CN107604064B - Ccl20在肿瘤化疗疗效评估和肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及CCL20在肿瘤化疗疗效评估和肿瘤治疗中的应用。具体地，本发明提供了一种CCL20基因、mRNA、cDNA、蛋白或其检测试剂的用途，用于制备检测紫杉烷类药物耐药性的诊断试剂或试剂盒。研究表明，CCL20可作为(i)检测紫杉烷类药物耐药性的标记物，和/或(ii)减弱紫杉烷类药物耐药性的靶标。本发明还提供一种基于CCL20减弱紫杉烷类药物耐药性的方法和药物组合物。

Description

CCL20在肿瘤化疗疗效评估和肿瘤治疗中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤学和诊断领域。更具体地，本发明涉及CCL20在肿瘤化疗疗效评估和肿瘤治疗中的应用。

背景技术

全世界每年有700多万人患癌症，其中约有500多万人被癌症夺去生命，约占死亡总数的10％。癌症向人类提出了严峻的挑战，癌症的预防和治疗仍是人类生物医药领域三大难题之一。如今在临床上抗癌治癌的方法主要有手术疗法、药物疗法(包括化学药物、生物工程药物和放射药物疗法)和物理疗法(如利用光、热、超声波等的作用)。

化疗是目前治疗癌症最有效的手段之一。化疗是化学药物治疗的简称，通过使用化学药物，在肿瘤细胞生长繁殖的不同环节上抑制或杀死肿瘤细胞，从而达到治疗目的。化疗是一种全身治疗的手段，化疗药物会随着血液循环遍布全身的绝大部分器官和组织。因此，对一些有全身播撒倾向的肿瘤及已经转移的中晚期肿瘤，化疗都是主要的治疗手段。

然而，在一些病人中，化疗过程中出现的药物抵抗问题大大限制了化疗效果。而针对目前临床上较为常用的紫杉烷类药物的抵抗问题，还未得到很好的解决，这给癌症治疗带来了很大的阻碍。近年来的科学研究表明，肿瘤微环境中的细胞因子在肿瘤进展中发挥着重要作用，参与了肿瘤生长、转移、药物抵抗等多个过程。

因此，探索紫杉烷类治疗过程中的细胞因子变化及其可能与耐药的关系，寻找一种有效诊断和治疗紫杉烷类药物耐药性的试剂和方法，已成为基础研究与临床医学的当务之急。

发明内容

本发明的目的是提供一种CCL20基因、mRNA、cDNA、或蛋白或其检测试剂的用途。

本发明的另一目的是提供一种基于CCL20减弱紫杉烷类药物耐药性的方法和药物组合物。

本发明的第一方面，提供了一种CCL20基因、mRNA、cDNA、蛋白、或其检测试剂的用途，用于制备检测紫杉烷类药物耐药性的诊断试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的蛋白包括全长蛋白或蛋白片段。

在另一优选例中，所述CCL20基因、mRNA、cDNA、或蛋白来源于哺乳动物。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人和非人哺乳动物，较佳地包括啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物(如人)。

在另一优选例中，所述CCL20基因、mRNA、cDNA、或蛋白来源于人。

在另一优选例中，所述的紫杉烷类药物耐药性指癌症或癌症细胞对紫杉烷类药物的耐药性。

在另一优选例中，所述癌症选自下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、***癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、***癌、***、淋巴癌、肾上腺肿瘤、或***。

在另一优选例中，所述癌症选自下组：乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、或其组合。

在另一优选例中，所述乳腺癌包括三阴性乳腺癌和非三阴性乳腺癌。

在另一优选例中，所述检测是针对离体样本的检测。

在另一优选例中，所述的离体样本包括：血液样本、血清样本、组织样本、体液样本或其组合。

在另一优选例中，所述检测试剂包括CCL20的抗体、特异性结合分子、引物、探针或芯片(如核酸芯片或蛋白质芯片)。

在另一优选例中，所述检测试剂包括：

(a)CCL20的特异性抗体、CCL20的特异性结合分子；和/或

(b)特异性扩增CCL20mRNA或CCL20cDNA的引物或引物对、探针或芯片。

在另一优选例中，所述的检测试剂偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

在另一优选例中，所述诊断试剂包括抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)或蛋白质芯片。

在另一优选例中，所述的核酸芯片包括基片和点样在基片上的特异性寡核苷酸探针，所述的特异性寡核苷酸探针包括与CCL20多核苷酸(mRNA或DNA)特异性结合的探针。

在另一优选例中，所述的蛋白质芯片包括基片和点样在基片上的特异性抗体，所述的特异性抗体包括抗CCL20的特异性抗体。

在另一优选例中，所述的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

在另一优选例中，所述用途还包括用于预测紫杉烷类药物耐药者的生存时间(预后)。

本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有一检测试剂，所述检测试剂用于检测CCL20基因、mRNA、cDNA、蛋白、或其组合。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有CCL20基因、mRNA、cDNA、和/或蛋白作为对照品或质控品。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断紫杉烷类药物耐药性。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：

如果检测对象的CCL20浓度C1显著高于对照参比值C0，则该对象发生紫杉烷类药物耐药的几率大于一般癌症患者。

在另一优选例中，所述的对照参比值C0为正常人群中相同样本中的CCL20浓度、或一般癌症患者人群中相同样本中的CCL20浓度、或该检测对象在接受紫杉烷类药物治疗前自身的相同样本中的CCL20浓度。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：

如果被检测细胞中CCL20浓度Z1显著高于对照参比值Z0，则该被检测细胞发生紫杉烷类药物耐药的几率大于一般细胞。

在另一优选例中，所述的被检测细胞为肿瘤细胞，并且所述的“一般细胞”是与所述被检测细胞同类的细胞。

在另一优选例中，所述的对照参比值Z0为所述一般细胞中的CCL20浓度、或正常的同类细胞中的CCL20浓度、或未接受紫杉烷类药物处理的同类细胞中的CCL20浓度。

在另一优选例中，所述的CCL20浓度包括CCL20浓度、CCL20的mRNA浓度、或其组合。

在另一优选例中，所述“显著高于”指C1/C0或Z1/Z0的比值≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3。

在另一优选例中，所述的试剂盒用于检测紫杉烷类药物耐药性。

本发明的第三方面，提供了一种检测紫杉烷类药物耐药性的方法，所述方法包括：

a)提供一来自待测对象的测试样本，所述的测试样本选自下组：血液样本、血清样本或其组合；

b)检测所述测试样本中CCL20蛋白的浓度，记为C1；和

c)将所述的CCL20蛋白的浓度C1与对照参比值C0进行比较，

其中所述样本中CCL20蛋白的浓度C1显著高于对照参比值C0，则表明所述待测对象发生紫杉烷类药物耐药的几率高于普通人群。

在另一优选例中，所述的待测对象包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的普通人群包括健康人群或一般的癌症患者。

在另一优选例中，所述的对象为癌症患者。

在另一优选例中，所述癌症选自下组：乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、或其组合。

在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。

在另一优选例中，所述的“显著高于”指C1与C0之比≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3。

在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。

本发明的第四方面，提供了一种体外确定离体肿瘤细胞的紫杉烷类药物耐药性的方法，所述方法包括：

(a)提供一待检测的离体肿瘤细胞，作为被检测细胞；和

(b)检测所述被检测细胞中CCL20浓度，记为Z1；

其中，如果所述Z1显著高于对照参比值Z0，则该被检测细胞发生紫杉烷类药物耐药的几率大于一般细胞。

在另一优选例中，所述的被检测细胞为肿瘤细胞，并且所述的“一般细胞”是与所述被检测细胞同类的细胞。

在另一优选例中，所述的对照参比值Z0为所述一般细胞中的CCL20浓度、或正常的同类细胞中的CCL20浓度、或未接受紫杉烷类药物处理的同类细胞中的CCL20浓度。

在另一优选例中，所述的CCL20浓度包括CCL20浓度、CCL20的mRNA浓度、或其组合。

在另一优选例中，所述“显著高于”指Z1/Z0的比值≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3。

在另一优选例中，所述的癌症细胞选自下组：乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、卵巢癌细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。

本发明的第五方面，提供了一种CCL20基因、mRNA、cDNA、或蛋白的用途，用作检测紫杉烷类药物耐药性的标志物；和/或用作减弱紫杉烷类药物耐药性的靶标。

本发明的第六方面，提供了一种CCL20的拮抗剂的用途，用于制备(a)用于减弱紫杉烷类药物耐药性的药物；和/或(b)用于增加紫杉烷类药物抗肿瘤效果的增敏剂。

在另一优选例中，所述的拮抗剂选自下组：针对CCL20的反义核酸(如siRNA、shRNA、反义RNA、反义DNA)、抗体、小分子化合物、或其组合。

在另一优选例中，所述的小分子化合物为降低CCL20表达或活性的小分子化合物。

本发明的第七方面，提供了一种用于减弱紫杉烷类药物耐药性的药物组合物，含有药学上可接受的载体以及CCL20的拮抗剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物还含有其他额外的治疗剂。

在另一优选例中，所述的治疗剂包括化疗药物。

在另一优选例中，所述的化疗药物为紫杉烷类药物。优选地，所述的药物组合物还含有紫杉醇、多西他赛、或其他紫杉烷类化疗药物。

在另一优选例中，所述的药物组合物通过选自下组的用药方式进行给药：口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。

在另一优选例中，所述的药物的制剂选自下组：片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、或喷雾剂。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人、小鼠、大鼠，更佳地，为人。

本发明的第八方面，提供了一种减弱紫杉烷类药物耐药性的方法，包括步骤：给需要的对象施用CCL20的拮抗剂。

在另一优选例中，所述的对象包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。

本发明的第九方面，提供了一种体外非治疗性的减弱紫杉烷类药物耐药性的方法，包括步骤：将所述的细胞与CCL20的拮抗剂进行接触；

在另一优选例中，所述细胞为紫杉烷类药物耐药性细胞。

在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了紫杉烷类药物处理使三阴性乳腺癌细胞中CCL20的相对mRNA水平显著升高。

图2显示了紫杉烷类药物处理使三阴性乳腺癌细胞中CCL20的蛋白水平显著升高。

图3显示了紫杉烷类药物处理使非三阴性乳腺癌细胞中CCL20的相对mRNA水平显著升高。

图4显示了紫杉烷类药物处理使非三阴性乳腺癌细胞中CCL20的蛋白水平显著升高。

图5显示了CCL20在多类型癌症的耐药细胞中高水平表达。

图6显示了CCL20在化疗抵抗的乳腺癌病人血清中具有更高的水平。

图7显示了CCL20中和抗体对乳腺癌干细胞对紫杉烷类化疗药物抵抗的影响。

图8显示了CCL20中和抗体能够明显减弱乳腺癌耐药株的药物抵抗。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，CCL20对紫杉烷类化疗药物的响应现象。CCL20在紫杉烷类药物耐药性细胞中特异性高表达，因此可用作紫杉烷类药物耐药性的标志物。实验结果显示，(a)紫杉烷类化疗药物处理使得肿瘤细胞CCL20表达水平显著增加；(b)CCL20在多种癌症的紫杉醇耐药株中显著高表达；(c)CCL20在化疗抵抗的乳腺癌病人血清中具有更高的水平。因此，CCL20可以作为检测紫杉烷类药物耐药性的标志物，应用于包括乳腺癌在内的多种癌症的紫杉烷类药物治疗效果的评判标志。本发明的实验还进一步证明：CCL20中和抗体能够明显减弱乳腺癌耐药株的药物抵抗。因此CCL20是一种极有价值的减弱紫杉烷类药物耐药性的靶标，CCL20的拮抗剂可用于制备(a)用于减弱紫杉烷类药物耐药性的药物和/或(b)用于增加紫杉烷类药物抗肿瘤效果的增敏剂，进一步提高肿瘤治疗效果。在此基础上完成了本发明。

术语

本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样本可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。样本也可以是以某种方式与受试者接触过的材料，这种接触方式使得对样本进行的测试可以提供与受试者有关的信息。样本也可以是已经与其它材料接触过的材料，这种其它材料不是受试者的，但是能够使第一材料随后被测试以确定与受试者有关的信息，例如样本可以是探针或解剖刀的清洗液。样本可以为接触受试者之外的生物材料源，只要本技术领域的专业人员仍然能够从样本确定与受试者有关的信息就行。

如本文所用，术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，并且包括由RNA或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cDNA，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如western印迹上半点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。

如本文所用，术语“参比值”或“对照参比值”是指当与分析结果相比时与特定结果统计学相关的值。在优选的实施方案中，参比值是根据对比较CCL20蛋白的表达与已知的临床结果的研究进行的统计学分析来确定的。在本文的实施例部分中显示了一些这样的研究。但是，来自文献的研究和本文公开的方法的用户经验也可用于生产或调整参比值。参比值也可以通过考虑与患者的医疗史、遗传学、年龄和其它因素特别相关的情况和结果来确定。

如本文所用，术语“三阴性乳腺癌(Triple Negative Breast Cancer，TNBC)”指***受体阴性(ER^-)，孕酮受体阴性(PR^-)和Her2阴性(Her2^-)的乳腺癌。

CCL20蛋白和多核苷酸

在本发明中，术语“CCL20”、“本发明蛋白”、“CCL20蛋白”、或“CCL20多肽”可互换使用，都指具有CCL20氨基酸序列的蛋白或多肽，它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的CCL20蛋白。此外，该术语还包括全长的CCL20及其片段。本发明所指的CCL20蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。

CCL20基因位于2号染色体，CCL20mRNA编码合成96个氨基酸的前体蛋白，最后切割成为拥有70个氨基酸的成熟蛋白。CCL20属于CC亚族的一类趋化因子。趋化因子又称趋化性细胞因子，是一组由组织细胞和炎性细胞产生的具有多种生物学功能的小分子生物活性肽，是由70到100个左右的氨基酸残基组成的，一般相对分子质量为8kD到10kD。除了CCL20所属的CC亚族外，趋化因子还包括其他3类：C亚族、CXC亚族和CX3C亚族，它们是根据N端保守的半胱氨酸的排列方式分类的，它们的受体是一类具有7个跨膜区的G蛋白偶联蛋白。CCL20的受体为CCR6，而且CCL20是目前发现的CCR6在体内唯一的配体。CCL20在被激活的单核细胞、T细胞、DC和内皮细胞中表达，其受体CCR6表达于肝脏组织、皮肤角质上皮细胞和肠道上皮细胞等部位。

人的CCL20蛋白全长为96个氨基酸(登录号NP_004582.1)。

鼠的CCL20蛋白全长为97个氨基酸(登录号NP_058656.1)。

人的CCL20基因的基因组全长3723bp(登录号为NC_000002.12)，其转录产物mRNA序列全长851bp(NCBI GenBank登录号为NM_004591.2)。

鼠的CCL20基因的基因组全长2402bp(登录号为NC_000067.6)，其转录产物mRNA序列全长852bp(NCBI GenBank登录号为NM_016960.2)。

人和鼠CCL20，在DNA水平的相似性为75％，蛋白序列相似性为64％。

在本发明中，术语“CCL20基因”、“CCL20多核苷酸”或“CC类趋化因子配体20基因”可互换使用，都指具有CCL20核苷酸序列的核酸序列。

需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。

在本发明中，本发明的蛋白还包括其保守性变异体，指与本发明蛋白的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

在得到了CCL20的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的CCL20核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的CCL20多肽。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码人CCL20多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，CCL20多核苷酸序列可***到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含CCL20编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

特异性抗体

在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗CCL20的特异性抗体”可互换使用。

本发明还包括对人CCL20多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人CCL20基因产物或片段。较佳地，指那些能与人CCL20基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人CCL20蛋白的分子，也包括那些并不影响人CCL20蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人CCL20基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人CCL20基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人CCL20蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人CCL20蛋白功能的抗体以及不影响人CCL20蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人CCL20基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人CCL20基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人CCL20蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是组织样本或血清样本)中的人CCL20蛋白。由于CCL20蛋白存在胞外区，因此在胞外区脱落并进入血液的情况下，这些可溶性的CCL20胞外区就可成为血清检测的靶对象。

拮抗剂

如本文所用，术语“拮抗剂”、“抑制剂”具有相同的含义，均指利用本发明蛋白(CCL20蛋白)，通过各种常规筛选方法，可筛选出与CCL20蛋白发生相互作用的物质，尤其是抑制剂等。

本发明CCL20蛋白的拮抗剂(包括抗体、反义核酸、小分子化合物以及其他抑制剂)，当在治疗上进行施用(给药)时，可抑制CCL20蛋白的表达和/或活性，进而减弱紫杉烷类药物耐药性。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药。

可用于本发明的拮抗剂包括：CCL20的抗体(如CCL20中和抗体)、抑制性mRNA、CCL20核酸的反义RNA、siRNA、shRNA、小分子化合物以及CCL20的活性抑制剂。其中，典型的CCL20抑制剂为抑制性miRNA、siRNA和CCL20中和抗体。

典型地，将CCL20基因作为制备减弱紫杉烷类药物耐药性的靶点的技术方案包括以下方案：

1.化学合成双链核糖核酸分子，其序列特异性针对CCL20基因序列。可利用本领域常规的方法来设计和合成特异性针对CCL20的核酸序列(如siRNA)。

2.利用各种载体，包括DNA载体、慢病毒载体来干扰CCL20基因的表达，达到体内干扰CCL20基因的效果，从而实现减弱紫杉烷类药物耐药性的目的。

3.获得能够特异性抑制CCL20基因转运活性的多肽、单克隆抗体，达到抑制CCL20活性的目的，从而减弱紫杉烷类药物耐药性。

检测方法

利用CCL20在紫杉烷类药物耐药性细胞、组织、血清中高表达，本发明还提供了检测紫杉烷类药物耐药性的方法。

在另一优选例中，本发明提供一种检测CCL20的ELISA法以及时间分辨免疫荧光法(TRFIA)。

本发明涉及定量和定位检测人CCL20蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人CCL20蛋白水平，可以用于诊断(包括辅助诊断)是否存在紫杉烷类药物耐药性。

一种检测样本中是否存在CCL20蛋白的方法是利用CCL20蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样本与CCL20蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样本中存在CCL20蛋白。

CCL20蛋白或其多核苷酸可用于CCL20蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗CCL20的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样本中的CCL20蛋白。

检测试剂盒

基于CCL20与紫杉烷类药物耐药性的相关性，即CCL20在紫杉烷类药物耐药性细胞中高表达，并且在紫杉烷类药物耐药性癌症病人血清中含量非常高，因此CCL20可以作为紫杉烷类药物耐药性的一种诊断标志物。

本发明还提供了一种检测紫杉烷类药物耐药性的试剂盒，所述的试剂盒含有一检测试剂，所述检测试剂用于检测CCL20基因、mRNA、cDNA、蛋白、或其组合。优选地，所述试剂盒含有本发明的抗CCL20的抗体或免疫偶联物，或其活性片段；或者含有特异性扩增CCL20的mRNA或cDNA的引物或引物对、探针或芯片。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断紫杉烷类药物耐药性。

其中，所述的标签或说明书注明以下内容：如果检测对象的CCL20浓度C1显著高于对照参比值C0，则该对象发生紫杉烷类药物耐药的几率大于一般癌症患者。

在另一优选例中，所述的对照参比值C0为正常人群中相同样本中的CCL20浓度、或一般癌症患者人群中相同样本中的CCL20浓度。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：

如果被检测细胞中CCL20浓度Z1显著高于对照参比值Z0，则该被检测细胞发生紫杉烷类药物耐药的几率大于一般细胞。

在另一优选例中，所述的被检测细胞为肿瘤细胞，并且所述的“一般细胞”是与所述被检测细胞同类的细胞。

在另一优选例中，所述的对照参比值Z0为所述一般细胞中的CCL20浓度、或正常的同类细胞中的CCL20浓度。

在另一优选例中，所述的CCL20浓度包括CCL20浓度、CCL20的mRNA浓度、或其组合。

在另一优选例中，所述“显著高于”指C1/C0的比值≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3。

在另一优选例中，本发明还提供了CCL20的诊断试剂盒，包括：CCL20mRNA诊断试剂盒或CCL20酶联免疫(ELISA)检测试剂盒。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的CCL20的拮抗剂(含量为0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％)，以及药学上可接受的载体(含量为余量)。所述的药物组合物可用于减弱紫杉烷类药物耐药性。

在本发明中，所述的拮抗剂包括针对CCL20的反义核酸(如siRNA、shRNA、反义RNA、反义DNA)、抗体、或其组合。此外，所述的拮抗剂还包括可以降低CCL20表达或活性的小分子化合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物还包括化疗药物，较佳地紫杉烷类药物。

通常，可将CCL20拮抗剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于减弱紫杉烷类药物耐药性。此外，还可与其他治疗剂联用。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的CCL20拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的CCL20拮抗剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点

(1)CCL20是本发明人首次发现的一个紫杉烷类药物耐药性的标志物，可应用于包括乳腺癌在内的多种癌症的紫杉烷类药物治疗效果的评判标志和紫杉烷类药物耐药性的诊断，可为更加精确的预后诊断以及制定更有针对性的治疗策略提供参考依据。

(2)CCL20为分泌型蛋白，能够存在于血液中。通过检测血液中CCL20的水平来对治疗的响应进行判断，操作可行性高、取样方便。如果观察到化疗后CCL20水平的显著升高，就提示需要注意药物抵抗存在的可能，为临床治疗用药提供参考。

(3)CCL20是有效减弱紫杉烷类药物耐药性的靶标。本发明提供的CCL20拮抗剂可以抑制CCL20从而减弱紫杉烷类药物耐药性，这对于提高紫杉烷类治疗效果具有极其重要的意义。

(4)CCL20拮抗剂可以用于制备：(a)用于减弱紫杉烷类药物耐药性的药物；和/或(b)用于增加紫杉烷类药物抗肿瘤效果的增敏剂，从而进一步提高肿瘤治疗效果。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用方法

实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR是将荧光能量技术应用于多聚酶链式反应的实验方法。一种称为SYBR GreenⅠ的荧光染料在这个实验中会被使用。在PCR反应体系中，SYBR GreenⅠ特异性地掺入DNA双链后，会发射荧光信号；而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号。因为这种方法使得荧光信号的增加与PCR产物的增加保持同步，也就是说，荧光染料发射出的荧光信号强度与DNA产量成正比。所以，检测PCR过程的荧光信号强度便可得知靶序列初始浓度，从而可以达到定量的目的。

酶联免疫吸附实验(ELISA)

本方法中运用的酶联免疫吸附实验是通过ELISA kit(Raybio公司，货号ELH-MIP3a)进行的。首先，取100uL标准品或样本加入到ELISA板的相应孔中，室温孵育2.5h。弃去液体，使用试剂盒中自带的wash solution洗去残留样本。每孔加入100uL生物素标记的抗体，室温下轻轻摇晃孵育一小时。弃去液体，使用试剂盒中自带的wash solution洗去残留抗体。每孔加入100uL HRP标记的链霉亲和素溶液，室温下轻轻摇晃孵育45min。弃去液体，使用试剂盒中自带的wash solution洗去残留的游离的链霉亲和素。每孔加入100uL反应底物，室温下轻轻摇晃避光孵育30min。每孔加入50uL终止液，然后立即测定450nm波长处的吸光度值。

实施例1.紫杉烷类化疗药物处理使得肿瘤细胞CCL20表达水平显著增加

1.1三阴性乳腺癌细胞中CCL20的mRNA表达水平显著增加

人乳腺癌细胞系SUM149、SUM159和MDA-MB-231，贴壁培养在10cm培养皿中。在生长至50％融合度时，使用紫杉醇(SUM149，2nM；SUM159，10nM；MDA-MB-231，13.46nM)或者多西他赛(SUM149，1nM；SUM159，5nM；MDA-MB-231，14.10nM)进行处理，同时设置生理盐水对照组。期间，每隔一天更换一次新鲜培养基，总共药物处理7天。处理结束后，使用0.05％EDTA-trypsin消化(SUM149，4min；SUM159，2min；MDA-MB-231，2min)，含2％FBS的PBS终止消化。4℃，1200rpm，离心5分钟。吸弃上清，用PBS重悬清洗一遍。再次离心、弃去上清、收集细胞，提取RNA，进行RT-PCR及实时荧光定量PCR检测各组细胞中CCL20的mRNA表达水平。

结果如图1和表1所示，当三阴性乳腺癌细胞受到紫杉烷类化疗药物的作用后，细胞中CCL20的相对mRNA水平显著升高。

表1紫杉烷类化疗药物处理后CCL20的相对mRNA水平

1.2三阴性乳腺癌细胞中CCL20的蛋白表达水平显著增加

处理方法同实施例1.1。处理结束后，更换为无血清培养基维持2天。然后，收集该培养上清，4℃，1200rpm，离心5分钟，取上清、弃去底部沉淀。使用0.22um滤膜过滤上清进一步除去可能残留的细胞。使用该上清进行ELISA检测各组中CCL20的蛋白水平。

表2紫杉烷类化疗药物处理后CCL20的蛋白水平

结果如图2和表2所示，当三阴性乳腺癌细胞受到紫杉烷类化疗药物的作用后，细胞分泌产生的CCL20蛋白的表达水平会显著升高。

1.3非三阴性乳腺癌细胞中CCL20的mRNA表达水平显著增加

处理浓度：紫杉醇(BT474，60nM；MCF7，60nM；SKBR3，2nM)，多西他赛(BT474，20nM；MCF7，20nM；SKBR3，1nM)，其他同实施例1.1中实验方法。

表3紫杉烷类化疗药物处理后CCL20的相对mRNA水平

结果如图3和表3所示，当非三阴性乳腺癌细胞受到紫杉烷类化疗药物的作用后，细胞中CCL20的相对mRNA水平显著升高。

1.4非三阴性乳腺癌细胞中CCL20的蛋白表达水平显著增加

处理浓度：紫杉醇(BT474，60nM；MCF7，60nM；SKBR3，2nM)，多西他赛(BT474，20nM；MCF7，20nM；SKBR3，1nM)。其他同实施例1.2中实验方法。

表4紫杉烷类化疗药物处理后CCL20的蛋白水平

结果如图4和表4所示，当非三阴性乳腺癌细胞受到紫杉烷类化疗药物的作用后，细胞分泌产生的CCL20蛋白的表达水平会显著升高。

综上所述，在乳腺癌中，当肿瘤细胞受到紫杉烷类化疗药物的作用后，细胞中CCL20的表达水平会显著升高。

实施例2.CCL20在多种癌症的紫杉醇耐药株中显著高表达

人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的紫杉醇耐药株(MDA-MB-231/T)及其对照细胞(MDA-MB-231)、人卵巢癌细胞系A2780的紫杉醇耐药株(A2780/T)及其对照细胞(A2780)、人结肠癌细胞系HCT-8的紫杉醇耐药株(HCT-8/T)及其对照细胞(HCT-8)，贴壁培养在10cm培养皿中。在生长至70％融合度时，使用0.05％EDTA-trypsin消化(MDA-MB-231，2min)或者0.25％EDTA-trypsin消化(A2780、HCT-8均为2min)，含2％FBS的PBS终止消化。4℃，1200rpm，离心5分钟。吸弃上清，用PBS重悬清洗一遍。再次离心、弃去上清、收集细胞，提取RNA，进行RT-PCR及实时荧光定量PCR检测各组细胞中CCL20的mRNA表达水平。

结果如图5和表5所示，在乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等癌症中，CCL20在这些癌症的耐药株中高水平表达，而在相应的对照细胞中表达水平很低。进一步验证了CCL20在多种癌症的紫杉醇耐药细胞中显著高表达。

表5 CCL20在三种癌症的紫杉醇耐药株中的相对mRNA水平

实施例3.CCL20在化疗抵抗的乳腺癌病人血清中具有更高的水平

收集新辅助化疗前以及新辅助化疗后(进行过两个疗程的化疗，化疗方案中包含紫杉醇或多西他赛)的乳腺癌病人血液。置于不含任何添加物的离心管中，室温放置20min，3000rpm离心10min，吸取上清。利用血清进行酶联免疫吸附实验(Raybio公司，货号ELH-MIP3a)测定血清中的CCL20蛋白水平。

结果如图6和表6所示，病理完全缓解的病人在化疗前后CCL20并没有显著差异，而对于病理未完全缓解的病人，化疗后血液中的CCL20水平显著升高，是化疗前的约1.7倍。因此，CCL20在化疗抵抗的病人血清中具有更高的水平。

表6化疗前后CCL20的相对蛋白水平

实施例4.CCL20中和抗体能够明显减弱乳腺癌干细胞对紫杉烷类化疗药物的抵抗

人乳腺癌细胞系SUM159和MDA-MB-231，用乳腺癌细胞微球培养液(STEMCELLTECHNOLOGIES公司，货号05620)悬浮培养在超低吸附的6孔培养板中，用来富集乳腺癌干细胞。维持培养7-10天，期间每3天添加新鲜的微球培养基1mL。培养结束后，收集微球液，4℃，1200rpm，离心5分钟，弃上清。使用0.25％EDTA-trypsin在37℃消化8分钟，每3-4分钟吹打一次。含2％FBS的PBS终止消化。4℃，1200rpm，离心5分钟。2％FBS的PBS重悬，如果还有未消化掉的微球，则使用200目滤网过滤除去团块以获得单细胞悬液。之后，各组细胞施加多西他赛(SUM159，5nM；MDA-MB-231，14.1nM)处理24h。其中，实验组在施加多西他赛同时加入CCL20中和抗体(200ng/ml)(R&D SYSTEMS公司，货号AF360，羊来源的抗人CCL20的IgG)，对照组相应地加入等体积PBS。处理结束后，使用凋亡检测试剂盒(BD公司，货号550474)检测凋亡情况，使用流式细胞仪(贝克曼公司)检测分析凋亡。化疗会导致细胞凋亡，使用以下公式将凋亡值换算成耐药指数，耐药指数＝1-(凋亡值_实验组-凋亡值_对照组)/凋亡值_对照组。

结果如图7所示，加入CCL20中和抗体后SUM159和MDA-MB-231的耐药指数分别是相对于对照的0.73和0.74(对照组的耐药指数为1)。结果表明，CCL20中和抗体能够显著减少乳腺癌干细胞对多西他赛的化疗抵抗。乳腺癌干细胞是化疗抵抗的元凶，所以将CCL20阻断后能够改善乳腺癌治疗中出现的紫杉烷类耐药现象，有效减弱癌细胞对紫杉烷类药物的抵抗。

实施例5.CCL20中和抗体能够明显减弱乳腺癌耐药株的药物抵抗

相同数量的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的紫杉醇耐药株(MDA-MB-231/T)及其对照细胞(MDA-MB-231)，贴壁培养在10cm培养皿中。待其完全贴壁后，开始施加紫杉醇(13.46nM)处理，其中一组紫杉醇耐药株(MDA-MB-231/T)同时添加CCL20中和抗体(200ng/ml)，其他组加入等体积的相应的溶剂(PBS)，维持3天。然后，收集培养上清中的细胞，同时，使用0.05％EDTA-trypsin消化贴壁细胞2min，含2％FBS的PBS终止消化。4℃，1200rpm，离心5分钟。2％FBS的PBS重悬。使用凋亡检测试剂盒(BD公司，货号550474)检测凋亡情况，使用流式细胞仪(贝克曼公司)检测分析凋亡。化疗会导致细胞凋亡，使用以下公式将凋亡值换算成耐药指数，耐药指数＝1-(凋亡值_实验组-凋亡值_对照组)/凋亡值_对照组。

结果如图8所示，对照组的耐药指数为1，而耐药株的耐药指数为1.58，因此MDA-MB-231的紫杉醇耐药株(MDA-MB-231/T)确实对紫杉醇更加抵抗。而加入了CCL20中和抗体的耐药株的耐药指数为1.46，表明CCL20中和抗体能够有效减弱紫杉烷类耐药株的药物抵抗。

讨论

一方面，紫杉烷类化疗药物能够显著诱导CCL20的产生，而且CCL20在病理未完全缓解的病人化疗之后显著升高。同时CCL20在乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等癌症的对照细胞中低表达甚至不表达，而在耐药株中高表达，这些提示CCL20能够做作为紫杉烷类化疗耐药的指示物：如果化疗过程中出现CCL20水平的显著升高，这就提示发生化疗耐药的几率增大。

另一方面，CCL20也参与了肿瘤细胞对化疗药物的抵抗过程。使用CCL20抗体将CCL20的蛋白中和之后，能够明显减弱肿瘤细胞的化疗耐药。这就提示可以将CCL20作为靶标，设计靶向药物，如针对CCL20的单抗药物或者抑制剂类药物，联合化疗药物使用，能够进一步提高肿瘤治疗效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种CCL20基因、mRNA、cDNA、蛋白、或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备检测紫杉烷类药物耐药性的诊断试剂或试剂盒；

并且，所述的紫杉烷类药物耐药性为癌症或癌症细胞对紫杉烷类药物的耐药性。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述癌症选自下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、***癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、大肠癌、***癌、***、淋巴癌、肾上腺肿瘤、***、或其组合。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述癌症选自下组：乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、或其组合。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测试剂包括：

(a)CCL20的特异性抗体、CCL20的特异性结合分子；和/或

(b)特异性扩增CCL20 mRNA或CCL20 cDNA的引物或引物对、探针或芯片。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途还包括用于预测紫杉烷类药物耐药者的生存时间(预后)。

6.一种CCL20的拮抗剂的用途，其特征在于，用于制备(a)用于减弱紫杉烷类药物耐药性的药物；和/或(b)用于增加紫杉烷类药物抗肿瘤效果的增敏剂；

并且，所述的紫杉烷类药物耐药性为癌症或癌症细胞对紫杉烷类药物的耐药性。

7.如权利要求6所述的拮抗剂的用途，其特征在于，所述拮抗剂选自下组：针对CCL20的反义核酸、抗体、小分子化合物、或其组合。

Images