JP6514825B2 - インスリン受容体アプタマーおよびこれを含む薬学的組成物 - Google Patents
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Description
分離された生物学的試料を準備する段階と、
前記生物学的試料に、本発明によるインスリン受容体アプタマーを反応させる段階と、
前記生物学的試料におけるインスリン受容体アプタマーの結合程度を測定する段階とを含み、
生物学的試料におけるインスリン受容体アプタマーの結合程度が正常な試料より高い場合、糖尿病であると診断することを特徴とするものであってもよい。
ヒトインスリン受容体蛋白質は、R&D system(Minneapolie、MN)から購入して使用した。使用されたアプタマーは、Aptamer Science,Inc.(Pohang、Korea)とST Pharm(Siheung、Korea)により合成された。ウェスタンブロットの際に使用した抗体は、次の通りである:Anti−phosphor−ERK(T202/Y204)、Anti−AKT、Anti−phosphor−AKT(S473)、Anti−phosphor−AKT(T308)、anti−phospho−FoxO1/3a(T24/T32)、およびanti−phospho−AS160(T642)(signaling、Beverly、MA)。Anti−IR β−subunit(C−19)、anti−IGF−1R β−subunit(C−20)、anti−phospho−IR(10C3、Y1150/Y1151)、anti−phospho−IRS1(Y632)、およびanti−phospho−Shc(Y239/Y240)抗体は、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz Biotechmology、Snata Cruz、CA)から購入する。Anti−phospho−tyrosine(4G10)、anti−phospho−IRS1(Y612)human/(Y608)mouse、およびanti−phospho−IR(Y1146)(Millipore、Darmstadt、Germany)。Anti−phospho−IR(Y960)、anti−phospho−IR(pAb、Y1150/Y1151)、anti−phospho−IR(Y1316)、anti−phospho−IR(Y1322)、anti−phospho−IR(Y1146/Y1150/Y1151)(Invitrogen、Carlsbad、CA)。
MCF7ヒト乳癌細胞株、ヒト胚腎臓細胞HEK293、マウス脂肪細胞3T3−L1は、American Type Culture Collection(Manassas、VA、USA)から購入した。インスリン受容体が過発現したRat−1線維細胞(Rat−1/hIR)は、University of CaliforniaのNicholas J.G.Webster博士から提供された。MCF7、HEK293、Rat−1/hIRは、10%fetal bovine serum(Gibco)、penicillin(100units/ml)、およびstreptomycin(100units/ml)が補充されたDulbecco’s modified Eagle’s medium(Lonza)にて、37℃および5%CO2の条件下で培養した。3T3−L1は、0%Bovine serum(Gibco)、penicillin(100units/ml)、およびstreptomycin(100units/ml)が補充されたDulbecco’s modified Eagle’s medium(Lonza)にて、37℃および5%CO2の条件下で培養した。
SELEXを用いてインスリン受容体の細胞外領域に結合するアプタマーを発掘した。40merの可変配列と両側に20merずつ存在する不可変配列とから構成された単鎖DNAライブラリー(配列番号3)を用いてSELEXを進行させた。
SELEXに必要な単鎖修飾DNAライブラリーを製造するために、5’にビオチン(biotin)の結合したアンチセンスライブラリー(配列番号3)を合成した。アンチセンスライブラリーを、0.5mMのdNTP(ATP、GTP、CTP、Bz−dU)、0.25U/ulのKOD XL(Invitrogen)、10X伸長緩衝液(1.2M Tris−HCl pH7.8、100mM KCl、60mM(NH4)2SO4、70mM MgSO4、1%TritonX−100、1mg/ml BSA)上で、70℃1時間、50uMの逆方向プライマー(配列番号4)と反応させて、二重螺旋DNAを製造した。これに、20mM NaOHを用いて単鎖修飾DNAライブラリーを溶出した後、HCL溶液で中和した。製造されたDNAライブラリーは、Amicon ultra−15(Millipore)を用いて濃縮した後、UV分光光度計(spectrophotometer)で定量した。
前記合成されたライブラリー1nmoleを選択緩衝液(selection buffer)(200mM HEPES、510mM NaCl、25mM KCl、25mM MgCl2)に入れて、95℃、70℃、48℃、37℃でそれぞれ5分間反応させた後、陰性選択(Negative selection)のために、10X蛋白質競争緩衝液(protein competition buffer)(10μM プロトロンビン、10μM カゼイン、0.1%(w/v)HSA(ヒト血清アルブミン、SIGMA)10μLを混合した後、上澄液の除去されたDynabeads(登録商標) MyOneTm ストレプトアビジン C1(SAビーズ)(50%(v/v)スラリー、10mg/ml Invitrogen)に添加して、37℃で10分間反応させた。
標的に結合するライブラリーDNAをQPCR(quantitative PCR、IQ5 multicolor real time PCR detection system、Bio−rad)を用いて増幅した。先にライブラリーの製造に使用された逆方向プライマー(配列番号4)とアンチセンスライブラリー(配列番号3)を、それぞれ5uM(5X QPCR master Mix、Novagen)、0.075U/ul KOD(Novagen)、1mM dNTP(Roche Applied science)、25mM MgCl2、5XSYBRgreenI(Invitrogen)の総体積が125μLとなるように混合して、96℃15秒、55℃10秒、68℃30分の条件で1回、そして、96℃15秒、72℃1分の条件で30回繰り返して、二重鎖ライブラリーを製造した。
eDNAは、酵素DNAでDNA鋳型とポリメラーゼを用いて生産したアプタマーを意味する。前記QPCRにより作られたDNAライブラリーを、25μL Myone SAビーズ(Invitrogen)に常温で10分間混合して固定した。この時、混合されたDNAの量は、QPCR産物で60ulとした。20mM NaOH溶液を添加して、単鎖DNAとして作った。そして、実施例1.1のライブラリーの製造と同様の方法で修飾された核酸を含むDNAを合成して次回に使用した。SELEXの一通りの手順を計8回行い、より選択的な結合のために、4回から6回まで、そして、7回から8回まで、それぞれDNAと蛋白質(インテグリンαVβ3)の複合体を10mM DxSO4(sigma)溶液に1/200、1/400に希釈して、DNAアプタマーを選別した。
SELEXの一通りの手順を8回経た後、その結果物をQPCR方法で二重鎖DNAに増幅した後、TAクローニングキット(SolGent)を用いてクローニングした。そして、ベクター上に存在するM13プライマー(配列番号5)をもってシーケンシングして、アプタマーの配列を得た。
アプタマーを探すために、発掘されたアプタマー(1uM)をインスリン受容体が過発現しているHEK293細胞に処理して、AKT S473のリン酸化が増加するかを分析した。ほとんどのアプタマーは効果がなかったが、発掘されたIR−A48FおよびIR−A62Fアプタマーは、AKTのリン酸化を大きく増加させた。IR−A48FおよびIR−A62Fの配列は、可変領域に8個のNap−dUを含む80merで構成されているが(図1A、図1D)、標的との結合に必要なアプタマーの最小配列を探すために、アプタマーの2次構造に基づいてアプタマー配列の最小化を行った。
アプタマーは、核酸専用の固相合成器であるBioautomation社のMermade12合成器を用いて、オリゴ固相合成(Solid Phase Oligo Synthesis)方法で自体合成した。オリゴヌクレオチド合成器(Bioautomation、Mermade12)を用いてβ−シアノエチル ホスホロアミダイト固相化学反応(solid phase b−cyanoethyl phosphoramidite chemistry)で合成し、合成後、CPG(200nmole 合成カラム、1000A(MM1−1000−))を開裂(cleavage)溶液[t−ブチルアミン:メタノール:水(体積比1:1:2)]に入れて、70℃で5時間開裂/脱保護(deprotection)後に真空乾燥させた後、HPLC(GE、AKTA basic)を用いて分離/精製した。使用したカラムは、RP−C18カラム(Waters、Xbridge OST C18 10x50mm)であり、UV254nm/290nm、流速:5ml/分、温度:65℃の条件で、0.1M TEAB/アセトニトリル緩衝液を用いた。これらのアプタマーはいずれも、LC−ESI MS分光計(Waters HPLC systems(Waters)+Qtrap2000(ABI))で0.02%の誤差範囲内で正確な分子量を測定し、HPLCを用いた純度測定から80−90%を得ることができた。
2.1.細胞実験のための準備
アプタマーを処理する前、血清欠乏のために、細胞をFBSのないDMEMに3時間処理した。以降、1時間、Krebs−Ringer HEPES緩衝液[25mM HEPES(pH7.4)、120mM NaCl、5mM KCl、1.2mM MgSO4、1.3mM CaCl2、および1.3mM KH2PO4]に細胞処理した。細胞処理のためのすべてのアプタマーは、同一のKrebs−Ringer HEPES緩衝液に準備され、正確な2次構造形成のために、95℃で5分間加熱して、常温でゆっくり冷やす過程を経た。
実施例1で発掘されたIR−A48およびIR−A62のインスリン受容体に対する結合特性を調べるために、フローサイトメトリー(Flow cytometry)を用いてインスリン競合分析(Insulin competition assay)を進行させた。Rat−1/hIR細胞を、5mM EDTAが含まれているPBSを用いて細胞培養容器から引き離した。準備された細胞にブロッキング緩衝液(Blocking buffer)(PBS、1%BSA、および0.1%NaN3)を処理して、4℃で30分間、20rpmで回転して反応させた。以降、FITCの結合したインスリンを多様な濃度のIR−A48と共に処理して、それぞれの結合が平衡状態に至るように、4℃で1時間反応させた。細胞をPBSで2回洗った後、4%パラホルムアルデヒドが含まれているPBSで常温に30分間固定させた。細胞に結合したインスリンの量をフローサイトメトリー(Flow cytometry、BD FACSCantoTM II)によりFITCの蛍光を測定することによって観察した。
選別されたアプタマーの結合力を調べるために、フィルタ結合分析法(filter binding assay)を行った。まず、アプタマーの5’末端にTdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase、NEB)でα−P32ATP(PerkinElmer)を標識した。アプタマー1μM0.25μL、α−P32ATP(5μM、perkinelmer)、0.25μL、TdTおよび10X NEB緩衝液4 10μL 反応体積で37℃で30分間反応させ、70℃で10分間インキュベーションして、TdTを不活性化させた。標識されたDNAプールは、Micro spin G−50 カラム(GE healthcare)を用いて精製した。
3.1.ウェスタン ブロッティング
インスリン受容体および信号伝達蛋白質のリン酸化を観察するために、溶解緩衝溶液[50mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、20mM NaF、10mM β−グリセロリン酸、2mM Na3VO4、1mM PMSF、10%グリセロール、1%Triton−X、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル]に細胞を溶解させた。細胞溶解物は、95℃、14,000rpmで15分間遠心分離して蛋白質を分離した。準備された細胞溶解物は6%〜16%SDS−PAGE上で電気泳動し、ニトロセルロース膜(Nitrocellulose membrane)に移された。膜に1次抗体を4℃で12時間反応させた後、HPR(ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ(Horseradish peroxidase))あるいはIRDye800CW(LI−COR)の結合した2次抗体を常温で1時間反応させた。蛋白質の存在およびリン酸化の程度は、ECL(Thermo Scientific、MA)を介したChemiluminescenceあるいはInfrared fluorescence system(Odyssey、LI−COR)を用いて測定された。
実施例1のIR−A48およびIR−A62アプタマーがインスリンの結合に及ぼす影響を調べるために、IR−A48、IR−A62およびインスリンを処理する場合、インスリン受容体のリン酸化の程度を前記記載のウェスタンブロッティング法により観察し、その結果を図2Bおよび図2Dに示した。
実施例1で発掘されたIR−A48およびIR−A62アプタマーのリン酸化効果を調べるために、6種類の抗体を使用した。インスリンが受容体に結合する時、細胞内領域の7つのチロシン(Y953、Y960、Y1146、Y1150、Y1151、Y1316およびY1322)がリン酸化されるが、このうち、Y953に対する抗体は開発されず、計6つのチロシンに対して実験した。
実施例1で発掘されたIR−A48によるY1150のリン酸化がインスリンの信号伝達にどのような異なる影響を及ぼすかをインスリンと比較した。
4.1.3T3−L1脂肪細胞におけるブドウ糖吸収
前記実施例1で発掘されたIR−48がAKT S473のリン酸化を増加させたため、ブドウ糖吸収に対するIR−A48の活性を3T3−L1脂肪細胞で調べた。
前記実施例1で発掘されたIR−A48の活性がPI3Kを介して伝達されるか否かを確認するために、3T3−L1でPI3K阻害剤(LY294002)を1時間処理した後、IR−A48によるAKTのリン酸化とブドウ糖吸収の増加を調べた。その結果、IR−A48によるブドウ糖吸収だけでなく、AKTのリン酸化もLY294002によって阻害することを確認した。その結果を図6Cおよび図6Dに示し、これは、IR−A48によるAKTのリン酸化とブドウ糖吸収の増加は、インスリンと同様に、PI3Kを介して誘導されることを示す。
実施例1で発掘されたIR−A48が細胞***に及ぼす影響を調べるために、インスリンの細胞***誘導能力を実験するのに幅広く使用されるMCF−7癌細胞株を使用した。
前記実施例3〜実施例6の結果をin vivoで証明するために、実施例1で発掘されたIR−A48がマウスの血糖に及ぼす影響を測定した。
Claims (19)
- インスリン受容体の細胞外領域に特異的に結合し、インスリン受容体のリン酸化を促進するアプタマーであって、
前記アプタマーは、配列番号2または配列番号7の塩基配列を含むものである、インスリン受容体アプタマー。 - 前記アプタマーは、インスリン受容体に結合し、IGF−1受容体には結合しないことを特徴とする、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記アプタマーは、インスリン受容体のY1150をリン酸化するか、またはAKT S473をリン酸化させるものである、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記アプタマーは、MAPK経路と独立した経路で活性化させることを特徴とする、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記アプタマーは、インスリン受容体のリン酸化を起こすが、細胞の成長または***を起こさないものである、請求項4に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記アプタマーは、配列番号1の塩基配列内の配列番号2の塩基配列を必須として含み、前記配列番号2の塩基配列の少なくとも一末端に連続する33個〜80個のヌクレオチドからなるものである、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記アプタマーは、配列番号6の塩基配列内の配列番号7の塩基配列を必須として含み、前記配列番号7の塩基配列の少なくとも一末端に連続する27個〜80個のヌクレオチドからなるものである、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記アプタマーは、配列番号2または配列番号7の塩基配列がステム−ループ構造を形成するものである、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記疎水性官能基は、ナフチル基、ベンジル基、ピロールベンジル基、およびトリプトファンからなる群より選択された1種以上である、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記配列番号2の塩基配列を含むアプタマーは、インスリン受容体と結合時の解離定数(Kd)が1〜20nMである、請求項6に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記配列番号2の塩基配列を含むアプタマーは、インスリン受容体と結合時の解離定数(Kd)が0.5〜40nMである、請求項6に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 前記アプタマーに含まれている少なくとも1つの塩基は、PEG、ビオチンidT、LNA、2’−メトキシヌクレオシド、2’−アミノヌクレオシド、2’F−ヌクレオシド、アミンリンカー、チオールリンカー、およびコレステロールからなる群より選択された1種以上が結合して修飾されたことを特徴とする、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 二量体または多量体として存在する、請求項1に記載のインスリン受容体アプタマー。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のインスリン受容体アプタマーを含む、インスリン受容体作用剤。
- 前記アプタマーは、インスリン受容体に結合し、IGF−1受容体には結合しないことを特徴とする、請求項14に記載の作用剤。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のインスリン受容体アプタマーを有効成分として含有する、インスリン関連疾患の予防または治療用薬学組成物。
- 前記疾患は、糖尿病、糖尿合併症、代謝性症候群、肥満または心血管疾患である、請求項16に記載の薬学組成物。
- インスリンを追加的に含む、請求項17に記載の薬学組成物。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のインスリン受容体アプタマーを有効成分として含有する、糖尿病または糖尿合併症の診断用組成物。
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