KR20230001481A - 혈관신생 억제용 보아칸진 유도체 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈관신생-관련 질병 또는 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있는 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 화합물은 혈관신생 억제인자(예컨대, VEGF)의 발현 억제를 통해 낮은 농도에서 세포독성 없이 VEGF-유도된 혈관신생 반응(angiogenic responses)을 강력하게 억제하므로, 약물의 안전성을 크게 개선한다. 또한, 본 발명의 화합물은 마우스 이종 이식 모델에서 유의한 종양세포 사멸 활성을 나타낸다.

Description

혈관신생 억제용 보아칸진 유도체 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물{Voacangine derivatives for inhibiting angiogenesis and pharmaceutical 2-phenyl-ethancomposition comprising the same as an active ingredient}

본 발명은 혈관신생 억제용 보아칸진 (Voacangine) 유도체 및 이를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 질병 또는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

암은 급속한 증식에 따라 산소와 영양분이 필요하므로 혈관신생을 유도하여 산소와 영양분을 공급한다. 이에 따라, 1970 년 초부터 혈관신생을 조절하여 암을 치료하고자 하는 많은 연구가 진행되어 왔다. 최근 연구 동향에 따르면, 혈관신생 억제를 통한 암 치료와 관련하여 두 가지 상충되는 아이디어가 논의되고 있다. 혈관신생 억제는 암세포에 영양분과 산소의 공급을 차단함으로써 암세포를 치료할 수 있게 하지만, 이와 같은 혈관신생의 억제는 약물 효능을 감소시킬 수 있다. 그럼에도 불구하고 혈관신생 억제는 최고의 암 치료법 중 하나로 입증되었다. 혈관신생 억제제로 치료되는 암들은 폐암, 신장암, 결장암 및 교모세포종 등이 있다. 예를 들어, Avastin® (베바시주맙)은 혈관내피 성장인자 수용체2 (VEGFR2) 신호 전달의 활성화제인 혈관내피 성장인자 (VEGF)를 표적으로 하는 혈관신생 억제제로서, 2009 년에 교모세포종 치료용으로 FDA 승인을 받았다. 그러나, Avastin®은 장기간 치료를 받은 환자에게 VEGF-A, -B, -C 및 VEGFR1의 발현을 증가시켜 약물 내성을 유발하는 것으로 보고되었다. 또한, 혈관신생 유발 인자 (pro-angiogenic factors)인 bFGF, 인슐린 유사 성장인자, EGF, 및 안지오포이에틴-2 등을 함께 증가시켜 약물 내성을 유발하는 것으로 보고되었다. 또 다른 예로서, 여러 합성 혈관신생 억제제가 신경교종 동물 모델에서 생존율을 증가시키는 것으로 나타났으나, 초기 종양 억제 후에 교모세포종의 침윤 능력 및 위성 종양이 증가하는 것으로 보고되었다. 이러한 한계들을 극복하기 위해 상대적으로 독성이 적은 천연 화합물의 이용이 제안되고 있다.

최근, 본 발명자들은 천연물인 보아칸가 아프리카나로부터 분리한 천연 화합물인 보아칸진 (voacangine; 12-methoxyibogamine-18-carboxylic acid methyl ester)이 독성이 없이 HUVEC (Human umbilical vascular endothelial cell; 이하, ‘Voa’라고 함) 증식 억제 효과 및 혈관신생 인자 (VEGF)의 발현 억제 효과를 나타냄으로써 항-혈관신생 효과를 나타낸다는 것을 입증한 바 있다(한국등록특허 공보 제10-1440073호).

이에 대한 후속 연구로서, 본 발명자들은 상기 Voa의 고유한 화학구조와 생물학적 활성을 기반으로 항-혈관신생 활성을 갖는 새로운 합성 화합물을 개발하고자 노력한 결과, VEGFR2 키나아제 도메인에 직접 결합하여 하류 신호 전달을 억제함으로서 더욱 강력한 항-혈관신생 활성 및 항암 활성을 갖는 신규한 Voa 유도체들을 설계 및 합성하는 것에 성공하였다 (도 1 참조).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

KR 10-1440073 B

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본 발명의 목적은 세포독성이 없으면서 효과적으로 혈관신생을 억제할 수 있는 보아칸진 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 보아칸진 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하여 혈관신생 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 하나의 측면에 따르면,

하기 구조식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 제공된다.

[구조식 1]

상기 구조식 1에서, R₁은 -H 또는 =O이고,

R₂는 H, 카르복실기,

또는

이고,

n은 1 내지 4의 정수이고,

R₃은 수소, 직쇄 또는 분지쇄의 C_1-6 알킬, 모르폴린, 치환 또는 비치환된 페닐, 또는 치환 또는 비치환된 피리딜이다.

바람직하게는, 상기 구조식 1에서,

n은 1 또는 2이고,

R₃은 수소, 직쇄 또는 분지쇄의 C_1-4 알킬, 모르폴린, 비치환된 페닐 또는 비치환된 피리딜일 수 있다.

더욱 바람직하게는, 상기 구조식 1에서,

상기 R₁은 수소이고,

더욱 바람직하게는, 상기 구조식 1에서,

상기 R₁은 수소이고,

R₂는

이며,

n은 1 또는 2이고,

R₃은 비치환된 피리딜일 수 있다.

더욱 바람직하게는, 상기 구조식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물 7c, 60, 12a, 13a, 15, 16, 17a, 18 및 19 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 화합물은 VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2) 키나아제 활성을 억제할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 화합물은 혈관내피세포의 증식을 억제할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 화합물은 HIF-1α (Hypoxia-inducible factor-1α)의 발현을 억제할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 화합물은 VEGF-유도된 혈관신생을 억제할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 화합물은 암세포의 사멸을 유도할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,

상기 구조식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 혈관신생 억제용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 약학 조성물은 암, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 혈관신생 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 습식 황반변성, 건선, 혈우병성 관절증, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드증, 상처 과립화, 혈관 협착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 캣 스크래치 질환, 궤양, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 당뇨병 및 신사구체병증 중에서 선택되는 1종 이상의 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 암은 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 비인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 대장암, 간암, 췌장암, 췌장내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 방광암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포종, 백혈병, 소아암, 피부암, 난소암 및 자궁경부암 중에서 선택될 수 있다.

바람직하게는, 상기 암은 뇌종양일 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명의 보아칸진 유도체 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 혈관신생 억제인자 (예컨대, VEGF)의 발현 억제를 통해 낮은 농도에서 세포독성 없이 VEGF-유도된 혈관신생 반응 (angiogenic responses)을 억제하므로, 약물의 안전성을 크게 개선한다.

(b) 본 발명의 보아칸진 유도체 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 마우스 이종 이식 모델에서 유의한 종양세포 사멸 활성을 나타낸다.

(c) 본 발명은 혈관신생-관련 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있는 혈관신생 억제용 약학 조성물, 또는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

도 1a-1b는 화학 구조에 대한 것으로, 도 1a는 보아칸진 (Voacangine)의 화학 구조를 나타내는 것이고, 도 1b는 본 발명의 보아칸진 유도체의 화학 구조를 나타내는 것이다.
도 2a-2i는 본 발명의 일 실시예에 따른 보아칸진 유도체들의 1H NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다. 도 2a는 보아칸진 유도체 화합물 7c, 도 2b는 보아칸진 유도체 화합물 60, 도 2c는 보아칸진 유도체 화합물 12a, 도 2d는 보아칸진 유도체 화합물 13a, 도 2e는 보아칸진 유도체 화합물 15, 도 2f는 보아칸진 유도체 화합물 16a, 도 2g는 보아칸진 유도체 화합물 17a, 도 2h는 보아칸진 유도체 화합물 18 및 도 2i는 보아칸진 유도체 화합물 19의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 3a-3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 보아칸진 유도체들이 VEGF-유도 pVEGFR2에 미치는 효과를 나타낸다. 도 3a는 보아칸진 (Voa) 및 보아칸진 유도체들 (7c, 12a, 13a, 15, 16a, 17a, 18, 19 및 60)이 VEGF-유도 pVEGFR2의 수준에 미치는 효과를 보여준다. 모든 세포들은 각각 20 μM의 보아칸진 및 보아칸진 유도체 용액으로 1시간 동안 전처리한 후 VEGF (30 ng/mL, 15분)로 유도되었다. 이렇게 VEGF로 유도된 pVEGFR2의 수준을 특정 항체를 이용한 면역블롯으로 측정하였다. 상기 실험은 3회 반복하여 수행되었다. 도 3b는 상기 도 3a에서 나타낸 각각의 실험군에서의 상기 VEGF-유도 pVEGFR2의 수준을 상대적인 수치로 비교하여 나타낸 그래프이다. 모든 데이터는 VEGF 단독 처리군에서 얻은 결과를 기준으로 표시된 것이다. 도 3c의 좌측은 pVEGFR2와 보아칸진 유도체 화합물 19 (V19) 간의 인 실리코 도킹 분석 모델(In silico docking model)을 나타낸 그림이고, 우측은 V19의 예측 결합 모드를 나타낸 것이다. 상기 도킹 분석은 CHARMm 역장을 적용한 Discovery Studio 2018 소프트웨어 (Accelrys, San Diego, CA, USA)를 이용하여 수행되었다. 도킹에 사용된 레퍼런스 단백질은 VEGFR2 (PDB 항목: 4AGD)의 결정 구조 (solution structure)에서 가져왔다. 데이터는 최소 3번의 독립적인 실험을 통해 수득한 후, 평균 ± 표준오차로 나타냈다 (* p < 0.05, ** p < 0.01).
도 4a-4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 히트 유도체들이 VEGF-유도 pVEGFR2에 미치는 효과를 나타낸다. 도 4a는 보아칸진 (Voa) 및 히트 유도체들 (7c, 12a, 18, 및 V19)이 VEGF-유도 pVEGFR2의 수준에 미치는 효과를 보여준다. 각각의 화합물들은 VEGF (30 ng/mL, 15분) 유도 전에 1 μM 또는 10 μM의 농도로 1시간 동안 전처리되었다. 이후, VEGF로 유도된 pVEGFR2의 수준을 특정 항체를 이용한 면역블롯으로 측정하였다. 도 4b는 도 4a에서 나타낸 각각의 실험군에서의 상기 VEGF-유도 pVEGFR2의 수준을 상대적인 수치로 비교하여 나타낸 그래프이다. 모든 데이터는 VEGF 단독 처리군에서 얻은 결과를 기준으로 표시된 것이다. 이때, "Voa"는 보아칸진 처리군을 의미한다.
도 5a-5b는 본 발명의 일 실시예에 의한 화합물 V19가 보아칸진 (Voa)에 비해 VEGF-유도 pVEGFR2 억제 활성이 큰 것을 나타낸다. 도 5a는 Voa 및 V19가 혈관내피세포 (HUVECs) 내 VEGFR2의 인산화를 용량-의존적으로 감소시키는 것을 나타낸다. 각각의 화합물들은 VEGF (30 ng/mL, 15분) 유도 전에 0.1 - 20 μM의 농도로 1시간 동안 전처리되었다. 이후, VEGF로 유도된 pVEGFR2의 수준을 특정 항체를 이용한 면역블롯으로 측정하였다. 상기 실험 데이터는 최소 3번의 독립적인 실험을 통해 수득되었다. 도 5b는 도 5a에서 나타낸 각각의 실험군에서의 VEGF-유도 pVEGFR2의 수준을 상대적인 수치로 비교하여 나타낸 그래프이다. 모든 데이터는 VEGF 단독 처리군에서 얻은 결과를 기준으로 표시된 것이다. 데이터는 최소 3번의 독립적인 실험을 통해 수득한 후, 평균 ± 표준오차로 나타냈다 (* p < 0.05, ** p < 0.01).
도 6a-6d는 V19와 VEGFR2 간의 생물물리학적 상호작용을 연구하기 위하여 표지자를 사용하지 않는 (label-free) 단백질 타겟의 동정방법인 DARTS (drug affinity responsive target stability) 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 도 6a는 VEGFR2 및 VDAC1 (로딩 대조군)을 다양한 농도의 Voa 및 V19 (0.1 - 100 μM)로 각각 처리한 후 1 ㎍/mL의 프로나제 (pronase)와 함께 5분 동안 인큐베이션하고, 웨스턴블롯에 의하여 분석한 결과이다. 도 6b는 도 6a에서 나타낸 각각의 실험군에서의 VEGFR2 및 VDAC1의 수준을 상대적인 수치로 비교하여 나타낸 그래프이다. 도 6c는 VEGFR2 및 VDAC1 (로딩 대조군)을 Voa 및 V19 (50 μM)로 각각 처리한 후 프로나제 (pronase)와 함께 인큐베이션 (0 - 10분, 1 ㎍/mL)하고, 웨스턴블롯에 의하여 분석한 결과이다. 도 6d는 도 6c에서 나타낸 각각의 실험군에서의 VEGFR2 및 VDAC1의 수준을 상대적인 수치로 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 7a-7d는 V19의 HUVECs 및 U87MG 세포 증식 효과를 나타낸 것이다. 세포들은 V19 (0 - 80 μM)로 처리한 후 72 시간 동안 배양하였다. 도 7a는 V19의 혈청 10% 조건 하에서의 HUVEC 증식 효과를 나타내는 그래프이고, 도 7b는 V19의 혈청 10% 조건 하에서의 U87MG 증식 효과를 나타내는 그래프이며, 도 7c는 V19의 VEGF (30 ng/mL) 조건 하에서의 HUVEC 증식 효과를 나타내는 그래프이고, 도 7d는 V19의 VEGF (30 ng/mL) 조건 하에서의 U87MG 증식 효과를 나타내는 그래프이다. 각각의 데이터는 최소 3번의 독립적인 실험을 통해 수득한 후, 평균 ± 표준오차로 나타냈다.
도 8a-8g는 V19가 종양의 부피를 감소시키지는 않았지만 종양 내부에서 세포사멸을 유도하는 것을 나타내는 결과이다. 도 8a는 V19 처리 후 20일이 지난 후의 U87MG 중양 이종이식편의 사진이다. U87MG 교포세포종 세포로 구성된 교모세포종 종양을 보유하는 흉선이 없는 누드 마우스에 비히클 또는 V19 (10 mg/kg, 복강내 투여)를 처리하였다. 도 8b는 V19 또는 비히클 (n=4)로 처리된 각각의 마우스의 종양 부피를 4일마다 20일 동안 측정하여 나타낸 그래프이다. 도 8c는 20일 후 V19 또는 비히클 (n=4)로 처리된 각각의 마우스로부터 얻은 종양의 무게를 전자 저울을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 8d는 20일 후 V19 또는 비히클 (n=4)로 처리된 각각의 마우스로부터 얻은 종양의 사진이다. 도 8e는 V19가 이종이식 종양에서 암세포 사멸에 미치는 효과를 나타낸 이미지이다. 종양 이미지는 H&E 염색 후 생검 중에 촬영되었다. 죽은 조직을 d 선으로 나눈 부분이 암세포가 사멸한 부위이다. 도 8f는 상기 두 그룹 (n=8)의 H&E 염색 결과에서 얻은 암세포가 사멸한 부위의 면적을 나타내는 그래프이다. 세포 사멸 면적의 백분율은 전체 조직 면적에 대한 사멸 세포 면적을 나타낸 것이다. 도 8g는 20일 동안 두 그룹 (n=4)의 마우스의 체중을 측정하여 나타낸 것이다. H&E 염색 이미지의 원래 비율: 200x, 스케일 바, 500 ㎛, ** 비히클 처리군에 대하여 p < 0.05.
도 9a-9j는 V19가 종양 혈관신생을 억제하여 종양의 세포사멸을 유도한다는 것을 나타내는 결과이다. 도 9a는 V19를 처리한 후 이종이식 종양 조직의 H&E 염색 이미지를 나타낸다. 흰색 화살표는 조직의 적혈구 (RBC)를 나타낸다. 도 9b는 면적당 적혈구 수를 정량화한 그래프 (n=8)이다. 도 9c는 조직의 적혈구 수와 사멸세포 영역 사이의 피어슨 상관관계를 나타내는 그래프이다. 도 9d는 V19가 종양 조직에서 혈관 마커인 CD31의 발현에 미치는 효과를 나타내는 이미지이다. 표시된 모든 이미지는 세 가지의 독립적인 실험으로서, 붉은 색은 CD31 발현을 나타내고, 파란색은 핵을 나타낸다. CD31 염색을 위한 형광 이미지의 원래 배율: 400x, 스케일 바, 300 um. 도 9e 및 도 9f는 미세혈관 밀도를 나타내는 결과로서, 상기 미세혈관의 밀도는 3개의 무작위 필드에서 형광 강도 (도 9e) 및 CD31-양성 구조의 길이 (도 9f)를 측정함으로써 파악할 수 있다. 도 9g는 마우스의 종양 조직을 분리하고 웨스턴 블롯을 수행하여 VEGFR2 다운스트림 신호 및 세포사멸 마커를 평가한 결과이다. 도 9h-9j는 상기 도 9g의 결과로부터 각각 CD31, pVEGFR2 및 Bcl-xL의 발현량을 정량화한 그래프 (n=4)이다. 각각의 데이터는 최소 3번의 독립적인 실험을 통해 수득한 후, 평균 ± 표준오차로 나타냈다. * 비히클 처리군에 대하여 p < 0.05.
도 10a 및 10b는 V19가 U87MG 이종이식 마우스에서 HIF-1a의 수준을 감소시키는 것을 나타낸다. U87MG 종양 절편을 형광 현미경으로 영상화한 후 HIF-1a를 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 정량화하였다. 데이터는 평균 ± 표준오차로 나타냈다. 붉은색: HIF-1a, 파란색: DAPI 염색.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명자들은 세포독성이 없으면서 효과적으로 혈관신생을 억제하는 항-혈관신생 제제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 VEGFR2에 결합된 보아칸진의 도킹 시뮬레이션 결과를 기반으로 한 보아칸진 유도체를 설계하였고, 이와 같이 설계된 화합물들은 VEGF- 또는 저산소상태-유도된 혈관신생을 억제시킬 수 있으며, 이는 다양한 혈관신생-관련 질환, 또는 다양한 암의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다는 것을 발견하였다.

본 발명의 화합물은 “화합물”, “보아칸진 유도체” 또는 “보아칸진 유도체 화합물”로도 표시된다.

본 명세서에서 “수소”란 별도의 정의가 없는 한, 일중수소, 이중수소, 또는 삼중수소를 의미한다.

본 명세서에서 "알킬(alkyl)기"란 별도의 정의가 없는 한, 지방족 탄화수소기를 의미한다.

알킬기는 어떠한 이중결합이나 삼중결합을 포함하고 있지 않은 "포화 알킬(saturated alkyl)기" 일 수 있다.

알킬기는 적어도 하나의 이중결합 또는 삼중결합을 포함하고 있는 "불포화 알킬(unsaturated alkyl)기"일 수도 있다.

포화이든 불포화이든 간에 알킬기는 분쇄형, 직쇄형 또는 환형일 수 있다.

예를 들어 상기 C_1-6 알킬기는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, t-부틸기, 펜틸기, 헥실기, 에테닐기, 프로페닐기, 부테닐기, 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기 등을 의미한다.

구체적인 예를 들어, C_1-4 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, n-부틸, iso-부틸, sec-부틸 및 t-부틸로 이루어진 군에서 선택됨을 나타낸다.

한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 보아칸진 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 보아칸진 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 0.01 내지 200 μM, 바람직하게는 0.1 내지 100 μM, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 50 μM의 농도, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 20 μM, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 10 μM로 사용될 수 있으나, 본 발명의 범위가 여기에 한정되지 않으며 본 발명의 약학 조성물 내에 포함되는 보아칸진 유도체의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

이하, 본 발명의 보아칸진 유도체, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 대해 설명하도록 한다.

본 발명의 보아칸진 유도체는 하기 구조식 1로 표시된다.

[구조식 1]

상기 구조식 1에서, R₁은 -H 또는 =O이고,

R₂는 H, 카르복실기,

또는

이고,

n은 1 내지 4의 정수이고,

R₃은 수소, 직쇄 또는 분지쇄의 C_1-6 알킬, 모르폴린, 치환 또는 비치환된 페닐, 또는 치환 또는 비치환된 피리딜이다.

이때, 상기 치환된 페닐 또는 피리딜은 수소, 할로겐, 및 C_1-6 알킬로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 치환기로 치환된 것일 수 있다.

바람직하게는, 상기 구조식 1에서,

n은 1 또는 2이고,

R₃은 수소, 직쇄 또는 분지쇄의 C_1-4 알킬, 모르폴린, 비치환된 페닐 또는 비치환된 피리딜일 수 있다.

더욱 바람직하게는, 상기 구조식 1에서

상기 R₁은 수소이고,

R₂는

이며,

n은 1 또는 2이고,

R₃은 비치환된 피리딜일 수 있다.

더욱 바람직하게는, 상기 구조식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물 7c, 60, 12a, 13a, 15, 16, 17a, 18 및 19 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2) 키나아제 활성을 억제한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 혈관내피세포의 증식을 억제하는 활성을 가진다. 바람직하게는 상기 혈관내피세포는 HUVEC (Human umbilical vascular endothelial cell)일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 HIF-1α(Hypoxia-inducible factor-1α)의 발현하는 활성을 가진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 종양세포-유도된 혈관신생, 즉 저산소상태- 또는 VEGF (Vascular endothelial growth factor)-유도된 혈관신생을 억제하는 활성을 가진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 암세포의 사멸을 유도한다.

상기 약학적으로 허용 가능한 염은 염산, 브롬산, 술폰산, 아미도황산, 인산, 질산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 젖산, 타르타르산, 시트르산, 파라톨루엔설폰산 및 메탄설폰산 중에서 선택되는 어느 하나의 무기산 또는 유기산을 이용하여 형성된 염일 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 광학 이성질체, 수화물 등을 모두 포함한다. 이러한 모든 화합물 및 부분입체이성질체는 본 발명의 범위에 포함된다.

하기 반응식 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 보아칸진 유도체의 제조 방법 및 이에 따라 제조된 보아칸진 유도체의 예시들을 나타낸다. 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 보아칸진 유도체는 4-메톡시페닐히드라진 히드로클로라이드 (4-methoxyphenylhydrazine hydrochloride) 및 1,3-시클로헥산디온 (1,3-cyclohexanedione)을 합성하여 제조될 수 있다.

[반응식 1]

일 구체예로서, 하기 반응식 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 보아칸진 유도체 7c 및 60의 제조 과정을 나타낸다.

[반응식 2]

다른 구체예로서, 하기 반응식 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 상기 보아칸진 유도체 60으로부터 보아칸진 유도체 12a를 제조하는 과정을 나타낸다.

[반응식 3]

또 다른 구체예로서, 하기 반응식 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 상기 보아칸진 유도체 60으로부터 보아칸진 유도체 13a 및 15를 제조하는 과정을 나타낸 다.

[반응식 4]

또 다른 구체예로서, 하기 반응식 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 상기 보아칸진 유도체 60으로부터 보아칸진 유도체 16, 17a, 18 및 19를 제조하는 과정을 나타낸다.

[반응식 5]

본 발명은 하기 구조식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 "혈관신생 억제용 약학 조성물"로 표현되며, 이는 "혈관신생-관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물" 또는 "비조절 혈관신생-관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물"로 표현될 수 있다.

[구조식 1]

상기 구조식 1에서, R₁은 -H 또는 =O이고,

R₂는 H, 카르복실기,

또는

이고,

n은 1 내지 4의 정수이고,

R₃은 수소, 직쇄 또는 분지쇄의 C_1-6 알킬, 모르폴린, 치환 또는 비치환된 페닐, 또는 치환 또는 비치환된 피리딜이고,

이때, 상기 치환된 페닐 또는 피리딜은 수소, 할로겐, 및 C_1-6 알킬로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 치환기로 치환된 것일 수 있다.

상기 구조식 1로 표시되는 화합물에 대한 설명은 상술한 바와 같으므로 구체적인 내용은 그 부분을 참조하기로 한다.

본 발명의 약학 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질병, 질환 또는 상태는 혈관신생과 관련된 다양한 질환을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 악학 조성물은 혈관신생을 억제하는 활성으로 인해 암, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 혈관신생 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 습식 황반변성, 건선, 혈우병성 관절증, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드증, 상처 과립화, 혈관 협착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 캣 스크래치 질환, 궤양, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 당뇨병 및 신사구체병증 중에서 선택되는 1종 이상의 질병, 질환 또는 상태에 대하여 예방 또는 치료 효과가 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 비인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 대장암, 간암, 췌장암, 췌장내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 방광암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포종, 백혈병, 소아암, 피부암, 난소암 및 자궁경부암을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 뇌종양일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 화합물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이다.

본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 화합물 또는 이를 포함하는 조성물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 조성물에서 유효 성분으로 이용되는 화합물은 상기 구조식 1의 화합물 자체뿐만 아니라, 그의 약제학적으로 허용 가능한 염, 수화물 또는 용매화물을 포함한다. 용어, "약제학적으로 허용 가능한 염"은 소망하는 약리학적 효과, 즉 종양세포-유도된 혈관신생을 억제하는 활성을 갖는 상기 구조식 1의 화합물의 염을 나타낸다. 이러한 염은 히드로클로라이드, 히드로브로마이드 및 히드로요오다이드와 같은 무기산, 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔설포네이트, 비설페이트, 설파메이트, 설페이트, 나프틸레이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 2-히드록시에탄설페이트, 락테이트, 말리에이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 토실레이트 및 운데카노에이트와 같은 유기산을 이용하여 형성된다.

본 발명의 용어, "약제학적으로 허용 가능한 수화물"은 소망하는 약리학적 효과를 갖는 상기 구조식 1의 화합물의 수화물을 나타낸다. 용어, "약제학적으로 허용 가능한 용매화물"은 소망하는 약리학적 효과를 갖는 상기 구조식 1의 화합물의 용매화물을 나타낸다. 상기 수화물 및 용매화물도 상기한 산을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 점막 투여 및 점안 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 /kg (체중)이다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계;를 포함하는 혈관신생 억제방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계;를 포함하는 암, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 혈관신생 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 습식 황반변성, 건선, 혈우병성 관절증, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드증, 상처 과립화, 혈관 협착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 캣 스크래치 질환, 궤양, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 당뇨병 및 신사구체병증 중에서 선택되는 1종 이상의 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 이용되는 약학 조성물 및 그 유효성분으로서의 화합물에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

<실시예>

실험재료 및 실험방법

실험재료

보아칸진 (12-methoxyibogamine-18-carboxylic acid methyl ester)은 THC Pharm (Frankfurt, Germany)으로부터 구매하였고, 저장액 (stock solution)인 100% 디메틸 설폭사이드 (DMSO)로 용해되어 -20 ℃에서 보관되었으며, 인 비트로 실험 전에 배지와 함께 희석되었다. 작업 용액은 기본 배지에서 새로 제조되었고, 대조군은 비히클 대조군과 동일한 양의 DMSO로 처리되었다. 내피 성장 배지-2 (EGM-2)는 Lonza (Walkersville, MD), 태아 소 혈청 (FBS)은 Invitrogen (Grand Island, NY), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 KOMA biotech (한국 서울)로부터 구매하였다. VEGF-A 및 VEGF-B는 Abcam (Cambridge, MA)로부터 구매하였다. 화학 침습 분석을 위한 트랜스웰 챔버 시스템은 Corning Costar (Corning, NY)로부터 구매하였다.

화학 분석 및 시약

모든 화합물들은 상업적 공급업체로부터 입수되었고, 추가 정제 없이 사용하였다. 습기에 민감한 실험은 표준 격막 기술 (standard septum techniques)을 사용하여 건조한 N₂ 분위기에서 수행되었다. 용매, 시약 및 화합물들은 Sigma-Aldrich, Acros Organics, Fisher Scientific, and VWR International로부터 구매하였다. 건조 탄화수소 용매는 Acros Organics로부터 구매하였고, 사용 전에 4-Å 분자체에서 보관하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피는 60-Å 기공 크기 및 230 - 400 메쉬의 실리카겔을 사용하거나, 자동화된 분석장비, Biotage Isolera^TM를 이용하여 수행하였다. 분취용 HPLC는 XTerra Prep RP8 10 μm, a 19x150mm 컬럼 및 지정된 용매가 장착된 Gilson HPLC 시스템으로 수행되었다. HPLC 분석은 Agilent 1100 Series system으로 수행되었다. HPLC/MS 분석은 Agilent 1100 Series LC/MSD SL system으로 수행되었다. 생물학적 분석을 위해 시험된 모든 화합물들은 ≥95% 이상의 순도를 나타내었다 (도 1b 및 표 1 참조).

¹H and ¹³C NMR 스펙트럼은 DMSO-d ₆ , 클로로포름-d 및 메탄올-d ₄ 용매를 사용하여 Varian Unity INOVA 400 MHz 분광계로 각각 400 및 100 MHz에서 측정되었으며, 화학적 이동은 잔류 용매 피크를 참조하였다 (도 2a-2i 참조).

화합물	R1	R2
7c	Carbonyl	Hydrogen
60	Hydrogen	Hydrogen
12a	Hydrogen	Carboxyl
13a	Hydrogen	2-phenylethanone
15	Hydrogen	3-methylbutan-1-one
16a	Hydrogen	2-morpholinoethanone
17a	Hydrogen	2-(pyridin-4-yl)ethanone
18	Hydrogen	3-morpholinopropan-1-one
19	Hydrogen	2-(pyridin-2-yl)ethanone

9-메톡시-3,4,5,6-테트라히드로-2H-아제피노[4,3- b ]인돌-1-온(9-Methoxy-3,4,5,6-tetrahydro-2H-azepino[4,3-b]indol-1-one) (7c)의 제조

시판되는 4-메톡시페닐히드라진 히드로클로라이드 (18.6 g, 107.0 mmol) 및 1,2-시클로헥산디온 (12.0 g, 107.0 mmol)을 HOAc : H₂O (1 : 1) 혼합물 (32 mL)에 첨가하고 70 °C에서 20분 동안 강하게 저으며 가열하였다. 이후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 목적 생성물 (1)을 여과하였다. 상기 생성물 (1)을 H₂O (3 x 50 mL), MeCN (3 x 20 mL)으로 세척하고 진공 분위기에서 건조하였다. 수율: 밝은 갈색 고체의 2.9 g (13%).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 11.71 (s, 1H), 7.45 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.78 (dd, J = 8.7, 2.5 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 2.93 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.15-2.04 (m, 2H).

EtOH : H₂O (2:1) 혼합물 (42 mL) 중의 케톤 (1) (2.20 g, 10.2 mmol)의 용액에, 물 (6.50 mL, 106.0 mmol) 중의 히드록실아민 50 중량% 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 20 시간 동안 가열하였다. 휘발성 물질을 진공 분위기에서 증발시키고, EtOH : H₂O 용액으로부터 재결정화하여 순수한 옥심 (2)을 수득하였다. 수율: 갈색 고체의 1.64 g (70%).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 11.06 (s, 1H), 10.23 (s, 1H), 7.39 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.70 (dd, J = 8.8, 2.8 Hz, 1H), 3.72 (s, 3H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.67 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.95-1.84 (m, 2H).

500 mL 둥근 바닥 플라스크에서, 옥심 (2) (1.00 g, 4.34 mmol) 및 폴리인산 (PPA) (40.0 mL)의 슬러리를 건조 질소 분위기 하에서 70 ℃에서 18 시간 동안 교반하였다. pH 8.0에 도달할 때가지 반응을 5M NaOH 수용액으로 켄칭하였다. 수득된 갈색 침전물 락탐 (7c)을 원심분리하여 분리하고, H₂O (3 x 40 mL)로 세척하였으며, 진공 분위기 하에서 MeCN (2 x 50 mL)의 증발을 통해 건조시켰다 (반응식 2 참조). 수율 : 밝은 갈색 고체의 0.92 g (91%) (도 2a 참조).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 11.28 (s, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.34-7.28 (m, 1H), 7.17 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.74-6.68 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.24-3.15 (m, 2H), 3.07 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.02-1.93 (m, 2H).

9-메톡시-1,2,3,4,5,6-헥사히드로-아제피노[4,3-b]인돌(9-Methoxy-1,2,3,4,5,6-hexahydro-azepino[4,3-b]indol) (60)의 제조

2구 500 mL 둥근바닥 플라스크에서, 락탐 (7c) (0.600 g, 2.61 mmol)을 건조 디옥산 (300 mL) 중 LiAlH₄ (0.990 g, 26.1 mmol) 현탁액에 조금씩 첨가하였다. 생성된 슬러리를 건조 질소 분위기 하에서 15 시간 동안 환류 하에 교반 및 가열하였다. 이후, 상기 혼합물을 실온으로 냉각시키고 H2O (5.0 mL, 333.3 mmol)로 켄칭하였다. 형성된 침전물을 여과하고, THF (3 x 100 mL)로 세척하였다. 상기 결합된 유기 분획을 MgSO₄로 건조시키고 진공 분위기에서 증발시켰다. 생성된 황색의 미정제 테트라히드로아제핀 유도체 (60)을 DCM : MeOH : Et₃N 혼합물 (10 : 1 : 0.5)을 용리액으로 사용하여 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (반응식 2 참조). 수율: 담황색 고체의 0.367 g (65%) (도 2b 참조).

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.69 (s, 1H), 7.16 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.93-6.88 (m, 1H), 6.79-6.74 (m, 1H), 4.06 (s, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.29-3.21 (m, 2H), 2.99-2.89 (m, 2H), 1.94-1.84 (m, 2H), 1.73 (s, 1H). 13C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 155.2, 140.4, 131.4, 129.5, 112.2, 111.3, 100.3, 56.3, 53.2, 45.1, 29.3, 28.9.

1-(9-메톡시-3,4,5,6-테트라히드로-1H-아제피노[4,3-b]인돌-2-일)에탄온(1-(9-Methoxy-3,4,5,6-tetrahydro-1H-azepino[4,3-b]indol-2-yl)-ethanone) (12a)의 제조

상기 화합물 (60) (0.030 g, 0.139 mmol)을 10 mL 둥근바닥 플라스크에 넣고 0 °C로 냉각시켰다. 이후, 아세트산 무수물 (3.0 mL, 31.7 mmol)을 적가하고 교반한 용액을 건조 질소 분위기 하에서 실온으로 가온되도록 하였다. 이후, 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 계속해서 교반하였다. 반응 완료 후, 휘발성 물질을 진공 분위기에서 증발시키고, 조 생성물 (12a)을 MeCN : H₂O : NH₃ (30 : 70 : 0.05) 혼합물을 용리액으로 하여 분취용 HPLC에 의해 정제하였다 (반응식 3). 수율: 백색 고체의 0.020 g (56 %) (도 2c 참조).

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.15 and 7.11 (d, J = 8.7 Hz and d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.01 (s, 1H), 6.70 and 6.66 (d, J = 8.7 Hz and d, J = 8.7 Hz, 1H), 4.75 and 4.67 (s and s, 2H), 3.89-3.82 (m, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.03-2.91 (m, 2H), 2.10 and 2.09 (s and s, 3H), 2.06-1.87 (m, 2H). ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 173.0, 172.0, 155.5, 155.2, 139.9, 138.9, 131.3, 131.2, 129.3, 128.8, 112.5, 112.1, 111.5, 111.4, 110.7, 110.5, 100.6, 99.9, 56.3, 56.3, 52.8, 50.0, 46.1, 42.1, 28.6, 28.0, 27.9, 27.2, 21.7, 21.5.

1-(9-메톡시-3,4,5,6-테트라히드로-1H-아제피노[4,3-b]인돌-2-일)-2-페닐-에탄온(1-(9-Methoxy-3,4,5,6-tetrahydro-1H-azepino[4,3-b]indol-2-yl)-2-phenyl -ethanone) (13a)의 제조

상기 화합물 (60) (0.030 g, 0.139 mmol), 트리에틸아민 (0.030 mL, 0.215 mmol) 및 페닐아세틸 클로라이드 (0.019 mL, 0.144 mmol)을 반응시켰다. 조 생성물 (13a)을 MeCN : H₂O : NH₃ (40 : 60 : 0.05) 혼합물을 용리액으로 하여 분취용 HPLC에 의해 정제하였다 (반응식 4). 수율: 백색 고체의 0.023 g (50 %) (도 2d 참조).

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.31-7.08 (m, 6H), 7.02 and 6.93 (s and s, 1H), 6.70 and 6.66 (d, J = 8.8 Hz and d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.78 and 4.67 (s and s, 2H), 3.93-3.83 (m, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.78 and 3.74 (s and s, 2H), 2.98-2.83 (m, 2H), 2.03-1.80 (m, 2H).

¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 173.4, 172.4, 155.5, 155.2, 139.8, 139.0, 136.6, 136.6, 131.3, 129.8, 129.7, 129.7, 129.6, 128.7, 128.6, 127.8, 127.7, 112.5, 112.1, 111.5, 110.6, 110.4, 100.6, 99.8, 56.3, 56.3, 52.4, 50.2, 45.7, 42.2, 41.6, 28.6, 27.9 ,27.7, 27.2.

1-(9-메톡시-3,4,5,6-테트라히드로-1H-아제피노[4,3-b]인돌-2-일)-3-메틸-부탄-1-온(1-(9-Methoxy-3,4,5,6-tetrahydro-1H-azepino[4,3-b]indol-2-yl)-3- methyl-butan-1-one) (15)의 제조

25 mL 둥근바닥 플라스크에서, 상기 화합물 (60) (0.040 g, 0.185 mmol) 및 트리에틸아민 (0.040 mL, 0.287 mmol)을 12 mL의 건조 THF에 용해시켰다. 이소발레릴 클로라이드 (0.024 mL, 0.194 mmol)을 실온에서 적가하고, 반응물을 질소 분위기 하에서 밤새 교반하였다. 이후, 휘발성 물질을 진공 분위기에서 증발시키고, 염수 (5.0 mL)를 첨가한 다음, 화합물을 EtOAc (4 x 7 mL)로 추출하였다. 합성된 유기층을 Na₂SO₄로 건조시키고 용매를 회전 증발에 의해 제거하였다. 조 생성물 (15)을 MeCN : H₂O : NH₃ (30 : 70 : 0.05) 혼합물을 용리액으로 하여 분취용 HPLC에 의해 정제하였다 (반응식 4). 수율: 백색 고체의 0.032 g (57 %) (도 2e 참조).

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.96 and 7.80 (s and s, 1H), 7.19 and 7.13 (d, J = 8.7 Hz and d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.05 and 6.91 (s and s, 1H), 6.80 and 6.76 (d, J = 8.7 Hz and d, J = 8.7 Hz, 1H), 4.84 and 4.63 (s and s, 2H), 3.91-3.76 (m, 5H), 2.99-2.86 (m, 2H), 2.30-1.95 (m, 5H), 0.97 and 0.88 (d, J = 5.9 Hz and d, J = 6.6 Hz, 6H).

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 172.2, 171.4, 154.4, 154.3, 138.0, 136.0, 129.4, 128.2, 127.5, 111.6, 111.4, 111.0, 111.0, 110.9, 110.4, 99.7, 99.1, 56.0, 55.8, 49.9, 48.2, 44.4, 42.4, 42.2, 41.1, 27.6, 27.3, 27.2, 26.0, 25.7, 25.6, 22.8, 22.7.

1-(9-메톡시-3,4,5,6-테트라히드로-1H-아제피노[4,3-b]인돌-2-일)-2-모르폴린-4-일-에탄온(1-(9-Methoxy-3,4,5,6-tetrahydro-1H-azepino[4,3-b]indol-2-yl) -2-morpholin-4-yl-ethanone) (16)의 제조

EDCI (0.053 g, 0.277 mmol), 상기 화합물 (60) (0.040 g, 0.185 mmol), Oxyma Pure^TM (0.039 g, 0.277 mmol), 휴니그염기(Hunig's base) (0.161 mL, 0.925 mmol) 및 2-피리딜아세트산 히드로클로라이드 (0.048 g, 0.277 mmol)을 건조 DMF (5.0 mL)에 용해시켰다. 생성된 용액을 질소 분위기 하의 실온에서 밤새 교반하였다. 이후, 휘발성 물질을 증발시키고, 잔류물을 7 mL의 EtOAc 및 5 mL의 염수로 분획하였다. 수성층을 EtOAc (3 x 7 mL)로 추출하고, 합성된 유기층을 Na₂SO₄로 건조시킨 후 용매를 증발시켰다. 조 생성물 (16)을 MeCN : H₂O : NH₃ (30 : 70 : 0.05) 혼합물을 용리액으로 하여 분취용 HPLC에 의해 정제하였다 (반응식 5). 수율: 담황색 고체의 0.047 g (74 %) (도 2f 참조).

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.15 and 7.10 (d, J = 8.7 Hz and d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.02 and 6.98 (s and s, 1H), 6.71 and 6.66 (d, J = 8.7 Hz and d, J = 8.7 Hz, 1H), 4.81 and 4.75 (s and s, 2H), 3.96-3.84 (m, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.69-3.63 (m, 1H), 3.51-3.44 (m, 3H), 3.24 (s, 2H), 3.03-2.91 (m, 2H), 2.50-2.34 (m, 4H), 2.09-1.90 (m, 2H).

¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 168.3, 167.4, 152.7, 152.4, 136.8, 136.5, 128.6, 128.5, 126.6, 126.2, 109.7, 109.4, 108.7, 108.6, 108.2, 107.9, 97.8, 97.5, 65.0, 64.7, 59.4, 59.1, 53.6, 53.5, 52.1, 51.9, 49.0, 47.6, 42.2, 39.4, 26.2, 25.3, 25.1, 24.4.

1 -(9-메톡시-3,4,5,6-테트라히드로-1H-아제피노[4,3-b]인돌-2-일)-2-피리딘-4-일-에탄온(1-(9-Methoxy-3,4,5,6-tetrahydro-1H-azepino[4,3-b]indol-2-yl) -2-pyridin-4-yl-ethanone) (17a)의 제조

EDCI (0.053 g, 0.277 mmol), 상기 화합물 (60) (0.040 g, 0.185 mmol), Oxyma Pure^TM (0.039 g, 0.277 mmol), 휴니그염기(Hunig's base) (0.161 mL, 0.925 mmol) 및 2-피리딜아세트산 히드로클로라이드 (0.048 g, 0.277 mmol)을 건조 DMF (5.0 mL)에 용해시켰다. 생성된 용액을 질소 분위기 하의 실온에서 밤새 교반하였다. 이후, 휘발성 물질을 증발시키고, 잔류물을 7 mL의 EtOAc 및 5 mL의 염수로 분획하였다. 수성층을 EtOAc (3 x 7 mL)로 추출하고, 합성된 유기층을 Na₂SO₄로 건조시킨 후 용매를 증발시켰다. 조 생성물 (17a)을 MeCN : H₂O : NH₃ (30 : 70 : 0.05) 혼합물을 용리액으로 하여 분취용 HPLC에 의해 정제하였다 (반응식 5). 수율: 백색 고체의 0.024 g (39 %) (도 2g 참조).

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8.42 and 8.24 (d, J = 4.8 Hz and d, J = 4.8 Hz, 2H), 7.34-7.05 (m, 3H), 7.01 and 6.94 (s and s, 1H), 6.73-6.62 (m, 1H), 4.79 and 4.75 (s and s, 2H), 3.95-3.89 (m, 2H), 3.87 (s, 2H), 3.80 (s, 3H), 2.99-2.90 (m, 2H), 2.04-1.90 (m, 2H).

¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 171.6, 170.6, 155.4, 155.2, 150.0, 149.6, 147.5, 147.2, 139.8, 139.0, 131.3, 131.2, 129.3, 128.6, 126.4, 126.1, 112.5, 112.2, 111.6, 111.5, 110.6, 110.5, 100.5, 100.0, 56.4, 56.2, 52.4, 50.3, 45.8, 42.3, 28.8, 27.9, 27.1.

1-(9-메톡시-3,4,5,6-테트라히드로-1H-아제피노[4,3-b]인돌-2-일)-3-모르폴린-4-일-프로판-1-온(1-(9-Methoxy-3,4,5,6-tetrahydro-1H-azepino[4,3-b]indol -2-yl)-3-morpholin-4-yl-propan-1-one) (18)의 제조

EDCI (0.053 g, 0.277 mmol), 상기 화합물 (60) (0.040 g, 0.185 mmol), Oxyma Pure^TM (0.039 g, 0.277 mmol), 휴니그염기(Hunig's base) (0.161 mL, 0.925 mmol) 및 2-피리딜아세트산 히드로클로라이드 (0.048 g, 0.277 mmol)을 건조 DMF (5.0 mL)에 용해시켰다. 생성된 용액을 질소 분위기 하의 실온에서 밤새 교반하였다. 이후, 휘발성 물질을 증발시키고, 잔류물을 7 mL의 EtOAc 및 5 mL의 염수로 분획하였다. 수성층을 EtOAc (3 x 7 mL)로 추출하고, 합성된 유기층을 Na₂SO₄로 건조시킨 후 용매를 증발시켰다. 조 생성물 (18)을 MeCN : H₂O : NH₃ (30 : 70 : 0.05) 혼합물을 용리액으로 하여 분취용 HPLC에 의해 정제하였다 (반응식 5). 수율: 백색 고체의 0.010 g (15%) (도 2h 참조).

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.96 and 7.82 (s and s, 1H), 7.18 and 7.13 (d, J = 8.7 Hz and d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.04 and 6.93 (s and s, 1H), 6.83-6.72 (m, 1H), 4.81 and 4.63 (s and s, 2H), 3.92-3.76 (m, 5H), 3.75-3.57 (m, 4H), 3.01-2.88 (m, 2H), 2.84-2.57 (m, 4H), 2.53 and 2.36 (br s and br s, 4H), 2.07-1.94 (m, 2H).

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 171.4, 170.3, 154.8, 154.7, 138.4, 136.5, 129.7, 129.7, 128.4, 127.8, 111.9, 111.8, 111.4, 111.3, 111.2, 110.6, 99.9, 99.4, 67.0, 56.2, 56.2, 54.9, 54.6, 54.0, 53.8, 50.4, 48.7, 44.5, 41.4, 31.0, 30.8, 27.8, 27.6, 26.2.

1-(9-메톡시-3,4,5,6-테트라히드로-1H-아제피노[4,3-b]인돌-2-일)-2-피리딘-2-일-에탄온(1-(9-Methoxy-3,4,5,6-tetrahydro-1H-azepino[4,3-b]indol-2-yl) -2-pyridin-2-yl-ethanone) (19)의 제조

EDCI (0.053 g, 0.277 mmol), 상기 화합물 (60) (0.040 g, 0.185 mmol), Oxyma Pure^TM (0.039 g, 0.277 mmol), 휴니그염기(Hunig's base) (0.161 mL, 0.925 mmol) 및 2-피리딜아세트산 히드로클로라이드 (0.048 g, 0.277 mmol)을 건조 DMF (5.0 mL)에 용해시켰다. 생성된 용액을 질소 분위기 하의 실온에서 밤새 교반하였다. 이후, 휘발성 물질을 증발시키고, 잔류물을 7 mL의 EtOAc 및 5 mL의 염수로 분획하였다. 수성층을 EtOAc (3 x 7 mL)로 추출하고, 합성된 유기층을 Na₂SO₄로 건조시킨 후 용매를 증발시켰다. 조 생성물 (19)을 MeCN : H₂O : NH₃ (30 : 70 : 0.05) 혼합물을 용리액으로 하여 분취용 HPLC에 의해 정제하였다 (반응식 5). 수율: 백색 고체의 0.021 g (34%) (도 2i 참조).

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.52 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 8.19 and 8.06 (s and s, 1H), 7.69-7.55 (m, 1H), 7.42-6.99 (m, 4H), 6.80-6.70 (m, 1H), 4.82 and 4.74 (s and s, 2H), 4.00-3.78 (m, 7H), 2.91-2.82 (m, 2H), 2.03-1.89 (m, 2H).

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 169.5, 168.7, 155.7, 155.6, 154.3, 154.2, 148.7, 148.5, 137.9, 137.2, 136.9, 136.5, 129.4, 129.3, 128.1, 127.6, 124.4, 123.9, 122.1, 121.9, 111.5, 111.3, 111.1, 110.9, 110.5, 110.4, 99.6, 99.5, 55.9, 55.8, 50.6, 48.7, 44.4, 43.7, 43.3, 41.3, 27.4, 27.3, 27.1, 25.9.

면역블롯 분석

세포 용해물을 10% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 이용하여 분리하고, 상기 단백질을 표준 전기 블로팅 절차를 사용하여 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막(Millipore, Billerica, MA)으로 옮겼다. 블롯을 차단하고, pVEGFR2, VEGFR2, pERK1/2 및 ERK1/2 (Cell Signaling, Beverly, MA)에 대한 1차 항체로 4 ℃에서 밤새 면역표지화하였다. β-튜불린은 Millipore(Billerica, MA)로부터 구매하였다. 샘플들을 10% SDS-PAGE로 분리하고, 상기 단백질들을 표준 전기 블로팅 절차를 사용하여 PVDF 막 (Bio-Rad, Hercules, CA)으로 옮겼다. 블롯을 차단하고 VEGFR2 (ab190360) (Abcam, Cambridge, MA)에 대한 1차 항체로 4 ℃에서 밤새 면역표지화하였다. 1차 항체를 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상기 막들을 TBST (Tris-buffered saline with Tween 20, 0.05%)로 각각 10분 동안 3회 세척하고, 2차 항체를 첨가하였다. 실온에서 1시간 후, ECL 키트 (Amersham, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 면역표지를 검출하였다.

DARTS (Drug Affinity Responsive Target Stability) 분석

HUVEC (6 × 10⁶ 세포)는 프로테아제/포스파타제 억제제 칵테일 (1/2 정제, 25 mL; Pierce)로 처리된 PBS 완충액에서 균질화하여 용해되었고, 총 단백질 농도는 Bradford 분석을 통해 측정되었다. 상기 세포 용해물 (단백질 농도 1.5mg/mL, 100μL)을 1.5mL 튜브에 분취하고 100μM V19 (3μL DMSO 중)와 함께 실온에서 회전하면서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 Pronase를 첨가하고 (1μg/mL 최종 농도) 25 ℃에서 5분 동안 인큐베이션을 계속하였다. 1x SDS의 최종 농도로 6x SDS 샘플 완충액을 첨가하여 프로테아제 활성을 중단시키고 샘플을 7분 동안 가열하였다. 이후 VEGFR2 및 VDAC1 (대조군)의 단백질 수준을 웨스턴 블롯을 통해 정량화하였다.

인 비보 마우스 종양 이종이식 분석

마우스는 대한민국 서울 연세대학교 실험동물연구센터의 병원체 없는 시설에 수용되었다. 동물실험은 연세대학교 동물실험 윤리위원회 (IACUC)의 승인 하에 가이드라인을 준수하고 (허가 번호: IACUC-A-202009-1149-01 및 IACUC-20170929-020), 실험동물의 윤리적 이용에 대한 국제 지침을 준수하며 수행되었다.

먼저, 200 μL 인산완충식염수 (PBS) / Matrigel (1:1)에 현탁된 U87 교모세포종 세포 (5×10⁶ 세포)를 흉선이 없는 누드 마우스 (4주령 암컷 BALB/c nu/ nu, 오리엔트바이오, 서울, 대한민국)의 옆구리 (dorsal flank)에 피하 이식하였다. 종양이 감지되면 (50 - 100 mm³, ~2주), 마우스를 무작위로 선택하여 두 그룹 (그룹당 4마리)으로 분리하고, 이틀에 한 번씩 비히클 또는 V19 (10 mg/kg) 용액을 복강 내 투여하였다. 대조군 및 실험용액에 사용된 비히클은 식염수 : 에탄올 : Tween-80 (97.8 : 2 : 0.2)으로 구성하였다. Tween-80은 약물의 용해도를 증가시키기 위해 사용되었다. 종양 부피와 마우스 체중을 다음 식 (π/6 × 길이 × 길이 × 너비)을 사용하여 매일 측정하였다. 10번의 약물 주사 후, 마우스를 희생시키고 조직 샘플을 얻었다. 종양을 외과적으로 분리한 후 드라이아이스 (-70 ℃)로 과냉각된 이소펜탄 욕조에 떠 있는 플라스틱 보트에 넣어 2분 동안 천천히 동결시켰다. 모든 동물 연구 프로토콜은 동물 실험 지침에 따라 수행되었으며 대한민국 서울 연세대학교 동물실험 윤리위원회 (IACUC)의 승인을 받았다.

면역 조직 화학

상기 종양 동결 절편 (10 ㎛)을 항-CD31 (BD Biosciences)과 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이를 세척한 후, 상기 절편을 실온에서 45분 동안 FITC- 또는 Alexa- 결합 이차 항체 (Invitrogen)와 함께 배양하고, Hoechst (Vector Laboratories, Cambridgeshire, UK)로 대조염색하였다. 이후 공초점 현미경(LSM700, Carl Zeiss)으로 400 x 배율에서 이미지를 분석하였다. Hoechst는 여기 파장 405 nm 및 방출 파장 435 nm에서 검출된 반면, CD31 항체는 여기 파장 555 nm 및 방출 파장 585 nm에서 검출되었다. CD31 수준은 미세혈관의 형광 강도 및 길이의 정량화를 위한 3개의 무작위 필드의 농도계 분석에 의해 정량화되었다.

통계 분석

모든 데이터는 GraphPad Prism (Windows용 버전 5.00, GraphPad Software, San Diego, CA, www.graphpad.com)을 사용하여 평균 ± 표준 오차(SE)로 표시된다. 본 발명에서 표시한 데이터는 최소 3번의 독립적인 실험에서 얻은 것이다. 통계 분석은 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 수행되었다. 0.05 미만의 p-값이 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다 (*는 p<0.05를 나타내고, **는 p<0.01을 나타내며, ***는 p<0.001을 나타냄).

<실험결과>

보아칸진 유도체의 합성

반응식 1에 나타낸 바와 같이, 보아칸진 유도체들은 시판되는 4-메톡시 페닐히드라진 히드로클로라이드 및 1,3-시클로헥산디온을 합성하여 제조되었다. 화합물 7c-19는 화학 반응기에서 메탄올 또는 에틸 아세테이트 중의 아민과 시판 시약들을 반응시켜 합성되었다.

보아칸진 유도체의 SAR 연구

보아칸진 유도체에 대한 초기 설계는 VEGFR2에 결합된 보아칸진의 도킹 시뮬레이션 결과를 기반으로 하였다. 상기 시뮬레이션 결과로부터 VEGFR2의 소수성 포켓 내 Asn 923 및 Cys 919에 수소 결합하고 있는 두 개의 산소 원자가 VEGFR2에 높은 친화도를 가지면서 직접적인 상호작용을 초래하는 것을 알았다. 보아칸진의 인돌 코어는 소수성 상호작용 (Pi-Pi T형 상호작용)을 통해 VEGFR2 키나제 도메인 (Leu 840, Val 848, Ala 866 및 Leu 1035)의 활성 잔기와 직접 상호작용한다. 보아칸진과 VEGFR2의 주요 상호작용을 복제하기 위하여, 보아칸진 유도체는 인돌 코어 (5-메톡시-1H-인돌)를 가지며, 시클로헵탄과 구별되는 다양한 작용기를 가지는 것으로 설계되었다 (도 1 및 표 2 참조). 본 발명의 실시예에서, 본 발명의 보아칸진 유도체들이 VEGFR2 억제 활성을 가지는 것을 구체적으로 확인하였다. 특히, 보아칸진 유도체 7c, 12a, 18 및 19는 보아칸진에 비해 pVEGFR2 억제 활성이 더욱 높은 것으로 나타났다 (도 3a 및 3b 참조). 도 3c에서 나타낸 바와 같이, Discovery Studio 프로그램으로 수행된 V19의 도킹 시뮬레이션 결과로부터 VEGFR2의 소수성 포켓 내에 V19 인돌 고리 잔기의 산소 원자가 존재함을 확인할 수 있다. 또한, VEGFR2 내 Cys919 및 Asn 923와 V19의 수소 결합은 보아칸진에서 관찰된 것과 유사하여, V19 또한 VEGFR2에 높은 친화도를 가지면서 직접적인 상호작용을 가지는 것을 확인할 수 있었다. V19의 상기 인돌 코어는 VEGFR2 키나제 도메인 (Leu 840, Val 848, Ala 866 및 Leu 1035)의 활성 잔기와 소수성 상호작용 (Pi-알킬, Pi-Pi 및 Pi-시그마 상호작용)을 형성하였다. 한편, V19의 R₂의 부피가 큰 작용기 (예: 시클로헵탄의 피리딘-2-일-아세트알데히드)는 VEGFR2의 소수성 포켓 외부의 Asn 923 및 Phe 921과 수소 결합을 하는 것으로 나타났다.

VEGFR2의 억제는 자가인산화를 유도하는 세포 혈관신생 시스템에 의해 유도된 사이토킨인 VEGF의 활성에 영향을 미친다. 따라서, 합성 화합물들의 활성은 웨스턴블롯을 이용하여 측정한 VEGFR2 인산화 수준을 통해 평가되었다. 본 발명의 보아칸진 유도체 화합물은 R2를 통해 아세트알데히드와 같은 다양한 작용기 (페닐, 메틸, 모르폴린, 피리딘 아세트알데히드)가 도입되었다. 이 중에서, 피리딘-2-일-아세트알데히드기를 갖는 보아칸진 유도체 화합물 19 (V19)의 VEGFR2 억제 활성이 가장 높은 것으로 나타났다 (IC₅₀ < 1 μM).

보아칸진 유도체의 VEGFR2 억제 활성 평가

웨스턴 블롯을 통해 보아칸진 유도체 7c, 12a, 18 및 V19를 더욱 낮은 용량으로 처리하여 VEGFR2 억제 활성을 평가하였다 (도 4). V19는 도 5 및 표 3에 나타낸 바와 같이 보아칸진의 최저 유효 농도 (10 μM)에 비해 10배 낮은 1 μM의 농도에서도 VEGF-유도 pVEGFR2에 대하여 현저히 높은 억제 활성을 나타내었다. 이러한 결과로부터 V19가 ECs에서 VEGFR2의 신호 전달을 억제하여 VEGF-유도된 혈관신생을 억제하는 특성이 있음을 알 수 있다.

DARTS 분석에 의한 VEGFR2와 V19의 직접 결합

이전 연구에서 본 발명자들은 리간드와 수용체 사이의 직접적인 상호작용으로 인해 증가된 단백질 안정성을 기반으로 하는 무표지 방법 DARTS를 사용하여 VEGFR2에 대한 새로운 소분자의 특이적 결합을 검증할 수 있음을 입증하였다. 따라서, 본 발명에서 VEGFR2에 대한 V19의 결합을 조사하기 위해 DARTS 분석을 수행하였다. VEGFR2의 안정성은 단백질 분해효소인 프로나제 (pronase) (1 μg/mL)에 5분 동안 노출한 경우 유의하게 감소하였다. 그러나 프로나제 노출 전에 V19 또는 보아칸진으로 사전 처리된 VEGFR2는 안정성을 유지하였다. 특히, V19로 전처리하고 프로나제에 노출한 경우에 VEGFR2의 분해가 보아칸진에 비해 더욱 크고, 용량 의존적으로 감소한 반면, VDAC1은 영향을 받지 않았다 (도 6a 및 6b). 프로나제의 카이네틱스 (kinetics)에 따른 VEGFR2의 안정성을 관찰하기 위해 DARTS 분석을 실시한 결과, V19는 VEGFR2의 안정성을 유지한 반면 보아칸진 양성 대조군은 그렇지 않았으며(도 6C 및 도 6D), 이는 V19가 보아칸진에 비해 VEGFR2에 대해 더 높은 친화력과 결합을 가짐을 시사한다.

V19는 생체 내에서 종양의 세포사멸을 유도함으로써 항종양 활성을 갖는다

VEGFR2는 종양 혈관신생에 중요하다. 또한, 교모세포종은 가장 공격적인 혈관신생 고형 종양 중 하나이므로 화학요법에 대한 내성이 매우 높다. V19의 종양 세포에 대한 항증식 효과를 조사하기 위해, 인 비트로 실험에서 혈청 또는 VEGF 처리 조건에서 U87MG 및 HUVEC에서의 VEGFR2 억제 활성을 조사하였다. 혈청과 함께 배양되는 HUVEC 및 U87MG의 증식은 V19 처리에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나, V19는 VEGF 유도 후의 HUVEC 및 U87MG 증식을 효과적으로 감소시켰다 (도 7). 이후, 종양 이종이식 마우스 모델에서 종양 진행 (즉, 종양 성장 및 혈관신생)에 대한 V19의 약리학적 효과를 평가하였다. 피하 인간 교모세포종 종양(U98MG) 이종이식편을 보유하는 누드 마우스에 20일 동안 격일로 V19 (10mg/kg) 또는 비히클 단독을 복강내 주사하였다. 그 결과, V19 투여가 종양의 크기와 무게를 감소시키지는 않았지만 치료 마지막 날 (도 8a, 8b, 8c) 평가한 바와 같이, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 V19가 종양 혈관신생의 형성을 방지하고, 종양 세포의 사멸을 비히클 처리군에 비해 4배 이상 유도하는 것을 나타내었다. 또한, V19 처리된 마우스의 체중 변화가 없는 것은 세포독성 효과가 없음을 시사하였다(도 8d, 8e, 8f 및 8g).

V19는 생체 내에서 종양 혈관신생을 억제하여 종양의 세포사멸을 유도한다

V19 처리군 비히클 처리군에 비해 종양의 세포사멸을 유의하게 증가시켰다. V19가 종양 세포의 생존력을 억제하는 방법을 설명하기 위해 H&E 염색 후 적혈구 (RBC) 수를 세어 종양 혈관신생에 대한 V19의 효과를 조사하였다 (도 9a). V19 처리군은 비히클 처리군에 비해 종양 세포의 RBC 수를 대략 2배 감소시켰다 (도 9b). 또한 Pearson의 상관 계수 분석을 사용하여 종양 세포사멸과 혈관신생 사이의 관계를 확립하였다. 특히, 종양 조직에서 관찰된 적혈구 수와 세포사멸 면적 사이에는 음의 상관관계 (r = -0.5001, P = 0.0485)가 나타났다 (도 9c). 이러한 결과는 종양 조직 근처에서의 새로운 혈관 형성의 결핍이 종양 세포사멸의 주요 원인일 수 있음을 시사한다. V19 처리에 의한 새로운 혈관 형성의 억제는 내피 세포 마커인 CD31에 의해 추가로 지지되었다 (도 9d). V19-처리된 종양은 비히클-처리된 종양과 비교하여 혈관 밀도가 73% 감소하고 혈관 길이가 약 2배 감소하는 것으로 나타났다 (도 9e 및 9f). 이전 연구에 따르면 VEGFR2 신호 전달의 억제는 HIF1α의 전사를 감소시킨다. 본 발명은 V19가 U87MG 이종이식 종양에서 HIF1α의 발현을 감소시켰고, 이로 인해 종양 세포자멸사를 유도하는 것을 규명하였다 (도 10). V19의 항종양 효과를 더 조사하기 위해, 혈관신생 또는 세포 사멸과 관련된 단백질 바이오마커를 평가하고, V19 처리 종양과 비히클 처리 종양을 비교하였다 (도 9g). 특히, V19 처리는 혈관신생 단백질 바이오마커인 pVEGFR2 및 CD3의 발현을 약 60% 감소시켰고, 항세포자멸 단백질인 Bcl-xL 발현을 20% 감소시켰다. 따라서, V19는 종양 혈관신생의 억제를 통해 종양 세포 사멸을 효율적으로 유도하는 것으로 나타났다 (도 9h, 9i 및 9j). 이러한 결과는 V19가 새로운 항혈관신생 암 치료제로 개발될 수 있음을 시사한다.

결론

최근 본 발명자들에 의해 VEGFR2를 표적으로 하는 천연 항-혈관신생 화합물인 보아칸진이 확인되었습니다. 본 발명자들은 보아칸진이 혈관내피 세포 및 종양 세포의 이동, 증식, 침습, 부착 및 관 형성과 관련된 세포외 신호 관련 키나제 (ERK)를 포함한 VEGFR2의 다운스트림 신호 전달 키나제를 조절함으로써 혈관신생을 억제한다는 것을 추가로 입증하였다. 따라서, VEGFR2를 표적으로 하는 소분자의 개발은 암과 같은 혈관신생 관련 질병을 치료하기 위한 유망한 접근법이 될 수 있다. 본 발명은 보아칸진의 독특한 구조에서 영감을 받은 유도체 화합물을 설계하고 합성하여 새로운 VEGFR2 조절제를 확인하였다. 본 발명에서는 메톡시-인돌 백본을 포함하는 일련의 보아칸진 유도체의 설계, 합성 및 생물학적 평가에 대해 자세히 기재하였다. 이 중에서도 V19는 VEGF-유도 pVEGFR2 활성을 측정한 VEGFR2 키나제 억제 분석에 의해 결정된 바와 같이 보아칸진에 비해 10배 더 큰 억제 효능을 나타내어 가장 강력한 유도체인 것으로 확인되다. V19는 세포독성 효과를 유도하지 않으면서 VEGF 매개된 혈관신생 신호를 억제함으로써 시험관 내 및 생체 내에서 VEGF 매개 혈관신생 신호를 억제하였다. VEGFR2의 발현이 상승된 U87MG 이종이식 종양 마우스 모델로 평가한 바와 같이, V19는 CD31 및 혈관신생 인자에 의해 평가된 미세혈관 밀도를 감소시킴으로써 비히클 대조군에 비해 종양 세포 사멸을 유의하게 유도하였다. V19는 종양의 크기를 감소시킬 수 없었으며, 이는 사이토카인 및 영양소의 환경이 억제되지 않은 생체 내 환경에서 종양 세포가 증식함을 시사한다. 인 비보 실험의 결과는 V19 처리가 혈청 내에서 U87MG 세포의 증식을 억제하지 않는 것이 관찰된 인 비트로 실험에서의 결과와 일치한다. 종양이 성장함에 따라 조직의 핵심은 점점 더 저산소 상태가 된다. 결과적으로, V19에 의한 VEGFR2 신호전달의 억제는 HIF1α의 피드백 루프를 감소시켜 세포 사멸을 초래한다. 종합적으로, 본 발명은 천연 화합물인 보아칸진으로부터 영감을 받은 새롭고 강력한 VEGFR2 조절제를 산출했으며, 이는 새로운 항-혈관신생제의 개발을 주도할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

1. 하기 구조식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
   [구조식 1]
   

   

   
   상기 구조식 1에서, R₁은 -H 또는 =O이고,
   R₂는 H, 카르복실기,

   

   또는

   

   이고,
   n은 1 내지 4의 정수이고,
   R₃은 수소, 직쇄 또는 분지쇄의 C_1-6 알킬, 모르폴린, 치환 또는 비치환된 페닐, 또는 치환 또는 비치환된 피리딜이다.
2. 제1항에 있어서,
   상기 구조식 1에서,
   n은 1 또는 2이고,
   R₃은 수소, 직쇄 또는 분지쇄의 C_1-4 알킬, 모르폴린, 비치환된 페닐 또는 비치환된 피리딜인 것을 특징으로 하는,
   화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
3. 제1항에 있어서,
   상기 구조식 1에서,
   상기 R₁은 -H이고,
   R₂는

   

   이며,
   n은 1 또는 2이고,
   R₃은 비치환된 피리딜인 것을 특징으로 하는,
   화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
4. 제1항에 있어서,
   상기 구조식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물 7c, 60, 12a, 13a, 15, 16, 17a, 18 및 19 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
   

   

   
   

   

   
   

   
5. 제1항에 있어서,
   상기 화합물은 VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2) 키나아제 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
6. 제1항에 있어서,
   상기 화합물은 혈관내피세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
7. 제1항에 있어서,
   상기 화합물은 HIF-1α (Hypoxia-inducible factor-1α)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
8. 제1항에 있어서,
   상기 화합물은 VEGF-유도된 혈관신생을 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
9. 제1항에 있어서,
   상기 화합물은 암세포의 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학 조성물.
11. 제10항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 암, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 혈관신생 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 습식 황반변성, 건선, 혈우병성 관절증, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드증, 상처 과립화, 혈관 협착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 캣 스크래치 질환, 궤양, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 당뇨병 및 신사구체병증 중에서 선택되는 1종 이상의 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
12. 제11항에 있어서,
    상기 암은 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 비인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 대장암, 간암, 췌장암, 췌장내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 방광암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포종, 백혈병, 소아암, 피부암, 난소암 및 자궁경부암 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
13. 제12항에 있어서,
    상기 암은 뇌종양인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
    

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