KR20230051277A - 세포 배양 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 단백질, 특히 항체와 같은 단백질의 제조 분야에 속한다.
Description
본 발명은 재조합 단백질, 특히 항체와 같은 단백질의 제조 분야에 속한다.
치료 항체와 같은 치료 단백질로서 재조합 단백질의 개발은 산업적 규모에서의 재조합 단백질 생산을 요구한다. 이를 달성하기 위해, 상이한 발현 시스템, 원핵 및 진핵 시스템 두 가지 모두가 사용될 수 있다. 그러나, 지난 20년 동안, 승인된 치료 단백질의 대부분은 포유동물 세포 배양을 통해 제조되어 왔고, 이러한 시스템은 여전히 인간에서 사용하기 위한 대량의 재조합 단백질을 생산하기 위해 선호되는 발현 시스템이다.
배지의 조성(Kshirsagar R., et al., 2012; US20130281355; WO2013158275)과 같은 세포 배양 조건 및 pH 및 온도(WO2011134919)를 포함한 성장 조건은 치료 단백질의 수율 및 품질 속성에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 지난 30년 동안, 세포 배양, 배지 및 재조합 단백질 발현의 기본 매개변수를 확립하는 데 많은 노력을 기울여 왔으며, 연구는 집중적으로 세포 배양 배지의 조성(예를 들어, 문헌[Hecklau C, et al., 2016; Zang L. et al., (2011)] 참조), 작동 조건의 변화 및 대형 생물반응기의 개발을 통해 최적의 세포 성장에 도달하는 데 전념해 왔다.
피드 배지(feed media)에 고 농도로 존재하는 일부 성분은 특히, 상기 배지의 pH가 거의 중성일 때 저장 동안 (상기 배지가 생물반응기에 첨가될 때까지) 침전되는 경향이 있다. 사용 전에 이러한 침전은 바람직하지 않다; 실제로, 이는 배지의 정확한 조성에 영향을 미칠 수 있다(용액/침전물 중의 성분의 양을 알 수 없기 때문에). 화학적으로 농축된 피드 배지(10X 내지 100X)에 관한 WO2008013809는 특정 pH 값, 예컨대 pH 5.8 초과에서 함께 용해될 때 염이 전형적으로 침전되거나, 엽산과 같은 다른 성분이 가용화를 위해 pH 8.6을 필요로 한다고 개시하고 있다. WO2008141207은 시스테인, 티로신 및 임의로 시스틴을 함유하고 고 농도에서 가용화하기 어려운 성분(예컨대, 티로신 또는 시스테인)에 대한 안정제로서 피루베이트를 추가로 함유하는 안정한 피드 배지를 제공한다. WO2011133902는 농축된 피드 배지를 2 내지 6가지 아미노산(예컨대, 알라닐 티로신 및/또는 알라닐 시스테인 및/또는 알라닐 시스틴 이량체)을 갖는 소형 펩티드로 보충하여 상기 피드의 침전 위험을 제한할 것을 제안하고 있다.
그러나, 수율 및 단백질 이질성에 최소한의 영향을 미치면서 치료 단백질의 생산을 위한 세포 배양 방법의 맥락에서 사용될 추가로 개선된 피드 배지를 제공하는 것이 여전히 필요하다.
제1 양상에서, 본 발명은 재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 포유동물 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계 및 생산기(production phase) 동안 세포 배양물을 적어도 하나의 피드 배지로 보충하는 단계를 포함하고, 이러한 적어도 하나의 피드 배지의 pH는 약 5.0 내지 약 6.3이다.
제2 양상에서, 본 발명은 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 상기 재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계 및 생산기 동안 세포 배양물을 적어도 하나의 피드 배지로 보충하는 단계를 포함하고, 이러한 적어도 하나의 피드 배지의 pH는 약 5.0 내지 약 6.3이다
제3 양상에서, 본 발명은 피드 배지에서 침전을 감소시키거나 방지하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계 및 생산기 동안 세포 배양물을 적어도 하나의 피드 배지로 보충하는 단계를 포함하고, 이러한 적어도 하나의 피드 배지의 pH는 약 5.0 내지 약 6.3이다.
제4 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 방법에서 사용하기 위한 피드 배지에 관한 것이며, 여기서 이러한 적어도 하나의 피드 배지의 pH는 약 5.0 내지 약 6.3이다.
제5 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법들 중 어느 하나에 의해 생산된 재조합 단백질을 기재한다. 이러한 양상들 중 어느 하나와 관련하여, 피드 배지는 농축된 주 피드 배지와 같은 주 피드 배지이다.
정의
상충하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본원의 보호대상이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 하기 정의가 제공된다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 본원의 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" 및 "B"를 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 배양" 또는 "배양"은 시험관내, 즉 유기체 또는 조직의 외부에서 세포의 성장, 증식 및/또는 유지를 의미한다. 포유동물 세포에 적합한 배양 조건은 예컨대 문헌[Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies (2005)]에 교시된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 포유동물 세포는 현탁액에서 또는 고체 기판에 부착된 상태에서 배양될 수 있다.
용어 "세포 배양 배지", "배양 배지", "배지" 및 이들의 임의의 복수형은 임의의 유형의 세포가 배양될 수 있는 임의의 배지를 지칭한다. "기초 배지"는 세포 대사에 유용한 모든 필수 성분을 함유하는 세포 배양 배지를 지칭한다. 이는 예를 들어 아미노산, 지질, 탄소원, 비타민 및 무기 염을 포함한다. DMEM(둘베코 변형 이글 배지(Dulbeccos' Modified Eagles Medium)), RPMI(로즈웰 파크 메모리얼 연구소 배지(Roswell Park Memorial Institute Medium)) 또는 배지 F12(햄 F12 배지(Ham's F12 medium))는 상업적으로 이용 가능한 기초 배지의 예이다. 다른 적합한 배지는 예를 들어 WO9808934 및 US20060148074(둘 다 그 전문이 본원에 통합됨)에서 설명되었다. 상업적으로 이용 가능한 추가의 적합한 배지에는 AmpliCHO CD 배지, Dynamis™ 배지, EX-CELL® Advanced™ CHO 유가식 시스템, CD FortiCHO™ 배지, CP OptiCHO™ 배지, 최소 필수 배지(Minimum Essential Media: MEM), BalanCD® CHO 성장 A 배지, ActiProTM 배지, DMEM-둘베코 변형 이글 배지 및 RPMI-1640 배지가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 상기 기초 배지는 모든 성분이 화학식 측면에서 설명될 수 있고 특정 농도로 존재하는, 본원에서 "화학적으로 정의된 배지" 또는 "화학적으로 정의된 배양 배지"로도 불리는 독점적 배지일 수 있다. 배양 배지는 바람직하게는 단백질 무함유 및 혈청 무함유이며, 배양 중인 세포의 필요에 따라 아미노산, 염, 당, 비타민, 호르몬, 성장 인자와 같은 임의의 추가 화합물(들)에 의해 보충될 수 있다.
용어 "피드 배지" 또는 "피드"(및 이들의 복수형)는 소비되는 영양소를 보충하기 위해 배양 동안에 첨가되는 배지를 의미한다. 피드 배지는 상업적으로 이용 가능한 피드 배지 또는 독점적 피드 배지(본원에서 대안적으로 "정의된 피드 배지" 또는 "화학적으로 정의된 피드 배지"로 명명됨)일 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 적합한 피드 배지에는 Cell Boost™ 보충물, EfficientFeed™ 보충물, ExpiCHO™ 피드가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 상기 피드 배지는 모든 성분이 화학식 측면에서 설명될 수 있고 특정 농도로 존재하는 독점적 피드 배지일 수 있다. 피드 배지는 전형적으로 배양물의 최종 용적을 고 수준으로 증가시키지 않기 위해 기초 배지와 비교하여 농축된다. 이러한 피드 배지는 세포 배양 배지의 성분 대부분을, 예를 들어 기초 배지 중의 이들의 정상 양의 약 1.5X, 2X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100X, 200X 또는 심지어 500X로 함유할 수 있다. 독점적 피드 배지는 전형적으로 분말이다. 상업적 피드는 액체 또는 분말이다. 피드가 이미 액체 형태인 경우, 이들은 전단지에 따라 그대로 사용된다. 분말 형태의 피드는, 사용 전에, 예를 들어 물에 가용화될 필요가 있다. 이들은 소정 양의 물에 가용화되어야 한다(예를 들어, 물 1 L 중 100 g, 도 1A 참조). 그러나, 분말 형태의 피드는 추가로 농축될 수 있다. 이러한 경우에, 이들은 상기 양에 통상적으로 필요한 것보다 적은 양의 액체를 사용하여 용해될 것이다(예를 들어, 도 1B에 도시된 바와 같이 물 1 L 중 200 g). 표준 프로토콜에 따라 제조된 상업적 액체 피드 또는 분말 형태의 피드는 본원에서 "통상적" 피드로도 불린다. 농축 방법에 따라 제조된 상업적 액체 피드 또는 분말 형태의 피드는 본원에서 "농축된 피드"로 불린다.
상이한 조성의 상이한 피드 배지는 배양 방법 전반에 걸쳐 첨가될 수 있다. 예를 들어, 3가지 상이한 피드 배지가 동일한 방법 동안 사용될 수 있다: 탄소원(예를 들어, 글루코스)으로 구성된 하나의 피드 배지, 소비되는 대부분의 영양소를 포함하는 하나의 피드 배지(이 피드는 본원에서 "주 피드", "주 피드 배지" 또는 "적어도 하나의 피드 배지"로도 지칭된다), 및 예를 들어 일부 추가 영양소가 응집/안정성 문제(예를 들어, 시스테인 및/또는 시스틴 및 /또는 티로신과 같은)를 나타내는 경우에 이 영양소를 포함하는 추가 피드 배지.
용어 "생물반응기"는 세포가 배양될 수 있는 임의의 시스템을 지칭한다. 이는 플라스크, 정적 플라스크, 스피너 플라스크, 튜브, 진탕 튜브, 진탕 병, 웨이브 백, 생물반응기, 섬유 생물반응기 및 마이크로캐리어가 있거나 없는 교반 탱크 생물반응기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 상기 용어는 마이크로타이터 플레이트, 모세관 또는 다중웰 플레이트를 포함한다. 임의의 크기, 예를 들어 1 밀리리터(1 mL, 매우 작은 규모)에서 20000 리터(20000 L 또는 20 KL, 매우 큰 규모)까지, 예컨대 0.1 mL, 0.5 mL, 1 mL, 5 mL, 0.01 L, 0.1 L, 1 L, 2 L, 5 L, 10 L, 50 L, 100 L, 500 L, 1000 L (1 KL), 2000 L (2 KL), 5000 L (5 KL), 10000 L (10 KL), 15000 L (15 KL) 또는 20000 L (20 KL)의 생물반응기가 사용될 수 있다.
용어 "유가식 배양"은 소모되는 영양소를 보충하기 위해 임의의 배지 제거 없이 볼루스(bolus)(또는 수회의 볼루스) 또는 연속적 피드 배지(또는 피드 배지들)가 첨가("첨가"는 본 발명의 맥락에서 "보충"으로도 명명된다는 것을 유의한다)되는 세포의 성장 방법을 지칭한다. 피드(들)은 예를 들어 매일, 2일마다 1회, 3일마다 1회 등의 예정된 일정에 따라 첨가될 수 있다. 대안적으로, 공급이 연속적이어야 하는 경우, 공급 속도는 배양 기간 전반에 걸쳐 다양할 수 있다. 이러한 세포 배양 기술은 배지 조성, 세포주 및 기타 세포 성장 조건에 따라 대략 10 x 106 내지 30 x 106 세포/ml 초과의 높은 세포 밀도를 얻을 수 있는 가능성을 갖고 있다. 2상 배양 조건은 다양한 피드 전략 및 배지 조성에 의해 생성되고 유지될 수 있다.
본 발명의 방법 및/또는 세포 배양 기술을 사용할 때, 포유동물 세포에서 재조합 단백질은 일반적으로 배양 배지로 직접 분비된다. 일단 상기 단백질이 배지로 분비되면, 관심대상 단백질의 단리를 시작하기 위해 이러한 발현 시스템으로부터 상청액을 먼저 수거 및 정화하고, 이를 정제 및 제형화하기 전에 농축시킬 수 있다.
본 발명에 따른 용어 "생산기"는 재조합 단백질을 제조하는 방법 동안 세포가 재조합 폴리펩티드(들)을 발현(즉, 생산)할 때의 세포 배양기를 포함한다. 생산기는 전형적으로 원하는 재조합 단백질의 역가가 증가할 때 및/또는 세포 성장이 본질적으로 종료되었을 때 시작하여, 재조합 단백질 생산이 본질적으로 종료되었을 때 세포(또는 세포 배양액 또는 상청액)의 수거로 종료된다. 세포는 원하는 세포 밀도 또는 원하는 재조합 단백질 역가에 도달할 때까지 생산기에서 유지될 수 있다. 예를 들어, 세포는 재조합 단백질의 역가가 최대에 도달할 때까지 후속 생산기에서 유지된다. 대안적으로, 배양물은 당업자의 생산 요건 또는 세포 자체의 필요에 따라 이 시점 이전에 수거될 수 있다. 전형적으로, 생산기의 시작 시, 세포 배양물은 생산 전 용기(N-1 용기)에서 생산 용기(N 용기), 예컨대 생물반응기로 옮겨진다. N-1 용기에서, 세포는 관류 모드, 배치식 모드 또는 유가식 모드와 같은 당업계의 임의의 기술에 따라 성장할 수 있다. 수거는 재조합 단백질, 예를 들어 재조합 항체를 후속 단계에서 회수 및 정제하기 위해 생산 용기로부터 세포 배양액을 제거하는 단계이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "세포 농도"("세포 밀도"로도 공지됨)는 소정 용적의 배양 배지 중의 세포의 수를 지칭한다. "생존 세포 농도"(또는 "VCC")는 소정 용적의 배양 배지 중의 살아있는 세포의 수를 지칭한다. 이것은 표준 생존율 분석에 의해 결정된다.
용어 "생존율" 또는 "세포 생존율"은 생존 세포의 총 수와 배양 중인 세포의 총 수 사이의 비율을 지칭한다. 생존율은 전형적으로 배양 시작과 비교하여 60% 임계값 미만으로 저하되지 않는 한 허용 가능하지만, 허용 가능한 임계값은 사례별로 결정될 수 있다. 생존율은 종종 수거 시기를 결정하는 데 사용된다. 예를 들어, 유가식 배양에서 수거는 생존율이 60%에 도달하였을 때 또는 배양한지 약 14일(전형적으로 14일 +/- 1일) 후에 수행될 수 있다.
용어 "역가"는 용액 중 관심대상 재조합 단백질의 농도를 지칭한다. 이는 실시예 섹션에서 사용되는 바와 같은 CEDEX 또는 단백질 A 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), Biacore C® 또는 ForteBIO Octet® 방법을 이용한 검출 방법(비색, 크로마토그래피 등)과 조합된 연속 희석과 같은 표준 역가측정(tire) 분석으로 결정된다.
용어 "더 높은 역가" 또는 "더 높은 생산성" 및 이들의 등가물은 역가 또는 생산성이 대조군 배양 조건과 비교할 때 적어도 10% 증가함을 의미한다. 역가 또는 특이적 생산성은 대조군 배양 조건과 비교하여 -10% 내지 10%의 범위 내이면 유지된 것으로 간주될 것이다. 용어 "더 낮은 역가" 또는 "더 낮은 생산성" 및 이들의 등가물은 역가 또는 생산성이 대조군 배양 조건과 비교할 때 적어도 10% 감소함을 의미한다.
피드 배지를 구성하는 요소들의 침전(본 발명의 맥락에서 이는 피드의 침전으로도 지칭된다)은 제조 또는/및 저장 단계 후에 발생할 수 있다. 침전은 용액 중 작은 고체 입자로서 육안으로 평가될 수 있다(용액 중 및/또는 용기의 바닥에서 입자로서 침강). 상기 평가는 당업자의 지식 범위 내에 있다. 용어 "침전의 감소"는, 예를 들어, 대조군 조건 하에 관찰된 침전과 비교할 때 육안으로 평가 시 침강된 침전물 및/또는 피드 배지 중 침전물의 감소로 이해되어야 한다. 용어 "침전의 방지"는 예를 들어 육안으로 평가 시 침강된 침전물 및/또는 피드 배지 중 침전물의 부재로서 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "이질성"은 동일한 제조 방법에 의해 또는 동일한 제조 배치 내에서 생산된 분자 집단 중 개별 분자, 예를 들어 재조합 단백질 사이의 차이를 지칭한다. 이질성은 예를 들어 폴리펩티드의 번역 후 변형 또는 전사 또는 번역 동안의 혼입 오류로 인한, 재조합 폴리펩티드의 불완전하거나 불균일한 변형으로부터 초래될 수 있다. 번역 후 변형은 예를 들어 탈아미노화 반응 및/또는 산화 반응 및/또는 소분자의 공유 첨가, 예컨대 당화 반응 및/또는 이성질체화 반응 및/또는 단편화 반응 및/또는 기타 반응의 결과일 수 있으며, 당화 패턴의 변경을 또한 포함한다. 이러한 이질성의 화학-물리적 구현은 전하 변이체 프로파일, 색상 또는 색상 강도 및 분자량 프로파일을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 생성된 재조합 폴리펩티드 제제에서의 다양한 특성을 초래한다. 재조합 단백질의 이소형을 측정할 때, 주요 전하 종 외에도 산성 이소형(APG) 및 염기성 이소형(BPG)도 측정된다. 주요 전하 종은 얻고자 하는 재조합 단백질의 이소형을 나타낸다.
용어 "재조합 단백질"은 재조합 기술에 의해 생산된 단백질을 의미한다. 재조합 기술은 당업자의 지식 범위 내에 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989] 및 최신판 참조). 용어 "단백질"은 예를 들어 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 항체, 또는 항체의 도메인 또는 다른 단편을 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 단클론 항체, 다클론 항체 및 당업계에 공지된 바와 같은 재조합 기술에 의해 생성되는 재조합 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. "항체"는 임의의 종, 특히 포유동물 종의 항체; 예컨대 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE, IgD를 포함하는 임의의 이소형의 인간 항체 및 IgGA1, IgG2, 또는 IgM 및 이의 변형된 변이체와 같은 오량체를 포함하는 이러한 기본 구조의 이량체로서 생산되는 항체; 예를 들어 침팬지, 개코원숭이, 레수스 또는 시노몰구스 원숭이로부터의 비인간 영장류 항체; 예를 들어, 마우스 또는 래트로부터의 설치류 항체; 토끼, 염소 또는 말 항체; 낙타과 항체(예를 들어, NanobodiesTM와 같은 낙타 또는 라마 유래) 및 이들의 유도체; 조류 종의 항체, 예컨대 닭 항체; 또는 어종의 항체, 예컨대 상어 항체를 포함한다. 용어 "항체"는 또한 적어도 하나의 중쇄 및/또는 경쇄 항체 서열의 제1 부분이 제1 종으로부터 유래되고 중쇄 및/또는 경쇄 항체 서열의 제2 부분이 제2 종으로부터 유래되는 "키메라" 항체를 지칭한다. 본원에서 관심대상의 키메라 항체는 비인간 영장류(예를 들어, 구세계 원숭이, 예컨대 개코원숭이, 레수스 또는 시노몰구스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다. "인간화" 항체는 비인간 항체로부터 유래된 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 활성을 갖는 비인간 종, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 닭 또는 비인간 영장류(공여자 항체)의 초가변 영역[또는 상보성 결정 영역(CDR)]의 잔기로 대체된 인간 항체(수용자 항체)이다. 대부분의 예에서, CDR 외부의; 즉 프레임워크 영역(FR) 내의 인간(수용자) 항체의 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 추가로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 특성을 더욱 개선하기 위해 이루어진다. 인간화는 인간에서 비인간 항체의 면역원성을 감소시킴으로써, 인간 질환 치료에 항체를 적용하는 것을 용이하게 한다. 인간화 항체 및 이를 생성하기 위한 여러 상이한 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 용어 "항체"는 또한 인간화의 대안으로서 생성될 수 있는 인간 항체를 지칭한다. 예를 들어, 면역화 시, 내인성 뮤린 항체의 생산 없이 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 가능하다. 시험관내에서 인간 항체/항체 단편을 얻기 위한 다른 방법은 적어도 부분적으로 인공적으로 생성되거나 공여자의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 생성되는 재조합 DNA 라이브러리가 사용되는 파지 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이 기술과 같은 디스플레이 기술에 기반한다. 인간 항체를 생성하기 위한 파지 및 리보솜 디스플레이 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 인간 항체는 또한 생체외에서 관심대상의 항원으로 면역화되고 후속적으로 융합되어 하이브리도마를 생성하는 단리된 인간 B 세포로부터 생성될 수 있으며, 이는 이후 최적의 인간 항체에 대해 스크리닝될 수 있다. 용어 "항체"는 글리코실화된 항체와 비글리코실화된 항체 둘 다를 지칭한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 전장 항체를 지칭할 뿐만 아니라, 항체 단편 및 특히 항원 결합 단편을 지칭하기도 한다. 항체의 단편은 당업계에 공지된 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 도메인을 포함하고 하나 이상의 항원(들)에 결합한다. 본 발명에 따른 항체 단편의 예에는 Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, Fab-Fv-Fv, scFv 및 Bis-scFv 단편이 포함된다. 상기 단편은 또한 디아바디, 트리바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 단일 도메인 항체(dAb), 예컨대 sdAb, VL, VH, VHH 또는 낙타과 항체(예를 들어, Nanobody™와 같은 낙타 또는 라마 유래) 및 VNAR 단편일 수 있다. 본 발명에 따른 항원 결합 단편은 또한 1개 또는 2개의 scFv 또는 dsscFv에 연결된 Fab를 포함할 수 있고, 각각의 scFv 또는 dsscFv는 동일하거나 상이한 표적에 결합한다(예를 들어, 하나의 scFv 또는 dsscFv는 치료 표적에 결합하고 하나의 scFv 또는 dsscFv는 예를 들어 알부민과 결합하여 반감기를 증가시킨다). 이러한 항체 단편의 예시는 FabdsscFv(BYbe®로도 지칭됨) 또는 Fab-(dsscFv)2(TrYbe®로도 지칭됨, 예를 들어 WO2015197772 참조)이다. 상기 정의된 바와 같은 항체 단편은 당업계에 공지되어 있다.
전형적으로, 수성 피드 용액은 생산 방법이 시작되기 전에 생성되고(액체에서 예상 농도에 도달할 때까지 분말의 용해; pH는 목표 값으로 조정된다; 도 1 참조) 생산 생물반응기에 첨가될 때까지 용기(예를 들어, 백 또는 공급 탱크)에서 저장된다. 저장은 백 또는 탱크가 생산 생물반응기에 연결될 때까지 저온(예를 들어, 2 내지 8℃)에서 수행될 수 있다. 이때부터, 저장은 전형적으로 실온에서 수행된다. 생산 방법은 전형적으로 약 14일 동안 지속되므로, 주 피드는 최대 14일 동안 저장되며, 배양 시작 훨씬 전에 생성되었다면 더 오래 저장될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 용기(예컨대, 백 또는 탱크)에서 피드 배지의 침전은 전형적으로 육안 관찰에 의해 관찰되었다.
본 발명은 일반적으로 포유동물 세포에서 재조합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유가식 공정의 구성에서 첨가될 주 피드의 pH를 저하시킴으로써, 전체 공정 성능(예를 들어, VCC 또는 역가의 측면에서 평가됨)에 영향을 미치지 않으면서 배양 방법 전반에 걸쳐 상기 주 피드의 침전을 피하거나 적어도 감소시킬 수 있다는 발명자들의 발견에 기반한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 포유동물 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계 및 생산기 동안 세포 배양물을 적어도 하나의 피드 배지로 보충하는 단계를 포함하고, 이러한 적어도 하나의 피드 배지의 pH는 약 5.0 내지 약 6.3이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 상기 재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계 및 생산기 동안 세포 배양물을 적어도 하나의 피드 배지로 보충하는 단계를 포함하고, 이러한 적어도 하나의 피드 배지의 pH는 약 5.0 내지 약 6.3이다.
추가의 실시양태에서, 피드 배지에서 침전을 감소시키거나 방지하는 방법이 본원에 기재되며, 여기서 상기 방법은 재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 배양물에서 배양하는 단계 및 생산기 동안 세포 배양물을 적어도 하나의 피드 배지로 보충하는 단계를 포함하고, 이러한 적어도 하나의 피드 배지의 pH는 약 5.0 내지 약 6.3이다.
전체적으로 본 발명의 맥락에서, 재조합 단백질을 생산하는 방법, 재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 방법 또는 피드 배지에서 침전을 감소시키거나 방지하는 방법은 하기 주요 단계들을 포함한다:
(i) 포유동물 세포를 생물반응기(예컨대, 생산 생물반응기) 내의 배양 배지(예컨대, 기초 배지)에 접종하는 단계,
(ii) 포유동물 세포에 의해 재조합 단백질이 생산되는 생산기를 통해 배양을 진행시키는 단계로서, 여기서 상기 생산기 동안 세포 배양물은 적어도 하나의 피드 배지로 보충되는 단계,
여기서, 이러한 적어도 하나의 피드 배지의 pH는 특정 범위 내에서 정의된다. 상기 피드 배지는 바람직하게는 주 피드 배지이고 농축된 피드 배지(예를 들어, 농축된 주 피드 배지)일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 방법에서 사용하기 위한 피드 배지에 관한 것으로, 여기서 이러한 적어도 하나의 피드 배지의 pH는 약 5.0 내지 약 6.3이다. 재조합 단백질을 생산하기 위해, 재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 배양하기 위해 또는 피드 배지에서 침전을 감소시키거나 방지하기 위해 사용되는 전체 전략에 따라, 본 발명에 따른 피드 배지(즉, 약 5.0 내지 약 6.3의 pH를 가짐)는 N-1기 동안과 같이 생산기에 선행하는 단계 동안에도 사용될 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 재조합 단백질을 기재한다.
전체적으로 본 발명의 맥락에서, 배양 시작 시(단계 (i))의 배양 배지는 바람직하게는 단백질 무함유 및 혈청 무함유 배양 배지이다. 상기 단백질 무함유 및 혈청 무함유 배양 배지는 상업적으로 이용 가능하거나 화학적으로 정의된 배지일 수 있다.
전체적으로 본 발명의 맥락에서, 적어도 하나의 피드 배지(본원에서 주 피드 배지로도 지칭됨)는 바람직하게는 단백질 무함유 및 혈청 무함유 배양 배지이고 필수 요소의 전부 또는 대부분을 포함한다. 적어도 하나의 피드 배지에 포함되지 않은 경우, 탄소원은 상이한 피드를 통해 도입될 수 있다. (적어도 하나의) 피드 배지는 표준 프로토콜에 따라 제조되고 사용되는 "통상적 피드"(도 1A에 개시된 바와 같음)일 수 있거나 농축된 피드 배지(예를 들어, 도 1B에 개시된 바와 같은 정의된 농축된 주 피드 배지 또는 상업적 농축된 피드 배지)일 수 있다. 대안적으로, 또한 전체적으로 본 발명의 맥락에서, (적어도 하나의) 피드 배지(본원에서 주 피드 배지로도 지칭됨)는 바람직하게는 단백질 무함유 및 혈청 무함유 배양 배지이고 필수 요소의 전부 또는 대부분을 포함하지만, 유리 아미노산: 시스테인 및/또는 시스틴(둘 다 Cys로 지칭됨) 및 티로신(Tyr) 중 어느 것도 포함하지 않는데, 이들 아미노산은 가용화하기 어렵고 약 8.0 미만의 pH에서 안정화되기 어려운 것으로 알려져 있기 때문이다. 탄소원뿐만 아니라 Cys 및 Tyr은 상이한 피드, 예컨대 탄소원으로 구성된 하나의 피드 및 1) Cys, Tyr로 구성된 하나의 하나의 피드 또는 2) 각각 Cys 및 Tyr으로 구성된 2개의 상이한 피드를 통해 도입될 수 있다. 전체적으로 본 발명의 맥락에서, 적어도 하나의 피드 배지는 표준 프로토콜에 따라 제조되고 사용되는 "통상적 피드"(도 1A에 개시된 바와 같음)일 수 있거나 농축된 피드 배지(예를 들어, 도 1B에 개시된, 정의된 농축된 주 피드 배지 또는 상업적 농축된 피드 배지)일 수 있다. 또 다른 대안에서, 또한 전체적으로 본 발명의 맥락에서, (적어도 하나의) 피드 배지(본원에서 주 피드 배지로도 지칭됨)는 바람직하게는 단백질 무함유 및 혈청 무함유 피드 배지이고 필수 요소의 모두 또는 대부분을 포함지만, 유리 아미노산: 시스테인 및/또는 시스틴(둘 다 Cys로 지칭됨), 트립토판(Trp) 및 티로신(Tyr) 중 어느 것도 포함하지 않는다. 탄소원뿐만 아니라 Cys, Tyr, Trp는 상이한 피드, 예컨대 탄소원으로 구성된 하나의 피드 및 1) Cys, Tyr, Trp로 구성된 하나의 피드, 2) Cys, Tyr, Trp로부터 선택된 임의의 2가지 아미노산의 조합으로 구성된 2개의 피드(제3 아미노산은 별도의 피드로 첨가된다) 또는 3) 각각 Cys, Tyr 및 Trp로 구성된 3개의 상이한 피드를 통해 도입될 수 있다. 전체적으로 본 발명의 맥락에서, 적어도 하나의 피드 배지는 표준 프로토콜에 따라 제조되고 사용되는 "통상적 피드"(도 1A에 개시된 바와 같음)일 수 있거나 농축된 피드 배지(예를 들어, 도 1B에 개시된, 정의된 농축된 주 피드 배지 또는 상업적 농축된 피드 배지)일 수 있다.
전체적으로 본 발명의 맥락에서, (적어도 하나의) 피드 배지의 pH는 약 5.0 내지 약 6.3, 바람직하게는 약 5.2 내지 약 6.2이다. pH 범위의 하한은 예를 들어 5.20, 5.25, 5.30, 5.35, 5.40, 5.45, 5.50, 5.55, 5.60, 5.65, 5.70, 5.75, 5.80 또는 5.85 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. pH 범위의 상한은 예를 들어 6.00, 6.05, 6.10, 6.15 또는 6.20 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 피드 배지의 pH는 예를 들어 5.20, 5.25, 5.30, 5.35, 5.40, 5.45, 5.50, 5.55, 5.60, 5.65, 5.70, 5.75, 5.80, 5.85, 5.90, 5.95, 6.00, 6.05, 6.10, 6.15 또는 6.20일 수 있다.
전체적으로 본 발명의 맥락에서, (적어도 하나의) 피드 배지의 pH 저하 덕분에, 전체 공정 성능에 영향을 미치지 않으면서 배양 방법 전반에 걸쳐 주 피드의 침전을 피하거나 적어도 감소시키는 것이 가능하였다.
본 발명의 맥락에서, 생산기는 바람직하게는 50 L 이상, 100 L 이상, 500 L 이상, 1,000 L 이상, 2,000 L 이상, 5,000 L 이상, 10,000 L 이상 또는 20,000 L 이상의 용적을 갖는 생물반응기(예컨대, 생산 생물반응기)에서 수행된다. 다시 말해서, 재조합 단백질을 생산하는 포유동물 세포는 바람직하게는 50 L 이상, 100 L 이상, 500 L 이상, 1,000 L 이상, 2,000 L 이상, 5,000 L 이상, 10,000 L 이상 또는 20,000 L 이상의 용적을 갖는 생물반응기(예컨대, 생산 생물반응기)에서 배양된다.
전체적으로 본 발명의 맥락에서, 적합한 포유동물 숙주 세포(포유동물 세포로도 명명됨)는 중국 햄스터 난소(CHO 세포), 림프구 세포주, 예를 들어 NSO 골수종 세포 및 SP2 세포, COS 세포, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 포유동물 세포는 CHO이다. CHO 세포의 적합한 유형은 CHO-DG44 세포 및 CHO-DXB11 세포와 같은 dhfr-CHO 세포를 포함하고 DHFR 선택 마커와 함께 사용될 수 있는 CHO 및 CHO-K1 세포, 또는 글루타민 신테타제 선택 마커와 함께 사용될 수 있는 CHOK1-SV를 포함할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 관심대상의 재조합 단백질을 코딩하는 발현 벡터로 안정하게 형질전환되거나 형질감염된다.
전체적으로 본 발명의 맥락에서, 재조합 단백질은 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 융합 단백질(예컨대, 항체의 도메인 또는 다른 단편을 포함하는 단백질) 또는 항체일 수 있다. 단백질이 항체인 경우, 이는 바람직하게는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4와 같은 IgG이다.
본 발명의 방법은 임의로, 바람직하게는 생산의 종료 시(수거 단계)에 세포 배양 배지로부터 재조합 단백질을 회수하는 단계(수거 단계)를 추가로 포함한다. 수거 후, 재조합 단백질은 예를 들어 단백질이 항체인 경우에 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다. 방법은 임의로 정제된 재조합 단백질을 예를 들어 높은 단백질 농도, 예컨대 10 mg/ml 이상, 예를 들어 50 mg/ml 이상, 예컨대 100 mg/ml 이상, 예를 들어 150 mg/ml 이상의 농도를 갖는 제형으로 제형화하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 제한 없이, 제형은 액체 제형, 동결건조된 제형 또는 분무 건조된 제형일 수 있다.
도면의 설명:
도 1: A) 분말로부터 "통상적" 피드의 제조. B) 분말로부터 "농축된" 피드의 제조
도 2: mAb1을 발현하는 세포의 생존 세포 농도 프로파일
도 3: mAb1에 대한 13일 및 14일차의 역가
도 4: mAb1을 발현하는 세포의 생존 세포 농도 프로파일
도 5: mAb1 생산 성능
도 6: mAb2를 발현하는 세포의 생존 세포 농도 프로파일
도 7: mAb2에 대한 13일 및 14일차의 역가
도 8: mAb3을 발현하는 세포의 생존 세포 농도 프로파일
도 9: mAb3에 대한 14일차의 역가
도 10: mAb4를 발현하는 세포의 생존 세포 농도 프로파일
도 11: mAb4에 대한 13일 및 14일차의 역가
실시예
세포주, 세포 배양 및 실험 절차
CHO-DG44 세포주를 사용하였다. 세포는 다중 발효 제어 시스템(MFCS, Sartorius Stedim Biotech)에 의해 제어되는 공급 타워(C-DCUII, Sartorius Stedim Biotech)가 있는 2 L 교반 탱크 유리 생물반응기(STR) 또는 진탕 플라스크에서 배양하였다. 각각 mAb1, mAb2, mAb3 또는 mAb4를 생산하는 4가지의 상이한 생산 세포주를 사용하였다. mAb1 및 mAb3은 pI가 각각 8.3 내지 8.7 및 7.70 내지 7.90인 IgG4 항체이다. mAb2 및 mAb4는 pI가 8.7 내지 9.2인 Trybe® 항체이다.
반응기에는 3-세그먼트 블레이드 임펠러가 장착되었다. 배양 시작 용적은 배양 종료 용적이 최적이 되는 것을 보장하도록 조정하였다. 생산 생물반응기에는 화학적으로 정의된 기초 배지 중의 목표 시딩 밀도(TSD)로 시딩하였다. 생산 생물반응기의 pH 제어는 0.2(pH 7.0 ± 0.2)의 불감대로 7.0으로 설정하였다. 목표 pO2는 40 내지 60% 공기 포화도로 설정하였고 표준 관행에 따라 제어하였다. 온도는 0.2(36.8℃ ± 0.2)의 불감대로 36.8℃에서 제어하였다.
실시예 1 내지 3 및 5의 경우에는 농축된 주 피드를 사용하였다. 주 피드 분말을 액체에서 원하는 농도(이 분말에 대한 표준 프로토콜에 비해 약 2배 농축됨)에 도달할 때까지 용해시켜 이러한 주 피드(수성)를 제조하였고, pH를 목표 pH로 조정하였다. 실시예 4에서 사용된 비농축 피드는 주 피드 분말을 이 분말에 대한 표준 프로토콜(농도 x1에 도달하기 위해)에 따라 용해시켜 제조하고 pH를 목표 pH로 조정하였다. 주 피드가 담긴 백은 모든 배양 방법 동안 실온에서 유지시켰다. 접종 48시간 후, 연속적인 영양소 공급("주 피드"로 명명된 농축된 피드를 이용)을 예정된 속도로 시작하였다. 요구에 따라, 즉 글루코스 농도가 소정의 임계값 미만으로 저하되었을 때(글로크스 농도는 매일 측정하였다) 글루코스 볼루스 피드를 배양물에 첨가하였다. 주 피드가 Cys, Tyr 및 Trp 중 어느 하나도 포함하지 않았기 때문에, 이들 아미노산은 별도로 첨가하였다.
생산은 실온에서 14일 동안 유가 실험 모드로 작동하였다. 이 단계 동안, 단클론 항체(mAb)가 배지로 분비된다. 샘플을 매일 채취하여 VCD, 생존율, 오프라인(off-line) pH, pCO2, 오스몰랄농도(osmolality), 글루코스-락테이트 농도, 아미노산 농도 및 mAb 농도를 결정한다. 피드 첨가 전에 아미노산 분석을 위한 샘플을 채취하였다.
분석 방법
트리판 블루 배제에 기반하여 작동하는 VI-CELL® XR(Beckman-Coulter, Inc., 캘리포니아주 브레아) 자동화 세포 계수 장치를 사용하여 세포를 계수하였다. 배양 배지 중의 글루코스 및 락테이트 수준을 Cedex Bio HT(Roche)를 사용하여 결정하였다. 모델 2020 빙점 삼투압계(Advanced Instruments, Inc., 매사추세츠주 노우드)를 오스몰랄농도 결정을 위해 사용하였다. 모델 BioProfile pHOx® 혈액 가스 분석기(Nova Biomedical Corporation, 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 오프라인 가스 및 pH 측정을 수행하였다. 또한 대사산물 농도를 CedexBioHT 시스템(Roche)을 사용하여 매일 결정한다. 생성물 역가 분석은 분석 전에 -80℃에서 저장된 세포 배양 상청액 샘플과 함께 CEDEX 또는 단백질 A 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 수행하였다. 세포 배양 상청액 샘플은 
Xpress 시스템에서 단백질 A 정제로 정제한다. 정제된 mAb의 주요 이소형의 상대적 백분율은 영상화 모세관 전기영동(ProteinSimple iCE3)에 의해 결정한다. SAS 소프트웨어 JMP 11 ⓒ를 사용하여 통계 분석을 수행하였다.
실시예 1 - 낮은 피드 pH는 생산기(N기) 동안 세포 배양 성능을 유지하면서 피드 침전을 감소시킨다.
본 실험을 위해, 2 L 생물반응기에 mAb1을 생산하는 CHO 세포를 3.75x106 세포/mL의 시딩 밀도로 접종하였다. 두 생물반응기 모두의 접종물은 동일한 N-1 생물반응기로부터 유래하였다. 본 실험에서는, 3가지 조건을 상기 실험 절차에서 설명된 바와 같이 유가식 모드에서 시험하였다. 생물반응기 ID 1, 2 및 3은 동일한 공급 전략을 가졌지만, 2가지 상이한 pH: 각각 6.5, 6.0 및 5.5를 갖는 주 피드가 공급되었다.
도 2는 주 피드의 3가지 pH에서 유사한 경향을 보여준다. 또한, 도 3에 보고된 바와 같이, 주 피드의 낮은 pH는 mAb 역가에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 임의의 시험된 조건(즉, pH 5.5, 6.0 및 6.5) 하에 성장한 세포는 수거일(13일 또는 14일차)에 관계없이 유사한 mAb1 역가를 나타낸다.
주 피드 침전에 대한 상당한 영향이 관찰되었다. 표 1에 서술된 바와 같이, pH 6.5의 주 피드에서는 침전이 발생하였지만, 더 낮은 pH(pH 6.0 및 5.5)를 갖는 주 피드에서는 침전이 발생하지 않았다. 육안 검사는 N기의 종료 시(생물반응기 1/2/3으로부터 주 피드 병을 분리한 후; 사진은 도시하지 않음)에 실시하였다. pH 6.5에서는 침전된 주 피드 용액의 혼탁함(cloudiness)이 관찰되었다. 대조적으로, pH 6.0 이하에서는 주 피드 용액에 대해 맑은/투명한 용액이 관찰되었다.
더 낮은 pH의 주 피드를 사용하고 목표 pH 7.0의 목표 범위 ± 0.2에서 유지시켰을 때 배양액의 pH는 거의 영향을 받지 않았다는 것이 주목된다.
결론 : 실시예 1은 공정 성능(VCC 및 역가 측정을 통해 평가됨)에 있어 모든 조건들 사이에 차이가 없음을 보여준다. 생산 공정 동안 배양물을 (이의 표준 pH, 즉 pH 6.5와 비교하여) 더 낮은 pH의 주 피드로 보충하는 것은 공정 성능에 영향을 미치지 않으며 주 피드 보충 동안 및/또는 후에 침전을 감소시키고/시키거나 방지할 수 있다는 결론이 내려졌다.
실시예 2 - mAb1을 생산하기 위한 대규모에서 낮은 pH의 주 피드로의 보충
본 실험을 위해, 2 L 및 2000 L 생물반응기에 mAb1을 생산하는 CHO 세포를 접종하였다. 2 L 생물반응기에는 3.75x106 세포/mL의 시딩 밀도로 접종한 반면, 2000 L에는 3.40x106 세포/mL의 시딩 밀도로 접종하였다. 각 생물반응기의 접종물은 3가지의 상이한 N-1 생물반응기로부터 유래하였다. 2가지 실험 조건을 상기 실험 절차에서 설명된 바와 같이 상이한 규모의 유가식 공정에서 시험하였다. 생물반응기 ID /4/5/6은 동일한 공급 전략을 가졌지만, 2가지 상이한 pH: 각각 6.5 및 6.0을 갖는 주 피드가 공급되었다(표 2 참조).
세포 성장 프로파일은 도 4에 도시되어 있다. 생물반응기 ID 4 및 5의 세포 성장은 유사한 경향을 나타냈다. 생물반응기 ID 6(대규모)은 소규모 조건에 비해 약간 더 양호한 세포 성장을 보여주었다. 또한, 생물반응기 ID 6은 다른 조건에 비해 더 양호한 역가(13일 및 14일차)를 보여주었다(도 5 참조). 결과는 대규모의 공정이 2 L 규모에서 생성된 데이터와 비교할 때 더 양호한 mAb1 생산을 야기한다는 것을 확인시켜 준다. 게다가, 이들은 더 낮은 pH의 주 피드를 보충하는 것이 전체 mAb1 생산에 미치는 부정적인 영향이 없음을 확인시켜 준다. 실시예 1에 따르면, pH 6.5에서는 침전된 주 피드 용액의 혼탁함이 관찰되었다. 대조적으로, 생산 규모에 관계없이 pH 6.0에서는 주 피드 용액에 대해 맑은/투명한 용액이 관찰되었다.
결론 : 실시예 2는 실시예 1의 조사결과를 확인시켜 주고 표준 pH(즉, pH 6.5)와 비교하여 더 낮은 pH의 주 피드가 소규모 공정 및 대규모 공정 두 가지 모두 동안 세포 배양물에 첨가되어 전체 공정 성능에 역효과를 미치지 않으면서 항체를 생산할 수 있음을 강조한다. 놀랍게도, 대규모 결과는 소규모에서 생성된 데이터와 비교할 때 세포 성장 및 최종 역가의 개선을 보여준다.
실시예 3 - mAb2를 생산하기 위한 낮은 pH의 주 피드의 보충
본 실험을 위해, 2 L 및 200 L 생물반응기에 mAb2를 생산하는 CHO 세포를 2.25x106 세포/mL의 시딩 밀도로 접종하였다. 본 실험에서는, 2가지 실험 조건을 상기 실험 절차에서 설명된 바와 같이 상이한 규모의 유가식 공정에서 시험하였다. 생물반응기 ID 7/8/9는 동일한 공급 전략을 가졌지만, 2가지 상이한 pH: 각각 6.5 및 6.0을 갖는 주 피드가 공급되었다(표 4 참조).
세포 성장 프로파일은 도 6에 도시되어 있다. 두 조건 모두 및 두 규모 모두에서의 세포 성장은 13일차까지 유사한 경향을 나타냈다. 생물반응기 ID 9는 또한 생물반응기 7 및 8 중 하나의 역가에 필적하는 역가(13일 및 14일차)를 보여준다(도 7 참조). 결과는 낮은 pH의 주 피드의 첨가가 적어도 농축된 주 피드의 침전을 감소시키는 이점을 가지면서, 규모에 관계없이 전체 mAb1 생산에 미치는 부정적인 영향이 없음을 확인시켜 준다.
결론 : 실시예 3은 실시예 1 및 2의 조사결과를 확인시켜 주고 표준 pH(즉, pH 6.5)와 비교하여 더 낮은 pH의 주 피드가 대규모 공정 동안 세포 배양물에 첨가되어 전체 공정 성능에 역효과를 주지 않으면서 항체를 생산할 수 있고 전체 배양 공정 동안 주 피드의 침전을 감소시키고/시키거나 피할 수 있음을 강조한다.
실시예 4 - mAb3를 생산하기 위한 낮은 pH에서 비농축 주 피드의 보충
본 실험을 위해, 2 L 생물반응기에 mAb3을 생산하는 CHO 세포를 0.35x106 세포/mL의 시딩 밀도로 접종하였다. 본 실험에서는, 2가지 실험 조건을 상기 실험 절차에서 설명된 바와 같이 2 L 규모의 유가식 공정에서 시험하였다. 생물반응기 ID 10/11에는 동일한 공급 전략에 따라 비농축 주 피드를 공급하였지만, 2가지 상이한 pH: 각각 6.5 및 5.5에서 공급하였다(표 5 참조).
세포 성장 프로파일은 도 8에 도시되어 있다. 두 조건 모두에 대한 세포 성장은 14일차까지 유사한 경향을 나타냈다. 생물반응기 ID 10 및 11은 필적하는 역가(14일차)를 보여준다(도 9 참조). 결과는 더 낮은 pH의 비농축 주 피드의 첨가가 전체 mAb3 생산에 미치는 부정적인 영향이 없음을 확인시켜 준다. 육안 검사는 N기의 종료 시(생물반응기 10/11로부터 주 피드 병을 분리한 후; 사진은 도시하지 않음)에 수행하였다. pH 6.5에서는 침전된 비농축 주 피드 용액의 혼탁함이 관찰되었다. 대조적으로, pH 5.5에서는 비농축 주 피드 용액에 대해 맑은/투명한 용액이 관찰되었다.
결론 : 실시예 4는 실시예 1, 2, 3의 조사결과를 확인시켜 주고 표준 pH(즉, pH 6.5)와 비교하여 더 낮은 pH의 주 피드가 세포 배양물에 첨가되어 전체 공정 성능에 역효과를 미치지 않으면서 항체를 생산할 수 있음을 강조한다. 실시예 4는 비농축 피드에 대한 pH의 저하가 전체 배양 공정 동안 비농축 피드의 침전을 감소시키고/시키거나 피할 수 있음을 강조한다.
실시예 5 - mAb4를 생산하기 위한 낮은 pH의 주 피드의 보충
본 실험을 위해, 2 L 생물반응기에 mAb4를 생산하는 CHO 세포를 7.5x106 세포/mL의 시딩 밀도로 접종하였다. 본 실험에서는, 2가지 실험 조건을 상기 실험 절차에서 설명된 바와 같이 2 L 규모의 유가식 공정에서 시험하였다. 생물반응기 ID 12/13은 동일한 공급 전략을 가졌지만, 2가지 상이한 pH: 각각 6.0 및 5.5을 갖는 농축된 주 피드가 공급되었다(표 7 참조).
생물반응기 13은 생물반응기 ID 12에 비해 약간 더 낮은 세포 성장을 나타냈지만(도 10 참조), 이들은 필적하는 역가(14일차)를 나타냈다(도 11 참조). 결과는 더 낮은 pH의 주 피드의 첨가가 전체 mAb4 생산에 미치는 부정적인 영향이 없음을 확인시켜 준다.
육안 검사는 N기의 종료 시(생물반응기 12/13으로부터 주 피드 병을 분리한 후; 사진은 도시하지 않음)에 수행하였다. pH 6.0 및 pH 5.5에서 주 피드 용액에 대해 맑은/투명한 용액이 관찰되었다.
결론 : 실시예 5는 실시예 1, 2, 3 및 4의 조사결과를 확인시켜 주고 낮은 pH의 주 피드가 세포 배양물에 첨가되어 전체 공정 성능에 해로운 효과를 미치지 않으면서 항체를 생산할 수 있음을 강조한다. pH를 0.5 pH 단위씩 저하시키는 것(즉, 주 피드 pH 6.0에 비해 주 피드 pH 5.5)은 세포 성장에 최소한의 영향을 미치는 것으로 보인다. 실시예 5는 14일의 세포 배양 동안 주 피드에 대한 낮은 pH 보충의 실행 가능성을 강조한다.
참조문헌
Claims (14)
- 재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 방법으로서, 여기서 상기 방법은 포유동물 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계 및 생산기 동안 세포 배양물을 적어도 하나의 피드 배지(feed medium)로 보충하는 단계를 포함하고, 이러한 적어도 하나의 피드 배지의 pH가 약 5.0 내지 약 6.3인 방법.
- 재조합 단백질을 생산하는 방법으로서, 여기서 상기 방법은 상기 재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계 및 생산기 동안 세포 배양물을 적어도 하나의 피드 배지로 보충하는 단계를 포함하고, 이러한 적어도 하나의 피드 배지의 pH가 약 5.0 내지 약 6.3인 방법.
- 피드 배지에서 침전을 감소시키거나 방지하는 방법으로서, 여기서 상기 방법은 재조합 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계 및 생산기 동안 세포 배양물을 적어도 하나의 피드 배지로 보충하는 단계를 포함하고, 이러한 적어도 하나의 피드 배지의 pH가 약 5.0 내지 약 6.3인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 피드 배지로서, 이러한 적어도 하나의 피드 배지의 pH가 약 5.0 내지 약 6.3인 피드 배지.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 피드 배지가 농축된 주 피드 배지와 같은 주 피드 배지인 방법; 또는 피드 배지.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 약 5.2 내지 약 6.2인 방법; 또는 피드 배지.
- 제1항 내지 제3항, 제5항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 유가식 공정인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 피드 배지가 유리 아미노산 Cys 및 Tyr 중 어느 하나도 포함하지 않는 것인 방법; 또는 피드 배지.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 피드 배지가 유리 아미노산 Cys, Tyr 및 Trp 중 어느 하나도 포함하지 않는 것인 방법; 또는 피드 배지.
- 제1항 내지 제3항 또는 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인 방법.
- 제1항 내지 제3항 또는 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질이 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 항체 또는 융합 단백질인 방법.
- 제11항에 있어서, 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체인 방법.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 항체가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 방법.
- 제1항 내지 제3항 또는 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 재조합 단백질.
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