JP7308611B2 - 多能性幹細胞用未分化維持培地 - Google Patents
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Description
従来、細胞培養には、血清やアルブミンを含む細胞培地が用いられてきた。アルブミンは、生体由来のものと遺伝子組み換えのものとがあり、生体由来のものであれば、ドナーがウイルス等に感染している場合、それらのウイルス等を培地に含むおそれがある。またウイルス等に感染していなくとも、アルブミンの精製中に何らかの因子が夾雑し、培地に含まれ、かかる因子に起因して細胞が意図しないタイミングで分化することもあり得る。加えて、生体由来であるため、ロット間で微量成分の濃度などや品質の差異が生じ、かかる差異により培養結果が変化し得る。一方で遺伝子組み換えのアルブミンは費用が高額となる。したがって、多能性幹細胞の培養には、アルブミンを含有しない培地を使用することが好ましい。
しかしながら、培地中にアルブミンを含有することなく、高い増殖性を有し接着培養などに適した汎用性の高い多能性幹細胞用の培地として十分な品質を有するものは未だ存在しない。
[1]親水性ポリマーを含有し、実質的にアルブミンを含有しない、多能性幹細胞接着培養用培地。
[2]さらに、抗酸化物質を含有する、前記[1]に記載の培地。
[3]親水性ポリマーが、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンである、前記[1]または[2]に記載の培地。
[4]抗酸化物質が、N-アセチル-L-システイン、還元型グルタチオン、ビタミンC、ビタミンEおよびクロロゲン酸からなる群より選択される少なくとも1種である、前記[2]または[3]に記載の培地。
[5]抗酸化物質が、N-アセチル-L-システインである、前記[2]~[4]のいずれかに記載の培地。
[6]さらに、アルブミン以外のタンパク質成分を含有する、前記[1]~[5]のいずれかに記載の培地。
[7]アルブミン以外のタンパク質成分が、インスリン、トランスフェリンおよび塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)からなる群より選択される少なくとも1種である、前記[6]に記載の培地。
[8]さらに、分化抑制剤を含有する、前記[1]~[7]のいずれかに記載の培地。
[9]分化抑制剤が、GSK3β(グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β)阻害剤、および/またはDYRK(Dual-specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase)阻害剤である、前記[8]に記載の培地。
[10]GSK3β阻害剤が、1-Azakenpaulloneである、前記[9]に記載の培地。
[11]DYRK阻害剤が、ID-8である、前記[9]に記載の培地。
[12]さらに、NFAT(活性化T細胞核内因子)阻害剤を含有する、前記[1]~[11]のいずれかに記載の培地。
[13]NFAT阻害剤が、Tacrolimusである、前記[12]に記載の培地。
[14]多能性幹細胞が、ヒト由来である、前記[1]~[13]のいずれかに記載の培地。
[15]多能性幹細胞が、iPS細胞である、前記[1]~[14]のいずれかに記載の培地。
[16]親水性ポリマー、抗酸化物質ならびにGSK3β阻害剤およびDYRK阻害剤からなる分化抑制剤を含有する、多能性幹細胞接着培養用培地。
[17]前記[1]~[16]のいずれかに記載の培地を用いる、多能性幹細胞の培養方法。
[18]多能性幹細胞の培養基材への接着を増強する方法であって、培地に親水性ポリマーを添加することを含む、前記方法。
[19]前記[17]または[18]の方法により製造された、多能性幹細胞。
本発明に係る「多能性幹細胞接着培養用培地」は、多能性幹細胞を接着培養するために用いる培地である。本発明に係る「多能性幹細胞」は、生体を構成する全ての組織または細胞に分化し得る分化多能性および自己複製能を有する細胞であり、一例として、ES細胞、胚性生殖細胞(EG細胞)、iPS細胞を挙げることができ、好ましくはiPS細胞である。本発明に係る「多能性幹細胞」の由来となる生物種は、特に限定されず、例えばヒト、サル、マウスなどが挙げられ、好ましくはヒト由来である。
本発明に係る培養基材への細胞接着を増強する方法は、培地に親水性ポリマーを添加することを含み、親水性ポリマーは培地製造時または培地使用時の任意のタイミングで添加してよい。本発明に係る培養基材は、公知のものを用いることができ、限定されることなく、例えばポリスチレン樹脂製やガラス製のものの他にこれらにラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、カゼインなどのタンパク質をコーティングしたものや高分子を固定化したものが使用できる。
[培地の調製]
DMEM/F12 with trace element培地(Sigma社製 D0547)10.8g、1M HEPES(ThermoScientific社製 15630-080)14mL、炭酸水素ナトリウム1.1g、塩化ナトリウム0.4g、L-アスコルビン酸リン酸マグネシウム(富士フイルム和光純薬社製 013-19641)0.06g、ITS溶液(ThermoScientific社製 41400-045 Insulin 1mg/mL、Transferrin 0.55mg/mL、Selenium 0.7μg/mL)18mL、1-Azakenpaullone(Toronto Research Chemicals社製 A800950)361μg、ID-8(Cayman Chemicals社製 15222)179μg、Tacrolimus(Cayman Chemicals社製 10007965)16ngを水1Lに溶解、混合し、1Lの基礎培地を得た。
基礎培地100mLに、アルブミン(MP Biomedicals社製 0215240180-100g)1gを添加した培地を得た。
無添加の基礎培地およびアルブミンを添加した培地それぞれに細胞をシングルセルで分散し1時間経過した後、それぞれDCFH-DAで細胞を蛍光染色し、フローサイトメーターを用いて蛍光強度を測定した。
[結果]
図1に示すとおり、アルブミンの添加によって、細胞内ROS量が約60%低減されたことが確認された。
ヒトiPS細胞253G1株を、PBSで洗浄後、TrypLE Select(ThermoScientific社)および0.5mM EDTAの等量混合液で37℃、5分間処理することでシングルセルに分散、回収し、血球計算盤を用いて細胞数を測定後、0.25μg/cm2となるようにiMatrix-511(マトリクソーム社)をコートした接着培養用6ウェルプレートに25,000細胞/ウェルで細胞を播種し、10μMのY-27632(Cayman Chemicals社製 10005583)を含む上記培地で37℃、5%CO2条件下で一晩培養し、毎日Y-27632を含まない培地に交換しながら7日間培養した。
培養は、基礎培地に何も添加しない培地をコントロールとし、基礎培地にアルブミンを添加した培地とで行った(n=1)。
[細胞の形態の確認]
培養3日目の、無添加の基礎培地およびアルブミンを添加した培地での培養における、細胞の形態を位相差顕微鏡で観察した。
[結果]
図2に示すとおり、アルブミンを添加した培地における細胞の形態は、紡錘形を示しており、球形を示している無添加の培地における細胞の形態よりも、良い状態であることが確認された。
[培地の調製]
基礎培地を比較例1と同様に調製し、基礎培地100mLにそれぞれN-アセチル-L-システイン(関東化学社製 01763-30)163mgを添加したもの、還元型グルタチオン(関東化学社製 17501-61)307mgを添加したもの、ビタミンC(富士フイルム和光純薬社製 013-19641)278mgを添加したもの、ビタミンE(関東化学社製 40562-30)430mgを添加したもの、クロロゲン酸(関東化学社製 10924-1A)353mgを添加したものを得た。また、対照として基礎培地に何も添加しない培地および基礎培地100mLにアルブミン1gを添加したものを得た。
[ROSの測定]
対照および各成分をそれぞれ添加した培地において培養した細胞をシングルセルに分散後、それぞれDCFH-DAで蛍光染色し、フローサイトメーターを用いて蛍光強度を測定した。
[結果]
図3に示すとおり、5種類の抗酸化物質を添加した培地でそれぞれ培養した細胞すべてにおいて無添加のものに比べて蛍光強度の低下が認められ、ROS量が低下していることが示唆された。また、5種類の中でもN-アセチル-L-システインおよび還元型グルタチオンにおいて高い効果を認め、約50%の細胞内ROS量の低減が認められた。
[培地の調製]
基礎培地を比較例1と同様に調製し、基礎培地100mLにそれぞれN-アセチル-L-システイン(関東化学社製 01763-30)8.2mgを添加したもの、還元型グルタチオン(関東化学社製 17501-61)16mgを添加したもの、ビタミンC(富士フイルム和光純薬社製 013-19641)14mgを添加したもの、ビタミンE(関東化学社製 40562-30)21mgを添加したもの、クロロゲン酸(関東化学社製 10924-1A)17mgを添加したものを得た。また、対照として基礎培地に何も添加しない培地および基礎培地100mLにアルブミン1gを添加したものを得た。
[培養]
ヒトiPS細胞253G1株を、PBSで洗浄後、TrypLE Select(ThermoScientific社)および0.5mM EDTAの等量混合液で37℃、5分間処理することでシングルセルに分散、回収し、血球計算盤を用いて細胞数を測定後、0.25μg/cm2となるようにiMatrix-511(マトリクソーム社)をコートした接着培養用6ウェルプレートに25,000細胞/ウェルで細胞を播種し、10μM Y-27632を含む上記培地で37℃、5%CO2条件下で一晩培養し、毎日Y-27632を含まない培地に交換しながら7日間培養した。
培養は、対照として基礎培地に何も添加しない培地およびアルブミンを添加した培地を用意し、それらおよびN-アセチル-L-システインを添加した培地、還元型グルタチオンを添加した培地、ビタミンCを添加した培地、ビタミンEを添加した培地、クロロゲン酸を添加した培地とで行った(n=1)。
[細胞の形態の確認]
対照および5種類の抗酸化物質を代表してN-アセチル-L-システインを添加した培地での培養における、培養3日目の細胞の形態を位相差顕微鏡で観察した。
[結果]
図4に示すとおり、N-アセチル-L-システインを添加した培地において培養された細胞の形態も、紡錘形を示しており、良好な細胞状態であることが確認された。
[培地の調製]
基礎培地を比較例1と同様に調製し、基礎培地100mLにそれぞれポリビニルアルコール(Sigma社製 P8136)0.25gを添加したもの、ポリビニルピロリドン(Sigma社製 PVP40)0.25gを添加したもの、アルブミン1gを添加したものを得た。
[培養]
ヒトiPS細胞253G1株を、PBSで洗浄後、TrypLE Select(ThermoScientific社)および0.5mM EDTAの等量混合液で37℃、5分間処理することでシングルセルに分散、回収し、血球計算盤を用いて細胞数を測定後、0.25μg/cm2となるようにiMatrix-511(マトリクソーム社)をコートした接着培養用6ウェルプレートに25,000細胞/ウェルで細胞を播種し、10μM Y-27632を含む上記培地で37℃、5%CO2条件下で一晩培養し、毎日Y-27632を含まない培地に交換しながら7日間培養した。
培養は、対照として基礎培地に何も添加しない培地およびアルブミンを添加した培地を用意し、それらおよびポリビニルアルコールを添加した培地、ポリビニルピロリドンを添加した培地とで行った(n=3)。
[細胞接着の確認]
培養した細胞をそれぞれクリスタルバイオレットで染色し、位相差顕微鏡下で細胞の接着状態を確認した。
[結果]
図5(-)に示すとおり、無添加の培地においては培養容器中央にのみ染色された細胞が確認され、培養容器の周縁部には細胞が接着していないことを確認した。それに対して、図5(+Alb)に示すとおり、アルブミンを添加した培地では、培地容器全体に染色された細胞が確認され、細胞の剥離が生じていないことを確認した。また、図5(+PVA)および(+PVP)に示すとおり、2種類の親水性ポリマーを添加した培地でそれぞれ培養した細胞においても、両方とも無添加の条件下で培養した細胞に比べて培養容器の周縁部まで細胞が隈なく接着していることを確認した。
[培地の調製]
基礎培地を、比較例1と同様に調製した。
基礎培地100mLに、それぞれN-アセチル-L-システイン8.2mgのみを添加したもの、ポリビニルアルコール0.25gのみを添加したもの、N-アセチル-L-システイン8.2mgおよびポリビニルアルコール0.25gを添加したものを得た。
ヒトiPS細胞253G1株を、PBSで洗浄後、TrypLE Select(ThermoScientific社)および0.5mM EDTAの等量混合液で37℃、5分間処理することでシングルセルに分散、回収し、血球計算盤を用いて細胞数を測定後、0.25μg/cm2となるようにiMatrix-511(マトリクソーム社)をコートした接着培養用6ウェルプレートに25,000細胞/ウェルで細胞を播種し、10μM Y-27632を含む上記培地で37℃、5%CO2条件下で一晩培養し、毎日Y-27632を含まない培地に交換しながら7日間培養した。
培養は、対照として基礎培地に何も添加していない培地を用意し、それおよびN-アセチル-L-システインのみを添加した培地、ポリビニルアルコールのみを添加した培地、N-アセチル-L-システインおよびポリビニルアルコールを添加した培地とで行った(n=3)。
[結果]
図6に示すとおり、基礎培地のみの培養結果に対し、N-アセチル-L-システインのみを添加したもので約1.4倍、ポリビニルアルコールのみを添加したもので約1.5倍、N-アセチル-L-システインおよびポリビニルアルコール両方を添加したもので約2.0倍の相対増殖率の増加が確認された。
Claims (13)
- 親水性ポリマーおよびN-アセチル-L-システインを含有し、アルブミンを含有しないかまたはアルブミンを0.010%以下で含む、多能性幹細胞接着培養用無血清培地。
- 親水性ポリマーが、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンである、請求項1に記載の培地。
- さらに、アルブミン以外のタンパク質成分を含有する、請求項1または2に記載の培地。
- アルブミン以外のタンパク質成分が、インスリン、トランスフェリンおよび塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項3に記載の培地。
- さらに、分化抑制剤を含有する、請求項1~4のいずれか一項に記載の培地。
- 分化抑制剤が、GSK3β(グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β)阻害剤、および/またはDYRK(Dual-specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase)阻害剤である、請求項5に記載の培地。
- GSK3β阻害剤が、1-Azakenpaulloneである、請求項6に記載の培地。
- DYRK阻害剤が、ID-8である、請求項6に記載の培地。
- さらに、NFAT(活性化T細胞核内因子)阻害剤を含有する、請求項1~8のいずれか一項に記載の培地。
- NFAT阻害剤が、Tacrolimusである、請求項9に記載の培地。
- 多能性幹細胞が、ヒト由来である、請求項1~10のいずれか一項に記載の培地。
- 多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞(iPS細胞)である、請求項1~11のいずれか一項に記載の培地。
- 請求項1~12のいずれか一項に記載の培地を用いる、多能性幹細胞の培養方法。
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