KR20200092348A - 세포 배양 방법 - Google Patents

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KR20200092348A
KR20200092348A KR1020207018104A KR20207018104A KR20200092348A KR 20200092348 A KR20200092348 A KR 20200092348A KR 1020207018104 A KR1020207018104 A KR 1020207018104A KR 20207018104 A KR20207018104 A KR 20207018104A KR 20200092348 A KR20200092348 A KR 20200092348A
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발렌틴 슈발리에
나딘 코하노프스키
레티샤 말페테스
빈센트 아돌프 카롤 쿨
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유씨비 바이오파마 에스알엘
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Abstract

본 발명은 세포 배양에서 생산되는 재조합 단백질 집단의 이질성을 감소시키는 방법으로서, 하나 이상의 시스테인/시스틴 유사체를 포함하는 세포 배양 배지에서 재조합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

Description

세포 배양 방법
본 발명은 재조합 단백질, 특히 항체의 제조 분야에 속한다. 보다 구체적으로, 이는 상업적 규모의 제조 중에 이질성이 감소한 재조합 단백질을 제조하기 위한 세포 배양 방법에 관한 것이다.
치료 항체와 같은 치료 단백질로서 재조합 단백질의 개발은 산업적 규모로 재조합 단백질의 생산을 요구한다. 이를 달성하기 위해, 여러 가지 발현 시스템, 원핵 및 진핵 시스템 두 가지 모두가 사용될 수 있다. 그러나 지난 20년 동안, 치료제로서 승인된 치료 단백질의 대부분은 포유동물 세포 배양을 통해 제조되었으며, 이러한 시스템은 여전히 대량의 인간용 재조합 단백질을 생산하기 위한 바람직한 발현 시스템이다.
그러나 포유동물 세포 배양은 중요한 과제를 제시한다. 생산된 재조합 단백질의 역가는 일반적으로 효모 및 곤충 세포에 기반한 것과 같은 다른 진핵생물 생산 시스템과 비교하여 매우 낮다. 지난 30년 동안, 세포 배양 배지의 조성 및 작동 조건의 변화, 및 대형 생물 반응기의 개발을 통해 최적의 세포 성장에 도달하는데 전념한 연구에 많은 초점을 맞추어 세포 배양 및 재조합 단백질 발현의 기본 파라미터를 확립하기 위해 많은 노력을 기울여 왔다(예를 들어, 문헌[Hecklau C., et al. J Biotech 218 (2016) 53-63; Zang Li. et al. Anal. Chem 83 (2011) 5422-5430] 참조). 예를 들어, L-시스테인은 배지 및 사료에 일반적으로 첨가되는 필수 아미노산 중 하나이다. S-술포시스테인 및 N-아세틸-시스테인과 같은 시스테인 유도체는 세포 배양에서 비생산성(specific productivity)을 향상시키기 위해 사용되어 왔다(Hecklau et al., 상기 문헌; Oh et al. (2005) Biotechnol. Prog. 21:1154).
수율은 포유동물 세포 배양에서 여전히 매우 중요한 측면이지만, 최근 몇 년간 개발 및 생산 규모의 모든 단계에서 생성물의 품질 및 공정의 일관성을 제어하는 데 중점을 두게 되었다. 포유동물 세포 배양에 의해 생산된 치료 단백질은 다양한 수준의 이질성을 나타낸다. 이러한 이질성은 상이한 글리코실화 패턴, 탈아미드화 또는 산화로 인한 차이, 상이한 전하 또는 크기 변이체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 재조합 단백질의 이질성은 또한 예를 들어 동일한 제조 공정에 의해 제조된 동일한 단백질의 상이한 뱃치(batch) 사이에서, 생성물의 색상 차이를 초래할 수 있다. 치료 단백질이 고농도로 제제화될 때, 관심의 재조합 단백질의 이러한 이질성, 특히 색상 차이가 더욱 명백해진다. 최근에, 치료 단백질을 고농도로 제제화해야 하는 치료 단백질의 피하 전달에 대한 경향이 꾸준히 있어왔다. 고농도는 또한 응집 수준증가와 관련되어왔다(Purdie J., et al. Biotechnology Progress, 2016). 산성 종의 수준증가와 같이 전하 변이체 증가는 단백질 안정성에 영향을 줄 수 있지만(Banks D. D., et al. Journal of pharmaceutical sciences, 2009) 농축된 치료 단백질의 색상은 더 강해질 수 있다.
배지의 조성과 같은 세포 배양 조건(Kshirsagar R., et al. Biotechnology and Bioengineering, 109:10, 2523-2532 (2012); US　2013/0281355호; WO　2013/158275호), 및 pH 및 온도를 포함하는 배양 조건(US　8,765,413호)은 치료 단백질의 품질 특성에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 그러나 치료 단백질, 특히 최소한의 이질성을 갖는 치료 항체의 생산을 위한 추가로 개선된 세포 배양 방법을 제공할 것이 여전히 요구된다.
발명의 요약
본 발명은 세포 배양에서 재조합 단백질의 생산에 사용되는 배지에 시스테인/시스틴 유사체를 첨가하고/하거나 시스테인/시스틴을 시스테인/시스틴 유사체로 부분적으로 대체함으로써 상기 확인된 요구를 해결한다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 세포 배양에서 생산되는 재조합 단백질 집단의 이질성을 감소시키는 방법으로서, 하나 이상의 시스테인/시스틴 유사체를 포함하는 세포 배양 배지에서 재조합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
제2 측면에서, 본 발명은 재조합 단백질 제제의 제조 방법으로서,
(i) 상기 숙주 세포를 초기량의
(a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
(b) 시스테인 및/또는 시스틴
을 선택적으로 포함하는 기본 배지에 접종하는 단계:
(ii) 재조합 단백질이 세포에 의해 생산되는 생산 단계를 통해 배양을 진행시키는 단계로서, 상기 생산 단계 동안 세포 배양 배지에는
(a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
(b) 시스테인 및/또는 시스틴
이 보충되는 것인 단계
를 포함하며,
(a) 및 (b)는 동시에 또는 순차적으로 첨가될 수 있으며,
기본 배지의 내용물 및 첨가된 총 보충물이 합산될 때, (a) 대 (b)의 몰비는 1:18 내지 18:1인 방법에 관한 것이다.
제3 측면에서, 본 발명은 재조합 단백질 제제의 제조 방법으로서,
(i) 상기 숙주 세포를 초기량의
(a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
(b) 시스테인 및/또는 시스틴
을 선택적으로 포함하는 기본 배지에 접종하는 단계:
(ii) 재조합 단백질이 세포에 의해 생산되는 생산 단계를 통해 배양을 진행시키는 단계로서, 상기 생산 단계 동안 세포 배양 배지에는
(a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
(b) 시스테인 및/또는 시스틴
이 보충되는 것인 단계
를 포함하며,
(a) 및 (b)는 동시에 또는 순차적으로 첨가될 수 있으며,
기본 배지의 내용물 및 첨가된 총 보충물이 합산될 때, (a) 대 (b)의 몰비는 1:18 내지 18:1인 방법에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된 재조합 단백질 제제에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 N,N'-디아세틸-L-시스틴-디메틸에스테르를 포함하는, 포유동물 세포를 배양하기에 적합한 세포 배양 배지에 관한 것이다.
[도 1]: 생존 세포 농도
[도 2]: 대조군(100% 시스테인 공급물)과 비교한 제14일에서의 Mab 역가의 상대 변화율(%)
[도 3]: 대조군(100% 시스테인 공급물)과 비교한 제14일에서의 색상 강도(b*값) 수준의 상대 변화율(%)
[도 4]: 대조군(100% 시스테인 공급물)과 비교한 제14일에서의 산성 종 수준의 상대 변화율(%)
[도 5]: 대조군(100% 시스테인 공급물)과 비교한 제14일에서의 주 전하 종 수준의 상대 변화율(%)
[도 6]: 생존 세포 농도
[도 7]: 대조군(100% 시스테인 공급물)과 비교한 제14일에서의 Mab 역가의 상대 변화율(%)
[도 8]: 대조군(100% 시스테인 공급물)과 비교한 제14일에서의 산성 종 수준의 상대 변화율(%)
[도 9]: 대조군(100% 시스테인 공급물)과 비교한 제14일에서의 주 전하 종 수준의 상대 변화율(%)
[도 10]: 2L 생물 반응기에서 세포주 1에 대한 세포 성장 프로파일(생존 세포 농도)
[도 11]: 2L 생물 반응기에서 세포주 1의 대조군과 비교한 Mab 역가의 상대 변화율(%)
[도 12]: 2L 생물 반응기에서 세포주 1의 대조군과 비교한 산성 종 수준의 상대 변화율(%)
[도 13]: 2L 생물 반응기에서 세포주 1의 대조군과 비교한 주 전하 종 수준의 상대 변화율(%)
[도 14]: 2L 생물 반응기에서 세포주 1의 대조군에 대한 색상 강도(b*값)의 상대 변화율(%)
[도 15]: 2L 생물 반응기에서 세포주 2에 대한 세포 성장 프로파일(생존 세포 농도)
[도 16]: 2L 생물 반응기에서 세포주 2의 대조군과 비교한 Mab 역가의 상대 변화율(%)
[도 17]: 2L 생물 반응기에서 세포주 2의 대조군과 비교한 산성 종 수준의 상대 변화율(%)
[도 18]: 2L 생물 반응기에서 세포주 2의 대조군과 비교한 주 전하 종 수준의 상대 변화율(%)
[도 19]: 2L 생물 반응기에서 데이터 세트 1 및 2의 평균 세포 성장 프로파일(오류 막대 = 1SD)
[도 20]: 대조군에 대한 Mab 역가의 상대 변화율(%). 데이터 세트 1 및 2의 평균 값(오류 막대 = 1SD)
[도 21]: 대조군에 대한 산성 종 수준의 상대 변화율(%). 데이터 세트 1 및 2의 평균 값(오류 막대 = 1SD)
[도 22]: 대조군에 대한 주 전하 종 수준의 상대 변화율(%). 데이터 세트 1 및 2의 평균 값(오류 막대 = 1SD)
[도 23]: 대조군에 대한 색상 강도(b*값)의 상대 변화율(%). 데이터 세트 1 및 2의 평균 값(오류 막대 = 1SD)
[도 24]: 15mL 생물 반응기에서 세포주 1에 대한 세포 성장 프로파일
[도 25]: 상이한 시스테인/시스틴 유사체 수준에 반응하는 대조군에 대한 산성 종 수준의 상대 변화율(%).
[도 26]: 상이한 시스테인/시스틴 유사체 수준에 반응하는 대조군에 대한 주 전하 종 수준의 상대 변화율(%).
상기한 바와 같이, 제1 측면에서, 본 발명은 세포 배양에서 생산되는 재조합 단백질 집단의 이질성을 감소시키는 방법으로서, 하나 이상의 시스테인/시스틴 유사체를 포함하는 세포 배양 배지에서 재조합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 특히 재조합 단백질의 착색을 감소시킨다. 따라서, 독립적인 측면에서, 본 발명은 세포 배양에서 생산되는 재조합 단백질 집단의 착색을 감소시키는 방법으로서, 하나 이상의 시스테인/시스틴 유사체를 포함하는 세포 배양 배지에서 재조합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
추가의 독립적인 측면에서, 본 발명은 재조합 단백질 제제의 제조 방법으로서,
(i) 상기 숙주 세포를 초기량의
(a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
(b) 시스테인 및/또는 시스틴
을 선택적으로 포함하는 기본 배지에 접종하는 단계:
(ii) 재조합 단백질이 세포에 의해 생산되는 생산 단계를 통해 배양을 진행시키는 단계로서, 상기 생산 단계 동안 세포 배양 배지에는
(a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
(b) 시스테인 및/또는 시스틴
이 보충되는 것인 단계
를 포함하며,
(a) 및 (b)는 동시에 또는 순차적으로 첨가될 수 있으며,
기본 배지의 내용물 및 첨가된 총 보충물이 합산될 때, (a) 대 (b)의 몰비는 1:18 내지 18:1인 방법에 관한 것이다.
이질성
본 발명은 재조합 단백질의 제조 공정에서 생산 단계 동안 시스테인/시스틴 유사체를 세포 배양 배지에 첨가함으로써, 생산 종료 시에 재조합 폴리펩티드의 역가를 감소시키지 않으면서 생산되는 재조합 폴리펩티드의 이질성이 감소된다는 발견에 기초한다.
이질성은 바람직하게는 다음과 관련하여 감소된다:
a. 색상 또는 색상 강도;
b. 전하 이질성(바람직하게는 산성 피크 그룹 종(APG) 및/또는 염기성 피크 그룹 종(BPG)을 감소시키는 단계에 의하며, 이로써 주 전하 종은 감소하지 않음); 및/또는
c. 아미노산 산화, 바람직하게는 메티오닌 산화.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "이질성"은 동일한 제조 공정에 의해 또는 동일한 제조 뱃치 내에서 생산된 분자 집단에서, 개별 분자, 예를 들어 재조합 단백질 사이의 차이를 지칭한다. 이질성은 재조합 폴리펩티드의 불완전한 또는 불균일한 변형의 결과일 수 있으며, 예를 들어 폴리펩티드의 번역 후 변형 또는 전사 또는 번역 동안 혼입 오류에 기인한다. 번역 후 변형은 예를 들어 탈아미노화 반응 및/또는 산화 반응 및/또는 소분자의 공유적 첨가 예컨대 글리코실화 반응 및/또는 이성질화 반응 및/또는 단편화 반응 및/또는 다른 반응의 결과일 수 있으며 글리코실화 패턴의 변화를 포함할 수도 있다. 이러한 이질성의 화학-물리적 발현은 전하 변이체 프로파일, 색상 또는 색상 강도 및 분자량 프로파일을 포함하지만 이에 제한되지 않는 생성된 재조합 폴리펩티드 제제에서 다양한 특성을 초래한다.
본원에서 사용될 때 "착색된" 또는 "착색되다"라는 용어는 농축 단백질 제제와 같은 액체 용액이 무색이 아님을 나타낸다. 유럽 약전의 정의에 따르면, 용액이 물 R 또는 용매의 외관을 갖거나 기준 용액 B9보다 더 강하게 착색되지 않으면 용액은 무색이다(유럽 약전 2.2.2). 본 발명에 따라 사용될 수 있는, 세포 배양에서 재조합 단백질의 색상 또는 색상 강도의 감소를 측정하는 가능한 방법은 투과에 의한 분광 광도계를 사용하여, 예를 들어 UltrascanPro를 사용하여 CIE 표준 광원 A 색상 강도의 상대 분광 전력 분포를 측정하는 것과 데이터를 CIE(commission internationale de l'
Figure pct00001
clairage) 척도와 비교하여 예를 들어 b*값을 비교하는 것에 의한다.
전하 이질성의 감소는 바람직하게는 세포 배양에서 생산된 재조합 단백질 집단에서 산성 피크 그룹(APG) 종을 측정함으로써 정의된다. APG 감소를 측정하는 가능한 방법은 영상화 모세관 전기영동(예를 들어, ProteinSimple iCE3)을 통해 시스테인/시스테인 유사체가 있거나 없는 세포 배양 배지에서 생산된 재조합 단백질의 산성 아이소형(APG: 산성 피크 그룹)의 상대 백분율을 결정하는 것이며, 상기 재조합 단백질은 측정 시에 바람직하게는 정제된다. 재조합 단백질의 아이소형을 측정할 때, APG 이외에 염기성 아이소형(염기성 피크 그룹(BPG)) 및 주 전하 종도 측정되며, 여기서 주 전하 종은 얻고자 하는 재조합 단백질의 아이소형을 나타낸다. APG가 감소할 때, BPG의 증가가 실질적으로 없는 것이 바람직하다. 바람직하게는, APG가 감소하면, 주 전하 종 수준이 증가한다.
기재된 바와 같이, 본 발명은 재조합 폴리펩티드의 수율을 감소시키지 않으면서 생산되는 재조합 폴리펩티드의 이질성이 감소한 재조합 단백질의 제조에 관한 것이다. 바람직하게는, 재조합 폴리펩티드의 역가는 증가한다. 본 발명에 따르면, "역가"는 달리 지시되지 않는 한, 생산 단계의 종료 시 재조합 폴리펩티드의 농도이다.
시스테인/시스틴 유사체
본원에서 사용될 때, 용어 "시스테인 유사체" 또는 "시스테인 유도체"는 시스테인 자체를 제외하고 시스테인의 구조적 유사체인 하나 이상의 화합물을 의미한다.
본원에서 사용될 때 용어 "시스틴 유사체" 또는 "시스틴 유도체"는 시스틴 자체를 제외하고 시스테인의 구조적 유사체인 하나 이상의 화합물을 의미한다.
용어 "시스테인/시스틴 유사체"는 "시스테인 유사체" 또는 "시스틴 유사체" 또는 "시스테인 유사체"와 "시스틴 유사체"의 혼합물을 의미한다.
용어 "시스테인/시스틴 유도체"는 "시스테인 유도체" 또는 "시스틴 유도체" 또는 "시스테인 유도체"와 "시스틴 유도체"의 혼합물을 의미한다.
본 발명에 따른 일 실시 양태에서, 시스테인/시스틴 유사체는 화학식 1 및 2로 나타낸 화합물로부터 선택된 하나 이상의 화합물 및 이의 염을 포함하거나 이로 이루어진다:
Figure pct00002
식에서,
R1, R2, R4 및 R5는 독립적으로 수소, 아미노 카르보닐, C2- 22아실, C1- 22알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 22알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C1-22 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C1- 22알킬술포닐, 또는 C5- 22아릴 술포닐을 나타내고,
R3 및 R6은 독립적으로 히드록시; NH2; C1- 22알콕시(여기서 C1-22 알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 선택적으로 대체될 수 있음); C1-22 알킬아미노(이 기는 히드록시 또는 C1-22 알킬로 선택적으로 치환됨); 히드록시 아미노; C1-22 알콕시 아미노; C1-22 알킬아미노(여기서 C1-22 알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); C1- 22헤테로알킬아미노; 히드록시로 선택적으로 치환된 디(C1-22 알킬)아미노; 디(C1-22알킬)아미노(여기서 C1-22 알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); 또는 디(C1-22헤테로알킬)아미노를 나타내고;
R7은 수소, 포스페이트 또는 술페이트를 나타내고;
L은 선택적으로 치환된 C1- 10알킬렌 쇄를 나타내고;
단, 상기 화합물은 시스테인 또는 시스틴이 아니다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "C1-22 알킬"은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고 쇄에 1 내지 22개의 탄소 원자를 포함할 수 있는 지방족 탄화수소기를 지칭한다. 일반적으로, 본 발명에서 사용되는 화합물에 존재할 수 있는 C1-22 알킬기는 C6-22 알킬기, C12-22 알킬기, C1-16 알킬기, C1-10 알킬기 및 C1-6 알킬기를 포함한다. C12-22 알킬기의 예에는 팔미티닐 및 스테아릴이 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "C5-22 아릴"은 단일 고리 또는 다중 축합 고리를 갖는 5 내지 22개의 탄소 원자의 불포화 방향족 카르보시클릭 기를 지칭한다. 일반적으로, 본 발명에서 사용되는 화합물에 존재할 수 있는 C5-22 아릴 기는 C5-14 아릴 기를 포함하고, 적합하게는 C5-10 아릴 기를 포함한다. C5-22 아릴 기의 예는 페닐 및 나프틸이다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "C5-22 헤테로아릴"은 단일 고리 또는 다중 축합 고리를 갖는 5 내지 22개의 탄소 원자의 방향족 카르보시클릭 기로서, 상기 탄소 원자 중 하나 이상은 산소, 황 및 질소로부터 선택된 하나 이상의 헤테로 원자로 대체된 기를 나타낸다. 일반적으로, 본 발명에서 사용되는 화합물에 존재할 수 있는 C5-22 헤테로아릴 기는 C5-14 헤테로아릴 아릴 기를 포함하고, 적합하게는 C5-10 헤테로아릴 기를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "C2-22 아실"은 화학식 -(C=O)R로 나타내는 기를 지칭하며, 여기서 R은 상기 정의된 바와 같은 C1-22 알킬기를 나타낸다. 일반적으로, 본 발명에서 사용되는 화합물에 존재할 수 있는 C2-22 아실 기는 C2-6 아실 기, C6-22 아실 기, 및 C12-22 아실 기를 포함한다. 이러한 C2-6 아실의 예는 메틸 카르보닐, 에틸 카르보닐, 및 부틸 카르보닐이다. C12-22 아실 기의 예는 팔미티닐 카르보닐 및 스테아릴 카르보닐을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "C1-22 알콕시"는 화학식 -O-R로 나타내는 기를 지칭하며, 여기서 R은 상기 정의된 바와 같은 C1-22 알킬기를 나타낸다. 일반적으로, 본 발명에 사용되는 화합물에 존재할 수 있는 C1- 22알콕시 기는 C1- 6알콕시 기 C6- 22알콕시 기 및 C12- 22알콕시 기를 포함한다. C1-6 알콕시 기의 예는 메톡시 및 에 톡시이다. C12-22 알콕시 기의 예는 팔미티닐옥시 및 스테아릴옥시를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "C1-22 헤테로알킬"은 하나 이상의 탄소 원자가 하나 이상의 산소 또는 질소 원자로 대체된 상기 정의된 바와 같은 C1-22 알킬을 지칭한다. 일반적으로, 본 발명에서 사용되는 화합물에 존재할 수 있는 C1-22 헤테로알킬 기는 C1- 6헤테로알킬 기, C6- 22헤테로알킬 기 및 C12- 22헤테로알킬 기를 포함한다. C1-22 헤테로알킬의 예는 에틸렌 글리콜의 올리고머를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "히드록시술포닐"은 화학식 -S(=O)2-OH로 나타내는 기를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "C1- 22알킬 술포닐"은 화학식 -S(=O)2-R로 나타내는 기를 지칭하며, 여기서 R은 상기 정의된 바와 같은 C1-22 알킬기를 나타낸다. 일반적으로, 본 발명에 사용되는 화합물에 존재할 수 있는 C1-22 알킬 술포닐 기는 C1-6 알킬 술포닐 기 및 C6-22 알킬 술포닐 기, C12-22 알킬 술포닐 기를 포함한다. C1-22 알킬 술포닐의 예는 메틸 술포닐, 에틸 술포닐, 및 tert-부틸 술포닐을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "C5- 22아릴 술포닐"은 화학식 -S(=O)2-R'로 나타내는 기를 지칭하며, 여기서 R'는 상기 정의된 바와 같은 C5-22 아릴기를 나타낸다. C5-22아릴 술포닐의 예는 페닐 술포닐 및 톨릴 술포닐을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "C1-2 알킬아미노"는 화학식 -NH-R로 나타내는 기를 지칭하며, 여기서 R은 상기 정의된 바와 같은 C1-22 알킬기를 나타낸다. 일반적으로, 본 발명에서 사용되는 화합물에 존재할 수 있는 C1- 22알킬아미노 기는 C1- 6알킬아미노 기, C6- 22알킬아미노 기 및 C12- 22알킬아미노 기를 포함한다. C1-22 알킬 아미노의 예는 메틸아미노, 에틸아미노, 및 부틸아미노를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 C1-22 알콕시 아미노는 화학식 -NH-OR로 나타내는 기를 지칭하며, 여기서 R은 상기 정의된 바와 같은 C1-22 알킬기를 나타낸다. 일반적으로, 본 발명에서 사용되는 화합물에 존재할 수 있는 C1- 22알콕시아미노 기는 C1-6알콕시아미노 기, C6- 22알콕시아미노 기 및 C12- 22알콕시아미노 기를 포함한다. C1-22 알킬아미노의 예는 메틸아미노, 에틸아미노, 및 부틸아미노를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "디(C1-22 알킬)아미노"는 화학식 -NRR'을 나타내며, 여기서 R 및 R'는 독립적으로 상기 정의된 바와 같은 C1-22 알킬기를 나타낸다. 일반적으로, 본 발명에 사용되는 화합물에 존재할 수 있는 디(C1-22 알킬)아미노 기는 디(C1-6 알킬)아미노, 디(C6-22 알킬)아미노 및 디(C12-22 알킬)아미노를 포함한다. 디(C1-22 알킬)아미노의 예에는 디메틸 아미노, (메틸)(에틸)아미노, 디에틸 아미노, 프로필 아미노 및 부틸 아미노가 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "C1-22 헤테로알킬아미노"는 화학식 -NH-R로 나타내는 기를 지칭하며, 여기서 R은 상기 정의된 바와 같은 C1-22 헤테로알킬 기를 나타낸다. 일반적으로, 본 발명에서 사용되는 화합물에 존재할 수 있는 C1- 22헤테로알킬아미노 기는 C1- 6헤테로알킬아미노, C6- 22헤테로알킬아미노 및 C12- 22헤테로알킬아미노를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "디(C1-22헤테로알킬)아미노"는 화학식 -NRR '을 나타내며, 여기서 R 및 R'는 독립적으로 상기 정의된 바와 같은 C1- 22헤테로알킬 기를 나타낸다. 일반적으로, 본 발명에 사용되는 화합물에 존재할 수 있는 디(C1-22 헤테로알킬)아미노 기는 디(C1-6 헤테로알킬)아미노, 디(C6-22 헤테로알킬)아미노 및 디(C12-22 헤테로알킬)아미노를 포함한다.
용어 "C1-10 알킬렌 쇄"는 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 2가 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌 쇄를 지칭한다. "C1-10 알킬렌 쇄"의 전형적인 예는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 및 부틸렌을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "아미노 카르보닐"은 화학식 -CO-N(RaRb)로 나타내는 기를 지칭하며, 여기서 -CO의 탄소는 시스테인/시스틴 유사체의 질소에 결합하고 Ra 및 Rb는 서로 독립적으로 상기 정의된 바와 같은 C1-22알킬을 나타낸다.
본 발명에 따른 일 실시 양태에서, 시스테인/시스틴 유사체는 화학식 1로 나타내는 시스테인 유사체로부터 선택되며, 식에서 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 L은 상기 정의된 바와 같다. 이 실시 양태의 특정 측면에서, R7은 수소를 나타낸다.
본 발명에 따른 다른 실시 양태에서, 시스테인/시스테인 유사체는 화학식 2로 나타내는 시스틴 유사체로부터 선택되며, 식에서 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 L은 상기 정의된 바와 같다.
일반적으로, R1, R2, R4 및 R5는 독립적으로 수소, C2- 22아실, C1- 22알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 22알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); 또는 C1-22 헤테로알킬을 나타낸다.
일반적으로, R3 및 R6은 독립적으로 히드록시; NH2; C1- 22알콕시(여기서 C1-22 알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 선택적으로 대체될 수 있음); C1-22 알킬아미노(이 기는 히드록시로 선택적으로 치환됨); 또는 히드록시로 선택적으로 치환된 디(C1-22 알킬)아미노를 나타낸다.
일반적으로, R7은 수소를 나타낸다.
일반적으로, L은 하나 이상의 C1-6 알킬, 바람직하게는 2개의 메틸기로 선택적으로 치환된 C1-4 알킬렌 쇄를 나타낸다.
적합하게는, R1은 수소 또는 C2- 22아실을 나타낸다. 전형적으로, R1은 수소 또는 C2- 6아실을 나타낸다. 예시적으로, R1은 수소 또는 아세틸을 나타낸다. 특정 실시 양태에서, R1은 수소를 나타낸다.
적합하게는, R2는 수소 또는 C2- 22아실을 나타낸다. 전형적으로, 수소 또는 C2-6아실을 나타낸다. 예시적으로, R2는 수소 또는 아세틸을 나타낸다.
적합하게는, R3은 히드록시 또는 C1- 22알콕시를 나타낸다. 전형적으로, R3은 히드록시 또는 C1-6알콕시이다. 예시적으로, R3은 히드록시 또는 메톡시를 나타낸다.
적합하게는, R4는 수소 또는 C2- 22아실을 나타낸다. 전형적으로, R4는 수소 또는 C2- 6아실을 나타낸다. 예시적으로, R4는 수소 또는 아세틸을 나타낸다. 특정 실시 양태에서, R4는 수소를 나타낸다.
적합하게는, R5는 수소 또는 C2- 22아실을 나타낸다. 전형적으로, R5는 수소 또는 수소 또는 C2- 6아실을 나타낸다. 예시적으로, R5는 아세틸을 나타낸다.
적합하게는, R6은 히드록시 또는 C1- 22알콕시를 나타낸다. 전형적으로, R6은 히드록시 또는 C1- 6알콕시를 나타낸다. 예시적으로, R6은 히드록시 또는 메톡시를 나타낸다.
적합하게는, L은 메틸렌 또는 에틸렌을 나타낸다. 예시적으로, L은 메틸렌을 나타낸다.
일 실시 양태에서, 시스테인/시스틴 유사체는 화학식 1로 나타내는 화합물로부터 선택된 하나 이상의 화합물 및 이의 염을 포함하며, 식에서 L, R1, R2, R3 및 R7은 상기 정의된 바와 같으며,
단,
(i) R1 또는 R2 기 중 하나가 C6- 22아실, C6- 22알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 22알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C6-22 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C6-22알킬술포닐, 또는 C5-22아릴 술포닐을 나타내면,
나머지 R1 또는 R2 기는 독립적으로 수소, 아미노 카르보닐, C2- 6아실, C1- 6알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 6알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C1-6 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C1- 6알킬술포닐, 또는 C5- 10아릴 술포닐을 나타내고,
R3은 히드록시; NH2; C1- 6알콕시(여기서 C1- 22알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 선택적으로 대체될 수 있음); C1-6 알킬아미노(이 기는 히드록시 또는 C1- 6알킬로 선택적으로 치환됨); 히드록시 아미노; C1-6 알콕시 아미노; C1-6 알킬아미노(여기서 C1- 6알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); C1- 6헤테로알킬아미노; 히드록시로 선택적으로 치환된 디(C1-6 알킬)아미노; 디(C1-6알킬아미노(여기서 C1- 6알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); 또는 디(C1-6헤테로알킬)아미노를 나타내고,
(ii) R3이 C6- 22알콕시(여기서 C6- 22알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 선택적으로 대체될 수 있음); C6-22 알킬아미노(이 기는 히드록시 또는 C1-22알킬로 선택적으로 치환됨); 히드록시 아미노; C6-22 알콕시 아미노; C6-22 알킬아미노(여기서 C1-22 알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); C6- 22헤테로알킬아미노; 히드록시로 선택적으로 치환된 디(C6-22 알킬)아미노; 디(C6-22알킬)아미노(여기서 C6- 22알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); 또는 디(C6-22헤테로알킬)아미노를 나타내면,
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 아미노 카르보닐, C2- 6아실, C1- 6알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 6알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C1-6 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C1-6알킬술포닐, 또는 C5- 10아릴 술포닐을 나타낸다.
일 실시 양태에서, 시스테인/시스틴 유사체는 화학식 2로 나타내는 화합물 및 이의 염을 포함하거나 이로 이루어지며, 식에서 L, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 상기 정의된 바와 같으며, 단
(i) R1 및 R2 기 중 하나가 C6- 22아실, C6- 22알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 22알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C6-22 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C6- 22알킬술포닐, 또는 C5- 22아릴 술포닐을 나타내고; R4 및 R5 기 중 하나가 C6- 22아실, C6- 22알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 22알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C6-22 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C6- 22알킬술포닐, 또는 C5-22아릴 술포닐을 나타내면,
나머지 R1, R2, R4, 또는 R5 기는 독립적으로 수소, 아미노 카르보닐, C2- 6아실, C1- 6알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 6알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C1-6 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C1- 6알킬술포닐, 또는 C5- 10아릴 술포닐을 나타내고,
R3 및 R6은 독립적으로 히드록시; NH2; C1- 6알콕시(여기서 C1- 22알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 선택적으로 대체될 수 있음); C1-6 알킬아미노(이 기는 히드록시 또는 C1- 6알킬로 선택적으로 치환됨); 히드록시 아미노; C1-6 알콕시 아미노; C1-6 알킬아미노(여기서 C1- 6알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); C1- 6헤테로알킬아미노; 히드록시로 선택적으로 치환된 디(C1-6 알킬)아미노; 디(C1-6알킬)아미노(여기서 C1- 6알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); 또는 디(C1-6헤테로알킬)아미노를 나타내고,
(ii) R1, R2, R4 및 R5 기 중 하나가 독립적으로 C6- 22아실, C6- 22알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 22알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C6-22 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C6- 22알킬술포닐, 또는 C5- 22아릴 술포닐을 나타내는 경우에만,
R3 및 R6 중 하나는 C6- 22알콕시(여기서 C1- 22알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 선택적으로 대체될 수 있음); C6-22 알킬아미노(이 기는 히드록시 또는 C1-22알킬로 선택적으로 치환됨); C6-22 알콕시 아미노; C6-22 알킬아미노(여기서 C1-22 알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); C6- 22헤테로알킬아미노; 히드록시로 선택적으로 치환된 디(C6-22 알킬)아미노; 디(C6-22알킬)아미노(여기서 C6- 22알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); 또는 디(C6-22헤테로알킬)아미노를 나타낼 수 있고,
(iii) R1, R2, R4 및 R5 기 중 어느 것도 C6- 22아실, C6- 22알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 22알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C6-22 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C6- 22알킬술포닐, 또는 C5- 22아릴 술포닐을 나타내지 않으면,
R3 및 R6은 둘 다 독립적으로 C6- 22알콕시(여기서 C1- 22알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 선택적으로 대체될 수 있음); C6-22 알킬아미노(이 기는 히드록시 또는 C1- 22알킬로 선택적으로 치환됨); C6-22 알콕시 아미노; C6-22 알킬아미노(여기서 C1-22 알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); C6- 22헤테로알킬아미노; 히드록시로 선택적으로 치환된 디(C6-22 알킬)아미노; 디(C6-22알킬)아미노(여기서 C6- 22알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); 또는 디(C6-22헤테로알킬)아미노를 나타낼 수 있다.
본 발명은 또한 그 범위 내에 화학식 1 및 2의 시스테인/시스틴 유사체의 염을 포함한다.
본 발명에 따른 염은 시스테인/시스틴 유사체 상에 존재하는 히드록시 기의 반응에 의해 형성될 수 있다. 이러한 염은 알칼리 금속염, 예를 들어 나트륨, 칼륨 또는 리튬 염; 알칼리 토금속 염, 예를 들어 마그네슘 또는 칼슘 염; 암모늄 염, 예를 들어 테트라 알킬 또는 아릴 암모늄 염; 술포늄 염, 예를 들어 트리알킬 또는 아릴 술포늄; 및 포스포늄 염, 예를 들어 테트라 알킬 또는 아릴 포스포늄 염을 포함한다.
대안적으로, 이러한 염은 시스테인/시스테인 유사체 상에 존재하는 아미노 기의 반응에 의해 형성될 수 있다. 이러한 염은 전형적으로 아미노 기와 무기산 또는 유기산의 반응으로부터 발생하며, 모노- 또는 디-HCl 염, H2SO4 염, H3PO4 염, 아세테이트 및 푸마레이트를 포함한다.
적합하게는, 상기 정의된 바와 같은 시스테인/시스틴 유사체는 L-시스테인과 동일한 키랄성을 갖는다.
본 발명의 특정 실시 양태에서 시스테인/시스테인 유사체는 N,N'-디아세틸-L-시스틴-디메틸에스테르, N-아세틸-L-시스테인 및 N,N'-디아세틸-L-시스틴으로부터 선택된다.
이 실시 양태의 특정 측면에서, 시스테인/시스틴 유사체는 화학식 2a((Ac-Cys-OMe)2)로 나타내는 N,N'-디아세틸-L-시스틴-디메틸에스테르로 이루어진다.
Figure pct00003
본 발명에 따른 시스테인/시스테인 유사체는 구입할 수 있거나 당업자에게 공지된 방법에 의해 L-시스테인 또는 L-시스틴으로부터 합성될 수 있다.
세포 배양
이하 본 발명의 설명으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 방법의 대부분의 실시 양태에서, 세포 배양 배지에는 시스테인 및/또는 시스틴이 보충되며, 다시 말해 이러한 보충은 다음으로 수행될 수 있다:
● 시스테인; 또는
● 시스틴; 또는
● 시스테인 및 시스틴
세포 배양 배지에서 시스테인 및 시스틴은 일정한 평형 상태에 있으며, 여기서 시스테인의 두 분자는 시스틴 분자로 산화되고 이는 시스테인의 두 분자로 환원된다.
용어 "세포 배양" 또는 이의 문법적 변형은 특정 기간, 예를 들어 생산 단계 동안 세포 배양 배지에서 유지되거나 배양된, 하나 이상의 재조합 폴리펩티드를 발현(즉, 생산)하도록 적합하게 조작되고/거나 처리된 복수의 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 숙주 세포를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 용어 "생산 단계"는 세포가 재조합 폴리펩티드(들)을 발현(즉, 생산)할 때 재조합 단백질을 제조하는 공정 동안 세포 배양 단계를 포함한다. 생산 단계는 원하는 생성물의 역가가 증가할 때 시작하고 세포 또는 세포 배양액 또는 상등액의 수거로 끝난다. 전형적으로, 생산 단계의 시작에서, 세포 배양물은 생물 반응기와 같은 생산 용기로 옮겨진다. 수거는 세포 배양액이 재조합 단백질, 예를 들어 재조합 항체가 후속 단계에서 회수 및 정제되기 위해서 예를 들어 생산 용기로부터 제거되는 단계이다.
바람직한 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포, 가장 바람직하게는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 포유동물 세포, 특히 CHO 세포는 그의 성방 및 재조합 폴리펩티드의 발현을 지지할 임의의 배지에서 배양될 수 있으며, 바람직하게는 배지는 동물 혈청 및 펩톤과 같은 동물 유래 생성물이 없는 배지이다. 당업자에게 이용 가능한 다양한 세포 배양 배지가 있으며, 각각의 배지는 세포 성장 및 단백질 생산을 가능하게 하는 적합한 농도로 존재하는 비타민, 아미노산, 호르몬, 성장 인자, 이온, 완충제, 뉴클레오시드, 글루코스 또는 동등한 에너지원의 상이한 조합을 포함한다. 적합한 배지는 예를 들어 WO98/08934호 및 US2006/0148074호(둘 다 그 전문이 본원에 포함됨)에 기재되어있다. 본 발명에 사용될 수 있거나 시스테인/시스테인 유사체 및/또는 시스테인 및/또는 시스틴 요건을 충족시키기 위해 변형될 수 있는 추가의 적합한 시판 배지는 AmpliCHO CD 배지, DynamisTM 배지, EX-CELL® AdvancedTM CHO 유가식 시스템, CD FortiCHOTM 배지, CP OptiCHOTM 배지, 최소 필수 배지(MEM), BalanCD® CHO 성장 A 배지, ActiProTM 배지, DMEM 둘베코 변형 이글(Dulbecco's Modified Eagle) 배지 및 RPMI-1640 배지를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시 양태에서, 상기 세포 배양 배지는
(a) 시스테인/시스틴 유사체; 및
(b) 시스테인 및/또는 시스틴
을 포함하며,
(a) 대 (b)의 몰비는 1:18 내지 18:1이다.
바람직하게는, 상기 (a) 대 (b)의 몰비는 1:15 내지 15:1, 예를 들어 1:12 내지 12:1, 예컨대 1:10 내지 10:1, 예를 들어 1:8 내지 8:1, 예컨대 1:6 내지 6:1, 예를 들어 1:4 내지 4:1, 예컨대 1:3 내지 3:1, 예를 들어 1:2 내지 2:1, 예컨대 1.5:1 내지 1:1.5, 예를 들어 1:1의 몰비이다.
상기 바람직한 실시 양태를 참조하여, 당업자는 (a) 및 (b)의 비가 이량체 형태 또는 단량체 형태를 기준점으로 취하는 지의 여부에 따라 결정된다는 것을 알고 있다. 세포 배양 배지에서 시스테인과 시스틴이 일정한 평형을 이루기 때문에, 비는 시스테인 당량에 대해 고려되며, 여기서 모든 시스틴은 환원된 형태인 것으로 가정된다. 다음 표는 시스테인 유사체 또는 시스틴 유사체를 고려하는 지의 여부에 따라 비가 어떻게 다른지 보여준다.
Figure pct00004
또 다른 바람직한 실시 양태에서, 상기 방법은
(i) 상기 숙주 세포를 초기량의
(a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
(b) 시스테인 및/또는 시스틴
을 선택적으로 포함하는 기본 배지에 접종하는 단계:
(ii) 재조합 단백질이 세포에 의해 생산되는 생산 단계를 통해 배양을 진행시키는 단계로서, 상기 생산 단계 동안 세포 배양 배지에는
(a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
(b) 시스테인 및/또는 시스틴
이 보충되는 것인 단계
를 포함하며,
(a) 및 (b)는 동시에 또는 순차적으로 첨가될 수 있으며,
기본 배지의 내용물 및 첨가된 총 보충물이 합산될 때, (a) 대 (b)의 몰비는 1:18 내지 18:1이다.
바람직하게는, 상기 언급된 실시 양태에서, 상기 (a) 대 (b)의 몰비는 1:15 내지 15:1. 예를 들어 1:12 내지 12:1, 예컨대 1:10 내지 10:1, 예를 들어 1:8 내지 8:1, 예컨대 1:6 내지 6:1, 예를 들어 1:4 내지 4:1, 예컨대 1:3 내지 3:1, 예를 들어 1:2 내지 2:1, 예컨대 1.5:1 내지 1:1.5, 예를 들어 1:1의 몰비이다.
상기 바람직한 실시 양태를 참조하여, 당업자는 (a) 및 (b)의 비가 이량체 형태 또는 단량체 형태를 기준점으로 취하는 지의 여부에 따라 결정된다는 것을 알고 있다. 세포 배양 배지에서 시스테인과 시스틴이 일정한 평형을 이루기 때문에, 비는 시스테인 당량에 대해 고려되며, 여기서 모든 시스틴은 환원된 형태인 것으로 가정된다.
본 발명의 방법에 따른 바람직한 실시 양태에서, 상기 세포 배양 배지는
(a) 시스테인/시스틴 유사체; 및
(b) 시스테인 및/또는 시스틴
을 포함하며,
(a)의 몰량은 (a)와 (b)의 총 몰량을 고려하여 10 내지 90%이고, 시스테인 유사체가 사용되는 경우, (b)의 몰량은 시스테인 당량을 고려하여 계산되고,
시스틴 유사체가 사용되는 경우, (b)의 몰량은 시스틴 당량을 고려하여 계산된다.
상기 실시 양태에서, (a)와 (b)의 총 몰량을 고려하여 (a)의 몰량은 바람직하게는 20 내지 90%; 예컨대 30 내지 90%, 예를 들어 40 내지 90% 또는 예를 들어 50 내지 90%, 예컨대 20 내지 80%; 예컨대 30 내지 80%, 예를 들어 40 내지 80% 또는 예를 들어 50 내지 80%, 예컨대 20 내지 70%, 30 내지 70%, 예를 들어 40 내지 70% 또는 예를 들어 50 내지 70%이다.
특히 바람직한 것은 시스틴 유사체가 N,N'-디아세틸-L-시스틴-디메틸에스테르 또는 N,N'-디아세틸-L-시스틴인 것(여기서 몰량 (a)는 (a)와 (b)의 총 몰량을 고려하여 20 내지 90%, 더 바람직하게는 30 내지 90%, 예컨대 20 내지 70%, 예를 들어 30 내지 70%임), 또는 시스테인 유사체가 N-아세틸-L-시스테인인 것(여기서 몰량 (a)는 (a)와 (b)의 총 몰량을 고려하여 50 내지 90%, 바람직하게는 50 내지 90%, 50 내지 80%, 더 바람직하게는 50 내지 70%임)이다.
또 다른 바람직한 실시 양태에서, 상기 방법은
(i) 상기 숙주 세포를 초기량의
(a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
(b) 시스테인 및/또는 시스틴
을 선택적으로 포함하는 기본 배지에 접종하는 단계:
(ii) 재조합 단백질이 세포에 의해 생산되는 생산 단계를 통해 배양을 진행시키는 단계로서, 상기 생산 단계 동안 세포 배양 배지에는
(a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
(b) 시스테인 및/또는 시스틴
이 보충되는 것인 단계
를 포함하며,
(a) 및 (b)는 동시에 또는 순차적으로 첨가될 수 있으며,
기본 배지의 내용물 및 첨가된 총 보충물이 합산될 때, (a)의 몰량은 (a)와 (b)의 총 몰량을 고려하여 10 내지 90%이고, 시스테인 유사체가 사용되는 경우, (b)의 몰량은 시스테인 당량을 고려하여 계산되고,
시스틴 유사체가 사용되는 경우, (b)의 몰량은 시스틴 당량을 고려하여 계산된다.
상기 실시 양태에서, (a)의 몰량은 (a)와 (b)의 총 몰량을 고려하여 바람직하게는 20 내지 90%; 예컨대 30 내지 90%, 예를 들어 40 내지 90% 또는 예를 들어 50 내지 90%, 예컨대 20 내지 80%; 30 내지 80%, 예를 들어 40 내지 80% 또는 예를 들어 50 내지 80%, 예컨대 20 내지 70%, 30 내지 70%, 예를 들어 40 내지 70% 또는 예를 들어 50 내지 70%이다.
특히 바람직한 것은 시스틴 유사체가 N,N'-디아세틸-L-시스틴-디메틸에스테르 또는 N,N'-디아세틸-L-시스틴인 것(여기서 몰량 (a)는 (a)와 (b)의 총 몰량을 고려하여 20 내지 90%, 더 바람직하게는 30 내지 90%, 예컨대 20 내지 70%, 예를 들어 30 내지 70%임), 또는 시스테인 유사체가 N-아세틸-L-시스테인인 것(여기서 몰량 (a)는 (a)와 (b)의 총 몰량을 고려하여 50 내지 90%, 바람직하게는 50 내지 90%, 50 내지 80%, 더 바람직하게는 50 내지 70%임)이다.
일 실시 양태에서, 상기 기본 배지에서 (b)의 농도는 0.05 내지 5 mmol/L, 예컨대 0.1 내지 1 mmol/L, 예를 들어 0.2 내지 0.6 mmol/L의 시스테인에 해당한다.
본 명세서의 "X mol의 시스테인에 해당"은 시스틴 또는 시스틴 유사체와 같은 이량체 형태가 사용되는 경우, 사용되거나 첨가되는 양을 계산하기 위해 2배로 계수되어야 함을 나타낸다. 예를 들어, 1 mmol/L의 시스틴은 2 mmol/L의 시스테인에 해당한다.
또 다른 실시 양태에서, 생산 단계 동안, 배지에는 (a) 시스테인/시스틴 유사체 및 (b) 시스테인 및/또는 시스틴이 보충되며, 여기서 전체 생산 단계에 걸쳐 배양물에 첨가되는 (a)와 (b)의 합은 1 내지 75 mmol/L, 예컨대 1 내지 50 mmol/L, 예를 들어 1 내지 20 mmol/L, 예컨대 2 내지 20 mmol/L, 예를 들어 4 내지 10 mmol/L의 시스테인에 해당한다.
또 다른 실시 양태에서, 생산 단계 동안, 배지에는 (a) 시스테인/시스틴 유사체 및 (b) 시스테인 및/또는 시스틴이 매일 보충되며, 여기서 매일 첨가에 의해 (a) + (b)의 농도는 0.05 내지 5 mmol/L, 예컨대 0.1 내지 1 mmol/L의 시스테인에 해당하는 농도가 된다.
생산 단계는 바람직하게는 유가식 모드로 작동되지만, 뱃치, 관류 또는 케모스타트(chemostat) 모드와 같은 임의의 다른 모드가 대안으로서 사용될 수 있다.
세포 배양은 진탕 플라스크 또는 생물 반응기와 같은 임의의 적합한 용기에서 일어날 수 있으며, 이는 요구되는 생산 규모에 따라 유가식 모드로 작동될 수 있거나 작동되지 않을 수 있다. 이들 생물 반응기는 교반 탱크 또는 에어 리프트 반응기일 수 있다. 바람직하게는, 생산 단계는 생물 반응기에서, 바람직하게는 50 L 이상, 100 L 이상, 500 L 이상, 1000 L 이상, 2,000 L 이상, 5,000 L 이상, 10,000 L 이상, 또는 20,000L 이상의 용량으로 수행된다.
바람직하게는, 재조합 단백질은 생산 단계 동안 생산되며, 여기서 생산 단계는 바람직하게는 적어도 7일, 더 바람직하게는 적어도 14일의 기간을 갖는다.
바람직한 실시 양태에서, 배양물은 생산 단계에서 매일 보충된다.
본 발명의 방법의 일 실시 양태에서, 세포 배양 배지에는 다음이 보충된다:
● 생산되는 재조합 단백질의 예상되는 총량의 10 중량% 내지 30 중량의 총량까지의 시스테인 또는 시스틴; 및/또는
● 생산되는 재조합 단백질의 예상되는 총량의 8 중량% 내지 35 중량%의 총량까지의 트립토판.
첨가되는 시스테인 또는 시스틴 및/또는 트립토판의 총량은 본원에서 생산된 재조합 폴리펩티드의 총량의 백분율로 표현될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이 용어 "중량%"는 중량 백분율을 지칭한다. "총"은 생산 단계의 종료 시에 측정되는 총량, 즉 생산 단계의 과정에 걸쳐 첨가된 시스테인 또는 시스틴 및/또는 트립토판의 총량 및 생산 단계의 과정에 걸쳐 생산된 재조합 단백질의 총량을 의미하며, 여기서 생산된 재조합 단백질의 총량은 생산 단계의 종료 시에 측정된다.
첨가된 시스테인 또는 시스틴 또는 트립토판의 총량은 첨가되는 공급물의 용량당 공급물이 첨가되는 배지 내 시스테인 또는 시스틴 또는 트립토판의 농도 및 공급물 중의 시스테인 또는 시스틴 또는 트립토판의 공급 속도(또는 공급 용량) 및 농도의 함수로서 계산된다. 생성된 재조합 폴리펩티드의 양은 세포 배양 배지의 최종 용량 및 최종 재조합 폴리펩티드 역가의 함수로서 계산된다. 이들 2개의 계산된 파라미터의 비는 생성된 재조합 폴리펩티드의 양당 첨가된 시스테인 또는 시스틴 및/또는 트립토판의 총량이다.
숙주 세포는 초기에(단계 a.에서) 시스테인/시스틴 유사체, 시스테인, 시스틴 및/또는 트립토판을 이미 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있는 세포 배양 배지에서 배양될 수 있다. 세포 배양 배지가 이미 초기량의 시스테인/시스틴 유사체, 시스테인, 시스틴 및/또는 트립토판을 포함한다면, 총량은 이 초기량을 포함할 것이다.
본 발명의 공정의 일 실시 양태에서, 세포 배양 배지에는 생산되는 재조합 폴리펩티드의 예상되는 총량의 12.06 중량% 내지 28.03 중량%의 총량, 예컨대 생성되는 재조합 폴리펩티드의 예상되는 총량의 12 중량% 내지 28 중량%, 예를 들어 12 중량% 내지 25 중량%, 예컨대 12 중량% 내지 20 중량의 총량까지의 시스테인 또는 시스틴이 보충된다.
본 발명의 공정의 또 다른 실시 양태에서, 세포 배양 배지에는 생성되는 재조합 폴리펩티드의 예상되는 총량의 8.84 중량% 내지 32.06 중량%의 총량, 예컨대 생성되는 재조합 폴리펩티드의 예상되는 총량의 8 중량% 내지 30 중량%, 예를 들어 8 중량% 내지 25 중량%, 예컨대, 8 중량% 내지 20 중량%의 총량까지의 트립토판이 보충된다.
본 발명의 방법의 다른 실시 양태에서,
● 세포 배양물에서 시스테인 또는 시스틴 농도는 생산 단계 동안 어느 시점에서든 0.9 g/L를 초과하지 않고/거나, 바람직하게는 세포 배양물에서 시스테인 또는 시스틴 농도는 생산 단계 동안 어느 시점에서든 0.3 g/L를 초과하지 않고/거나,
● 세포 배양물에서 트립토판 농도는 생산 단계 동안 어느 시점에서든 0.6 g/L를 초과하지 않으며, 바람직하게는 세포 배양물에서 트립토판 농도는 생산 단계 동안 어느 시점에서든 0.3 g/L를 초과하지 않는다.
본 발명의 방법의 추가 실시 양태에서,
● 공정 동안 제공되는 시스테인 또는 시스틴의 총량은 2.9 내지 12 g/(1012 세포), 예컨대 2.9 내지 7 g/(1012 세포), 예를 들어 5.6 내지 7 g/(1012 세포)(여기서 세포는 생산 단계의 종료 시에 예상되는 전체 생존 세포 수를 지칭함)이고/거나,
● 공정 동안 제공되는 트립토판의 총량은 2.5 내지 7 g/(1012 세포), 예컨대 2.5 내지 3.5 g/(1012 세포/L)(여기서 세포는 생산 단계의 종료 시에 예상되는 전체 생존 세포 수를 지칭함)이다.
통상의 기술자는 생산 단계와 같은 특정 단계에서 세포 배양물에 첨가되고/거나 존재하는 시스테인 또는 시스틴 및/또는 트립토판의 양을 측정하는 방법을 알고 있을 것으로 이해된다. 유사하게, 당업자는 세포 배양물에 의해 생성되는 재조합 폴리펩티드의 총량을 측정하고 결과적으로 원하는 기술적 효과를 달성하기 위해 본 발명의 교시를 적용하는 방법을 알고 있을 것이다.
생산되는 재조합 폴리펩티드의 총량당 시스테인 또는 시스틴 및/또는 트립토판의 양이 특정 범위 내로 유지되는 공정을 설계하기 위해, 특정 배양 조건하에서 특정 숙주 세포에 의해 생산되는 재조합 폴리펩티드의 대략적인 수준을 결정하는 하나 이상의 초기 실험을 수행해야 할 수도 있다. 일단 생산되는 재조합 폴리펩티드의 대략적인 총 수준이 알려지면, 생산되는 재조합 폴리펩티드의 총량당 시스테인 또는 시스틴 및/또는 트립토판의 양이 명시된 범위 내로 유지되는 본 발명에 따른 공정을 설계할 수 있다.
생산 단계 동안 세포 배양 배지에서 시스테인/시스틴 유사체, 시스테인, 시스틴 및/또는 트립토판의 총량에 도달하기 위해 다양한 전략이 사용될 수 있다. 일 실시 양태에서, 총량은 생산 단계의 시작 시 바로, 예를 들어 단 한 번, 시스테인/시스틴 유사체, 시스테인, 시스틴 및/또는 트립토판을 첨가함으로써 또는 생산 세포 배양 배지에 이미 포함된 것으로 도달될 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 총량은 생산 단계 동안 첨가, 예를 들어 매일 첨가 또는 연속 첨가의 합산에 의해 도달될 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 총량은 생산 단계의 시작 시 세포 배양액에서 초기 시스테인/시스틴 유사체, 시스테인, 시스틴 및/또는 트립토판 농도의 조합에 의해, 그리고 첨가에 의해 도달될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법의 일 실시 양태에서, 세포 배양 배지 중 시스테인/시스틴 유사체, 시스테인, 시스틴 및/또는 트립토판의 총량은
a. 생산 단계 초기에
b. 생산 단계 동안 언제라도 한 번 또는 여러 번
c. 생산 단계 동안 연속 첨가를 통해, 또는
d. a., b. 및 c.의 임의의 조합으로
시스테인/시스틴 유사체, 시스테인, 시스틴 및/또는 트립토판을 세포 배양 배지에 첨가함으로써 도달된다.
추가의 독립적 측면에서, 본 발명은 N,N'-디아세틸-L-시스틴-디메틸에스테르를 포함하는, 포유동물 세포를 배양하기에 적합한 세포 배양 배지에 관한 것이다.
재조합 폴리펩티드
본 발명의 공정을 사용하여 예를 들어 유의한 3차 구조를 갖는 펩티드 또는 더 큰 폴리펩티드뿐만 아니라 예를 들어 당 단백질 및 다량체 단백질을 포함하는 임의의 유형의 재조합 단백질 또는 폴리펩티드를 생산할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 생산되는 재조합 단백질은 표준 조건하에서 생산될 때 고농도로 착색된 제제를 생성하는 단백질이다. 이러한 착색은 본 발명의 방법을 사용하여 감소되거나 방지될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법의 바람직한 실시 양태에서, 재조합 단백질은 시스테인/시스틴 유사체를 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 배양된 숙주 세포에 의해 생산될 때 10 mg/ml 이상, 예컨대 50 mg/ml 이상의 농도에서 무색이 아닌 단백질이며, 여기서 색상은 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 결정된다. 환자에게 피하 투여되어야 하는 항체와 같은 단백질 제제는 종종 예를 들어 100 mg/ml 이상, 또는 심지어 150 mg/ml 초과의 훨씬 더 높은 단백질 농도를 갖는다. 이러한 농도에서, 바람직하지 않은 착색이 종종 문제가 된다. 따라서, 또 다른 바람직한 실시 양태에서, 재조합 단백질은 시스테인/시스틴 유사체를 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 배양된 숙주 세포에 의해 생산될 때 100 mg/ml 이상, 예컨대 150 mg/ml 이상의 농도에서 무색이 아닌 단백질이다.
바람직한 실시 양태에서, 본 발명에 따른 공정에서 생산된 재조합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "항체" 또는 "항체들"은 예를 들어 단일 특이적 및 다중 특이적 항체 둘 다, 예컨대 이중 특이적 항체뿐만 아니라 단클론 및 다클론 항체 둘 다를 포함한다. "항체" 또는 "항체들"에는 전형적으로 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 임의의 종의 항체, 특히 포유동물 종의 항체, IgA1, IgA2, IgD, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE, 및 IgM을 포함하는 임의의 아이소형의 인간 항체 및 이의 변형된 변이체, 비인간 영장류 항체, 예를 들어 침팬지, 개코 원숭이, 붉은 털 또는 시노몰구스 원숭이의 항체, 설치류 항체, 예를 들어 마우스, 랫트 또는 토끼의 항체; 염소 또는 말 항체, 및 이의 유도체, 또는 조류 종 예컨대 닭 항체 또는 어류 종의 항체, 예컨대 상어 항체가 포함된다. 용어 "항체" 또는 "항체들"은 또한 적어도 하나의 중쇄 및/또는 경쇄 항체 서열의 제1 부분이 제1 종으로부터 유래하고 중쇄 및/또는 경쇄 항체 서열의 제2 부분이 제2 종으로부터 유래하는 "키메라" 항체를 지칭한다. 본원에서 관심의 키메라 항체는 비-인간 영장류(예를 들어, 구대륙 원숭이, 예컨대 개코 원숭이, 붉은 털 또는 시노몰구스 원숭이)로부터 유래한 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다. "인간화" 항체는 비인간 항체로부터 유래한 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수여 항체의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 활성을 갖는 비인간 종(공여 항체), 예컨대 마우스, 랫트, 토끼, 닭 또는 비인간 영장류의 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기로 대체되는 인간 항체(수여 항체)이다. 대부분의 경우, CDR 외부, 즉, 골격 영역(FR)에서의 인간(수여) 항체의 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 추가로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 수행된다. 인간화는 인간에서 비인간 항체의 면역원성을 감소시켜, 인간 질병의 치료에 항체의 적용을 용이하게 한다. 인간화 항체 및 이들을 생성하기 위한 몇 가지 상이한 기술이 당 업계에 공지되어 있다. 용어 "항체" 또는 "항체들"은 또한 인간화에 대한 대안으로서 생성될 수 있는 인간 항체를 지칭한다. 예를 들어, 면역화 시에 내인성 설치류 항체의 생성 없이 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스)을 생성하는 것이 가능하다. 예를 들어, 키메라의 생식 계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동형 접합 결실은 내인성 항체 생산을 완전히 억제하는 것으로 설명되었다. 이러한 생식 계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자 배열의 전달은 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 동물을 특정 항원으로 면역화할 때 상기 항원에 대해 특이성을 갖는 인간 항체의 생산을 초래할 것이다. 이러한 트랜스제닉 동물을 생산하기 위한 기술 및 이러한 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 단리 및 생성하기 위한 기술은 당 업계에 공지되어있다. 대안적으로, 트랜스제닉 동물, 예를 들어 마우스에서, 마우스 항체의 가변 영역을 코딩하는 면역글로불린 유전자만이 상응하는 인간 가변 면역글로불린 유전자 서열로 대체된다. 항체 불변 영역을 코딩하는 마우스 생식 계열 면역글로불린 유전자는 변하지 않고 유지된다. 이러한 방식으로, 항체 이펙터는 트랜스제닉 마우스의 면역계에서 기능을 하고, 결과적으로 B 세포 발생은 본질적으로 변하지 않으며, 이는 생체 내에서 항원 공격 시 항체 반응을 개선시킬 수 있다. 일단 특정의 관심 항체를 코딩하는 유전자가 이러한 트랜스제닉 동물로부터 단리되면, 불변 영역을 코딩하는 유전자는 완전한 인간 항체를 수득하기 위해 인간 불변 영역 유전자로 대체될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "항체" 는 "항체들"은 또한 글리코실화되지 않은 항체를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "이의 항원 결합 단편" 또는 이의 문법적 변형은 항체 단편을 지칭한다. 항체의 단편은 당 업계에 공지된 바와 같이 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 도메인을 포함하고 하나 이상의 항원(들)에 결합한다. 본 발명에 따른 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 및 scFv 단편; 뿐만 아니라 디아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 미니바디, 도메인 항체(dAb), 예컨대 sdAb, VHH 또는 낙타류 항체(예를 들어 낙타 또는 라마 유래, 예컨대 Nanobodies™) 및 VNAR 단편, 단쇄 항체, 항체 단편 또는 항체로부터 형성된 이중 특이적, 삼중 특이적, 사중 특이적 또는 다중 특이적 항체(Fab-Fv 또는 Fab-Fv-Fv 구축물을 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 포함한다. 본원에서 사용될 때, 항체 단편은 또한 예를 들어 융합 단백질 형태로 면역글로불린 도메인 이외에 비-면역글로불린 유래 서열을 포함하는 분자를 포함한다. 상기 정의된 바와 같은 항체 단편은 당 업계에 공지되어있다.
특히 바람직한 실시 양태에서, 본 발명에 따른 방법을 통해 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기이다(표 1);
1) a 내지 d를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
a. 서열 번호 1에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-H1; 서열 번호 2에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-H2; 서열 번호 3에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-H3; 서열 번호 4에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-L1; 서열 번호 5에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-L2 및 서열 번호 6에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-L3; 또는
b. 서열 번호 7에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 8에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 또는
c. 서열 번호 7에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 8에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 중쇄 가변 영역;
d. 서열 번호 7에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 11에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄; 또는
e. 서열 번호 7에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 11에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 중쇄; 또는
2) 서열 번호 9에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 경쇄 및 서열 번호 10에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 또는
3) 서열 번호 9에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 경쇄 및 서열 번호 10에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체.
상보성 결정 영역("CDR")은 본원에서 카바트(Kabat) 정의에 따라 정의된다. 카바트 정의는 항체의 잔기를 넘버링하기 위한 표준이며, 전형적으로 CDR 영역을 식별하는데 사용된다(Kabat et al., (1991), 5th edition, NIH publication No. 91-3242).
Figure pct00005
Figure pct00006
재조합 단백질 또는 바람직한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전형적으로 폴리펩티드 또는 항체 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 벡터를 함유하는 숙주 세포에 의해 생산될 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드만을 포함할 수 있으며, 이 경우 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드 코딩 서열만이 세포를 형질 감염시키기 위해 사용될 필요가 있다. 중쇄 및 경쇄 둘 다를 포함하는 생성물의 생산하기 위해, 세포는 2개의 벡터, 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 제1 벡터 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터로 형질 감염될 수 있다. 대안적으로, 단일 벡터가 사용될 수 있으며, 이 벡터는 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다.
선택적인 추가 단계
본 발명의 방법은 선택적으로 세포 배양 배지로부터 재조합 단백질을 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 이어서, 재조합 단백질은, 예를 들어 단백질이 항체인 경우, 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여, 정제될 수 있다. 상기 방법은 선택적으로 정제된 재조합 단백질을, 예를 들어 높은 단백질 농도, 예컨대 10 mg/ml 이상, 예를 들어 50 mg/ml 이상, 예컨대 100 mg/ml 이상, 예를 들어 150 mg/ml 이상의 농도의 제제로, 제제화하는 단계룰 추가로 포함한다. 추가의 실시 양태에서, 단백질은 동결 건조되거나 분무 건조된다. 단백질은 건조 형태로 환자에게 투여되거나 투여 전에 액체 형태로 재구성될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 생성물
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된 벌크 재조합 단백질 제제와 같은 재조합 단백질 제제에 관한 것이다. 이렇게 수득된 상기 제제에서 재조합 단백질, 바람직하게는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 동일한 공정으로 수득된 동일한 재조합 단백질과 비교하여 감소한 이질성을 나타내지만, 여기서 배지는 시스테인/시스틴 유사체를 포함하지 않는다. 바람직한 실시 양태에서, 제제는 무색이다.
본 발명의 추가의 측면 및 실시 양태:
1. 세포 배양에서 생산되는 재조합 단백질 집단의 이질성을 감소시키는 방법으로서, 하나 이상의 시스테인/시스틴 유사체를 포함하는 세포 배양 배지에서 재조합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 생산 종료시에 재조합 단백질의 역가를 실질적으로 감소시키지 않으면서, 이질성의 감소를 얻는 것인 방법.
2. 실시 양태 1에 있어서, 상기 이질성의 감소는 하기를 감소시키는 단계를 포함하는 것인 방법:
a. 색상 또는 색상 강도;
b. 전하 이질성(바람직하게는 산성 피크 그룹 종(APG) 및/또는 염기성 피크 그룹 종(BPG)을 감소시키는 단계에 의하며, 이로써 주 전하 종은 감소하지 않음); 및/또는
c. 아미노산 산화, 바람직하게는 메티오닌 산화.
3. 본 발명에 따른 일 실시 양태에서, 시스테인/시스틴 유사체는 화학식 1 및 2로 나타내는 화합물로부터 선택된 하나 이상의 화합물 및 이의 염을 포함하거나 이로 이루어진다:
Figure pct00007
식에서,
R1, R2, R4 및 R5는 독립적으로 수소, 아미노 카르보닐, C2- 22아실, C1- 22알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 22알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C1-22 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C1- 22알킬술포닐, 또는 C5- 22아릴 술포닐을 나타내고;
R3 및 R6은 독립적으로 히드록시; NH2; C1- 22알콕시(여기서 C1-22 알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 선택적으로 대체될 수 있음); C1-22 알킬아미노(이 기는 히드록시 또는 C1-22 알킬로 선택적으로 치환됨); 히드록시 아미노; C1-22 알콕시 아미노; C1-22 알킬아미노(여기서 C1-22 알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); C1- 22헤테로알킬아미노; 히드록시로 선택적으로 치환된 디(C1-22 알킬)아미노; 디(C1-22알킬)아미노(여기서 C1-22 알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); 또는 디(C1-22헤테로알킬)아미노를 나타내고;
R7은 수소, 포스페이트 또는 술페이트를 나타내고;
L은 선택적으로 치환된 C1-10알킬렌 쇄를 나타내고;
단, 상기 화합물은 시스테인 또는 시스틴이 아니다.
4. 실시 양태 3에 있어서, C1-22 알킬은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고 쇄에 1 내지 22개의 탄소 원자를 포함할 수 있는 지방족 탄화수소기, 예컨대 C6-22 알킬기, C12-22 알킬기, C1-16 알킬기, C1-10 알킬기 및 C1-6 알킬기를 지칭하는 것인 방법.
5. 실시 양태 3 또는 4에 있어서, C5-22 아릴은 단일 고리 또는 다중 축합 고리를 갖는 5 내지 22개의 탄소 원자의 불포화 방향족 카르보시클릭 기, 예컨대 C5-14 아릴 기, C5-10 아릴 기를 지칭하는 것인 방법.
6. 실시 양태 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, "C5-22 헤테로아릴"은 단일 고리 또는 다중 축합 고리를 갖는 5 내지 22개의 탄소 원자의 방향족 카르보시클릭 기로서, 상기 탄소 원자 중 하나 이상은 산소, 황 및 질소로부터 선택된 하나 이상의 헤테로 원자로 대체된 기를 나타내고, C5-22 헤테로아릴 기는 C5-14 헤테로아릴 아릴 기를 포함하고, 적합하게는 C5-10 헤테로아릴 기를 포함하는 것인 방법.
7. 실시 양태 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, C2- 22아실은 화학식 -(C=O)R(여기서 R은 상기 정의된 바와 같은 C1-22 알킬기를 나타냄)로 나타내는 기를 지칭하고, C2-6아실 기, C6-22아실 기, 및 C12-22아실 기를 포함하는 것인 방법.
8. 실시 양태 3 내지 7 중 어느 하나에 있어서, "C1-22 알콕시"는 화학식 -O-R(여기서 R은 상기 정의된 바와 같은 C1-22 알킬기를 나타냄)로 나타내는 기를 지칭하고, C1- 6알콕시 기 C6- 22알콕시 기 및 C12- 22알콕시 기를 포함하는 것인 방법.
9. 실시 양태 3 내지 8 중 어느 하나에 있어서, C1-22 헤테로알킬은 하나 이상의 탄소 원자가 하나 이상의 산소 또는 질소 원자로 대체된 상기 정의된 바와 같은 C1-22 알킬을 지칭하고, C1- 6헤테로알킬 기, C6- 22헤테로알킬 기 및 C12-22헤테로알킬 기를 포함하는 것인 방법.
10. 실시 양태 3 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 히드록시술포닐은 화학식 -S(=O)2-OH로 나타내는 기를 지칭하는 것인 방법.
11. 실시 양태 3 내지 10 중 어느 하나에 있어서, C1- 22알킬 술포닐은 화학식 -S(=O)2-R(여기서 R은 상기 정의된 바와 같은 C1-22 알킬기를 나타냄)로 나타내는 기를 지칭하고, C1-6 알킬 술포닐 기 및 C6-22 알킬 술포닐 기, C12-22 알킬 술포닐 기를 포함하는 것인 방법.
12. 실시 양태 3 내지 11 중 어느 하나에 있어서, C5- 22아릴 술포닐은 화학식 -S(=O)2-R'(여기서 R'는 상기 정의된 바와 같은 C5-22 아릴기를 나타냄)로 나타내는 기를 지칭하는 것인 방법.
13. 실시 양태 3 내지 12 중 어느 하나에 있어서, C1-22 알킬아미노는 화학식 -NH-R(여기서 R은 상기 정의된 바와 같은 C1-22 알킬기를 나타냄)로 나타내는 기를 지칭하고, C1- 6알킬아미노 기, C6- 22알킬아미노 기 및 C12- 22알킬아미노 기를 포함하는 것인 방법.
14. 실시 양태 3 내지 13 중 어느 하나에 있어서, C1-22 알콕시 아미노는 화학식 -NH-OR(여기서 R은 상기 정의된 바와 같은 C1-22 알킬기를 나타냄)로 나타내는 기를 지칭하고, C1- 6알콕시아미노 기, C6- 22알콕시아미노 기 및 C12- 22알콕시아미노 기를 포함하는 것인 방법.
15. 실시 양태 3 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 디(C1-22 알킬)아미노는 화학식 -NRR'(여기서 R 및 R'는 독립적으로 상기 정의된 바와 같은 C1-22 알킬기를 나타냄)로 나타내는 기를 지칭하고, 디(C1-6 알킬)아미노, 디(C6-22 알킬)아미노 및 디(C12-22 알킬)아미노를 포함하는 것인 방법.
16. 실시 양태 3 내지 15 중 어느 하나에 있어서, C1-22 헤테로알킬아미노는 화학식 -NH-R(여기서 R은 상기 정의된 바와 같은 C1-22 헤테로알킬 기를 나타냄)로 나타내는 기를 지칭하고, C1- 6헤테로알킬아미노, C6- 22헤테로알킬아미노 및 C12- 22헤테로알킬아미노를 포함하는 것인 방법.
17. 실시 양태 3 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 디(C1-22헤테로알킬)아미노는 화학식 -NRR'(여기서 R 및 R'는 독립적으로 상기 정의된 바와 같은 C1- 22헤테로알킬 기를 나타냄)을 나타내는 기를 지칭하고, 디(C1-6 헤테로알킬)아미노, 디(C6-22 헤테로알킬)아미노 및 디(C12-22 헤테로알킬)아미노를 포함하는 것인 방법.
18. 실시 양태 3 내지 17 중 어느 하나에 있어서, C1-10 알킬렌 쇄는 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 2가 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌 쇄를 지칭하고, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 및 부틸렌을 포함하는 것인 방법.
19. 실시 양태 3 내지 18 중 어느 하나에 있어서, "아미노 카르보닐"은 화학식 -CO-N(RaRb)로 나타내는 기를 지칭하며, 식에서 -CO의 탄소는 시스테인/시스틴 유사체의 질소에 결합하고 Ra 및 Rb는 서로 독립적으로 상기 정의된 바와 같은 C1- 22알킬을 나타내는 것인 방법.
20. 실시 양태 3 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 시스테인/시스틴 유사체는 화학식 1로 나타내는 시스테인 유사체로부터 선택되며, 식에서 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 L은 상기 정의된 바와 같은 것인 방법.
21. 실시 양태 3 내지 20 중 어느 하나에 있어서, R7은 수소를 나타내는 것인 방법.
22. 실시 양태 3 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 시스테인/시스테인 유사체는 화학식 2로 나타내는 시스틴 유사체로부터 선택되며, 식에서 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 L은 상기 정의된 바와 같은 것인 방법.
23. 실시 양태 3 내지 22 중 어느 하나에 있어서, R1, R2, R4 및 R5는 독립적으로 수소, C2- 22아실, C1- 22알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 22알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); 또는 C1-22 헤테로알킬을 나타내는 것인 방법.
24. 실시 양태 3 내지 23 중 어느 하나에 있어서, R3 및 R6은 독립적으로 히드록시; NH2; C1- 22알콕시(여기서 C1-22 알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 선택적으로 대체될 수 있음); C1-22 알킬아미노(이 기는 히드록시로 선택적으로 치환됨); 또는 히드록시로 선택적으로 치환된 디(C1-22 알킬)아미노를 나타내는 것인 방법.
25. 실시 양태 3 내지 24 중 어느 하나에 있어서, L은 하나 이상의 C1-6 알킬, 바람직하게는 2개의 메틸기로 선택적으로 치환된 C1-4 알킬렌 쇄를 나타내는 것인 방법.
26, 실시 양태 3 내지 25 중 어느 하나에 있어서, R1은 수소 또는 C2- 22아실, 예컨대 수소 또는 C2- 6아실을 나타내는 것인 방법.
27. 실시 양태 3 내지 26 중 어느 하나에 있어서, R2는 수소 또는 C2- 22아실, 예컨대 C2- 6아실을 나타내는 것인 방법.
28. 실시 양태 3 내지 27 중 어느 하나에 있어서, R3은 히드록시 또는 C1- 22알콕시, 예컨대 C1- 6알콕시를 나타내는 것인 방법.
29. 실시 양태 3 내지 28 중 어느 하나에 있어서, R4는 수소 또는 C2- 22아실, 예컨대 C2- 6아실을 나타내는 것인 방법.
30. 실시 양태 3 내지 29 중 어느 하나에 있어서, R5는 수소 또는 C2- 22아실, 예컨대 수소 또는 C2- 6아실을 나타내는 것인 방법.
31. 실시 양태 3 내지 30 중 어느 하나에 있어서, R6은 히드록시 또는 C1- 22알콕시, 예컨대 C1- 6알콕시를 나타내는 것인 방법.
32. 실시 양태 3 내지 31 중 어느 하나에 있어서, L은 메틸렌 또는 에틸렌을 나타내는 것인 방법.
33. 실시 양태 3 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 시스테인/시스틴 유사체는 화학식 1로 나타내는 화합물로부터 선택된 하나 이상의 화합물 및 이의 염을 포함하며, 식에서 L, R1, R2, R3 및 R7은 상기 정의된 바와 같으며,
단,
(i) R1 또는 R2 기 중 하나가 C6- 22아실, C6- 22알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 22알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C6-22 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C6- 22알킬술포닐, 또는 C5- 22아릴 술포닐을 나타내면,
나머지 R1 또는 R2 기는 독립적으로 수소, 아미노 카르보닐, C2- 6아실, C1- 6알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 6알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C1-6 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C1- 6알킬술포닐, 또는 C5- 10아릴 술포닐을 나타내고,
R3은 히드록시; NH2; C1- 6알콕시(여기서 C1- 22알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 선택적으로 대체될 수 있음); C1-6 알킬아미노(이 기는 히드록시 또는 C1- 6알킬로 선택적으로 치환됨); 히드록시 아미노; C1-6 알콕시 아미노; C1-6 알킬아미노(여기서 C1- 6알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); C1- 6헤테로알킬아미노; 히드록시로 선택적으로 치환된 디(C1-6 알킬)아미노; 디(C1-6알킬)아미노(여기서 C1- 6알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); 또는 디(C1-6헤테로알킬)아미노를 나타내고,
(ii) R3이 C6- 22알콕시(여기서 C6- 22알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 선택적으로 대체될 수 있음); C6-22 알킬아미노(이 기는 히드록시 또는 C1- 22알킬로 선택적으로 치환됨); 히드록시 아미노; C6-22 알콕시 아미노; C6-22 알킬아미노(여기서 C1-22 알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); C6- 22헤테로알킬아미노; 히드록시로 선택적으로 치환된 디(C6-22 알킬)아미노; 디(C6-22알킬)아미노(여기서 C6- 22알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); 또는 디(C6-22헤테로알킬)아미노를 나타내면,
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 아미노 카르보닐, C2- 6아실, C1- 6알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 6알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C1-6 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C1- 6알킬술포닐, 또는 C5- 10아릴 술포닐을 나타내는 것인 방법.
34. 실시 양태 3 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 시스테인/시스틴 유사체는 화학식 2로 나타내는 화합물 및 이의 염을 포함하거나 이로 이루어지며, 식에서 L, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 상기 정의된 바와 같으며, 단
(i) R1 및 R2 기 중 하나가 C6- 22아실, C6- 22알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 22알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C6-22 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C6- 22알킬술포닐, 또는 C5- 22아릴 술포닐을 나타내고; R4 및 R5 기 중 하나가 C6- 22아실, C6- 22알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 22알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C6-22 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C6- 22알킬술포닐, 또는 C5-22아릴 술포닐을 나타내면,
나머지 R1, R2, R4, 또는 R5 기는 독립적으로 수소, 아미노 카르보닐, C2- 6아실, C1- 6알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 6알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C1-6 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C1- 6알킬술포닐, 또는 C5- 10아릴 술포닐을 나타내고,
R3 및 R6은 독립적으로 히드록시; NH2; C1- 6알콕시(여기서 C1- 22알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 선택적으로 대체될 수 있음); C1-6 알킬아미노(이 기는 히드록시 또는 C1- 6알킬로 선택적으로 치환됨); 히드록시 아미노; C1-6 알콕시 아미노; C1-6 알킬아미노(여기서 C1- 6알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); C1- 6헤테로알킬아미노; 히드록시로 선택적으로 치환된 디(C1-6 알킬)아미노; 디(C1-6알킬)아미노(여기서 C1- 6알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); 또는 디(C1-6헤테로알킬)아미노를 나타내고,
(ii) R1, R2, R4 및 R5 기 중 하나가 독립적으로 C6- 22아실, C6- 22알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 22알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C6-22 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C6- 22알킬술포닐, 또는 C5- 22아릴 술포닐을 나타내는 경우에만,
R3 및 R6 중 하나는 C6- 22알콕시(여기서 C1- 22알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 선택적으로 대체될 수 있음); C6-22 알킬아미노(이 기는 히드록시 또는 C1-22알킬로 선택적으로 치환됨); C6-22 알콕시 아미노; C6-22 알킬아미노(여기서 C1-22 알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); C6- 22헤테로알킬아미노; 히드록시로 선택적으로 치환된 디(C6-22 알킬)아미노; 디(C6-22알킬)아미노(여기서 C6- 22알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); 또는 디(C6-22헤테로알킬)아미노를 나타낼 수 있고,
(iii) R1, R2, R4 및 R5 기 중 어느 것도 C6- 22아실, C6- 22알킬(이 기는 히드록시 및 C1- 22알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환됨); C6-22 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C6- 22알킬술포닐, 또는 C5- 22아릴 술포닐을 나타내지 않으면,
R3 및 R6은 둘 다 독립적으로 C6- 22알콕시(여기서 C1- 22알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 선택적으로 대체될 수 있음); C6-22 알킬아미노(이 기는 히드록시 또는 C1- 22알킬로 선택적으로 치환됨); C6-22 알콕시 아미노; C6-22 알킬아미노(여기서 C1-22 알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); C6- 22헤테로알킬아미노; 히드록시로 선택적으로 치환된 디(C6-22 알킬)아미노; 디(C6-22알킬)아미노(여기서 C6- 22알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체됨); 또는 디(C6-22헤테로알킬)아미노를 나타낼 수 있는 것인 방법.
35. 실시 양태 3 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 시스테인/시스틴 유사체는 화학식 1 및 2의 염을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 방법.
36. 실시 양태 35에 있어서, 염은 시스테인/시스틴 유사체 상에 존재하는 히드록시 기의 반응에 의해 형성되는 것인 방법.
37. 실시 양태 35 또는 36에 있어서, 염은 알칼리 금속염, 예를 들어 나트륨, 칼륨 또는 리튬 염; 알칼리 토금속 염, 예를 들어 마그네슘 또는 칼슘 염; 암모늄 염, 예를 들어 테트라 알킬 또는 아릴 암모늄 염; 술포늄 염, 예를 들어 트리알킬 또는 아릴 술포늄; 및 포스포늄 염, 예를 들어 테트라 알킬 또는 아릴 포스포늄 염을 포함하는 것인 방법.
38. 실시 양태 35 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 염은 시스테인/시스테인 유사체 상에 존재하는 아미노 기의 반응, 예컨대 무기산 또는 유기산과 아미노 기의 반응에 의해 형성되며, 모노- 또는 디-HCl 염, H2SO4 염, H3PO4 염, 아세테이트 및 푸마레이트를 포함하는 것인 방법.
39. 실시 양태 3 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 정의된 바와 같은 시스테인/시스틴 유사체는 L-시스테인과 동일한 키랄성을 갖는 것인 방법.
40. 실시 양태 3 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 시스테인/시스테인 유사체는 N,N'-디아세틸-L-시스틴-디메틸에스테르, N-아세틸-L-시스테인 및 N,N'-디아세틸-L-시스틴, 또는 S-술포시스테인으로부터 선택되는 것인 방법.
41. 실시 양태 3 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 시스테인/시스틴 유사체는 L-시스테인과 동일한 키랄성을 갖는 화합물을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 방법.
42. 실시 양태 3 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 시스테인/시스틴 유사체는 N,N'-디아세틸-L-시스틴-디메틸에스테르로 이루어지는 것인 방법.
43. 실시 양태 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양 배지는
(a) 시스테인/시스틴 유사체; 및
(b) 시스테인 및/또는 시스틴
을 포함하며,
(a) 대 (b)의 몰비는 1:18 내지 18:1인 방법.
44. 실시 양태 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 방법은
(i) 상기 숙주 세포를 초기량의
(a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
(b) 시스테인 및/또는 시스틴
을 선택적으로 포함하는 기본 배지에 접종하는 단계:
(ii) 재조합 단백질이 세포에 의해 생산되는 생산 단계를 통해 배양을 진행시키는 단계로서, 상기 생산 단계 동안 세포 배양 배지에는
(a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
(b) 시스테인 및/또는 시스틴
이 보충되는 것인 단계
를 포함하며,
(a) 및 (b)는 동시에 또는 순차적으로 첨가될 수 있으며,
기본 배지의 내용물 및 첨가된 총 보충물이 합산될 때, (a) 대 (b)의 몰비는 1:18 내지 18:1인 방법.
45. 실시 양태 43 또는 44에 있어서, 상기 (a) 대 (b)의 몰비는 1:15 내지 15:1. 예를 들어 1:12 내지 12:1, 예컨대 1:10 내지 10:1, 예를 들어 1:8 내지 8:1, 예컨대 1:6 내지 6:1, 예를 들어 1:4 내지 4:1, 예컨대 1:3 내지 3:1, 예를 들어 1:2 내지 2:1, 예컨대 1.5:1 내지 1:1.5, 예를 들어 1:1의 몰비인 방법.
46. 실시 양태 43 또는 44에 있어서, 상기 기본 배지에서 (b)의 농도는 0.05 내지 5 mmol/L, 예컨대 0.1 내지 1 mmol/L, 예를 들어 0.2 내지 0.6 mmol/L의 시스테인에 해당하는 것인 방법.
47. 실시 양태 43 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 생산 단계 동안, 배지에는 (a) 시스테인/시스틴 유사체 및 (b) 시스테인 및/또는 시스틴이 보충되며, 전체 생산 단계에 걸쳐 배양물에 첨가되는 (a)와 (b)의 합은 1 내지 75 mmol/L, 예컨대 2 내지 20 mmol/L, 예를 들어 4 내지 10 mmol/L의 시스테인에 해당하는 것인 방법.
48. 실시 양태 43 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 생산 단계 동안, 배지에는 (a) 시스테인/시스틴 유사체 및 (b) 시스테인 및/또는 시스틴이 매일 보충되며, 매일 첨가에 의해 (a) + (b)의 농도는 0.05 내지 5 mmol/L, 예컨대 0.1 내지 1 mmol/L의 시스테인에 해당하는 농도가 되는 것인 방법.
49. 실시 양태 43 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 생산 단계 동안 세포 배양 배지에는 다음이 보충되는 것인 방법:
● 생산되는 재조합 단백질의 예상되는 총량의 10 중량% 내지 30 중량의 총량까지의 시스테인 또는 시스틴; 및/또는
● 생산되는 재조합 단백질의 예상되는 총량의 8 중량% 내지 35 중량%의 총량까지의 트립토판.
50. 실시 양태 43 내지 49 중 어느 하나에 있어서,
● 세포 배양물에서 시스테인 또는 시스틴 농도는 생산 단계 동안 어느 시점에서든 0.9 g/L를 초과하지 않고/거나, 바람직하게는 세포 배양물에서 시스테인 또는 시스틴 농도는 생산 단계 동안 어느 시점에서든 0.3 g/L를 초과하지 않고/거나,
● 세포 배양물에서 트립토판 농도는 생산 단계 동안 어느 시점에서든 0.6 g/L를 초과하지 않으며, 바람직하게는 세포 배양물에서 트립토판 농도는 생산 단계 동안 어느 시점에서든 0.3 g/L를 초과하지 않는 것인 방법.
51, 실시 양태 43 내지 50 중 어느 하나에 있어서,
● 공정 동안 제공되는 시스테인 또는 시스틴의 총량은 2.9 내지 12 g/(1012 세포), 예컨대 2.9 내지 7 g/(1012 세포)(여기서 세포는 생산 단계의 종료 시에 예상되는 전체 생존 세포 수를 지칭함)이고/거나,
● 공정 동안 제공되는 트립토판의 총량은 2.5 내지 7 g/(1012 세포), 예컨대 2.5 내지 3.5 g/(1012 세포/L)(여기서 세포는 생산 단계의 종료 시에 예상되는 전체 생존 세포 수를 지칭함)인 방법.
52. 실시 양태 1 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 방법은 뱃치 방법인 방법.
53. 실시 양태 1 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 재조합 단백질은 생산 단계 동안 생산되며, 바람직하게는 생산 단계는 적어도 7일, 더 바람직하게는 적어도 14일의 기간을 갖는 것인 방법.
54. 실시 양태 1 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 배양물은 생산 단계에서 매일 보충되는 것인 방법.
55. 실시 양태 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 생산 단계는 생물 반응기에서, 바람직하게는 50 L 이상, 100 L 이상, 500 L 이상, 1000 L 이상, 2,000 L 이상, 5,000 L 이상, 10,000 L 이상, 또는 20,000L 이상의 용량으로 수행되는 것인 방법.
56. 실시 양태 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 바람직하게는 CHO 세포인 방법.
57. 실시 양태 1 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 재조합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
58. 실시 양태 57에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기인 방법:
i) a 내지 d를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편
a. 서열 번호 1에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-H1; 서열 번호 2에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-H2; 서열 번호 3에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-H3; 서열 번호 4에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-L1; 서열 번호 5에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-L2 및 서열 번호 6에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-L3; 또는
b. 서열 번호 7에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 8에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 또는
c. 서열 번호 7에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 8에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 중쇄 가변 영역;
d. 서열 번호 7에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 11에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄; 또는
e. 서열 번호 7에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 11에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 중쇄; 또는
ii) 서열 번호 9에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 경쇄 및 서열 번호 10에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 또는
iii) 서열 번호 9에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 경쇄 및 서열 번호 10에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체.
59. 실시 양태 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 재조합 단백질은 시스테인/시스틴 유사체를 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 배양된 숙주 세포에 의해 생산될 때 10 mg/ml 이상, 예컨대 50 mg/ml 이상의 농도에서 무색이 아닌 단백질이며, 색상은 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 결정되는 것인 방법.
60. 실시 양태 1 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 방법은 세포 배양 배지로부터 재조합 단백질을 회수하는 단계 및 재조합 단백질을 정제하는 추가의 단계를 포함하는 방법.
61. 실시 양태 60에 있어서, 정제는 단백질 A 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.
62. 실시 양태 60 또는 61에 있어서, 정제된 재조합 단백질을 제제화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
63. 본 발명은 재조합 단백질 제제의 제조 방법으로서,
(i) 상기 숙주 세포를 초기량의
(a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
(b) 시스테인 및/또는 시스틴
을 선택적으로 포함하는 기본 배지에 접종하는 단계:
(ii) 재조합 단백질이 세포에 의해 생산되는 생산 단계를 통해 배양을 진행시키는 단계로서, 상기 생산 단계 동안 세포 배양 배지에는
(a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
(b) 시스테인 및/또는 시스틴
이 보충되는 것인 단계
를 포함하며,
(a) 및 (b)는 동시에 또는 순차적으로 첨가될 수 있으며,
기본 배지의 내용물 및 첨가된 총 보충물이 합산될 때, (a) 대 (b)의 몰비는 1:18 내지 18:1인 방법.
64. 실시 양태 63에 있어서, 시스테인/시스틴 유사체는 상기 실시 양태 3 내지 41에 기재된 바와 같은 것인 방법.
65. 실시 양태 63 또는 64에 있어서, 상기 (a) 대 (b)의 몰비는 1:15 내지 15:1. 예를 들어 1:12 내지 12:1, 예컨대 1:10 내지 10:1, 예를 들어 1:8 내지 8:1, 예컨대 1:6 내지 6:1, 예를 들어 1:4 내지 4:1, 예컨대 1:3 내지 3:1, 예를 들어 1:2 내지 2:1, 예컨대 1.5:1 내지 1:1.5, 예를 들어 1:1의 몰비인 방법.
66. 실시 양태 63 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 상기 기본 배지에서 (b)의 농도는 0.05 내지 5 mmol/L, 예컨대 0.1 내지 1 mmol/L, 예를 들어 0.2 내지 0.6 mmol/L의 시스테인에 해당하는 것인 방법.
67. 실시 양태 63 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 생산 단계 동안, 배지에는 (a) 시스테인/시스틴 유사체 및 (b) 시스테인 및/또는 시스틴이 보충되며, 전체 생산 단계에 걸쳐 배양물에 첨가되는 (a)와 (b)의 합은 1 내지 75 mmol/L, 예컨대 2 내지 20 mmol/L, 예를 들어 4 내지 10 mmol/L의 시스테인에 해당하는 것인 방법.
68. 실시 양태 63 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 생산 단계 동안, 배지에는 (a) 시스테인/시스틴 유사체 및 (b) 시스테인 및/또는 시스틴이 매일 보충되며, 매일 첨가에 의해 (a) + (b)의 농도는 0.05 내지 5 mmol/L, 예컨대 0.1 내지 1 mmol/L의 시스테인에 해당하는 농도가 되는 것인 방법.
69. 실시 양태 63 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 상기 생산 단계 동안 세포 배양 배지에는 다음이 보충되는 것인 방법:
● 생산되는 재조합 단백질의 예상되는 총량의 10 중량% 내지 30 중량의 총량까지의 시스테인 또는 시스틴; 및/또는
● 생산되는 재조합 단백질의 예상되는 총량의 8 중량% 내지 35 중량%의 총량까지의 트립토판.
70. 실시 양태 63 내지 69 중 어느 하나에 있어서,
● 세포 배양물에서 시스테인 또는 시스틴 농도는 생산 단계 동안 어느 시점에서든 0.9 g/L를 초과하지 않고/거나, 바람직하게는 세포 배양물에서 시스테인 또는 시스틴 농도는 생산 단계 동안 어느 시점에서든 0.3 g/L를 초과하지 않고/거나,
● 세포 배양물에서 트립토판 농도는 생산 단계 동안 어느 시점에서든 0.6 g/L를 초과하지 않으며, 바람직하게는 세포 배양물에서 트립토판 농도는 생산 단계 동안 어느 시점에서든 0.3 g/L를 초과하지 않는 것인 방법.
71, 실시 양태 63 내지 70 중 어느 하나에 있어서,
● 공정 동안 제공되는 시스테인 또는 시스틴의 총량은 2.9 내지 12 g/(1012 세포), 예컨대 2.9 내지 7 g/(1012 세포)(여기서 세포는 생산 단계의 종료 시에 예상되는 전체 생존 세포 수를 지칭함)이고/거나,
● 공정 동안 제공되는 트립토판의 총량은 2.5 내지 7 g/(1012 세포), 예컨대 2.5 내지 3.5 g/(1012 세포/L)(여기서 세포는 생산 단계의 종료 시에 예상되는 전체 생존 세포 수를 지칭함)인 방법.
72. 실시 양태 63 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 방법은 뱃치 방법인 방법.
73. 실시 양태 63 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 재조합 단백질은 생산 단계 동안 생산되며, 바람직하게는 생산 단계는 적어도 7일, 더 바람직하게는 적어도 14일의 기간을 갖는 것인 방법.
74. 실시 양태 63 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 배양물은 생산 단계에서 매일 보충되는 것인 방법.
75. 실시 양태 63 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 생산 단계는 생물 반응기에서, 바람직하게는 50 L 이상, 100 L 이상, 500 L 이상, 1000 L 이상, 2,000 L 이상, 5,000 L 이상, 10,000 L 이상, 또는 20,000L 이상의 용량으로 수행되는 것인 방법.
76. 실시 양태 63 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 바람직하게는 CHO 세포인 방법.
77. 실시 양태 63 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 재조합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
78. 실시 양태 77에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기인 방법:
i) a 내지 d를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편
a. 서열 번호 1에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-H1; 서열 번호 2에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-H2; 서열 번호 3에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-H3; 서열 번호 4에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-L1; 서열 번호 5에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-L2 및 서열 번호 6에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-L3; 또는
b. 서열 번호 7에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 8에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 또는
c. 서열 번호 7에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 8에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 중쇄 가변 영역;
d. 서열 번호 7에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 11에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄; 또는
e. 서열 번호 7에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 11에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 중쇄; 또는
ii) 서열 번호 9에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 경쇄 및 서열 번호 10에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 또는
iii) 서열 번호 9에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 경쇄 및 서열 번호 10에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체.
79. 실시 양태 63 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 재조합 단백질은 시스테인/시스틴 유사체를 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 배양된 숙주 세포에 의해 생산될 때 10 mg/ml 이상, 예컨대 50 mg/ml 이상의 농도에서 무색이 아닌 단백질이며, 색상은 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 결정되는 것인 방법.
80. 실시 양태 63 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 방법은 세포 배양 배지로부터 재조합 단백질을 회수하는 단계 및 재조합 단백질을 정제하는 추가의 단계를 포함하는 방법.
81. 실시 양태 80에 있어서, 정제는 단백질 A 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.
82. 실시 양태 80 또는 81에 있어서, 정제된 재조합 단백질을 제제화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
83. 실시 양태 63 내지 82 중 어느 하나에있어서, 상기 숙주 세포는 CHO 세포이고 상기 시스테인/시스틴 유사체는 N,N'-디아세틸-L-시스틴-디메틸에스테르인 방법.
84. 상기 실시 양태 1 내지 83 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된 재조합 단백질 제제.
85. N,N'-디아세틸-L-시스틴-디메틸에스테르를 포함하는, 포유동물 세포를 배양하기에 적합한 세포 배양 배지.
본 발명은 이제 첨부 도면에 도시된 실시 양태를 참조하여 예로써 추가로 설명될 것이다.
실시예
약어
mAb: 단클론 항체; Cys: 시스테인 또는 시스틴; APG: 산성 피크 그룹; VCC: 생존 세포 수; DO: 용존 산소; CO2: 이산화탄소; CHO: 중국 햄스터 난소; UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography): 초고성능 액체 크로마토그래피.
실시예 1
세포 배양에서 배양된 숙주 세포에 의해 재조합으로 생산된 항체 제제의 색상 및 산성 종을 감소시키는 시스테인/시스틴 유도체의 능력을 평가하였다. 이 실험을 위해, 진탕 플라스크의 규모 축소 모델을 사용하였다. 전장 항체 mAb1을 생산하는 CHO-DG44 세포를 0.35x106 세포/mL의 접종 밀도로 100mL의 기본 배지에 접종하였다. mAb1은 서열 번호 9에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 경쇄 및 서열 번호 10에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄를 포함한다.
진탕 플라스크 용기는 빛이 차단된 교반 인큐베이터(Infors)에 배치된 250 mL 진탕 플라스크(corning)였다. 세포를 36.8℃에서 80% 습도로 14일 동안 배양하였다. 공정 초기에 세포 배양물을 140 rpm으로 교반하였다. 2L 생물 반응기 공정에서와 같이 진탕 플라스크에서 DO%를 40%로 유지하기 위해 250 rpm에 도달하도록 공정 동안 점진적으로 교반을 증가시켰다. 인큐베이터의 CO2를 공정 전 5%에서 공정 동안 2%로 감소시켜 세포 배양물을 pH 7.0±0.2로 유지하였다. 배양의 매일 공급물을 일시에 첨가하여 유가식 모드로 세포를 배양하였다. 기본 배지는 0.04 mmol/L의 시스테인 + 0.38 mmol/L의 시스틴을 함유하였다. 공급물은 153.3 mmol/L의 시스틴을 함유하였다. 전체 14일의 생산 단계에 걸쳐, 첨가된 총 공급물의 용량은 배양 개시 용량의 4.47% (v/v)에 해당하였다.
공급물에 존재하는 시스테인은 표 1에 제시된 바와 같이 상이한 백분율의 상이한 시스테인 및 시스틴 유도체로 대체하였다. Advanced Instruments의 삼투압계를 사용하여 삼투압을 매일 모니터하였다. 모델 BioProfile pHOx® 혈액 가스 분석기(Nova Biomedical Corporation, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)를 사용하여 오프 라인 pH, 용존 O2 및 용존 CO2를 매일 모니터하였다. CedexBioHT 시스템(Roche)을 사용하여 대사 물질 농도를 매일 측정하였다. ViCell 자동 세포 계수기(Beckman Coulter)를 사용하여 생존 세포 농도 및 세포 생존도를 매일 측정하였다. 단백질 A HPLC(Waters)를 사용하여 항체 역가를 결정하기 위해 1mL의 세포 배양액을 원심 분리하여 세포 배양액을 매일 수집하였다. 14일의 배양 종료 시에, 세포 배양액을 원심 분리에 의해 수거하였다. 이어서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피(MabSelect Sure, GE)를 사용하여 상등액을 정제하였다. UPLC 크기 배제(Waters)를 이용한 분자량 결정을 위해 단백질 A 용리액을 사용하였다. 정제된 mAb의 주요 산성(APG: 산성 피크 그룹) 및 염기성(BPG: 염기성 피크 그룹) 아이소형의 상대 백분율을 영상화 모세관 전기영동(ProteinSimple iCE3)에 의해 결정하였다. 단백질 A 용리액의 다른 부분을 Amicon centricon 원심 분리 필터 장치(Millipore)를 사용하여 40mg/mL로 농축시켰다.
농축 단백질 A 용리액에서 투과에 의한 분광 광도계(UltrascanPro)를 사용하여 농축된 항체 조성물의 색상 강도를 측정하고 CIE(commission internationale de l'
Figure pct00008
clairage) 척도와 비교하였다. 수치 결과는 40mg/mL의 농도로 정규화하였다.
[도 1]은 공급물 내 시스테인의 상이한 대체율을 갖는 상이한 시스테인 및 시스틴 유도체를 사용한 세포 성장 프로파일을 보여준다. Cys 유도체가 100%인 조건에서, 세포가 제7일에 빠르게 사멸한 100% S-술포시스테인 조건을 제외하고는 대조군 조건과 비교하여 제6일부터 세포 성장이 둔화하였다. 생존 세포 농도는 제10일까지 50% 유도체 공급물에 대해 대조군 조건과 유사하였다. 제10일부터 생존 세포 밀도는 대조군 조건보다 높았다. 그러나 50% S-술포시스테인의 경우, 생존 세포 농도는 최대 2x106 세포/mL에 도달하였으며, 이는 대조군 조건보다 현저히 낮았다. Cys의 100%가 Cys 유도체로 대체될 때 대조군에서와 마찬가지로 세포는 성장하지 않았는데 이는 시스테인 유도체가 시스테인을 완전히 대체할 수 없음을 시사한다. 반면에, 50% 유도체를 사용한 조건이 대조군 조건보다 더 나은 성장을 나타냈는데 이는 최소한의 시스테인이 존재할 때 시스테인/시스틴 유도체의 긍정적인 영향을 시사한다. S-술포시스테인은 세포 성장을 가능하게 하는 것과 관련하여 시험된 다른 유도체처럼 작용하지 않는 것으로 보인다.
100% 시스테인 유도체에서 관찰된 세포 사멸의 관점에서, 다른 성능 및 생성물 품질 결과는 50% 시스테인 유도체 조건에 대해서만 분석하였다.
생성물 역가는 사용된 유도체가 S-술포시스테인일 때를 제외하고 대조군 조건보다 50%의 시스테인 유도체를 사용한 배양물에서 더 높았다(도 2).
농축 단백질 A 용리액의 b*값은 대조군 조건과 비교하여 6.5% 내지 21.2% 감소하였으며, 최상의 결과는 50%의 N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르(CAS 등록 번호 32381-28-5, 예를 들어 Bachem AG로부터 구입 가능)에서 관찰되었다(도 3). 마찬가지로, 대조군 조건과 비교하여 7.6% 내지 24.8%의 산성 변이체 수준에서의 감소가 또한 관찰되었으며, 최상의 결과는 50%의 N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르에서 관찰되었다(도 4). 산성 종 수준에서의 이러한 감소는 S-술포시스테인(미제시)을 제외하고는 염기성 변이체 수준의 유의한 증가 없이 주 전하 종의 증가와 연관되었다(도 5). 이러한 결과는 재조합 단백질의 미세 이질성의 감소를 확인시켜 주었다.
[표 1]
Figure pct00009
실시예 2
세포 배양에서 재조합 단백질 제제의 색상 및 산성 종을 감소시키는 시스테인/시스틴 유도체의 능력을 다른 항체 생산 세포주인 세포주 2를 사용하여 평가하였다. 이 실험을 위해, 진탕 플라스크에서 규모 축소 모델을 사용하였다. 다중 특이적 항체 유도체를 생산하는 CHO-DG44 세포를 0.35x106 세포/mL의 접종 밀도로 100mL의 기본 배지에 접종하였다. 진탕 플라스크 용기는 빛이 차단된 교반 인큐베이터(Infors)에 배치된 250 mL 진탕 플라스크(corning)였다. 세포를 36.8℃에서 80% 습도로 14일 동안 배양하였다. 공정 초기에 세포 배양물을 140 rpm으로 교반하였다. 2L 생물 반응기 공정에서와 같이 진탕 플라스크에서 DO%를 40%로 유지하기 위해 250 rpm에 도달하도록 공정 동안 점진적으로 교반을 증가시켰다. 인큐베이터의 CO2를 공정 전 5%에서 공정 동안 2%로 감소시켜 세포 배양물을 pH 7.0±0.2로 유지하였다. 배양의 매일 공급물을 일시에 첨가하여 유가식 모드로 세포를 배양하였다. 기본 배지는 0.04 mmol/L의 시스테인 + 0.38 mmol/L의 시스틴을 함유하였다. 공급물은 153.3 mmol/L의 시스틴을 함유하였다. 전체 14일의 생산 단계에 걸쳐, 첨가된 총 공급물의 용량은 배양 개시 용량의 2.81% (v/v)에 해당하였다.
공급물에 존재하는 시스테인은 50% 등몰의 대체율을 갖는 상이한 시스테인 및 시스틴 유도체로 대체하였다(표 1). 관찰된 개선이 시스테인 유도체의 존재 또는 시스테인만의 감소에 의한 것인지의 여부를 시험하기 위해 대조군 시스테인 수준의 50%만을 사용한 조건을 또한 추가하였다. Advanced Instruments의 삼투압계를 사용하여 삼투압을 매일 모니터하였다. Nova Biomedical Phox(Nova biomedical)를 사용하여 오프 라인 pH, 용존 O2 및 용존 CO2를 매일 모니터하였다. CedexBioHT 시스템(Roche)을 사용하여 대사 물질 농도를 매일 측정하였다. ViCell 자동 세포 계수기(Beckman Coulter)를 사용하여 생존 세포 농도 및 세포 생존도를 매일 측정하였다. 단백질 L 옥텟(Octet) 측정(Pall)을 사용하여 항체 역가를 결정하기 위해 1mL의 세포 배양액을 원심 분리하여 세포 배양액을 매일 수집하였다. 14일의 배양 종료 시에, 세포 배양액을 원심 분리에 의해 수거하였다. 이어서, 단백질 L 친화성 크로마토그래피(CapToL, GE)를 사용하여 상등액을 정제하였다. UPLC 크기 배제(Waters)를 이용한 분자량 결정 및 모세관 등전 집중법(ProteinSimple iCE3)을 이용한 전하 변이체 측정을 위해 단백질 L 용리액을 사용하였다. 세포주 2로 생산된 재조합 단백질은 착색된 분자가 아니었다. 따라서, 이 경우에는 색상 측정을 수행하지 않았다.
[도 6]은 공급물에서 시스테인의 대체율이 50%인 상이한 시스테인 및 시스틴 유도체를 사용한 세포 성장 프로파일을 보여준다. 시스테인 및 시스틴 유도체를 사용한 조건과 대조군 조건 사이에서 유사한 세포 성장 프로파일이 관찰되었다. 따라서, 이들 성분은 이 세포주(세포주 2)의 세포 성장에 영향을 미치지 않는다. 생성물 역가는 또한 모든 시스테인 및 시스틴 유도체에 대한 대조군 조건과 유사하였다(도 7).
[도 8]에서 볼 수 있는 바와 같이, 2가지 시스틴 유도체, N,N'-디아세틸-L-시스틴 및 N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르의 대조군 조건과 비교하여 46.6% 내지 50.2%의 산성 변이체 수준의 감소가 관찰되었다. 산성 변이체 수준의 14.5% 감소가 N-아세틸-시스테인에서 관찰되었다. 산성 종 수준의 이러한 감소는 염기성 변이체 수준의 유의한 증가 없이(데이터 미제시) 주 전하 종의 증가와 관련되었다(도 9). 이러한 결과는 시스틴 유도체에 의한 재조합 단백질의 미세 이질성의 감소를 확인시켜 주었다. 한편, S-술포시스테인에서와 시스테인만의 감소에서 5% 내지 10%의 산성 종의 증가가 관찰되었다.
실시예 3
세포 배양에서 재조합 단백질 제제의 색상 및 산성 종을 감소시키는 시스테인/시스틴 유도체의 능력을 생물 반응기에서 2가지 세포주에 대해 평가하였다. 이 모델은 기하학적 구조 및 추가 제어로 인해 진탕 플라스크보다 대규모 생산을 대표한다. 세포주 1 및 2로부터의 CHO-DG44 세포를 2L 교반 생물 반응기(Sartorius)에서 0.35x106 세포/mL의 접종 밀도로 1300mL의 기본 배지에 접종하였다. 세포를 유가식 모드에서 14일 동안 배양하였다. 세포 배양물을 280 rpm으로 교반하고 DO를 40%로 유지하였다. 세포 배양물을 자동 CO2 살포 조절로 pH 7.0±0.2로 유지시켰다. 배양의 매일 공급물을 일시에 첨가하여 유가식 모드로 세포를 배양하였다. 기본 배지는 0.04 mmol/L의 시스테인 + 0.38 mmol/L의 시스틴을 함유하였다. 공급물은 153.3 mmol/L의 시스틴을 함유하였다. 전체 14일의 생산 단계에 걸쳐, 첨가된 총 공급물의 용량은 세포주 1에 대한 배양 개시 용량의 5.7%(w/w) 및 세포주 2에 대한 배양 개시 용량의 3.1%(w/w)에 해당하였다.
공급물에 존재하는 시스테인은 표 2에 제시된 바와 같이 상이한 백분율로 상이한 시스테인 및 시스틴 유도체로 대체하였다. 관찰된 개선이 시스테인 유도체에 의한 것인지 또는 시스테인만의 감소에 의한 것인지의 여부를 시험하기 위해 50%의 시스테인만을 사용한 조건을 추가하였다. Advanced Instruments의 삼투압계를 사용하여 삼투압을 매일 모니터하였다. Nova Biomedical Phox(Nova biomedical)를 사용하여 오프 라인 pH, 용존 O2 및 용존 CO2를 매일 모니터하였다. CedexBioHT 시스템(Roche)을 사용하여 대사 물질 농도를 매일 측정하였다. ViCell 자동 세포 계수기(Beckman Coulter)를 사용하여 생존 세포 농도 및 세포 생존도를 매일 측정하였다. HPLC prot A(waters)에 의해 또는 단백질 L 옥텟 측정(Pall)을 사용하여 항체 역가를 결정하기 위해 1mL의 세포 배양액을 원심 분리하여 세포 배양액을 매일 수집하였다. 14일의 배양 종료 시에, 세포 배양액을 원심 분리에 의해 수거하였다. 이어서, 단백질 A 또는 L 친화성 크로마토그래피(GE)를 사용하여 상등액을 정제하였다. UPLC 크기 배제(Waters)를 이용한 분자량 결정 및 모세관 등전 집중법(ProteinSimple iCE3)을 이용한 전하 변이체 측정을 위해 단백질 A 또는 L 용리액을 사용하였다. 단백질 A 용리액의 다른 부분(세포주 1에서만)을 Amicon centricon 원심 분리 필터 장치(Millipore)를 사용하여 40mg/mL로 농축시켰다. 농축 단백질 A 용리액에서 투과에 의한 분광 광도계(UltrascanPro)를 사용하여 농축된 항체 조성물의 색상 강도를 측정하고 CIE(commission internationale de l'
Figure pct00010
clairage) 척도와 비교하였다. 수치 결과는 40mg/mL의 농도로 정규화하였다.
[표 2]
Figure pct00011
세포주 1
시험된 모든 조건에서 유사한 세포 성장 경향이 관찰되었다(도 10).
N,N'-디아세틸-시스틴 및 N-아세틸-시스테인에서 10% 내지 17%의 항체 역가의 유의한 감소가 관찰되었지만 N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르에서 5% 미만의 유의하지 않은 감소가 관찰되었다(도 11). 50% 시스테인 공급물만으로도 역가의 유의한 감소가 관찰되었으며, 이는 N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르가 역가를 개선시킨다는 것을 시사한다.
산성 종 수준과 관련하여, N,N'-디아세틸-L-시스틴에서 5%, N-아세틸-L-시스테인에서 10%, N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르에서 15%의 감소가 관찰되었다(도 12). 이 감소는 주요 종의 증가와 관련되었다(도 13). 진탕 플라스크에서와 같이 2L 규모에서 전하 변이체에 유사한 영향이 관찰되었다. 이 감소는 50% 시스테인 공급물만으로도 관찰되었다. 이는 여기서 산성 종의 수준 감소가 시스테인의 감소 때문일 수 있음을 시사한다. b 값 수준의 감소는 N,N'-디아세틸-L-시스틴에서 2.5%, N-아세틸-L-시스테인에서 13%, N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르에서 25%가 관찰되었다. 진탕 플라스크에서와 같이 2L 규모에서 생성물 색상에 유사한 영향이 관찰되었다. 50% 시스테인 공급물만으로 b*값의 감소가 관찰되지 않았다. 착색에 대한 N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르의 영향이 확인되었다.
세포주 2
시험된 모든 조건에 대해 유사한 세포 성장 경향이 관찰되었다(도 15).
N,N'-디아세틸-시스틴, N-아세틸-시스테인 및 N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르에서 15% 내지 23%의 항체 역가의 유의한 증가가 관찰되었다(도 16). 이 결과는 진탕 플라스크에서 얻은 결과와 다르다.
산성 종 수준과 관련하여, N,N'-디아세틸-L-시스틴에서 8%, N-아세틸-L-시스테인에서 13%, N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르에서 13%의 감소가 관찰되었다(도 17). 이 감소는 주요 종의 증가와 관련되었다(도 18). N-아세틸-시스테인을 제외하고 진탕 플라스크와 비교하여 2L 규모에서 전하 변이체에 대한 유사한 경향이 관찰되었다. N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르에 의한 시스테인 대체가 전하 변이체에 미치는 영향이 확인되었다.
50% 시스테인 공급물에서 산성 종 수준의 27% 감소가 관찰되었다. 이것은 시스테인의 감소가 산성 종의 감소에 주요 동인임을 나타낸다. 시스테인/시스틴 유도체에서 15% 내지 23% 대신에 50% 시스테인 공급물에서 10%의 역가 증가가 관찰되었다. 시스테인/시스틴 유도체에 의한 시스테인의 50%의 대체는 이 세포주에 대한 역가 증가와 이질성 감소 사이의 좋은 절충안이다.
실시예 4
세포주 1을 사용한 생물 반응기에서 결과의 재현성을 평가하였다. 추가 대조군 및 50% S-술포시스테인 50% 시스테인 공급물을 사용한 생물 반응기로 실시예 3의 실험을 반복하였다. 이전에 시스테인/시스틴 유도체로 관찰된 효과를 확인하기 위해 두 실험으로부터의 데이터를 분석하였다.
[도 3]
Figure pct00012
제0일과 제8일 사이에 세포 성장에 관한 차이는 관찰되지 않았다. 제9일부터 S-술포시스테인을 사용한 조건은 대조군보다 더 높은 세포 사멸을 보였다. 50% 시스테인 공급물, 50% N,N'-디아세틸 시스틴 50% 시스테인 공급물 및 50% N-아세틸-시스테인 50% 시스테인 공급물은 대조군 조건보다 더 높은 VCC를 보였다. 50% N,N'-디아세틸 시스틴 디메틸 에스테르 50% 시스테인 공급물 조건은 대조군 조건 평균과 유사하였다(도 19).
N,N'-디아세틸 시스틴 디메틸 에스테르에서 대조군 평균과 비교하여 5% 미만의 항체 역가의 유의하지 않은 감소가 관찰되었다. 그러나 50% 시스테인 공급물에서 10% 감소가 관찰되었다. 따라서 N,N'-디아세틸 시스테인 디메틸 에스테르의 사용은 공급물에서 시스테인 감소로 인한 5%의 역가 손실을 보상하였다. 또한, 50% 시스테인 공급물에서 관찰된 VCC가 높을수록 50% 시스테인 공급물과 비교하여 N,N'-디아세틸 시스틴 디메틸 에스테르의 비생산성이 증가함을 나타낸다. 이러한 관찰은 N,N'-디아세틸 시스틴 디메틸 에스테르의 첨가에 의해 시스테인의 감소로 인한 비생산성의 손실이 보상될 수 있음을 확인시켜 준다. N-아세틸 시스테인 및 N,N'-디아세틸 시스테인에서도 10%의 감소가 관찰되었다. 이들 분자는 이 세포주의 생산성에 영향을 미치지 않았다. 한편, S-술포시스테인에서 역가의 25% 감소가 관찰되었다. 이는 VCC의 감소와 시스테인 감소로 인한 생산성의 감소 때문이었지만 S-술포시스테인이 비생산성에 미치는 특이적인 영향으로 인한 것은 아니었다(도 20).
산성 종 수준과 관련하여, N,N'-디아세틸-L-시스틴 및 N-아세틸-L-시스테인에서 평균 10% 감소가 관찰되었다(도 21). 이 감소는 주요 종의 증가와 관련되었다(도 22).
N,N'-디아세틸-L-시스틴에서 평균 15% 감소가 관찰되었다. 이 감소는 50% 시스테인 공급물만으로도 관찰된다. 이것은 또한 산성 종 수준 감소가 시스테인 수준의 감소 때문임을 시사한다. S-술포시스테인과 대조군 조건 사이에서 유사한 산성 종 수준이 관찰되었다. 이것은 S-술포시스테인이 시스테인 감소에 의해 정상적으로 감소된 산성 종 수준을 증가시켰음을 시사한다.
b 값 수준과 관련하여 S-술포시스테인에서 5%, N,N'-디아세틸-L-시스틴에서 14%, N-아세틸-L-시스테인에서 13%, N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르에서 30%의 평균 감소가 관찰되었다. 50% 시스테인 공급물만으로 b*값의 감소가 관찰되지 않았다. 착색에 대한 N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르의 영향이 확인되었다(도 23).
실시예 5
본 발명자들은 미니 생물 반응기에서 배양된 세포 배양물에서 생산된 재조합 단백질 제제의 APG 수준에서의 개선에 대해 상이한 농도의 시스테인/시스틴 유도체를 시험하였다. 세포주 1로부터의 CHO-DG44 세포를 Ambr15 생물 반응기(Sartorius)에서 0.35x106 세포/mL의 접종 밀도로 12mL 기본 배지에 접종하였다. 세포를 14일 동안 유가식 모드로 배양하였다. DO를 40%로 유지시켰고 pH를 자동 CO2 살포 조절로 7.0±0.2로 유지시켰다. ViCell 자동 세포 계수기(Beckman Coulter)를 사용하여 생존 세포 농도 및 세포 생존도를 매일 측정하였다. 공급물을 매일 일시에 첨가하여 유가식 모드로 세포를 배양하였다. 기본 배지는 0.04 mmol/L의 시스테인 + 0.38 mmol/L의 시스틴을 함유하였다. 공급물은 153.3 mmol/L의 시스틴을 함유하였다. 전체 14일의 생산 단계에 걸쳐, 첨가된 총 공급물의 용량은 배양 개시 용량의 4.7%(v/v)에 해당하였다.
공급물에 존재하는 상이한 백분율의 시스테인은 상이한 시스테인 및 시스틴 유사체로 대체하였다. 표 4는 시스테인 또는 시스틴에 대한 시험된 상이한 백분율 및 몰비의 당량에 대한 개요를 제공한다. 예를 들어, N-아세틸-L-시스테인의 경우 10%는 10% 몰량의 시스테인 당량이 10% 몰량의 N-아세틸-L-시스테인으로 대체되었음을 의미하고; N,N'-디아세틸-L-시스틴의 경우, 10%는 10 몰량의 시스틴 당량이 10% 몰량의 N,N'-디아세틸-L-시스틴으로 대체되었음을 의미한다. 14일의 배양 종료 시에, 세포 배양액을 원심 분리에 의해 수거하였다. 이어서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피(GE)를 사용하여 상등액을 정제하였다. 모세관 등전 집중법(ProteinSimple iCE3)을 이용한 전하 변이체 측정을 위해 단백질 L 용리액을 사용하였다.
[표 4]
Figure pct00013
[도 24]는 세포의 성장 프로파일을 보여준다. 대조군 조건(유사체가 첨가되지 않음)과 시험된 대부분의 조건 사이에서 유사한 생존 세포 농도 프로파일이 관찰되었다. 성장 억제는 90%의 N,N'-디아세틸-L-시스틴 및 90%의 N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르에서 관찰되었다.
[도 25 및 26]은 산성 종 및 주 전하 종 수준에서 N,N'-디아세틸-L-시스틴, N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르 또는 N-아세틸-시스틴의 상이한 시스테인/시스틴 대체 수준에 대해 반응을 나타낸다. N,N'-디아세틸-L-시스틴의 경우, 교체율이 증가함에 따라 산성 종 수준이 감소하여 최대 27.5% 감소에 도달한다. 미세 이질성의 이러한 감소는 주 전하 종 수준에서 관찰된 대조군과 대한 양(positive)의 차이에 의해 확인된다. N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르에서 최적의 주 전하 종 수준은 50% 내지 70%의 시스테인/시스틴 대체에서 수득되었다. 그러나 N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르는 맞춤 곡선에 따라 15% 내지 90%의 주 전하 종 수준에 긍정적인 영향을 미친다. 이 결과는 [도 25]에서 N,N'-디아세틸-L-시스틴 디메틸에스테르에서도 관찰된 산성 종 수준의 감소에 의해 확인된다. 12.5%의 산성 종의 감소와 함께 약 70%의 대체로 최적의 값을 갖는 N-아세틸-시스테인에서 더 낮은 영향이 관찰되었다.
SEQUENCE LISTING <110> UCB Biopharma SPRL <120> Cell Culture Methods <130> PF0128-WO-PCT <160> 11 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Val 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised <400> 2 Tyr Ile Asp Ser Asp Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Huminazed <400> 3 Gly Ile Val Arg Pro Phe Leu Tyr 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized <400> 4 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val Gly Ala Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized <400> 5 Leu Val Ser Thr Leu Asp Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized <400> 6 Leu Gln Gly Thr His Phe Pro His Thr 1 5 <210> 7 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val Gly Ala 20 25 30 Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Phe Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Asp Ser Gly Ile Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized <400> 8 Glu Val Pro Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Asp Ser Asp Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Gly Ile Val Arg Pro Phe Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser 115 <210> 9 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val Gly Ala 20 25 30 Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Phe Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Asp Ser Gly Ile Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 10 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized <400> 10 Glu Val Pro Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Asp Ser Asp Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Gly Ile Val Arg Pro Phe Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 11 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized <400> 11 Glu Val Pro Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Asp Ser Asp Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Gly Ile Val Arg Pro Phe Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220

Claims (20)

  1. 세포 배양에서 생산되는 재조합 단백질 집단의 이질성을 감소시키는 방법으로서, 하나 이상의 시스테인/시스틴 유사체를 포함하는 세포 배양 배지에서 재조합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 생산 공정의 종료시에 재조합 단백질의 역가를 실질적으로 감소시키지 않으면서, 상기 이질성의 감소를 얻으며, 상기 이질성의 감소는
    a. 색상 또는 색상 강도;
    b. 전하 이질성, 바람직하게는 산성 피크 그룹 종(APG) 및/또는 염기성 피크 그룹 종(BPG)을 감소시키고, 이로써 주 전하 종은 감소하지 않는 것; 및/또는
    c. 아미노산 산화, 바람직하게는 메티오닌 산화
    를 감소시키는 단계를 포함하는 것인 세포 배양에서 생산되는 재조합 단백질 집단의 이질성을 감소시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 시스테인/시스틴 유사체는 화학식 1 및 2로 나타내는 화합물로부터 선택된 하나 이상의 화합물 및 이의 염을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 방법:
    Figure pct00014

    식에서,
    R1, R2, R4 및 R5는 독립적으로 수소, 아미노 카르보닐, C2- 22아실, C1- 22알킬로서, 이 기는 히드록시 및 C1- 22알콕시로부터 선택된 1 또는 2개의 치환기로 선택적으로 치환되는 것; C1-22 헤테로알킬, 히드록시술포닐, C1- 22알킬술포닐, 또는 C5- 22아릴 술포닐을 나타내고;
    R3 및 R6은 독립적으로 히드록시; NH2; C1- 22알콕시로서, C1-22 알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 선택적으로 대체될 수 있는 것; C1-22 알킬아미노로서, 이 기는 히드록시 또는 C1-22 알킬로 선택적으로 치환되는 것; 히드록시 아미노; C1-22 알콕시 아미노; C1-22 알킬아미노로서, C1-22 알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체되는 것; C1- 22헤테로알킬아미노; 히드록시로 선택적으로 치환된 디(C1-22 알킬)아미노; 디(C1-22알킬)아미노로서, C1-22 알킬의 하나 이상의 탄소는 아릴 또는 헤테로아릴로 대체되는 것; 또는 디(C1-22헤테로알킬)아미노를 나타내고;
    R7은 수소, 포스페이트 또는 술페이트를 나타내고;
    L은 선택적으로 치환된 C1- 10알킬렌 쇄를 나타내고;
    단, 상기 화합물은 시스테인 또는 시스틴이 아니다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시스테인/시스틴 유사체는 N,N'-디아세틸-L-시스틴-디메틸에스테르, N-아세틸-L-시스테인 및 N,N'-디아세틸-L-시스틴, 또는 S-술포시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 시스테인/시스틴 유사체는 N,N'-디아세틸-L-시스틴-디메틸에스테르, N-아세틸-L-시스테인 및 N,N'-디아세틸-L-시스틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는
    (a) 시스테인/시스틴 유사체; 및
    (b) 시스테인 및/또는 시스틴
    을 포함하며,
    (a) 대 (b)의 몰비는 1:18 내지 18:1인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 방법은
    (i) 상기 숙주 세포를, 초기량의
    (a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
    (b) 시스테인 및/또는 시스틴
    을 선택적으로 포함하는 기본 배지에 접종하는 단계:
    (ii) 재조합 단백질이 세포에 의해 생산되는 생산 단계를 통해 배양을 진행시키는 단계로서, 상기 생산 단계 동안 세포 배양 배지에는
    (a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
    (b) 시스테인 및/또는 시스틴
    이 보충되는 것인 단계
    를 포함하며,
    (a) 및 (b)는 동시에 또는 순차적으로 첨가될 수 있고,
    기본 배지의 내용물 및 첨가된 총 보충물이 합산될 때, (a) 대 (b)의 몰비는 1:18 내지 18:1인 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 (a) 대 (b)의 몰비는 1:15 내지 15:1. 예를 들어 1:12 내지 12:1, 예컨대 1:10 내지 10:1, 예를 들어 1:8 내지 8:1, 예컨대 1:6 내지 6:1, 예를 들어 1:4 내지 4:1, 예컨대 1:3 내지 3:1, 예를 들어 1:2 내지 2:1, 예컨대 1.5:1 내지 1:1.5인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는
    (a) 시스테인/시스틴 유사체; 및
    (b) 시스테인 및/또는 시스틴
    을 포함하며,
    (a)의 몰량은 (a)와 (b)의 총 몰량을 고려하여 10 내지 90%이고, 시스테인 유사체가 사용되는 경우, (b)의 몰량은 시스테인 당량을 고려하여 계산되고,
    시스틴 유사체가 사용되는 경우, (b)의 몰량은 시스틴 당량을 고려하여 계산되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 방법은
    (i) 상기 숙주 세포를, 초기량의
    (a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
    (b) 시스테인 및/또는 시스틴
    을 선택적으로 포함하는 기본 배지에 접종하는 단계:
    (ii) 재조합 단백질이 세포에 의해 생산되는 생산 단계를 통해 배양을 진행시키는 단계로서, 상기 생산 단계 동안 세포 배양 배지에는
    (a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
    (b) 시스테인 및/또는 시스틴
    이 보충되는 것인 단계
    를 포함하며,
    (a) 및 (b)는 동시에 또는 순차적으로 첨가될 수 있고,
    기본 배지의 내용물 및 첨가된 총 보충물이 합산될 때, (a)의 몰량은 (a)와 (b)의 총 몰량을 고려하여 10 내지 90%이고, 시스테인 유사체가 사용되는 경우, (b)의 몰량은 시스테인 당량을 고려하여 계산되고,
    시스틴 유사체가 사용되는 경우, (b)의 몰량은 시스틴 당량을 고려하여 계산되는 것인 방법.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 기본 배지에서 (b)의 농도는 0.05 내지 5 mmol/L, 예컨대 0.1 내지 1 mmol/L, 예를 들어 0.2 내지 0.6 mmol/L의 시스테인에 해당하는 것인 방법.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생산 단계 동안, 배지에는 (a) 시스테인/시스틴 유사체 및 (b) 시스테인 및/또는 시스틴이 보충되며, 전체 생산 단계에 걸쳐 배양물에 첨가되는 (a)와 (b)의 합은 1 내지 75 mmol/L, 예컨대 2 내지 20 mmol/L의 시스테인에 해당하는 것인 방법.
  12. 제6항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생산 단계 동안, 배지에는 (a) 시스테인/시스틴 유사체 및 (b) 시스테인 및/또는 시스틴이 매일 보충되며, 매일 첨가에 의해 (a) + (b)의 농도는 0.05 내지 5 mmol/L, 예컨대 0.1 내지 1 mmol/L의 시스테인에 해당하는 농도가 되는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 바람직하게는 CHO 세포인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 재조합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    i) a. 서열 번호 1에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-H1; 서열 번호 2에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-H2; 서열 번호 3에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-H3; 서열 번호 4에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-L1; 서열 번호 5에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-L2 및 서열 번호 6에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 CDR-L3; 또는
    b. 서열 번호 7에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 8에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 또는
    c. 서열 번호 7에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 8에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 중쇄 가변 영역;
    d. 서열 번호 7에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 11에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄; 또는
    e. 서열 번호 7에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 11에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 중쇄
    를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는
    ii) 서열 번호 9에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 경쇄 및 서열 번호 10에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 또는
    iii) 서열 번호 9에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 경쇄 및 서열 번호 10에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 80% 동일성 또는 유사성, 바람직하게는 90% 동일성 또는 유사성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체
    인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 재조합 단백질은, 시스테인/시스틴 유사체를 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 배양된 숙주 세포에 의해 생산될 때 10 mg/ml 이상, 예컨대 50 mg/ml 이상의 농도에서 무색이 아닌 단백질인 방법.
  17. 재조합 단백질 제제의 제조 방법으로서,
    (i) 상기 숙주 세포를, 초기량의
    (a) 제2항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 명시된 바와 같은 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
    (b) 시스테인 및/또는 시스틴
    을 선택적으로 포함하는 기본 배지에 접종하는 단계:
    (ii) 재조합 단백질이 세포에 의해 생산되는 생산 단계를 통해 배양을 진행시키는 단계로서, 상기 생산 단계 동안 세포 배양 배지에는
    (a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
    (b) 시스테인 및/또는 시스틴
    이 보충되는 것인 단계
    를 포함하며,
    (a) 및 (b)는 동시에 또는 순차적으로 첨가될 수 있고,
    기본 배지의 내용물 및 첨가된 총 보충물이 합산될 때, (a) 대 (b)의 몰비는 1:18 내지 18:1인, 재조합 단백질 제제의 제조 방법.
  18. 재조합 단백질 제제의 제조 방법으로서,
    (i) 상기 숙주 세포를, 초기량의
    (a) 제2항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 명시된 바와 같은 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
    (b) 시스테인 및/또는 시스틴
    을 선택적으로 포함하는 기본 배지에 접종하는 단계:
    (ii) 재조합 단백질이 세포에 의해 생산되는 생산 단계를 통해 배양을 진행시키는 단계로서, 상기 생산 단계 동안 세포 배양 배지에는
    (a) 시스테인/시스틴 유사체; 및/또는
    (b) 시스테인 및/또는 시스틴
    이 보충되는 것인 단계
    를 포함하며,
    (a) 및 (b)는 동시에 또는 순차적으로 첨가될 수 있고,
    기본 배지의 내용물 및 첨가된 총 보충물이 합산될 때, (a)의 몰량은 (a)와 (b)의 총 몰량을 고려하여 10 내지 90%이고, 시스테인 유사체가 사용되는 경우, (b)의 몰량은 시스테인 당량을 고려하여 계산되고,
    시스틴 유사체가 사용되는 경우, (b)의 몰량은 시스틴 당량을 고려하여 계산되는 것인, 재조합 단백질 제제의 제조 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 따른 방법에 의해 수득 가능하거나 수득되는 재조합 단백질 제제.
  20. N,N'-디아세틸-L-시스틴-디메틸에스테르를 포함하는, 포유동물 세포를 배양하기에 적합한 세포 배양 배지.
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