CN107267462B - 一种诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞培养基技术领域，具体涉及一种诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基。本发明提供的诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞生长因子20‑40ng/mL，转铁蛋白21‑30μg/mL，纤粘连蛋白6‑9μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮10‑15μg/mL，金雀异黄素1‑3μg/mL，甘露醇4‑7μg/mL，胰岛素5‑8μg/mL，L‑谷氨酰胺11‑15μg/mL，棕榈酸12‑16μg/mL和橙皮甙8‑15μg/mL。本发明提供的诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基成分明确，不含血清，安全性高，能够快速产生诱导多能干细胞。

Description

一种诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基
技术领域
本发明属于细胞培养基技术领域，具体涉及一种诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基。
背景技术
诱导多能干细胞(IPS)最初是日本科学家山中伸弥于2006年利用病毒载体将四个转录因子的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的一种细胞类型。通过采用导入外源基因的方法使体细胞去分化为多能干细胞，对于这类干细胞我们称之为诱导多能干细胞。自从诱导多能干细胞技术出现后，世界各地的研究者都在对这项技术进行研究开发，它不仅具有胚胎干细胞的多能性，而且不涉及人类伦理问题，对再生医学来说，有着不可估量的潜在价值。
中国专利申请CN104830753A公开了一种用于生物技术领域的诱导多能干细胞培养基，其应用及培养方法，以IMDM/F12为基础培养基，每500mLIMDM/F12基础培养基中包括以下浓度的组分：重组人胰岛素，重组转铁蛋白，维生素C，人白蛋白，bFGF，PDGF-bb，EGF，IGF-1，TGF-β，纤维连接蛋白，Fetuin，Betacellulin，β-mercaptoethanol，Thiazovivin。
中国专利申请CN105907705A公开了一种多能干细胞培养基，包括基础培养基和以下添加组分：L-抗坏血酸-2磷酸镁、***钠、人胰岛素、柠檬酸铁、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子beta1。
目前，对于诱导多能干细胞的培养多采用含有胎牛血清的培养基，含有血清的培养基无法规避动物血清中的异源体，如果使用动物血清培养基培育出来的细胞，会存在人体异源体排斥和冲突，这使得诱导多能干细胞在临床上的应用价值和安全性降低。虽然已经研发出用于诱导多能干细胞的无血清培养基，但是存在细胞增殖的速度慢等问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基。本发明提供的诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基成分明确，不含血清，避免了使用血清导致的异种成分引起的排斥现象，安全性高，能够快速产生诱导多能干细胞，提高了诱导多能干细胞的增殖速度。
本发明的技术方案是：
一种诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞生长因子20-40ng/mL，转铁蛋白21-30μg/mL，纤粘连蛋白6-9μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮10-15μg/mL，金雀异黄素1-3μg/mL，甘露醇4-7μg/mL，胰岛素5-8μg/mL，L-谷氨酰胺11-15μg/mL，棕榈酸12-16μg/mL和橙皮甙8-15μg/mL。
进一步地，所述诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞生长因子26ng/mL，转铁蛋白24μg/mL，纤粘连蛋白7μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮13μg/mL，金雀异黄素2μg/mL，甘露醇5μg/mL，胰岛素7μg/mL，L-谷氨酰胺12μg/mL，棕榈酸14μg/mL和橙皮甙11μg/mL。
进一步地，所述基础培养基为F12培养基或DMEM培养基。
进一步地，所述细胞生长因子由成纤细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子按重量比8-10∶3-5∶1-3组成。
更进一步地，所述细胞生长因子由成纤细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子按重量比9∶4∶2组成。
另外，本发明还提供了诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基的制备方法，步骤如下：
S1向基础培养基中加入细胞生长因子、胰岛素、L-谷氨酰胺和棕榈酸，搅拌，搅拌速度为80-120r/min，搅拌时间为35-50min，加入转铁蛋白、纤粘连蛋白、金雀异黄素和橙皮甙，继续搅拌40min，加入聚乙烯吡咯烷酮和甘露醇，搅拌32min，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至6.8-7.2，用0.22μm滤膜过滤除菌，即得。
进一步地，所述步骤S1搅拌速度为90r/min。
进一步地，所述步骤S1搅拌时间为44min。
进一步地，所述步骤S2调节步骤S1所得混合物的pH至6.9。
本发明提供的诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基，包括基础培养基和添加剂，添加的添加剂包括细胞生长因子、转铁蛋白、纤粘连蛋白和聚乙烯吡咯烷酮等。在本发明的各种培养基的成分中，基础培养基能够提供诱导多能干细胞的生存和最低的生理活动。在本发明中，细胞因子主要作为诱导多能干细胞体外培养生存、增殖和分化所需的补充因子。
在本发明中，转铁蛋白是一种结合铁离子的糖蛋白，它能够调节体内铁元素的代谢，通过细胞表面的转铁蛋白受体将铁元素转移到细胞内；另外，它还可以与其他微量元素结合，从而调节诱导多能干细胞的生长增殖与功能表达。在本发明中，纤粘连蛋白能够促进细胞的黏连生长。在本发明中，聚乙烯吡咯烷酮能够吸收酚类物质，减轻酚类物质对细胞的毒害，另外，它还与本发明中的其他成分如金雀异黄素、橙皮甙协同作用，消除氧自由基对细胞的毒害。
在本发明中，金雀异黄素不仅具有抗氧化、抗炎和抗增生等作用，它还能调控诱导多能干细胞的细胞周期的有丝***、细胞生存、细胞转化和诱导细胞分化，与本发明中的细胞因子协同作用，促进诱导多能干细胞的增殖和分化。
在本发明中，橙皮甙不仅具有清除羟自由基的作用，另外，橙皮甙通过与本发明中的细胞因子和金雀异黄素协同作用，对诱导多能干细胞增殖具有显著的促进作用。
在本发明中，甘露醇主要用于调节培养基的渗透压，另外，它还与本发明中的其他成分共同作用，起到更好的清除自由基的作用。在本发明中，胰岛素可刺激细胞对尿苷和葡萄糖的吸收以合成RNA、蛋白质和脂质，另外，它还能与细胞膜上的胰岛素受体结合而调控细胞内的多种代谢途径，增加脂肪酸和葡萄糖的合成，对细胞生长起重要作用。在本发明中，L-谷氨酰胺能够参与蛋白质的合成和核酸代谢。在本发明中，棕榈酸能够提供细胞膜合成所需的脂质。
经试验发现，在所有检测的传代中，生长在本发明实施例1-3制备的诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基中的细胞产率，明显高于生长在对比例1-3制备的诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基中的细胞产率。这说明，本发明由成纤细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子按一定重量比组成的细胞生长因子，以及金雀异黄素、橙皮甙，与本发明中的其他成分相互协同，起提高诱导多能干细胞的增殖速度的作用。
本发明提供的诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基搭配合理，各成分间协同作用，能提供诱导多能干细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，促进诱导多能干细胞的增殖，缩短诱导多能干细胞培养的时间。
与现有技术相比，本发明提供的诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基具有以下优势：
(1)本发明提供的诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基安全性高，不含血清，避免了使用血清导致的异种成分引起的排斥现象。
(2)本发明提供的诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基能够快速产生诱导多能干细胞，提高了诱导多能干细胞的增殖速度，大大缩短了诱导多能干细胞培养的时间。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明F12培养基可购自上海拜力生物科技有限公司，型号E523-1；DMEM培养基可购自北京北方同正生物技术发展有限公司，货号SH30022；聚乙烯吡咯烷酮可购自广州共冠化工有限公司，型号PVP K-30；金雀异黄素可购自西安天丰生物科技有限公司，货号NF-035；橙皮甙可购自陕西泰克生物科技有限公司，货号TK-01。
实施例1、一种诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基
所述诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞生长因子20ng/mL，转铁蛋白21μg/mL，纤粘连蛋白6μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮10μg/mL，金雀异黄素1μg/mL，甘露醇4μg/mL，胰岛素5μg/mL，L-谷氨酰胺11μg/mL，棕榈酸12μg/mL和橙皮甙8μg/mL。
所述基础培养基为F12培养基。
所述细胞生长因子由成纤细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子按重量比8∶5∶3组成。
制备方法：
S1向基础培养基中加入细胞生长因子、胰岛素、L-谷氨酰胺和棕榈酸，搅拌，搅拌速度为80r/min，搅拌时间为35min，加入转铁蛋白、纤粘连蛋白、金雀异黄素和橙皮甙，继续搅拌40min，加入聚乙烯吡咯烷酮和甘露醇，搅拌32min，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至6.8，用0.22μm滤膜过滤除菌，即得。
实施例2、一种诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基
所述诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞生长因子40ng/mL，转铁蛋白30μg/mL，纤粘连蛋白9μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮15μg/mL，金雀异黄素3μg/mL，甘露醇7μg/mL，胰岛素8μg/mL，L-谷氨酰胺15μg/mL，棕榈酸16μg/mL和橙皮甙15μg/mL。
所述基础培养基为DMEM培养基。
所述细胞生长因子由成纤细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子按重量比10∶3∶1组成。
制备方法：
S1向基础培养基中加入细胞生长因子、胰岛素、L-谷氨酰胺和棕榈酸，搅拌，搅拌速度为120r/min，搅拌时间为50min，加入转铁蛋白、纤粘连蛋白、金雀异黄素和橙皮甙，继续搅拌40min，加入聚乙烯吡咯烷酮和甘露醇，搅拌32min，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至7.2，用0.22μm滤膜过滤除菌，即得。
实施例3、一种诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基
所述诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞生长因子26ng/mL，转铁蛋白24μg/mL，纤粘连蛋白7μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮13μg/mL，金雀异黄素2μg/mL，甘露醇5μg/mL，胰岛素7μg/mL，L-谷氨酰胺12μg/mL，棕榈酸14μg/mL和橙皮甙11μg/mL。
所述基础培养基为F12培养基。
所述细胞生长因子由成纤细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子按重量比9∶4∶2组成。
制备方法：
S1向基础培养基中加入细胞生长因子、胰岛素、L-谷氨酰胺和棕榈酸，搅拌，搅拌速度为90r/min，搅拌时间为44min，加入转铁蛋白、纤粘连蛋白、金雀异黄素和橙皮甙，继续搅拌40min，加入聚乙烯吡咯烷酮和甘露醇，搅拌32min，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至6.9，用0.22μm滤膜过滤除菌，即得。
对比例1、一种诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基
所述诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞生长因子26ng/mL，转铁蛋白24μg/mL，纤粘连蛋白7μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮13μg/mL，金雀异黄素2μg/mL，甘露醇5μg/mL，胰岛素7μg/mL，L-谷氨酰胺12μg/mL，棕榈酸14μg/mL和橙皮甙11μg/mL。
所述基础培养基为F12培养基。
所述细胞生长因子由成纤细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子按重量比1∶1∶1组成。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，所述细胞生长因子由成纤细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子按重量比1∶1∶1组成。
对比例2、一种诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基
所述诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞生长因子26ng/mL，转铁蛋白24μg/mL，纤粘连蛋白7μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮13μg/mL，黄豆黄素2μg/mL，甘露醇5μg/mL，胰岛素7μg/mL，L-谷氨酰胺12μg/mL，棕榈酸14μg/mL和橙皮甙11μg/mL。
所述基础培养基为F12培养基。
所述细胞生长因子由成纤细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子按重量比9∶4∶2组成。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将金雀异黄素替换为黄豆黄素。
对比例3、一种诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基
所述诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞生长因子26ng/mL，转铁蛋白24μg/mL，纤粘连蛋白7μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮13μg/mL，金雀异黄素2μg/mL，甘露醇5μg/mL，胰岛素7μg/mL，L-谷氨酰胺12μg/mL，棕榈酸14μg/mL和柚皮甙11μg/mL。
所述基础培养基为F12培养基。
所述细胞生长因子由成纤细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子按重量比9∶4∶2组成。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将橙皮甙换为柚皮甙。
试验例一、诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基对诱导多能干细胞的培养试验
1、试验对象：实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2和对比例3制得的诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基。
2、试验方法：
将诱导多能干细胞分别接种于实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2和对比例3制得的无血清培养基中，在5％CO2及37℃环境中传代培养，传代过程中使用IV胶原酶消化诱导多能干细胞后，加入培养基，轻轻将细胞刮成小块儿聚集物，将所得细胞聚集物混合液转移到离心管中，以1000rpm离心6min，弃去上清，以各自培养基重悬后加入培养瓶中继续传代培养，每24h更换培养基。在培养基中生长的细胞用PBS冲洗，收获细胞，计数并重接种。在每次传代结束时，测定细胞产率。
3、试验结果：
试验结果如表1所示。
表1：不同培养基测得细胞产率比较
Figure BDA0001372101990000081
由表1可以得出，在所有检测的传代中，生长在本发明实施例1-3制备的诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基中的细胞产率，明显高于生长在对比例1-3制备的诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基中的细胞产率。这说明本发明制得的培养基能够快速产生诱导多能干细胞，提高诱导多能干细胞的增殖速度。

Claims (4)

1.一种诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞生长因子20-40ng/mL，转铁蛋白21-30μg/mL，纤粘连蛋白6-9μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮10-15μg/mL，金雀异黄素1-3μg/mL，甘露醇4-7μg/mL，胰岛素5-8μg/mL，L-谷氨酰胺11-15μg/mL，棕榈酸12-16μg/mL和橙皮甙8-15μg/mL；
所述细胞生长因子由成纤细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子按重量比8-10∶3-5∶1-3组成。
2.如权利要求1所述的诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞生长因子26ng/mL，转铁蛋白24μg/mL，纤粘连蛋白7μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮13μg/mL，金雀异黄素2μg/mL，甘露醇5μg/mL，胰岛素7μg/mL，L-谷氨酰胺12μg/mL，棕榈酸14μg/mL和橙皮甙11μg/mL。
3.如权利要求1或2所述的诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为F12培养基或DMEM培养基。
4.如权利要求1所述的诱导多能干细胞快速产生的无血清培养基，其特征在于，所述细胞生长因子由成纤细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子按重量比9∶4∶2组成。
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