값이 기존의 A62보다 우수함을 확인하고, 이를 서열 최적화를 통한 최종 변형체로서 선택하였다(도 11 내지 도 12).
본 발명의 압타머는 인슐린 수용체의 Y1150을 인산화시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 수용체 특이적 압타머로써 선별된 변형 압타머(A62m) combi 7(A62ms)의 IR 선택적 인산화를 확인하기 위해, 인슐린 수용체의 세포 내 영역의 6개의 티로신(Y960, Y1146, Y1150, Y1151, Y1316 및 Y1322) 영역 각각의 인산화 활성을 분석한 결과, 인슐린은 Y960, Y1146, Y1150, Y1151, Y1316, Y1322의 모든 영역의 인산화 활성을 갖지만, A62ms은 오직 Y1150 위치에서만 특이적인 인산화를 일으켰으며, 다른 티로신 위치에 대한 인산화는 매우 낮음을 확인하였다(도 19).
본 발명의 압타머는 AKT를 인산화시킬 수 있다.
본 발명의 압타머는 ERK의 인산화를 감작(sensitizing)시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 수용체 특이적 압타머인 A62m combi 7(A62ms)의 선택적 Y1150 인산화가 인슐린의 하위 신호전달에 어떤 영향을 끼치는지 확인한 결과, Y1150의 인산화가 관찰되지 않을 정도의 저농도의 인슐린 단독 처리 시 하위 인자들의 인산화가 잘 유도되었고, A62m combi 7의 단독처리에서는 인산화에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다. 반면에, A62m combi 7 과 인슐린이 함께 처리되면 인슐린의 하위 신호 전달을 증가시키는 것을 확인하였다(도 21).
본 발명의 압타머는 세포의 포도당 흡수를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 수용체 특이적 압타머인 A62m combi 7(A62ms)가 IR 압타머로서 정상 상태 또는 인슐린 저항성 상태에서 포도당 흡수 활성을 갖는지 확인하기 위해, 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 이용하여 in vitro 포도당 흡수 실험을 수행한 결과, A62ms의 경우 포도당 흡수의 EC50는 197 nM 정도로, 49 nM의 EC50를 가지는 인슐린보다 4배 정도 높지만, 최대 포도당 흡수도는 인슐린 대비 100% 이상의 수치에 도달함을 확인하였다(도 22). 이를 통해 본 발명의 압타머가 인슐린과 포도당 흡수 효과 측면에서 유사한 효능을 가지고 있음을 알 수 있다.
본 발명의 압타머는 세포 분열을 촉진시키지 않는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 수용체 특이적 압타머인 A62m combi 7(A62ms)가 인슐린과 같이 암세포의 분열을 촉진시키는 부작용을 나타내는지 확인하기 위해, 유방암세포주인 MCF-7 세포를 이용하여 세포 분열 여부를 확인한 결과, 인슐린은 MCF-7의 분열을 촉진시켰으나, A62ms는 세포의 분열을 촉진시키지 않음을 확인하였다(도 24). 이를 통해 본 발명의 압타머는 암세포 분열 촉진의 부작용 없이 안전하게 투여 가능함을 알 수 있다.
본 발명의 압타머는 혈당 강하 활성을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 수용체 특이적 압타머인 A62m combi 7(A62ms)가 in vivo에서 혈당 강하 효과를 나타내는지를 제2형(Type II) 당뇨병 동물 모델로써 식이와 에너지 항상성에 중요한 역할을 하는 호르몬인 렙틴의 수용체(leptin receptor)를 발현하는 유전자에 돌연변이가 있는 db/db 마우스를 이용하여 확인한 결과, A62ms는 지속형 인슐린 제제인 란투스(Lantus)와 유사한 수준의 혈당 강하 효과를 나타내었으며, 혈당 강하 지속 시간은 란투스에 비해 긴 것을 확인하였다(도 25).
본 발명의 압타머는 체중 증가 억제 활성을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 인슐린 수용체 특이적 압타머인 A62m combi 7(A62ms)가 in vivo에서 체중 증가 억제 효과를 나타내는지를 나타내는지를 제2형 당뇨병 동물 모델을 이용하여 확인한 결과, A62ms는 란투스 대비 유의한 체중 증가 억제 효과를 나타냄을 확인하였다(도 26).
또한, A62ms는 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 이용하여 지방 분해(Lipolysis) 억제 활성을 in vitro에서 확인한 결과, 인슐린에 의한 지방 분해의 EC50는 7.3 nM로, 포도당 흡수에 비해 6배 정도 낮았으나, 압타머에 의한 지방 분해의 EC50는 81 nM로, 포도당 흡수에 비해 1.5배 낮았다(도 23). 동일한 포도당 흡수량 대비 지방 분해 억제 효능을 비교한 결과 A62ms는 인슐린 대비 지방 분해 억제 정도가 현저히 낮았다(도 23), 이를 통해 본 발명의 압타머는 포도당 흡수량에 비해 지방 분해 억제 효능이 상대적으로 낮은 바, 동일한 양의 포도당 흡수를 유도하는 상황에서 인슐린보다 지방 분해 억제 효능이 낮음을 알 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, A62ms는 양성 대조군인 란투스 대비 유의한 체중 증가 억제 효과를 나타내었다(도 26).
본 발명의 압타머는 40% 이상의 생체 이용률(Bioavailability)을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 압타머는 5 시간 이상의 혈중 반감기를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, ICR 마우스에 정맥 주사(intravenous injection, IV) 또는 피하 주사(subcutaneous injection, SC)로 각각 10 mg/kg로 단회 투여 후 24시간 동안 8 point로 혈액 샘플을 채취하여 압타머를 측정한 결과, 본 발명의 인슐린 수용체 특이적 압타머인 A62m combi 7(A62ms)를 피하 주사한 경우 A62ms의 정맥 주사 시 4.2시간의 반감기, 피하 주사 시 40% 이상의 생체 이용률(Bioavailability)과 5.2시간의 혈중 반감기가 나타남을 확인하였다(도 27). 혈중 최대 농도는(Cmax) 정맥 주사 시 125321.0 ng/mL와 피하 주사 시 6400.4 ng/mL로, 투여 경로에 따른 차이가 관찰되었다.
본 발명은 본 발명자들의 선행특허인 대한민국 공개특허 제10-2017-0013178호에 개시된 인슐린 수용체 특이적 압타머(IR-A62)를 기반으로, 인슐린 수용체에 대한 결합력, 인슐린 수용체의 인산화 활성 및 혈청 안정성을 향상시키고자 하였다.
그에 따라, 뉴클레오티드 서열의 최적화 및 화학적 변형을 이용한 최적화를 수행하기 위해, 전술한 바와 같이 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 특정 부위의 뉴클레오티드를 다른 종류의 뉴클레오티드로 치환하거나; 특정 부위의 뉴클레오티드를 링커에 결합시키거나; 뉴클레오티드를 추가적으로 화학적 변형시켜 변형 압타머를 제조하였다.
또한, 상기 변형 압타머가 기존의 변형 전 압타머(A62)에 비해 IR 인산화 활성 및 혈청 내 안정성이 우수하고, 인슐린에 비해 IR 인산화 활성 및 포도당 흡수 활성이 우수하고, 지방 분해 억제 활성은 낮고, 기존의 지속형 인슐린 제제인 란투스에 상응하는 혈당 강하 효과를 나타내고, 상기 란투스에 비해 혈당 강하 지속 시간이 길고, 우수한 체중 증가 억제 효과를 나타내고, 생체 이용율 및 혈중 반감기가 우수하며, 암세포 분열 촉진의 부작용 없이 안전하게 투여할 수 있는 바, 당뇨병, 당뇨 합병증, 대사성 증후군, 비만 및 심혈관 질환 등의 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료 및 진단 용도로 제공할 수 있음을 확인한 것에 의의가 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 인슐린 수용체 특이적 압타머를 포함하는, 인슐린 수용체 작용제(agonist)를 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "인슐린 수용체 작용제(agonist)"는 인슐린 수용체에 선택적으로 결합하는 약학적으로 허용 가능한 제제를 의미한다. 통상적으로 인슐린 수용체 작용제는, 효과적으로 혈당을 조절하기 위하여 개발된 새로운 종류의 인슐린 관련 질환의 치료제를 의미한다. 본 발명의 인슐린 수용체 작용제는 인슐린 수용체에 특이적으로 결합할 뿐 아니라 암 발생의 부작용이 없는 특징이 있다. 따라서, 상기 인슐린 수용체의 작용제는 인슐린과 관련한 다양한 질환의 진단 또는 치료용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 인슐린 수용체 특이적 압타머를 유효성분으로 포함하는, 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "인슐린 관련 질환"은 인슐린의 비정상적인 분비, 인슐린과 인슐린 수용체간의 비이상적 결합 또는 인슐린 수용체 및 인슐린의 하위 신호전달 단백질의 비이상적 활성 등과 관련된 질환으로서, 그 예로, 상기 질환은 당뇨병, 당뇨 합병증, 대사성 증후군, 비만, 심혈관 질환 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물을 개체에 투여하여 인슐린 관련 질환을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 본 발명의 조성물을 개체에 투여하여 인슐린 관련 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 상기 인슐린 수용체 특이적 압타머를 유효 성분으로 포함하는 것에 더하여, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로, 구체적으로는 0.001 중량% 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.
본 발명에서 "약학적으로 허용 가능"하다는 것은, 이를 투여 시 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는, 약학 분야에서 통상적으로 사용되는 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토 덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 약학 조성물은 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 상기 담체와 함께 전술한 바에 따라 제제화되어, 식품, 의약품, 사료 첨가제, 음용수 첨가제 등으로 활용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 적합한 다양한 제형으로 제제화되어 사용될 수 있다.
상기 경구 투여용 제제의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다.
나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.
상기 비경구용 제제의 비제한적인 예로는, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
또한, 보다 구체적으로 본 발명의 상기 약학 조성물을 주사액으로 제제화하는 경우, 본 발명의 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 약학 조성물을 에어로졸제로 제제화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와함께 배합할 수 있다.
본 발명의 인슐린 수용체 특이적 압타머는 지속형 인슐린 제제인 란투스 대비 in vivo에서의 혈당 강하 효과(실시예 3-4), 인슐린 대비 in vitro에서의 포도당 흡수 효과(실시예 3-1) 및 지방 분해 억제 감소 효과(실시예 3-2)가 보다 우수하다는 것을 확인하였는 바, 상기 압타머를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료 용도로 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 mg/kg 내지 100mg/kg, 보다 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 10 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 다양한 포유동물에 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함하며, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 복막, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 구체적으로는 경구 투여일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 인간에 적용되는 의약품뿐만 아니라, 동물 의약품의 형태로도 사용될 수 있다. 여기에서, 동물이란 가축 및 반려동물을 포함하는 개념이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "개체"는 인슐린 관련 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물을 비롯한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학 조성물을 인슐린 관련 질환의 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 악액질의 의심 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 약학 조성물은 악액질을 예방 또는 치료하는 것을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체에든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 인슐린 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위하여 단독으로, 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 압타머를 포함하는, 당뇨병 또는 당뇨 합병증 진단용 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 구체적으로 당뇨병 또는 당뇨 합병증의 발병 여부를 판단하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 인슐린 수용체 특이적 압타머를 이용하여 당뇨병 또는 당뇨 합병증 진단에 대한 정보 제공방법을 제공한다.
상기 당뇨병 또는 당뇨 합병증 진단에 정보를 제공하는 방법은 분리된 생물학적 시료를 준비하는 단계; 상기 생물학적 시료에, 본 발명에 따른 인슐린 수용체 특이적 압타머를 반응시키는 단계; 및 상기 생물학적 시료에서의 인슐린 수용체 특이적 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하고, 생물학적 시료에서의 인슐린 수용체 특이적 압타머의 결합 정도가 정상 시료보다 높은 경우, 당뇨병인 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 생물학적 시료에서의 인슐린 수용체 특이적 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계는 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 DNA 압타머 결합 측정 기술을 이용하여 수행될 수 있으며, 예컨대 인슐린 수용체 특이적 압타머 말단에 형광 또는 방사성 물질 표지하여 형광 또는 방사성 세기를 측정하거나, 이미지화하여 관찰하는 방법 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 압타머는 기존 압타머에 비해 인슐린 수용체(Insulin receptor, IR) 인산화 활성 및 혈청 내 안정성이 우수하고, 인슐린에 비해 IR 인산화 활성 및 포도당 흡수 활성이 우수하고, 지방 분해 억제 활성은 낮고, 지속형 인슐린 제제인 란투스(Lantus)에 상응하는 혈당 강하 효과를 나타내고, 상기 란투스에 비해 혈당 강하 지속 시간이 길고, 우수한 체중 증가 억제 효과를 나타내고, 생체 이용율 및 혈중 반감기가 우수하며, 암세포 분열 촉진의 부작용 없이 안전하게 투여할 수 있는 바, 당뇨병, 당뇨 합병증, 대사성 증후군, 비만 및 심혈관 질환 등의 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료 및 진단에 적용할 수 있다.
도 1는 각 뉴클레오티드 위치별로 링커가 결합되어 변형된 압타머 라이브러리 10 nM 처리에 따른 인슐린 수용체(Insulin receptor, IR) 인산화 활성을 확인한 도이다.
도 2는 각 뉴클레오티드 위치별로 링커가 결합되어 변형된 압타머 라이브러리 5 nM 처리에 따른 IR 인산화 활성을 확인한 도이다.
도 3은 C 뉴클레오티드 위치별로 2번째 탄소 위치에 메톡시기(2-O-Me, 2-O-Methoxy-DNA)가 도입되어 변형된 압타머 라이브러리 10 nM 또는 5 nM 처리에 따른 IR 인산화 활성을 확인한 도이다.
도 4는 C 뉴클레오티드 위치별로 2번째 탄소 위치에 불소(2-F, 2-Fluorine-DNA)가 도입되어 변형된 압타머 라이브러리 10 nM 또는 5 nM 처리에 따른 IR 인산화 활성을 확인한 도이다.
도 5는 A 뉴클레오티드 위치별로 2번째 탄소 위치에 불소가 도입되어 변형된 압타머 라이브러리 10 nM 또는 5 nM 처리에 따른 IR 인산화 활성을 확인한 도이다.
도 6은 A 뉴클레오티드 위치별로 2번째 탄소 위치에 메톡시기가 도입되어 변형된 압타머 라이브러리 10 nM 또는 5 nM 처리에 따른 IR 인산화 활성을 확인한 도이다.
도 7은 G 뉴클레오티드 위치별로 2번째 탄소 위치에 불소가 도입되어 변형된 압타머 라이브러리 10 nM 또는 5 nM 처리에 따른 IR 인산화 활성을 확인한 도이다.
도 8은 G 뉴클레오티드 위치별로 2번째 탄소 위치에 메톡시기가 도입되어 변형된 압타머 라이브러리 10 nM 또는 5 nM 처리에 따른 IR 인산화 활성을 확인한 도이다.
도 9는 나프틸-우라실 뉴클레오티드(Naphthyl-dU, W) 위치별로 벤질-우라실 뉴클레오티드(Benzyl-dU, Y)로 변형된 압타머 라이브러리 10 nM 또는 5 nM 처리에 따른 IR 인산화 활성을 확인한 도이다.
도 10은 각 뉴클레오티드 위치별로 단일 서열에 대한 화학적 최적화를 진행하여 IR 인산화와 단백질 결합 결과에 대한 MAP을 작성, 치환 스캐닝 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 각 압타머 라이브러리의 IR에 대한 Kd 및 Bmax를 확인한 결과이다.
도 12는 도 11에 이어서, 각 압타머 라이브러리의 IR에 대한 Kd 및 Bmax를 확인한 결과이다.
도 13은 A62m combi 1 내지 combi 4의 IR 인산화 활성을 확인한 결과이다.
도 14는 A62m combi 5 내지 combi 10의 IR 인산화 활성을 확인한 결과이다.
도 15는 A62m combi 5 내지 combi 10의 처리 농도별 IR 인산화 활성을 확인한 결과이다.
도 16은 A62m combi 6 내지 combi 9의 처리 농도별 IR 인산화 활성을 확인한 결과이다.
도 17은 A62m combi 7 내지 combi 9의 처리 농도별 IR 인산화 활성을 확인한 결과이다.
도 18은 A62m combi 7 내지 combi 9의 혈청 안정성을 확인한 결과이다.
도 19는 A62m combi 7(A62ms)의 IR 인산화 위치를 확인한 결과이다.
도 20은 A62m combi 7(A62ms) 처리 시간별 및 처리 농도별로 Y1150 위치에서의 인산화 정도를 확인한 결과이다.
도 21은 A62m combi 7(A62ms), 인슐린, 또는 A62m combi 7 및 인슐린 각각을 세포에 처리하여 각 조건별 인슐린의 하위 신호전달에 대한 영향을 확인한 결과이다.
도 22는 A62m combi 7(A62ms)의 in vitro 포도당 흡수(glucose uptake) 활성을 확인한 결과이다.
도 23은 A62m combi 7(A62ms)의 in vitro 지방 분해(Lipolysis) 억제 활성을 확인한 결과이다.
도 24는 A62m combi 7(A62ms)의 in vitro 암세포 분열 촉진 여부를 확인한 결과이다.
도 25는 A62m combi 7(A62ms)의 in vivo 혈당 강하 활성을 확인한 결과이다.
도 26은 A62m combi 7(A62ms)의 체중 증가 억제 활성을 확인한 결과이다.
도 27은 A62m combi 7(A62ms)의 투여 방법에 따른 생체 이용율(Bioavailability) 및 혈중 반감기를 확인한 결과이다.
도 28은 약동학적(pharmacokinetics, PK) 반감기를 증가시키기 위하여 A62m combi 7(A62ms)의 말단에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 화학적으로 결합시킨 후, 활성도 변화여부를 확인하기 위하여 IR 및 Akt 인산화 활성을 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: A62의 화학적 최적화를 통해 변형된 인슐린 수용체(Insulin receptor, IR) 압타머 라이브러리 제조 및 선별
기존의 인슐린 수용체 특이적 압타머로 알려진 IR-A62 압타머(이하, A62)(대한민국 공개특허 제10-2017-0013178호)의 효과를 개선하기 위해, A62의 폴리뉴클레오티드 서열 일부(22 번째 내지 48 번째 위치에 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 1)를 변형시키는 서열 최적화를 수행하였다. 상기 서열 최적화를 통해 제작된 A62 변형체는 기존의 A62보다 IR에 대한 결합력이 향상되었는 바, 이를 통해 기존의 IR 압타머인 A62보다 효과가 우수한 압타머를 제조하였다.
실시예 1-1: 압타머 라이브러리 제조
A62에서 일부 서열을 변형시키는 서열 최적화를 위해 어떠한 뉴클레오티드를 변형시켰을 때 효과가 향상되는지를 확인하였다. 이를 위해, A62의 서열(A62 Ori, 서열번호 1) 내 뉴클레오티드를 dUTP(deoxyuracil) 뉴클레오티드의 5번째 탄소가 나프틸기로 치환된 나프틸-우라실 뉴클레오티드(Naphthyl-dU, W)를 제외한 나머지 뉴클레오티드에 링커(Linker, C3-L, L)가 결합되거나, 2번째 탄소 위치에 메톡시기(2'-Me, 2-O-Methoxy-DNA, Nme) 또는 불소(2'-F, 2-Fluorine-DNA, Nf)가 도입된 뉴클레오티드로 변형시켜, 총 60개의 압타머 라이브러리(서열번호 5~64)를 제작하였다. 또한, 서열 내 W를 dUTP 뉴클레오티드의 5번째 탄소가 벤질기로 치환된 벤질-우라실 뉴클레오티드(Benzyl-dU, Y)로 각각 변형시켜 7개의 추가적인 압타머 라이브러리(서열번호 65~71)를 제작하였다.
상기 링커는 탄소 3개로 구성되는 것일 수 있으며, 압타머의 5' 말단, 3' 말단, 중간 또는 양 말단의 뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 5'-말단(화학식 3), 3'-말단(화학식 4), 중간(화학식 5)의 뉴클레오티드에 상기 C3 링커가 결합되어 연결된 구조는 하기 화학식과 같다.
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
압타머 SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)에 필요한 라이브러리를 제조하기 위하여 5'에 비오틴(biotin)이 결합된 안티센스(antisense) 라이브러리를 합성하였다. 상기 안티센스 라이브러리를 합성하기 위해, 1 mM의 dNTP(dATP, dGTP, dCTP, Nap-dU), 0.25 U/ul KOD XL, 10X extension 완충액(1.2 M Tris-HCl pH 7.8, 100 mM KCl, 60 mM (NH4)2SO4, 70 mM MgSO4, 1% TritonX100, 1 mg/ml BSA)상에서 70℃, 2시간 동안 50uM의 정방향 프라이머(서열번호 2)와 반응시켜 이중가닥 DNA를 제조하였다. 여기에 20 mM NaOH를 이용하여 단일가닥 변형 DNA를 용출한 뒤 HCl 용액으로 중화시켰다. 제조된 라이브러리는 10% 요소 겔(urea gel)을 이용하여 정량하였다. 본 실시예 1에서 사용되는 프라이머의 서열은 하기 표 1과 같다.
서열번호 서열명 서열(5' -> 3')
2 forward_F GAGTGACCGTCCGCCTG
3 reverse_R GGCTGGTGGTGTGGCTG
실시예 1-2: IR 인산화 활성 평가
상기 실시예 1-1에서 제작된 압타머 라이브러리(서열번호 5~71)의 화학적 최적화에 따른 IR 인산화 활성을 하기와 같은 실험을 통해 확인하였다.
구체적으로, SV40 초기 프로모터의 제어하에 인간 인슐린 수용체(human insulin receptor, hIR)를 안정적으로 발현하는 쥐 배아 섬유아세포인 Rat-1/hIR 세포 105개를 12웰-플레이트의 각 웰에 플레이팅 한 후, 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)을 함유하는 고함량 글루코스 DMEM(high glucose Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 37℃ 및 5% CO2를 포함하는 가습 조건으로 밤새 배양하였다. 상기 압타머 샘플을 처리하기 전 세포를 FBS가 포함되지 않은 DMEM에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 1X PBS(Phosphate-buffered saline)로 3 회 세척한 다음 Krebs-Ringer HEPES 버퍼[25 mM HEPES (pH 7.4), 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.3 mM CaCl2, 및 1.3 mM KH2PO4]에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 압타머 샘플은 95℃에서 5분 동안 가열 후, 압타머의 3차 구조가 재구성되도록 실온에서 천천히 식히고, 실험을 위해 Krebs-Ringer HEPES 완충액에 용해하여 준비하였다.
상기 압타머 샘플을 10 nM 또는 5 nM로 포함하는 Krebs-Ringer HEPES 버퍼를 Rat-1/hIR 세포가 배양된 각 웰에 처리 후 1 시간 동안 배양하였다.
1xPBS로 3회 세척 후 세포를 플레이트에서 떼어내어 용해 완충액으로 용해시켰다. 상기 세포 용해물은 4℃에서 14,000 rpm으로 15분 동안 원심 분리하여 단백질을 분리해 내었다. 상기 분리된 샘플은 5X 샘플 완충액과 함께 100℃에서 5분 동안 가열 후, 실온에서 천천히 식혀 웨스턴블랏 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플은 4%~12% SDS-PAGE 상에서 1시간 30분 동안 전기영동 하였고, 1시간 30분 동안 니트로 셀룰로오스 막(Nitrocellulose membrane)에 옮겨졌다. 그 후 상기 막을 블락킹 완충용액(1xPBST, 3% 탈지분유) 용액에 40분 동안 실온에서 블락킹 한 후, 블락킹 완충용액에 1차 항체[항-포스포-IR(10C3), Santa Cruz Biotechnology 또는 항-β-엑틴(D6A8), Cell Signaling Technology] 1:500 또는 1:1500으로 희석하여 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 그 후 상기 막을 후 1xPBS로 3회 세척 후 블락킹 완충용액에 결합한 2차 항체를 1:20000으로 희석시켜 1시간 동안 상온에서 인큐베이션 한 후, 1xPBST로 3회 세척하였다. 상기 막에 ECL(Enhanced chemiluminescence) 용액을 뿌린 후 상온에서 1분 동안 인큐베이션 시킨 후, x-ray 필름에 상기 막을 노출시켰다. 상기 막에 생긴 밴드의 강도를 측정하여 정량화한 후 A62와 비교하였다.
그 결과, 각 뉴클레오티드 위치별, 화학적 변형 종류별로 인슐린 수용체 인산화의 정도가 각각 달랐고, 상기 인산화 정도를 화학적 변형이 되지 않은 A62의 인산화 활성을 기준으로 하여 도 1 내지 도 10에 나타내었다.
실시예 1-3: 클론 결합 친화도 어세이
상기 실시예 1-1에서 제작된 압타머 라이브러리(서열번호 5~71)의 인슐린 수용체에 대한 결합력이 A62 압타머보다 우수한지 확인하기 위해 클론 결합 친화도 어세이를 수행하였다.
구체적으로, 각 압타머 샘플 10 fmole을 1X SB18 버퍼(200 mM HEPES, 510 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 25 mM KCl)에 넣고 95℃, 70℃, 48℃, 37℃에서 각각 5분간 반응시켰다. 1X SB18 버퍼를 이용하여 IR을 100 nM에서 4.64배씩 7 포인트로 순차적 희석한 뒤, 압타머를 30 ul씩 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이후, 형성된 압타머와 단백질 결합체에 Dynabead TALON 5.5 ul를 첨가하고 상온에서 5분간 반응시켰다. 그리고 미리 1X SB18 버퍼 30ul로 적셔 놓은 Durapore filter plate에 넣고 진공(vacuum) 상태로 만든 후, 1X SB18 버퍼 100 ul를 넣고 다시 진공 상태로 만들어 씻어주었다. 2 mM NaOH 용액을 넣고 상온에서 5분간 반응시켜 용출(elution)시킨 후 8 mM HCl 용액으로 중화하였다.
상기의 압타머와 단백질 중합체를 QPCR(정량적 PCR)을 이용하여 증폭하였다. 구체적으로, 라이브러리 제조에 사용된 정방향 프라이머(서열번호 2)와 역방항 프라이머(서열번호 3) 각각 0.2 uM dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 5 mM MgCl2, 0.025 U/ul KOD XL과 DNA 단백질 결합체를 총 부피가 20 ul가 되도록 혼합하여, 96℃ 15초, 55℃ 10초, 70℃ 30분 조건으로 1회, 그리고 96℃ 15초, 55℃ 10초, 70℃ 1분 조건으로 40회 반복하여 증폭시켰다. Ct 값을 기준으로 정규화한 뒤 SigmaPlot으로 Kd 및 Bmax를 계산하였다.
그 결과, 도 11 내지 도 12에서와 같이, 단일 sequence를 치환하였을때 기존의 A62 보다 우수한 Kd 값이 나타나는 서열을 확인하였다. 이후의 실시예에서 IR 인산화 결과 Map과 함께 적용하여 최적화 서열을 도출하였다.
C3 링커 변형체의 경우, 폴리머라제를 적용할 수 없는 바 Kd 및 Bmax를 측정하지 않았다.
실시예 1-4: 화학적 변형 조합에 따른 변형체 압타머(A62m) 선별
상기 실시예 1-1에서 제작된 압타머 라이브러리(서열번호 5~71)의 뉴클레오티드의 각 위치의 화학적 변형에 따른 IR 인산화 활성화 정도를 확인한 결과, 도 10과 같았다.
이를 토대로, 각 위치의 화학적 변형에 따른 수많은 조합 실험을 수행하여 화학적 최적화가 된 것으로 보이는 10개의 후보 서열을 선별하였다. 후보 서열은 인산화 활성 정도 및 압타머 자체의 안정성을 고려하여 선별하였고, 안정성 향상에 초점을 두었는 바, 심각한 인산화 활성 감소가 아니라면 안정성이 향상되는 방향으로 후보 서열을 선별하였다.
또한, 티민을 메톡시화시키는 경우에는 메톡시화가 RNA로부터 비롯되므로, T 메톡시보다 U 메톡시가 일반적인 경우이다. 따라서 티민의 RNA에서의 존재 형태인 우라실로 변형한 후, 메톡시화를 진행하였다.
상기 후보 서열은 A62m combi 1 내지 combi 10(각각 Co 1 내지 Co 10) (서열번호 72~81)로 명명하였으며, 각 서열은 하기 표 2와 같다.
서열번호 서열명 서열(5' -> 3') 크기
72 A62m combi 1 CAFYYA CFGCFAW GMeAMeGMeYC WAGAFW CMeCFGYCMe AMeGMe 27mer
73 A62m combi 2 CAFYYA CFGCFAW GMeAMeGMeYC WAGAFW CMeCFGYCMe AMe 26mer
74 A62m combi 3 CAFYYA CFGCFAW GMeAMeGMeYC WAGAFW CMeCFGYCMe 25mer
75 A62m combi 4 CAFYYA CFGCFAW GMeAMeGMeYC WAGAFW CMeCFGY 24mer
76 A62m combi 5 CAFYYA CFGCFAW GMeAFGMeYC WAGAFW CMeCFGYCMe AMeGMe 27mer
77 A62m combi 6 CAFYYA CFGCFAW GMeAFGMeYC WAGAFW CMeCFGYCMe AMeK 27mer
78 A62m combi 7 CAFYYA CFGCFAW GMeAFGMeYC WAGAFW CMeCFGYCMe 25mer
79 A62m combi 8 CAFYYA CFGCFAW GMeAFGMeYC WAGAFW CMeCFGYCMe AFGMe 27mer
80 A62m combi 9 CAFYYA CFGCFAW GFAMeGFYC WAGAFW CMeCFGYCMe AFGMe 27mer
81 A62m combi 10 CAFYYA CFGCFAW GMeAFGMeYC WAGAFW CMeCFGYK AMeK 27mer
상기 W는 나프틸-우라실 뉴클레오티드(Naphthyl-dU)이다.상기 Y는 벤질-우라실 뉴클레오티드(Benzyl-dU)이다.
상기 K는 링커(C3 linker)가 결합된 뉴클레오티드이다.
상기 NMe는 2번째 탄소 위치에 메톡시기(2-O-Me, 2-O-Methoxy-DNA)가 도입된 뉴클레오티드이다.
상기 NF는 2번째 탄소 위치에 불소(2-F, 2-Fluorine-DNA)가 도입된 뉴클레오티드이다.
상기 압타머는 각 서열의 3' 또는 5' 말단에 idT(inverted deoxythymidine)가 결합되었다.
실시예 2: 화학적 최적화된 A62m의 활성 평가
실시예 2-1: IR 인산화 활성 평가
상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 A62m combi 1 내지 combi 10(서열번호 72~81)의 IR 인산화 정도를 확인한 결과, A62 Ori에 비해 EC50가 개선된 후보가 다수 확인 되었으며, 그 중 A62m combi 7 의 IR 인산화 EC50가 7.37 nM로 A62Ori 대비 가장 낮은 것으로 확인되었다. 측정된 Combi 7, 8, 9의 EC50은 각각 7.37, 10.43, 9.831 nM로 확인되었다(도 13 내지 도 17).
실시예 2-2: 압타머의 혈청 안정성 확인
상기 실시예 2-1에서 IR 인산화 정도가 우수한 A62m combi 7 내지 combi 9(서열번호 72~81)의 혈청 안정성을 확인하였다. 상기 혈청 안정성은 압타머를 치료제로서 생체 내에 투여했을 때 얼마나 오랫동안 생체 내에 존재할 수 있는 지 확인하는 것으로, 혈청 안정성이 높을수록 압타머가 생체 내에 더 오래 존재하여 효과를 오래 유지할 수 있으며, 따라서 투약 간격이 넓어지는 장점이 있다.
구체적으로, 10 uM 압타머 10 ul 를 100% 혈청 45 ul에 첨가 후, 37℃에서 각각 0, 4, 24, 48, 72시간 동안 배양하였다. 인큐베이션 후 10 uM 대조군 압타머 5 ul를 첨가한 후, 증류수 165 ul로 이를 희석하였다. 상기 용액과 동일한 부피의 페놀:클로로폼:이소아밀 알코올(25:24:1)을 상기 샘플에 넣어 볼텍스 믹서로 20초 동안 혼합하고, 10분 동안 16,000 g로 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 새로운 튜브에 옮긴 후 5X 샘플 완충액을 넣고 95℃에서 5분간 가열하였다. 상기 샘플은 urea 겔에서 25분동안 220V에서 전기영동한 후 상기 겔을 SYBR gold로 염색하여 Gel Doc™ EZ 시스템 적외선 이미징 시스템으로 확인하였다.
그 결과, A62m combi 7 내지 combi 9는 모두 A62보다 우수한 혈청 안정성을 보여주었는 바, 당뇨병 치료제로서 생체 내에서 안정적으로 활성을 갖는 것을 알 수 있다(도 18).
상기 실시예 2-1의 IR 인산화 및 실시예 2-2의 혈청 안정성에서 가장 우수한 효과를 나타낸 A62m combi 7(서열번호 78)을 A62ms로 명명하고, 하기 실시예에서 구체적인 활성을 추가로 확인하였다.
실시예 2-3: IR 선택적 인산화 확인
상기 실시예 2-1의 IR 인산화 및 실시예 2-2의 혈청 안정성에서 가장 우수한 효과를 나타낸 A62m combi 7(A62ms)의 IR 선택적 인산화를 확인하기 위해, 인슐린 수용체의 세포 내 영역의 6개의 티로신(Y960, Y1146, Y1150, Y1151, Y1316 및 Y1322) 영역 각각의 인산화 활성을 다양한 종류의 인슐린 수용체 인산화 항체를 사용하여 웨스턴블랏을 수행하여 분석하였다. 참고적으로 Y953의 인산화 항체는 개발되지 않아 상기 영역은 제외하고 실험을 수행하였다.
구체적으로, 항-포스포(phospho)-IR 항체(Y1150/Y1151) (10C3, Santa Cruz Biotechnology), 항-포스포-IR 항체(Y960) (Invitrogen), 항-포스포-IR 항체 (Y1146) (Invitrogen), 항-포스포-IR 항체(Y1316) (Invitrogen), 항-포스포-IR 항체(Y1322) (Invitrogen), 항-포스포-IR 항체(Py) (4G10, Millipore), 항-IR-항체 (Santa Cruz, CA, USA), 항-β-액틴(D6A8) (Cell Signaling Technology)의 항체를 1차 항체로 사용하여, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 웨스턴블랏을 통해 IR의 인산화 활성을 확인하되, 상기 압타머 샘플을 처리하기 전 세포는 FBS가 포함되지 않은 DMEM에서 3 시간 동안 배양하였다.
그 결과, 인슐린은 Y960, Y1146, Y1150, Y1151, Y1316, Y1322의 모든 영역의 인산화 활성을 갖지만, A62m combi 7(A62ms)은 오직 Y1150 위치에서 특이적인 인산화를 일으켰으며, 다른 티로신 위치에 대한 인산화는 매우 낮음을 확인하였다(도 19).
다음으로, A62m combi 7(A62ms) 처리 시간별(0, 1 min, 5 min, 10 min, 30 min, 1 hr, 2 hr, 4 hr, 8 hr) 및 처리 농도별(0, 0.98, 195, .91, 7.81, 15.63, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000 nM)로 Y1150 위치에서의 인산화 정도를 인슐린 처리시와 비교하였다.
그 결과, 시간별로는 인슐린의 경우 처리 후 1 min 내지 10 min에 인산화가 일어나 짧은 시간안에 빠르게 포화(saturation)되는 반면, A62m combi 7의 경우 처리 후 서서히 인산화가 관찰되기 시작하여 10 min 내지 4 hr에 인산화가 일어남을 확인하였다.
또한, 농도별로는 인슐린과 A62m combi 7이 유사한 양상을 나타내었으나, 인슐린보다 A62 combi 7에서의 EC50가 약 4.7배 낮은 18.4 nM로 확인되었으며 인슐린에 비해 빠른 포화가 관찰되어 인산화 강도가 더 높음을 확인하였다(도 20).
실시예 2-4: 인슐린 신호전달 단백질의 인산화
상기 실시예 2-3에서 A62m combi 7(A62ms)이 인슐린에 존재하는 여러 개의 티로신 중 Y1150의 인산화만을 유도한다는 것을 확인하였는 바, 상기 선택적 인산화가 인슐린의 하위 신호전달에 어떤 영향을 끼치는지를 확인하였다.
구체적으로, 완전히 분화된 3T3-L1 세포에 95℃에서 5분간 가열하고 실온에서 식힌 A62m combi 7 200 nM, 인슐린 50 nM, 또는 A62m combi 7 200 nM 및 인슐린 50 nM 각각을 세포에 처리한 후(인슐린의 경우 5 min, 압타머의 경우 1hr 동안 처리), 이를 샘플링하여 항-포스포-IR 항체(Y1150/Y1151), 항-포스포-IR 기질 1(phospho-Insulin receptor substrate 1, pIRS-1) 항체, 항-포스포-Akt 항체(S473), 항-포스포-Akt 항체(T308), 및 항-포스포-ERK(1/2) 항체(T202/Y204)를 1차 항체로 사용하여, 웨스턴블랏을 통해 인슐린 신호전달 단백질의 인산화를 확인하였다.
그 결과, Y1150의 인산화가 관찰되지 않을 정도의 저농도의 인슐린 단독 처리 시 하위 인자들의 인산화가 잘 유도되었고 A62m combi 7의 단독처리에서는 인산화에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다. 반면에 A62m combi 7과 인슐린이 함께 처리되면 인슐린의 하위 신호 전달을 증가시키는 것을 확인하였다(도 21).
실시예 3: A62ms의 당뇨병 개선 효과 확인
실시예 3-1: A62ms의 in vitro 포도당 흡수(glucose uptake) 활성 확인
상기 실시예 2에서 선별된 A62m combi 7(A62ms)가 IR 압타머로서 정상 상태 또는 인슐린 저항성 상태에서 포도당 흡수 활성을 갖는지 확인하기 위해, 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 이용하여 in vitro에서 단위시간 동안의 포도당 흡수 속도를 확인하였다.
구체적으로, 아무런 처리도 하지 않은 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 정상 상태로 정하였고, 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포에 10ng/ml의 TNF(Tumor necrosis factor)-α를 처리하여 인슐린 저항성 상태로 유도하여 실험을 진행하였다.
완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 FBS가 없는 DMEM에 3시간 동안 배양한 후, 1시간 동안 Krebs-Ringer HEPES 완충용액으로 처리했다. 그 후, 인슐린 또는 A62ms를 1.6 nM, 8 nM, 40 nM, 200 nM, 1000 nM의 농도로 해당시간 동안 처리한 후, 2-deoxy[14C]glucose 를 10분 동안 처리하였다. 20 mM 포도당이 첨가된 PBS로 3번을 씻어내고 0.5 N NaOH와 1% SDS가 포함된 용액으로 세포를 녹여내었다. 액체 섬광 계수기(Liquid scintillation counter)를 사용하여 세포 내로 흡수된 2-Deoxy-D-glucose의 양을 관찰하였다.
그 결과, A62ms의 경우 포도당 흡수의 EC50는 197 nM 정도로, 49 nM의 EC50를 가지는 인슐린보다 4배 정도 높지만, 최대 포도당 흡수도는 인슐린 대비 100% 이상의 수치에 도달함을 확인하였다(도 22). 이에, 본 발명의 압타머가 인슐린과 포도당 흡수 효과 측면에서 유사한 효능을 가지고 있음을 알 수 있다.
실시예 3-2: A62ms의 in vitro 지방 분해(Lipolysis) 억제 활성 확인
선별된 A62m combi 7(A62ms)가 IR 압타머로서 지방분해 억제에 미치는 효과를 확인하기 위해, 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 이용하여 지방분해 과정에서 분비되는 글리세롤(Glycerol)의 양을 측정했다.
구체적으로, 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 혈청 결핍을 위해 FBS가 없는 DMEM에 3시간 동안 처리한 후, 포도당 결핍에 의한 지방분해를 유도하기 위해 1시간 동안 Krebs-Ringer HEPES 완충용액으로 처리했다. 인슐린 혹은 A62ms를 0.93nM, 2.59nM, 7.26nM, 20.34nM, 56.94nM, 159.44nM, 446.43nM, 1250nM, 3500nM의 농도로 각각 4시간 동안 처리 후, 세포에 처리된 버퍼를 채취하였다. 96 웰 플레이트에 채취된 버퍼 20ul를 각각 넣고 Free glycerol reagent(Sigma F6428) 200ul를 첨가한 후, 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후 세포에서 분비된 글리세롤 농도에 의한 발색을 540nm 흡광도를 통해 측정하였다.
그 결과, 인슐린에 의한 지방 분해의 EC50는 7.3 nM로, 포도당 흡수에 비해 6배 정도 낮았으나, 압타머에 의한 지방 분해의 EC50는 81 nM로, 포도당 흡수에 비해 1.5배 낮았다(도 23). 동일한 포도당 흡수량 대비 지방 분해 억제 효능을 비교한 결과 A62ms는 인슐린 대비 지방 분해 억제 정도가 현저히 낮았다(도 23), 이를 통해 본 발명의 압타머는 포도당 흡수량에 비해 지방 분해 억제 효능이 상대적으로 낮은 바, 동일한 양의 포도당 흡수를 유도하는 상황에서 인슐린보다 지방 분해 억제 효능이 낮음을 알 수 있다.
실시예 3-3: A62ms의 in vitro 암세포 분열 촉진 여부 확인
선별된 A62m combi 7(A62ms)가 인슐린과 같이 암세포의 분열을 촉진시키는 부작용을 나타내는지 확인하기 위해, 유방암세포주인 MCF-7 세포를 이용하여 분열된 세포의 양을 분석하였다.
구체적으로, MCF-7 세포를 24 웰 플레이트에 배양한 후, 2% FBS 조건에서 인슐린 또는 A62ms를 농도별로 3일 동안 처리하였다. 이후, 세포 내 DNA를 1 μM SYTO60 형광색소가 포함된 PBS로 염색시킨 후 LI-COR Odyssey 스캐너로 형광을 측정하여 분열된 세포의 양을 정량하였다.
그 결과, 인슐린은 MCF-7의 분열을 촉진시켰으나, A62ms는 세포의 분열을 촉진시키지 않음을 확인하였다(도 24). 이를 통해 본 발명의 압타머는 암세포 분열 촉진의 부작용 없이 안전하게 투여가능함을 알 수 있다.
실시예 3-4: A62ms의 in vivo 혈당 강하 및 체중 증가 억제 활성 확인
선별된 A62m combi 7(A62ms)가 IR 압타머로서 in vivo에서 혈당 강하 및 체중 증가 억제 효과를 나타내는지 확인하기 위해, 제2형(Type II) 당뇨병 동물 모델로써 식이와 에너지 항상성에 중요한 역할을 하는 호르몬인 렙틴의 수용체(leptin receptor)를 발현하는 유전자에 돌연변이가 있는 db/db 마우스를 이용하여 인슐린 내성 테스트(ITT: Insulin Tolerance Test) 어세이를 수행하였다.
구체적으로, 8주령의 db/db 마우스를 12시간 동안 금식시킨 후 A62ms를 PBS에 녹여 5, 10, 20 mg/kg의 용량으로 복강내 주사(Intraperitoneal injection, IP)를 통해 투여하였다. 투여 후 2, 4, 6, 8hr이 지났을 때, 꼬리로부터 혈액을 채취하여 혈당측정기(Accu-Check Active; Roche Diagnostics)를 통해 혈당 변화를 관찰하였다. 양성 대조군으로써 지속형 인슐린 제제인 란투스(Lantus) 3IU/kg를 db/db 마우스에 투여하였다.
그 결과, A62ms는 양성 대조군인 란투스와 유사한 수준의 혈당 강하 효과를 나타내었으며, 혈당 강하 지속 시간은 란투스에 비해 긴 것을 확인하였다(도 25).
다음으로, 상기 db/db 마우스(n=8)에 PBS에 녹인 A62ms를 10, 20, 30 mg/kg의 용량으로 복강주사를 통해 28일 동안 매일 투여하고 체중 변화를 관찰하였다. 양성 대조군으로써 지속형 인슐린 제제인 란투스(Lantus) 6IU/kg를 db/db 마우스에 투여하였다.
그 결과, A62ms는 양성 대조군인 란투스 대비 유의한 체중 증가 억제 효과를 나타냄을 확인하였다(도 26).
실시예 4: A62ms의 약동학 분석
혈중 반감기를 측정하기 위해 ICR 마우스에 A62ms 10 mg/kg을 단회로 정맥 주사(intravenous injection, IV) 또는 피하 주사(subcutaneous injection, SC)하고, 24시간 동안 8 point(0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 6, 12, 24 시간) 혈액을 채취하여 혈청을 확보하였다. 주사 후 24시간 뒤 개체에서 간, 신장, 넓적다리 근육 조직을 채취하여 Precellys® Lysing Kits(France)를 이용하여 분쇄하였으며 6000 RPM에서 15초간 원심분리하여 샘플링하였다. ELOHA(enzyme-linked oligonucleotide hybridization assay)를 통해 준비된 혈청과 조직 샘플로부터 압타머를 측정하였다. 측정한 값은 Phoenix® WinNonlin®(Ver. 8.2, Certara)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, A62ms의 정맥 주사 시 4.2시간의 반감기, 피하 주사 시 40% 이상의 생체 이용률(Bioavailability)과 5.2시간의 혈중 반감기가 나타남을 확인하였다(도 27). 혈중 최대 농도는(Cmax) 정맥 주사 시 125321.0 ng/mL와 피하 주사 시 6400.4 ng/mL로, 투여 경로에 따른 차이가 관찰되었다.
다음으로, in vivo에서 A62ms의 반감기를 향상시키기 위해 A62ms의 5' 말단 또는 3' 말단에 40kD 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 화학적으로 결합(conjugation)한 후, PEG에 결합에 따라 A62ms의 IR 및 Akt 인산화 효과에 영향이 있는지를 확인하였다. IR이 과발현된 Rat-1 세포에 각각의 압타머(A62ms, A62ms-PEG, PEG-A62ms)를 100, 1000 nM로 처리하여 1시간 동안 반응시켰다. 인슐린은 20 nM로 처리되었다. 1시간 후 세포를 회수하여 용해 버퍼를 이용하여 ptotein을 추출하였으며 웨스턴 블롯을 이용하여 p-1150, p-AKT의 변화를 관찰하였다.
그 결과, 5' 말단에 PEG가 결합된 A62ms(PEG-A62ms) 및 3' 말단에 PEG가 결합된 A62ms(A62ms-PEG) 모두 IR 및 Akt 인산화 활성을 나타내었으나, 3' 말단에 PEG가 결합된 A62ms가 5' 말단에 PEG가 결합된 A62ms에 비해 낮은 농도(100 nM)에서 더 강한 IR 및 Akt 인산화 활성을 나타냄을 확인하였다(도 28). 인슐린은 장시간 처리되어 p-IR(1150)의 발현이 낮게 관찰되었다.
상기 실시예의 결과로부터, 본 발명에 따라 기존의 인슐린 수용체 특이적 압타머인 A62를 화학적 최적화로 변형시킨 A62ms 압타머는, A62 압타머에 비해 IR 인산화 활성 및 혈청 내 안정성이 우수하고, 인슐린에 비해 IR 인산화 활성 및 포도당 흡수 활성이 우수하고, 지방 분해 억제 활성은 낮고, 지속형 인슐린 제제인 란투스에 상응하는 혈당 강하 효과를 나타내고, 상기 란투스에 비해 혈당 강하 지속 시간이 길고, 우수한 체중 증가 억제 효과를 나타내고, 생체 이용율 및 혈중 반감기가 우수하며, 암세포 분열 촉진의 부작용 없이 안전하게 투여할 수 있는 바, 당뇨병, 당뇨 합병증, 대사성 증후군, 비만 및 심혈관 질환 등의 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료 및 진단에 적용할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Aptamer Sciences Inc. POSTECH Research and Business Development Foundation <120> Insulin receptor aptamer and uses thereof <130> KPA220172-KR <160> 82 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IR-A62F(22-48) <400> 1 cannacgcan gagncnagan ccgncag 27 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward_F <400> 2 gagtgaccgt ccgcctg 17 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse_R <400> 3 ggctggtggt gtggctg 17 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> General formula 1 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> B is dUTP in which the 5th carbon position of the nucleotide is substituted with a hydrophobic functional group. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> B is dUTP in which the 5th carbon position of the nucleotide is substituted with a hydrophobic functional group. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> B is dUTP in which the 5th carbon position of the nucleotide is substituted with a hydrophobic functional group. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> B is dUTP in which the 5th carbon position of the nucleotide is substituted with a hydrophobic functional group. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> B is dUTP in which the 5th carbon position of the nucleotide is substituted with a hydrophobic functional group. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> B is dUTP in which the 5th carbon position of the nucleotide is substituted with a hydrophobic functional group. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> B is dUTP in which the 5th carbon position of the nucleotide is substituted with a hydrophobic functional group. <400> 4 cabbacgcab gagbcbagab ccgbcag 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 L 1 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 5 kawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 Me 2 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 6 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 F 3 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 7 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 L 4 <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 8 ckwwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 Me 5 <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> A is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 9 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 F 6 <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 10 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 L 7 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 11 cawwkcgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 15 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 F 12 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 16 cawwacgcaw 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<222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 18 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 F 15 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> G is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 19 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 L 16 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 20 cawwacgkaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 Me 17 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 21 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 F 18 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 22 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 L 19 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 23 cawwacgckw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 Me 20 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> A is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 24 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 F 21 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 25 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 L 22 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 26 cawwacgcaw kagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 Me 23 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 27 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 F 24 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> G is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 28 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 L 25 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 29 cawwacgcaw gkgwcwagaw ccgwcag 27 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> 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is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 31 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 L 28 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 32 cawwacgcaw gakwcwagaw ccgwcag 27 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 Me 29 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 33 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 F 30 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> G is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 34 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 L 31 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 35 cawwacgcaw gagwkwagaw ccgwcag 27 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 Me 32 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 36 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 F 33 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 37 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 L 34 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 38 cawwacgcaw gagwcwkgaw ccgwcag 27 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 Me 35 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 39 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 F 36 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 40 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 L 37 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 41 cawwacgcaw gagwcwakaw ccgwcag 27 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 Me 38 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 42 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 43 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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<220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 44 cawwacgcaw gagwcwagkw ccgwcag 27 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 Me 41 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> A is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 45 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 F 42 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 46 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 L 43 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 47 cawwacgcaw gagwcwagaw kcgwcag 27 <210> 48 <211> 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NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 49 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 50 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 L 46 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 50 cawwacgcaw gagwcwagaw ckgwcag 27 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 Me 47 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is 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<223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 54 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 55 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 F 51 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> G is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 55 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 56 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 L 52 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<223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <400> 57 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 58 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 F 54 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <400> 58 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 59 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 L 55 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (26) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <400> 59 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwckg 27 <210> 60 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 Me 56 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (26) <223> A is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <400> 60 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 61 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 F 57 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (26) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <400> 61 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 62 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 L 58 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <400> 62 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcak 27 <210> 63 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 Me <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <400> 63 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgwcag 27 <210> 64 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 F <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> 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(3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> W is NapdU. <400> 70 cawwacgcaw gagwcwagay ccgwcag 27 <210> 71 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62 b 7 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> Y is BndU. <400> 71 cawwacgcaw gagwcwagaw ccgycag 27 <210> 72 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62m combi 1 <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> A is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (26) <223> A is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <400> 72 cayyacgcaw gagycwagaw ccgycag 27 <210> 73 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (26) <223> A is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <400> 73 cayyacgcaw gagycwagaw ccgyca 26 <210> 74 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62m combi 3 <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> A is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> 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(6) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> A is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> Y is BndU. <400> 75 cayyacgcaw gagycwagaw ccgy 24 <210> 76 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62m combi 5 <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (26) <223> A is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <400> 76 cayyacgcaw gagycwagaw ccgycag 27 <210> 77 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62m combi 6 <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (26) <223> A is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <400> 77 cayyacgcaw gagycwagaw ccgycak 27 <210> 78 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62m combi 7(A62ms) <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <400> 78 cayyacgcaw gagycwagaw ccgyc 25 <210> 79 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62m combi 8 <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (26) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <400> 79 cayyacgcaw gagycwagaw ccgycag 27 <210> 80 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62m combi 9 <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> G is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> A is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> G is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (26) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <400> 80 cayyacgcaw gagycwagaw ccgycag 27 <210> 81 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A62m combi 10 <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> G is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> A is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> W is NapdU. <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> C is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> C is a nucleotide in which a fluorine group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> Y is BndU. <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <220> <221> misc_feature <222> (26) <223> A is a nucleotide in which a methoxy group is introduced at the second carbon position. <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> K is a nucleotide to which a C3 linker is attached. <400> 81 cayyacgcaw gagycwagaw ccgykak 27 <210> 82 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> General formula 1' <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> B is NapdU or BndU. <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> B is NapdU or BndU. <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> B is NapdU or BndU. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> B is NapdU or BndU. <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> B is NapdU or BndU. <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> B is NapdU or BndU. <220> <221> misc_feature <222> (24) <223> B is NapdU or BndU. <400> 82 cabbacgcab gagbcbagab ccgbc 25

Claims (20)

  1. 하기의 일반식 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 인슐린 수용체 특이적 압타머:
    [일반식 1]
    5'- CABBACGCAB GAGBCBAGAB CCGBCAG- 3' (서열번호 4);
    여기서 상기 일반식 1의 B는 뉴클레오티드의 5번째 탄소 위치가 소수성 작용기로 치환된 데옥시리보스 우라실(deoxyuracil)이고,
    상기 일반식 1의 C는 변형 또는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 변형은 뉴클레오티드에 링커(C3 linker) 결합; 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기(2-O-Me, 2-O-Methoxy-DNA) 도입; 및 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소(2-F, 2-Fluorine-DNA) 도입;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변형을 포함하고,
    상기 일반식 1의 G는 변형 또는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 변형은 뉴클레오티드에 링커 결합; 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기 도입; 및 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소 도입;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변형을 포함하고,
    상기 일반식 1의 A는 변형 또는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 변형은 뉴클레오티드에 링커 결합; 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기 도입; 및 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소 도입;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변형을 포함함.
  2. 제1항에 있어서, 상기 소수성 작용기는 나프틸기, 벤질기, 피롤벤질기, 이소부틸기 및 트립토판으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 인슐린 수용체 특이적 압타머.
  3. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 상기 일반식 1의 서열의 3' 말단 또는 5' 말단 중 선택되는 어느 하나로부터 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 제외된 것인, 인슐린 수용체 특이적 압타머.
  4. 제3항에 있어서, 상기 압타머는 하기의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 인슐린 수용체 특이적 압타머:
    5'- CABBACGCAB GAGBCBAGAB CCGBC- 3' (서열번호 82);
    여기서 상기 일반식 1의 B는 dUTP 뉴클레오티드의 5번째 탄소가 나프틸기로 치환된 나프틸-우라실 뉴클레오티드; 또는 dUTP 뉴클레오티드의 5번째 탄소가 벤질기로 치환된 벤질-우라실 뉴클레오티드; 중 선택되는 어느 하나 이상이고,
    상기 일반식 1의 C는 변형 또는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 변형은 뉴클레오티드에 링커 결합; 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기 도입; 및 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소 도입;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변형을 포함하고,
    상기 일반식 1의 G는 변형 또는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 변형은 뉴클레오티드에 링커 결합; 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기 도입; 및 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소 도입;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변형을 포함하고,
    상기 일반식 1의 A는 변형 또는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 변형은 뉴클레오티드에 링커 결합; 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기 도입; 및 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소 도입;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변형을 포함함.
  5. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 서열번호 5 내지 서열번호 81의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 인슐린 수용체 특이적 압타머.
  6. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 이의 3' 말단 또는 5' 말단 중 선택되는 어느 하나 이상에 PEG(polyethylene glycol), idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 아민 링커(amine linker), 티올 링커(thiol linker) 및 콜레스테롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 결합된 것인, 인슐린 수용체 특이적 압타머.
  7. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 인슐린과 경쟁적 또는 비경쟁적으로 인슐린 수용체에 결합하는 것인, 인슐린 수용체 특이적 압타머.
  8. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 인슐린 수용체의 Y1150을 인산화시키는 것인, 인슐린 수용체 특이적 압타머.
  9. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 AKT를 인산화시키는 것인, 인슐린 수용체 특이적 압타머.
  10. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 ERK의 인산화를 감작시키는 것인, 인슐린 수용체 특이적 압타머.
  11. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 세포의 포도당 흡수를 증가시키는 것인, 인슐린 수용체 특이적 압타머.
  12. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 세포 분열을 촉진시키지 않는 것인, 인슐린 수용체 특이적 압타머.
  13. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 혈당 강하 활성을 나타내는 것인, 인슐린 수용체 특이적 압타머.
  14. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 체중 증가 억제 활성을 나타내는 것인, 인슐린 수용체 특이적 압타머.
  15. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 40% 이상의 생체 이용률(Bioavailability)을 나타내는 것인, 인슐린 수용체 특이적 압타머.
  16. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 5 시간 이상의 혈중 반감기를 나타내는 것인, 인슐린 수용체 특이적 압타머.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 압타머를 포함하는, 인슐린 수용체 작용제(agonist).
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 압타머를 유효성분으로 포함하는, 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 인슐린 관련 질환은 당뇨병, 당뇨 합병증, 대사성 증후군, 비만 및 심혈관 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 압타머를 포함하는, 당뇨병 또는 당뇨 합병증 진단용 조성물.
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