CN110183595A - 烷氧醚树形聚合物/明胶复合冷冻凝胶、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种烷氧醚树形聚合物/明胶复合冷冻凝胶、其制备方法及其应。本发明利用经过甲基丙烯酸酐改性后的明胶和具有优异温度敏感行为的烷氧醚树枝化基元作为原材料,利用氧化还原反应,通过单向冷冻的方法制备了具有适中的力学性能、定向的多孔结构、温度响应型的一系列智能水凝胶,通过调控不同组分的比例和制冷速率实现了凝胶孔径和力学性能的可调。该方法工艺简单、安全有效、不采用有机溶液。通过细胞培养,结果显示该凝胶对细胞具有良好的黏附性能,细胞具有较高的存活率,且细胞的生长形态受凝胶孔径和形貌所控制。本发明所得的水凝胶可应用细胞基质的模拟,也可以应用与其它组织工程以及药物控释领域。
Description
技术领略
本发明属于生物材料制造领域,涉及一种烷氧醚树形聚合物/明胶复合冷冻凝胶、其制备方法及其应用。属于高分子水凝胶材料领域,也属于生物医药中的组织工程领域。
背景技术
组织工程目的在于利用生命科学的原理和技术构建生物组织或支持组织和器官构建从而提高其功能。基质在组织工程中起到至关重要的作用,主要用于维持和促进细胞或组织的生长。理想的组织工程基质应该具有以下特征:无毒、生物相容性好、具有适合的机械性能并且降解之后不会对周围的组织和器官产生危害。多孔结构的基质由于其有利于细胞的种植、生长、分化、同时能够向细胞及时提供养分及***废物等优异特点,近年来得到众多关注。水凝胶是一类具有良好生物相容性的多孔基质材料,含有超过90%的水分,且具有与人体组织类似的机械性能,因此广泛用作细胞培养基质。水凝胶的制备方法有多种,其中采用低温冷冻条件下,以冰晶作为模版制备得到的冷冻凝胶(cryogel)具有连续贯穿的较大孔洞结构,可以使得传质效应加强,是作为一种模拟生物组织和细胞基质的优良选择,在细胞培养方面具有独特的优势。
明胶是一种成本低、来源广泛、生物相容性好、可降解、含有促进细胞黏附基团的一种天然高分子材料,这些优良的特性使得其广泛应用于组织工程和药物载体等研究中。但是天然明胶的机械性能不易调控、稳定性比较差且容易被生物体降解,通过化学键的交联或者改性增强其力学性能,比如加入戊二醛、二异氰酸盐,碳化二亚胺等交联剂可以增强其稳定性。戊二醛是使用最广泛的,但是其存在一定的生物毒性,限制了其在生物医药方面的应用。利用甲基丙烯酸酐改性明胶是一种比较绿色安全的方法,可利用光引发聚合或氧化还原反应聚合,可制备成可注射凝胶、多孔材料,薄膜、微球等应用于药物释放、组织工程、伤口敷料等领域中,但仍存在机械性能不易调控,且在生物体内不稳定降解速度快的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种力学性能可调控、具有多孔结构且大小和形貌可调、具有温敏响应特性、生物相容性良好的水凝胶材料,能够促进细胞黏附、生长和诱导细胞定向分化。
本发明的目的之二在于提供该水凝胶材料的制备方法,该方法将明胶与甲基丙烯酸酐反应引入丙烯酸类官能团,与带有相同官能团的烷氧醚树枝化基元在冷冻温度控制的条件下,利用氧化还原反应制备定向多孔的水凝胶。制得的水凝胶能够作为细胞基质用于细胞培养,选择的细胞是人骨髓间充质干细胞(hMSC)。
为达到上述目的,本发明采用如下反应机理示意如下:
1.明胶改性的反应式:
2.水凝胶的合成:
根据上述反应机理,本发明采用如下技术方案:
一种烷氧醚树形聚合物/明胶复合冷冻凝胶,其特征在于该冷冻凝胶是利用甲基丙烯酸酐改性后的明胶和树型烷氧醚单体具有相同的丙烯酸官能团,以过硫酸铵为氧化剂,N,N-四甲基乙二胺为催化剂,通过自由基引发链增长的方式,通过单向冷冻的方法得到的具有定向多孔结构的温度响应型的水凝胶,其固含量为6%mg/ml,孔径大小在20~150微米,所述的树型烷氧醚单体和甲基丙烯酸酐改性后的明胶的单体质量比例为5~7:5~3;所述的烷氧醚树形聚合物的结构式为:
所述的甲基丙烯酸酐改性后的明胶的结构式为:
一种制备上述的烷氧醚树形聚合物/明胶复合冷冻凝胶的方法,其特征在于该方法的具体步骤为:
a.将树型烷氧醚单体、甲基丙烯酸酐改性后的明胶、氧化剂过硫酸铵、催化剂四甲基乙二胺 5-7:5-3:0.05:0.05的质量比溶于水中,控制固含量为6%mg/mL;
b.将步骤a所得溶液在液氮环境下冷冻,待凝胶体系完全冻住转移至-22℃中反应过夜即得到烷氧醚树形聚合物/明胶复合冷冻凝胶。
一种上述的烷氧醚树形聚合物/明胶复合冷冻凝胶作为细胞基质的应用。
准备合适尺寸大小的薄片状凝胶,并采用荧光染料对其进行修饰以方便观察其结构,将其放入多孔板中,并将人骨髓间充质干细胞种植黏附在凝胶上面进行培养,最后加入活细胞荧光染料对细胞进行染色以观测其生长状态。
本发明采用的烷氧醚树形聚合物是一类典型的非线形结构聚合物,具有较大的分子尺寸以及结构可调的优点,且具有屏蔽效应和温敏响应行为,本发明结合明胶和烷氧醚树形聚合物的优点制备一类复合冷冻凝胶,作为细胞培养基质,采用单向冷冻的方法通过控制溶液体系的冷冻速度从而使得冰晶按照一个生长方向,利用单向的冰晶可形成高度有序的多孔结构,材料的孔径大小可以通过控制冰晶的大小来控制,而冰晶的大小又可以利用溶液的浓度来调控。通过对孔径大小的调控以及定向形貌特征,可对细胞的黏附、生长、分化产生影响,从而影响其在组织和器官中扮演的角色。此外,利用烷氧醚树形聚合物的温敏响应特性,以温度为调控参数,也可在药物控释方面具有应用价值。
本发明的优点在于
1.其工艺简单可行,聚合条件温度温和。
2.原料成本低,生物相容性好具有温敏行为、可模仿生物体的微环境
3.本实验发明的凝胶具有定向的孔结构、可控的可降解性质,且对细胞具有较好的黏附性,使细胞保持较高存活绿和生长成不同形态。该材料在组织工程和药物负载和控释领域均具有重要的研究价值和广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明的烷氧醚与改性明胶质量比例为5:5、7:3和纯改性明胶凝胶以及非定向方法制备凝胶样品在共聚焦激光显微镜和扫描电镜的形貌。
图2为烷氧醚与改性明胶质量比例为5:5、7:3和纯改性明胶凝胶的流变力学。
图3为烷氧醚与改性明胶质量比例为5:5、7:3和纯改性明胶凝胶的平行与和垂直冰晶生长方向的流变力学。
图4为烷氧醚与改性明胶质量比例为5:5、7:3和纯改性明胶凝胶的压缩模量。
图5为共聚焦显微镜观测利用凝胶样品(5:5)培养干细胞1天后和生长4天后的细胞形态。
具体实施方式
甲基丙烯酸酸酐改性明胶的制备方法请参见:Biomacromolecules 2000,1,31-38。
树型烷氧醚的合成参照参考文献:Macromolecules,2008,41,3659-3667。
预先将各组分配制成水溶液,烷氧醚单体20%(1g/5mL)、改性明胶10%(500mg/5mL)、氧化剂过硫酸铵5%(40mg/800mL)、催化剂四甲基乙二胺5%(40mg/800mL)。单向冷冻装置:至少提前半小时将边长为5厘米的正方形铜块放置于液氮中,始终保持一面在液氮液面上,使铜块与液氮温度保持一直。
本发明提出以下实例作为进一步说明,但并非限制本发明权利保护范围。
实施例1:烷氧醚与改性明胶质量比例为5:5凝胶样品的制备:从组分母液中移取烷氧醚单体溶液300μL、改性明胶600μL、去离子水800μL,氧化剂和催化剂各80μL,整个体系成胶固含量为6w/v%。依次加入内径为14毫米的聚丙烯塑料磨具中,震荡均匀并利用聚丙烯塑料泡沫隔绝周围热量迅速与铜面接触(模具不能接触到液氮)待凝胶体系完全冻住转移至-22度冰箱中得到烷氧醚:明胶=5:5的凝胶样品。
实施例2:烷氧醚与改性明胶质量比例为7:3的凝胶样品的制备:从各组分母液中移取烷氧醚单体溶液400μL、改性之后的明胶360μL、去离子水1000μL,氧化剂和催化剂各80μL 依次加入内径为14毫米的聚丙烯塑料磨具中,震荡均匀并利用泡沫隔绝周围热量迅速与铜面接触(模具不能接触到液氮)待凝胶体系完全冻住转移至-22度冰箱中反应过夜即可得到烷氧醚:明胶=7:3的凝胶样品。
实施例3:利用非单向冷冻方法制备烷氧醚与改性明胶质量比例为5:5的凝胶样品
从组分母液中取烷氧醚单体300μL、改性明胶600μL、去离子水800μL,氧化剂和催化剂各80μL,整个体系成胶固含量为6w/v%。依次加入内径为14毫米的玻璃样品瓶中,震荡均匀迅速放置到-22度冰箱中反应过夜。
实施例4:纯改性明胶凝胶样品的制备。从各组分母液中取明胶1200μL、去离子水560μL,氧化剂过硫酸铵120μL、催化剂过硫酸铵120μL依次加入内径为14毫米的聚丙烯塑料模具中,震荡均匀并利用泡沫隔绝周围热量迅速与铜面接触(模具不能接触到液氮)待凝胶体系完全冻住转移至-22度冰箱中反应过夜即可得到纯改性明胶凝胶样品。
实施实例5:利用共聚焦激光显微镜和扫面电镜显微镜观测凝胶样品的微观形貌。
共聚焦激光显微镜观测:利用刀片切取凝胶中间部分切成圆片,用去离子水充分洗脱后,加入少量异硫氰酸荧光素染料溶于二甲基亚砜和水的混合溶液中并利用该溶液对凝胶切片进行染色,两小时后将未吸附的染料洗掉,利用激光共聚焦显微镜20倍物镜对凝胶形貌进行观测。
扫面电镜显微镜观测:将所得水凝胶样品用去离子水充分洗脱后,冻干,同样切取凝胶中间部分切成圆片,喷金后利用扫描电镜进行观测形貌。如图1所示,采用定向方法制备的凝胶形貌分布比较有规律,纯明胶凝胶孔径分布有一定程度的有序性,但较差。当烷氧醚与明胶比例为5:5时,孔结构分布有序,大小在10-50微米,当烷氧醚增多时孔径分布范围变大,大小在20-100微米。采用非定向方法制备的凝胶形貌分布无规律,大小20-200微米。
实施实例6:水凝胶力学性能表征
根据上述实例1,2,3,4中的方法,制得不同烷氧醚单体和改性明胶比例为5:5和7:3、以及纯改性明胶凝胶3个凝胶样品。直径为14毫米,高度4毫米,使用旋转流变仪对各凝胶样品进行应变扫描时,设定扫描频率为1rad/s,扫描应变范围为0.01-100%。力学性能如图2 所示,纯改性明胶的储能模量为3kPa左右,5:5的为2kPa左右,7:3的为300Pa。
实施实例7:压缩模量测试
对实例1,2,3的方法制得水凝胶进行压缩测试。凝胶样品高度12毫米直径14毫米,测试模式应力应变模式、室温,初始力为0.01N,应变速率为10%每分钟,形变率为20%。结果如图3所示,当形变率为20%时,纯改性明胶凝胶的储能模量为9kPa左右,5:5的为2kPa左右,7:3的为400Pa左右。
实施实例8:利用凝胶样品模拟细胞基质进行细胞培养
首先将凝胶切成厚度为1mm、直径为5mm的圆形片状,每种凝胶准备4个样品进行平行实验,采用荧光染料罗丹明对凝胶样品进行修饰,之后将带有荧光标记的凝胶放入48孔板中,分别经70%乙醇消毒,PBS溶液洗涤,细胞培养液浸泡,去除培养液后,加入含有培养液的细胞,放入培养箱中进行培养,于1天后加入绿色荧光活细胞示踪剂(CellTrackerGreen CMFDA dye)进行活细胞染色,并采用共聚焦显微镜对培养不同天数后的细胞生长状态进行观察。由图5可知,凝胶基质的微观形貌会影响细胞的黏附和生长行为,当微观形貌尺寸狭长有序时,细胞沿着基质生长为狭长的状态,细胞黏附效率也下降。而无规分布的凝胶样品细胞生长形貌偏圆形,细胞分化能力很强。
Claims (3)
1.一种烷氧醚树形聚合物/明胶复合冷冻凝胶,其特征在于该冷冻凝胶是利用甲基丙烯酸酐改性后的明胶和树型烷氧醚单体具有相同的丙烯酸官能团,以过硫酸铵为氧化剂,N, N-四甲基乙二胺为催化剂,通过自由基引发链增长的方式,通过单向冷冻的方法得到的具有定向多孔结构的温度响应型的水凝胶,其固含量为6%mg/ml,孔径大小在20~150微米,所述的树型烷氧醚单体和甲基丙烯酸酐改性后的明胶的单体质量比例为5~7:5~3;所述的烷氧醚树形聚合物的结构式为:
所述的甲基丙烯酸酐改性后的明胶的结构式为:
。
2.一种制备根据权利要求1所述的烷氧醚树形聚合物/明胶复合冷冻凝胶的方法,其特征在于该方法的具体步骤为:
将树型烷氧醚单体、甲基丙烯酸酐改性后的明胶、氧化剂过硫酸铵、催化剂四甲基乙二胺5-7:5-3:0.05:0.05的质量比溶于水中,控制固含量为6 %mg/mL;
将步骤a所得溶液在液氮环境下进行单向冷冻,待凝胶体系完全冻住转移至-22℃中反应过夜即得到烷氧醚树形聚合物/明胶复合冷冻凝胶。
3.一种根据权利要求1所述的烷氧醚树形聚合物/明胶复合冷冻凝胶作为细胞基质的应用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190830 |
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