KR20230042407A - 포유류 세포들에서 젖분비자극 활성의 조절 - Google Patents

포유류 세포들에서 젖분비자극 활성의 조절 Download PDF

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마사루 켄 시라토리
브래들리 리차드 스네데코어
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Abstract

본 발명은 관심 생성물, 예컨대, 재조합 단백질의 생성을 위한 방법, 세포 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 개선된 포유류 세포들을 제공하며, 이 때 세포들 (예컨대, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포들)은 조절된 젖분비자극 활성을 가진다. 본 발명은 또한 포유류 세포에서 피루베이트 키나아제 근육 (PKM) 발현 (예컨대, PKM-1 발현)을 조절하고, 이에 의해 상기 세포의 젖분비자극 활성을 감소 또는 제거하는 방법 및 조성물, 뿐만 아니라 감소 또는 제거된 젖분비자극 활성을 가지는 세포를 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

포유류 세포들에서 젖분비자극 활성의 조절{MODULATING LACTOGENIC ACTIVITY IN MAMMALIAN CELLS}
관련 출원들에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 3월 29일 출원된 미국 가특허출원 제 62/649,963호의 우선권의 이익을 주장하며, 이 문헌은 본 명세서에 그 전문이 참고문헌으로 포함된다.
서열 목록
본 명세서는 서열 목록을 포함하며, 이는 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 제출되었고 본 명세서에 전체가 참고로 포함된다. 2019년 3월 28일 생성된 상기 ASCII 복사본의 파일명은 00B206_0785_SL.txt이며 444,511 바이트 크기이다.
1. 발명의 분야
본 발명은 관심 생성물, 예컨대, 재조합 단백질의 생성 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유류 세포들에 관한 것으로, 이 때 세포들 (예컨대, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포들)은 조절된 젖분비자극 활성을 가진다. 본 발명은 또한 포유류 세포에서 피루베이트 키나제 근육 (PKM) 발현 (예컨대, PKM-1 발현)을 조절하여, 상기 세포의 젖분비자극 활성을 감소 또는 제거하는 방법 및 조성물, 뿐만 아니라 감소 또는 제거된 젖분비자극 활성을 가지는 하나 이상의 세포들을 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
2. 배경
중국 햄스터 난소 (CHO) 세포는 적절한 단백질 폴딩, 어셈블리 및 번역후 응용 능력으로 인해 임상 적용을 위한 치료용 단백질 생성에 널리 사용되어 왔다. 일반적으로 CHO 세포는 다른 불멸화된 세포주와 마찬가지로 포도당을 소모하는 경향이 있으며 Warburg 효과로 알려진 과정인 호기성 해당 과정을 통해 락테이트를 생성한다 (Warburg, 1956, Science 123(3191):309-14). 생성 배양물에 락테이트가 축적되면 세포 성장, 생존력 및 생산성에 악영향을 미칠 수 있다. 제조 과정 중 CHO 세포의 이러한 젖분비자극 거동 (즉, 락테이트 생성 거동)은 생존력과 생산성을 저하시키고 생성된 치료 단백질의 품질을 변화시킬 수 있다.
젖분비자극 CHO 세포주에서 락테이트 생성을 완화시키기 위한 공정 조건을 표적으로 하는 여러 접근법이 개발되었다. 예를 들면, 구리 수준을 최적화하는 것은 일부 CHO 세포주들에서 젖분비자극 거동을 방해함에 효과적인 것으로 나타났다 (Luo 외, 2012, Biotechnol. Bioeng. 109(1): 146-56; Xu 외, 2016, Bioprocess Biosyst. Eng. 39(11): 1689-702). 배양물에서 pH를 높임으로써 유발되는 제어된 영양소 공급을 포함하는 또 다른 접근법 (고-말단 pH-제어된 포도당 전달, 또는 HIPDOG) 또한 대규모 CHO 배양물에서 락테이트 축적을 감소 또는 제거함에 효과적인 것으로 나타났다 (Gagnon 외, 2011, Biotechnol. Bioeng. 108(6): 1328-37). 그러나, 전자의 접근법은 젖분비자극 CHO 세포주들 모두에 적용할 수 없고, 후자는 대규모 제작 공정을 복잡하게 할 수 있기 때문에, 이들 접근법들에는 한계가 있다. 더욱이, 이들 접근법들은 CHO 세포들에서 젖분비자극 거동의 기저 메커니즘을 표적하지 않는다.
그러므로, 세포 배양물에서 락테이트 생성을 감소시키는 기술들이 해당 분야에 필요하다.
3. 요약
본 발명은 관심 생성물, 예컨대, 재조합 단백질의 생성을 위한 방법, 세포 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 명세서에 기재된 방법, 세포 및 조성물들은 관심 생성물을 발현하는 개선된 포류유 세포들을 포함하며, 이 때 이러한 세포들 (예컨대, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포들)은 조절된 젖분비자극 활성을 가진다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물들은 포유류 세포들의 젖분비자극 활성을 조절하고, 그리하여 젖분비자극 활성과 관련된 바람직하지 않은 효과들, 예컨대, 포유류 세포들의 생존력 및 생산성 감소 그리고 생성된 관심 생성물의 질 변화를 감소 또는 제거한다.
본 발명은 또한 포유류 세포에서 피루베이트 키나제 근육 (PKM) 발현 (예컨대, PKM-1 발현)을 조절하고, 이에 의해 상기 세포의 젖분비자극 활성을 감소 또는 제거하는 방법 및 조성물, 뿐만 아니라 감소 또는 제거된 젖분비자극 활성을 가지는 세포 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
한 양상에서, 본 발명은 피루베이트 키나제 근육 (PKM) 폴리펩티드 동형, 또는 동형들의 발현이 녹다운 또는 녹아웃되어 있는, 젖분비자극 활성이 감소 또는 제거된 포유류 세포에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 녹아웃 또는 녹다운된 PKM 폴리펩티드 동형은 PKM-1 폴리펩티드 동형이다. 특정 구체예들에서, 녹아웃 또는 녹다운된 PKM 폴리펩티드 동형들은 PKM-1 폴리펩티드 동형 및 PKM-2 폴리펩티드 동형 모두이다. 특정 구체예들에서, 포유류 세포의 젖분비자극 활성은 참조 세포의 젖분비자극 활성의 약 50% 미만, 예컨대, 약 20% 미만이다. 특정 구체예들에서, 참조 세포는 PKM 유전자의 하나 이상의 야생형 대립유전자를 포함하는 세포이다, 예컨대, PKM 유전자의 대립유전자 모두는 야생형이거나 비변형된 것이다. 특정 구체예들에서, 포유류 세포의 젖분비자극 활성은 생산 단계의 14일차 또는 15일차에 결정된다. 특정 구체예들에서, 포유류 세포는 생산 단계 동안 약 1.0 g/L 미만 또는 약 2.0 g/L 미만의 락테이트를 생성한다, 예컨대, 진탕 플라스크에서 생산 단계 동안 약 1.0 g/L 미만 또는 약 2.0 g/L 미만의 락테이트를 생성한다. 특정 구체예들에서, 포유류 세포는 생물반응기에서 생산 단계 동안 약 2.0 g/L 미만의 락테이트를 생성한다. 본 발명은 서열 번호: 39-41로 구성된 그룹에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호: 37 및 38에 제시된 뉴클레오티드 서열들을 포함하는, PKM 유전자의 대립유전자를 포함하는 포유류 세포를 제공한다. 본 발명은 하나 이상의 세포들, 예컨대, 본 명세서에 개시된 포유류 세포들을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
특정 구체예들에서, 상기 포유류 세포는 관심 생성물을 인코드하는 핵산 서열을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 핵산 서열은 표적된 위치에서 상기 포유류 세포의 세포 게놈에 통합된다. 대안적으로 및/또는 추가적으로, 상기 관심 생성물을 인코드하는 핵산은 포유류 세포의 세포 게놈에 무작위로 통합된다. 특정 구체예들에서, 포유류 세포는 CHO 세포이다.
특정 구체예들에서, 관심 생성물은 단백질, 예컨대, 재조합 단백질을 포함한다. 특정 구체예들에서, 관심 생성물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 항체는 다중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 구체예들에서, 항체는 단일 중쇄 서열 및 단일 경쇄 서열 또는 이의 항원 결합 단편들로 구성된다. 특정 구체예들에서, 항체는 키메라 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체 및/또는 단클론 항체이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 세포에서 젖분비자극 활성의 감소 또는 제거 방법에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 상기 방법은 피루베이트 키나제 근육 (PKM) 폴리펩티드 동형의 발현을 녹다운 또는 녹아웃하는 것을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 방법은 상기 세포에 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하며, 이 때 유전자 조작 시스템은 피루베이트 키나제 근육 (PKM) 폴리펩티드 동형의 발현을 녹다운 또는 녹아웃시킨다. 특정 구체예들에서, 상기 유전자 조작 시스템은 CRISPR/Cas 시스템, 징크-핑거 핵산분해효소 (ZFN) 시스템, 전사 활성인자-유사 효과기 핵산분해효소 (TALEN) 시스템 및 이의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된다. 특정 구체예들에서, 상기 방법은 참조 세포의 젖분비자극 활성의 약 50% 미만, 예컨대, 약 20% 미만인 젖분비자극 활성을 가지는 세포를 생성한다. 특정 구체예들에서, 참조 세포는 PKM 유전자의 하나 이상의 야생형 대립유전자를 포함하는 세포이다, 예컨대, PKM 유전자의 대립유전자 모두는 야생형이거나 비변형된 것이다. 특정 구체예들에서, 상기 세포의 젖분비자극 활성은 생산 단계의 14일차 또는 15일차에 결정된다. 특정 구체예들에서, 상기 세포는 생산 단계 동안 약 1.0 g/L 미만 또는 약 2.0 g/L 미만의 락테이트를 생성한다, 예컨대, 진탕 플라스크에서 생산 단계 동안 약 1.0 g/L 미만 또는 약 2.0 g/L 미만의 락테이트를 생성한다. 특정 구체예들에서, 상기 세포는 생물반응기에서 생산 단계 동안 약 2.0 g/L 미만의 락테이트를 생성한다.
비-제한적 특정 구체예들에서, 본 발명에서 사용하기 위한 유전자 조작 시스템은 Cas9 분자, 및 PKM 유전자의 표적 서열에 상보적인 표적화 도메인을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA들 (gRNA들)을 포함하는, CRISPR/Cas9 시스템이다. 특정 구체예들에서, 상기 표적 서열은 다음으로 구성된 그룹에서 선택된다: PKM 유전자의 일부, PKM 유전자의 엑손 9에 연접하는 5' 인트론 영역, PKM 유전자의 엑손 9에 연접하는 3' 인트론 영역, PKM 유전자의 엑손 10에 연접하는 3' 인트론 영역, PKM 유전자의 엑손 1의 내부 영역, PKM 유전자의 엑손 2의 내부 영역, PKM 유전자의 엑손 12의 내부 영역 및 이의 조합. 특정 구체예들에서, 상기 하나 이상의 gRNA들은 PKM 유전자의 엑손 9에 연접한 5' 인트론 영역에 상보적인 표적 서열을 포함하는 제 1 gRNA 및 PKM 유전자의 엑손 9에 연접한 3' 인트론 영역에 상보적인 표적 도메인을 포함하는 제 2 gRNA를 포함한다. 특정 구체예들에서, 하나 이상의 gRNA들은 PKM 유전자의 엑손 2 내부의 영역에 상보적인 표적 서열을 포함하는 제 1 gRNA 및 PKM 유전자의 엑손 12 내부의 영역에 상보적인 표적 도메인을 포함하는 제 2 gRNA를 포함한다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 하나 이상의 gRNA들은 서열 번호: 33-34 및 42-43으로 구성된 그룹에서 선택된 서열, 및 이의 조합을 포함한다. 특정 구체예들에서, PKM 폴리펩티드 동형의 발현은 녹아웃 또는 녹다운되고, 세포에서 젖분비자극 활성은 제거된다. 특정 구체예들에서, PKM 폴리펩티드 동형은 PKM-1 폴리펩티드 동형 또는 PKM-1 및 PKM-2 폴리펩티드 동형들의 조합이다.
특정 구체예들에서, 본 발명에서 사용하기 위한 유전자 조작 시스템은 징크-핑거 핵산분해효소 (ZFN) 시스템 또는 전사 활성인자-유사 효과기 핵산분해효소 (TALEN) 시스템이다. 비-제한적 특정 구체예들에서, 상기 유전자 조작 시스템은 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 및 마이크로 RNA (miRNA)로 구성된 그룹에서 선택된 RNA를 포함하며, 이러한 RNA는 PKM 유전자에 의하여 발현되는 mRNA에 상보적이다. 특정 구체예들에서, 상기 PKM 유전자에 의해 발현되는 mRNA는 PKM-1 폴리펩티드 동형을 인코드한다. 특정 구체예들에서, PKM-1 폴리펩티드 동형의 발현은 녹다운되고, 상기 세포의 젖분비자극 활성은 감소된다. 특정 구체예들에서, 상기 유전자 조작 시스템은 shRNA, siRNA, 및 마이크로RNA miRNA로 구성된 그룹에서 선택된 제 2 RNA를 추가로 포함하며, 이러한 제 2 RNA는 PKM-2 폴리펩티드 동형을 인코드하는 PKM 유전자에 의해 발현되는 mRNA의 일부에 상보적이다. 특정 구체예들에서, PKM-1 및 PKM-2 폴리펩티드 동형들의 발현은 녹아웃 또는 녹다운되고, 상기 세포의 젖분비자극 활성은 감소된다.
한 추가 양상에서, 본 발명은, 예컨대, 본 명세서에 개시된 세포들로부터 관심 생성물을 제조하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 관심 생성물의 제조 방법은 포유류 세포들을 배양하여 관심 생성물을 생성하는 것을 포함하고, 이 때 포유류 세포들은 젖분비자극 활성이 감소 또는 제거되었다. 특정 구체예들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유류 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유류 세포들은 젖분비자극 활성이 감소 또는 제거되었다. 특정 구체예들에서, 젖분비자극 활성은 포유류 세포들에서 피루베이트 키나제 근육 (PKM) 폴리펩티드 동형의 발현의 녹다운 또는 녹아웃으로 인해 감소 또는 제거된다. 특정 구체예들에서, PKM 폴리펩티드 동형은 PKM-1 폴리펩티드 동형이다. 특정 구체예들에서, PKM-2 폴리펩티드 동형의 발현 또한 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 구체예들에서, 상기 방법은 상기 세포 배양물로부터 관심 생성물을 분리하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
4. 도면의 간단한 설명
도 1A-1F. mAb-1 세포주의 락테이트 수준은 PKM-1 수준과 직접적으로 상관관계가 있다. 저 및 고 락테이트 과정들하의 mAb-1 세포주에서 퍼센트 세포 생존력 (도 1A), 14일차 역가 (도 1B), 및 락테이트 수준 (도 1C). (도 1D) 저 및 고 락테이트 과정들하에서의 생산 동안 상이한 일차에서 mAb-1 세포 용해물들의 PKM-1 및 PKM-2 웨스턴 블롯 분석. 부하 대조군으로서 액틴이 사용되었다. 액틴에 대해 정규화된, 상대 PKM-1 (도 1E) 및 PKM-2 (도 1F) 수준의 정량화.
도 2A-2F. mAb-2 세포주의 락테이트 수준은 PKM-1 수준과 직접적으로 상관관계가 있다. 저 및 고 락테이트 과정들하의 mAb-2 세포주에서 퍼센트 세포 생존력 (도 2A), 14일차 역가 (도 2B), 및 락테이트 수준 (도 2C). (도 2D) 저 및 고 락테이트 과정들하에서의 생산 동안 상이한 일차들에서 mAb-2 세포 용해물들의 PKM-1 및 PKM-2 웨스턴 블롯 분석. 부하 대조군으로서 액틴이 사용되었다. 액틴에 대해 정규화된, 상대 PKM-1 (도 2E) 및 PKM-2 (도 2F) 수준들의 정량화.
도 3A-3E. CHO 세포는 PKL/R 효소를 발현하지만 이러한 효소의 수준은 생성 배양물에서의 락테이트 수준과 관련이 없다. (도 3A) 2개의 상이한 CHO 숙주 세포주 (K1 및 DHFR -/-) 및 인간 293 세포들에서 PKL/R 단백질들의 세포내 발현의 웨스턴 블롯 분석. 액틴은 부하 대조군으로 사용된다. (도 3B 및 3C) mAb-1 (도 3B) 및 mAb-2 (도 3C) 세포주들의 저 및 고 락테이트 생성 과정들 동안 상이한 일차에서 PKL/R의 세포내 단백질 수준. (도 3D 및 3E) mAb-1 (도 3D) 및 mAb-2 (도 3E) 세포주들에서 액틴에 대해 정규화된, 상대 PKL/R 수준들의 정량화.
도 4A-4C. PKM-1의 생성은 세포주들을 녹아웃시킨다. (도 4A) mAb-2 세포주에서 엑손-9의 결실을 평가하는데 사용되는 PKM 유전자의 엑손 8-10 및 gRNA 스크리닝 프라이머들에 관한 개략도. PKM 유전자의 엑손 9에 연접한 2개의 gRNA들을 Cas9 트랜스진으로 공동-형질감염시켜 엑손 9 결실을 유도하였다. 형질감염된 세포들을 단일 세포 클로닝하였다. 상기 결실 영역에 연접한 PCR 프라이머들을 사용하여 PKM 대립유전자(들)에서 엑손-9가 성공적으로 결실된 세포주들을 스크리닝하였다. (도 4B) 야생형 (WT) mAb-2 세포들 그리고 gRNA들 및 Cas9 트랜스진을 통해 엑손-9가 표적화 결실된 세포주들을 PCR 프라이머들을 스크리닝하여 분석하였다. 상부 띠는 WT PKM 대립유전자(들)을 나타내는 반면 하부 띠는 엑손 9 결실된 PKM 대립유전자(들)을 나타낸다. KO: 녹아웃 세포주, HET: 이형접합 세포주. (도 4C) 표적화된 세포주들에서 엑손-9 KO 대립유전자(들)과 대비한 PKM WT 대립유전자의 서열 비교. KO-15 세포주는 표적화된 PKM 대립유전자(들)에서 엑손-9의 5' 영역에서 의도한 것보다 더 큰 (122 bp만큼) 결실을 보유함을 유의하라.
도 5A-5H. PKM-1 발현의 제거 또는 감소는 고-락테이트 과정하에서도 mAb-2 세포주의 젖분비자극 거동들을 방지하였다. AMBR15 생물반응기를 사용하여 14-일 유가식 생성 분석동안 WT 그리고 PKM-1 HET 및 KO mAb-2 세포주의 생존가능 세포수 (도 5A), 퍼센트 세포 생존력 (도 5B), 14일차 역가 (도 5C), 14일차 비생산성 (specific productivity) (도 5D), 및 락테이트 수준 (도 5E). 과정 제어는 도 2의 고 락테이트 과정에서와 동일하였다. (도 5F) 제시된 세포주들의 세포 용해물들의 PKM-1 및 PKM-2 단백질들에 대한 웨스턴 블롯 분석. 액틴은 부하 대조군으로 사용된다. (도 5G 및 5H) 제시된 세포주들로부터의 mAb-2의 퍼센트 응집 (도 5G) 및 퍼센트 전하 변이체 (도 5H)를 비롯한 항체 생성물 품질.
도 6A-6G. 젖분비자극 거동은 세포 나이 또는 해동 이후 여부에 관계없이 PKM-1 KO 또는 HET mAb-2 세포주들에서, 고-락테이트 과정을 사용하여 방지 또는 감소되었다. AMBR15 생물반응기를 사용한 14-일 유가식 생성 분석에서, 어린 세포 나이에서 제시된 세포주들의 생존가능 세포수 (도 6A), 퍼센트 세포 생존력 (도 6B), 14일차 역가 (도 6C), 14일차 비생산성 (도 6D), 및 락테이트 수준 (도 6E). (도 6F 및 6G) 제시된 세포주들로부터의 mAb-2의 퍼센트 응집 (도 6F) 및 퍼센트 전하 변이체 (도 6G)를 비롯한 항체 생성물 품질. 과정 제어는 도 5에서와 동일하였다. 오차 막대는 4개의 각 실험들로부터의 표준 오차를 나타낸다.
도 7. PKM 및 PKM-1 KO 숙주 세포주들로부터 유래된 MAb-3 생산 풀은 비등하거나 보다 높은 Qp 및 역가를 가졌으나, 성장은 보다 낮았다 (진탕 플라스크 생산에서).
도 8A-8B. 진탕 플라스크 생산에서 PKM 및 PKM-1 KO 숙주 세포주들로부터 유래한 MAb-3 생산 풀은 보다 낮은 락테이트를 생성하였으나 (도 8A), 포도당을 보다 많이 소모하였다 (도 8B).
도 9A. 진탕 플라스크 생산에서 PKM 및 PKM-1 KO 숙주 세포주로부터 유래된 MAb-3 생산 풀은 상이한 아미노산 합성/소모율을 나타냈다.
도 9B. 직사각형으로 둘러싸인 막대와 경로는 PKM KO 숙주 세포주가 3-포스포글리세레이트를 축적했음을 보여준다.
도 9C. 직사각형으로 둘러싸인 막대와 경로는 WT 숙주 세포주가 피루베이트를 축적했음을 보여준다.
도 9D. 직사각형으로 둘러싸인 막대와 경로는 PKM-1 KO 숙주 세포주가 TCA 회로 생성물인 알파-케토글루타레이트 (a-KG)를 축적했음을 보여준다.
도 9E. 직사각형으로 둘러싸인 막대와 경로는 PKM-1 KO 숙주 세포주가 TCA 회로 생성물인 옥살로아세테이트를 축적했음을 보여준다.
도 10. 포도당, 락테이트 및 아미노산의 숙주 세포 특이적 소모 또는 생성.
도 11. PKM 및 PKM-1 KO 숙주 세포주들로부터 유래된 MAb-3 생산 풀은 진탕 플라스크 생산에서 상이한 당화 프로파일을 나타냈다. PKM KO 숙주는 갈락토실화를 감소시켰고, PKM KO 및 PKM-1 KO 숙주 세포주들은 푸코실화를 약간 감소시켰다.
5. 상세한 설명
명확성을 위해 (그러나 제한은 아님), 본 명세서에 개시된 주제의 상세한 설명을 다음과 같은 하위섹션들로 나눈다:
5.1 정의;
5.2 PKM 발현 조절;
5.3 젖분비자극 활성이 감소 또는 제거된 세포들;
5.4 세포 배양 방법;
5.5 생성물;
5.6 예시적 구체예들.
5.1 정의
본 명세서에서 사용된 용어는 일반적으로 본 발명의 내용에서 그리고 각 용어가 사용되는 특정 문맥에서 당해 분야의 통상적인 의미를 갖는다. 특정 용어는 명세서의 구성 및 방법을 설명하고, 이를 작성하고 사용하는 방법에 대해 숙련된 기술자에게 추가 지침을 제공하기 위해 아래 또는 다른 곳에서 논의된다.
본원에서 사용되는 단어 "하나 (a 또는 an)"의 사용은, 청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용될 때, "하나 (one)"를 의미할 수 있으나 이는 또한 "하나 이상의", "적어도 하나" 및 "하나 또는 이상"의 의미와 동일하다.
본원에서 사용되는 용어 "포함하다", "비롯하다", "가지는", "가지다", "~ 수 있다", "내포하다" 및 이의 변화형들은, 추가적인 작용 또는 구조 가능성을 배제하지 않는 열린 말단의 변이형 어구들, 용어들 또는 단어들인 것으로 한다. 본 발명은 또한 명시적으로 제시되었는지 여부와 관계없이, 본 명세서에 제시된 구체예들 또는 요소들 "을 포함하는", "로 구성된" 및 "로 본질적으로 구성된" 다른 구체예들을 고려한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "젖분비자극 거동" 또는 "젖분비자극 활성"은 세포, 예를 들면, 호기성 해당과정을 통해 포도당을 소모하여 락테이트를 생성함에 의한, 세포의 락테이트 생성 활성을 지칭한다. 특정 구체예들에서, 세포의 젖분비자극 활성은 세포 배양 배지에서 축적된 락테이트의 수준에 의해 측정될 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 해당 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 결정된 특정 수치에 대해 허용가능한 오차 범위 내에 있음을 의미하며, 이는 부분적으로 그 수치가 어떻게 측정 또는 결정되는지, 즉, 측정 시스템의 한계에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, "약"은 해당 기술 분야의 실제에 따르면 3 또는 3 초과의 표준 편차 이내임을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 수치의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 더욱 바람직하게는 최대 5%, 그리고 더욱 바람직하게는 또한 최대 1% 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정들과 관련하여, 이 용어는 하나의 값의 바람직하게는 5-배 이내, 그리고 더욱 바람직하게는 2-배 이내의 자리수에 속함을 의미할 수 있다.
용어 "세포 배양 배지"및 "배양 배지"는 일반적으로 다음 범주 중 하나 이상으로부터 적어도 하나의 성분을 제공하는 포유류 세포 성장에 사용되는 영양 용액을 지칭한다:
1) 일반적으로 포도당과 같은 탄수화물 형태의 에너지원;
2) 모든 필수 아미노산, 일반적으로 20개의 기본 아미노산과 시스테인;
3) 저 농도로 필요한 비타민 및/또는 기타 유기 화합물;
4) 유리 지방산; 및
5) 미량 원소, 여기서 미량 원소는 일반적으로 마이크로 몰 범위의 매우 낮은 농도로 일반적으로 필요한 무기 화합물 또는 자연 발생 원소로 정의된다.
영양 용액은 선택적으로 다음 범주들 중 하나 이상의 성분들으로 보충 될 수 있다:
1) 예를 들어 인슐린, 트랜스페린 및 표피 성장 인자와 같은 호르몬 및 기타 성장 인자;
2) 예를 들어, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트와 같은 염 및 완충제;
3) 예를 들어, 아데노신, 티미딘 및 하이포잔틴과 같은 뉴클레오시드 및 염기; 그리고
4) 단백질 및 조직 가수분해물.
세포 "배양"은 세포의 생존 및/또는 성장 및/또는 증식에 적합한 조건하에서 세포를 세포 배양 배지와 접촉시키는 것을 지칭한다.
"회분식 배양"은 세포 배양을 위한 모든 성분 (세포 및 모든 배양 영양소 포함)이 배양 과정 시작시 배양 생물반응기에 공급되는 배양을 의미한다.
본원에서 사용되는 "유가식 세포 배양"은 세포들 및 배양 배지가 초기에 배양 생물반응기에 공급되고, 배양 과정 동안 추가 배양 영양소가, 연속하여 또는 별개의 증분으로 배양물에 공급되고, 배양 종료 전 주기적 세포 및/또는 생성물을 수확하거나 수확하지 않는, 회분식 배양을 지칭한다.
때때로 연속 배양으로 지칭되는 "관류 배양"은 이에 의해 세포들이 예컨대, 여과, 캡슐화, 마이크로담체에 대한 고정, 등에 의하여 배양물에서 억제되고 배양 배지가 연속으로, 단계적으로 또는 간헐적으로 도입되고 (또는 이드르이 조합) 배양 생물반응기로부터 제거되는 배양이다.
본원에서 사용되는 용어 "세포"는 동물 세포들, 포유류 세포들, 배양된 세포들, 숙주 세포들, 재조합 세포들 및 재조합 숙주 세포들을 지칭한다. 이러한 세포들은 적절한 영양소 및/또는 성장 인자들을 내포하는 배지에 배치될 때 성장하고 생존할 수 있는 포유류 조직들로부터 얻거나 유래된 세포주들이다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물(culture)"은 호환적으로 이용되며, 외인성 핵산이 도입되어 있는 세포를 지칭하고 이러한 세포들의 자손을 포함한다. 숙주 세포들은 "형질전환체 (transformants)"와 "형질전환된 (transformed) 세포들"이 포함되는데, 이들은 계대의 수와 무관하게, 1차 형질전환된 세포와 이로부터 유도된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어서 부모계 세포와 완벽하게 동일할 필요는 없으며, 돌연변이를 포함할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에 대하여 선별된 또는 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 보유한 돌연변이 자손이 본 명세서에 포함된다.
용어 "포유류 숙주 세포"또는 "포유류 세포"는 적절한 영양분 및 성장 인자를 함유하는 배지에서 단층 배양 또는 현탁 배양에 배치 될 때 성장 및 생존 할 수 있는 포유동물로부터 유래된 세포주를 지칭한다. 특정 세포주에 필요한 성장 인자는 Mammalian Cell Culture (Mather, J. P. ed., Plenum Press, N.Y. 1984), 및 Barnes and Sato, (1980) Cell, 22:649에 설명된 바와 같이 과도한 실험없이 경험적으로 용이하게 결정된다. 전형적으로, 세포는 배양 배지 내로 관심있는 특정 단백질, 예를 들어, 당단백질을 대량으로 발현하고 분비 할 수 있다. 본 발명의 내용에 속하는 적합한 포유류 숙주 세포들의 예들은 중국 햄스터 난소 세포들/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 1980); dp12.CHO 세포들 (EP 307,247 1989년 3월 15일 공개); CHO-K1 (ATCC, CCL-61); SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통; 인간 배아 신장 계통 (현탁액 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포들, Graham 외, J. Gen Virol., 36:59 1977); 새끼 햄스터 신장 세포들 (BHK, ATCC CCL 10); 마우스 정소 세포들 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 1980); 원숭이 신장 세포들 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포들 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포들 (HELA, ATCC CCL 2); 개과 신장 세포들 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포들 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포들 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포들 (Hep G2, HB 8065); 마우스 포유류 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포들 (Mather 외, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 1982); MRC 5 세포들; FS4 세포들; 및 인간 간암 계통 (Hep G2)을 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 포유류 세포들은 중국 햄스터 난소 세포들/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 1980); dp12.CHO 세포들 (1989년 3월 15일 공개된 EP 307,247)을 포함한다.
본 발명의 내용에서 용어 "펩톤"은 본질적으로 가수분해된 동물 단백질인 배지 보충물을 지칭하는 것을 의미한다. 이 단백질의 공급원은 도축장, 정제된 젤라틴 또는 식물 재료의 동물 부산물 일 수 있다. 단백질은 일반적으로 산, 열 또는 다양한 효소 제제를 사용하여 가수 분해된다.
세포 배양물의 "성장 단계"는 세포들이 일반적으로 급속하게 분열중인 지수적 세포 성장 기간 (로그기)를 지칭한다. 세포들이 성장 단계에서 유지되는 시기는 예를 들면, 세포-유형, 세포들의 성장율 및/또는 배양 조건에 기초하여 달라질 수 있다. 특정 구체예들에서, 이러한 성장 단계동안, 세포들은 일정 시기 동안, 일반적으로 1-4 일, 그리고 세포 성장이 최대화되는 조건하에서 배양된다. 숙주 세포에 대한 성장주기의 결정은 과도한 실험없이 계획된 특정 숙주 세포에 대해 결정될 수 있다. "시기 및 세포 성장이 최대화되는 조건하에서" 등은, 특정 세포주에 대해, 세포 성장 및 분열에 최적인 것으로 결정되는 배양 조건들을 지칭한다. 특정 구체예들에서, 성장 단계 동안, 세포들은 특정 세포주에 대해 최적의 성장이 구현되도록 일반적으로 약 30°-40°C의 가습되고 제어된 대기에서 필요한 첨가제들을 함유하는 영양 배지에서 배양된다. 특정 구체예들에서, 세포들은 약 1일 내지 4일, 일반적으로 2 내지 3일의 기간 동안 성장 단계에서 유지된다.
세포 배양의 "전이기"는 생산 단계의 배양 조건이 관여하는 시기를 지칭한다. 전이기 동안 세포 배양 온도, 배지 삼투압 등과 같은 환경 요인은 성장 조건에서 생산 조건으로 이동된다.
세포 배양물의 "생산 단계"는 세포 성장이 정체되는/정체되었던 중의 시기를 지칭한다. 로그 세포 성장은 통상적으로 이러한 시기 이전 또는 도중에 감소하며 단백질 생산이 이어진다. 생산 단계 동안, 로그 세포 성장은 종료되었고, 단백질 생산이 일순위가 된다. 이러한 시기 동안 배지는 일반적으로 지속적인 단백질 생산을 지원하고 원하는 당단백질 생성물을 구현하기 위해 보충된다. 유가식 및/또는 관류 세포 배양 과정은 원하는 세포 밀도, 생존력 및 또는 재조합 단백질 산물 역가를 달성 및/또는 유지하기 위해 이 단계 동안 세포 배양 배지를 보충하거나 새로운 배지를 제공한다. 생산 단계는 대규모로 수행될 수 있다.
용어 "발현" 또는 "발현하다"는 숙주 세포 내에서 발생하는 전사 및 번역을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 숙주 세포에서 생성물 유전자의 발현 수준은 세포에 존재하는 상응하는 mRNA의 양 또는 세포에 의해 생성되는 생성물 유전자에 의해 인코드되는 단백질의 양에 기초하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 생성물 유전자로부터 전사된 mRNA는 바람직하게는 노던 혼성화에 의해 정량화된다. Sambrook 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 7.3-7.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). 생성물 유전자에 의해 인코드된 단백질은, 단백질의 생물학적 활성을 분석하거나 이러한 활성과 무관한 분석법, 가령, 단백질과 반응 할 수 있는 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅 또는 방사면역분석법을 사용하여 정량화 될 수 있다. Sambrook 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 18.1-18.88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
본원에 사용된 "폴리펩티드"는 일반적으로 약 10개 이상의 아미노산을 보유하는 펩티드 및 단백질을 지칭한다. 이러한 폴리펩티드는 숙주 세포에 상동성일 수 있거나, 또는 바람직하게는, 외인성일 수 있으며, 이는 이용되는 숙주 세포에 대해 이종, 즉, 외래임, 가령, 중국 햄스터 난소 세포에 의해 생성된 인간 단백질, 또는 포유류 세포에 의해 생성된 효모 폴리펩티드임을 의미한다. 특정 구체예들에서, 포유동물 폴리펩티드 (원래 포유동물 유기체로부터 유래된 폴리펩티드), 보다 바람직하게는 배지로 직접 분비되는 폴리펩티드가 사용된다.
용어 "단백질"은 사슬 길이가 보다 높은 수준의 3차 및/또는 4차 구조를 생성하기에 충분한 아미노산 서열을 지칭함을 의미한다. 이는 이러한 구조를 갖지 않는 "펩티드" 또는 기타 저분자량 약물과 구별하기 위한 것이다. 전형적으로, 본원의 단백질은 적어도 약 15-20 kD, 바람직하게는 적어도 약 20 kD의 분자량을 가질 것이다. 본원의 정의에 포함되는 단백질의 예는 모든 포유동물 단백질, 특히 치료 및 진단 항체와 같은 치료 및 진단 단백질, 및 일반적으로 하나 이상의 이황화 결합을 포함하는 단백질을 포함하며, 하나 이상의 사슬간 및/또는 사슬내 이황화 결합을 포함하는 다중 사슬 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 단클론 항체, 다클론 항체, 단일특이적 항체 (예를 들어, 단일 중쇄 서열 및 단일 경쇄 서열로 구성된 항체, 이러한 쌍의 다량체 포함), 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 다양한 항체 구조를 포함한다.
본원에서 사용되는 "항체 단편", 항체의 "항원 결합 부분" (또는 간단히 "항체 부분") 또는 항체의 "항원-결합 단편"은, 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자 (예컨대, scFv, 및 scFab); 단일 도메인 항체들 (dAbs); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 항체 단편들에 대한 검토는, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)를 참고한다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 출처 또는 종으로부터 유래되지만, 중쇄 및/또는 경쇄의 잔부는 상이한 출처 또는 종들로부터 유래한 항체를 지칭한다.
항체의 "클래스(class)"란 항체의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체에는 5 가지 주요 클래스가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들중 몇 가지는 하위클래스(동형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더 세분될 수 있다. 특정 구체예들에서, 항체는 IgG1 동형의 항체이다. 특정 구체예들에서, 항체는 IgG2 동형의 항체이다. 상이한 면역글로불린 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 차례로 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 2가지 유형 소위 카파 (
Figure pat00001
) 및 람다 (
Figure pat00002
) 중 하나로 지정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "역가"는 세포 배양에 의해 생성된 재조합적으로 발현된 항체의 총량을 주어진 양의 배지 부피로 나눈 것을 지칭한다. 역가는 통상적으로 배지 밀리리터 또는 리터 당 항체 밀리그램의 단위 (mg/ml 또는 mg/L)로 표현된다. 특정 구체예들에서, 역가는 배지 리터 당 항체의 그램으로 표현된다 (g/L). 역가는 상이한 배양 조건하에서 단백질 생성물을 얻는 것과 비교했을 때 역가의 백분율 증가와 같은 상대적 측정값의 관점에서 표현되거나 평가 될 수 있다.
용어 "핵산", "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 각 뉴클레오티드는 염기, 특히 퓨린- 또는 피리미딘 염기 (즉, 시토신 (C), 구아닌 (G), 아데닌 (A), 티민 (T) 또는 우라실 (U)), 당 (즉, 데옥시리보스 또는 리보스) 및 포스페이트 기로 구성된다. 종종, 핵산 분자는 염기 서열로 기술되며, 이 염기 서열은 핵산 분자의 1차 구조 (선형 구조)를 나타낸다. 염기 순서는 일반적으로 5'으로부터 3'으로 제시된다. 본원에서, 용어 핵산 분자는, 예컨대, 상보적 DNA (cDNA) 및 게놈 DNA를 비롯한 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 특히, 전령 RNA (mRNA), DNA 또는 RNA의 합성 형태들, 그리고 둘 이상의 이러한 분자들을 포함하는 혼합 중합체를 포함한다. 핵산 분자는 선형 또는 원형일 수 있다. 또한, 핵산 분자라는 용어는 센스 및 안티센스 가닥 모두, 뿐만 아니라 단일 가닥 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 더욱이, 본원에 기재된 핵산 분자는 자연 발생 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 포함 할 수 있다. 비-자연 발생 뉴클레오티드의 예에는 유도된 당 또는 포스페이트 골격 연결부 또는 화학적으로 변형된 잔기가 있는 변형된 뉴클레오티드 염기가 포함된다. 핵산 분자는 또한 시험관내 및/또는 생체내, 예를 들어, 숙주 또는 환자에서 본 발명의 항체의 직접 발현을 위한 벡터로 적합한 DNA 및 RNA 분자를 포함한다. 이러한 DNA (예컨대, cDNA) 또는 RNA (예컨대, mRNA) 벡터는 비변형 또는 변형 될 수 있다. 예를 들면, mRNA는 RNA 벡터의 안정성 및/또는 인코드된 분자의 발현을 개선하기 위하여 화학적으로 변형될 수 있으며, 이러한 mRNA는 대상체에 주사되어 생체내에서 항체를 생성할 수 있다 (예컨대, 2017년 6월 12일 온라인으로 공개된 Stadler 외, Nature Medicine 2017, doi:10.1038/nm.4356 또는 EP 2 101 823 B1 참고).
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 이것에 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다.
용어 "하이브리도마"는 면역학적 기원의 불멸 세포주와 항체 생산 세포의 융합에 의해 생성된 하이브리드 세포주를 지칭한다. 이 용어는 인간 세포들과 쥐과 골수종 세포주의 융합, 그리고 후속적으로 형질 세포와 융합되어 생성되며, 통상적으로 트리오마 세포주로 공지되어 있는 이종하이브리드 골수종 융합물의 자손을 포함한다. 또한, 이 용어는 예를 들어 쿼드로마와 같은 항체를 생산하는 불멸화 하이브리드 세포주를 포함하고자 한다. 예컨대, Milstein 외, Nature, 537:3053 (1983) 참고.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 이용하여 비-인간 출처로부터 유도된 항체의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체이다. 인간 항체의 정의에서 특히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외한다.
"인간화" 항체는 비인간 CDR들로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR들로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 양상들에 있어서, 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나의, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함하는데, 이 때, CDR들의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 비-인간 항체에 대응하며, FR들의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화된 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체의 "인간화된 형태", 가령, 비-인간 항체는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변적이고, 항원 결합 특이성을 결정하는 항체 가변 도메인 영역들 각각, 예를 들면, "상보성 결정 영역들" ("CDR들")을 지칭한다.
일반적으로, 항체들은 6개의 HVR: VH에 3개 (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3), 및 VL에 3개 (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)를 포함한다. 본원에서 예시적인 CDR들은 다음을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에서 나타나는 초가변 루프 (Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에서 나타나는 CDR (Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); 및
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에서 나타나는 항원 접촉부 (MacCallum 외 J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)).
달리 지시되지 않는 한, CDR들은 상기 Kabat 외의 문헌에 따라 결정된다. 당업자는 CDR 표시가 또한 상기 Chothia, 상기 McCallum의 문헌, 또는 임의의 다른 과학적으로 허용되는 명명법에 따라 결정될 수 있음을 이해할 것이다.
"면역접합체"는, 비제한적으로 세포독성제를 포함한, 하나 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 항체이다.
본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 획득된 항체를 말하는데, 가령, 개별 항체는 동일한 집단 및/또는 같은 에피토프에 결합하는 집단을 포함하는데, 다만, 변이체 항체, 가령, 자연 발생적 돌연변이 또는 단클론 항체 제재를 만드는 동안 발생되는 돌연변이를 가진 변이체 항체 가능성이 있으며, 이러한 변이체들은 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정부위(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 통상적으로 포함하는 다클론 항체 제제와 반대로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정부위에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "단클론(monoclonal)"은 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본원에 개시된 발명에 따른 단클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법 그리고 인간 면역 글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 포함하는 유전자삽입 동물을 이용하는 방법들을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 기술에 의해 제조 될 수 있으며, 이러한 방법 및 단클론 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법이 본 명세서에 기재되어 있다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 말한다. 고유 항체의 중쇄와 경쇄 (차례로 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역들 (FR들)과 3개의 상보성 결정 영역 (CDR들)을 포함한다. (예컨대, Kindt 외. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91 페이지 (2007).참고) 단일 VH 또는 VL 도메인은 충분히 항원-결합 특이성을 부여할 수 있다. 더욱이, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크린하기 위하여 항원에 결합하는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 분리될 수 있다. 예컨대, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 외, Nature 352:624-628 (1991)을 참고하라.
본원에서 사용되는 용어 "세포 밀도"는 주어진 부피의 배지에서의 세포수를 지칭한다. 특정 구체예에서, 높은 세포 밀도는 더 높은 단백질 생산성으로 이어질 수 있다는 점에서 바람직하다. 세포 밀도는 배양물에서 샘플을 추출하고, 상업적으로 이용가능한 세포 계수 장치를 사용하거나 생물 반응기 자체에 (또는 배지와 부유 세포가 통과 한 다음 생물 반응기로 되돌아가는 루프에) 도입되는 상업적으로 이용가능한 적합한 프로브를 사용하여 현미경으로 세포를 분석하는 것을 포함하는 (그러나 이에 제한되지 않는) 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해 모니터링 될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "씨딩"은 생산 단계 초기에 배양 배지에 성장 세포를 첨가 또는 접종하는 것을 지칭한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "씨드 트레인"은 세포주의 유지를 위한 약 20L 이하의 배양 배지 부피에서의 연속적 세포 계대를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 세포"는 이들이 유래되는 원래의 모세포로부터 일부 유전적 변형을 갖는 세포를 지칭한다. 이러한 유전적 변형은 유전자 산물, 예를 들어 재조합 단백질을 발현시키기 위한 이종 유전자 도입의 결과 일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 단백질"은 일반적으로 항체를 비롯한 펩티드 및 단백질을 지칭한다. 이러한 재조합 단백질은 "이종", 즉, CHO 세포들에 의해 생성되는 항체와 같이, 이용될 숙주 세포에 대해 외인성이다.
본원에서 사용되는 "PKM 폴리펩티드"는 PKM 유전자에 의해 인코드되는 폴리펩티드를 지칭한다. PKM 폴리펩티드는 PKM-1 폴리펩티드 동형 및/또는 PKM-2 폴리펩티드 동형을 포함한다.
5.2 PKM 발현 조절
해당작용은 포유류 세포, 예를 들어, CHO 세포가 에너지를 생성하기 위해 사용하는 포도당 대사 과정이다. 해당작용은 고 또는 저 플럭스 상태에서 발생할 수 있다. 포도당 수준에 대한 세포 반응과 이러한 플럭스 상태들 간의 전환은 해당 경로에 존재하는 효소들의 수준과 조합, 그리고 세포주들에 따라 달라질 수 있다 (Mulukutla 외, 2014, PLoS One 9(6):e98756). 통상의 배양 조건하에서, CHO 세포는 다른 불멸화된 세포주와 마찬가지로 포도당을 소모하는 경향이 있으며 Warburg 효과로 알려진 과정인 호기성 해당 과정을 통해 락테이트를 생성한다 (Warburg, 1956, Science 123(3191):309-14). 생성 배양물에 락테이트가 축적되면 세포 성장, 생존력 및 생성성에 악영향을 미칠 수 있다. 따라서 세포 배양 생산 단계에서 락테이트 축적으로 인한 바람직하지 않은 결과를 방지하기 위해 세포 에너지 플럭스 및 대사의 조절이 활용 될 수 있다 (Mulukutla 외, 2010, Trends Biotechnol. 28(9):476-84; Luo 외, 2012, Biotechnol. Bioeng. 109(1): 146-56; Ahn and Antoniewicz, 2012, Biotechnol. J. 7(1):61-74).
해당 과정의 마지막 단계는 포스포엔올피루베이트 (PEP)를 피루베이트로 전환하는 것을 포함하며, 이는 피루베이트 키나제 (PK) 효소에 의해 매개된다. PK의 4가지 다른 동형들이 확인된 바 있다: PK 간 (PKL), PK 적혈구 (PKR), PK 근육 1 (PKM-1) 및 PK 근육 2 (PKM-2). PK 효소들은 PKLR과 PKM이라는 두 가지 다른 유전자들에 의해 발현된다. 대체 엑손 스플라이싱은 상이한 PK 동형들을 생성한다. PKLR 유전자의 mRNA 전사체에 엑손 1과 2가 모두 존재하면 PKR 단백질이 발현되는 반면, 엑손 2로 시작하는 mRNA 전사체는 PKL 단백질이 발현된다. PKM 유전자 전사체에서 엑손 9 또는 10의 대체 스플라이싱은 각각 PKM-1 또는 PKM-2를 생성한다. 구체적으로, PKM-1은 PAM 유전자의 엑손 9를 포함하고 엑손 10을 제외시키며, PKM-2는 PKM 유전자의 엑손 10을 포함하고 엑손 9를 제외시킨다. 조직 특이적 프로모터, 전사 인자 및 대체 스플라이싱은 서로 다른 조직 및 세포주에서 이러한 동형들의 발현을 조절한다 (Chaneton and Gottlieb, 2012, Trends. Biochem. Sci. 37(8):309-16; Israelsen and Vander Heiden, 2015, Semin Cell Dev Biol 43:43-51; Mazurek, 2011, Int. J. Biochem. Cell Biol 43(7):969-80; Harada 외, 1978, Biochim. Biophys. Acta. 524(2):327-39; Noguchi 외, 1986, J. Biol. Chem. 261(29): 13807-12; Noguchi 외, 1987, J. Biol. Chem. 262(29): 14366-71).
PKM-2는 암세포 대사 및 종양 성장에서 중심적인 역할을 하기 때문에 광범위하게 연구되어 왔으며, 높은 포도당 소모와 락테이트 생산을 특징으로 한다. PKM-1 효소는 항시적으로 활성인 반면, PKM-2 활성은 올리고머화, 기질 결합 및 번역후 변형에 의해 조절된다 (Christofk 외, 2008, Nature 452(7184):230-3; Chaneton and Gottlieb, 2012, Trends Biochem. Sci. 37(8):309-16; Israelsen and Vander Heiden, 2015, Semin. Cell Dev. Biol 43:43-51). 예를 들어, 프럭토스 1,6-비스포스페이트 (FBP)는 PKM-2에 가역적으로 결합하여 이의 사량체화를, 그리하여 활성화를 촉진한다 (Ashizawa 외, 1991, J. Biol. 266(25): 16842-6; Dombrauckas 외, 2005, Biochemistry 44(27):9417-29). 티로신 105에서 PKM-2의 인산화 또는 다른 포스포티로신 단백질에 대한 이의 결합은 FBP 결합을 차단하고 PKM-2 사량체화를 방지함으로써 PKM-2를 비활성화시킨다 (Christofk 외, 2008, Nature 452 (7184):181-6; Hitosugi 외, 2009, Sci. Signal 2(97):ra73). 그러나 해당작용의 수준 증가는, 샤프론-매개 자가포식현상을 통한 이의 분해를 위해 PKM-2를 표적으로 하는 대사 피드백 루프의 일부로서 리신 305에서의 PKM-2의 아세틸화를 촉진시킨다 (Lv 외, 2011, Mol. Cell 42(6):719-30) (Macintyre and Rathmell, 2011, Mol. Cell 42(6):713-4). 또한, PKM-2 이량체들은 단백질 키나제로 작용하는 세포 핵에 국지화되는 것으로 나타났으며, PEP를 포스페이트 공여체로 이용하여, STAT3의 인산화 및 MEK5의 활성화를 통해 세포 증식을 촉진시킨다 (Gao 외, 2012, Mol. Cell 45(5):598-609).
한 양상에 따르면, 본 발명은 세포에서 PKM 발현, 예컨대, PKM 폴리펩티드 발현을 조절함으로써 포유류 세포의 젖분비자극 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 이러한 포유류 세포의 젖분비자극 활성 조절 방법은 세포에서 PKM 폴리펩티드 발현을 녹아웃 또는 녹다운하는 것을 포함한다. 특정 구체예들에서, PKM-1의 발현은 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 구체예들에서, PKM-2의 발현은 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 구체예들에서, PKM-1 및 PKM-2 모두의 발현은 녹다운 또는 녹아웃된다. 본원에서 사용되는, 녹아웃된 발현은 참조 세포와 비교하여 세포에서 PKM 폴리펩티드, 예컨대, PKM-1 폴리펩티드 및/또는 PKM-2 폴리펩티드의 발현 제거를 지칭한다. 본원에서 사용되는, 녹다운된 발현은 참조 세포와 비교하여 세포에서 PKM 폴리펩티드, 예컨대, PKM-1 폴리펩티드 및/또는 PKM-2 폴리펩티드의 발현 감소를 지칭한다.
특정 구체예들에서, 참조 세포는 PKM 폴리펩티드, 예컨대, PKM-1 및/또는 PKM-2의 발현이 조절, 예컨대, 감소되지 않는 세포이다. 특정 구체예들에서, 참조 세포는 PKM 유전자의 야생형 대립유전자들 중 적어도 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 참조 세포는 야생형 PKM 대립유전자들 모두를 가지는 세포이다. 특정 구체예들에서, 참조 세포들은 WT CHO 세포들이다.
특정 구체예들에서, PKM 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 PKM 폴리펩티드, 예컨대, PKM-1 및/또는 PKM-2의 발현은, 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포의 PKM 폴리펩티드 발현의 약 90% 미만, 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에서, PKM-1 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 PKM-1 폴리펩티드의 발현은, 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포의 PKM-1 폴리펩티드 발현의 약 90% 미만, 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만이다.
특정 구체예들에서, PKM 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 PKM 폴리펩티드, 예컨대, PKM-1 및/또는 PKM-2의 발현은, 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포의 PKM 폴리펩티드 발현의 약 90% 이상, 약 80% 이상, 약 70% 이상, 약 60% 이상, 약 50% 이상, 약 40% 이상, 약 30% 이상, 약 20% 이상, 약 10% 이상, 약 5% 이상, 약 4% 이상, 약 3% 이상, 약 2% 이상 또는 약 1% 이상이다. 특정 구체예들에서, PKM-1 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 PKM-1 폴리펩티드의 발현은, 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포의 PKM-1 폴리펩티드 발현의 약 90% 이상, 약 80% 이상, 약 70% 이상, 약 60% 이상, 약 50% 이상, 약 40% 이상, 약 30% 이상, 약 20% 이상, 약 10% 이상, 약 5% 이상, 약 4% 이상, 약 3% 이상, 약 2% 이상 또는 약 1% 이상이다.
특정 구체예들에서, PKM 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 PKM 폴리펩티드, 예컨대, PKM-1 및/또는 PKM-2의 발현은, 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포의 PKM 폴리펩티드 발현의 약 90% 이하, 약 80% 이하, 약 70% 이하, 약 60% 이하, 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 20% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하 또는 약 1% 이하이다. 특정 구체예들에서, PKM 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 PKM 폴리펩티드, 예컨대, PKM-1 및/또는 PKM-2의 발현은, 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포의 PKM 폴리펩티드 발현의 약 40% 이하이다. 특정 구체예들에서, PKM-1 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 PKM-1 폴리펩티드의 발현은, 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포의 PKM-1 폴리펩티드 발현의 약 90% 이하, 약 80% 이하, 약 70% 이하, 약 60% 이하, 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 20% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하 또는 약 1% 이하이다.
특정 구체예들에서, PKM 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 PKM 폴리펩티드, 예컨대, PKM-1 및/또는 PKM-2의 발현은 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포의 PKM-1 폴리펩티드 발현의 약 1% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 70%, 약 1% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 40%이다. 특정 구체예들에서, PKM-1 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 PKM-1 폴리펩티드의 발현은 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포의 PKM-1 폴리펩티드 발현의 약 1% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 70%, 약 1% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 40%이다.
특정 구체예들에서, PKM 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 PKM 폴리펩티드, 예컨대, PKM-1 및/또는 PKM-2의 발현은, 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포의 PKM 폴리펩티드 발현의 약 5% 내지 약 40%이다. 특정 구체예들에서, PKM-1 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 PKM-1 폴리펩티드의 발현은, 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포의 PKM-1 폴리펩티드 발현의 약 5% 내지 약 40%이다. 상이한 참조 세포들 (예컨대, PKM 유전자의 두 야생형 대립유전자들 중 적어도 하나 또는 둘 모두를 포함하는 세포들)에서 PKM 폴리펩티드, 예컨대, PKM-1 및/또는 PKM-2의 발현 수준은 다양할 수 있다. 예를 들어, 씨드 트레인 세포 또는 저 락테이트 생산 세포는 낮은 수준의 PKM-1을 생산할 수 있는 반면, 고 락테이트 생산 세포는 높은 수준의 PKM-1을 생산할 수 있다.
PKM 유전자 전사체에서 엑손 9 또는 10의 대체 스플라이싱은 각각 PKM-1 또는 PKM-2를 생성한다. 녹다운 또는 녹아웃된 PKM 유전자는 인간으로부터의 PKM 유전자일 수 있다. 특정 구체예들에서, PKM 유전자는 비-인간, 예를 들어, 붉은 털 원숭이, 개, 녹색 원숭이, 닭, 소, 돼지, 마우스, 중국 햄스터, 래트 또는 토끼로부터 유래 될 수 있다.
특정 구체예들에서, 녹다운되거나 녹아웃된 PKM 유전자는 중국 햄스터 PKM 유전자이다. 특정 구체예들에서, 중국 햄스터 PKM 유전자 서열은 NCBI 참조 서열 번호 NW_003613709.1 (범위: 200602..223561) (서열 번호: 44)을 가진다. 특정 구체예들에서, PKM 유전자 서열은 NW_003613709.1 서열과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 뉴클레오티드만큼 상이하다. 특정 구체예들에서, PKM 유전자 서열은 서열 번호: 44에 제시된 서열과 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% 또는 그 이상만큼 상이하다.
PKM 유전자의또 다른 비 제한적인 예는 인간 PKM 유전자 (예컨대, NC_000015.10 (범위 72199029..72231624) (서열 번호: 45)), 붉은 털 원숭이 PKM 유전자 (예컨대, NC_027899.1 (범위 49211766..49245983) (서열 번호: 46)), 녹색 원숭이 PKM 유전자 (예컨대, NC_023667.1 (범위 11224332..11255538) (서열 번호: 47)), 개 PKM 유전자 (예컨대, NC_006612.3 (범위 35712853..35737643) (서열 번호: 48)), 마우스 PKM 유전자 (예컨대, NC_000075.6 (범위 59656368..59679375) (서열 번호: 49)), 래트 PKM 유전자 (예컨대, NC_005107.4 (범위 64480963..64502957) (서열 번호: 50)), 토끼 PKM 유전자 (예컨대, NC_013685.1 (범위 304096..317843) (서열 번호: 51)), 닭 PKM 유전자 (예컨대, NC_006097.4 (범위 1506428.. 1523684) (서열 번호: 52)), 돼지 PKM 유전자 (예컨대, NC_010449.5 (범위 60971807..61032780) (서열 번호: 53)) 및 소 PKM 유전자 (예컨대, AC_000167.1 (범위 18965981.. 18992644) (서열 번호: 54))를 포함한다. 특정 구체예들에서, PKM 유전자 서열은 서열 번호: 45-54에 제시된 서열들 중 어느 하나와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 뉴클레오티드만큼 상이하다. 특정 구체예들에서, PKM 유전자 서열은 서열 번호: 45-54에 제시된 서열들 중 어느 하나와 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% 또는 그 이상만큼 상이하다.
당업자는 서로 다른 포유류 세포주들, 심지어, 동일한 종으로부터의 세포주들, 예를 들어, 별개의 2개 CHO 숙주 세포주들이 동일한 PKM 유전자 서열들을 공유할 수 없음을 알고 있을 것이다. 동일한 종들의 2개 포유류 세포주들 사이에 PKM 유전자 서열들에서 작은 차이, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드의 차이가 존재할 수 있다.
5.2.1 PKM 발현 조절 방법
특정 구체예들에서, 유전자 조작 시스템을 사용하여 PKM 폴리펩티드의 발현 (예컨대, PKM-1 발현)을 조절 (예컨대, 녹다운 또는 녹아웃)한다. 당업계에 공지된 다양한 유전자 조작 시스템들이 본원에 개시된 방법들에서 사용될 수 있다. 이러한 시스템의 비 제한적인 예로는 CRISPR/Cas 시스템, 아연-핑거 핵산분해효소 (ZFN) 시스템, 전사 활성인자 유사 효과기 핵산분해효소 (TALEN) 시스템 및 유전자 침묵에 의한 단백질 녹다운을 위한 기타 툴들, 가령, 작은 간섭 RNA들 (siRNAs), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 및 마이크로RNA (miRNA)의 사용이 포함된다. 종래의, 개선된 또는 변형된 Cas 시스템들을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 CRISPR/Cas 시스템들, 뿐만 아니라 현존하는 다른 세균 기반 게놈 절제 툴, 가령, Cpf-1을 본원에 개시된 방법들과 함께 사용할 수 있다.
당업계에 공지된 임의의 PKM 억제제들을 또한 본원에 개시된 방법과 함께 사용하여 PKM 활성을 조절하고, 그리하여 본원에 개시된 세포의 젖분비자극 활성을 조절할 수 있다. PKM 억제제의 비-제한적인 예들에는 소듐 모노플루오로포스페이트, L-페닐알라닌, 크레아틴 포스페이트, Ca2+, 플루로포스페이트 및 피리독살 5'-포스페이트가 포함된다.
특정 구체예들에서, PKM 폴리펩티드의 발현을 조절, 예컨대, 녹다운 또는 녹아웃하기 위해 PKM 유전자의 일부분이 결실된다. 특정 구체예들에서, PKM 유전자의 약 2% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상 또는 약 90% 이상이 결실된다. 특정 구체예들에서, PKM 유전자의 약 2% 이하, 약 5% 이하, 약 10% 이하, 약 15% 이하, 약 20% 이하, 약 25% 이하, 약 30% 이하, 약 35% 이하, 약 40% 이하, 약 45% 이하, 약 50% 이하, 약 55% 이하, 약 60% 이하, 약 65% 이하, 약 70% 이하, 약 75% 이하, 약 80% 이하, 약 85% 이하 또는 약 90% 이하가 결실된다. 특정 구체예들에서, PKM 유전자의 약 2% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%, 약 2% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%, 약 2% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 70%, 약 2% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 60%, 약 2% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 50%, 약 2% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 40%, 약 2% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 30%, 약 2% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 또는 약 2% 내지 약 5%가 결실된다.
특정 구체예들에서, PKM 유전자의 하나 이상의 엑손은 적어도 부분적으로 결실된다. 본원에서 사용되는 "부분적으로 결실된"은, 해당 영역, 예컨대, 엑손의 약 2% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 2% 이하, 약 5% 이하, 약 10% 이하, 약 15% 이하, 약 20% 이하, 약 25% 이하, 약 30% 이하, 약 35% 이하, 약 40% 이하, 약 45% 이하, 약 50% 이하, 약 55% 이하, 약 60% 이하, 약 65% 이하, 약 70% 이하, 약 75% 이하, 약 80% 이하, 약 85% 이하, 약 90% 이하, 약 95% 이하, 약 2% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%, 약 2% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%, 약 2% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 70%, 약 2% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 60%, 약 2% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 50%, 약 2% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 40%, 약 2% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 30%, 약 2% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 또는 약 2% 내지 약 5%가 결실된다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), PKM 유전자의 엑손 9는 적어도 부분적으로 결실되거나 완전히 결실될 수 있다. 특정 구체예들에서, PKM 유전자의 엑손 10은 적어도 부분적으로 결실되거나 완전히 결실될 수 있다. 특정 구체예들에서, PKM 유전자의 엑손 9 및 엑손 10은 적어도 부분적으로 결실되거나 완전히 결실될 수 있다. 특정 구체예들에서, 엑손 1-12를 포함하는 영역은 적어도 부분적으로 결실되거나 완전히 결실된다.
비-제한적 특정 구체예들에서, CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 PKM 폴리펩티드의 발현을 조절한다. 클러스터링된 주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 반복서열 (CRISPR) 시스템은 원핵 세포들에서 발현된 게놈 편집 툴이다. 게놈 편집에 사용되는 경우, 이러한 시스템은 Cas9 (그 가이드로서 crRNA를 이용하여 DNA를 변형시킬 수 있는 단백질), CRISPR RNA (crRNA, tracrRNA (일반적으로 헤어핀 루프 형태)에 결합하여 Cas9와 활성 복합체를 형성하는 영역과 함께 숙주 DNA의 올바른 구획으로 이를 유도하는, Cas9에 의해 사용되는 RNA를 내포), 및 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA, crRNA에 결합하여 Cas9와 활성 복합체를 형성함)를 포함한다. 용어 "가이드 RNA" 및 "gRNA"는 세포의 표적 서열, 가령, 게놈 또는 에피솜 서열에 대한 RNA-유도된 핵산분해효소, 가령, Cas9의 특이적 결합 (또는 "표적화")을 촉진시키는 임의의 핵산을 지칭한다. gRNA들은 단분자 (단일 RNA 분자를 포함, 그리고 대안적으로 키메라로 지칭됨) 또는 모듈 (하나 이상, 그리고 통상적으로 2개의 별도의 RNA 분자들, 가령, crRNA 및 tracrRNA를 포함, 이들은 일반적으로, 예를 들어, 듀플렉싱에 의해 서로 결합됨) 일 수 있다. CRISPR/Cas9 전략들은 포유류 세포를 형질감염시키기 위해 벡터를 사용할 수 있다. 가이드 RNA (gRNA)는 Cas9가 세포에서 표적 DNA를 확인하고 직접 결합하는 데 사용하는 서열이므로 각 응용 분야에 맞게 설계 될 수 있다. 다수의 crRNA와 tracrRNA가 함께 포장되어 단일 가이드 RNA (sgRNA)를 형성 할 수 있다. sgRNA는 세포내에 형질 감염되도록 하기 위해 Cas9 유전자와 함께 결합되어 벡터로 만들어질 수 있다.
특정 구체예들에서, 하나 이상의 PKM 폴리펩티드들의 발현 조절에 사용하기 위한 CRISPR/Cas9 시스템은 Cas9 분자 및 PKM 유전자의 표적 서열에 상보적인 표적화 도메인을 포함하는 하나 이상의 gRNA들을 포함한다. 특정 구체예들에서, 표적 유전자는 PKM 유전자의 일 영역이다. 상기 표적 서열은 PKM 유전자 내 임의의 엑손 또는 인트론 영역일 수 있으며, 예컨대, 이의 표적화는 PKM1 및/또는 PKM2 폴리펩티드들의 발현을 제거 또는 감소시킨다. 특정 구체예들에서, 상기 표적 서열은 PKM 유전자의 엑손 1에 연접한 5' 영역, 엑손 1 내부 영역, 엑손 2에 연접한 5' 영역, 엑손 2 내부 영역, 엑손 9에 연접한 5' 영역, 엑손 9에 연접한 3' 영역, 엑손 10에 연접한 3' 영역, 엑손 12 내부 영역 및/또는 엑손 12에 연접한 3' 영역일 수 있다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 상기 표적 서열은 PKM 유전자의 엑손 9에 연접한 5' 인트론 영역, PKM 유전자의 엑손 9에 연접한 3' 인트론 영역, PKM 유전자의 엑손 10에 연접한 3' 인트론 영역 및 이의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된다.
특정 구체예들에서, PKM 유전자의 엑손 9에 연접한 5' 인트론 영역 및 PKM 유전자의 엑손 9에 연접한 3' 인트론 영역은 모두 본원에 개시된 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 표적된다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), CRISPR/Cas9 시스템은 예컨대, PKM-1 녹다운 또는 녹아웃된 세포들을 생성하기 위하여 Cas9 분자, PKM 유전자의 엑손 9에 연접한 5' 인트론 영역을 표적하는 gRNA 및 PKM 유전자의 엑손 9에 연접한 3' 인트론 영역을 표적하는 gRNA를 포함한다. 특정 구체예들에서, PKM 유전자의 엑손 9에 연접한 5' 인트론 영역을 표적하는 gRNA는 서열 번호: 33에 제시된 서열을 포함한다. 특정 구체예들에서, PKM 유전자의 엑손 9에 연접한 3' 인트론 영역을 표적하는 gRNA는 서열 번호: 34에 제시된 서열을 포함한다.
특정 구체예들에서, 상기 표적 서열은 엑손 1에 연접한 5' 영역, 엑손 1 내부 영역, 엑손 2에 연접한 5' 영역, 엑손 2 내부 영역, 엑손 12 내부 영역, 엑손 12에 연접한 3' 영역 또는 이의 조합일 수 있다. 예를 들면 (그리고 제한은 아님), 본 발명의 CRISPR/Cas9 시스템은 예컨대, PKM-1 및 PKM-2 둘 모두 녹다운 또는 녹아웃된 세포들을 생성하기 위하여, Cas9 분자, PKM 유전자의 엑손 1 내부 영역을 표적하는 gRNA 및 PKM 유전자의 엑손 12 내부 영역을 표적하는 gRNA를 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 CRISPR/Cas9 시스템은 예컨대, PKM-1 및 PKM-2 둘 모두 녹다운 또는 녹아웃된 세포들을 생성하기 위하여, Cas9 분자, PKM 유전자의 엑손 2 내부 영역을 표적하는 gRNA 및 PKM 유전자의 엑손 12 내부 영역을 표적하는 gRNA를 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, PKM 유전자의 엑손 2 내부 영역을 표적하는 gRNA는 서열 번호: 42에 제시된 서열을 포함한다. 특정 구체예들에서, PKM 유전자의 엑손 12 내부 영역을 표적하는 gRNA는 서열 번호: 43에 제시된 서열을 포함한다.
특정 구체예들에서, gRNA들은 단일 벡터에서 세포에 투여되고 Cas9 분자는 제 2 벡터에서 세포에 투여된다. 특정 구체예들에서, gRNA들 및 Cas9 분자는 단일 벡터에서 세포에 투여된다. 대안적으로, gRNA들 및 Cas9 분자 각각은 별도의 벡터들에 의해 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, CRISPR/Cas9 시스템은 하나 이상의 gRNA와 복합체화된 Cas9 단백질을 포함하는 리보핵단백질 복합체 (RNP)로서 세포에 전달 될 수 있으며, 예를 들어, 전기천공에 의해 전달 될 수 있다 (예컨대, 세포에 RNP를 전달하는 또 다른 방법은 DeWitt 외, Methods 121-122:9-15 (2017) 참조). 특정 구체예들에서, CRISPR/Cas9 시스템을 세포에 투여하면 PKM-1 폴리펩티드 발현을 녹아웃 또는 녹다운시킨다. 특정 구체예들에서, CRISPR/Cas9 시스템을 세포에 투여하면 PKM-1 및 PKM-2 폴리펩티드 모두의 발현을 녹아웃 또는 녹다운시킨다.
특정 구체예들에서, 유전자 조작 시스템은 포유류 세포에서 PKM 폴리펩티드의 발현을 조절하기 위한 ZFN 시스템이다. ZFN은 아연 핑거 DNA 결합 도메인과 DNA 절단 도메인을 결합하여 생성되는 제한 효소 역할을 할 수 있다. 아연 핑거 도메인은 아연-핑거 핵산분해효소가 게놈 내에서 원하는 서열을 표적화 할 수 있도록 하는 특정 DNA 서열들을 표적하도록 조작 될 수 있다. 개별 ZFN의 DNA 결합 도메인은 일반적으로 복수의 개별 아연 핑거 반복서열들을 포함하고 각각 복수의 염기쌍을 인식 할 수 있다. 새로운 아연-핑거 도메인을 생성하는 가장 일반적인 방법은 공지된 특이성의 더 작은 아연-핑거 "모듈"을 결합하는 것이다. ZFN에서 가장 일반적인 절단 도메인은 II형 제한 엔도뉴클레아제 FokI로부터의 비특이적 절단 도메인이다. ZFN은 표적 DNA 서열에서 이중-가닥 절단(DSB)를 생성하여 단백질들의 발현을 조절하며, 이는 상동성 주형의 부재시, 비-상동 말단 결합 (NHEJ)에 의해 복구될 것이다. 이러한 복구는 염기쌍의 결실 또는 삽입을 초래하여 프레임 이동을 생성하고 유해한 단백질의 생성을 방지 할 수 있다 (Durai 외, 핵산 Res.; 33 (18): 5978-90 (2005)). 또한 여러 쌍의 ZFN을 사용하여 게놈 서열의 전체 큰 세그먼트를 완전히 제거 할 수도 있다 (Lee 외, Genome Res.; 20 (1): 81-9 (2010)). 특정 구체예들에서, 표적 유전자는 PKM 유전자의 일 부분이다. 특정 구체예들에서, 상기 표적 서열은 PKM 유전자의 엑손 9이다. 특정 구체예들에서, 상기 표적 서열은 PKM 유전자의 엑손 9 및 엑손 10이다.
특정 구체예들에서, 유전자 조작 시스템은 포유류 세포에서 PKM 폴리펩티드의 발현을 조절하기 위한 TALEN 시스템이다. TALEN은 특정 DNA 서열을 절단하도록 조작 할 수 있는 제한 효소이다. TALEN 시스템들은 ZFN과 유사한 원리로 작동한다. TALEN은 전사 활성인자-유사 효과기 DNA-결합 도메인을 DNA 절단 도메인과 결합하여 생성된다. 전사 활성인자-유사 효과기들 (TALEs)은 특정 뉴클레오티드를 강력하게 인지하는 2개의 가변 위치들을 가진 33-34개 아미노산 반복 모티프들로 구성된다. 이들 TALE의 어레이를 조립함으로써, TALE DNA-결합 도메인은 원하는 DNA 서열에 결합하도록 조작 될 수 있으며, 이에 따라 핵산분해효소가 게놈의 특정 위치에서 이를 절단하도록 유도 할 수 있다 (Boch 외, Nature Biotechnology; 29(2): 135-6 (2011)). 특정 구체예들에서, 표적 유전자는 PKM 유전자의 일 부분이다. 특정 구체예들에서, 상기 표적 서열은 PKM 유전자의 엑손 9이다. 특정 구체예들에서, 상기 표적 서열은 PKM 유전자의 엑손 9 및 엑손 10이다.
특정 구체예들에서, PKM 폴리펩티드의 발현은 PKM 핵산 (예컨대, PKM mRNA, PKM-1 mRNA 또는 PKM-2 mRNA)에 상보적인 서열들을 가지는 올레고뉴클레오티드들을 사용하여 녹다운 될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 비-제한적인 예는 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 및 마이크로 RNA (miRNA)를 포함한다. 특정 구체예들에서, 이러한 올리고뉴클레오티드는 PKM 핵산 서열, 예컨대, PKM, PKM-1 또는 PKM-2 핵산 서열의 적어도 일부에 상동성일 수 있으며, 이 때 이러한 PKM 핵산 서열에 대한 상기 일부의 상동성은 적어도 약 75 또는 적어도 약 80 또는 적어도 약 85 또는 적어도 90 또는 적어도 약 95 또는 적어도 약 98 퍼센트이다. 비-제한적 특정 구체예들에서, 상기 상보적 부분은 적어도 10개 뉴클레오티드 또는 적어도 15개 뉴클레오티드 또는 적어도 20개 뉴클레오티드 또는 적어도 25개 뉴클레오티드 또는 적어도 30개 뉴클레오티드를 구성할 수 있으며 안티센스 핵산, shRNA, mRNA 또는 siRNA 분자는 최대 15 또는 최대 20 또는 최대 25 또는 최대 30 또는 최대 35 또는 최대 40 또는 최대 45 또는 최대 50 또는 최대 75 또는 최대 100개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 안티센스 핵산, shRNA, mRNA 또는 siRNA 분자는 DNA 또는 비정형 또는 비자연 발생 잔기, 예를 들어, 포스포로티오에이트 잔기를 포함 할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 개시된 유전자 조작 시스템은 바이러스 벡터, 예를 들어, 감마-레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터를 사용하여 포유류 세포 내로 전달 될 수 있다. 레트로바이러스 벡터와 적절한 패키징 세포주의 조합들이 적합한데, 이 때 캡시드 단백질은 인간 세포들을 감염시킴에 기능적일 것이다. PA12 (Miller, 외 (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437); PA317 (Miller, 외 (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902); 및 CRIP (Danos, 외 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464)를 비롯한 다양한 양생 바이러스-생성 세포주들이 공지되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비-양생 입자들, 예컨대, VSVG, RD114 또는 GALV 외피를 가진 슈도타입화 입자들 및 해당 분야에 공지된 기타 입자들도 적합하다. 가능한 형질도입 방법들은 또한 예컨대, Bregni, 외 (1992) Blood 80:1418-1422에 기재된 방법에 의한 생산자 세포들과 세포들의 직접 공-배양, 또는 바이러스 상청액 단독 또는 적절한 성장 인자들 및 다가양이온들의 존재 또는 부재하에서, 예컨대, Xu, 외 (1994) Exp. Hemat. 22:223-230; 및 Hughes, 외 (1992) J. Clin. Invest. 89:1817에 기재된 방법에 의해 농축된 벡터 스톡과의 배양을 포함한다.
다른 형질도입 바이러스 벡터들을 사용하여 본원에 개시된 포유류 세포를 변형시킬 수 있다. 특정 구체예들에서, 선택된 벡터는 높은 감염 효율성 및 안정한 통합 빛 발현을 나타낸다 (예컨대, Cayouette 외, Human Gene Therapy 8:423-430, 1997; Kido 외, Current Eye Research 15:833-844, 1996; Bloomer 외, Journal of Virology 71:6641-6649, 1997; Naldini 외, Science 272:263-267, 1996; 및 Miyoshi 외, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997 참고). 사용될 수 있는 다른 바이러스 벡터들은, 예를 들면, 예를 들어, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 아데나-관련 바이러스 벡터, 우두 바이러스, 소 유두종 바이러스 또는 엡스타인-바 바이러스와 같은 헤르페스 바이러스를 포함한다 (또한, 예를 들면, Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244:1275-1281, 1989; Eglitis 외, BioTechniques 6:608-614, 1988; Tolstoshev 외, Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991; Cometta 외, Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987; Anderson, Science 226:401-409, 1984; Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991; Miller 외, Biotechnology 7:980-990, 1989; LeGal La Salle 외, Science 259:988-990, 1993; 및 Johnson, Chest 107:77S-83S, 1995에 기재된 벡터들을 참고). 레트로바이러스 벡터들은 특히 잘 개발되었으며 임상 환경에서 사용되어왔다 (Rosenberg 외, N. Engl. J. Med 323:370, 1990; Anderson 외, 미국 특허 제 5,399,346).
비-바이러스 접근법들 또한 본원에 개시된 포유류 세포의 유전자 조작을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 핵산 분자는 세포 리포펙션의 존재하에 핵산을 투여함으로써 (Feigner 외, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987; Ono 외, Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham 외, Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger 외, Methods in Enzymology 101:512, 1983), 아시알루로소뮤코이드-폴리리신 접합 (Wu 외, Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu 외, Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989), 또는 수술 조건들하에서 마이크로-주입에 의해 (Wolff 외, Science 247:1465, 1990) 포유류에 도입될 수 있다. 유전자 전달을 위한 다른 비-바이러스 수단은 칼슘 포스페이트, DEAE 덱스트란, 전기천공 및 원형질체 융합을 사용한 시험관내 형질감염을 포함한다. 리포좀은 또한 핵산 분자를 세포로 전달하는데 잠재적으로 유익 할 수 있다. 대상체의 감염된 조직으로의 정상 유전자의 이식은 또한 정상 핵산을 생체외 배양가능한 세포 유형 (예컨대, 자가 또는 이종 일차 세포 또는 이의 자손)으로 전달하여 구현될 수 있으며, 그 후 세포 (또는 그 후손) 표적 조직에 주사되거나 전신 주사된다.
5.3 젖분비자극 활성이 감소 또는 제거된 세포들
한 양상에서, 본 발명은 젖분비자극 활성이 감소 또는 제거된 세포들 또는 이러한 하나 이상의 세포들, 예컨대, 포유류 세포들을 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. PKM 폴리펩티드 (예컨대, PKM-1 발현)의 발현은 세포에서 녹다운 또는 녹아웃되고, 이는 세포의 젖분비자극 활성을 감소 또는 제거한다. 상기 세포들의 비-제한적 예들에는 CHO 세포들 (예컨대, DHFR CHO 세포들), dp12.CHO 세포들, CHO-K1 (ATCC, CCL-61), SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통 (예컨대, COS-7 ATCC CRL-1651), 인간 배아 신장 계통 (예컨대, 현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포들), 새끼 햄스터 신장 세포들 (예컨대, BHK, ATCC CCL 10), 마우스 정소 세포들 (예컨대 TM4), 원숭이 신장 세포들 (예컨대, CV1 ATCC CCL 70), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포들 (예컨대, VERO-76, ATCC CRL-1587), 인간 자궁경부 암종 세포들 (예컨대, HELA, ATCC CCL 2), 개과 신장 세포들 (예컨대, MDCK, ATCC CCL 34), 버팔로 래트 간 세포들 (예컨대, BRL 3A, ATCC CRL 1442), 인간 폐 세포들 (예컨대, W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포들 (예컨대, Hep G2, HB 8065), 마우스 포유류 종양 (예컨대, MMT 060562, ATCC CCL51), TRI 세포들, MRC 5 세포들, FS4 세포들, 인간 간암 계통 (예컨대, Hep G2), 골수종 세포주들 (예컨대, Y0, NS0 및 Sp2/0)이 포함된다. 특정 구체예들에서, 세포들은 CHO 세포들이다. CHO 숙주 세포들의 또 다른 비-제한적 예들에는 CHO K1SV 세포들, CHO DG44 세포들, CHO DUKXB-11 세포들, CHOK1S 세포들 및 CHO KIM 세포들이 포함된다. 특정 구체예들에서, PKM 유전자 중 하나의 대립유전자만이 본 발명의 세포에서 변형된다. 특정 구체예들에서, PKM 유전자의 두 대립유전자 모두 변형된다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 세포는 서열 번호: 39-41로 구성된 그룹에서 선택된 서열을 포함하는, 또는 서열 번호: 37 및 38에 제시된 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 PKM 유전자의 적어도 하나의 대립유전자를 포함한다 (도 4C 참고). 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 본 발명의 세포는 서열 번호: 39-41로 구성된 그룹에서 선택된 서열을 포함하는, 또는 서열 번호: 37 및 38에 제시된 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 PKM 유전자의 대립유전자를 포함한다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 세포는 서열 번호: 39-41로 구성된 그룹에서 선택된 서열을 포함하는 PKM 유전자의 적어도 하나의 대립유전자를 포함한다. 특정 구체예들에서, 세포는 CHO 세포이다. 젖분비자극 활성이 감소 또는 제거된 세포의 비-제한적 예들은 본원에 개시된 HET-3, HET-18, KO-2 및 KO-15를 포함한다.
특정 구체예들에서, PKM 폴리펩티드 (예를 들어, PKM-1 및 / 또는 PKM-2)의 발현은 녹아웃되고, 이는 참조 세포와 비교하여 세포의 젖분비자극 활성을 제거한다. 특정 구체예들에서, PKM 폴리펩티드의 발현은 세포에서 녹다운되고, 이는 참조 세포와 비교하여 세포의 젖분비자극 활성을 감소시킨다. 특정 구체예들에서, 참조 세포는 PKM 폴리펩티드의 발현이 조절되지 않는 세포이다. 특정 구체예들에서, 참조 세포는 하나 이상의 야생형 PKM 대립유전자를 가지는 세포들이다. 특정 구체예들에서, 참조 세포는 두 야생형 PKM 대립유전자들 모두를 가지는 세포들이다. 특정 구체예들에서, 참조 세포들은 WT CHO 세포들이다.
특정 구체예들에서, 세포들의 젖분비자극 활성은 세포들의 배양 기간 동안 세포 배양 배지에서의 락테이트 농도로 나타낸다. 특정 구체예들에서, 세포들의 젖분비자극 활성은 배양 기간 중 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일, 25 일, 30 일, 35 일, 40 일, 45 일, 50 일, 55 일, 60 일, 65 일, 70 일 또는 80 일차시 세포 배양 배지에서의 락테이트 농도로 나타낸다. 특정 구체예들에서, 세포들의 젖분비자극 활성은 배양 시작 후 80일 이상 경과한 세포 배양 배지에서의 락테이트 농도로 나타낸다. 특정 구체예들에서, 본원에 개시된 세포들의 젖분비자극 활성은 생산 단계 동안의, 예컨대, 세포 배양 과정 중 생산 단계의 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일차 세포 배양 배지에서의 락테이트 농도로 나타낸다. 특정 구체예들에서, 락테이트 농도는 생산 단계의 6 일, 7 일, 10 일, 11 일, 14 일 및/또는 15 일차에 결정된다. 특정 구체예들에서, 락테이트 농도는 생산 단계의 7 일, 10 일 및/또는 14 일차에 결정된다.
세포의 젖분비자극 활성을 측정 및/또는 배양 중 세포에 의한 락테이트 생산을 측정하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법이 본원에 개시된 주제와 함께 사용될 수 있다. 비-제한적인 예시적 방법들은 TeSlaa and Teitell, Methods Enzymol (2014) 542:91-114 및 Lehman 외, Med Sci Sports Exerc. (1991) 23(8):935-8에 개시된 방법들을 포함하며, 이들 문헌은 본원에 그 전문이 참고문헌으로 포함된다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 이러한 기술은 상업적인 세포 외 락테이트염 키트 사용, 세포 외 바이오 분석기 사용, 예컨대, Seahorse XF 분석기를 사용한 세포외 산성화 속도 (ECAR) 측정, 속도-제한 해당 효소의 활성 측정 및 추적자들을 사용한 락테이트 생성 측정을 포함한다.
특정 구체예들에서, 젖분비자극 활성이 감소된 (예컨대, PKM 폴리펩티드를 녹다운 또는 녹아웃시키도록 하는 세포들에서의 PKM 유전자 조절로 인해) 세포들의 젖분비자극 활성은 참조 세포의 젖분비자극 활성의 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2% 또는 약 1%이다. 특정 구체예들에서, 젖분비자극 활성이 감소된 (예컨대, PKM 폴리펩티드를 녹다운 또는 녹아웃시키도록 하는 세포들에서의 PKM 유전자 조절로 인해) 세포들의 젖분비자극 활성은 참조 세포의 젖분비자극 활성의 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2% 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에서, 세포의 젖분비자극 활성은 예컨대, 세포 배양의 생산 단계의 14일 또는 15일차에 관찰된 바와 같이, 참조 세포의 젖분비자극 활성의 약 50% 미만이다. 특정 구체예들에서, 세포의 젖분비자극 활성은 예컨대, 세포 배양의 생산 단계의 14일 또는 15일차에 관찰된 바와 같이, 참조 세포의 젖분비자극 활성의 약 20% 미만이다. 특정 구체예들에서, 세포의 젖분비자극 활성은 예컨대, 세포 배양의 생산 단계의 14일 또는 15일차에 관찰된 바와 같이, 참조 세포의 젖분비자극 활성의 약 10% 미만이다. 특정 구체예들에서, 참조 세포는 PKM 유전자의 야생형 대립유전자들 중 최소한 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 세포들에 의해 생산된 세포 배양 배지에서의 락테이트 농도는 예컨대, 세포 배양의 생산 단계에서 (예컨대, 생산 단계의 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일 또는 20 일차에서) 약 15 g/L 미만, 약 14 g/L 미만, 약 13 g/L 미만, 약 12 g/L 미만, 약 101 g/L 미만, 약 10 g/L 미만, 약 9 g/L 미만, 약 8 g/L 미만, 약 7 g/L 미만, 약 6 g/L 미만, 약 5 g/L 미만, 약 4 g/L 미만, 약 3 g/L 미만, 약 2 g/L 미만, 약 1 g/L 미만 또는 약 0.5 g/L 미만이다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 세포들에 의해 생산된 세포 배양 배지에서 락테이트 농도는 약 5 g/L 미만, 약 2 g/L 미만, 또는 약 1 g/L 미만이다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 세포들에 의해 생산된 세포 배양 배지에서 락테이트 농도는 세포 배양의 생산 단계의 7일, 10일, 14일 또는 15일차에서 약 5 g/L 미만, 약 2 g/L 미만, 또는 약 1 g/L 미만이다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 세포들에 의해 생산된 세포 배양 배지에서 락테이트 농도는 진탕 플라스크 배양의 생산 단계 동안 약 1 g/L 미만, 또는 약 2 g/L 미만이다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 세포들에 의해 생산된 세포 배양 배지에서 락테이트 농도는 생물반응기에서의 세포 배양의 생산 단계 동안 약 2 g/L 미만이다.
특정 구체예들에서, 본원에 개시된 젖분비자극 활성이 감소 또는 제거된 세포들 (예컨대, PKM 폴리펩티드 발현의 녹아웃 또는 녹다운에 의해 생성된 세포들)은 보통의 젖분비자극 활성을 가지는 세포들 (예컨대, 야생형 세포들)과 비등한 역가 및/또는 비 생산성을 가진다. 특정 구체예들에서, 젖분비자극 활성이 감소 또는 제거된 세포와 보통의 젖분비자극 활성을 갖는 세포 사이의 역가 및/또는 비 생산성의 차이는 보통의 젖분비자극 활성을 갖는 세포 (예를 들어, 참조 세포)의 약 1% 미만, 약 5% 미만, 약 10% 미만, 약 15% 미만, 약 20% 미만, 약 25% 미만, 또는 약 30% 미만이다. 특정 구체예들에서, 젖분비자극 활성이 감소 또는 제거된 세포는 보통의 젖분비자극 활성을 갖는 세포보다 더 높은 역가 및/또는 비 생산성을 갖는다. 특정 구체예들에서, 젖분비자극 활성이 감소 또는 제거된 세포의 역가는 보통의 젖분비자극 활성을 가진 세포의 역가보다 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45% 또는 약 50% 더 높다. 특정 구체예들에서, 젖분비자극 활성이 감소 또는 제거된 세포들의 역가는 보통의 젖분비자극 활성을 가진 세포의 역가보다 약 50% 이상 더 높다. 특정 구체예들에서, 젖분비자극 활성이 감소 또는 제거된 세포들의 비 생산성 (Qp)은 보통의 젖분비자극 활성을 가지는 세포들의 비 생산성보다 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90% 더 높다. 특정 구체예들에서, 젖분비자극 활성이 감소 또는 제거된 세포들의 비 생산성은 보통의 젖분비자극 활성을 가진 세포의 비 생산성보다 약 90% 이상 더 높다.
세포 배양 배지의 락테이트 농도는 화학 분석기 또는 락테이트 분석 키트로 측정 할 수 있다. 화학 분석기의 비-제한적 예로는 Bioprofile 400 (Nova Biomedical), Piccolo Xpress 화학 분석기, Excel-반자동 화학 분석기, Indiko 임상 및 특수 화학 시스템, ACE Axcel® 임상 화학 시스템이 있다. 락테이트 분석 키트의 비-제한적인 예에는 L-락테이트 분석 키트 (비색계) (ab65331, Abeam), BioVision 락테이트 비색계/형광측정 분석 키트, PicoProbe?? 락테이트 형광측정 분석 키트, 락테이트 비색계 분석 키트 II, Cell Biolabs 락테이트 분석 키트가 포함된다.
특정 구체예들에서, 본원에 개시된 세포들은 관심 생성물을 발현한다. 특정 구체예들에서, 관심 생성물은 재조합 단백질이다. 특정 구체예들에서, 관심 생성물은 단클론 항체이다. 관심 생성물의 추가적인 비-제한적 예들은 섹션 5.5에 제공된다. 특정 구체예들에서, 본원에 개시된 세포들은 상업적으로 유용한 양의 관심 생성물의 생산을 위해 사용될 수 있다.
특정 구체예들에서, 본원에 개시된 세포는 관심 생성물을 인코드하는 핵산을 포함 할 수 있다. 특정 구체예들에서, 핵산은 하나 이상의 벡터들, 예컨대, 발현 벡터에 존재할 수 있다. 한 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 추가적인 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 추가적인 DNA 세그먼트가 바이러스 유전체 내에 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포 (예컨대, 박테리아 복제 원점을 가지는 박테리아 벡터 및 에피좀 포유류 벡터)에서 독자적으로 복제될 수 있다. 다른 벡터 (예컨대, 비-에피좀 포유류 벡터)는 숙주 세포로의 도입시 숙주 세포의 유전체에 통합되며, 및 이를 통해 숙주 유전체와 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터, 발현 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시 할 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 (벡터)의 형태이다. 본원에서 사용하기 위한 발현 벡터들의 또 다른 비-제한적 예들에는 동등한 기능들을 제공하는 바이러스 벡터들 (예컨대, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)이 포함된다.
특정 구체예들에서, 관심 생성물을 인코드하는 핵산이 본원에 개시된 숙주 세포에 도입될 수 있다. 특정 구체예들에서, 세포로의 핵산의 도입은, 형질감염, 전기천공, 미세주입, 핵산 서열들을 함유하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터로의 감염, 세포 주입, 염색체-매개 유전자 전달, 마이크로세포-매개 유전자 전달, 스페로플라스트 융합, 등을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 숙주 세포는 진핵, 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구 세포 (예컨대, Y0, NS0, Sp20 세포)다.
특정 구체예들에서, 관심 생성물을 인코드하는 핵산은 숙주 세포 게놈에 무작위로 통합 될 수 있다 ("무작위 통합" 또는 "RI"). 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 관심 생성물을 인코드하는 핵산은 PKM 폴리펩티드, 예컨대, PKM-1의 발현이 녹다운 또는 녹아웃되도록 조절된 세포의 게놈에 무작위로 통합될 수 있다.
특정 구체예들에서, 관심 생성물을 인코드하는 핵산은 숙주 세포 게놈에 표적화된 방식으로 통합될 수 있다 ("표적화된 통합" 또는 "TI"). 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 관심 생성물을 인코드하는 핵산은 PKM 폴리펩티드, 예컨대, PKM-1의 발현이 녹다운 또는 녹아웃되도록 조절된 세포의 게놈에 표적화된 방식으로 통합될 수 있다. "통합 부위"는 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입되는 숙주 세포 게놈 내의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구체예들에서, 통합 부위는 숙주 세포 게놈상의 2개의 인접한 뉴클레오티드들 사이에 존재한다. 특정 구체예들에서, 통합 부위는 뉴클레오티드 서열들의 스트레치를 포함한다. 특정 구체예들에서, 통합 부위는 TI 숙주 세포 게놈의 특정 유전자좌 내에 위치한다. 특정 구체예들에서, TI 숙주 세포의 내인성 유전자 내부에 존재한다. 당업계에 공지된 임의의 통합 부위는 본원에 개시된 주제에 따라 조절되고 이와 함께 사용될 수 있다. 표적화된 통합은 당업계에 공지된 방법들 및 시스템들에 의해 매개될 수 있다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 본원에 그 전문 내용이 참고문헌으로 포함되는 2018년 12월 21일에 출원된 국제 특허 출원 제 PCT/US18/067070에 개시된 방법 및 시스템들이 표적화된 통합을 위해 사용될 수 있다.
특정 구체예들에서, 관심 생성물을 인코드하는 핵산은 트랜스포사제-기반 통합을 사용하여 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있다. 트랜스포사제-기반 통합 기술들은, 예를 들면, Trubitsyna 외, Nucleic Acids Res. 45(10):e89 (2017), Li 외, PNAS 110(25):E2279-E2287 (2013) 및 WO 2004/009792에 개시되어 있으며, 이들은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된다.
특정 구체예들에서, 관심 생성물을 인코드하는 핵산은 숙주 세포 게놈에 무작위로 통합 될 수 있다 ("무작위 통합" 또는 "RI"). 특정 구체예들에서, 무작위 통합은 당업계에 공지된 임의의 방법 또는 시스템들에 의해 매개될 수 있다. 특정 구체예들에서, 무작위 통합은 MaxCyte STX® 전기천공 시스템에 의해 매개된다.
특정 구체예들에서, 표적화 통합은 무작위 통합과 조합될 수 있다. 특정 구체예들에서, 표적화 통합 후 무작위 통합이 이어질 수 있다. 특정 구체예들에서, 무작위 통합 후 표적화 통합이 이어질 수 있다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 관심 생성물을 인코드하는 핵산은 PKM 폴리펩티드, 예컨대, PKM-1의 발현이 녹다운 또는 녹아웃되도록 조절된 세포의 게놈에 표적화된 방식으로 통합될 수 있으며 동일한 관심 생성물을 인코드하는 핵산은 표적화된 방식으로 세포의 게놈에 통합될 수 있다.
특정 구체예들에서, 숙주 세포는 RI 숙주 세포이다. 특정 구체예들에서, 숙주 세포는 TI 숙주 세포이다.
5.4 세포 배양 방법
한 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 세포를 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 생산 방법을 제공한다. 당업계에 공지된 포유류 세포들의 적합한 배양 조건들이 본원의 세포들을 배양하기 위해 사용될 수 있으며 (J. Immunol. Methods (1983) 56:221-234) 또는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다 (예를 들면, Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickwood, D. and Hames, B. D., eds. Oxford University Press, New York (1992)참고).
포유류 세포 배양은 배양되는 특정 세포에 적합한 배지에서 준비될 수 있다. 상업적으로 구입가능한 배지, 가령, Ham사의 F10 (Sigma), 최소 필수 배지 (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 Dulbecco사의 변형된 Eagle 배지 (DMEM, Sigma)는 예시적인 영양 솔루션이다. 또한, Ham and Wallace, (1979) Meth. Enz., 58:44; Barnes and Sato, (1980) Anal. Biochem., 102:255; 미국 특허 제 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 5,122,469 또는 미국 특허 제 4,560,655; 국제 공개 특허출원 제 WO 90/03430; 및 WO 87/00195에 기재된 임의의 배지가 배양 배지로 사용될 수 있으며; 이들 모두의 내용은 본원에 참고문헌으로 포함된다. 이러한 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (가령, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (가령, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액 (가령, HEPES), 뉴클레오시드 (가령, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (가령, 겐타마이신 (겐타미신), 미량 원소 (일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 지질 (가령, 리놀레산 또는 기타 지방산) 및 이들의 적합한 담체, 포도당 또는 균등한 에너지원으로 보충 될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제들은 또한 당업자들에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다.
특정 구체예들에서, PKM 폴리펩티드의 발현을 감소 및/또는 제거하도록 변형된 포유류 세포는 CHO 세포이다. 임의의 적합한 배지를 사용하여 CHO 세포를 배양할 수 있다. 특정 구체예들에서, CHO 세포 배양에 적합한 배지는 변형된 농도의 일부 성분들, 가령, 아미노산, 염, 당, 및 비타민, 그리고 선택적으로 함유되는 극리신, 하이포잔틴, 및 티미딘을 가지는, 기본 배지 성분, 가령, DMEM/HAM F-12계 제제 (DMEM 및 HAM F12 배지의 조성에 관하여, 세포주 및 하이브리도마에 관한 미국 표준 균주 카탈로그, Sixth Edition, 1988, 346-349 페이지의 배양 배지 배합을 참고) (미국 특허 제 5,122,469에 기재된 배지의 배합이 특히 적절함); 재조합 인간 인슐린, 가수분해 펩톤, 가령, Primatone HS 또는 Primatone RL (Sheffield, 영국), 또는 이의 균등물; 세포 보호제, 가령, Pluronic F68 또는 이와 균등한 플루로닉 폴리올; 젠타마이신; 및 미량 원소들을 포함할 수 있다.
특정 구체예들에서, PKM 폴리펩티드의 발현을 감소 및/또는 제거하도록 변형된 포유류 세포는 재조합 단백질을 발현하는 세포이다. 재조합 단백질은 다양한 세포 배양 조건들하에서 관심 생성물을 발현하는 세포들을 성장시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 대규모 또는 소규모 단백질 생산을 위한 세포 배양 절차는 본 발명의 내용에서 잠재적으로 유용하다. 유동층 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기, 롤러 병 배양, 진탕 플라스크 배양, 또는 교반식 탱크 생물반응기 시스템을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 절차들이 마이크로담체가 있거나 없는 후자의 2개 시스템에서 사용될 수 있으며 대안적으로 회분식, 유가식, 또는 연속식으로 작동될 수 있다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 세포 배양은 교반식 탱크 생물반응기 시스템에서 수행되고 유가식 배양 절차가 사용된다. 유가식 배양에서, 포유류 숙주 세포들 및 배양 배지는 초기에 배양 용기에 공급되고 추가적인 배양 영양소들은 배양하는 동안 연속으로 또는 별개의 증분으로 배양물에 공급되며, 배양 종료 전 주기적으로 세포 및/또는 생성물을 수집하거나 수집하지 않는다. 유가식 배양은, 예를 들면, 반-연속 유가식 배양을 포함할 수 있으며, 여기서 주기적으로 전체 배양물 (세포들 및 배지 포함)이 제거되고 새로운 배지로 대체된다. 유가식 배양은 세포 배양을 위한 모든 성분 (세포 및 모든 배양 영양소 포함)이 배양 과정 시작시 배양 용기에 공급되는 단순 회분식 배양과 구별된다. 유가식 배양은 과정 중에 상청액이 배양 용기로부터 제거되지 않는 한 관류 배양과도 또한 구별 될 수 있다 (관류 배양에서, 세포는, 예컨대, 여과, 캡슐화, 마이크로담체에 고정, 등에 의해 배양물에서 제한되며, 배양 배지는 연속적으로 또는 간헐적으로 도입하고 배양 용기로부터 제거된다).
특정 구체예들에서, 배양 세포들은 특정 숙주 세포 및 고려되는 특정 생산 계획에 적합할 수 있는 임의의 계획 또는 경로에 따라 증폭될 수 있다. 따라서, 본 발명은 단일 단계 또는 다단계 배양 절차를 고려한다. 단일 단계 배양에서, 숙주 세포는 배양 환경에 접종되고, 본 발명의 공정들이 세포 배양의 단일 생산 단계 동안 사용된다. 대안적으로, 다단계 배양이 구상된다. 다단계 배양에서 세포들은 여러 단계들 또는 기들에서 배양 될 수 있다. 예를 들면, 세포들은 제 1 단계 또는 성장 단계 배양에서 성장될 수 있으며, 여기서 저장으로부터 제거될 수 있는 세포들은, 성장 촉진 및 높은 생존력에 적합한 배지에 접종된다. 숙주 세포 배양물에 신선한 배지를 첨가함으로써 세포는 적절한 시기 동안 성장 단계에서 유지 될 수 있다.
특정 구체예들에서, 유가식 또는 연속식 세포 배양 조건들은 세포 배양의 성장 단계에서 포유류 세포들의 성장을 향상시키기 위해 고안된다. 성장 단계에서 세포는 성장에 최대화된 조건하에서 그리고 이러한 시기동안 성장된다. 온도, pH, 용존 산소 (dO2) 등과 같은 배양 조건이 특정 숙주와 함께 사용되며 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 일반적으로 pH는 산 (예컨대, CO2) 또는 염기 (예컨대, Na2CO3 또는 NaOH)를 사용하여 약 6.5와 7.5 사이의 수준으로 조정된다. CHO 세포와 같은 포유류 세포를 배양하는데 적합한 온도 범위는 약 30° 내지 38°C이고 적합한 dO2는 공기 포화도의 5-90%이다.
특정 단계에서 세포들을 사용하여 생산 단계 또는 세포 배양 단계를 접종 할 수 있다. 대안적으로, 전술한 바와 같이, 상기 생산 단계 또는 생산기는 접종 또는 성장 단계 또는 성장기와 연속일 수 있다.
특정 구체예들에서, 본 발명에 기재된 배양 방법들은 세포 배양으로부터, 예컨대, 세포 배양의 생산 단계로부터 생성물을 수확하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 세포 배양 방법들에 의해 생산된 생성물은 제 3 생물반응기, 예컨대, 생산 생물반응기로부터 수확될 수 있다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 개시된 방법들은 세포 배양의 생산 단계 완료시 생성물을 수확하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 생산 단계가 완료되기 전에 생성물을 수확 할 수 있다. 특정 구체예들에서, 특정 세포 밀도가 도달되었으면 세포 배양물로부터 생성물을 수확할 수 있다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 세포 밀도는 수확 전 약 2.0 x 107개 세포들/mL 내지 약 5.0 x 107개 세포들/mL 일 수 있다.
특정 구체예들에서, 세포 배양물로부터 생성물을 수확하는 것은 원심분리, 여과, 음향파 분리, 응집 및 세포 제거 기술 중 하나 이상을 포함 할 수 있다.
특정 구체예들에서, 관심 생성물은 숙주 세포로부터 분비 될 수 있거나 막-결합, 세포질 또는 핵 단백질 일 수 있다. 특정 구체예들에서, 폴리펩티드의 가용성 형태들은 조절된 세포 배양 배지로부터 정제될 수 있고, 폴리펩티드의 막-결합 형태들은 발현 세포들로부터 전체 막 분획을 제조하고 TRITON® X-100 (EMD Biosciences, San Diego, Calif.)와 같은 비이온성 세재로 이들 막을 추출함으로써 정제될 수 있다. 특정 구체예들에서, 세포질 또는 핵 단백질은 숙주 세포들을 용해시키고 (예컨대, 물리적 힘, 초음파 및/또는 세제에 의해), 세포막 분획을 원심분리하여 제거하고 상청액을 보유함으로써 준비될 수 있다.
5.5 생성물
본 발명의 세포 및/또는 방법을 사용하여 본원에 개시된 세포에 의해 발현 될 수 있는 임의의 관심 생성물을 생성 할 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 세포들 및/또는 방법들은 폴리펩티드, 예컨대, 포유류 폴리펩티드의 제조를 위해 사용될 수 있다. 이러한 폴리펩티드의 비-제한적인 예는 호르몬, 수용체, 융합 단백질, 조절 인자, 성장 인자, 보체 시스템 인자, 효소, 응고 인자, 항-응고 인자, 키나제, 사이토카인, CD 단백질, 인터루킨, 치료 단백질, 진단 단백질 및 항체를 포함한다. 본 발명의 세포들 및/또는 방법들은 생산되는 분자, 예컨대, 항체에 특이적이지 않다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 방법들은 치료 및 진단 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체의 생산에 사용될 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 단일특이적 항체 (예컨대, 단일 중쇄 서열 및 단일 경쇄 서열로 구성된 항체, 이러한 쌍의 다량체 포함), 다중특이적 항체 및 이의 항원 결합 단편일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 다중특이적 항체는 이중특이적 항체, 이중에피토프 항체, T-세포-의존성 이중특이적 항체 (TDB), 이중 작용 FAb (DAF) 또는 이의 항원 결합 단편들일 수 있다.
5.5.1 다중특이적 항체
특정 양상들에서, 본원에 제공된 세포들 및 방법들에 의해 생산된 항체는 다중특이적 항체, 예컨대, 이중특이적 항체이다. "다중특이적 항체"는 적어도 2가지 상이한 부위들, 즉, 상이한 항원들 상의 상이한 에피토프 (즉, 이중특이적) 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프 (즉, 이중에피토프)에 대한 결합 특이성을 가지는 단클론 항체들이다. 특정 양상들에서, 다중특이적 항체는 3개 이상의 결합 특이성을 가진다. 다중특이적 항체는 본원에 기재된 전장 항체 또는 항체 단편들로 준비될 수 있다.
다중특이적 항체를 만드는 기술은 상이한 특이성을 보유한 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동-발현 (Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983) 참고) 및 "놉-인-홀 조작기술 (예컨대, 미국 특허 제 5,731,168, 및 Atwell 외, J. Mol. Biol. 270:26 (1997) 참고)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다중특이적 항체는 항체 Fc-이종이량체 분자들을 제조하기 위하여 정전기적 스티어링 효과를 조작 (예컨대, WO 2009/089004 참고); 둘 이상의 항체 또는 단편들을 가교 (예컨대, 미국 특허 제 4,676,980, 및 Brennan 외, Science, 229: 81 (1985)참고); 류신 지퍼를 이용하여 이중-특이적 항체를 제조 (예컨대, Kostelny 외, J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992) 및 WO 2011/034605 참고); 경쇄 미스페어링 문제를 피하기 위하여 통상적인 경쇄 기술을 사용 (예컨대, WO 98/50431 참고); 이중특이적 항체 단편들을 제조하기 위하여 "디아바디" 기술을 사용 (예컨대, Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 참고); 및 단일-사슬 Fv (sFv) 이량체를 사용 (예컨대, Gruber 외, J. Immunol., 152:5368 (1994) 참고); 및 예컨대, Tutt 외 J. Immunol. 147: 60 (1991)에 기재된 삼중특이적 항체들을 제조함으로써 또한 제조될 수 있다.
예를 들어, "옥토푸스 항체" 또는 DVD-Ig를 포함하는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예컨대, WO 2001/77342 및 WO 2008/024715 참고). 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다중특이적 항체의 다른 비-제한적인 예는 WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 및 WO 2013/026831에서 찾을 수 있다. 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예컨대, US 2008/0069820 및 WO 2015/095539 참조).
다중특이적 항체는 또한 동일한 항원 특이성의 하나 이상의 결함 아암들에서 도메인 교차에 의해, 즉, VH/VL 도메인들 (예컨대, WO 2009/080252 및 WO 2015/150447 참조), CH1/CL 도메인들 (예컨대, WO 2009/080253) 또는 완전한 Fab 아암들 (예컨대, WO 2009/080251, WO 2016/016299 참고, 또한 Schaefer 외, PNAS, 108 (2011) 1187-1191, 및 Klein 외, MAbs 8 (2016) 1010-20 참고)을 교환함으로써 비대칭 형태로 제공될 수 있다. 특정 구체예들에서, 다중특이적 항체는 교차-Fab 단편을 포함한다. 용어 "교차-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "교차 Fab 단편"은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환된 Fab 단편을 지칭한다. 교차 Fab 단편은 경쇄 가변 영역 (VL)과 중쇄 불변 영역 1 (CH1)로 구성된 폴리펩티드 사슬과 중쇄 가변 영역 (VH)과 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성된 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 비대칭 Fab 암은 또한 정확한 Fab 페어링을 지시하기 위해 하전되거나 하전되지 않은 아미노산 돌연변이를 도메인 경계면에 도입함으로써 조작 될 수 있다. 예컨대, WO 2016/172485 참고.
다중특이적 항체에 대한 다양한 추가적인 분자 형태들이 당업계에 공지되어 있으며 본원에 포함된다 (예를 들어, Spiess 외, Mol. Immunol. 67 (2015) 95-106 참조).
특정 구체예들에서, 본원에 또한 포함되는 특정 유형의 다중특이적 항체는 표적 세포를 사멸시키기 위한 T 세포들의 재표적화를 위해, 표적 세포, 예컨대, 종양 세포 상의 표면 항원 및 T 세포 수용체 (TCR) 복합체, 가령, CD3의 활성화 불변 성분에 동시에 결합하도록 설계된 이중특이적 항체이다.
이러한 목적에 유용 할 수 있는 이중특이적 항체 형태의 또 다른 비 제한적인 예에는, 2개의 scFv 분자들이 가요성 연결기에 의해 융합되는 소위 "BiTE" (이중특이적 T 세포 참여자) 분자들 (예컨대, WO 2004/106381, WO 2005/061547, WO 2007/042261, 및 WO 2008/119567, Nagorsen and Bδuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011) 참고); 디아바디 (Holliger 외, Prot. Eng. 9, 299-305 (1996)) 및 이의 유도체, 가령, 탠덤 디아바디 ("TandAb"; Kipriyanov 외, J Mol Biol 293, 41-56 (1999)); 디아바디 형태를 기반으로 하지만 추가 안정화를 위한 C-말단 이황화물 다리를 특징으로 하는 "DART" (이중 친화도 재표적화) 분자들 (Johnson 외, J Mol Biol 399, 436-449 (2010)), 및 전체 하이브리드 마우스/래트 IgG 분자들인 소위 트리오맙 (Seimetz 외, Cancer Treat. Rev. 36, 458-467 (2010)에서 검토)이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에 포함되는 특정한 T 세포 이중특이적 항체 형태들은 WO 2013/026833, WO 2013/026839, WO 2016/020309; Bacac 외, Oncoimmunology 5(8) (2016) el203498에 기재되어 있다.
5.5.2 항체 단편들
특정 양상들에서, 본원에 제공된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 항체 단편이다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH 또는 F(ab')2 단편, 특히, Fab 단편이다. 무손상 항체들의 파파인 분해는 각각 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (각각 VH 및 VL) 및 경쇄의 불변 도메인 (CL) 및 중쇄의 제 1 불변 도메인 (CH1) 또한 함유하는 2개의 동일한 항원-결합 단편들, 소위 "Fab" 단편들을 생성한다. 따라서 용어 "Fab 단편"은 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 경쇄 및 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 단편을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. Fab' 단편은 항체 힌지(hinge)의 영역으로부터의 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하여 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 잔기들의 부가에 의해, Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본 명세서에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab' 단편이다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위 (2개의 Fab 단편) 및 Fc 영역의 일부를 갖는 F(ab')2 단편을 생성한다. 구난(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고, 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편들의 논의는 미국 특허 제 5,869,046을 참고한다.
특정 구체예들에서, 항체 단편은 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디이다. "디아바디"는 이가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 가진 항체 단편들이다. 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson 외, Nat. Med. 9:129-134 (2003); 그리고 Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)을 참고한다. 트리아바디(Triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies) 또한 Hudson 외. Nat. Med. 9:129-134 (2003)에서 설명된다.
한 추가 양상에서, 항체 단편은 단일 사슬 Fab 단편이다. "단일 사슬 Fab 단편"또는 "scFab"은 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 중쇄 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 연결기로 구성된 폴리펩티드로서, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 연결기는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음 순서 중 하나를 갖는다: a) VH-CH1-연결기-VL-CL, b) VL-CL-연결기-VH-CH1, c) VH-CL-연결기-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-연결기-VH-CL. 특히, 상기 연결기는 적어도 30개 아미노산, 바람직하게는 32개 내지 50개 아미노산의 폴리펩티드이다. 상기 단일 사슬 Fab 단편은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이의 자연 이황화 결합을 통해 안정화된다. 또한, 이들 단일 사슬 Fab 단편은 (예를 들어, Kabat 넘버링에 따라 가변 중쇄에서 위치 44 및 가변 경쇄에서 위치 100) 시스테인 잔기의 삽입을 통한 사슬간 이황화 결합의 생성에 의해 추가로 안정화 될 수 있다.
또 다른 양상에서, 항체 단편은 단일-사슬 가변 단편 (scFv)이다. "단일-사슬 가변 단편" 또는 "scFv"는 연결기에 의해 연결된 항체의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 도메인의 융합 단백질이다. 특히, 연결기는 10 내지 25개 아미노산의 짧은 폴리펩티드이며 일반적으로 가요성을 위해 글리신, 용해도를 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부하며, VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연결할 수 있거나 그 반대일 수 있다. 이 단백질은 불변 영역의 제거와 연결기의 도입에도 불구하고 원래 항체의 특이성을 유지한다. scFv 단편들의 검토는 예로써, Pluckth
Figure pat00003
n, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); WO 93/16185; 그리고 미국 특허 제 5,571,894 및 5,587,458을 또한 참고한다.
또 다른 양상에서, 항체 단편은 단일-도메인 항체이다. "단일-도메인 항체"는 이 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부분 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부분을 포함하는 항체 단편들이다. 특정 양상들에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예로써, 미국 특허 제 6,248,516 B1 참고).
항체 단편은 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이에는 손상되지 않은 항체의 단백질분해 절단을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
5.5.3 키메라 및 인간화 항체
특정 양상들에서, 본원에 제공된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예로써, U.S. 특허번호 4,816,567; 그리고 Morrison 외 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))에서 설명된다. 일 예에서, 키메라 항체는 비인간 가변 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비인간 영장류, 예컨대, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 한 추가 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 부모 항체의 클래스로부터 변화되어 있는 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 양상들에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성이 감소되지만, 모체 비-인간 항체의 특이성 및 친화도는 유지된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 또는 그 이상의 가변적 도메인을 포함하는데, CDR들, (또는 이의 부분들)는 비-인간 항체로부터 유도되고, FRs (또는 이의 부분들)은 인간 항체 서열로부터 유도된다. 인간화된 항체는 선택적으로 인간 불변 영역의 최소한 일부분을 또한 포함할 것이다. 특정 구체예들에 있어서, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기는 비-인간 항체 (예로써, CDR 잔기가 유도된 항체)의 대응 잔기로 대체되어, 예로써, 항체 특이성 또는 친화도가 복원 또는 개선된다.
인간화된 항체 및 이를 만드는 방법들은 예로써, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 볼 수 있고, 그리고 예로써, Riechmann 외, Nature 332:323-329 (1988); Queen 외, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 제 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri 외, Methods 36:25-34 (2005) (특이성 결정 영역 (SDR) 접목을 설명); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) ("재표면화(resurfacing)"을 설명); Dall'Acqua 외, Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링(shuffling)"을 설명); 그리고 Osbourn 외, Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka 외, Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "유도된 선별" 방법 설명)에서 추가 설명된다.
인간화에 이용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: "최적-적합 (best-fit)" 방법을 이용하여 선별된 프레임워크 영역 (예로써, Sims 외, J. Immunol. 151:2296 (1993) 참고); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위 집단의 인간항체의 공통 서열로부터 유도된 프레임워크영역 (예로써, Carter 외, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 그리고 Presta 외, J. Immunol., 151:2623 (1993) 참고); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역 (예로써, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 참고); 그리고 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유도된 프레임워크 영역(예로써, Baca 외, J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok 외, J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996) 참고).
5.5.4 인간 항체
특정 양상들에서, 본원에 제공된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 해당 분야에 공지된 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 인간 항체는 전반적으로 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에서 설명된다.
항원 공격접종 (challenge)에 반응하여, 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 가진 무손상 항체를 만들기 위하여 변형된 유전자삽입 동물에 면역원을 주사함으로써, 인간 항체를 만들 수 있다. 이러한 동물은 통상적으로, 내인성 면역글로불린 유전자 좌위를 대체하거나, 염색체외 존재하거나 무작위로 동물의 염색체에 통합된, 인간 면역글로불린 유전자 좌위의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 유전자삽입 마우스에서 상기 내생적 면역글로불린 좌위는 일반적으로 비활성화 되어있다. 유전자삽입 동물로부터 인간 항체를 획득하는 방법은 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)을 참고하라. 또한, 예로써, 미국 특허 제 6,075,181 및 6,150,584에서는 XENOMOUSETM 기술을 설명하고; 미국 특허 제 5,770,429에서는 HuMab® 기술을 설명하고; 미국 특허 제 7,041,870에서는 K-M MOUSE® 기술을 설명하고, 그리고 미국 공개특허 출원 US 2007/0061900에서는 VELOCIMOUSE® 기술을 설명한다). 이러한 동물에 의해 생성되는 무손상 항체의 인간 가변적 영역은 예로써, 상이한 인간 불변 영역과 복합됨으로써 추가 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법들에 의해 만들어질 수 있다. 인간 단클론 항체를 만들기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 설명된 바 있다. (예컨대, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur 외, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner 외, J. Immunol., 147: 86 (1991)참고) 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통하여 생성된 인간 항체가 Li 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에서 설명된다. 추가 방법들은 예를 들면, 미국 특허 제 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단클론 인간 IgM 항체의 생산을 설명) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 설명)에서 설명된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (Trioma technology)은 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005)에서 또한 설명된다.
5.5.5 표적 분자
본원에 개시된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체에 의해 표적화 될 수 있는 분자의 비-제한적인 예는 가용성 혈청 단백질 및 이들의 수용체 및 기타 막 결합 단백질 (예를 들어, 아데신)을 포함한다. 특정 구체예들에서, 본원에 개시된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 8MPI, 8MP2, 8MP38 (GDFIO), 8MP4, 8MP6, 8MP8, CSFI (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGF1 (αFGF), FGF2 (
Figure pat00004
FGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFN81, IFNG, IFNWI, FEL1, FEL1 (EPSELON), FEL1 (ZETA), IL 1A, IL 1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL 11, IL 12A, IL 12B, IL 13, IL 14, IL 15, IL 16, IL 17, IL 17B, IL 18, IL 19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBb3, LTA (TNF-
Figure pat00005
), LTB, TNF (TNF-α), TNFSF4 (OX40 리간드), TNFSF5 (CD40 리간드), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 리간드), TNFSF8 (CD30 리간드), TNFSF9 (4-1 BB 리간드), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (AP03L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, IL1R1, IL1R2, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, IL10RA, IL10RB, IL 11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP (렙틴), PTN, 및 THPO.k로 구성된 그룹에서 선택된, 하나, 둘 이상의 사이토카인, 사이토카인-관련 단백질, 및 사이토카인 수용체들에 결합할 수 있다.
특정 구체예들에서, 본원에 개시된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 CCLI (1-309), CCL2 (MCP -1/MCAF), CCL3 (MIP-Iα), CCL4 (MIP-I
Figure pat00006
), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCL11 (에오탁신), CCL 13 (MCP-4), CCL 15 (MIP-Iδ), CCL 16 (HCC-4), CCL 17 (TARC), CCL 18 (PARC), CCL 19 (MDP-3b), CCL20 (MIP-3α), CCL21 (SLC/엑소두스-2), CCL22 (MDC/ STC-1), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2 /에오탁신-2), CCL25 (TECK), CCL26 (에오탁신-3), CCL27 (CTACK / ILC), CCL28, CXCLI (GROI), CXCL2 (GR02), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL 10 (IP 10), CXCL 11 (1-TAC), CXCL 12 (SDFI), CXCL 13, CXCL 14, CXCL 16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL 1 (SCYDI), SCYEI, XCLI (림포탁틴), XCL2 (SCM-I
Figure pat00007
), BLRI (MDR15), CCBP2 (D6/JAB61), CCRI (CKRI/HM145), CCR2 (mcp-IRB IRA), CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/S TRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBII), CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR- L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), XCR1 (GPR5/CCXCR1), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Rα), IL8RB (IL8R
Figure pat00008
), LTB4R (GPR16), TCP10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5, C5R1, CSF3, GRCC10 (C10), EPO, FY (DARC), GDF5, HDF1, HDF1α, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREM1, TREM2, 및 VHL로 구성된 그룹에서 선택된 케모카인, 케모카인 수용체, 또는 케모카인-관련 단백질에 결합할 수 있다.
특정 구체예들에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 항체 (예컨대, 다중특이적 항체, 가령, 이중특이적 항체)는 다음에서 선택된 하나 이상의 표적 분자들에 결합할 수 있다: 0772P (CA125, MUC16) (즉, 난소 암 항원), ABCF1; ACVR1; ACVR1B; ACVR2; ACVR2B; ACVRL1; ADORA2A; 아그리칸; AGR2; AICDA; AIF1; AIG1; AKAP1; AKAP2; AMH; AMHR2; 아밀로이드 베타; ANGPTL; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOC1; AR; ASLG659; ASPHD1 (아스파테이트 베타-하이드록실라제 도메인; LOC253982); AZGP1 (아연-a-당단백질); B7.1; B7.2; BAD; BAFF-R (B 세포-활성화 인자 수용체, BLyS 수용체 3, BR3; BAG1; BAI1; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRI (MDR15); BMP1; BMP2; BMP3B (GDF10); BMP4; BMP6; BMP8; BMPR1A; BMPR1B (골 형태형성 단백질 수용체-유형 IB); BMPR2; BPAG1 (플렉틴); BRCA1; 브레비칸; C19orf10 (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANT1; CASP1; CASP4; CAV1; CCBP2 (D6/JAB61); CCL1 (1-309); CCL11 (에오탁신); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP1δ); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3
Figure pat00009
); CCL2 (MCP-1); MCAF; CCL20 (MIP-3α); CCL21 (MTP-2); SLC; 엑소두스-2; CCL22 (MDC/STC-1); CCL23 (MPIF-1); CCL24 (MPIF-2/에오탁신-2); CCL25 (TECK); CCL26 (에오탁신-3); CCL27 (CTACK/ILC); CCL28; CCL3 (MTP-Iα); CCL4 (MDP-I
Figure pat00010
); CCL5(RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNA1; CCNA2; CCND1; CCNE1; CCNE2; CCR1 (CKRI/HM145); CCR2 (mcp-IR
Figure pat00011
/RA);CCR3 (CKR/CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5/ChemR13); CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/ DRY6); CCR7 (CKBR7/EBI1); CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-L1); CCR9 (GPR-9-6); CCRL1 (VSHK1); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CD1C; CD20; CD200; CD22 (B-세포 수용체 CD22-B 동형); CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A (CD79α, 면역글로불린-관련 알파, B 세포-특이적 단백질); CD79B; CDS; CD80; CD81; CD83; CD86; CDH1 (E-카드헤린); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKN1A (p21/WAF1/Cip1); CDKN1B (p27/Kip1); CDKN1C; CDKN2A (P16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CER1; CHGA; CHGB; 키티나제; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3;CLDN7 (클라우딘-7); CLL-1 (CLEC12A, MICL, 및 DCAL2); CLN3; CLU (클러스테린); CMKLR1; CMKOR1 (RDC1); CNR1; COL 18A1; COL1A1; COL4A3; COL6A1; 보체 인자 D; CR2; CRP; CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유래 성장 인자); CSFI (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA4; CTNNB1 (b-카테닌); CTSB (카텝신 B); CX3CL1 (SCYDI); CX3CR1 (V28); CXCL1 (GRO1); CXCL10 (IP-10); CXCL11 (I-TAC/IP-9); CXCL12 (SDF1); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-78/LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR5 (버킷 림프종 수용체 1, G 단백질-결합된 수용체); CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo); CYB5; CYC1; CYSLTR1; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCLI; DPP4; E16 (LAT1, SLC7A5); E2F1; ECGF1; EDG1; EFNA1; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EphB2R; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESR1; ESR2; ETBR (엔도텔린 B형 수용체); F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCER1A; FCER2; FCGR3A; FcRH1 (Fc 수용체-유사 단백질 1); FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (포스파타제 고정 단백질 1a를 함유하는 SH2 도메인), SPAP1B, SPAP1C); FGF; FGF1 (αFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR; FGFR3; FIGF (VEGFD); FEL1 (EPSILON); FIL1 (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRTI (피브로넥틴); FLT1; FOS; FOSL1 (FRA-1); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEB1; GAGEC1; GALNAC4S-6ST; GAT A3; GDF5; GDNF-Ra1 (GDNF 패밀리 수용체 알파 1; GFRA1; GDNFR; GDNFRA; RETL1; TRNR1; RET1L; GDNFR-알파1; GFR-알파-1); GEDA; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNASI; GNRHI; GPR2 (CCR10); GPR19 (G 단백질-결합된 수용체 19; Mm.4787); GPR31; GPR44; GPR54 (KISS1 수용체; KISS1R; GPR54; HOT7T175; AXOR12); GPR81 (FKSG80); GPR172A (G 단백질-결합된 수용체 172A; GPCR41; FLJ11856; D15Ertd747e);GRCCIO (CIO); GRP; GSN (겔솔린); GSTP1; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIF1A; HOP1; 히스타민 및 히스타민 수용체; HLA-A; HLA-DOB (MHC 클래스 II 분자의 베타 소단위 (Ia 항원); HLA-DRA; HM74; HMOXI; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; 1D2; IFN-a; IFNA1; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFN감마; DFNW1; IGBP1; IGF1; IGF1R; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-1; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; ILIA; IL1B; ILIF10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HY1; IL1R1; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2; IL1RL1; IL1RL2, ILIRN; IL2; IL20; IL20Rα; IL21 R; IL22; IL-22c; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (당단백질 130); 인플루엔자 A; 인플루엔자 B; EL7; EL7R; EL8; IL8RA; DL8RB; IL8RB; DL9; DL9R; DLK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAKI; IRTA2 (면역글로불린 수퍼패밀리 수용체 전위 관련 2); ERAK2; ITGA1; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (a6 인테그린); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b4 인테그린); α4
Figure pat00012
7 및 αE
Figure pat00013
7 인테그린 이종이량체; JAG1; JAK1; JAK3; JUN; K6HF; KAI1; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLKIO; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (케라틴 19); KRT2A; KHTHB6 (모발-특이적 유형 H 케라틴); LAMAS; LEP (렙틴); LGR5 (류신-풍부 반복서열-함유 G 단백질-결합된 수용체 5; GPR49, GPR67); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; LY64 (림프구 항원 64 (RP105), 류신 풍부 반복서열 (LRR) 패밀리의 유형 I 막 단백질); Ly6E (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 E; Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-l); Ly6G6D (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 G6D; Ly6-D, MEGT1); LY6K (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K; LY6K; HSJ001348; FLJ35226); MACMARCKS; MAG 또는 OMgp; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MDP; MIB1; 미드카인; MEF; MIP-2; MKI67; (Ki-67); MMP2; MMP9; MPF (MPF, MSLN, SMR, 거핵구 증강 인자, 메소텔린); MS4A1; MSG783 (RNF124, 가설 단백질 FLJ20315);MSMB; MT3 (메탈로티오넥틴-111); MTSS1; MUC1 (뮤신); MYC; MY088; Napi3b (NaPi2b로도 공지) (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 담체 패밀리 34 (소듐 포스페이트), 구성원 2, 유형 II 나트륨-의존성 포스페이트 전달체 3b); NCA; NCK2; 뉴로칸; NFKB1; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NME1 (NM23A); NOX5; NPPB; NR0B1; NR0B2; NR1D1; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR112; NR113; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRP1; NRP2; NT5E; NTN4; ODZI; OPRD1; 0X40; P2RX7; P2X5 (퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이트된 이온 채널 5); PAP; PARTI; PATE; PAWR; PC A3; PCNA; PD-L1; PD-L2; PD-1; POGFA; POGFB; PEC AMI; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; 포스파칸; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDC1; PMEL17 (은 상동체; SILV; D12S53E; PMEL17; SI; SIL); PPBP (CXCL7); PPID; PRI; PRKCQ; PRKDI; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자); PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21 Rac2); RARB; RET (ret 원-종양유전자; MEN2A; HSCR1; MEN2B; MTC1; PTC; CDHF12; Hs. 168114; RET51; RET-ELE1); RGSI; RGS13; RGS3; RNF110 (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2 (리포필린 B); SCGB2A1 (맘마글로빈2); SCGB2A2 (맘마글로빈 1); SCYEI (상피 단핵구-활성화 사이토카인); SDF2; Serna 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, 세마 도메인, 7가지 트롬보스폰딘 반복서열 (유형 1 및 유형 1-유사), 막경유 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B); SERPINA1; SERPINA3; SERP1NB5 (마스핀); SERPINEl(PAI-l); SERPDMF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPI; SPRR1B (Sprl); ST6GAL1; STABI; STAT6; STEAP (전립선의 6가지 막경유 상피 항원); STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선 암 관련 유전자 1, 전립선 암 관련 단백질 1, 전립선 2의 6가지 막경유 상피 항원, 6가지 막경유 전립선 단백질); TB4R2; TBX21; TCPIO; TOGFI; TEK; TENB2 (추정 막경유 프로테오글리칸); TGFA; TGFBI; TGFB1II; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBRI; TGFBR2; TGFBR3; THIL; THBSI (트롬보스폰딘-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TMP3; 조직 인자; TLR1; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TLR10; TMEFF1 (EGF-유사 및 2개의 폴리스타틴-유사 도메인들 1을 가지는 막경유 단백질; 토모레귤린-1); TMEM46 (시사 상동체 2); TNF; TNF-a; TNFAEP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSFIIA; TNFRSF1A; TNFRSF1B; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSF10 (TRAIL); TNFSF11 (TRANCE); TNFSF12 (AP03L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (OX40 리간드); TNFSF5 (CD40 리간드); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (CD27 리간드); TNFSFS (CD30 리간드); TNFSF9 (4-1 BB 리간드); TOLLIP; 톨-유사 수용체; TOP2A (국소이성화효소 Ea); TP53; TPM1; TPM2; TRADD; TMEM118 (링 핑거 단백질, 막경유 2; RNFT2; FLJ14627); TRAF1; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREM1; TREM2; TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 M, 구성원 4); TRPC6; TSLP; TWEAK; 티로시나제 (TYR; OCAIA; OCA1A; 티로시나제; SHEP3);VEGF; VEGFB; VEGFC; 베르시칸; VHL C5; VLA-4; XCL1 (림포탁틴); XCL2 (SCM-1b); XCRI(GPR5/ CCXCRI); YY1; 및 ZFPM2.
특정 구체예들에서, 본원에 개시된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 CD 단백질, 가령, CD3, CD4, CD5, CD16, CD19, CD20, CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡스타인 바 바이러스 수용체) 또는 Hs.73792); CD33; CD34; CD64; CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2); CD79b (CD79B, CD79P, IGb (면역글로불린-관련 베타), B29); ErbB 수용체 패밀리, 가령, EGF 수용체, HER2, HER3, 또는 HER4 수용체의 CD200 구성원; 세포 부착 분자, 가령, LFA-1, Mac1, pl50.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 알파4/베타7 인테그린, 및 이의 알파 또는 베타 소단위를 포함하는 알파v/베타3 인테그린 (예컨대, 항-CD11a, 항-CD18, 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자, 가령, VEGF-A, VEGF-C; 조직 인자 (TF); 알파 인터페론 (알파IFN); TNF알파, 인터루킨, 가령, IL-1 베타, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-13, IL 17 AF, IL-1S, IL-13R 알파1, IL13R 알파2, IL-4R, IL-5R, IL-9R, IgE; 혈액형 항원들; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; RANKL, RANK, RSV F 단백질, 단백질 C 등에 결합할 수 있다
특정 구체예들에서, 본원에 제공된 세포 및 방법은 보체 단백질 C5에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 다중특이적 항체, 가령, 이중특이적 항체) (예컨대, 인간 C5에 특이적으로 결합하는 항-C5 효현제 항체)를 생산하는데 사용될 수 있다. 특정 구체예들에서, 항-C5 항체는 (a) SSYYMA (서열 번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) AIFTGSGAEYKAEWAKG (서열 번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) DAGYDYPTHAMHY (서열 번호: 27)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (d) RASQGISSSLA (서열 번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (e) GASETES (서열 번호: 29)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (f) QNTKVGSSYGNT (서열 번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 CDR을 포함한다. 예를 들면, 특정 구체예들에서, 항-C5 항체는: (a) SSYYMA (서열 번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) AIFTGSGAEYKAEWAKG (서열 번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) DAGYDYPTHAMHY (서열 번호: 27)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3에서 선택된 1, 2, 또는 3개 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열; 및/또는 (d) RASQGISSSLA (서열 번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (e) GASETES (서열 번호: 29)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (f) QNTKVGSSYGNT (서열 번호: 30)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3에서 선택된 1, 2, 또는 3개 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 상기 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 상기 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열은 US 2016/0176954에 각각 서열 번호: 117, 서열 번호: 118, 서열 번호: 121, 서열 번호: 122, 서열 번호: 123 및 서열 번호: 125로 개시되어있다. (US 2016/0176954의 표 7 및 8 참조.)
특정 구체예들에서, 상기 항-C5 항체는 각각 QVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTVH SSYYMAWVRQ APGKGLEWVG AIFTGSGAEY KAEWAKGRVT ISKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCASD AGYDYPTHAM HYWGQGTLVT VSS (서열 번호: 31)
및
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SSLAWYQQKP GKAPKLLIYG ASETESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN TKVGSSYGNT FGGGTKVEIK (서열 번호: 32)의 VH 및 VL 서열들을 포함하며, 이들 서열들의 번역후 변형들이 포함된다. 상기 VH 및 VL 서열들은 US 2016/0176954에 각각 서열 번호: 106 및 서열 번호: 111로 개시되어 있다. (US 2016/0176954의 표 7 및 8 참고.) 특정 구체예들에서, 항-C5 항체는 305L015이다 (US 2016/0176954 참고).
특정 구체예들에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 항체는 OX40에 결합할 수 있다 (예컨대, 인간 OX40에 특이적으로 결합하는 항-OX40 효현제 항체). 특정 구체예들에서, 항-OX40 항체는 (a) DSYMS (서열 번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) DMYPDNGDSSYNQKFRE (서열 번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) APRWYFSV (서열 번호: 4)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (d) RASQDISNYLN (서열 번호: 5)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (e) YTSRLRS (서열 번호: 6)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (f) QQGHTLPPT (서열 번호: 7)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 CDR을 포함한다. 예를 들면, 특정 구체예들에서, 항-OX40 항체는: (a) DSYMS (서열 번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) DMYPDNGDSSYNQKFRE (서열 번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) APRWYFSV (서열 번호: 4)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3에서 선택된 1, 2, 또는 3개 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열 및/또는 (a) RASQDISNYLN (서열 번호: 5)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (b) YTSRLRS (서열 번호: 6)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (c) QQGHTLPPT (서열 번호: 7)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3에서 선택된 1, 2, 또는 3개 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 특정 구체예들에서, 항-OX40 항체는 각각 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DSYMSWVRQA PGQGLEWIGD MYPDNGDSSY NQKFRERVTI TRDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCVLAP RWYFSVWGQG TLVTVSS (서열 번호: 8)
및
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GHTLPPTFGQ GTKVEIK (서열 번호: 9)의 VH 및 VL 서열들을 포함하며, 이들 서열들의 번역후 변형들을 포함한다.
특정 구체예들에서, 항-OX40 항체는 (a) NYLIE (서열 번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) VINPGSGDTYYSEKFKG (서열 번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) DRLDY (서열 번호: 12)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (d) HASQDISSYIV (서열 번호: 13)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (e) HGTNLED (서열 번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (f) VHYAQFPYT (서열 번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 CDR을 포함한다. 예를 들면, 특정 구체예들에서, 항-OX40 항체는: (a) NYLIE (서열 번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) VINPGSGDTYYSEKFKG (서열 번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) DRLDY (서열 번호: 12)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3에서 선택된 1, 2, 또는 3개 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열 및/또는 (a) HASQDISSYIV (서열 번호: 13)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (b) HGTNLED (서열 번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (c) VHYAQFPYT (서열 번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3에서 선택된 1, 2, 또는 3개 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 특정 구체예들에서, 항-OX40 항체는 각각 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYAFT NYLIEWVRQA PGQGLEWIGV INPGSGDTYY SEKFKGRVTI TRDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCARDR LDYWGQGTLV TVSS (서열 번호: 16)
및
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCHASQDIS SYIVWYQQKP GKAPKLLIYH GTNLEDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCVH YAQFPYTFGQ GTKVEIK (서열 번호: 17)의 VH 및 VL 서열들을 포함하며, 이들 서열들의 번역후 변형들을 포함한다.
항-OX40 항체에 관한 추가 세부 사항은 WO 2015/153513에 제공되며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
특정 구체예들에서, 본원에 개시된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 인플루엔자 바이러스 B 적혈구응집소, 즉, "fluB"에 결합 할 수 있다 (예컨대, 시험관내에서 및/또는 생체내에서 인플루엔자 B 바이러스의 야마가타 계통의 적혈구응집소에 결합하는, 인플루엔자 B 바이러스의 빅토리아 계통의 적혈구응집소에 결합하는, 인플루엔자 B 바이러스의 조상 계통의 적혈구응집소에 결합하는, 또는 인플루엔자 B 바이러스의 야마가타 계통, 빅토리아 계통, 및 조상 계통의 적혈구응집소에 결합하는 항체). 항-FluB 항체에 관한 추가 세부 사항은 WO 2015/148806에 제공되며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
특정 구체예들에서, 본원에 개시된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 (LRP)-1 또는 LRP-8 또는 트랜스페린 수용체에 결합 할 수 있으며, 베타-세크레타제 (BACE1 또는 BACE2), 알파-세크레타제, 감마-세크레타제, 타우-세크레타제, 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), 사멸 수용체 6 (DR6), 아밀로이드 베타 펩티드, 알파-시누클레인, 파킨, 헌팅틴, p75 NTR, CD40 및 카스파제-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적에 결합 할 수 있다.
특정 구체예들에서, 본원에 개시된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 CD40에 대한 인간 IgG2 항체이다. 특정 구체예들에서, 항-CD40 항체는 RG7876이다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 세포 및 방법을 사용하여 폴리펩티드를 생성 할 수 있다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 폴리펩티드는 표적화된 면역사이토카인이다. 특정 구체예들에서, 표적화된 면역사이토카인은 CEA-IL2v 면역사이토카인이다. 특정 구체예들에서, CEA-IL2v 면역사이토카인은 RG7813이다. 특정 구체예들에서, 표적화된 면역사이토카인은 FAP-IL2v 면역사이토카인이다. 특정 구체예들에서, FAP-IL2v 면역사이토카인은 RG7461이다.
특정 구체예들에서, 본원에 제공된 세포 또는 방법에 의해 생성된 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체)는 CEA 및 적어도 하나의 추가 표적 분자에 결합 할 수 있다. 특정 구체예들에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생성된 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체)는 종양 표적화 사이토카인 및 적어도 하나의 추가 표적 분자에 결합 할 수 있다. 특정 구체예들에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생성된 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체)는 IL2v (즉, 인터루킨 2 변이체)에 융합되고 IL1 기반 면역 사이토카인 및 적어도 하나의 추가 표적 분자에 결합한다. 특정 구체예들에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생성된 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체)는 T-세포 이중특이적 항체 (즉, 이중특이적 T-세포 참여자 또는 BiTE)이다.
특정 구체예들에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생성된 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체)는 다음에서 선택도인 적어도 2개의 표적 분자들에 결합할 수 있다: IL-1 알파 및 IL- 1 베타, IL-12 및 IL-1S; IL-13 및 IL-9; IL-13 및 IL-4; IL-13 및 IL-5; IL-5 및 IL-4; IL-13 및 IL-1베타; IL-13 및 IL- 25; IL-13 및 TARC; IL-13 및 MDC; IL-13 및 MEF; IL-13 및 TGF-~; IL-13 및 LHR 효현제; IL-12 및 TWEAK, IL-13 및 CL25; IL-13 및 SPRR2a; IL-13 및 SPRR2b; IL-13 및 ADAMS, IL-13 및 PED2, IL17A 및 IL17F, CEA 및 CD3, CD3 및 CD19, CD138 및 CD20; CD 138 및 CD40; CD19 및 CD20; CD20 및 CD3; CD3S 및 CD13S; CD3S 및 CD20; CD3S 및 CD40; CD40 및 CD20; CD-S 및 IL-6; CD20 및 BR3, TNF 알파 및 TGF-베타, TNF 알파 및 IL-1 베타; TNF 알파 및 IL-2, TNF 알파 및 IL-3, TNF 알파 및 IL-4, TNF 알파 및 IL-5, TNF 알파 및 IL6, TNF 알파 및 IL8, TNF 알파 및 IL-9, TNF 알파 및 IL-10, TNF 알파 및 IL-11, TNF 알파 및 IL-12, TNF 알파 및 IL-13, TNF 알파 및 IL-14, TNF 알파 및 IL-15, TNF 알파 및 IL-16, TNF 알파 및 IL-17, TNF 알파 및 IL-18, TNF 알파 및 IL-19, TNF 알파 및 IL-20, TNF 알파 및 IL-23, TNF 알파 및 IFN 알파, TNF 알파 및 CD4, TNF 알파 및 VEGF, TNF 알파 및 MIF, TNF 알파 및 ICAM-1, TNF 알파 및 PGE4, TNF 알파 및 PEG2, TNF 알파 및 RANK 리간드, TNF 알파 및 Te38, TNF 알파 및 BAFF,TNF 알파 및 CD22, TNF 알파 및 CTLA-4, TNF 알파 및 GP130, TNF a 및 IL-12p40, VEGF 및 안지오포이에틴, VEGF 및 HER2, VEGF-A 및 HER2, VEGF-A 및 PDGF, HER1 및 HER2, VEGFA 및 ANG2,VEGF-A 및 VEGF-C, VEGF-C 및 VEGF-D, HER2 및 DR5,VEGF 및 IL-8, VEGF 및 MET, VEGFR 및 MET 수용체, EGFR 및 MET, VEGFR 및 EGFR, HER2 및 CD64, HER2 및 CD3, HER2 및 CD16, HER2 및 HER3; EGFR (HER1) 및 HER2, EGFR 및 HER3, EGFR 및 HER4, IL-14 및 IL-13, IL-13 및 CD40L, JL4 및 CD40L, TNFR1 및 IL-1 R, TNFR1 및 IL-6R 및 TNFR1 및 IL-18R, EpCAM 및 CD3, MAPG 및 CD28, EGFR 및 CD64, CSPGs 및 RGM A; CTLA-4 및 BTN02; IGF1 및 IGF2; IGF 1/2 및 Erb2B; MAG 및 RGM A; NgR 및 RGM A; NogoA 및 RGM A; OMGp 및 RGM A; POL-1 및 CTLA-4; 및 RGM A 및 RGM B.
특정 구체예들에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생성된 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체)는 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체이다. 특정 구체예들에서, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체는 RG7802이다. 특정 구체예들에서, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체는 이하에서 제공되는 서열 번호: 18-21에 제시된 아미노산 서열들을 포함한다:
Figure pat00014
Figure pat00015
(서열 번호: 18)
Figure pat00016
Figure pat00017
(서열 번호: 19)
Figure pat00018
Figure pat00019
(서열 번호: 20)
Figure pat00020
Figure pat00021
Figure pat00022
(서열 번호: 21)
항-CEA/항-CD3 항체에 관한 추가 세부 사항은 WO 2014/121712에 제공되며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
특정 구체예들에서, 본원에 제공된 세포 및 방법에 따라 생성된 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체)는 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체이다. 특정 구체예들에서, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체는 크로스맙 (Crossmab)이다. 특정 구체예들에서, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체는 RG7716이다. 특정 구체예들에서, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체는 이하에서 제공되는 서열 번호: 22-25에 제시된 아미노산 서열들을 포함한다:
Figure pat00023
Figure pat00024
(서열 번호: 22)
Figure pat00025
Figure pat00026
(서열 번호: 23)
Figure pat00027
Figure pat00028
(서열 번호: 24)
Figure pat00029
Figure pat00030
(서열 번호: 25)
특정 구체예들에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생성된 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체)는 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체이다. 특정 구체예들에서, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체는 RG7221이다. 특정 구체예들에서, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체는 CAS 번호 1448221-05-3이다.
선택적으로 다른 분자에 접합된 가용성 항원 또는 이의 단편은 항체 생성을 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 수용체들과 같은 막경유 분자들의 경우, 이들의 단편들 (예컨대, 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 막경유 분자를 발현하는 세포들이 면역원으로 사용될 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원 (예컨대, 암 세포주)으로부터 유래 될 수 있거나 막경유 분자를 발현하기 위해 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포 일 수 있다. 항체 제조에 유용한 다른 항원 및 이의 형태는 당업자에게 명백 할 것이다.
특정 구체예들에서, 본원에 개시된 세포 및 방법에 의해 생성된 폴리펩티드 (예컨대, 항체)는 화학 분자, 가령, 염료 또는 세포독성제, 가령, 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예컨대, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편들), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 추가로 접합될 수 있다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 항체 또는 이중특이적 항체를 포함하는 면역접합체는 중쇄 중 하나만 또는 경쇄 중 하나만 불변 영역에 접합된 세포독성제를 함유 할 수 있다.
5.5.6 항체 변이체
특정 양상들에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체, 예컨대, 섹션 5.5.5에 제공된 항체가 고려된다. 예를 들면, 항체의 상기 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질들을 변화시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체들은 상기 항체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열 내부에 적절한 변형을 도입시킴으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다. 이러한 변형은 예를 들면, 상기 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기 결실, 및/또는 이들 아미노산 서열 내부로의 잔기 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 만일 최종 구조체가 바람직한 특징, 예컨대, 항원-결합을 보유한다면, 최종 구조체에 도달하기 위한 임의의 결실, 삽입, 및 치환의 조합이 이루어질 수 있다.
5.5.6.1 치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정 양상들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들을 갖는 항체 변이체들이 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위에는 CDR들 및 FR들이 포함된다. 보존적 치환들은 표 1에서 "선호적 치환"이라는 제목 아래에 나타낸다. 더 많은 실질적인 변화는 표 1의 "예시적 치환"이라는 제목하에 제시되며, 이는 아미노산 측쇄 클래스를 참고하여 보다 상세히 기재된다. 아미노산 치환들은 바람직한 활성, 예컨대, 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대하여 스크린된 관심 항체 및 생성물 내부에 도입될 수 있다.
표 1
Figure pat00031
Figure pat00032
아미노산은 다음과 같이 공통적인 측쇄 성질들에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성 : 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존성 치환들은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스의 구성원으로 교환하게 할 것이다.
치환성 변이체의 한 가지 유형은 부모 항체의 하나 또는 그 이상의 초가변적 영역 잔기의 치환 (예컨대, 인간화된 또는 인간 항체)과 관련된다. 일반적으로, 추가 연구를 위하여 선별된 생성된 변이체(들)은 부모 항체와 비교하였을 때, 특정 생물학적 성질들의 변형(예컨대, 개선), (예컨대, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)을 가지거나 및/또는 부모 항체의 특정 생물학적 성질들을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환성 변이체는 친화성 성숙 항체이며, 이는 편의상 예컨대, 파지 디스플레이-기반의 친화성 성숙 기술, 가령, 본 명세서에 기재된 것들을 이용하여 생성될 수 있다. 간략하게 설명하자면, 하나 또는 그 이상의 CDR 잔기는 돌연변이되며, 변이체 항체는 파지 상에서 디스플레이되며, 그리고 특정 생물학적 활성 (예컨대, 결합 친화도)에 대하여 스크리닝된다.
변경 (예로써, 치환들)은 예로써, 항체 친화도를 개선하기 위하여 CDR들에서 만들어질 수 있다. 이러한 변경은 CDR에서 "핫스팟(hotspot)", 즉, 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이 되는 코돈에 의해 인코드되는 잔기 (즉, Chowdhury Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), 및/또는 항원을 접촉하는 잔기들에서 생성될 수 있고, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대하여 시험된다. 제 2 라이브러리를 구축하고, 재선별함에 의한 친화도 성숙은 예컨대, Hoogenboom 외. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 외, ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에서 설명되어 있다. 친화도 성숙의 일부 양상들에 있어서, 다양성은 다양한 방법들 중 임의의 방법에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자들에 도입된다(예컨대, 오류-발생(error-prone) PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이생성). 이어서 제 2 라이브러리가 생성된다. 이어서, 이 라이브러리를 스크리닝하여, 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 동정한다. 다양성을 도입하는 또다른 방법은 CDR-지시된 접근법을 포함하는데, 이때 몇개 CDR 잔기 (가령, 한번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 CDR 잔기는 예컨대, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 동정될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 종종 표적이 된다.
일부 양상들에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변이로 인하여 상기 항체가 항원에 결합하는 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 또는 그 이상의 HVR들 안에서 발생될 수 있다. 예를 들면, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (가령, 본 명세서에서 제공된 보존적 치환)이 CDR들에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어, CDR들의 항원 접촉 잔기의 외부에 있을 수 있다. 상기 제시된 특정 변이체 VH 및 VL 서열들에서, 각 CDR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이상의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발의 표적이 될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 확인하는 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에서 설명된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 불린다. 이 방법에서, 표적 잔기 또는 표적 잔기들의 그룹 (예컨대, 하전된 잔기, 가령, arg, asp, his, lys, 및 glu)이 확인되고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예컨대, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어, 항원과 항체의 상호작용이 영향을 받았는지를 판단한다. 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 추가 치환이 도입될 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 이용하여 항체와 항원 간의 접촉점들을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 접촉 잔기와 이웃 잔기는 치환의 후보로서 표적되거나, 또는 제거될 수 있다. 변이체들은 원하는 성질을 내포하는지를 결정하기 위하여 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 한 개 잔기에서 수백 또는 그 이상의 잔기가 함유된 폴리펩티드 범위, 뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입이 포함된 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 상기 항체 분자의 다른 삽입 변이체들은 효소 (예컨대, ADEPT (항체 지시된 효소 전구약물 요법)의 경우)에 항체의 N- 또는 C-말단의 융합 또는 상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 항체의 N- 또는 C-말단의 융합을 포함한다.
5.5.6.2 당화 변이체
특정 양상들에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 이 항체가 당화되는 정도를 증가 또는 감소시키기 위하여 변경된다. 항체의 당화 부위의 추가 또는 결실은 하나 또는 그 이상의 당화 부위가 만들어지거나 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편의적으로 실행될 수 있다.
상기 항체가 Fc 영역을 포함할 때, 이에 부착된 올리고당이 변경될 수 있다. 포유류 세포들에 의해 만들어지는 고유 항체는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-링키지에 의해 일반적으로 부착된 분지화된, 이촉각성(biantennary) 올리고당을 전형적으로 포함한다. 예컨대, Wright 외 TIBTECH 15:26-32 (1997) 참고. 상기 올리고당은 다양한 탄수화물, 예로써, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라 상기 이촉각성 올리고당 구조의 "줄기(stem)"에 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 양상들에서, 특정한 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 본 발명의 항체의 올리고당의 변형이 이루어질 수 있다.
한 양상에서, 비-푸코실화 올리고당, 즉, Fc 영역에 부착된 (직접 또는 간접적으로) 푸코스가 없는 올리고당 구조를 가지는 항체 변이체들이 제공된다. 이러한 비-푸코실화 올리고당 (또한 "아푸코실화" 올리고당으로도 지칭됨)는 특히 이촉각성 올리고당 구조의 줄기에서 첫 번째 GlcNAc에 부착된 푸코스 잔기가 없는 N-연결된 올리고당이다. 한 양상에서, 천연 또는 부모 항체와 비교하여 Fc 영역에서 증가된 비율의 비-푸코실화 올리고당을 갖는 항체 변이체들이 제공된다. 예를 들어, 비-푸코실화 올리고당의 비율은 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 적어도 약 80% 또는 심지어 약 100% (즉, 푸코실화 올리고당이 존재하지 않음) 일 수 있다. 비-푸코실화 올리고당의 백분율은, 예를 들어, WO 2006/082515에 설명되어 있는 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 올리고당 (예컨대, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조들)의 합에 대한 푸코스 잔기가 없는 올리고당의 (평균) 양이다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 위치 297 (Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 항체에서 소수의 서열 변이로 인하여 위치 297의 상류 또는 하류의 약 ± 3의 아미노산, 가령, 위치 294와 300 사이에 또한 위치할 수 있다. Fc 영역에서 증가된 비율의 비-푸코실화 올리고당을 갖는 이러한 항체는 개선된 FcγRIIIa 수용체 결합 및/또는 개선된 효과기 기능, 특히 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예컨대, US 2003/0157108; US 2004/0093621 참고.
푸코실화가 감소된 항체를 생성할 수 있는 세포주들의 예들에는 단백질 푸코실화 결핍 Lec13 CHO 세포들 (Ripka 외 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 2003/0157108; 및 WO 2004/056312, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주들, 가령, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포들 (예컨대, Yamane-Ohnuki 외 Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004); Kanda, Y. 외, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO 2003/085107 참고), 또는 GDP-푸코스 합성 또는 전달체 단백질의 활성이 감소 또는 제거된 세포들 (예컨대, US2004259150, US2005031613, US2004132140, US2004110282 참고)이 포함된다.
한 추가 양상에서, 항체의 Fc 영역의 이촉각성 올리고당이 GlcNAc에 의해 양분되어 있는, 양분된 올리고당을 가진 항체 변이체들이 제공된다. 이러한 항체 변이체들은 상기 기재한 바와 같이 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 보유할 수 있다. 이러한 항체 변이체들의 예들은, 예컨대, Umana 외, Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara 외, Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878에 기재되어 있다.
Fc 영역에 부착된 올리고당에서 최소한 한 개의 갈락토스 잔기를 가진 항체 변이체들이 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체들은 개선된 CDC 기능을 보유할 수 있다. 이러한 항체 변이체들은 예로써, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 그리고 WO 1999/22764에서 설명된다.
5.5.6.3 Fc 영역 변이체
특정 양상들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형이 본 발명의 항체의 Fc 영역 안으로 도입되고, 이로 인하여 Fc 영역 변이체가 만들어질 수 있다. 상기 Fc 영역 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예컨대, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)를 포함할 수 있다.
특정 양상들에서, 본원의 개시 내용은 전체 효과기 기능이 아닌 일부만을 보유하는 항체 변이체를 고려하는데, 이들 변이체는 항체의 반감기도 중요하지만, 특정 효과기 기능 (가령, 보체-의존적 세포독성 (CDC) 및 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC))은 불필요하거나 또는 유해한 용도에 바람직한 후보물질이 될 수 있다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 실행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석을 실행하여, 상기 항체는 FcγR 결합 (이로 인하여 ADCC 활성이 결여될 가능성이 있음)은 없지만, 여전히 FcRn 결합 능력은 유지하고 있다는 것을 확인할 수 있다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포들, NK 세포들은 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포들에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 페이지 464의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적 실시예는 미국 특허 제 5,500,362 (예컨대, Hellstrom, I. 외. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 참고) 및 Hellstrom, I 외, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. 외, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 참고)에 설명되어 있다. 대안으로, 비-방사능활성 분석 방법들이 이용될 수 있다 (예를 들면, 유동 세포측정을 위한 ACTI?? 비-방사능활성 세포독성 분석 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 그리고 CytoTox 96® 비-방사능활성 세포독성 분석 (Promega, Madison, WI) 참고). 이러한 분석에 유용한 효과기 세포들은 말초 혈액 단핵 세포들 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포들을 포함한다. 대안으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은, 예컨대, Clynes 외. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에서 공개된 바와 같은 동물 모델에서 생체내에서 평가될 수 있다. 상기 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 이로 인하여 CDC 활성이 없음을 확인하기 위하여 C1q 결합 분석이 또한 수행될 수 있다. 예컨대, WO 2006/029879와 WO 2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참고. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 분석이 실행될 수 있다 (예를 들면, Gazzano-Santoro 외. J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. 외. Blood. 101:1045-1052 (2003); 그리고 Cragg, M.S. 및 M.J. Glennie Blood. 103:2738-2743 (2004) 참고). FcRn 결합과 생체내 제거/반감기 결정은 당분야에 공지된 방법들을 이용하여 또한 실행될 수 있다 (예로써, Petkova S B. 외, Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929 A1 참고).
감소된 효과기 기능를 가진 항체들은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 또는 그 이상의 치환을 가진 것들을 포함한다 (U.S. 특허 제 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체들은 잔기 265 및 297의 잔기가 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하는, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327중 2개 또는 그 이상에서 치환을 가진 Fc 돌연변이체를 포함한다 (US 특허 제 7,332,581 참고).
FcRs에 대한 결합이 개선된 또는 감소된 특정 항체 변이체들이 설명된다. (가령, 미국 특허 제 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields 외, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). 참고)
특정 양상들에 있어서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 예로써, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다.
특정 양상들에 있어서, 항체 변이체는 FcγR 결합을 감소시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 예로써, Fc 영역의 위치 234 및 235 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 치환은 L234A 및 L235A (LALA)이다. 특정 양상들에서, 항체 변이체는 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에 D265A 및/또는 P329G를 추가로 포함한다. 한 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서의 L234A, L235A 및 P329G (LALA-PG)이다. (예컨대, WO 2012/130831 참고). 또 다른 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서의 L234A, L235A 및 D265A (LALA-DA)이다.
일부 양상들에 있어서, Fc 영역 안에 예로써, 미국 특허 제 6,194,551, WO　99/51642, 및 Idusogie 외, J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에서 설명된 바와 같이, 변경된 (가령, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 초래하는 변형이 만들어진다.
태아로 모계 IgGs의 전달을 담당하는, 증가된 반감기와 신생아의 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합이 개선된 항체들(Guyer 외, J. Immunol. 117:587 (1976) 그리고 Kim 외, J. Immunol. 24:249 (1994))은 US2005/0014934 (Hinton 외)에서 설명된다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 또는 그 이상의 치환들을 가진 Fc 영역을 내부에 포함한다. 이러한 Fc 변이체들은 Fc 영역 잔기의 하나 또는 그 이상에서 치환을 가진 것들을 포함한다: 238, 252, 254, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예로써, Fc 영역 잔기 434의 치환 (예컨대, 미국 특허 제 7,371,826; Dall' Acqua, W.F., 외, J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524 참고).
마우스 Fc-마우스 FcRn 상호작용에 중요한 Fc 영역 잔기는 부위 지정 돌연변이유발에 의해 확인되었다 (예컨대, Dall 'Acqua, WF, 외. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180 참조). 잔기 I253, H310, H433, N434 및 H435 (EU 인덱스 넘버링)는 상호작용에 관여한다 (Medesan, C., 외, Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533; Firan, M., 외, Int. Immunol. 13 (2001) 993; Kim, J.K., 외, Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542). 잔기 I253, H310 및 H435는 인간 Fc와 뮤린 FcRn의 상호 작용에 중요한 것으로 밝혀졌다 (Kim, JK, 외, Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819). 인간 Fc-인간 FcRn 복합체에 관한 연구는 잔기 I253, S254, H435, 및 Y436이 이러한 상호작용에 중요함을 보여주었다 (Firan, M., 외, Int. Immunol. 13 (2001) 993; Shields, R.L., 외, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). Yeung, Y.A., 외 (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671)에서, 잔기 248 내지 259 및 301 내지 317 및 376 내지 382 및 424 내지 437의 다양한 돌연변이체들이 보고되었으며 조사되었다.
특정 양상들에 있어서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 감소시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 예로써, Fc-영역의 위치 253, 및/또는 310, 및/또는 435 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 특정 양상들에서, 항체 변이체는 위치 253, 310 및 435에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 이러한 치환은 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유래된 Fc 영역에서의 I253A, H310A 및 H435A이다. 예컨대, Grevys, A., 외, J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508 참고.
특정 양상들에 있어서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 감소시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 예로써, Fc 영역의 위치 310, 및/또는 433, 및/또는 436 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 특정 양상들에서, 항체 변이체는 위치 310, 433 및 436에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 이러한 치환은 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유래된 Fc 영역에서의 H310A, H433 A 및 Y436A이다. (예컨대, WO 2014/177460 A1 참고).
특정 양상들에 있어서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 증가시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 예로써, Fc 영역의 위치 252, 및/또는 254, 및/또는 256 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 특정 양상들에서, 항체 변이체는 위치 252, 254, 및 256에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 이러한 치환은 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유래된 Fc 영역에서의 M252Y, S254T 및 T256E이다. 또한 Fc 영역 변이체들의 다른 예들에 관련된 Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 제 5,648,260; 미국 특허 제 5,624,821; 그리고 WO 94/29351 참고.
본원에 보고된 항체 중쇄의 C-말단은 아미노산 잔기 PGK로 끝나는 완전한 C-말단 일 수 있다. 중쇄의 C-말단은 C 말단 아미노산 잔기 중 1개 또는 2개가 제거된 단축된 C-말단일 수 있다. 한 바람직한 양상에서, 중쇄의 C-말단은 PG로 끝나는 단축된 C-말단이다. 본원에 보고된 모든 양상들 중 한 양상에서, 본원에 명시된 바와 같은 C-말단 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 C-말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, 아미노산 위치의 EU 인덱스 넘버링)를 포함한다. 본원에 보고된 모든 양상들 중 한 양상에서, 본원에 명시된 바와 같은 C-말단 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 C-말단 글리신 잔기 (G446, 아미노산 위치의 EU 인덱스 넘버링)를 포함한다.
5.5.6.4 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 양상들에 있어서, 항체의 하나 또는 그 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 대체된, 시스테인 조작된 항체, 예컨대, THIOMAB?? 항체를 만드는 것이 바람직할 수 있다. 특정 양상들에서, 상기 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 나타난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올기는 이러한 항체의 접근가능한 부위에 위치하게 되고, 다른 모이어티, 가령, 하기에서 설명되는 약물 모이어티 또는 연결기-약물 모이어티에 이 항체가 접합되어 면역접합체가 생성될 수 있다. 시스테인 조작된 항체는 예를 들면, 미국 특허 제 7,521,541, 8,30,930, 7,855,275, 9,000,130, 또는 WO 2016040856에서 설명된 것과 같이 생성될 수 있다.
5.5.6.5 항체 유도체
특정 양상들에 있어서, 본 발명에서 제공되는 항체는 해당 분야에 공지되어 있고, 쉽게 입수할 수 있는 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 모이어티들은 수용성 중합체들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 수 가용성 폴리머의 비-제한적인 예로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 코폴리머, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥소란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 무수물 코폴리머, 폴리아미노산 (호모폴리머 또는 무작위 코폴리머), 그리고 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 호모폴리머, 프로리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 코-폴리머, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예로써, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이의 혼합물을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인하여 제조에 있어 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비-분지형일 수 있다. 상기 항체에 부착된 폴리머의 수는 가변적일 수 있으며, 하나 이상의 폴리머가 부착된 경우, 이들은 동일하거나 또는 상이한 분자들일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용된 중합체의 수 및/또는 유형은 개선되는 항체의 특정 성질들 또는 기능들, 상기 항체 유도체가 특정 조건하에서 치료에 이용되는지의 여부를 포함하는 고려사항들에 근거하여 결정될 수 있다.
5.5.7 면역접합체
본 발명은 하나 또는 그 이상의 치료제, 가령, 세포독성제, 화학치료제 또는 약물, 성장 억제제 물질, 톡신 (예컨데, 단백질 톡신, 박테리아, 진균성, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성 톡신, 또는 이의 단편), 또는 방사능활성 동위원소에 접합된 본원에 개시된 항체를 포함하는 면역접합체를 또한 제공한다.
한 양상에서, 면역접합체는 항체가 상기 언급된 치료제 중 하나 이상에 접합된 항체-약물 접합체 (ADC)이다. 항체는 전형적으로 연결기를 사용하여 하나 이상의 치료제에 연결된다. 치료제, 약물 및 연결기의 예를 포함한 ADC 기술의 개요는 Pharmacol Review 68 : 3-19 (2016)에 제시되어 있다.
또 다른 양상에서, 면역접합체는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, (슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모덱신 A 쇄, 알파-사르신, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국 자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센을 포함하지만 이에 제한되지 않는 효소 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
또다른 양상에서, 면역접합체는 방사성접합체를 만들기 위하여 방사능활성 원자에 접합된 본원에서 기술하는 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생산을 위해 사용가능하다. 실시예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 상기 방사성접합체가 탐지용으로 이용될 때, 이것은 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들면 tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (또는 자기 공명 영상화, MRI로도 공지됨)를 위한 회전 라벨, 가령, 다시 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 또한 함유할 수 있다.
항체와 세포독성 물질의 접합체는 다양한 이중기능성 단백질 커플링 물질, 가령, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중기능성 유도체들 (가령, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (가령, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (가령, 글루타알데히드), 비스-아지도 화합물 (가령, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체들 (가령, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (가령, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플로린 화합물 (가령, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 Vitetta 외, Science 238:1098 (1987)에서 기술된 바와 같이 준비될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-아이소싸이오시아나토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세틱 애시드 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO 94/11026 참고. 상기 연결기는 세포 안에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 연결기"일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정 연결기, 펩티다제-민감성 연결기, 광 불안정 연결기, 다이메틸 연결기 또는 이황화물-함유 연결기 (Chari 외, Cancer Res. 52:127-131 (1992); 미국 특허 제 5,208,020)가 이용될 수 있다.
본원에서 면역접합체 또는 ADCs를 명시적으로 고려하는데, 이러한 접합체는 상업적으로 이용가능한 (예컨데, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 그리고 SVSB (숙시니미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하는 (그러나 이에 제한되지 않음) 가교 시약으로 준비된다.
5.6 예시적인 구체예들
A. 비-제한적 특정 구체예들에서, 본원에 개시된 발명은 피루베이트 키나제 근육 (PKM) 폴리펩티드 동형의 발현이 녹다운 또는 녹아웃된, 젖분비자극 활성이 감소 또는 제거된 포유류 세포를 제공하고, 이 때 PKM 폴리펩티드 동형은 PKM-1 폴리펩티드 동형을 포함한다.
A1. 전술한 A에 있어서, PKM-2 폴리펩티드 동형의 발현이 녹다운 또는 녹아웃되는, 포유류 세포.
A2. 전술한 A 또는 A1에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포인, 포유류 세포.
A3. 전술한 A-A2 중 어느 하나에 있어서, 관심 생성물을 인코드하는 핵산 서열을 포함하는, 포유류 세포.
A4. 전술한 A3에 있어서, 관심 생성물은 단백질을 포함하는, 포유류 세포.
A5. 전술한 A3 또는 A4에 있어서, 관심 생성물은 재조합 단백질을 포함하는, 포유류 세포.
A6. 전술한 A3-A5 중 어느 하나에 있어서, 관심 생성물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 포유류 세포.
A7. 전술한 A6에 있어서, 상기 항체는 다중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 포유류 세포.
A8. 전술한 A6에 있어서, 상기 항체는 단일 중쇄 서열 및 단일 경쇄 서열 또는 이의 항원 결합 단편들로 구성되는, 포유류 세포.
A9. 전술한 A6-A8 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체, 인간 항체, 또는 인간화 항체를 포함하는, 포유류 세포.
A10. 전술한 A6-A9 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 단클론 항체를 포함하는, 포유류 세포.
A11. 전술한 A3-A10 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 서열은 표적된 위치에서 상기 포유류 세포의 세포 게놈에 통합되는, 포유류 세포.
A12. 전술한 A11에 있어서, 상기 포유류 세포의 세포 게놈에 무작위로 통합되는 관심 생성물을 인코드하는 핵산을 추가로 포함하는, 포유류 세포.
A13. 전술한 A-A12 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유류 세포의 젖분비자극 활성은 참조 세포의 젖분비자극 활성의 약 50% 미만인, 포유류 세포.
A14. 전술한 A13에 있어서, 상기 포유류 세포의 젖분비자극 활성은 참조 세포의 젖분비자극 활성의 약 20% 미만인, 포유류 세포.
A15. 전술한 A13 또는 A14에 있어서, 상기 참조 세포는 PKM 유전자의 야생형 대립유전자를 포함하는 세포인, 포유류 세포.
A16. 전술한 A-A15 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유류 세포의 젖분비자극 활성은 생산 단계의 14일차 또는 15일차에 결정되는, 포유류 세포.
A17. 전술한 A-A16 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유류 세포는 생산 단계 동안 약 2.0 g/L 미만의 락테이트를 생성하는, 포유류 세포.
A18. 전술한 A-A16 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유류 세포는 진탕 플라스크에서 생산 단계 동안 약 2.0 g/L 미만의 락테이트를 생성하는, 포유류 세포.
A19. 전술한 A-A16 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유류 세포는 생물반응기에서 생산 단계 동안 약 2.0 g/L 미만의 락테이트를 생성하는, 포유류 세포.
B. 비-제한적 특정 구체예들에서, 본원에 개시된 발명은 서열 번호: 39-41로 구성된 그룹에서 선택된 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 번호: 37 및 38에 제시된 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 PKM 유전자의 대립유전자를 포함하는 포유류 세포를 제공한다.
C. 비-제한적 특정 구체예들에서, 본원에 개시된 발명은 전술한 A-A19 중 어느 하나의 포유류 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
D. 비-제한적 특정 구체예들에서, 본원에 개시된 발명은 피루베이트 키나제 근육 (PKM) 폴리펩티드 동형의 발현을 녹다운 또는 녹아웃하는 것을 포함하는, 세포에서 젖분비자극 활성의 감소 또는 제거 방법을 제공한다.
E. 비-제한적 특정 구체예들에서, 본원에 개시된 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포에서의 젖분비자극 활성의 감소 또는 제거 방법을 제공하며, 이 때 상기 유전자 조작 시스템은 피루베이트 키나제 근육 (PKM) 폴리펩티드 동형의 발현을 녹다운 또는 녹아웃시킨다.
E1. 전술한 E에 있어서, 상기 유전자 조작 시스템은 CRISPR/Cas 시스템, 징크-핑거 핵산분해효소 (ZFN) 시스템, 전사 활성인자-유사 효과기 핵산분해효소 (TALEN) 시스템 및 이의 조합으로 구성된 그룹에서 선택되는, 방법.
E2. 전술한 E 또는 E1에 있어서, 상기 유전자 조작 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템인, 방법.
E3. 전술한 E2에 있어서, 상기 CRISPR/Cas9 시스템은 다음을 포함하는, 방법:
(a) Cas9 분자, 및
(b) PKM 유전자에서 표적 서열에 상보적인 표적화 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA들 (gRNA들).
E4. 전술한 E3에 있어서, 상기 표적 서열은 다음으로 구성된 그룹에서 선택되는, 방법: PKM 유전자의 일부, 엑손 1 내부 영역, 엑손 2에 연접한 5' 영역, 엑손 2 내부 영역, PKM 유전자의 엑손 9에 연접하는 5' 인트론 영역, PKM 유전자의 엑손 9에 연접하는 3' 인트론 영역, PKM 유전자의 엑손 10에 연접하는 3' 인트론 영역, PKM 유전자의 엑손 1 내부 영역, PKM 유전자의 엑손 12 내부 영역 및 이의 조합.
E5. 전술한 E3-E4 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 gRNA들은 서열 번호: 33-34 및 42-43 및 이의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 서열을 포함하는, 방법.
E6. 전술한 E3 또는 E4에 있어서, 상기 하나 이상의 gRNA들은 (1) PKM 유전자의 엑손 9에 연접한 5' 인트론 영역에 상보적인 표적 서열을 포함하는 제 1 gRNA; 및 (2) PKM 유전자의 엑손 9에 연접한 3' 인트론 영역에 상보적인 표적 도메인을 포함하는 제 2 gRNA를 포함하는, 방법.
E7. 전술한 E3-E6 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 gRNA들은 서열 번호: 33-34 및 이의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 서열을 포함하는, 방법.
E8. 전술한 E3 또는 E4에 있어서, 상기 하나 이상의 gRNA들은 (1) PKM 유전자의 엑손 2 내부 영역에 상보적인 표적 서열을 포함하는 제 1 gRNA; 및 (2) PKM 유전자의 엑손 12 내부 영역에 상보적인 표적 도메인을 포함하는 제 2 gRNA를 포함하는, 방법.
E9. 전술한 E3-E5 및 E8 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 gRNA들은 서열 번호: 42-43 및 이의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 서열을 포함하는, 방법.
E10. 전술한 D 및 E-E9 중 어느 하나에 있어서, PKM 폴리펩티드 동형의 발현은 녹아웃되고, 세포의 젖분비자극 활성은 참조 세포의 젖분비자극 활성에 비하여 제거 또는 감소되는, 방법.
E11. 전술한 D 및 E-E9 중 어느 하나에 있어서, PKM 폴리펩티드 동형의 발현은 녹다운되고, 세포의 젖분비자극 활성은 참조 세포의 젖분비자극 활성에 비하여 감소되는, 방법.
E12. 전술한 E10 또는 E11에 있어서, 상기 세포의 젖분비자극 활성은 참조 세포의 젖분비자극 활성의 약 50% 미만인, 방법.
E13. 전술한 E10 또는 E11에 있어서, 상기 세포의 젖분비자극 활성은 참조 세포의 젖분비자극 활성의 약 20% 미만인, 방법.
E14. 전술한 D 및 E-E13 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포의 젖분비자극 활성은 생산 단계의 14일차 또는 15일차에 결정되는, 방법.
E15. 전술한 D 및 E-E14 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 생산 단계 동안 약 2.0 g/L 미만의 락테이트를 생성하는, 방법.
E16. 전술한 D 및 E-E14 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 진탕 플라스크에서 생산 단계 동안 약 2.0 g/L 미만의 락테이트를 생성하는, 방법.
E17. 전술한 D 및 E-E14 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 생물반응기에서 생산 단계 동안 약 2.0 g/L 미만의 락테이트를 생성하는, 방법.
E18. 전술한 E11-E17 중 어느 하나에 있어서, 상기 참조 세포는 PKM 유전자의 야생형 대립유전자를 포함하는 세포인, 방법.
E19. 전술한 D 및 E-E18 중 어느 하나에 있어서 상기 PKM 폴리펩티드 동형은 PKM-1 폴리펩티드 동형인, 방법.
E20. 전술한 D 및 E-E19 중 어느 하나에 있어서 상기 PKM 폴리펩티드 동형은 PKM-1 폴리펩티드 동형 및 PKM-2 폴리펩티드 동형인, 방법.
E21. 전술한 E에 있어서, 상기 유전자 조작 시스템은 다음으로 구성된 그룹에서 선택된 RNA를 포함하며: 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 및 마이크로RNA (miRNA), 이 때 상기 RNA는 PKM 유전자에 의하여 발현되는 mRNA의 일부에 상보적인, 방법.
E22. 전술한 E21에 있어서, 상기 PKM 유전자에 의해 발현되는 mRNA는 PKM-1 폴리펩티드 동형을 인코드하는, 방법.
E23. 전술한 E22에 있어서, PKM-1 폴리펩티드 동형의 발현은 녹아웃 또는 녹다운되고, 세포에서의 젖분비자극 활성은 참조 세포의 젖분비자극 활성에 비하여 감소되는, 방법.
E24. 전술한 E21-E23 중 어느 하나에 있어서, 상기 유전자 조작 시스템은 다음으로 구성된 그룹에서 선택된 제 2 RNA를 추가로 포함하며: shRNA, siRNA, 및 마이크로RNA miRNA, 이 때 제 2 RNA는 PKM-2 폴리펩티드 동형을 인코드하는 PKM 유전자에 의해 발현되는 mRNA의 일부에 상보적인, 방법.
E25. 전술한 E24에 있어서, PKM-1 및 PKM-2 폴리펩티드 동형들의 발현은 녹아웃 또는 녹다운되고, 상기 세포의 젖분비자극 활성은 감소되는, 방법.
E26. 전술한 E에 있어서, 상기 유전자 조작 시스템은 징크-핑거 핵산분해효소 (ZFN) 시스템 또는 전사 활성인자-유사 효과기 핵산분해효소 (TALEN) 시스템인, 방법.
E27. 전술한 D 및 E-E26에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인, 방법.
E28. 전술한 E27에 있어서, 포유류 세포는 CHO 세포인, 방법.
E29. 전술한 D 및 E-E28에 있어서, 상기 세포는 관심 생성물을 발현하는, 방법.
E30. 전술한 E29에 있어서, 상기 세포에 의해 발현된 관심 생성물은 핵산 서열에 의해 인코드되는, 방법.
E31. 전술한 E30에 있어서, 상기 핵산 서열은 표적된 위치에서 상기 세포의 세포 게놈에 통합되는, 방법.
E32. 전술한 E26-E31 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포에 의해 발현되는 관심 생성물은 상기 포유류 세포의 세포 게놈에 무작위로 통합된 핵산 서열에 의해 추가로 인코드되는, 방법.
E33. 전술한 E26-E31 중 어느 하나에 있어서, 관심 생성물은 단백질을 포함하는, 방법.
E34. 전술한 E33에 있어서, 관심 생성물은 재조합 단백질을 포함하는, 방법.
E35. 전술한 E26-E33 중 어느 하나에 있어서, 관심 생성물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 방법.
E36. 전술한 E35에 있어서, 상기 항체는 다중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 방법.
E37. 전술한 E35에 있어서, 상기 항체는 단일 중쇄 서열 및 단일 경쇄 서열 또는 이의 항원 결합 단편들로 구성되는, 방법.
E38. 전술한 E35-E37 중 어느 하나에 있어서, 항체는 키메라 항체, 인간 항체, 또는 인간화 항체인, 방법.
E39. 전술한 E35-E38 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 단클론 항체인, 방법.
F. 비-제한적 특정 구체예들에서, 본원에 개시된 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유류 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 이 때 상기 포유류 세포들은 관심 생성물을 발현하고 젖분비자극 활성이 감소 또는 제거되었다.
G. 비-제한적 특정 구체예들에서, 본원에 개시된 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유류 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유류 세포들은 젖분비자극 활성이 감소 또는 제거되었다.
G1. 전술한 F 또는 G에 있어서, 젖분비자극 활성은 포유류 세포들에서 피루베이트 키나제 근육 (PKM) 폴리펩티드 동형의 발현의 녹아웃 또는 녹다운으로 인해 감소 또는 제거되는, 방법.
G2. 전술한 G1에 있어서, 상기 PKM 폴리펩티드 동형은 PKM-1 폴리펩티드 동형인, 방법.
G3. 전술한 G1에 있어서, 상기 PKM 폴리펩티드 동형은 PKM-1 폴리펩티드 동형 및 PKM-2 폴리펩티드 동형인, 방법.
G4. 전술한 F 및 G-G3 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유류 세포의 젖분비자극 활성은 참조 세포의 젖분비자극 활성의 약 50% 미만인, 방법.
G5. 전술한 F 및 G-G3 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유류 세포의 젖분비자극 활성은 참조 세포의 젖분비자극 활성의 약 20% 미만인, 방법.
G6. 전술한 F 및 G-G5 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유류 세포의 젖분비자극 활성은 생산 단계의 14일차 또는 15일차에 결정되는, 방법.
G7. 전술한 F 및 G-G6 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유류 세포는 생산 단계 동안 약 2.0 g/L 미만의 락테이트를 생성하는, 방법.
G8. 전술한 F 및 G-G6 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유류 세포는 진탕 플라스크에서 생산 단계 동안 약 2.0 g/L 미만의 락테이트를 생성하는, 방법.
G9. 전술한 F 및 G-G6 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유류 세포는 생물반응기에서 생산 단계 동안 약 2.0 g/L 미만의 락테이트를 생성하는, 방법.
G10. 전술한 F 및 G-G9 중 어느 하나에 있어서, 상기 참조 세포는 PKM 유전자의 야생형 대립유전자들 중 최소한 하나 또는 둘 모두를 포함하는 세포인, 방법.
G11. 전술한 F 및 G-G10 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유류 세포들은 CHO 세포들인, 방법.
G12. 전술한 F 및 G-G11 중 어느 하나에 있어서, 상기 포유류 세포에 의해 발현된 관심 생성물은 핵산 서열에 의해 인코드되는, 방법.
G13. 전술한 G12에 있어서, 상기 핵산 서열은 표적된 위치에서 상기 포유류 세포의 세포 게놈에 통합되는, 방법.
G14. 전술한 F 및 G-G13 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포에 의해 발현되는 관심 생성물은 상기 포유류 세포의 세포 게놈에 무작위로 통합된 핵산 서열에 의해 추가로 인코드되는, 방법.
G15. 전술한 F 및 G-G14 중 어느 하나에 있어서, 관심 생성물은 단백질을 포함하는, 방법.
G16. 전술한 F 및 G-G15 중 어느 하나에 있어서, 관심 생성물은 재조합 단백질을 포함하는, 방법.
G17. 전술한 F 및 G-G16 중 어느 하나에 있어서, 관심 생성물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 방법.
G18. 전술한 G17에 있어서, 상기 항체는 다중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 방법.
G19. 전술한 G17에 있어서, 상기 항체는 단일 중쇄 서열 및 단일 경쇄 서열 또는 이의 항원 결합 단편들로 구성되는, 방법.
G20. 전술한 G17-G19 중 어느 하나에 있어서, 항체는 키메라 항체, 인간 항체, 또는 인간화 항체인, 방법.
G21. 전술한 G17-G20 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 단클론 항체인, 방법.
G22. 전술한 F 및 G-G21 중 어느 하나에 있어서, 관심 생성물을 수집하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
실시예
다음 실시예는 단순히 본원에 개시된 발명에 관한 예시일 뿐이며 어떠한 방식으로든 제한으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1: PKM-1 발현은 CHO 세포주에서 젖분비자극 거동을 유도하여, 생존력과 생산성을 낮춘다
세포주 개발 (CLD) 과정에서 서로 다른 항체 분자를 발현하는 두 가지 젖분비자극 세포주가 확인되었다. 이들 세포주들의 젖분비자극 거동은 세포주에 따라, 영양소 영양공급 또는 배양 pH의 최적화를 통해 차등적으로 완화될 수 있다. 해당 과정에 관여하는 다양한 단백질을 분석한 결과 피루베이트 키나제 근육-1 (PKM-1) 동형 수준과 젖분비자극 거동 사이의 직접적인 상관관계가 밝혀졌다.
CRISPR/Cas9는 녹아웃 PKM-1 발현을 녹아웃시키기위한 엑손-9의 표적화된 결실에 사용되었다. PKM-1 발현 녹아웃은 선택된 두 세포주에서 젖분비자극 거동을 완전히 제거하여, 완화 전략에 대한 필요성을 없앤다. 두 PKM-1 및 PKM-2 유전자 모두의 발현이 성장 및 생존력에 어떠한 부작용도 주지 않고 완전히 파괴된 단일 세포주가 확인되었다. 부모 및 CHO 세포주들을 추가 분석한 결과 이들 모두 피루베이트 키나제의 PKL 및 PKR 형태들 모두를 발현시키고, 이들이 PKM 발현의 완전한 결여를 관용하는 것을 가능하게 하는 것으로 나타났으나, 특정 이론에 제한되는 것은 아니다. 이들 세포주들의 젖분비자극 거동을 제어하는데 사용된 고유한 완화 전략들은 이들의 대사 경로를 이동시켜, PKM-1 전사 및 발현 패턴을 변경시키고, 젖분비자극 거동을 방해 또는 지연시켰다. PKM 유전자는 배양물 및 생물반응기에서 생성된 세포주의 거동을 분석하기 위해 완전히 녹아웃된다.
요약하면, 본 발명은 젖분비자극 거동과 생성 배양물들에서의 높은 PKM-1 수준 사이의 직접적 상관관계를 묘사한다. 더욱이, PKM-1 발현의 제거는 관용되었으며 선택된 CHO 세포주들에서 젖분비자극 거동을 역전시켰다. 따라서, CHO 세포에서 본 발명에 있어서 PKM-1 또는 전체 PKM 유전자의 영구적 결실은 생물반응기에서 생산하는 동안 젖분비자극 거동의 발생을 감소시킴에 유익할 수 있다.
재료 및 방법
세포주
재조합 단클론 항체 mAb-1 또는 mAb-2를 분비하는 세포주는 글루타민 합성 효소 (GS) 선별 마커를 사용하여 CHO-K1 숙주로부터 유도되었다. 씨드 트레인들은 150 rpm의 진탕 속도, 37°C, 및 5% CO2.에서 선별 물질로서 메티오닌 설폭시민 (MSX)를 함유하는 등록 DMEM/F12-기반 배지에서 유지되었다. 세포들은 3일 또는 4일마다 계대되었다.
2-L 생물반응기 생산
2-L 생물반응기 생산은 Finesse 컨트롤러 (Applikon, Foster City, CA)가 장착된 유리 교반-탱크 생물반응기 (Applikon, Foster City, CA)에서 수행되었다. 모든 생산 배양들은 14일간 지속되는 생산 단계 (N) 접종에 앞서 생물반응기들에서 3일간의 단일 접종물 트레인 단계 (N-1)를 이용하였다. N-1 접종 배양물은 0.17 %의 목표 패킹된 세포 부피 (PCV)에 대해 1.5 내지 1.7 L의 작업 부피로 접종되었다. 이들은 37°C에서, 7.0의 pH 설정 포인트, 30%의 용존 산소 (DO) 설정포인트, 및 275 rpm의 교반으로 작동되었다. 3일 후, 세포들을 0.25%의 목표 PCV에서 1.4 내지 1.7 L의 부피까지 옮겨 생산 (N) 생물반응기들을 접종하였다. 모든 생물반응기들은 37°C에서 작동되었으며 72시간시 35°C로 온도 이동되었다. CO2를 산 대조군으로 그리고 1 M 소듐 카보네이트를 염기성 대조군으로 사용하여 0.03의 허용오차로 7.00 pH에서 배양을 실시하였다. 이 pH 작업의 유일한 예외는 0.03의 동일한 허용오차를 사용하여 6.80의 일정한 pH에서 작동된 mAb-2 pH 수준이었다. 모든 배양은 DO를 일정하게 유지하기 위해 공기와 산소 가스 흐름의 조합을 사용하여 350 rpm 및 30%의 DO에서 작동하도록 설정되었다. mAb-1의 대조 과정 배양의 경우, 생산 3 일 (72 시간)에 영양공급이 발생했으며 당시 배양 총 부피의 20%였다. 개선된 영양공급 과정의 경우, 영양공급은 3일차 (72 시간) 및 6일차 (144 시간)에 각 영양공급에 대한 총 부피 배양의 15%로 발생하였다.
AMBR15 작동
AMBR15 시스템 (Sartorius, Goettingen Germany)에서 생산 배양들은 37°C의 온도, 30%의 DO, 7.0의 pH, 및 1400 rpm의 교반 속도의 설정 포인트에서 작동되었다. N-1 접종 트레인들을 4일 동안 실행한 다음, 생산 (N) 단계를 13 mL의 총 부피를 1백만개 세포들/mL로 37°C 온도, 30%의 DO, 7.0의 pH, 및 1400 rpm의 교반 속도로 접종하였다. 이들 배양들을 위해, 2-L 생물반응기의 규모축소 과정이 수행되었다.
오프-라인 샘플 분석
분석 또는 웨스턴 블롯팅 분석에 제출하기 위해 상청액 및 세포 펠렛 샘플들을 수집하였다. 샘플들을 Vi-Cell XR (Beckman Coulter)를 사용하여 생존 세포 농도 (VCC) 및 생존력에 대해, 그리고 Bioprofile 400 (Nova Biomedical)을 사용하여 pO2, pH, pCO2, Na+, 포도당, 및 락테이트에 대해 분석하였다. 2-L 및 AMBR 생물 반응기의 모든 샘플은 오프-가스를 최소화하기 위해 샘플링 후 수 분 이내에 BioProfile 400에서 분석되었다. 모든 샘플들에 대해 동일한 Vi-세포 XR, BioProfile 400, 및 삼투압계 (Model 2020, Advanced Instruments)들을 사용하여 기기간 변동성을 제거하였다. 단백질 A 컬럼을 구비한 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 항체 역가를 측정하였다. PhyTip (PhyNexus, San Jose, CA) 단백질 A 컬럼으로 정제한 세포 배양 상청액 샘플들을 사용하여 항체 생성물 품질 분석을 수행하였다. 항체 분자 크기 분포는 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC)로 분석되었다. 단백질 전하 비균질성은 이미지화 모세관 등전 집중법 (icIEF)을 사용하여 측정되었으며, 모든 전하 비균질성 샘플들을 카르복시펩티다제 B로 전처리하였다. 모든 단백질 생성물 품질 분석들은 내부 개발되었으며 상세한 프로토콜이 공개된 바 있다 (Hopp 외, 2009, Biotechnol. Prog. 25(5): 1427-32).
면역탁본법
세포 펠릿들을 용해 완충액 (10 mM Tris pH 8.0, 0.5% NP40, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 프로테아제 억제제)에 용해시키고 얼음에서 20분 동안 배양하였다. 이어서 샘플들을 13,000 rpm에서 10분 동안 회전시키고 상청액을 새로운 튜브로 옮겨 Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington DE)를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 이용해 단백질 농도를 결정하였다. 15 μL의 용해물을 5 μL의 4x 러닝 완충액 (400 μL of 2x Invitrogen 로딩 완충액 + 400 μL의 50% 글리세롤 + 200 μL의 20% SDS + 100 μL 베타-메르캅토에탄올)과 조합하여 90°C에서 5분 동안 가열하였다. 이후 동량의 단백질들을 12 웰 4-20% 트리스-글리신 겔에 부하하고, 1.5 시간 동안 150 V에서 SDS 러닝 완충액을 사용하여 실행하였다. 그 후 단백질들을 Thermo Fisher사의 iBlot2를 사용하여 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 1x TBST 완충액으로 세척 후, 5% 우유 용액에서 최소 1시간 블롯들을 차단한 후 일차 항체로 밤새 배양하였다. 이어서 블롯들을 세척하고 최소 1시간 동안 이차 항체에서 배양한 다음 TBST 완충액으로 다시 세척했다. ECL 시약을 사용한 후 Bio-Rad 이미지화 기기 (Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 블롯을 이미지화하였다.
PKM-1 녹아웃
PKM-1을 녹아웃하기 위해, PKM 유전자의 엑손 9에 연접하는 5' 및 3' 인트론 영역들 모두를 표적하는 가이드 RNA들 (gRNA들)을 Genentech gRNA-발현 벡터에 클로닝하였다. 이어서,이 구조체를 Cas9 발현 플라스미드와 함께 mAb-2 발현 세포에 공동 형질감염시켰다. 형질감염된 세포들을 단일 세포 클로닝하고 게놈 DNA PCR로 엑손 9의 결실을 확인하였다. 엑손-9 (PKM-1)를 결실시킴에 있어 다음 gRNA 올리고들이 가장 효과적이었으며 이들 올리고들을 사용하여 표적화된 풀을 사용하여 PKM-1 녹아웃 mAb-2 세포주들을 분리하였다:
5' gRNA: GTCCTTTGGGCAGAGACAG (서열 번호: 33)
3' gRNA: GACCAGAGTACTCCCTCGT (서열 번호: 34)
게놈 DNA PCR 프라이머들의 서열:
5'-프라이머: CCAGATTTGGTGAGGACGAT (서열 번호: 35)
3'-프라이머: AGCTGTGTTGTGAGGCATTG (서열 번호: 36)
결과
생산 동안 PKM-1 수준의 증가는 CHO 세포들 젖분비자극 거동과 상관관계가 있다
mAb-1 발현 세포주의 배양된 씨드 트레인을 사용하여 표준 또는 개선된 공급 전략을 사용하는 생물반응기에서 생산 배양물을 공급하였다. 표준 영양공급은 mAb-1 세포주에서 젖분비자극 거동을 유발시킨 반면, 개선된 영양공급 전략은 젖분비자극 거동을 완화시켰다. 높은 락테이트 조건은 생산 배양에서 10일 후 세포 생존력의 하락을 유발하여 (도 1A), 낮은 락테이트 조건보다 낮은 14일차 역가 (도 1B)를 가져왔다. 두 배양 조건들 모두 7일차까지 락테이트 수준이 비등하였으나, 높은 락테이트 조건은 생산 배양에서 7일차부터 락테이트 축적의 급격한 증가를 보여주었으며, 14일차에 15 g/L 이상에 도달하였다. 낮은 락테이트 조건의 경우, 3-4일의 지연이 관찰된 후 락테이트 수준이 높아지는 경향을 보이기 시작하였으며 (12일차 내지 14일차) 14일차에는 단지 8 g/L에 도달하였다 (도 1C).
관찰된 젖분비자극 거동과 상관관계가 있을 수 있는 효소(들)를 확인하기 위해, 세포 성장 신호전달 및 해당 경로에 관여하는 다양한 단백질들에 대하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 높은 락테이트 조건에서 세포 생존력은 10일차 이후 급격히 떨어졌기 때문에 이 세트의 0, 2, 7 및 10일차의 샘플들을 낮은 락테이트 상태의 0, 7, 10 및 14일차의 샘플들과 비교했다 (도 1D-1F). 분석된 모든 다른 단백질 (데이터는 표시되지 않음) 중에서 PKM-1 수준만이 mAb-1 발현 세포주의 젖분비자극 거동과 직접적인 상관관계를 나타냈다. 도 1D-1F는 세포 펠릿들에서 PKM-1 및 PKM-2 단백질 수준들을 보여주었다. 높은 락테이트 샘플들에서 PKM-1 발현 수준들은 낮은 락테이트 샘플들과 비교하여 생산 배양에서 7일차 이후 다르게 증가하기 시작하였다. 흥미롭게도, PKM-1 수준은 락테이트 축적이 증가함에 따라 밀접하게 증가하는 경향이 존재하였는데, 왜냐하면 낮은 락테이트 조건들하에서 조차도 생산 배양의 종료시 (도 1E, 10 내지 14일차)까지 PKM-1 수준이 배양물에서 락테이트 수준이 높아짐에 따라 증가하는 경향을 나타냈기 때문이다 (도 1C). 그러나 PKM-2 수준들은 mAb-1 발현 세포주에서의 젖분비자극 거동과 반비례 상관관계가 있었다 (도 1F).
mAb-2 발현 세포주에 대하여 유사한 생물반응기 실험들을 수행하였다. 이러한 세포주는 젖분비자극 또는 비-젖분비자극 거동을 촉진하는 조건의 생산 배지에서 배양되었다. mAb-2 세포주에 대한 세포 생존력은 생산 배양의 13 및 14일차까지 높은 락테이트 조건과 낮은 락테이트 조건 사이에서 비등하였다 (도 2A). 이는 낮은 락테이트 조건에 비해 높은 락테이트에서 역가를 대략 25% 감소시켰다 (도 2B). 생산 과정 전반에 걸쳐, mAb-2 세포주 실험의 낮은 락테이트 대조군 아암에 있어서 배지에서의 락테이트 축적은 낮았다. 그러나, 높은 락테이트 조건하에서 락테이트 수준은 생산 배양 7일차부터 달라지기 시작하여 14일차에는 15 g/L 이상에 도달하였다 (도 2C). 웨스턴 블롯 분석은 PKM-1 단백질 수준이 낮은 락테이트 샘플들에 비해 생산 배양 7일차 즈음에 높은 락테이트 샘플들에서 증가하기 시작하였으며, 생산 배양 종료시까지 선형적으로 증가하였음을 나타내었다 (도 2D 및 2E). 이러한 PKM-1 수준의 증가는 축적된 락테이트의 증가와 밀접한 관련이 있다 (도 2C 및 2E). mAb-1과 유사하게, 낮은 락테이트 mAb-2 샘플에서 PKM-2의 전체 수준은 도 2D (하단 패널) 및 도 2F에 도시된 바와 같이 높은 락테이트 샘플의 수준보다 더 높았다. 종합하면, 이들 데이터는 mAb-1 및 mAb-2 발현 세포들에서의 젖분비자극 거동과 이들 세포들에서의 PKM-1 수준 사이의 직접적 상관관계를 시사한다.
PKL/R 단백질들은 CHO 세포들에서 발현되지만 젖분비자극 거동과 상관관계가 없다
(PKM 이외의) 다른 형태의 PK가 등록 CHO 숙주 세포에서 발현되는지 여부를 평가하기 위해 두 개의 다른 CHO 숙주 세포주 (CHO-K1 및 DHFR-/-)와 인간 (HEK 293) 세포주를 PKL 및 PKR (PKL/R) 단백질 발현에 대해 분석했다. CHO 세포주와 대조군 HEK 293 세포주 모두 PKL/R 효소의 발현을 보였으며 (도 3A), 이는 PK 유전자들의 동형들 모두 (PKM-1, PKM-2, 및 PKL/R 포함)가 선택된 CHO 숙주들에서 발현됨을 나타낸다. mAb-1 및/또는 mAb-2 발현 세포주에서 높은 락테이트 조건과 낮은 락테이트 조건을 비교할 때 PKL/R의 발현이 차등적으로 조절되었는지 여부를 다음과 같이 평가했다. mAb-1 및 mAb-2 세포주들 모두에서 높은 및 낮은 락테이트 조건들 간의 PKL/R 발현 수준들은 비등하였으며 (단백질 수준을 내부 대조군으로서 액틴에 대해 정규화하였을 때), 이는 이들 세포주들에서 젖분비자극 거동과 상관관계가 없음을 보여주는 것이다 (도 3B-3D). 도 3C에서 7 및 10일차 동안 mAb-2 고 락테이트 샘플에서 보다 낮은 PKL/R 수준은 전반적인 단백질 부하 저하로 인한 것이었으며 이는 동일한 레인의 보다 낮은 액틴 수준 (부하 대조군)으로 나타난다. PK 동형들 이외에도, 세포 성장 신호전달 및 해당 경로에 관여하는 몇 가지 상이한 단백질들의 발현 또한 분석되었다. 그러나, 이들 단백질의 발현과 mAb-1 또는 mAb-2 발현 세포주에서 관찰된 젖분비자극 거동 사이의 명확한 상관관계는 관찰되지 않았다 (데이터는 표시되지 않음). 상이한 PK 동형들이 선택된 CHO 숙주 세포에서 발현되었다는 사실은 이들 세포주가 하나 이상의 PK 동형들의 표적화된 결실을 허용가능 할 수도 있음을 시사한다. mAb-1 및 mAb-2 세포주들의 젖분비자극 거동과 생산 단계 동안의 PKM-1 수준 사이에서 관찰된 직접적인 상관관계는 이 효소를 표적화된 결실에 우수한 후보가 되게 하였다.
CRISPR/Cas9는 PKM 유전자에서 엑손-9의 표적화된 결실을 매개하였다
PKM 유전자는 PKM-1 및 PKM-2 효소의 발현을 담당하며, 이는 각각 엑손 9 또는 엑손 10을 달리 포함한다는 점에서만 다르다. 선택된 CHO 세포주가 시퀀싱 및 주석 처리되지 않았기 때문에 PKM 대립 유전자 유형, 유전자 복제수 또는 서열에 관한 정보는 알 수 없었다. 그러므로, PKM-1 유전자의 발현을 방해하기 위하여, 공개 데이터베이스에서 이용가능한 CHO 서열들을 사용하여 엑손 9에 연접한 인트론 영역들을 표적하는 가이드 RNA 구조체들을 설계하였다 (Kent 외 2002, Genome Res. 12(6):996-1006). 5 ' 스크리닝 PCR 프라이머 (들)는 엑손 8과 9 사이의 인트론 영역과 일치하도록 설계되었으며, 3' 스크리닝 PCR 프라이머는 엑손 10과 일치하도록 설계되었다 (도 4A). 엑손 서열 정보는 선택된 CHO 숙주의 mRNA들로부터 PKM cDNA의 증폭 및 시퀀싱에 기초하여 얻었다. mAb-2 발현 세포주는 Cas9 및 다양한 gRNA 구조체들로 형질감염되었다. 초기 스크리닝 후, 엑손 9의 가장 효율적인 표적화를 보여주는 풀을 단일 세포 클로닝하였다. 이 풀로부터 20 개의 세포주를 엑손-9의 표적화된 결실에 대해 스크리닝하고, 표적화된 대립유전자의 결실이 PCR 및 시퀀싱에 의해 완전히 확인된, 2개의 이형접합 (HET-3 및 HET-18) 및 2개의 녹아웃 (KO-2 및 KO-15) 세포주들이 확인되었다 (도 4B 및 4C). 이후 생물반응기에서 추가 평가를 위해 이들 세포주들에 대한 배양을 확장하였다. 표적화된 대립 유전자(들)의 시퀀싱은 모든 선택된 세포주에서 엑손 9의 결실을 확인시켜 주었다 (도 4C). 3개의 세포주 (KO-2, HET-3 및 HET-18)는 5 '및 3' gRNA 표적 부위에서 정확히 엑손 9가 결실되었다 (도 4C). KO-15 세포주의 경우, 표적화된 대립유전자(들)의 PCR 크기는 다른 세포주에서 관찰된 것보다 작았다 (도 4B). 시퀀싱 분석 결과 5' gRNA의 상류 122개 염기쌍 (bp)이 KO-15 세포주에서 결실되고 부분적으로 관련없는 삽입으로 대체되었음이 확인되었다 (도 4C 및 데이터는 도시되지 않음). 이 영역에서의 결실은 엑손 8과 9 사이의 인트론의 통합성에 영향을 줄 수 있다. 이와 상관없이, 엑손 9는 시퀀싱 분석에 따라 선택된 세포주들 모두에서 완전히 결실되었다.
PKM-1 발현의 차단 또는 감소는 mAb-2 세포주에서 젖분비자극 거동을 각각 방지 또는 감소시켰다.
AMBR 생물반응기들에서 14일 생산 배양을 셋업하기 위해 일부 (HET) 또는 모든 (KO) 대립유전자 및 WT mAb-2 계통에서 엑손-9가 결실된 4가지 mAb-2 세포주들을 모두 공급하였다. PKM-1 KO, HET 및 WT 세포주들에서 성장 및 생존력을 도 5A 및 5B에 도시하였다. PKM-1 HET 또는 KO mAb-2 계통은 WT mAb-2 세포주와 비교적 유사한 역가 및 비 생산성을 가졌다 (도 5C 및 5D). PKM-1 KO (KO-2 및 KO-15) 및 HET mAB-2 세포주들 중 하나 (HET-3)는 제어 (젖분비자극) 조건하에서 배양했을 때 WT mAb-2 세포주에 비해 매우 낮은 락테이트 수준들을 가졌다 (도 5E). 반면에 HET-18 계통은 10일차까지 WT mAb-2에 비해 유사한 젖분비자극 거동을 보여주었다. 10일차 이후 WT mAb-2 계통에서 증가된 락테이트 축적 속도는 14일차까지의 HET-18 계통에 비해 대략 2배였다 (도 5E).
이들 세포주들의 웨스턴 블롯 분석은 KO-2 및 KO-15 계통들은 PKM-1 발현이 완전히 결핍되었으며, HET-3 세포주는 HET-18 세포주 보다 낮은 PKM-1 발현을 가졌음을 보여주었다 (도 5F). PKM-1 HET 및 KO 세포주들의 젖분비자극 거동이 여러 세포주들에서 PKM-1 단백질 발현과 직접적으로 상관관계가 있다는 사실은 관찰된 젖분비자극 거동의 변화가 그 외 다른 클론 차이 때문만은 아님을 시사한다. 전장 WT 대립유전자에 해당하는 밴드가 HET 세포주들의 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있기 때문에 (도 4B), 이러한 관찰결과들에 대한 가능한 설명은 다음을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다: 상이한 CHO PKM 대립유전자(들)로부터 PKM-1의 차등 발현; 단 하나의 gRNA 구조체에 의해 WT PKM 대립유전자(들)을 표적화하여, 적절한 엑손 스플라이싱을 파괴; inversion of the gRNA 표적된 영역의 반전, 또는 대립유전자 재조합에 의해 매개된 4-균질화.
PKM-2 수준은 WT mAb-2 세포주에서 보다 낮았던 반면 (액틴 부하 대조군 또한 이 샘플에서 더 낮았다는 경고와 함께 상대적 차이가 고려되었음), HET-3, HET-18, 및 KO-2 세포주들에서는 보다 높았다 (도 5F). 흥미롭게도, KO-15 mAb-2 세포주는 PKM-1 이외에도 PKM-2의 발현이 완전히 결핍되었다 (도 5F). 이는 PKM 대립유전자(들)의 5' gRNA 표적 영역의 상류에서 관찰된 보다 큰 결실(들)로 인한 것일 수 있으며, 이는 엑손 8과 9 사이의 인트론 영역의 기능성에 영향을 미칠 수 있다 (도 4C). 이는 선택된 CHO 세포들이 아마도 PKL/R 효소(들)을 발현시키는 이들의 능력으로 인해 PKM-1 및 PKM-2 효소들 모두의 완전한 결핍을 관용할 수 있었음을 시사하였다 (도 3A).
WT와 PKM-1 KO 및 HET mAb2 발현 세포주들 사이의 생성물 품질 속성들, 가령, 높은 분자량 (응집체) 및 전하 변이체 종들을 조사하였다. WT와 PKM-1 KO 및 HET 세포주 사이의 생성물 응집 수준에서 유의한 차이가 관찰되지 않았지만 (도 5G), mAb-2 생성물 전하 변이체 (도 5H) 프로파일에 대해 약간의 변화가 관찰되었다. 락테이트 수준과 생성물 품질 속성 (도 5G 및 5H) 사이에 명확한 경향 또는 상관관계가 없었기 때문에 관찰된 차이는 세포주 유도 중에 발생할 수 있는 일반적인 변화로 인한 것일 수 있다. 또한, 이들 실험들에 사용된 배지 및 영양공급은 WT mAb-2 세포주에 대해 최적화되었으며, PKM-1 KO 또는 HET 세포주들에 대해서는 그렇지 않았다. PKM 수준 변경은 이들 세포주들의 전반적인 대사 프로파일에 영향을 줄 수 있기 때문에, 전체 효과 및 생성물 품질 속성에 대한 이들의 모든 효과 및 영향을 조사하기 위하여 미세-조정 배지 및 영양공급을 필요로 할 수 있다.
세포 뱅킹 및 해동 후 모든 세포주의 거동을 분석하는 것이 중요하기 때문에 PKM-1 KO 및 HET mAb-2 세포주를 뱅킹한 다음 해동하고 대조군으로서 WT 세포주와 함께 2.5주 동안 배양물에서 유지하였다. 이어서 이들 세포들은 해동 후 성능을 평가하기 위해, 각 세포주에 대해 4중으로 생산 배양들을 셋업하기 위하여 공급되었다. 데이터는 PKM-1 KO 및 HET 세포주들의 성장, 생존력, 역가, 비 생산성, 및 젖분비자극 프로파일이 세포 뱅킹 전과 후가 비등하였음을 보여주었다 (도 5A-5D 및 6A-6D). 이전에 관찰된 바와 같이 (데이터 도시되지 않음), 새로이 해동시킨 WT mAb-2 세포들은 더 오래된 세포들 (15 g/L, 도 5E)에 비해 젖분비자극이 더 적었다 (10 g/L, 도 6E). 그러나, 이러한 거동은 WT mAb-2 세포주에 특유하였는데, 이는 세포 나이가 mAb-2 PKM-1 KO 및 HET 세포주들의 젖분비자극 거동에는 유의한 영향을 미치지 않았기 때문이다 (도 5E 및 6E). 모든 세포주에 대해 생산 배양 7일차에서 배지에서 락테이트의 점진적인 축적이 관찰되었으며, 그 후 PKM-1 KO 및 HET-3 세포주는 락테이트를 소모한 반면 WT 및 HET-18 세포주 모두에서는 락테이트 급증 (run-away) 프로필이 관찰되었다 (도 6E). 모든 젊은 세포주들 (해동 후)은 보다 오래된 세포주들 (도 5G)에 비해 비교적 더 낮은 %의 산성 피크들을 가졌음이 관찰되었지만 (도 6G), 아마도 세포 나이와 관련되어 있었던 형질은, 젖분비자극 (WT 또는 PKM-1 HET-18) 및 비-젖분비자극 (PKM-1 KO 또는 HET-3) 세포주들 간의 생성물 품질과 관련하여 주요한 차이점이 없었다 (도 6F-6G).
논의
CHO 세포 배양에서 젖분비자극 거동은 배양 pH를 제어하기 위해 염기를 첨가한 결과로서 배양 산성화 및 높은 삼투압을 유발하고, 생존력, VCC, 그리고 궁극적으로 생성물 역가에 부정적인 영향을 줄 수 있다 (Li 외, 2010, MAbs 2(5):466-79). 락테이트 생성은 통상적으로 Warburg 효과로 공지되어 있는 거동인 호기성 해당과정으로부터 발생하며 (Warburg, 1956, Science 123(3191):309-14) 이는 많은 배양된 그리고 암 세포들에서 관찰된다. 이들 세포들은 해당 과정을 이용하여 에너지를 생성하고 다양한 에너지 및 대사 플럭스들에 반응하여 이러한 과정을 조절한다 (Mulukutla 외, 2014, PLoS One 9(6):e98756; Mulukutla 외 2010, Trends Biotechnol. 28(9):476-84; Luo 외, 2012, Biotechnol. Bioeng. 109(1): 146-56; Ahn and Antoniewicz, 2012, Biotechnol. J. 7(l):61-74). 일부 젖분비자극 거동들은 과정 조작에 의해 억제될 수 있으나 (Luo 외, 2012, Biotechnol. Bioeng. 109(1): 146-56; Gagnon 외, 2011, Biotechnol. Bioeng. 108(6): 1328-37), 이러한 접근법들에서 관찰된 거동의 근본적인 원인은 밝혀지지 않았다. CHO 숙주에서 젖분비자극 거동을 보다 잘 이해하기 위하여, 젖분비자극 거동이 영양공급 전략 또는 배양 pH를 변형함에 의해 억제될 수 있는 mAb-1 또는 mAb-2를 발현하는 2가지 젖분비자극 세포주들을 확인하였다. 독립적으로 유도된 이들 세포주들은 젖분비자극 거동과의 가능한 상관관계를 설명하기 위해 세포 성장 신호전달 또는 해당 경로에 관여하는 단백질 및 효소들의 패널을 분석하는 툴로 활용되었다. 이러한 관찰결과는 mAb-1 및 mAb-2 세포주들 모두에서 PKM-1 발현과 젖분비자극 거동 사이의 직접적인 상관관계를 보여주었다 (도 1D-1F 및 2D-2F).
mAb-1 및 mAb-2 생산 배양물 모두에서 탐지된 PKM-1 수준은 생산 동안 초기 시점에서는 낮았으며 배양물에서의 락테이트 수준 증가와 관련있는 방식으로 증가하였다. PKM-2 수준은 이들 세포주들에서 젖분비자극 거동과 반비례 관계였다 (도 1D-1F 및 2D-2F). 이는 PKM 유전자로부터 PKM-1 또는 PKM-2 전사체들의 대안적 스플라이싱에 관여하는 단백질들의 기능으로 인한 것일 수 있다 (Chaneton and Gottlieb, 2012, Trends Biochem. Sci. 37(8):309-16; Israelsen and Vander Heiden, 2015, Semin. Cell Dev. Biol. 43:43-51; Mazurek, 2011, Int. J. Biochem. Cell Biol. 43(7):969-80; Harada 외, 1978, Biochim. Biophys. Acta. 524(2):327-39; Noguchi 외, 1986, J. Biol. Chem. 261(29): 13807-12; Noguchi 외, 1987, J. Biol. Chem. 262(29): 14366-71). PKM 유전자의 2가지 동형들 중에서, PKM-2는 대사 경로를 변화시키는 중심 스위치로 기능하여, 생리학적으로 바람직하지 않은 조건들하에서, 가령, 종양 환경 내부에서 암 세포들을 생존 및 번성하게 할 수 있는 것으로 보고된다 (Christofk 외, 2008, Nature 452(7184):230-3; Chaneton and Gottlieb, 2012, Trends Biochem. Sci. 37(8):309-16; Israelsen and Vander Heiden, 2015, Semin. Cell Dev. Biol. 43:43-51). 한편, PKM-1 동형은 일단 발현되면 항시적으로 활성이다. 이론에 제한되지 않고, 생산 배양 후기에서 젖분비자극 거동과 PKM-1의 상관관계는 이 효소에 의한 PEP의 피루베이트로의 제어불가능한 전환, 이어서 피루베이트의 락테이트으로의 LDH 매개 전환으로 인한 것일 수 있다.
mAb-2 발현 세포주에서 엑손-9 그리고 이에 따른 PKM-1의 CRISPR 매개된 결실은 WT mAb-2 발현 세포들이 젖분비자극 거동을 보였던 조건들하에서 PKM-1 KO 세포들에서 젖분비자극 거동을 완전히 반전시켰다 (도 5E). 2개의 PKM-1 HET mAb-2 세포주들이 뚜렷한 거동들을 나타내었다. HET-3 KO 세포주는 매우 적은 락테이트를 생성하였으나 (이의 PKM-1 KO 대응물보다 단지 약간 더 많음), HET-18 세포주는 젖분비자극 되어 WT mAb-2 세포들보다 대략 2/3 많은 락테이트를 생성하였다 (도 5E). 이들 PKM-1 HET 세포주들의 젖분비자극 거동과 이들 세포들에서의 보다 높은 PKM-1 수준 사이의 직접적인 상관관계 또한 관찰되었다 (도 5F). HET-3 세포주들과 비교한, HET-18에서 관찰된 PKM-1 수준의 차이는 다음으로 인한 것일 수 있다: 상이한 PKM 대립유전자로부터 PKM-1의 차등 발현, 또는 HET-3 세포주에서 gRNA 구조체(들)에 의한 PKM 대립유전자(들)의 부분적 표적화, 또는 표적화된 PKM 대립유전자(들) 내부의 표적화된 영역의 반전.
PKM-2 단백질을 발현할 수 없었던 PKM-1 녹아웃 세포주 (KO-15) (도 5F)를 확인하였다. 이 세포주는 5' gRNA 표적화 영역의 상류 인트론에서 무작위 염기들의 122-bp 결실 및 삽입을 가진다 (도 3C). CHO 세포주들 또한, PKM 발현 부족을 보상할 수 있는 PKL/R을 발현하기 때문에 KO-15 세포주는 PKM-1 및 PKM-2 효소들 모두의 손실을 관용할 수 있다 (도 3A). WT 및 모든 PKM-1 HET 및 KO 세포주들에서 PKL/R 단백질(들)의 발현은 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인되었다 (데이터 도시되지 않음). 그럼에도 불구하고, PKM-1 발현의 부족 또는 감소는 역가 또는 비 생산성에 영향을 주지 않고 모든 PKM-1 KO 또는 HET 세포주들에서 각각 락테이트 생성을 저하시켰다 (도 5C-5D 및 6C-6D). 이들 세포주들에서 젖분비자극 거동의 부재 또는 약화는 해동후 보다 어린 세포 나이에서 그리고 모든 복제물들에서 재현가능하고 일관적이었다 (도 5A-5E 및 6A-6E).
생산 배양 동안 젖분비자극 거동을 제어하는 것은 제작을 수행하여 최적의 역가 및 생성물 품질을 얻음에 있어 중요하므로, 숙주들에서 PKM-1 발현을 녹아웃하는 것은 CHO 세포들의 젖분비자극 거동을 다룸에 유리할 수 있다. PKL/R 효소들이 PKM 제거를 보상할 수 있기 때문에, PKM-1 또는 전체 PKM 유전자를 결실을 위해 표적화하기 전에 CHO 세포들에서 다른 PK 효소들의 발현을 확인하고 모니터하는 것이 중요하다. 전체 PKM 유전자의 녹아웃은 CHO 숙주들에서 관용될 수 있으며, PKM KO CHO 숙주들은 WT 숙주와 비등한 역가 및 생성물 품질을 가지는 관심 항체 또는 생성물을 발현할 수 있다. 이들 PKM KO 숙주들은 젖분비자극 거동을 감소시킬 수 있으며 KO-2 및 KO-15 세포주들에서 관찰된 바와 같이 WT 숙주보다 우수한 성장 프로파일을 가진다 (도 5A 및 6A).
실시예 2: PKM 녹아웃 및 PKM-1 녹아웃 CHO 세포주들에서 mAb-3의 생산
PKM 유전자 또는 PKM-1 유전자를 CHO-K1M 세포주에서 녹아웃하여, 1개의 PKM KO 숙주 세포주 및 4개의 PKM-1 KO 숙주 세포주들을 생성하였다. mAb-3을 인코드하는 트랜스진을 표적 통합에 의해 WT CHO-K1M, PKM KO, 및 PKM-1 KO 숙주 세포주들에 도입하여, 동일한 숙주 세포주로부터 3개의 mAb-3 발현 WT 풀들, 동일한 숙주 세포주로부터 3개의 mAb-3 발현 PKM KO 풀들, 및 4개의 상이한 숙주 세포주들로부터 4개의 mAb-3 발현 PKM-1 KO 풀들을 생성하였다.
하기 실험들은 PKM KO 숙주를 생성하기 위한 gRNA들이 상이하고 아래에 제공되어 있음을 제외하고는 실시예 1에 개시된 바와 같이 수행되었다. PKM-1 KO 숙주 세포들을 생성하는데 사용된 gRNA들은 실시예 1에서 사용된 것과 동일하다.
PKM KO 숙주 세포들을 생성하기 위한 gRNA들은 다음 서열들을 가졌다:
5'-gRNA: CCCATCACGGCCCGCAACAC (서열 번호: 42, PKM 유전자의 엑손 2 내부 영역을 표적화)
3'-gRNA: CTTCTTCAAGACGGGGGATG (서열 번호: 43, PKM 유전자의 엑손 12 내부 영역을 표적화)
PKM 및 PKM-1 KO 숙주 세포주들로부터 유도된 MAb-3 생산 풀들은 WT 풀들과 비등하거나 더 높은 Qp 및 역가를 가졌으나, 진탕 플라스크 생산에서 성장은 보다 낮았다 (누적 생존 세포 농도 (IVCC)로 나타냄) (도 7). PKM 및 PKM1 KO 숙주 세포주들로부터 유도된 MAb-3 생산 풀들 또한 WT 숙주 세포주들보다 낮은 락테이트를 생성하였으나 (도 8A), 진탕 플라스크 생산에서 보다 많은 포도당을 소모하였다 (도 8B). 도 8A에 도시된 바와 같이, WT 숙주 세포들은 진탕 플라스크에서 생산 15일차까지 약 1.0 g/L의 락테이트를 생성하였다. 진탕 플라스크 생산 동안, 1-2.5 g/L의 락테이트 농도는 높은 것으로 간주된다. 대조적으로, 15일차까지 PKM-1 KO 숙주 세포들은 매우 적은 락테이트를 생성하였고 PKM KO 숙주 세포들은 0.2 g/L 미만의 락테이트를 생성하였으며, 이는 PKM-1 또는 PKM-1과 PKM-2 모두가 녹아웃되는 경우 락테이트 생성을 80% 이상 감소시켰다.
진탕 플라스크 생산에서 PKM/PKM-1 KO 숙주 세포주로부터 유래된 MAb-3 생산 풀은 아미노산 합성/소모율이 상이하였다 (도 9A 및 도 10). 예를 들어, PKM KO 숙주 세포주는 3-포스포글리세레이트를 축적시켜 WT 및 PKM-1 숙주 세포에 비해 세린 및 글리신의 생산을 증가시켰다 (도 9B). WT 숙주 세포주는 PKM KO 및 PKM-1 숙주 세포들과 비교하여 피루베이트를 축적시켰다 (도 9C). 특정 이론에 제한되지 않고, 숙주 세포에서 피루베이트가 축적되면 락테이트가 축적되고 알라닌 생산이 증가 할 수 있다 (도 10). PKM-1 KO 숙주 세포주들은 TCA 회로 생성물들, 가령, 아스파르트산 및 아스파라긴을 축적시키는 옥살로아세테이트 (도 9D), 및 글루탐산, 아르기닌 및 글루타민을 축적시키는 알파-케토글루타레이트 (a-KG)를 축적시켰다 (도 9E). 특정 이론에 제한되지 않고, 이러한 결과들은 PKM-1 및 PKM-2가 피루베이트 생산 수준을 조절하는 기능을 할 수 있으며 그리하여 피루베이트가 우선적으로 TCA 회로에 진입할 수 있음을 시사한다. 상기 관찰결과들의 요약을 도 10에 나타낸다. 이들 데이터에 기초하여, 소모된 포도당의 양 및/또는 소모 또는 합성된 아미노산의 양을 보충하도록 PKM-1 및 PKM KO 세포들을 배양하기 위해 사용되는 세포 배양 배지 및 조건들을 조정할 수 있다.
PKM/PKM-1 KO 숙주 세포주들로부터 유래된 MAb-3 생산 풀은 진탕 플라스크 생산에서 상이한 당화 프로파일을 가졌다. PKM KO 숙주는 갈락토실화를 감소시켰고, PKM KO 및 PKM-1 KO 숙주 세포주들은 푸코실화를 약간 감소시켰다 (도 11). 특정 이론에 제한되지 않고, 당화에서 이러한 변화들은 생성되는 항체의 활성에 영향을 미치지 않을 것이다.
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SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. <120> MODULATING LACTOGENIC ACTIVITY IN MAMMALIAN CELLS <130> 00B206.0785 <150> 62/649,963 <151> 2018-03-29 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Ser Ser Tyr Tyr Met Ala 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Asp Ser Tyr Met Ser 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Glu <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val 1 5 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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gcaaaggacc ccaggccctt tgtgtgacat ccctccaatg catcctcccc caaaaaacct 20280 ctggactaga taccatcctt tccttcttca ctttctaagt gattaggctc aagtggcttc 20340 caaagaagac atgacagtca cagtggatac tttctcaggg gtgaaacaag acatcttgac 20400 tacagatgtt ttctggtctg tccttggtgt tctgggtgga tttgccccta atgaaatcag 20460 tagagaccag tgtctgccct tgggacagct gtgtttttct ggctgatggc caccccctgt 20520 gtgacatgac tgctgtcctg atgctcatgc actgcaggct cacggttctt ctcacctgtc 20580 ccagtgagta cttcctctct cctgggagat agtgaccttg aaccagtccc ctctagagtg 20640 gttgatgtta gtgtttatgg gtttccatat agaattatat acatatactg taacgataac 20700 tgctttgctt agtcatgtgg ccccacggcc tctgagacct tgacacgtta gactttaggg 20760 actttgtgtc tttgggcaca tcattggacc tctcaaggcc ttatctaaga agtgaattag 20820 atgggatatg tttaattaca ccctttgcgt taaattgcac tgctgttata aaatgtctgc 20880 taagaacctc atgcaggttc ttaacctcag tgaggtcaat gtcaacccac ttctaatgga 20940 tgagggcaca tgataatcga gcttgagttt ggacccaggt cagctgactc tgaagccagc 21000 attccctctt agaacacatc tagcagatca ggacaggtgt cctgtggggc 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Claims (1)

  1. 젖분비자극 활성(lactogenic activity)이 감소 또는 제거된 포유류 세포의 용도.
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