KR20230029033A - 젤라틴 가교입자의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 냉동된 젤라틴 입자를 해동시키면서 가교하는 단계를 포함함으로써, 작교 균질한 젤라틴 가교입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 젤라틴 가교입자의 제조 방법에 관한 것이다.
최근 수십 년 동안 나노입자는 작은 크기, 안정성 및 생체적합성으로 인해 약물 전달 시스템 및 조직 공학을 비롯한 다양한 생물 의학 분야에서 주목을 받아왔다. 특히, 고분자 기반 나노입자는 다른 나노입자 시스템에 비해 캡슐화 공정이 더 발달되어 질병 표적화에 더 높은 효율을 보였다.
이러한 나노입자의 표적화 효율은 주로 입자 크기, 표면 전하 및 표면의 변형에 의해 영향을 받으며, 특히, 나노입자의 크기는 세포막과의 상호작용과 생물학적 장벽의 침투를 결정하는 가장 중요한 요인 중 하나로 알려져 있다. 예를 들어, 100 nm 미만의 크기인 나노입자는 뇌-혈액 장벽과 같은 다양한 생물학적 장벽을 관통할 수 있다.
천연고분자인 젤라틴은 나노입자 제조 재료로서 친수성, 생분해성, 무독성, 생체적합성, 낮은 가격 등 많은 장점을 가지고 있다. 이러한 다양한 장점 때문에 많은 연구자들이 다양한 생의학 응용 분야에 젤라틴 기반 나노입자의 사용을 연구해왔다. 그러나, 이전 연구에서 일반적인 탈용매화 방법을 사용해 제조된 젤라틴 입자는 입자가 불안정하고 응집되기 쉬운 경향이 있었다. 이러한 한계를 극복하기 위해 응집되지 않고 안정적인 작은 젤라틴 입자를 제조할 수 있는 2단계(침전-가교) 탈용매화방법이 보고되었으나, 기존의 2단계 탈용매화 방법으로 제조된 젤라틴 입자의 평균 크기는 150~300 nm로 사용상의 제약이 있었다. 예를 들어, 100 nm 보다 큰 나노입자는 간과 비장에 대량으로 축적되는 문제가 있다.
한국공개특허 제2010-0081291호는 침전반응을 통한 젤라틴 나노입자의 제조방법을 제시하고 있으나, 상기의 문제점을 해결하지는 못하고 있다.
이에, 작고 균질한 젤라틴 입자를 제조하는 방법에 대한 연구가 필요하다.
본 발명은 작고 균질한 젤라틴 가교입자의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 냉동된 젤라틴 입자를 해동시키면서 가교하는 단계를 포함하는 젤라틴 가교입자의 제조 방법.
2. 위 1에 있어서, 상기 해동은 냉장 하에 수행되는 젤라틴 가교입자의 제조 방법.
3. 위 1에 있어서, 상기 가교는 글루타르알데하이드와의 반응으로 수행되는 젤라틴 가교입자의 제조 방법.
4. 위 1에 있어서, 젤라틴 용액으로부터 젤라틴 침전액을 얻고, 이를 냉동하여 상기 냉동된 젤라틴 입자를 얻는 단계를 더 포함하는, 젤라틴 가교입자의 제조 방법.
5. 위 4에 있어서, 상기 용액의 용매는 물이며, 상기 침전은 아세톤을 첨가하여 수행되는 젤라틴 가교입자의 제조 방법.
6. 위 1에 있어서, 젤라틴 용액에서 젤라틴을 침전시키고, 그 침전물을 재용해시키고 산 첨가 후에 재침전시켜 젤라틴 침전액을 얻고, 이를 냉동하여 상기 냉동된 젤라틴 입자를 얻는 단계를 더 포함하는 젤라틴 가교입자의 제조 방법.
7. 위 1에 있어서, 가교된 젤라틴 입자에 유기 용매를 첨가하고 원심분리하여 젤라틴 가교입자를 정제하는 단계를 더 포함하는 젤라틴 가교입자의 제조 방법.
본 발명의 실시예에 따른 젤라틴 가교입자의 제조 방법은 작고 균질한 젤라틴 가교입자를 제조할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 젤라틴 가교입자는 세포독성이 없다.
본 발명의 실시예에 따른 젤라틴 가교입자는 약물 전달 시스템 및 조직 공학 등 생체의학 분야에 적용될 수 있다.
도 1은 기존 젤라틴 입자 제조 방법과 실시예의 제조 방법을 도식화하여 비교한다.
도 2는 기존 젤라틴 입자 제조 방법으로 제조된 젤라틴 입자와 실시예의 제조 방법으로 제조된 젤라틴 입자의 SEM 관찰 결과(2a, 2b) 및 크기 분포를 비교한다(2c, 2d).
도 3은 젤라틴과 실시예의 제조 방법으로 제조된 젤라틴 입자의 FT-IR 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예의 제조 방법으로 제조된 젤라틴 입자의 농도에 따른 조골세포 및 섬유아세포의 세포생존률을 나타낸다.
도 5는 실시예의 제조 방법으로 제조된 젤라틴 입자의 트리판블루 농도에 따른 약물방출 프로파일을 나타낸다.
도 6은 실시예의 제조 방법으로 제조된 젤라틴 입자의 실제 약물방출 프로파일과 수학적 모델에 따른 약물방출 프로파일을 비교한다.
도 2는 기존 젤라틴 입자 제조 방법으로 제조된 젤라틴 입자와 실시예의 제조 방법으로 제조된 젤라틴 입자의 SEM 관찰 결과(2a, 2b) 및 크기 분포를 비교한다(2c, 2d).
도 3은 젤라틴과 실시예의 제조 방법으로 제조된 젤라틴 입자의 FT-IR 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예의 제조 방법으로 제조된 젤라틴 입자의 농도에 따른 조골세포 및 섬유아세포의 세포생존률을 나타낸다.
도 5는 실시예의 제조 방법으로 제조된 젤라틴 입자의 트리판블루 농도에 따른 약물방출 프로파일을 나타낸다.
도 6은 실시예의 제조 방법으로 제조된 젤라틴 입자의 실제 약물방출 프로파일과 수학적 모델에 따른 약물방출 프로파일을 비교한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 냉동된 젤라틴 입자를 해동시키면서 가교하는 단계를 포함하는 젤라틴 가교입자의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 젤라틴은 동물의 가죽·힘줄·연골 등을 구성하는 천연 단백질인 콜라겐에서 얻어지는 유도 단백질의 일종을 의미한다. 젤라틴은 제조공정에서 원료를 산 처리 하여 얻어지는 A타입과, 염기 처리하여 얻어지는 B타입으로 구별되며, 본 발명의 젤라틴은 A타입 또는 B타입의 젤라틴일 수 있다.
상기 젤라틴 입자는 젤라틴이 알갱이 형태로 있는 것을 의미하며, 예를 들면 젤라틴을 용해시킨 후 침전 반응을 통해 얻을 수 있다.
상기 냉동은 젤라틴 입자의 온도를 상온 보다 낮은 온도로 내리는 것을 의미한다. 상기 냉동된 젤라틴 입자는 젤라틴 입자의 부피가 온도 감소로 인하여 상온에서의 부피보다 줄어든 상태이면 특별히 제한되지 않으며, 냉동되는 온도는 극저온도를 포함한다. 냉동은 급속 냉동일 수 있으며, 급속 냉동은 물질의 온도를 급속하게 떨어트려 보존하는 방법을 의미한다. 급속 냉동은 예를 들면 급속 냉동 기능이 구비된 냉동고를 통해 수행할 수 있고, 급속 냉동의 방법은 예를 들면 찬 공기를 이용하는 송풍 냉동, 선반에 냉매를 순환시키는 접촉 냉동, 또는 액체 질소를 쓰는 극저온 냉동법일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
냉동된 젤라틴 입자는 예를 들면 용매에 분산된 젤라틴 입자를 냉동시킨 것일 수 있다. 그 경우, 용매에 분산된 젤라틴 입자를 용매의 녹는점 이하의 온도로 냉동시킨 것일 수 있다. 용매는 예를 들면 물일 수 있다.
상기 해동은 젤라틴 입자의 온도를 상기 냉동된 온도와 상온 사이의 온도로 올리는 것을 의미하며, 따라서 상기 해동시키면서 가교하는 단계는 젤라틴 입자가 냉동 전 상태로 완전히 돌아가지 않은 상태에서 가교가 이루어짐을 의미한다. 해동은 예를 들면 냉장 하에 수행될 수 있으며, 냉장 온도는 예를 들면 0 ℃ 내지 10 ℃일 수 있다.
상기 가교는 젤라틴 입자를 이루는 사슬모양의 젤라틴 분자가 화학결합에 의해 서로 연결되는 것을 의미한다. 상기 젤라틴을 가교하는 단계는 당업자가 통상의 지식에 의해 적절히 선택할 수 있는 가교결합 방법을 통해 수행될 수 있으며 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 젤라틴의 가교결합은 글루타르알데하이드 또는 제니핀과의 반응으로 수행될 수 있다.
냉동된 젤라틴 입자가 용매에 분산된 젤라틴 입자를 냉동시킨 것이라면, 냉동 상태로 가교제와 반응되기는 어려우므로, 이를 해동시키면서 용매에서 가교제와 젤라틴 입자가 접촉할 수 있도록 하여 가교시킬 수 있다. 젤라틴 입자가 완전히 해동되고 온도가 상승한다면 부피가 다시 팽창될 것이므로, 가교는 완전히 해동되기 전에 수행되는 것이고, 냉동된 젤라틴 입자가 용매에 분산된 젤라틴 입자를 냉동시킨 것이라면, 가교는 완전히 해동되기 전, 예를 들면 살얼음이 끼어 있는 상태에서 수행될 수 있다.
본 발명은 젤라틴 용액으로부터 젤라틴 침전액을 얻고, 이를 냉동하여 상기 냉동된 젤라틴 입자를 얻는 단계를 포함할 수 있다.
상기 침전액은 젤라틴 용액에서 젤라틴이 포화에 도달하여 용액 속에 나온 상태를 의미하며, 젤라틴 용액으로부터 젤라틴 침전액을 얻는 방법은 당업자가 통상의 지식에 의해 적절히 선택할 수 있는 침전 반응을 통해 수행될 수 있으며 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면 젤라틴 침전 반응은 젤라틴 용액에 침전 시약을 첨가하여 일어날 수 있다. 젤라틴 용액은 예를 들면 젤라틴을 40 ℃ 내지 60 ℃의 용매(ex. 물)에 녹이는 방법으로 얻을 수 있으며, 침전 시약은 예를 들면 젤라틴 수용액일 때, 아세톤, 에탄올, 피크린산용액 및 삼산화크롬용액 중에서 선택된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 침전 반응에 사용되는 용매 및 시약의 양, pH 및 온도 등은 실시 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
상기 냉동은 전술한 냉동과 동일한 의미를 가진다.
본 발명은 젤라틴 용액에서 젤라틴을 침전시키고, 그 침전물을 재용해시키고 산 첨가 후에 재침전시켜 젤라틴 침전액을 얻고, 이를 냉동하여 상기 냉동된 젤라틴 입자를 얻는 단계를 포함할 수 있다.
상기 젤라틴의 침전 및 냉동은 전술한 젤라틴의 침전 및 냉동과 동일한 의미를 가진다.
침전 반응이 수행되기 전의 젤라틴 용액의 pH는 침전을 통해 생성된 젤라틴 입자의 형태 및 크기에 영향을 미친다. 상기 산 첨가는 젤라틴 용액의 pH를 낮춤으로써 용액 속 젤라틴 분자의 표면 전하를 높이며, 이로 인한 젤라틴 분자 사이의 반발력이 침전 반응 시 생성되는 젤라틴 입자의 형태를 균일하고 작게 할 수 있다. 상기 산 첨가를 통해 얻어지는 젤라틴 용액의 pH는 예를 들면 2 내지 4일 수 있으며, 구체적으로 3일 수 있다. 상기 산은 HCl일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 이후 가교된 젤라틴 입자에 유기 용매를 첨가하고, 원심분리하여 젤라틴 가교입자를 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 유기 용매는 아세톤, 아세토니트릴, 클로로포름, 메탄올, 에탄올 중에서 선택된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 정제는 냉장 하에 수행될 수 있다. 상기 냉장 온도는 예를 들면 0 ℃ 내지 10 ℃일 수 있다.
본 발명에서 후술하는 약물방출 프로파일은 젤라틴 입자에 약물이 로드될 경우 약물이 방출되는 속도와 경향성을 분석한 것으로서, 본 발명의 젤라틴 입자를 약물 전달 시스템에 사용할 경우 이를 바탕으로 입자의 적정량 사용과 방출 조절이 가능하도록 돕기 위하여 기재되었다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 구체적인 실시예를 제시하나, 이는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실험
1. 냉동-해동 방법을 통한 젤라틴 가교입자의 제조
젤라틴 A타입 (Sigma, 1.25g)을 50 ℃에서 25 mL의 물에 용해하였다. 젤라틴이 충분히 용해된 후, 25 mL의 아세톤을 첨가한 다음, 혼합액을 빠르게 저어 젤라틴의 침전을 빠르게 하였다. 그 후 상층액을 제거하여 높은 몰 질량의 젤라틴 침전물만을 남겼다. 침전물을 다시 50 ℃에서 25 mL의 물에 용해한 후, HCl 첨가를 통해 혼합액의 pH를 3으로 조정하였다. 그 후 75 mL의 아세톤(Sigma)을 첨가하고 40 ℃에서 600 rpm으로 회전시킨 후, 젤라틴을 압축하기 위해, 젤라틴 용액을 초저온냉동고에서 빠르게 냉동시켰다. 1시간 후, 냉동된 젤라틴 용액을 녹이고 4 ℃의 저온냉장쳄버에서 저어주었다. 그 후 젤라틴 입자의 가교 결합 형성을 위해 280 μL 의 글루타르알데하이드 (25%, v/v)를 첨가하였다. 그 후 젤라틴 입자를 75%의 아세톤 용액에 용해한 후, 4 ℃에서 6500 rpm으로 3회 원심분리하여 젤라틴 가교입자를 정제하였다. 이후 3일 동안 젤라틴 가교입자를 동결 건조하였다.
2. 젤라틴 가교입자의 SEM 분석
젤라틴 가교입자의 크기를 ImageJ 소프트웨어를 사용한 주사전자현미경(SEM) (JSM-7500F) 으로 관찰하였다. PerkinElmer Spectrum 400 기구를 사용하여 푸리에변환적외선분광법(FT-IR)을 수행하였다.
3. 젤라틴 가교입자의 세포독성 분석
MG-63 조골세포 및 건세포(tenocyte)에 대한 젤라틴 가교입자의 독성을 분석하기 위해, WST-1 assay를 수행하였다. MG-63 조골세포 및 건세포 각각을 1 × 104 cells/well의 밀도로 96-well plate에 분주한 후, 배양 배지(Cellgro)에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 배양 배지를 젤라틴 가교입자가 각 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1% 및 2%(w/v) 포함된 배양 배지로 교체한 후, 다시 24시간 동안 배양하였다. 그 후 WST-1 assay를 통해 생존한 세포의 수를 측정하였다.
4. 생체외 젤라틴 가교입자의 약물방출 분석
젤라틴 가교입자의 약물방출 프로파일을 위해 트리판블루를 모델 약물로 사용하였다. 젤라틴 가교입자를 트리판블루 용액(용액의 농도는 각 0.05%, 0.1% 및 0.2% (w/v))에 5 μL/mg의 비율로 함침시킨 후 상온에서 2시간 동안 보존하였다. 그 후, 젤라틴 가교입자를 인산염완충식염수(phosphate-buffered saline)에 1.5 mL/5 mg의 비율로 담근 후 인큐베이터에서 37 ℃에서 20 rpm으로 인버팅(inverting)한다. 이후 분광기에서 595 nm의 파장을 측정하여 상층액의 트리판블루 농도를 측정하였다.
5. 약물방출의 수학적 모델 제안
Fick’s second law를 바탕으로 간단한 1차원 수학적 모델을 제안하였다. 하기 식은 일반 확산 방정식이다.
상기 식 중, CA는 시간에 따른 약물 농도이며, A는 입자의 내부 위치, B는 입자의 외부 위치, t는 시간, DAB는 젤라틴 입자의 처음 3일 간의 약물방출 결과를 모델링하여 얻어진 확산 계수를 의미한다.
결과
본 발명은 작은 크기의 젤라틴 가교입자를 제조하기 위하여, 냉동-해동 단계를 바탕으로 한, 두 단계의 탈용매화 방법을 사용하였다. 이 방법은 온도 감소에 따라 물질의 분자의 압축이 증가하고 부피가 줄어드는 자연현상을 바탕으로 한 것이다.
도 1에서 상기 방법을 도식화하였다. 기존 방법에서는 젤라틴을 먼저 침전시키고 입자가 형성되면 글루타르알데하이드를 추가하는 것과 대조적으로, 본 발명에서는 젤라틴의 참전 후, 급속 냉동에 의해 젤라틴 분자 사이의 압축이 촉진되어 평균 100 nm 이하의 젤라틴 나노입자가 제조되었다. 도 2a은 기존 방법으로 제조된 젤라틴 입자의 SEM 이미지를 나타낸 것이며, 더 응집된 형태의 젤라틴 입자가 관찰된다. 도 2b는 냉동-해동 방법을 통해 제조된 젤라틴 가교입자의 SEM 이미지를 나타낸 것이며, 기존 방법으로 제조된 젤라틴 입자와 비교할 때 응집되지 않고 구형의 작은 크기의 입자가 제조되었음을 확인할 수 있다. 기존 방법으로 제조된 젤라틴 입자의 평균적인 크기는 도 2c에서와 같이 150 nm 이상이며, 냉동-해동 방법으로 제조된 젤라틴 가교입자는 평균적으로 최소 40~60 nm에서 최대 100 nm의 크기를 갖는다.
젤라틴과 본 발명의 젤라틴 가교입자의 화학적 구조를 비교하기 위하여, 젤라틴 및 젤라틴 가교입자의 작용기를 FT-IR로 분석한 결과를, 도 3에서 나타내었다. 3466 cm-1 에 분포하는 N-H stretching으로 인한 amide-A 피크는 가교결합의 정도와 관련되어 있으며, amide I 및 N-H denaturation에 대한 1630 cm-1의 C=0 stretching, amide II에 대한 1565 cm-1 의 C-N stretching이 있다.
입자의 크기는 입자의 세포독성을 결정하는 중요한 요소로 보고되어 왔다. 일반적으로, 100 nm 이하의 입자가 가장 독성이 적으며, 반면에 매우 작은 크기(1 nm 이하)의 입자는 세포독성이 매우 높은 것으로 알려져 있다. 젤라틴 가교입자의 세포독성을 조사하기 위하여, MG-63 조골세포 및 건세포를 각각 조골세포 및 섬유아세포의 모델로 사용하여 WST-1 assay를 수행하였다. 두 세포그룹 모두, 젤라틴 가교입자가 0%인 대조군과 비교하여 더 높은 세포생존력을 나타냈다. 흥미롭게도, 조골세포의 경우는 젤라틴 가교입자 농도가 증가함에 따라 세포생존력이 증가하였다. 상기 결과를 통해 젤라틴 가교입자가 세포독성이 없음을 알 수 있다.
입자의 크기는 일반적으로 생체내외에서 약물방출속도를 결정하는 중요 요소 중 하나로 알려져 있다. 젤라틴 가교입자의 양물방출속도 프로파일을 확인하기 위하여, 생체외에서 약물방출속도 실험을 수행하였다. 도 5에서, 모델 약물(트리판블루)의 농도가 각 0.05%, 0.1%, 및 0.2% 일 때의 약물방출 프로파일을 나타내었다. 실험결과, 상기 세 가지 농도에서, 각 40%, 30% 및 20%로 로드된(loaded) 약물에 대하여, 처음 3일 동안 초기 약물급속방출이 관찰되었다. 이는 트리판블루가 젤라틴 가교입자의 외부 표면에 흡수되었던 것으로 해석될 수 있다. 더욱이, 젤라틴의 약한 기계적 성질로 인해 초기 방출이 높았던 것으로 해석된다. 위 실험 결과는 초기의 약물급속방출을 보여줄 뿐만 아니라, 세 가지 농도에서 약물방출 곡선이 유사하게 나타남을 보여준다. 그러나, 약물방출속도는 로드된 약물의 양이 많을수록 높았다. 젤라틴 가교입자의 약물방출 메커니즘은, solid matrices의 약물방출에 대한 Higuchi 방정식에 따라, 확산에 의해 제어되는 것으로 알려져 있다.
생체의학에서의 응용에서, 신규한 입자의 약물방출 프로파일에 대한 수학적 모델링은 매우 중요한 요소이다. 수학적 모델링을 통한 입자의 약물방출 프로파일 및 방출 경향에 대한 이해는 입자에 대하여 적정량의 사용과 방출 조절을 가능하도록 해준다. 따라서, 기존 확산 방정식을 사용하여 간단한 수학적 모델을 제시하였다. 전술한 방정식 (1)은, 처음 3일 동안의 약물방출 프로파일에서 얻어진 확산 계수를 사용하였다. 추가적으로, 처음 3일 동안의 급속방출을 고려하여 결과를 보정하였다. 도 6에서 세 가지 농도에서의 방출 모델 결과와 실험 결과를 비교하여 나타내었다.
Claims (7)
- 냉동된 젤라틴 입자를 해동시키면서 가교하는 단계를 포함하는 젤라틴 가교입자의 제조 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 해동은 냉장 하에 수행되는 젤라틴 가교입자의 제조 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 가교는 글루타르알데하이드와의 반응으로 수행되는 젤라틴 가교입자의 제조 방법.
- 청구항 1에 있어서, 젤라틴 용액으로부터 젤라틴 침전액을 얻고, 이를 냉동하여 상기 냉동된 젤라틴 입자를 얻는 단계를 더 포함하는, 젤라틴 가교입자의 제조 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 용액의 용매는 물이며, 상기 침전은 아세톤을 첨가하여 수행되는 젤라틴 가교입자의 제조 방법.
- 청구항 1에 있어서, 젤라틴 용액에서 젤라틴을 침전시키고, 그 침전물을 재용해시키고 산 첨가 후에 재침전시켜 젤라틴 침전액을 얻고, 이를 냉동하여 상기 냉동된 젤라틴 입자를 얻는 단계를 더 포함하는 젤라틴 가교입자의 제조 방법.
- 청구항 1에 있어서, 가교된 젤라틴 입자에 유기 용매를 첨가하고 원심분리하여 젤라틴 가교입자를 정제하는 단계를 더 포함하는 젤라틴 가교입자의 제조 방법.
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| Food Hydrocolloids, 33(2), p.273-279, 2013. * |
| journal of bioactive and compatible polymers, 25(5), p.498-512(1-24), 2010. * |
| Polymers, 13(14), p.1-26, 2021.07.14. * |
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